CN113874025A - 用于抑制hmgb1表达的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本公开内容涉及用于减少HMGB1表达、特别是在肝细胞中的表达的寡核苷酸、组合物和方法。公开的用于减少HMGB1表达的寡核苷酸可以是双链的或单链的，并且可以被修饰以改善特性，诸如对核酸酶的更强抗性和更低的免疫原性。公开的用于减少HMGB1表达的寡核苷酸还可以被设计成包括靶向配体以靶向特定细胞或器官，例如肝脏的肝细胞，并且可以用于治疗肝纤维化和相关病症。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年12月28日提交的美国临时申请号62/786,287、2018年12月31日提交的美国临时申请号62/787,038和2019年1月3日提交的美国临时申请号62/788,111在35 U.S.C. § 119(e)下的权益，它们中的每一篇的整个内容通过引用并入本文。
对序列表、表格或计算机程序的引用
序列表的正式副本作为ASCII格式的文本文件通过EFS-Web与说明书并行地提交，其文件名称为“400930-014WO_ST25.txt”，创建日期为2019年12月12日，且大小为306千字节。通过EFS-Web提交的序列表是说明书的一部分，并特此通过引用整体并入本文。
技术领域
本申请涉及寡核苷酸及其用途，特别是与涉及纤维化的病症的治疗有关的用途。
背景技术
组织纤维化是一种以细胞外基质和炎症因子的异常积累为特征的病症，其导致瘢痕形成并促进慢性器官损伤。在肝脏中，纤维化是对可导致肝硬化和肝细胞癌的肝损伤的多细胞应答。该应答经常由与病症诸如酒精滥用、病毒性肝炎、代谢疾病和肝疾病诸如胆汁郁积性肝病、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)相关的肝损伤触发。研究已经表明高速泳动族框1 (HMGB1)蛋白在肝纤维化中具有促纤维化作用(参见，例如，Li L-C, 等人, J. Cell. Mol. Med., 2014, 18(12):2331-39)。HMGB1是一种从受损细胞释放的核蛋白，其作为促炎介质发挥作用，并已被证实将肝星形细胞和肝内皮细胞募集到肝损伤部位(Seo等人, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol., 2013, 305:G838-G848)。据信肝星形细胞通过转化为促进肝脏中的纤维发生活性的增殖性肌成纤维细胞而在肝纤维化的进展中发挥核心作用(参见，Kao YH, 等人, Transplant Proc., 2008, 40:2704-5)。
发明内容
本公开内容的方面涉及使用选择性地抑制HMGB1表达的寡核苷酸治疗受试者的纤维化(例如，肝纤维化)的组合物和方法。在某些实施方案中，已经开发了用于选择性地抑制HMGB1表达的有效RNAi寡核苷酸。因此，在某些实施方案中，本文提供的RNAi寡核苷酸可用于减少HMGB1表达，特别是在肝细胞中的表达，并从而减少或预防纤维化。在某些实施方案中，将掺入有切口的四环结构的RNAi寡核苷酸与GalNAc部分缀合以促进递送至肝脏肝细胞以抑制HMGB1表达从而治疗肝纤维化(参见，例如，实施例3和4，其评价原代猴或人肝细胞中的GalNAc-缀合的HMGB1寡核苷酸)。在某些实施方案中，本文提供的方法涉及使用RNAi寡核苷酸治疗患有或疑似患有肝病症例如胆汁郁积性肝病、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的受试者。在其它实施方案中，本公开内容是基于HMGB1 mRNA的关键靶向序列的鉴定，其特别适合使用基于RNAi寡核苷酸的方案实现mRNA敲低。此外，本文开发了具有特定修饰模式的RNAi寡核苷酸(如表2中的概述)，并且本文提供了特别适用于降低体内HMGB1 mRNA表达水平的RNAi寡核苷酸。
本公开内容的一些方面提供了用于减少HMGB1表达的寡核苷酸，该寡核苷酸包含15-50个核苷酸长度的有义链和15-30个核苷酸长度的反义链，其中有义链与反义链形成双链体区域，其中有义链包含如SEQ ID NO.: 1-13中的任一个所示的序列，并且其中反义链包含选自SEQ ID NO: 14-26的互补序列。
在某些实施方案中，所述有义链序列包含在SEQ ID NO: 27-39中的任一个中所示的序列或由其组成。在某些实施方案中，所述反义链序列由在SEQ ID NO: 14-26中的任一个中所示的序列组成。
在某些实施方案中，所述有义链序列包含在SEQ ID NO: 27中所示的序列且所述反义链序列包含在SEQ ID NO: 14中所示的序列。
在某些实施方案中，所述有义链序列包含在SEQ ID NO: 28中所示的序列且所述反义链序列包含在SEQ ID NO: 15中所示的序列。
在某些实施方案中，所述有义链序列包含在SEQ ID NO: 29中所示的序列且所述反义链序列包含在SEQ ID NO: 16中所示的序列。
在某些实施方案中，所述有义链序列包含在SEQ ID NO: 30中所示的序列且所述反义链序列包含在SEQ ID NO: 17中所示的序列。
在某些实施方案中，所述有义链序列包含在SEQ ID NO: 31中所示的序列且所述反义链序列包含在SEQ ID NO: 18中所示的序列。
在某些实施方案中，所述有义链序列包含在SEQ ID NO: 32中所示的序列且所述反义链序列包含在SEQ ID NO: 19中所示的序列。
在某些实施方案中，所述有义链序列包含在SEQ ID NO: 33中所示的序列且所述反义链序列包含在SEQ ID NO: 20中所示的序列。
在某些实施方案中，所述有义链序列包含在SEQ ID NO: 34中所示的序列且所述反义链序列包含在SEQ ID NO: 21中所示的序列。
在某些实施方案中，所述有义链序列包含在SEQ ID NO: 35中所示的序列且所述反义链序列包含在SEQ ID NO: 22中所示的序列。
在某些实施方案中，所述有义链序列包含在SEQ ID NO: 36中所示的序列且所述反义链序列包含在SEQ ID NO: 23中所示的序列。
在某些实施方案中，所述有义链序列包含在SEQ ID NO: 37中所示的序列且所述反义链序列包含在SEQ ID NO: 24中所示的序列。
在某些实施方案中，所述有义链序列包含在SEQ ID NO: 38中所示的序列且所述反义链序列包含在SEQ ID NO: 25中所示的序列。
在某些实施方案中，所述有义链序列包含在SEQ ID NO: 39中所示的序列且所述反义链序列包含在SEQ ID NO: 26中所示的序列。
在某些实施方案中，所述寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸。
在某些实施方案中，本文描述的寡核苷酸的所有核苷酸都被修饰。在某些实施方案中，经修饰的核苷酸包含2′-修饰。在某些实施方案中，所述2′-修饰是2′-氟或2′-O-甲基。
在某些实施方案中，有义链的位置1、2、4、6、7、12、14、16、18-27和31-36中的一个或多个，和/或反义链的位置1、4、6、8、9、11、13、15、18和20-22中的一个或多个被2′-O-甲基修饰。在某些实施方案中，有义链的位置1、2、4、6、7、12、14、16、18-27和31-36的全部和反义链的位置1、4、6、8、9、11、13、15、18和20-22的全部被2′-O-甲基修饰。在某些实施方案中，有义链的位置3、5、8-11、13、15和17中的一个或多个和/或反义链的位置2、3、5、7、10、12、14、16、17和19中的一个或多个被2′-氟修饰。在某些实施方案中，有义链的位置3、5、8-11、13、15和17的全部和反义链的位置2、3、5、7、10、12、14、16、17和19的全部被2′-氟修饰。
在某些实施方案中，有义链的位置1-7、12-27和31-36中的一个或多个和/或反义链的位置1、4、6、8、9、11-13和15-22中的一个或多个被2′-O-甲基修饰。在某些实施方案中，有义链的位置1-7、12-27和31-36的全部和反义链的位置1、4、6、8、9、11-13和15-22的全部被2′-O-甲基修饰。在某些实施方案中，有义链的位置8-11中的一个或多个和/或反义链的位置2、3、5、7、10和14中的一个或多个被2′-氟修饰。在某些实施方案中，有义链的位置8-11的全部和反义链的位置2、3、5、7、10和14的全部被2′-氟修饰。
在某些实施方案中，有义链的位置1、2、4-7、9、11、14-16、18-27和31-36中的一个或多个和/或反义链的位置1、6、8、9、11、13、15、18和20-22中的一个或多个被2′-O-甲基修饰。在某些实施方案中，有义链的位置1、2、4-7、9、11、14-16、18-27和31-36的全部和反义链的位置1、6、8、9、11、13、15、18和20-22的全部被2′-O-甲基修饰。在某些实施方案中，有义链的位置3、8、10、12、13和17中的一个或多个和/或反义链的位置2-5、7、10、12、14、16、17和19中的一个或多个被2′-氟修饰。在某些实施方案中，有义链的位置3、8、10、12、13和17的全部和反义链的位置2-5、7、10、12、14、16、17和19的全部被2′-氟修饰。
