JPWO2020139764A5

JPWO2020139764A5 -

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Publication number: JPWO2020139764A5
Application number: JP2021538378A
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Publication date: 2023-02-24

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いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは以下の１つ以上の組み合わせの間：センス鎖の１位と２位との間、アンチセンス鎖の１位と２位との間、アンチセンス鎖の２位と３位との間、アンチセンス鎖の３位と４位との間、アンチセンス鎖の２０位と２１位との間、及びアンチセンス鎖の２１位と２２位との間にホスホロチオエート結合を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは以下の各組み合わせの間：センス鎖の１位と２位との間、アンチセンス鎖の１位と２位との間、アンチセンス鎖の２位と３位との間、アンチセンス鎖の２０位と２１位との間、アンチセンス鎖の２１位と２２位との間にホスホロチオエート結合を有する。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の第１位置のウリジンはホスフェート類似体を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはアンチセンス鎖の１位に以下の構造を含む：

相補的：本明細書で使用しているように、用語「相補的」は、２つのヌクレオチドが互いに塩基対を形成することを可能にする２つのヌクレオチド（例えば、２つの対向する核酸上、又は単一の核酸鎖の対向する領域上）間の構造的関係を指す。例えば、１つの核酸のプリンヌクレオチドは対向する核酸のピリミジンヌクレオチドに相補的であり、互いに水素結合を形成することにより一緒に塩基対になる。いくつかの実施形態では、互いに相補的なヌクレオチドは、ワトソン‐クリック様式で、又は安定二重鎖の形成を可能にする任意の他の様式で塩基対になることが可能である。いくつかの実施形態では、２つの核酸は、本明細書に記載しているように、相補性領域を形成するように互いに相補的な複数のヌクレオチドの領域を有してもよい。
デオキシリボヌクレオチド：本明細書で使用しているように、用語「デオキシリボヌクレオチド」は、リボヌクレオチドと比較して、そのペントース糖の２’位置にヒドロキシルの代わりに水素を有するヌクレオチドを指す。修飾デオキシリボヌクレオチドとは、２’位以外の位置で原子の１つ以上の修飾又は置換を有するデオキシリボヌクレオチドであり、糖、ホスフェート基、もしくは塩基中に修飾もしくは置換を含むか、又は糖、ホスフェート基、もしくは塩基の修飾もしくは置換を含む。
二本鎖オリゴヌクレオチド：本明細書で使用しているように、用語「二本鎖オリゴヌクレオチド」は、ほぼ二重鎖形態であるオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの二重鎖領域（単数又は複数）の相補的塩基対は、共有結合していない核酸鎖のヌクレオチドの逆平行配列間に形成される。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの二重鎖領域（単数又は複数）の相補的な塩基対は、共有結合している核酸鎖のヌクレオチドの逆平行配列間に形成される。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの二重鎖領域（単数又は複数）の相補的な塩基対は、一緒に塩基対となるヌクレオチドの相補的な逆平行配列を提供するように（例えば、ヘアピンを介して）折り畳まれた単一の核酸鎖から形成される。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、互いに完全に二重化された２つの共有結合していない核酸鎖を含む。しかし、いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、部分的に二重化された、例えば一端又は両端にオーバーハングを有する２つの共有結合していない核酸鎖を含む。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、部分的に相補的であるヌクレオチドの逆平行配列を含み、従って、内部ミスマッチ又は末端ミスマッチなどの１つ以上のミスマッチを有していてもよい。

二重鎖：本明細書で使用しているように、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）に関して、用語「二重鎖」は、ヌクレオチドの２つの逆平行配列の相補的な塩基対合を経て形成される構造を指す。
賦形剤：本明細書で使用しているように、用語「賦形剤」は、例えば、所望の一致性又は安定化効果を提供するか、又はそれらに寄与するために組成物に含まれてもよい非治療剤を指す。
肝細胞：本明細書で使用しているように、用語「肝細胞（単数又は複数）」は、肝臓の実質組織の細胞を指す。これらの細胞は肝臓の質量のおよそ７０～８５％を占め、血清アルブミン、フィブリノーゲン、及び凝固因子（因子３及び４を除く）のプロトロンビン群を産生する。肝細胞系統細胞のマーカーとしては：トランスサイレチン（Ｔｔｒ）、グルタミン合成酵素（Ｇｌｕｌ）、肝細胞核因子１ａ（Ｈｎｆ１ａ）、及び肝細胞核因子４ａ（Ｈｎｆ４ａ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。成熟肝細胞のマーカーとしては、限定するものではないが：シトクロムＰ４５０（Ｃｙｐ３ａ１１）、フマリルアセトアセテート加水分解酵素（Ｆａｈ）、グルコース６‐ホスフェート（Ｇ６ｐ）、アルブミン（Ａｌｂ）、及びＯＣ２‐２Ｆ８（例えば、Ｈｕｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１３年、第４９４巻（７４３６号）：ｐ．２４７‐２５０参照）が挙げられ、肝細胞マーカーに関するこれらの内容は参照により本明細書に援用される。
肝毒性物質：本明細書で使用しているように、用語「肝毒性物質」は、それ自体が肝臓に毒性であるか、又は肝臓に毒性を持つ代謝物を形成するように処理できる化合物、ウイルス、又は他の物質である。肝毒性物質としては、四塩化炭素（ＣＣｌ₄）、アセトアミノフェン（パラセタモール）、塩化ビニル、ヒ素、クロロホルム、及び非ステロイド系抗炎症剤（アスピリンやフェニルブタゾンなど）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

肝臓の炎症：本明細書で使用しているように、用語「肝臓の炎症」又は「肝炎」は、特に損傷や感染の結果として肝臓が腫脹、機能障害、及び／又は疼痛を起こしている身体的状態を指し、肝毒性物質への暴露により引き起こされる場合もある。症状としては、黄疸（皮膚や目が黄色くなる）、疲労感、脱力感、吐き気、嘔吐、食欲不振、及び体重減少が挙げられる。肝臓の炎症は、治療せずに放置すると、線維症、硬変、肝不全、又は肝臓癌へと進行する恐れがある。
肝線維症：本明細書で使用しているように、用語「肝線維症」又は「肝臓の線維症」は、コラーゲン（Ｉ、ＩＩＩ、及びＩＶ）、フィブロネクチン、ウンジュリン（ｕｎｄｕｌｉｎ）、エラスチン、ラミニン、ヒアルロナン、及びプロテオグリカンなどの細胞外マトリックスタンパク質が肝臓内に過剰に蓄積することを意味し、炎症及び肝臓細胞死に起因する。肝線維症は、治療せずに放置すると、硬変、肝不全、肝臓癌へと進行する恐れがある。
ループ：本明細書で使用しているように、「ループ」は、適切なハイブリダイゼーション条件下（例えば、ホスフェート緩衝液中や、細胞内）で、不対領域に隣接する２つの逆平行領域がハイブリダイズして二重鎖（「ステム」と称する）を形成するように互いに十分に相補的な核酸の２つの逆平行領域に隣接した核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）の不対領域を指す。

修飾ヌクレオチド間結合：本明細書で使用しているように、用語「修飾ヌクレオチド間結合」は、ホスホジエステル結合を含む基準ヌクレオチド間結合と比較して、１つ以上の化学修飾を有するヌクレオチド間結合を指す。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは天然には存在しない結合である。典型的には、修飾ヌクレオチド間結合は、修飾ヌクレオチド間結合が存在する核酸に１つ以上の望ましい特性を付与する。例えば、修飾ヌクレオチドは、熱安定性、分解耐性、ヌクレアーゼ耐性、溶解性、生物学的利用能、生物活性、免疫原性低下等を改善する可能性がある。
修飾ヌクレオチド：本明細書で使用しているように、用語「修飾ヌクレオチド」は：アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド、アデニンデオキシリボヌクレオチド、グアニンデオキシリボヌクレオチド、シトシンデオキシリボヌクレオチド、及びチミジンデオキシリボヌクレオチドから選択される対応する基準ヌクレオチドと比較して、１つ以上の化学修飾を有するヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、天然には存在しないヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、その糖、核酸塩基、及び／又はホスフェート基に１つ以上の化学修飾を有する。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、対応する基準ヌクレオチドと共役した１つ以上の化学的部分を有する。典型的には、修飾ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドが存在する核酸に１つ以上の望ましい特性を付与する。例えば、修飾ヌクレオチドは、熱安定性、分解耐性、ヌクレアーゼ耐性、溶解性、生物学的利用能、生物活性、免疫原性低下等を改善する可能性がある。
ニックドテトラループ構造：「ニックドテトラループ構造」は、別個のセンス（パッセンジャー）鎖及びアンチセンス（ガイド）鎖が存在することを特徴とするＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの構造であって、ここでは、センス鎖はアンチセンス鎖と相補性のある領域を有し、また、鎖の少なくとも１つ、一般的にはセンス鎖は、少なくとも１つの鎖内に形成された隣接ステム領域を安定化するように構成したテトラループを有する。