在某些实施方案中，所述寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸间键。在某些实施方案中，所述至少一个修饰的核苷酸间键是硫代磷酸酯键。
在某些实施方案中，所述寡核苷酸具有以下一个或多个之间的硫代磷酸酯键：有义链的位置1和2，反义链的位置1和2，反义链的位置2和3，反义链的位置3和4，反义链的位置20和21，和反义链的位置21和22。在某些实施方案中，所述寡核苷酸具有以下每个之间的硫代磷酸酯键：有义链的位置1和2，反义链的位置1和2，反义链的位置2和3，反义链的位置20和21，和反义链的位置21和22。
在某些实施方案中，在反义链的第一个位置处的尿苷包含磷酸酯类似物。在某些实施方案中，所述寡核苷酸包含在反义链的位置1处的下述结构：
在某些实施方案中，在有义链上的位置28-30处的-AAA-序列的一个或多个核苷酸缀合至单价GalNAc部分。在某些实施方案中，在有义链上的位置28-30处的-AAA-序列的每个核苷酸缀合至单价GalNAc部分。在某些实施方案中，在有义链上的位置28-30处的-AAA-基序包含结构：
其中:
L代表键、点击化学把手(click chemistry handle)或包含端点在内的1-20个连贯的、共价地键合的原子长度的接头，所述接头选自：被取代的和未被取代的亚烷基、被取代的和未被取代的亚烯基、被取代的和未被取代的亚炔基、被取代的和未被取代的亚杂烷基、被取代的和未被取代的亚杂烯基、被取代的和未被取代的亚杂炔基和它们的组合；且X是O、S或N。
在某些实施方案中，L是缩醛接头。在某些实施方案中，X是O。
在某些实施方案中，在有义链上的位置28-30处的-AAA-序列包含以下结构：
本公开内容的其它方面提供了用于减少HMGB1的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含15-30个核苷酸长度的反义链，其中所述反义链具有与HMGB1的互补性区域，该区域与在SEQ ID NO: 1-13中的任一个中所示的序列的至少15个连续核苷酸互补。
在某些实施方案中，所述反义链是19-27个核苷酸长度。在某些实施方案中，所述反义链是22个核苷酸长度。在某些实施方案中，所述寡核苷酸进一步包含15-50个核苷酸长度的有义链，其中所述有义链与所述反义链形成双链体区域。在某些实施方案中，所述有义链是19-50个核苷酸长度。在某些实施方案中，所述双链体区域是20个核苷酸长度。
在某些实施方案中，所述用于减少HMGB1的表达的寡核苷酸包含有义链和反义链，其中：
(a)所述有义链包含在SEQ ID NO: 788中所示的序列且所述反义链包含在SEQ IDNO: 814中所示的序列；
(b)所述有义链包含在SEQ ID NO: 789中所示的序列且所述反义链包含在SEQ IDNO: 815中所示的序列；
(c)所述有义链包含在SEQ ID NO: 790中所示的序列且所述反义链包含在SEQ IDNO: 816中所示的序列；
(d)所述有义链包含在SEQ ID NO: 791中所示的序列且所述反义链包含在SEQ IDNO: 817中所示的序列；
(e)所述有义链包含在SEQ ID NO: 792中所示的序列且所述反义链包含在SEQ IDNO: 818中所示的序列；
(f)所述有义链包含在SEQ ID NO: 793中所示的序列且所述反义链包含在SEQ IDNO: 819中所示的序列；
(g)所述有义链包含在SEQ ID NO: 794中所示的序列且所述反义链包含在SEQ IDNO: 820中所示的序列；
(h)所述有义链包含在SEQ ID NO: 795中所示的序列且所述反义链包含在SEQ IDNO: 821中所示的序列；
(i)所述有义链包含在SEQ ID NO: 796中所示的序列且所述反义链包含在SEQ IDNO: 822中所示的序列；
(j)所述有义链包含在SEQ ID NO: 797中所示的序列且所述反义链包含在SEQ IDNO: 823中所示的序列；
(k)所述有义链包含在SEQ ID NO: 798中所示的序列且所述反义链包含在SEQ IDNO: 824中所示的序列；
(l)所述有义链包含在SEQ ID NO: 799中所示的序列且所述反义链包含在SEQ IDNO: 825中所示的序列；
(m)所述有义链包含在SEQ ID NO: 800中所示的序列且所述反义链包含在SEQ IDNO: 826中所示的序列；
(n)所述有义链包含在SEQ ID NO: 801中所示的序列且所述反义链包含在SEQ IDNO: 827中所示的序列；
(o)所述有义链包含在SEQ ID NO: 802中所示的序列且所述反义链包含在SEQ IDNO: 828中所示的序列；
(p)所述有义链包含在SEQ ID NO: 803中所示的序列且所述反义链包含在SEQ IDNO: 829中所示的序列；
(q)所述有义链包含在SEQ ID NO: 804中所示的序列且所述反义链包含在SEQ IDNO: 830中所示的序列；
(r)所述有义链包含在SEQ ID NO: 805中所示的序列且所述反义链包含在SEQ IDNO: 831中所示的序列；
(s)所述有义链包含在SEQ ID NO: 806中所示的序列且所述反义链包含在SEQ IDNO: 832中所示的序列；
(t)所述有义链包含在SEQ ID NO: 807中所示的序列且所述反义链包含在SEQ IDNO: 833中所示的序列；
(u)所述有义链包含在SEQ ID NO: 808中所示的序列且所述反义链包含在SEQ IDNO: 834中所示的序列；
(v)所述有义链包含在SEQ ID NO: 809中所示的序列且所述反义链包含在SEQ IDNO: 835中所示的序列；
(w)所述有义链包含在SEQ ID NO: 810中所示的序列且所述反义链包含在SEQ IDNO: 836中所示的序列；
(x)所述有义链包含在SEQ ID NO: 811中所示的序列且所述反义链包含在SEQ IDNO: 837中所示的序列；
(y)所述有义链包含在SEQ ID NO:812中所示的序列且所述反义链包含在SEQ IDNO: 838中所示的序列；或者
(z)所述有义链包含在SEQ ID NO: 813中所示的序列且所述反义链包含在SEQ IDNO: 839中所示的序列。
本文进一步提供了组合物，其包含本文描述的任一种寡核苷酸和赋形剂。
本文进一步提供了向受试者递送寡核苷酸的方法，所述方法包括给所述受试者施用包含本文描述的任一种寡核苷酸的组合物。
在某些实施方案中，所述受试者患有肝纤维化或处于患有肝纤维化的风险中。在某些实施方案中，所述受试者患有胆汁郁积性或自身免疫性肝病。在某些实施方案中，通过给所述受试者施用所述寡核苷酸来减少HMGB1蛋白的表达。
本文进一步提供了治疗患有肝纤维化或处于患有肝纤维化的风险中的受试者的方法，所述方法包括给所述受试者施用本文描述的任一种寡核苷酸。在某些实施方案中，所述受试者患有胆汁郁积性或自身免疫性肝病。在某些实施方案中，所述受试者患有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。在某些实施方案中，在所述受试者向肝毒性试剂的暴露之前施用所述寡核苷酸。在某些实施方案中，在所述受试者向肝毒性试剂的暴露之后施用所述寡核苷酸。在某些实施方案中，与所述受试者向肝毒性试剂的暴露同时地施用所述寡核苷酸。在某些实施方案中，所述施用导致肝HMGB1水平的下降。在某些实施方案中，所述施用导致血清HMGB1水平的下降。
本文进一步提供了本文描述的任一种寡核苷酸用于治疗患有肝纤维化或处于患有肝纤维化的风险中的受试者的用途。在某些实施方案中，所述受试者患有胆汁郁积性或自身免疫性肝病。在某些实施方案中，所述受试者患有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
附图说明
并入本说明书并构成本说明书一部分的附图解释了某些实施方案，并且与书面描述一起用于提供本文公开的组合物和方法的某些方面的非限制性实施例。
图1A和图1B: 具有3种不同修饰模式(图1B)的3种GalNAc-缀合的HMGB1寡核苷酸的体内活性评价(图1A)。在x-轴上使用NM_002128.5位置编号。
图2: 在3个不同浓度的3种GalNAc-缀合的HMGB1寡核苷酸的体内活性评价。在x-轴上使用NM_002128.5位置编号。
图3: 在4个不同时间点的三种GalNAc-缀合的HMGB1寡核苷酸的体内活性评价。在x-轴上使用NM_002128.5位置编号。
图4A-4F：在Huh-7(人肝)细胞中的288种三重常见HMGB1 RNAi寡核苷酸的筛选。在x轴上指示了与每种siRNA的有义链的3′末端对应的NM_002128.5中的核苷酸位置。为5′测定(红色)和3′测定(蓝色)中的每一个显示了剩余mRNA百分比。