オリゴヌクレオチド：本明細書で使用しているように、用語「オリゴヌクレオチド」は、例えば１００ヌクレオチド長未満の短い核酸を指す。オリゴヌクレオチドは一本鎖であっても二本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは二重鎖領域を有していても、有していなくてもよい。一連の非限定的な例として、オリゴヌクレオチドは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ダイサー基質干渉ＲＮＡ（ｄｓｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短鎖ｓｉＲＮＡ、又は一本鎖ｓｉＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドはＲＮＡｉオリゴヌクレオチドである。
オーバーハング：本明細書で使用しているように、用語「オーバーハング」は、１つの鎖又は領域が二重鎖を形成する相補鎖の末端を超えて延びる１つの鎖又は領域に起因する末端非塩基対ヌクレオチド（単数又は複数）を指す。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、二本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端の二重鎖領域から延びる１つ以上の非対合ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、オーバーハングは、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖又はセンス鎖上の３’又は５’オーバーハングである。
ホスフェート類似体：本明細書で使用しているように、用語「ホスフェート類似体」は、ホスフェート基の静電的及び／又は立体的特性を模倣する化学部分を指す。いくつかの実施形態では、ホスフェート類似体は、酵素除去されやすい５’‐ホスフェートの代わりに、オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに配置される。いくつかの実施形態では、５’ ホスフェート類似体はホスファターゼ抵抗性の結合を含む。ホスフェート類似体の例としては、５’メチレンホスホネート（５’‐ＭＰ）及び５’‐（Ｅ）‐ビニルホスホネート（５’‐ＶＰ）などの５’ホスホネートが挙げられる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’末端ヌクレオチドにおいて、糖の４’‐炭素位置にホスフェート類似体（「４’‐ホスフェート類似体」と称する）を有する。４’‐ホスフェート類似体の例としては、オキシメチル基の酸素原子が糖部分（例えば、その４’‐炭素）に結合しているオキシメチルホスホネート又はその類似体が挙げられ（例えば、国際特許公開ＷＯ／２０１８／０４５３１７を参照）、ホスフェート類似体に関連するその内容は参照により本明細書に援用される。オリゴヌクレオチドの５’末端については、他の修飾が開発されている（例えば、ＷＯ２０１１／１３３８７１；米国特許第８，９２７，５１３号；及びＰｒａｋａｓｈら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、２０１５年、第４３巻（６号）：ｐ．２９９３‐３０１１、ホスフェート類似体に関連するそれぞれの内容は参照により本明細書に援用される）。

発現低下：本明細書で使用しているように、遺伝子の「発現低下」という用語は、適切な基準細胞又は被験体と比較して、細胞又は被験体において、遺伝子にコードされたＲＮＡ転写物もしくはタンパク質量が減少すること、及び／又は遺伝子活性の量が減少することを指す。例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、ＨＭＧＢ１ｍＲＮＡ配列に相補的なアンチセンス鎖を有するもの）で細胞を処理することは、二本鎖オリゴヌクレオチドで処理していない細胞と比較して、（例えば、ＨＭＧＢ１遺伝子にコードされた）ＲＮＡ転写産物、タンパク質及び／又は活性の量を減少させる可能性がある。同様に、本明細書で用いられる「発現低下」とは、遺伝子（例えば、ＨＭＧＢ１）の発現を低下させることを指す。
相補性の領域：本明細書で使用しているように、用語「相補性の領域」は、ヌクレオチドの逆平行配列に対して十分に相補的である核酸のヌクレオチド（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド）の配列を指し、当該領域は、適切なハイブリダイゼーション条件下で、例えばホスフェート緩衝液中、細胞内等で、ヌクレオチドの２つの配列間でハイブリダイゼーションを可能にする。
リボヌクレオチド：本明細書で使用しているように、用語「リボヌクレオチド」はその五炭糖としてリボースを有するヌクレオチドを指し、これはその２’位置にヒドロキシル基を含む。修飾リボヌクレオチドは、２’位置以外で原子の１つ以上の修飾又は置換を有するリボヌクレオチドであり、リボース、ホスフェート基、もしくは塩基中に修飾もしくは置換を含むか、又はリボース、ホスフェート酸基、もしくは塩基の修飾もしくは置換を含む。
ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド：本明細書で使用しているように、用語「ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド」は以下のいずれかを指す：（ａ）センス鎖（パッセンジャー）及びアンチセンス鎖（ガイド）を有し、該アンチセンス鎖又はその一部はアルゴノート２（Ａｇｏ２）エンドヌクレアーゼによって標的ｍＲＮＡの切断に使用される、二本鎖オリゴヌクレオチド；又は（ｂ）単一のアンチセンス鎖を有し、該アンチセンス鎖（又はアンチセンス鎖の一部）はＡｇｏ２エンドヌクレアーゼによって標的ｍＲＮＡの切断に使用される、一本鎖オリゴヌクレオチド。