图5: 在图4A-4F的筛选中鉴定的22种HMGB1 RNAi寡核苷酸的体内活性评价。22种HMGB1寡核苷酸是用2种不同修饰模式(M2和M3，关于修饰模式参见图1B)进行GalNAc-缀合的。在x-轴上使用NM_002128.5位置编号。
图6: 施用后21天先导GalNAc-缀合的HMGB1寡核苷酸的体内活性评价。在x-轴上使用NM_002128.5位置编号。
图7: 在原代猴/人肝细胞中试验的GalNAc-缀合的HMGB1寡核苷酸。箭头指示，寡核苷酸也被选择以在非人灵长类动物筛选中进行试验。
图8A-8D：通过IC50曲线显示的6种GalNAc-缀合物HMGB1寡核苷酸在原代猴(食蟹猴)和人肝细胞中的活性。(图8A)食蟹猴肝细胞#1。(图8B)食蟹猴肝细胞#2。(图8C)人肝细胞#1。(图8D)阳性对照GalNAc-缀合的LDHA寡核苷酸。
图9A-9B: GalNAc-缀合的HMGB1寡核苷酸在非人灵长类动物中的体内活性评价。(图9A) 4 mg/kg，一剂。(图9B) 2 mg/kg定量施用，4个重复剂量。
图10A-10F：在3个不同浓度(0.03 nM、0.1 nM和1 nM)的6种HMGB1 RNAi寡核苷酸在小鼠、猴和人细胞系中的筛选。(图10A)小鼠细胞系, 5’测定。(图10B)小鼠细胞系, 3’测定。(图10C)猴细胞系, 5’测定。(图10D)猴细胞系, 3’测定。(图10E)人细胞系, 5’测定。(图10F)人细胞系, 3’测定。
图11A-11C：通过IC50曲线测量4种GalNAc-缀合物HMGB1寡核苷酸在Huh-7细胞中的活性。HMGB1 (图11A)、HMGB2 (图11B)和HMGB3 (图11C)的IC50曲线，标准化至模拟处理。
具体实施方式
根据某些方面，本公开内容提供了用于治疗肝纤维化的靶向HMGB1 mRNA的寡核苷酸，其有效地减少细胞、特别是肝脏细胞(例如，肝细胞)中的HMGB1表达。因此，在有关的方面，本公开内容提供了治疗纤维化的方法，其涉及选择性地减少肝脏中的HMGB1基因表达。在某些实施方案中，本文提供的靶向HMGB1的寡核苷酸被设计用于递送至靶组织的选定细胞(例如，肝脏肝细胞)以治疗那些组织中的纤维化。本文公开了具有特定修饰模式的RNAi寡核苷酸(如表2中所概述)，其对于体内敲低HMGB1 mRNA是特别有用的。
下面提供了本公开内容的其它方面，包括定义的术语的描述。
I. 定义
大约：如本文中使用的，应用于一个或多个感兴趣的值的术语“大约”或“约”表示与所述的参考值相似的值。在某些实施方案中，术语“大约”或“约”表示在任一个方向落入所述的参考值的25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少(大于或小于)内的值的范围，除非另有说明或另外从上下文中显而易见(除非这样的数字将超过可能值的100%)。
施用：本文中使用的术语“施用”是指以药理学上有用的方式(例如，为了治疗受试者的病症)向受试者提供物质(例如，寡核苷酸)。
无唾液酸糖蛋白受体(ASGPR): 本文中使用的术语“无唾液酸糖蛋白受体”或“ASGPR”表示由主要的48 kDa (ASGPR-1)和次要的40 kDa亚基(ASGPR-2)形成的二分C-型凝集素。ASGPR主要在肝细胞的窦面上表达，并且在含有末端半乳糖或N-乙酰基半乳糖胺残基的循环糖蛋白(无唾液酸糖蛋白)的结合、内化和随后清除中起主要作用。
减弱：本文中使用的术语“减弱”是指减少或有效停止。作为一个非限制性例子，本文提供的一种或多种治疗可以减少或有效停止受试者中肝纤维化或肝炎症的发作或进展。这种减弱可以通过例如以下举例说明：肝纤维化或肝炎症的一个或多个方面(例如，症状、组织特征和细胞、炎症或免疫学活性等)的减少，没有可检测的肝纤维化或肝炎症的一个或多个方面的进展(恶化)，或在受试者中没有可检测的肝纤维化或肝炎症的方面，而它们否则可能是可以预期的。
互补的: 本文中使用的术语“互补的”表示两个核苷酸之间的结构关系(例如，在两个相对的核酸上或在单个核酸链的相对区域上)，其允许所述两个核苷酸彼此形成碱基对。例如，与相对核酸的嘧啶核苷酸互补的一种核酸的嘌呤核苷酸可以通过彼此形成氢键而碱基配对在一起。在某些实施方案中，互补核苷酸可以以沃森-克里克方式或以允许形成稳定双链体的任何其它方式进行碱基配对。在某些实施方案中，如本文所述，两个核酸可以具有彼此互补的多个核苷酸的区域从而形成互补性的区域。
脱氧核糖核苷酸: 本文中使用的术语“脱氧核糖核苷酸”表示与核糖核苷酸相比在其戊糖的2'位置具有氢取代羟基的核苷酸。修饰的脱氧核糖核苷酸是具有一个或多个除2' 位置之外的原子的修饰或取代的脱氧核糖核苷酸，包括在糖、磷酸酯基团或碱基中或对它们的修饰或取代。
双链寡核苷酸：本文中使用的术语“双链寡核苷酸”表示基本上呈双链体形式的寡核苷酸。在某些实施方案中，双链寡核苷酸的双链体区域的互补碱基配对是在共价分开的核酸链的核苷酸的反平行序列之间形成。在某些实施方案中，双链寡核苷酸的双链体区域的互补碱基配对是在共价连接的核酸链的核苷酸的反平行序列之间形成。在某些实施方案中，双链寡核苷酸的双链体区域的互补碱基配对由折叠(例如，通过发夹)以提供碱基配对在一起的核苷酸的互补反平行序列的单个核酸链形成。在某些实施方案中，双链的寡核苷酸包含彼此完全双链体化的两条共价分离的核酸链。但是，在某些实施方案中，双链的寡核苷酸包含部分双链体化的两条共价分离的核酸链，例如在一端或两端具有突出端。在某些实施方案中，双链的寡核苷酸包含部分地互补的核苷酸的反平行序列，且因而，可能具有一个或多个错配，其可能包括内部错配或末端错配。
双链体：如本文中使用的，关于核酸(例如，寡核苷酸)的术语“双链体”表示通过两个反平行核苷酸序列的互补碱基配对而形成的结构。
赋形剂：本文中使用的术语“赋形剂”表示可包含在组合物中的非治疗剂，例如以提供或促成期望的稠度或稳定效应。
肝细胞: 本文中使用的术语“肝细胞”表示肝脏的实质组织的细胞。这些细胞占肝脏质量的大约70-85%，并制造血清白蛋白、纤维蛋白原和凝血因子的凝血酶原组(因子3和4除外)。肝细胞谱系细胞的标志物可包括、但不限于：转甲状腺素蛋白(Ttr)、谷氨酰胺合成酶(Glul)、肝细胞核因子1a (Hnf1a)和肝细胞核因子4a (Hnf4a)。成熟肝细胞的标志物可包括、但不限于：细胞色素P450 (Cyp3a11)、富马酰乙酰乙酸水解酶(Fah)、葡萄糖6-磷酸(G6p)、白蛋白(Alb)和OC2-2F8 (参见，例如，Huch等人, Nature, 2013, 494(7436):247-250，其与肝细胞标志物相关的内容通过引用并入本文。
肝毒性试剂: 本文中使用的“肝毒性试剂”是其本身对肝脏有毒或者可以被加工以形成对肝脏有毒的代谢物的化学化合物、病毒或其它物质。肝毒性试剂可包括、但不限于：四氯化碳(CCl4)、对乙酰氨基酚(扑热息痛)、乙烯基氯、砷、氯仿和非甾体类抗炎药(诸如阿司匹林和保泰松)。
肝炎症：本文中使用的术语“肝炎症”或“肝炎”表示其中肝脏变得肿胀、功能失调和/或疼痛的身体状况，尤其是由于损伤或感染，如可能由向肝毒性试剂的暴露引起。症状可能包括黄疸(皮肤或眼睛发黄)、疲劳、虚弱、恶心、呕吐、食欲下降和体重减轻。肝炎症如果不治疗，可能发展为纤维化、肝硬化、肝衰竭或肝癌。
肝纤维化: 本文中使用的术语“肝纤维化”或“肝的纤维化”表示细胞外基质蛋白在肝脏中的过度积累，所述细胞外基质蛋白可以包括胶原蛋白(I、III和IV)、纤连蛋白、粗纤维调节素、弹性蛋白、层粘连蛋白、透明质烷和由炎症和肝细胞死亡引起的蛋白聚糖。肝纤维化如果不治疗，可能发展为肝硬化、肝衰竭或肝癌。
环: 本文中使用的术语“环”表示核酸(例如，寡核苷酸)的未配对区域，其两侧是彼此充分互补的核酸的两个反平行区域，使得在适当的杂交条件下(例如，在磷酸盐缓冲液中，在细胞中)，位于未配对区域侧翼的两个反平行区域杂交以形成双链体(被称作“茎”)。
修饰的核苷酸间键: 本文中使用的术语“修饰的核苷酸间键”表示与包含磷酸二酯键的参考核苷酸间键相比具有一个或多个化学修饰的核苷酸间键。在某些实施方案中，修饰的核苷酸是非天然存在的键。通常，修饰的核苷酸间键给在其中存在修饰的核苷酸间键的核酸赋予一种或多种期望的特性。例如，修饰的核苷酸可以提高热稳定性、对降解的抗性、核酸酶抗性、溶解性、生物利用度、生物活性、降低的免疫原性等。
修饰的核苷酸：本文中使用的术语“修饰的核苷酸”表示与选自以下的相应参考核苷酸相比具有一个或多个化学修饰的核苷酸：腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸、腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸、胞嘧啶脱氧核糖核苷酸和胸苷脱氧核糖核苷酸。在某些实施方案中，修饰的核苷酸是非天然存在的核苷酸。在某些实施方案中，修饰的核苷酸在其糖、核碱基和/或磷酸酯基团中具有一个或多个化学修饰。在某些实施方案中，修饰的核苷酸具有缀合至相应参考核苷酸的一个或多个化学部分。通常，修饰的核苷酸给在其中存在修饰的核苷酸的核酸赋予一种或多种期望的特性。例如，修饰的核苷酸可以提高热稳定性、对降解的抗性、核酸酶抗性、溶解性、生物利用度、生物活性、降低的免疫原性等。