ｉｖ．オリゴヌクレオチド修飾
オリゴヌクレオチドは、特異性、安定性、送達、生物学的利用能、ヌクレアーゼ分解への耐性、免疫原性、塩基対合特性、ＲＮＡ分布及び細胞取り込み、並びに治療又は研究の使用に関連する他の特徴を向上又は制御するために、様々な方法で修飾し得る（例えば、Ｂｒａｍｓｅｎら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、２００９年、第３７巻：ｐ．２８６７‐２８８１；Ｂｒａｍｓｅｎ及びＫｊｅｍｓ、ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓ、２０１２年、第３巻：ｐ．１‐２２参照）。従って、いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の好適な修飾を含んでもよい。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、その塩基（又は核酸塩基）、糖（例えば、リボース、デオキシリボース）、又はホスフェート基中に修飾を有する。
オリゴヌクレオチド上の修飾の数及びそのヌクレオチド修飾の位置は、オリゴヌクレオチドの特性に影響を与える可能性がある。例えば、オリゴヌクレオチドは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）もしくは類似の担体と共役又は包含させることにより、インビボで送達してもよい。しかし、オリゴヌクレオチドがＬＮＰ又は類似の担体に保護されていない場合、保護されないことはヌクレオチドの少なくとも一部が修飾されることに有利である場合もある。従って、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドのいずれかの特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの全て又はほぼ全てのヌクレオチドが修飾される。特定の実施形態では、半分を超えるヌクレオチドが修飾される。特定の実施形態では、半分を下回るヌクレオチドが修飾される。典型的には、ネイキッド送達により、全ての糖が２’位置で修飾される。これらの修飾は可逆的であっても不可逆的であってもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示したオリゴヌクレオチドは、所望の特徴（例えば、酵素分解からの保護、インビボ投与後に所望の細胞を標的とする能力、及び／又は熱力学的安定性）をもたらすに十分な数及び種類の修飾ヌクレオチドを有する。