有切口的四环结构：“有切口的四环结构”是以分开的有义(乘客)链和反义(引导)链的存在为特征的RNAi寡核苷酸的结构，其中有义链具有与反义链互补的区域，并且其中至少一条链(通常有义链)具有被构造成稳定在至少一条链内形成的相邻茎区域的四环。
寡核苷酸：本文中使用的术语“寡核苷酸”表示短核酸，例如小于100个核苷酸长度的核酸。寡核苷酸可以是单链的或双链的。寡核苷酸可以具有或不具有双链体区域。作为一组非限制性例子，寡核苷酸可以是、但不限于小干扰RNA (siRNA)、微RNA (miRNA)、短发夹RNA (shRNA)、dicer底物干扰RNA (dsiRNA)、反义寡核苷酸、短siRNA或单链siRNA。在某些实施方案中，双链寡核苷酸是RNAi寡核苷酸。
突出端: 本文中使用的术语“突出端”表示由一条链或区域延伸超出互补链(所述一条链或区域与其形成双链体)的末端而产生的末端非碱基配对核苷酸。在某些实施方案中，突出端包含从双链寡核苷酸的5'末端或3'末端处的双链体区域延伸的一个或多个未配对核苷酸。在某些实施方案中，突出端是双链寡核苷酸的反义链或有义链上的3′或5′突出端。
磷酸酯类似物：本文中使用的术语“磷酸酯类似物”表示模拟磷酸酯基团的静电和/或空间特性的化学部分。在某些实施方案中，磷酸酯类似物位于寡核苷酸的5′末端核苷酸，代替5’-磷酸，后者经常易于酶促去除。在某些实施方案中，5′磷酸酯类似物含有磷酸酶抗性的键。磷酸酯类似物的例子包括5′膦酸酯，诸如5′亚甲基膦酸酯(5′-MP)和5′-(E)-乙烯基膦酸酯(5′-VP)。在某些实施方案中，寡核苷酸具有在5’-端核苷酸的糖的4’-碳位置处的磷酸酯类似物(被称作“4’-磷酸酯类似物”)。4’-磷酸酯类似物的一个例子是氧甲基膦酸酯，其中氧甲基的氧原子结合至糖部分(例如，在其4'-碳处)或其类似物(参见，例如，国际专利公开WO/2018/045317，其关于磷酸酯类似物的内容通过引用并入本文。已经为寡核苷酸的5′末端开发了其它修饰(参见，例如，WO 2011/133871；美国专利号8,927,513；和Prakash等人, Nucleic Acids Res., 2015, 43(6):2993-3011，它们中的每一篇关于磷酸酯类似物的内容通过引用并入本文)。
减少的表达：本文中使用的术语基因的“减少的表达”表示，与适当的参考细胞或受试者相比，由该基因编码的RNA转录物或蛋白的量的减少，和/或该基因在细胞或受试者中的活性的量的减少。例如，用双链寡核苷酸(例如，具有与HMGB1 mRNA序列互补的反义链的寡核苷酸)处理细胞的行为可能导致与未用双链寡核苷酸处理的细胞相比，RNA转录物、蛋白和/或活性(例如，由HMGB1基因编码)的量的减少。类似地，本文中使用的“减少表达”表示导致基因(例如，HMGB1)的表达减少的行为。
互补性区域：本文中使用的术语“互补性区域”表示与反平行核苷酸序列充分互补以允许在适当的杂交条件下(例如，在磷酸盐缓冲液中，在细胞中等)两个核苷酸序列之间的杂交的核酸(例如，双链寡核苷酸)的核苷酸序列。
核糖核苷酸: 本文中使用的术语“核糖核苷酸”表示具有核糖作为其戊糖的核苷酸，其在其2'位置含有羟基。修饰的核糖核苷酸是具有一个或多个除2' 位置以外的原子的修饰或取代的核糖核苷酸，包括在核糖、磷酸酯基团或碱基中或对它们的修饰或取代。
RNAi寡核苷酸：本文中使用的术语“RNAi寡核苷酸”表示(a)具有有义链(乘客)和反义链(引导)的双链寡核苷酸，其中反义链或反义链的一部分在靶mRNA的切割中被Argonaute 2 (Ago2)内切核酸酶使用，或(b)具有单个反义链的单链寡核苷酸，其中该反义链(或该反义链的部分)在靶mRNA的切割中被Ago2内切核酸酶使用。
链: 本文中使用的术语“链”表示通过核苷酸间键(例如，磷酸二酯键、硫代磷酸酯键)连接在一起的单个连续核苷酸序列。在某些实施方案中，链具有两个游离端，例如，5'-端和3'-端。
受试者：本文中使用的术语“受试者”是指任何哺乳动物，包括小鼠、兔和人类。在某些实施方案中，受试者是人或非人灵长类动物。术语“个体”或“患者”可以与“受试者”互换使用。
合成的：本文中使用的术语“合成的”表示这样的核酸或其它分子：其通过人工合成(例如，使用机器(例如，固态核酸合成仪))或以其它方式并非源自通常产生所述分子的天然来源(例如，细胞或生物体)。
靶向配体：本文中使用的术语“靶向配体”表示这样的分子(例如，碳水化合物、氨基糖、胆固醇、多肽或脂质)：其选择性地结合目标组织或细胞的同源分子(例如，受体)，并且可与另一种物质缀合以将其它物质靶向目标组织或细胞。例如，在某些实施方案中，靶向配体可以缀合至寡核苷酸以便将寡核苷酸靶向特定的目标组织或细胞。在某些实施方案中，靶向配体选择性地结合细胞表面受体。因此，在某些实施方案中，当缀合至寡核苷酸时，靶向配体通过选择性结合在细胞表面上表达的受体以及细胞对包含寡核苷酸、靶向配体和受体的复合物的胞内体内化，促进寡核苷酸向特定细胞中的递送。在某些实施方案中，靶向配体通过接头缀合至寡核苷酸，所述接头在细胞内化之后或过程中被切割，使得寡核苷酸在细胞中从靶向配体释放。
四环：本文中使用的术语“四环”表示增加由核苷酸的侧翼序列的杂交形成的相邻双链体的稳定性的环。当相邻茎双链体的解链温度(Tm)的增加高于平均而言从一组由随机选择的核苷酸序列组成的具有相当长度的环预期的相邻茎双链体的Tm时，稳定性的增加是可检测的。例如，四环可以给包含至少2个碱基对长度的双链体的发夹赋予至少50℃、至少55℃、至少56℃、至少58℃、至少60℃、至少65℃或至少75℃的在10 mM NaHPO4中的解链温度。在某些实施方案中，四环可以通过堆叠相互作用稳定相邻茎双链体中的碱基对。此外，四环中核苷酸之间的相互作用包括、但不限于非-沃森-克里克碱基配对、堆叠相互作用、氢键合和接触相互作用(Cheong等人, Nature, 1990, 346(6285):680-2; Heus和Pardi,Science, 1991, 253(5016):191-4)。在某些实施方案中，四环包含3至6个核苷酸或由其组成，并且通常为4至5个核苷酸。在某些实施方案中，四环包含三个、四个、五个或六个核苷酸或由其组成，其可以被或不被修饰(例如，其可以缀合至或可以不缀合至靶向部分)。在一个实施方案中，四环由四个核苷酸组成。如在Cornish-Bowden, Nucleic Acids Res., 1985,13:3021-3030中所述，可以在四环中使用任何核苷酸，并且可以使用此类核苷酸的标准IUPAC-IUB符号。例如，字母“N”可以用于表示任何碱基可能位于该位置，字母“R”可以用于表明A(腺嘌呤)或G(鸟嘌呤)可能位于该位置，以及“B”可以用于表明C(胞嘧啶)、G(鸟嘌呤)或T(胸腺嘧啶)可能位于该位置。四环的例子包括四环的UNCG家族(例如，UUCG)、四环的GNRA家族(例如，GAAA)和CUUG四环(Woese等人, Proc Natl Acad Sci USA., 1990, 87(21):8467-71; Antao等人, Nucleic Acids Res., 1991, 19(21):5901-5)。DNA四环的例子包括四环的d(GNNA)家族(例如，d(GTTA)、四环的d(GNRA))家族、四环的d(GNAB)家族、四环的d(CNNG)家族、以及四环的d(TNCG)家族(例如，d(TTCG))。参见，例如，Nakano等人,Biochemistry, 2002, 41(48):14281-14292; Shinji等人, Nippon Kagakkai KoenYokoshu, 2000, 78(2):731；其相关公开内容通过引用并入本文。在某些实施方案中，四环被包含在有切口的四环结构内。
治疗：本文中使用的术语“治疗”表示向有此需要的受试者提供护理的行为，例如，通过向受试者施用治疗剂(例如，寡核苷酸)，以相对于现有病症(例如，疾病、障碍)改善受试者的健康和/或健康状况，或预防或降低病症发生的可能性。在某些实施方案中，治疗包括降低受试者经历的病症(例如，疾病、障碍)的至少一种体征、症状或促成因素的频率或严重程度。
II.HMGB1表达的基于寡核苷酸的抑制剂
i. HMGB1靶序列
在某些实施方案中，本文提供了HMGB1表达的基于寡核苷酸的抑制剂，其可以用于实现治疗益处。通过检查HMGB1 mRNA，包括多个不同物种(人、恒河猴和小鼠)的mRNA(参见，例如，实施例1)，和体外和体内试验，已经发现，HMGB1 mRNA的某些序列可用作靶向序列，因为它们比其它序列更易于受到基于寡核苷酸的抑制。在某些实施方案中，HMGB1靶序列包含如SEQ ID NO: 1-13中任一个所示的序列或由其组成。为了抑制HMGB1 mRNA表达的目的，可以使用如本文中讨论的寡核苷酸靶向HMGB1 mRNA的这些区域。