ｂ．５’末端ホスフェート
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’末端ホスフェート基は、アルゴノート２との相互作用を促進する。しかし、５’‐ホスフェート基を含むオリゴヌクレオチドは、ホスファターゼ又は他の酵素を介して分解しやすく、インビボでの生物学的利用能を制限する可能性がある。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドには、そのような分解に対して抵抗性のある５’ ホスフェートの類似体が含まれる。いくつかの実施形態では、ホスフェート類似体はオキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、又はマロニルホスホネートであってもよい。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端は、天然５’‐ホスフェート基の静電的かつ立体的特性を模倣する化学部分（「ホスフェート模倣体」）に連結する（例えば、Ｐｒａｋａｓｈら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、２０１５年、第４３巻（６号）：ｐ．２９９３‐３０１１参照。ホスフェート類似体に関する内容は参照により本明細書に援用される）。５’末端に連結できる多数のホスフェート模倣体が開発されている（例えば、米国特許第８，９２７，５１３号参照。ホスフェート類似体に関する内容は参照により本明細書に援用される）。オリゴヌクレオチドの５’末端については、他の修飾が開発されている（例えば、国際特許公開ＷＯ２０１１１３３８７１参照。ホスフェート類似体に関する内容は参照により本明細書に援用される）。特定の実施形態では、ヒドロキシル基はオリゴヌクレオチドの５’末端に連結する。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは糖の４’‐炭素位置（「４’‐ホスフェート類似体」と称する）にホスフェート類似体を有する（例えば、「４’‐ＰｈｏｓｐｈａｔｅＡｎａｌｏｇｓａｎｄＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓＣｏｍｐｒｉｓｉｎｇｔｈｅＳａｍｅ」と題された国際特許公開ＷＯ２０１８０４５３１７参照。ホスフェート類似体に関する内容は参照により本明細書に援用される）。いくつかの実施形態では、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドは５’末端ヌクレオチドに４’‐ホスフェート類似体を含む。いくつかの実施形態では、ホスフェート類似体は、オキシメチル基の酸素原子が（例えば、その４’‐炭素での）糖部分又はその類似体に結合したオキシメチルホスホネートである。他の実施形態では、４’‐ホスフェート類似体は、チオメチル基の硫黄原子又はアミノメチル基の窒素原子が糖部分又はその類似体の４’‐炭素に結合しているチオメチルホスホネート又はアミノメチルホスホネートである。特定の実施形態では、４’‐ホスフェート類似体はオキシメチルホスホネートである。いくつかの実施形態では、オキシメチルホスホネートは式‐Ｏ‐ＣＨ₂‐ＰＯ（ＯＨ）₂又は‐Ｏ‐ＣＨ₂‐ＰＯ（ＯＲ）₂で表し、式中、Ｒは独立してＨ、ＣＨ₃、アルキル基、ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＮ、ＣＨ₂ＯＣＯＣ（ＣＨ₃）₃、ＣＨ₂ＯＣＨ₂ＣＨ₂Ｓｉ（ＣＨ₃）₃、又は保護基から選択される。特定の実施形態では、アルキル基はＣＨ₂ＣＨ₃である。より典型的には、Ｒは独立して、Ｈ、ＣＨ₃、又はＣＨ₂ＣＨ₃から選択される。

特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドに連結したホスフェート類似体はメトキシホスホネート（ＭＯＰ）である。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドに連結したホスフェート類似体は５’モノ‐メチル保護されたＭＯＰである。いくつかの実施形態では、ホスフェート類似体を含む以下のウリジンヌクレオチドを、例えば、ガイド（アンチセンス）鎖の第１位置で使用してもよい：

式中、修飾ヌクレオチドは［Ｍｅホスホネート‐４Ｏ‐ｍＵ］又は５’‐メトキシ、ホスホネート‐４’オキシ‐２’‐Ｏ‐メチルウリジンと称する。

ｃ．修飾ヌクレオチド間結合
いくつかの実施形態では、ホスフェート修飾又は置換により、オリゴヌクレオチドが少なくとも１つ（例えば、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、又は少なくとも５個）の修飾ヌクレオチド間結合を含むようになる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示したオリゴヌクレオチドのいずれか１つは、１～１０個（例えば、１～１０個、２～８個、４～６個、３～１０個、５～１０個、１～５個、１～３個、又は１～２個）の修飾ヌクレオチド間結合を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示したオリゴヌクレオチドのいずれか１つは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個の修飾ヌクレオチド間結合を含む。
修飾ヌクレオチド間結合はホスホロジチオエート結合、ホスホロチオエート結合、ホスホトリエステル結合、チオノアルキル（ｔｈｉｏｎｏａｌｋｙｌ）ホスホネート結合、チオンアルキル（ｔｈｉｏｎａｌｋｙｌ）ホスホトリエステル結合、ホスホラミダイト結合、ホスホネート結合、又はボラノホスフェート結合であってもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示したオリゴヌクレオチドのいずれか１つのうちの少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合はホスホロチオエート結合である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは以下の１つ以上の組み合わせの間：センス鎖の１位と２位との間、アンチセンス鎖の１位と２位との間、アンチセンス鎖の２位と３位との間、アンチセンス鎖の３位と４位との間、アンチセンス鎖の２０位と２１位との間、及びアンチセンス鎖の２１位と２２位との間にホスホロチオエート結合を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは以下の各組み合わせの間：センス鎖の１位と２位との間、アンチセンス鎖の１位と２位との間、アンチセンス鎖の２位と３位との間、アンチセンス鎖の２０位と２１位との間、及びアンチセンス鎖の２１位と２２位との間にホスホロチオエート結合を有する。