因此，在某些实施方案中，本文提供的寡核苷酸被设计为具有与HMGB1 mRNA (例如，在HMGB1 mRNA的靶序列内)互补的区域，用于靶向细胞中的mRNA并抑制其表达的目的。互补区域通常具有合适的长度和碱基含量以使得寡核苷酸(或其链)能够与HMGB1 mRNA退火以达到抑制其表达的目的。在某些实施方案中，互补区域是至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个核苷酸长度。在某些实施方案中，本文提供的寡核苷酸具有在12-30 (例如，12-30、12-22、15-25、17-21、18-27、19-27或15-30)个核苷酸长度的范围内的与HMGB1互补的区域。在某些实施方案中，本文提供的寡核苷酸具有12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长度的与HMGB1互补的区域。
在某些实施方案中，本文中公开的寡核苷酸包含与在SEQ ID NO: 1-13中的任一个中所示的序列至少部分地互补的互补区域(例如，在双链寡核苷酸的反义链上)。在某些实施方案中，本文中公开的寡核苷酸包含与在SEQ ID NO: 1-13中的任一个中所示的序列完全互补的互补区域(例如，在双链寡核苷酸的反义链上)。在某些实施方案中，寡核苷酸的互补区域(例如，在双链寡核苷酸的反义链上)与在SEQ ID NO: 1-13中的任一个中所示的序列的在12-20个核苷酸(例如，12-20、12-18、12-16、12-14、14-20、14-18、14-16、16-20、16-18或18-20)长度的范围内的连续核苷酸序列互补。在某些实施方案中，寡核苷酸的互补区域(例如，在双链寡核苷酸的反义链上)与在SEQ ID NO: 11-13中的任一个中所示的序列的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸长度的连续核苷酸序列互补。
在某些实施方案中，与在SEQ ID NO: 1-13中的任一个中所示的序列的连续核苷酸互补的寡核苷酸的互补性区域跨反义链的整个长度。在某些实施方案中，与在SEQ IDNO: 1-13中的任一个中所示的序列的连续核苷酸互补的寡核苷酸的互补性区域跨反义链的整个长度的一部分。在某些实施方案中，本文中公开的寡核苷酸包含与跨在SEQ ID NO:1-13中的任一个中所示的序列的核苷酸1-20的连续核苷酸段至少部分地(例如，完全地)互补的互补性区域(例如，在双链寡核苷酸的反义链上)。
在某些实施方案中，与HMGB1 mRNA的对应序列相比，与HMGB1的互补性区域可以具有一个或多个错配。在寡核苷酸上的互补区域可以具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个等错配，前提条件是，它维持在适当的杂交条件下与HMGB1 mRNA形成互补碱基对的能力。可替换地，在寡核苷酸上的互补区域可以具有不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个或不超过5个错配，前提条件是，它维持在适当的杂交条件下与HMGB1 mRNA形成互补碱基对的能力。在某些实施方案中，如果在互补区域中存在多于一个错配，则它们可以连续定位(例如，2、3、4个或更多个在一行中)，或散布在整个互补区域，前提条件是，寡核苷酸维持在适当的杂交条件下与HMGB1 mRNA形成互补碱基对的能力。
ii. 寡核苷酸的类型
有多种寡核苷酸结构可用于在本公开内容的方法中靶向HMGB1，包括RNAi、反义、miRNA等。本文或别处描述的任何结构可用作框架以并入或靶向本文描述的序列(例如，HMBG1的hotpot序列，诸如在SEQ ID NO: 1-13中所示的那些)。
在某些实施方案中，用于减少HMGB1表达的寡核苷酸衔接在dicer参与的上游或下游的RNA干扰(RNAi)途径。例如，已经开发了RNAi寡核苷酸，每条链的大小为19-25个核苷酸，具有至少一个1-5个核苷酸的3’突出端(参见，例如，美国专利号8,372,968)。还已经开发了更长的寡核苷酸，其由Dicer加工以产生活性RNAi产物(参见，例如，美国专利号8,883,996)。进一步的工作产生了延伸的双链寡核苷酸，其中至少一条链的至少一端延伸超过双链体靶向区域，包括其中一条链包含热力学上稳定的四环结构的结构(参见，例如，美国专利号8,513,207和8,927,705，以及国际专利公开WO2010033225，它们对这些寡核苷酸的结构和形式的公开内容通过引用并入本文)。此类结构可以包括单链延伸(在分子的一侧或两侧)以及双链延伸。
在某些实施方案中，本文提供的寡核苷酸被设计为衔接dicer参与(例如，dicer切割)的下游的RNA干扰途径。此类寡核苷酸可以在有义链的3' 末端具有突出端(例如，1、2或3个核苷酸长度的突出端)。此类寡核苷酸(例如，siRNA)可以包含与靶RNA反义的21个核苷酸的引导链和互补的乘客链，其中两条链在任一个或两个3’末端退火形成19-碱基对双链体和2个核苷酸的突出端。更长的寡核苷酸设计也是可用的，包括具有23个核苷酸的引导链和21个核苷酸的乘客链的寡核苷酸，其中在分子右侧存在平头末端(乘客链的3′-末端/引导链的5′-末端)且在分子左侧存在两个核苷酸的3′-引导链突出端(乘客链的5′-末端/引导链的3′-末端)。在这样的分子中，存在21个碱基对的双链体区域。参见，例如，美国专利号9,012,138、9,012,621和9,193,753，关于它们的有关公开内容，它们中的每一个被并入本文。
在某些实施方案中，本文公开的寡核苷酸可包含均在17-26 (例如，17-26、20-25或21-23)个核苷酸长度范围内的有义链和反义链。在某些实施方案中，本文公开的寡核苷酸包含均在19-22个核苷酸长度范围内的有义链和反义链。在某些实施方案中，有义链和反义链具有相等的长度。在某些实施方案中，寡核苷酸包含有义链和反义链，使得在有义链或反义链中的任一个或有义链和反义链两者上存在3’-突出端。在某些实施方案中，对于具有均在21-23个核苷酸长度范围内的有义链和反义链的寡核苷酸，在有义链、反义链、或有义链和反义链两者上的3’突出端是1或2个核苷酸长度。在某些实施方案中，寡核苷酸具有22个核苷酸的引导链和20个核苷酸的乘客链，其中在分子的右侧存在平头末端(乘客链的3′-末端/引导链的5′-末端)且在分子的左侧存在两个核苷酸的3′-引导链突出端(乘客链的5′-末端/引导链的3′-末端)。在这样的分子中，存在20个碱基对的双链体区域。
用于与本文中公开的组合物和方法一起使用的其它寡核苷酸设计包括：16-聚体siRNA (参见，例如，Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Blackburn (编),Royal Society of Chemistry, 2006), shRNA (例如，具有19bp或更短的茎；参见，例如，Moore等人. Methods Mol. Biol., 2010, 629:141-158), 平端siRNA (例如，19bp长度；参见，例如，Kraynack和Baker, RNA, 2006, 12:163-176), 不对称siRNA (aiRNA；参见，例如，Sun等人, Nat. Biotechnol., 2008, 26:1379-1382), 不对称的较短双链体siRNA(参见，例如，Chang等人, Mol Ther., 2009, 17(4):725-32), 叉siRNA (参见，例如，Hohjoh, FEBS Letters, 2004, 557(1-3):193-198), 单链的siRNA (Elsner, NatureBiotechnology, 2012, 30:1063), 哑铃形环状siRNA (参见，例如，Abe等人, J Am ChemSoc., 2007, 129:15108-15109), 和小内部片段化的干扰RNA (siRNA；参见，例如，Bramsen等人, Nucleic Acids Res., 2007, 35(17):5886-5897)。关于其中的有关公开内容，前述参考文献中的每一篇通过引用整体并入。可以在某些实施方案中用于降低或抑制HMGB1表达的寡核苷酸结构的其它非限制性例子是微RNA (miRNA)、短发夹RNA (shRNA)和短siRNA (参见，例如，Hamilton等人, EMBO J., 2002, 21(17):4671-4679；也参见美国专利公开号20090099115)。
此外，在某些实施方案中，如本文所述的用于减少HMGB1表达的寡核苷酸是单链的。此类结构可包括、但不限于单链RNAi分子。最近的努力已经证明了单链RNAi分子的活性(参见，例如，Matsui等人, Molecular Therapy, 2016, 24(5):946-955)。但是，在某些实施方案中，本文提供的寡核苷酸是反义寡核苷酸(ASO)。反义寡核苷酸是具有核碱基序列的单链寡核苷酸，当以5' 到3' 方向书写时，其包含特定核酸的靶向片段的反向互补物，并且经过适当修饰(例如，作为gapmer)以便在细胞中诱导RNA酶H介导的其靶RNA的裂解或(例如，作为mixmer)以抑制靶mRNA在细胞中的翻译。用于本公开内容的反义寡核苷酸可以以本领域已知的任何合适的方式进行修饰，包括，例如，如在美国专利号9,567,587中所示，其关于反义寡核苷酸的修饰(包括，例如，长度、核碱基(嘧啶、嘌呤)的糖部分、和核碱基的杂环部分的改变)的公开内容通过引用并入本文。此外，几十年来，反义分子已被用于减少特定靶基因的表达(参见，例如，Bennett等人, “Pharmacology of Antisense Drugs,”Ann RevPharmacol Toxicol., 2017, 57:81-105)。
iii. 双链寡核苷酸
用于靶向HMGB1表达(例如，通过RNAi途径)的双链寡核苷酸通常具有相互形成双链体的有义链和反义链。在某些实施方案中，所述有义链和反义链不是共价连接的。但是，在某些实施方案中，所述有义链和反义链是共价连接的。在某些实施方案中，在有义链和反义链之间形成的双链体是至少15 (例如，至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20或至少21)个核苷酸长度。在某些实施方案中，在有义链和反义链之间形成的双链体是在15-30个核苷酸长度(例如，15-30、15-27、15-22、18-22、18-25、18-27、18-30或21-30个核苷酸长度)的范围内。在某些实施方案中，在有义链和反义链之间形成的双链体是15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长度。在某些实施方案中，双链体区域是20个核苷酸长度。在某些实施方案中，在有义链和反义链之间形成的双链体没有跨有义链和/或反义链的整个长度。在某些实施方案中，在有义链和反义链之间的双链体跨有义链或反义链的整个长度。在某些实施方案中，在有义链和反义链之间的双链体跨有义链和反义链的整个长度。
在某些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含具有在SEQ ID NO: 1-13中的任一个中所示的序列的有义链和包含选自SEQ ID NO: 14-26的互补序列的反义链，如在表1中所排列的。
在某些实施方案中，有义链包含在SEQ ID NO: 1中所示的序列且反义链包含在SEQ ID NO: 14中所示的序列。在某些实施方案中，有义链包含在SEQ ID NO: 2中所示的序列且反义链包含在SEQ ID NO: 15中所示的序列。在某些实施方案中，有义链包含在SEQ IDNO: 3中所示的序列且反义链包含在SEQ ID NO: 16中所示的序列。在某些实施方案中，有义链包含在SEQ ID NO: 4中所示的序列且反义链包含在SEQ ID NO: 17中所示的序列。在某些实施方案中，有义链包含在SEQ ID NO: 5中所示的序列且反义链包含在SEQ ID NO:18中所示的序列。在某些实施方案中，有义链包含在SEQ ID NO: 6中所示的序列且反义链包含在SEQ ID NO: 19中所示的序列。在某些实施方案中，有义链包含在SEQ ID NO: 7中所示的序列且反义链包含在SEQ ID NO: 20中所示的序列。在某些实施方案中，有义链包含在SEQ ID NO: 8中所示的序列且反义链包含在SEQ ID NO: 21中所示的序列。在某些实施方案中，有义链包含在SEQ ID NO: 9中所示的序列且反义链包含在SEQ ID NO: 22中所示的序列。在某些实施方案中，有义链包含在SEQ ID NO: 10中所示的序列且反义链包含在SEQID NO: 23中所示的序列。在某些实施方案中，有义链包含在SEQ ID NO: 11中所示的序列且反义链包含在SEQ ID NO: 24中所示的序列。在某些实施方案中，有义链包含在SEQ IDNO: 12中所示的序列且反义链包含在SEQ ID NO: 25中所示的序列。在某些实施方案中，有义链包含在SEQ ID NO: 13中所示的序列且反义链包含在SEQ ID NO: 26中所示的序列。
在某些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含含有在SEQ ID NO: 27-39中的任一个中所示的序列的有义链和含有选自SEQ ID NO: 14-26的互补序列的反义链，如也排列在表2中，包括对有义序列和反义序列的修饰。在某些实施方案中，有义链包含在SEQ ID NO:27中所示的序列且反义链包含在SEQ ID NO: 14中所示的序列。在某些实施方案中，有义链包含在SEQ ID NO: 28中所示的序列且反义链包含在SEQ ID NO: 15中所示的序列。在某些实施方案中，有义链包含在SEQ ID NO: 29中所示的序列且反义链包含在SEQ ID NO: 16中所示的序列。在某些实施方案中，有义链包含在SEQ ID NO: 30中所示的序列且反义链包含在SEQ ID NO: 17中所示的序列。在某些实施方案中，有义链包含在SEQ ID NO: 31中所示的序列且反义链包含在SEQ ID NO: 18中所示的序列。在某些实施方案中，有义链包含在SEQ ID NO: 32中所示的序列且反义链包含在SEQ ID NO: 19中所示的序列。在某些实施方案中，有义链包含在SEQ ID NO: 33中所示的序列且反义链包含在SEQ ID NO: 20中所示的序列。在某些实施方案中，有义链包含在SEQ ID NO: 34中所示的序列且反义链包含在SEQID NO: 21中所示的序列。在某些实施方案中，有义链包含在SEQ ID NO: 35中所示的序列且反义链包含在SEQ ID NO: 22中所示的序列。在某些实施方案中，有义链包含在SEQ IDNO: 36中所示的序列且反义链包含在SEQ ID NO: 23中所示的序列。在某些实施方案中，有义链包含在SEQ ID NO: 37中所示的序列且反义链包含在SEQ ID NO: 24中所示的序列。在某些实施方案中，有义链包含在SEQ ID NO: 38中所示的序列且反义链包含在SEQ ID NO:25中所示的序列。在某些实施方案中，有义链包含在SEQ ID NO: 39中所示的序列且反义链包含在SEQ ID NO: 26中所示的序列。
应当理解，在某些实施方案中，在描述寡核苷酸或其它核酸的结构时可以参考在序列表中呈现的序列。在这样的实施方案中，实际的寡核苷酸或其它核酸可以具有一种或多种替代核苷酸(例如，DNA核苷酸的RNA相应物或RNA核苷酸的DNA相应物)和/或一种或多种修饰的核苷酸和/或一个或多个修饰的核苷酸间键和/或与指定序列相比一种或多种其它修饰，同时保留与指定序列基本上相同或相似的互补特性。
在某些实施方案中，双链的寡核苷酸包含25-核苷酸有义链和27-核苷酸反义链，其当被dicer酶作用后产生掺入进成熟RISC中的反义链。在某些实施方案中，寡核苷酸的有义链长于27个核苷酸(例如，28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸)。在某些实施方案中，寡核苷酸的有义链长于25个核苷酸(例如，26、27、28、29或30个核苷酸)。
在某些实施方案中，在寡核苷酸的有义链和反义链之间形成的双链体的长度可以是12-30个核苷酸(例如，12-30、12-27、15-25、18-30或19-30个个核苷酸)长度。在某些实施方案中，在寡核苷酸的有义链和反义链之间形成的双链体的长度是至少12个核苷酸长度(例如，至少12个、至少15个、至少20个或至少25个核苷酸长度)。在某些实施方案中，在寡核苷酸的有义链和反义链之间形成的双链体的长度是12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长度。
在某些实施方案中，本文提供的寡核苷酸具有一个5’末端，其与其它5’末端相比是热力学上不太稳定的。在某些实施方案中，提供了一种不对称寡核苷酸，其包括在有义链的3’末端的平头末端和在反义链的3’末端的突出端。在某些实施方案中，在反义链上的3’突出端是1-8个核苷酸长度(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个核苷酸长度)。通常，用于RNAi的寡核苷酸具有在反义(引导)链的3’末端上的两个核苷酸的突出端。但是，其它突出端是可能的。在某些实施方案中，突出端是包含长度介于1到6个核苷酸之间的3′突出端，任选地一到五个、一到四个、一到三个、一到两个、二到六个、二到五个、二到四个、二到三个、三到六个、三到五个、三到四个、四到六个、四到五个、五到六个核苷酸，或一、二、三、四、五或六个核苷酸。但是，在某些实施方案中，突出端是包含长度介于1到6个核苷酸之间的5′突出端，任选地为一到五个、一到四个、一到三个、一到两个、二到六个、二到五个、二到四个、二到三个、三到六个、三到五个、三到四个、四到六个、四到五个、五到六个核苷酸，或一、二、三、四、五或六个核苷酸。