ｅ．可逆的修飾
標的細胞に到達する前にインビボ環境からオリゴヌクレオチドを保護するための特定の修飾を行うことが可能である一方で、その修飾は、オリゴヌクレオチドが標的細胞の細胞基質に到達するとオリゴヌクレオチドの効力又は活性を低下させる可能性がある。可逆的修飾は、分子が細胞外では望ましい特性を保持し、細胞の細胞基質環境に入るとその特性は無くなるように行うことが可能である。可逆的修飾は、例えば、細胞内酵素の作用、又は細胞内の化学的条件により（例えば、細胞内グルタチオンによる還元を経て）消すことが可能である。
いくつかの実施形態では、可逆的に修飾したヌクレオチドはグルタチオン感受性部位を含む。典型的には、核酸分子は、ヌクレオチドジホスフェート間結合により生じる負電荷を覆い隠して細胞取り込み及びヌクレアーゼ耐性を改善するために環状ジスルフィド部分で化学修飾している（例えば、米国特許公開第２０１１０２９４８６９号、国際特許公開ＷＯ２０１５１８８１９７；Ｍｅａｄｅら、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１４年、第３２巻：ｐ．１２５６‐１２６３；国際特許公開ＷＯ２０１４０８８９２０参照；各文献は、そのような修飾の開示について参照により援用される）。ヌクレオチドジホスフェート間結合の可逆的修飾は、細胞基質の還元環境（例えば、グルタチオン）により細胞内で切断されるように設計している。先行例としては、細胞内で切断可能であると報告されている中和ホスホトリエステル修飾が挙げられる（Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒら、米国化学会誌、２００３年、第１２５巻：ｐ．９４０‐９５０）。

ＩＩＩ．製剤
オリゴヌクレオチドの使用を容易にするために、様々な製剤が開発されている。例えば、分解を最小限に抑え、送達及び／もしくは取り込みを容易にし、又は製剤中のオリゴヌクレオチドに別の有益な特性を提供する製剤を用いて、オリゴヌクレオチドを被験体又は細胞環境に送達することが可能になる。いくつかの実施形態では、ＨＭＧＢ１発現を低減するためのオリゴヌクレオチド（例えば、一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチド）を含む組成物が本明細書で提供される。このような組成物は、被験体において標的細胞のごく近い環境に、又は全身に投与されたときに、十分量のオリゴヌクレオチドが細胞に入り、ＨＭＧＢ１発現を低減するように、好適に配合できる。本明細書に開示したＨＭＧＢ１を低減するオリゴヌクレオチドを送達するために、任意の様々な好適なオリゴヌクレオチド製剤を使用できる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはホスフェート緩衝生理食塩水などの緩衝液、リポソーム、ミセル構造体、及びカプシド中に配合する。
細胞へのオリゴヌクレオチドのトランスフェクションを促進するために、カチオン性脂質を含むオリゴヌクレオチドの製剤を使用できる。例えば、リポフェクチン、カチオン性グリセリン誘導体、及びポリカチオン性分子（例えば、ポリリジン）などのカチオン性脂質を使用できる。好適な脂質としては、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＮＣ３８８（ＲｉｂｏｚｙｍｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、コロラド州、Ｂｏｕｌｄｅｒ）、又はＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社）が挙げられ、これらは全てメーカー説明書に従って使用できる。

注射用途に適した医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液、及び滅菌注射用液又は分散液を即席に調製するための滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与では、好適な担体として、生理食塩水、静菌水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ．ＴＭ．（ＢＡＳＦ社、米国、ニュージャージー州、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ）、又はホスフェート緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液状ポリエチレングリコール等）、及びこれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒体となり得る。多くの場合、等張剤、例えば糖類、マンニトールやソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。滅菌注射用溶液は、上述で列挙した成分の１つ又は組み合わせと共に、必要量のオリゴヌクレオチドを、選択した溶媒中に組み込み、次いで必要に応じてろ過滅菌することにより調製できる。
いくつかの実施形態では、組成物は、治療剤（例えば、ＨＭＧＢ１発現を低減するためのオリゴヌクレオチド）を少なくとも約０．１％、又はそれ以上を含有してもよいが、有効成分（単数又は複数）の割合は全組成物の重量又は体積の約１％～約８０％以上であってもよい。溶解性、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、製品貯蔵寿命、並びに他の薬理学的考慮事項などの要因は、当業者がそのような医薬製剤を調製することにより検討され、よって様々な投与量及び治療レジメンが望ましいものとなる可能性がある。
多くの実施形態は、本明細書で開示したオリゴヌクレオチドのいずれかの肝臓標的送達を意図しているが、他の組織の標的化も検討されている。

Claims

ＨＭＧＢ１発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、１５～５０ヌクレオチド長のセンス鎖及び１５～３０ヌクレオチド長のアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、前記アンチセンス鎖と共に二重鎖領域を形成し、前記センス鎖が、配列番号１～１３のいずれか１つに記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号１４～２６から選択される相補的な配列を含むか、前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、表４に記載されたものから選択されることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
前記センス鎖配列が、配列番号２７～３９のいずれか１つに記載の配列を含むか、又は前記配列から成る、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
前記アンチセンス鎖配列が、配列番号１４～２６のいずれか１つに記載の配列から成る、請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド。
前記センス鎖配列及び前記アンチセンス鎖配列が、以下を含むセットから選択される、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。

Ａ．配列番号２７及び配列番号１４、
Ｂ．配列番号２８及び配列番号１５、
Ｃ．配列番号２９及び配列番号１６、
Ｄ．配列番号３０及び配列番号１７、
Ｅ．配列番号３１及び配列番号１８、
Ｆ．配列番号３２及び配列番号１９、
Ｇ．配列番号３３及び配列番号２０、
Ｈ．配列番号３４及び配列番号２１、
Ｉ．配列番号３５及び配列番号２２、
Ｊ．配列番号３６及び配列番号２３、
Ｋ．配列番号３７及び配列番号２４、
Ｌ．配列番号３８及び配列番号２５、又は
Ｍ．配列番号３９及び配列番号２６
前記センス鎖配列が、配列番号３５に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖配列が、配列番号２２に記載の配列を含む、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
前記オリゴヌクレオチドの全ヌクレオチドが、修飾されている、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
前記修飾ヌクレオチドが、２’‐修飾を含み、前記２’‐修飾が、２’‐フルオロ又は２’‐Ｏ‐メチルである、請求項６又は７に記載のオリゴヌクレオチド。
前記センス鎖の１位、２位、４位、６位、７位、１２位、１４位、１６位、１８～２７位及び３１～３６位の全て、及び、前記アンチセンス鎖の１位、４位、６位、８位、９位、１１位、１３位、１５位、１８位及び２０～２２位の全てが、２’‐Ｏ‐メチルで修飾されている、請求項６～８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
前記センス鎖の３位、５位、８～１１位、１３位、１５位及び１７位の全て、及び、前記アンチセンス鎖の２位、３位、５位、７位、１０位、１２位、１４位、１６位、１７位及び１９位の全てが、２’‐フルオロで修飾されている、請求項６～９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
前記センス鎖の１～７位、１２～２７位及び３１～３６位の全て、及び、前記アンチセンス鎖の１位、４位、６位、８位、９位、１１～１３位及び１５～２２位の全てが、２’‐Ｏ‐メチルで修飾されている、請求項６～８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
前記センス鎖の８～１１位の全て、及び前記アンチセンス鎖の２位、３位、５位、７位、１０位及び１４位の全てが、２’‐フルオロで修飾されている、請求項６～８及び１１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
前記センス鎖の１位、２位、４～７位、９位、１１位、１４～１６位、１８～２７位及び３１～３６位の全て、及び、前記アンチセンス鎖の１位、６位、８位、９位、１１位、１３位、１５位、１８位及び２０～２２位の全てが、２’‐Ｏ‐メチルで修飾されている、請求項６～８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
前記センス鎖の３位、８位、１０位、１２位、１３位、及び１７位の全て、並びに前記アンチセンス鎖の２～５位、７位、１０位、１２位、１４位、１６位、１７位、及び１９位の全てが、２’‐フルオロで修飾されている、請求項６～８及び１３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
以下の位置の間：前記センス鎖の１位と２位との間、前記アンチセンス鎖の１位と２位との間、前記アンチセンス鎖の２位と３位との間、前記アンチセンス鎖の３位と４位との間、前記アンチセンス鎖の２０位と２１位との間、及び前記アンチセンス鎖の２１位と２２位との間の１以上の間に、ホスホロチオエート結合を有する、請求項１～１４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
以下の位置の間：前記センス鎖の１位と２位との間、前記アンチセンス鎖の１位と２位との間、前記アンチセンス鎖の２位と３位との間、前記アンチセンス鎖の２０位と２１位との間、前記アンチセンス鎖の２１位と２２位との間のそれぞれの間に、ホスホロチオエート結合を有する、請求項１～１４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
前記アンチセンス鎖の第１位置のウリジンが、ホスフェート類似体を含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
前記アンチセンス鎖の１位に以下の構造：