在某些实施方案中，修饰反义链的3' 末端上的两个末端核苷酸。在某些实施方案中，在反义链的3’末端上的两个末端核苷酸与靶标互补。在某些实施方案中，在反义链的3'末端上的两个末端核苷酸与靶标不互补。在某些实施方案中，在有切口的四环结构中寡核苷酸的每个3’末端上的两个末端核苷酸是GG。通常，在寡核苷酸每个3’末端的两个末端GG核苷酸中的一个或两个与靶标不互补。
在某些实施方案中，在有义链和反义链之间存在一个或多个(例如，1、2、3、4、5个)错配。如果在有义链和反义链之间存在超过一个错配，则它们可以连续定位(例如，2、3个或更多个在一行中)，或散布在整个互补区域中。在某些实施方案中，有义链的3'-末端含有一个或多个错配。在一个实施方案中，在有义链的3' 末端掺入两个错配。在某些实施方案中，寡核苷酸的有义链的3'-末端区段的碱基错配或去稳定会提高RNAi中的合成双链体的效力，这可能通过促进Dicer的加工。
a. 反义链
在某些实施方案中，寡核苷酸的反义链可以被称作“引导链”。例如，如果反义链可以与RNA诱导的沉默复合物(RISC)衔接并与Argonaut蛋白结合，或者与一种或多种相似因子衔接或结合，并指导靶基因的沉默，则它可以被称作引导链。在某些实施方案中，与引导链互补的有义链可以被称作“乘客链”。
在某些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含至多50个核苷酸长度(例如，至多30、至多27、至多25、至多21或至多19个核苷酸长度)的反义链。在某些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含至少12个核苷酸长度(例如，至少12、至少15、至少19、至少21、至少25或至少27个核苷酸长度)的反义链。在某些实施方案中，本文中公开的寡核苷酸的反义链是在12-50或12-30 (例如，12-30、11-27、11-25、15-21、15-27、17-21、17-25、19-27或19-30)个核苷酸长度的范围内。在某些实施方案中，本文中公开的任一个寡核苷酸的反义链是12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸长度。
在某些实施方案中，本文中公开的寡核苷酸包含含有在SEQ ID NO: 14-26中的任一个中所示的序列的反义链。在某些实施方案中，寡核苷酸包含反义链，所述反义链包含在SEQ ID NO: 14-26中的任一个所示的任何序列的在12-20个核苷酸(例如，12-20、12-18、12-16、12-14、14-20、14-18、14-16、16-20、16-18或18-20个核苷酸)长度的范围内的连续核苷酸序列。在某些实施方案中，寡核苷酸包含反义链，所述反义链包含12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸长度的在SEQ ID NO: 14-26中的任一个中所示的序列的连续核苷酸序列。在某些实施方案中，寡核苷酸包含由在SEQ ID NO: 14-26中的任一个中所示的序列组成的反义链。
b. 有义链
在某些实施方案中，双链寡核苷酸可以具有至多40个核苷酸长度(例如，至多40、至多35、至多30、至多27、至多25、至多21、至多19、至多17或至多12个核苷酸长度)的有义链。在某些实施方案中，寡核苷酸可以具有至少12个核苷酸长度(例如，至少12、至少15、至少19、至少21、至少25、至少27、至少30、至少35或至少38个核苷酸长度)的有义链。在某些实施方案中，寡核苷酸可以具有在12-50 (例如，12-40、12-36、12-32、12-28、15-40、15-36、15-32、15-28、17-21、17-25、19-27、19-30、20-40、22-40、25-40或32-40)个核苷酸长度的范围内的有义链。在某些实施方案中，寡核苷酸可以具有12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸长度的有义链。在某些实施方案中，寡核苷酸的有义链长于27个核苷酸(例如，28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸)。在某些实施方案中，寡核苷酸的有义链长于25个核苷酸(例如，26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个核苷酸)。在某些实施方案中，有义链是20个核苷酸长度。在某些实施方案中，有义链是36个核苷酸长度。
在某些实施方案中，本文中公开的寡核苷酸包含在SEQ ID NO: 1-13和27-39中的任一个中所示的有义链序列。在某些实施方案中，寡核苷酸具有有义链，所述有义链包含在SEQ ID NO: 1-13和27-39中的任一个中所示的序列的至少12 (例如，至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22或至少23)个连续核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸具有有义链，所述有义链包含在SEQ ID NO: 1-13和27-39中的任一个所示的任何序列的在7-36个核苷酸(例如，12-30、12-27、12-22、15-25、17-21、18-27、19-27、20-36或15-36个核苷酸)长度的范围内的连续核苷酸序列。在某些实施方案中，寡核苷酸具有有义链，所述有义链包含12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个核苷酸长度的在SEQ ID NO: 1-13和27-39中的任一个中所示的序列的连续核苷酸序列。在某些实施方案中，寡核苷酸具有由在SEQ ID NO: 1-13和27-39中的任一个中所示的序列组成的有义链。
在某些实施方案中，有义链包含在其3’-末端的茎-环。在某些实施方案中，有义链包含在其5’-末端的茎-环。在某些实施方案中，包含茎环的链是在2-66个核苷酸长度(例如，2-66、10-52、14-40、2-30、4-26、8-22、12-18、10-22、14-26或14-30个核苷酸长度)的范围内。在某些实施方案中，包含茎环的链是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长度。在某些实施方案中，茎包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个核苷酸长度的双链体。在某些实施方案中，茎-环为分子提供更好的抗降解(例如，酶促降解)保护并促进递送至靶细胞的靶向特性。例如，在某些实施方案中，环提供添加的核苷酸，可以在其上进行修饰而不显著影响寡核苷酸的基因表达抑制活性。在某些实施方案中，本文提供了一种寡核苷酸，其中有义链包含(例如，在其3’-末端)如S1-L-S2所示的茎-环，其中S1与S2互补，并且其中L在S1和S2之间形成至多10个核苷酸长度(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸长度)的环。
在某些实施方案中，茎-环的环(L)是四环(例如，在有切口的四环结构内)。四环可以含有核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、修饰的核苷酸和它们的组合。通常，四环具有4到5个核苷酸。但是，在某些实施方案中，四环包含3至6个核苷酸或由其组成，并且通常由4至5个核苷酸组成。在某些实施方案中，四环包含三个、四个、五个或六个核苷酸或由其组成。
iv. 寡核苷酸修饰
可以以各种方式修饰寡核苷酸以改善或控制特异性、稳定性、递送、生物利用度、对核酸酶降解的抗性、免疫原性、碱基配对特性、RNA分布和细胞摄取以及与治疗或研究用途相关的其它特征(参见，例如，Bramsen等人, Nucleic Acids Res., 2009, 37:2867-2881; Bramsen和Kjems, Frontiers in Genetics, 2012, 3:1-22)。因此，在某些实施方案中，本公开内容的寡核苷酸可以包括一种或多种合适的修饰。在某些实施方案中，修饰的核苷酸在其碱基(或核碱基)、糖(例如，核糖、脱氧核糖)或磷酸酯基团中具有修饰。
在寡核苷酸上的修饰的数量和那些核苷酸修饰的位置可能影响寡核苷酸的特性。例如，通过将寡核苷酸缀合到或包含在脂质纳米颗粒(LNP)或类似载体中，可以在体内递送寡核苷酸。但是，当寡核苷酸不受LNP或类似载体保护时，修饰至少一些核苷酸可能是有利的。因此，在本文提供的任何寡核苷酸的某些实施方案中，寡核苷酸的所有或基本上所有的核苷酸都被修饰。在某些实施方案中，超过一半的核苷酸被修饰。在某些实施方案中，少于一半的核苷酸被修饰。通常，在裸递送的情况下，每个糖在2′-位置被修饰。这些修饰可以是可逆的或不可逆的。在某些实施方案中，本文公开的寡核苷酸具有足以引起所需特征(例如，保护免于酶促降解、在体内施用后靶向所需细胞的能力和/或热力学稳定性)的修饰核苷酸的数量和类型。