を含む、請求項１７に記載のオリゴヌクレオチド。
前記センス鎖上の２８～３０位の‐ＡＡＡ‐配列のヌクレオチドの１つ以上が、一価ＧａｌＮＡｃ部分と共役している、請求項１～１８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
前記センス鎖上の２８～３０位の‐ＡＡＡ‐配列の各ヌクレオチドが、一価ＧａｌＮＡｃ部分と共役しており、前記センス鎖上の２８～３０位の‐ＡＡＡ‐配列が、以下の構造：

を含む、請求項１９に記載のオリゴヌクレオチド。
センス鎖及びアンチセンス鎖を含む、ＨＭＧＢ１の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、
（ａ）前記センス鎖が、配列番号７８８に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８１４に記載の配列を含む；
（ｂ）前記センス鎖が、配列番号７８９に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８１５に記載の配列を含む；
（ｃ）前記センス鎖が、配列番号７９０に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８１６に記載の配列を含む；
（ｄ）前記センス鎖が、配列番号７９１に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８１７に記載の配列を含む；
（ｅ）前記センス鎖が、配列番号７９２に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８１８に記載の配列を含む；
（ｆ）前記センス鎖が、配列番号７９３に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８１９に記載の配列を含む；
（ｇ）前記センス鎖が、配列番号７９４に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８２０に記載の配列を含む；
（ｈ）前記センス鎖が、配列番号７９５に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８２１に記載の配列を含む；
（ｉ）前記センス鎖が、配列番号７９６に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８２２に記載の配列を含む；
（ｊ）前記センス鎖が、配列番号７９７に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８２３に記載の配列を含む；
（ｋ）前記センス鎖が、配列番号７９８に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８２４に記載の配列を含む；
（ｌ）前記センス鎖が、配列番号７９９に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８２５に記載の配列を含む；
（ｍ）前記センス鎖が、配列番号８００に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８２６に記載の配列を含む；
（ｎ）前記センス鎖が、配列番号８０１に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８２７に記載の配列を含む；
（ｏ）前記センス鎖が、配列番号８０２に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８２８に記載の配列を含む；
（ｐ）前記センス鎖が、配列番号８０３に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８２９に記載の配列を含む；
（ｑ）前記センス鎖が、配列番号８０４に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８３０に記載の配列を含む；
（ｒ）前記センス鎖が、配列番号８０５に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８３１に記載の配列を含む；
（ｓ）前記センス鎖が、配列番号８０６に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８３２に記載の配列を含む；
（ｔ）前記センス鎖が、配列番号８０７に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８３３に記載の配列を含む；
（ｕ）前記センス鎖が、配列番号８０８に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８３４に記載の配列を含む；
（ｖ）前記センス鎖が、配列番号８０９に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８３５に記載の配列を含む；
（ｗ）前記センス鎖が、配列番号８１０に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８３６に記載の配列を含む；
（ｘ）前記センス鎖が、配列番号８１１に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８３７に記載の配列を含む；
（ｙ）前記センス鎖が、配列番号８１２に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８３８に記載の配列を含む；
（ｚ）前記センス鎖が、配列番号８１３に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８３９に記載の配列を含む；又は
（aa）前記センス鎖及びアンチセンス鎖が、表５に記載されるものから選択される、
ことを特徴とするオリゴヌクレオチド。
請求項１～２１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド及び賦形剤を含むことを特徴とする組成物。
肝線維症に罹患しているか、又はそのリスクを有する被験体を治療するのに使用される、請求項１～２１に記載のオリゴヌクレオチド又は請求項２２に記載の組成物であって、前記被験体が、胆汁うっ滞性又は自己免疫性肝疾患に罹患しているか、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に罹患しており、前記被験者の治療により、肝臓ＨＭＧＢ１レベルが低下するか、又は血清ＨＭＧＢ１レベルが低下することを特徴とするオリゴヌクレオチド又は組成物。