a. 糖修饰
在某些实施方案中，修饰的糖(本文中也称为糖类似物)包括修饰的脱氧核糖或核糖部分，例如，其中一个或多个修饰发生在糖的2′、3′、4′和/或5′碳位置。在某些实施方案中，修饰的糖还可以包括非天然替代碳结构，诸如存在于锁核酸(“LNA”) (参见，例如，Koshkin等人, Tetrahedron, 1998, 54:3607-3630)、非锁核酸(“UNA”) (参见，例如，Snead等人, Molecular Therapy - Nucleic Acids, 2013, 2, e103)和桥连核酸(“BNA”)(参见，例如，Imanishi和Obika, The Royal Society of Chemistry, Chem. Commun.,2002, 16:1653-1659)中的那些。为了它们关于糖修饰的公开内容，Koshkin等人、Snead等人和Imanishi和Obika通过引用并入本文。
在某些实施方案中，在糖中的核苷酸修饰包含2’-修饰。2’-修饰可以是2’-氨基乙基、2’-氟、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸。通常，修饰是2’-氟、2’-O-甲基或2’-O-甲氧基乙基。在某些实施方案中，在糖中的修饰包含糖环的修饰，其可以包含糖环的一个或多个碳的修饰。例如，核苷酸的糖的修饰可以包含与糖的1’-碳或4’-碳连接的糖的2’-氧，或通过亚乙基或亚甲基桥与1’-碳或4’-碳连接的2’-氧。在某些实施方案中，修饰的核苷酸具有缺少2’-碳至3’-碳键的无环糖。在某些实施方案中，修饰的核苷酸具有硫醇基团，例如，在糖的4’位置。
在某些实施方案中，本文描述的寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸(例如，至少1、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60或更多)。在某些实施方案中，寡核苷酸的有义链包含至少一个修饰的核苷酸(例如，至少1、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35或更多)。在某些实施方案中，寡核苷酸的反义链包含至少一个修饰的核苷酸(例如，至少1、至少5、至少10、至少15、至少20或更多)。
在某些实施方案中，寡核苷酸的有义链的所有核苷酸被修饰。在某些实施方案中，寡核苷酸的反义链的所有核苷酸被修饰。在某些实施方案中，寡核苷酸的所有核苷酸(即，有义链和反义链)被修饰。在某些实施方案中，经修饰的核苷酸包含2′-修饰(例如，2′-氟或2′-O-甲基)。
本公开内容提供了具有不同修饰模式的寡核苷酸。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含具有在SEQ ID NO: 27-39中的任一个中所示的序列的有义链序列和具有在SEQID NO: 14-26中的任一个中所示的序列的反义链序列。在某些实施方案中，对于这些寡核苷酸，有义链的位置1、2、4、6、7、12、14、16、18-27和31-36中的一个或多个、和/或反义链的位置1、4、6、8、9、11、13、15、18和20-22中的一个或多个被2′-O-甲基修饰。在某些实施方案中，有义链的位置1、2、4、6、7、12、14、16、18-27和31-36的全部和反义链的位置1、4、6、8、9、11、13、15、18和20-22的全部被2′-O-甲基修饰。在某些实施方案中，有义链的位置3、5、8-11、13、15和17中的一个或多个和/或反义链的位置2、3、5、7、10、12、14、16、17和19中的一个或多个被2′-氟修饰。在某些实施方案中，有义链的位置3、5、8-11、13、15和17的全部、和反义链的位置2、3、5、7、10、12、14、16、17和19的全部被2′-氟修饰。在某些实施方案中，有义链的位置1、2、4、6、7、12、14、16、18-27和31-36的全部、反义链的位置1、4、6、8、9、11、13、15、18和20-22的全部被2′-O-甲基修饰, 有义链的位置3、5、8-11、13、15和17的全部和反义链的位置2、3、5、7、10、12、14、16、17和19的全部被2′-氟修饰。
在某些实施方案中，对于包含具有在SEQ ID NO: 27-39中的任一个中所示的序列的有义链和具有在SEQ ID NO: 14-26中的任一个中所示的序列的反义链的寡核苷酸，有义链的位置1-7、12-27和31-36中的一个或多个和/或反义链的位置1、4、6、8、9、11-13和15-22中的一个或多个被2′-O-甲基修饰。在某些实施方案中，有义链的位置1-7、12-27和31-36的全部和反义链的位置1、4、6、8、9、11-13和15-22的全部被2′-O-甲基修饰。在某些实施方案中，有义链的位置8-11中的一个或多个和/或反义链的位置2、3、5、7、10和14中的一个或多个被2′-氟修饰。在某些实施方案中，有义链的位置8-11的全部和反义链的位置2、3、5、7、10和14的全部被2′-氟修饰。在某些实施方案中，有义链的位置1-7、12-27和31-36的全部、反义链的位置1、4、6、8、9、11-13和15-22的全部被2′-O-甲基修饰，有义链的位置8-11的全部和反义链的位置2、3、5、7、10和14的全部被2′-氟修饰。
在某些实施方案中，对于包含具有在SEQ ID NO: 27-39中的任一个中所示的序列的有义链和具有在SEQ ID NO: 14-26中的任一个中所示的序列的反义链的寡核苷酸，有义链的位置1、2、4-7、9、11、14-16、18-27和31-36中的一个或多个和/或反义链的位置1、6、8、9、11、13、15、18和20-22中的一个或多个被2′-O-甲基修饰。在某些实施方案中，有义链的位置1、2、4-7、9、11、14-16、18-27和31-36的全部和反义链的位置1、6、8、9、11、13、15、18和20-22的全部被2′-O-甲基修饰。在某些实施方案中，有义链的位置3、8、10、12、13和17中的一个或多个和/或反义链的位置2-5、7、10、12、14、16、17和19中的一个或多个被2′-氟修饰。在某些实施方案中，有义链的位置3、8、10、12、13和17的全部和反义链的位置2-5、7、10、12、14、16、17和19的全部被2′-氟修饰。
在某些实施方案中，末端3’-末端基团(例如，3’-羟基)与磷酸酯基团或其它基团一起，它们可以用于例如连接接头、衔接物或标记，或用于将寡核苷酸直接连接至另一个核酸。
b. 5’末端磷酸酯
在某些实施方案中，寡核苷酸的5’-端磷酸酯基团会增强与Argonaute 2的相互作用。但是，包含5’-磷酸酯基团的寡核苷酸可能容易被磷酸酶或其它酶降解，这可以限制它们的体内生物利用度。在某些实施方案中，寡核苷酸包括对这样的降解具有抗性的5’磷酸酯的类似物。在某些实施方案中，磷酸酯类似物可以是氧甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯。在某些实施方案中，寡核苷酸链的5’末端连接至模拟天然5’-磷酸酯基团的静电和空间特性的化学部分(“磷酸酯模仿物”) (参见，例如，Prakash等人,Nucleic AcidsRes., 2015, 43(6):2993-3011，其关于磷酸酯类似物的内容通过引用并入本文)。已经开发了许多可以连接至5’末端的磷酸酯模仿物(参见，例如，美国专利号8,927,513，其关于磷酸酯类似物的内容通过引用并入本文)。已经针对寡核苷酸的5’末端开发了其它修饰(参见，例如，国际专利公开WO2011133871，其关于磷酸酯类似物的内容通过引用并入本文)。在某些实施方案中，羟基连接至寡核苷酸的5’末端。
在某些实施方案中，寡核苷酸具有在糖的4’-碳位置处的磷酸酯类似物(被称作“4’-磷酸酯类似物”) (参见，例如，国际专利公开WO2018045317，标题为4’-PhosphateAnalogs and Oligonucleotides Comprising the Same，其关于磷酸酯类似物的内容通过引用并入本文)。在某些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含在5’-端核苷酸处的4’-磷酸酯类似物。在某些实施方案中，磷酸酯类似物是氧甲基膦酸酯，其中氧甲基的氧原子结合至糖部分(例如，在其4’-碳处)或其类似物。在其它实施方案中，4’-磷酸酯类似物是硫基甲基膦酸酯或氨基甲基膦酸酯，其中硫基甲基的硫原子或氨基甲基的氮原子结合至糖部分或其类似物的4’-碳。在某些实施方案中，4’-磷酸酯类似物是氧甲基膦酸酯。在某些实施方案中，氧甲基膦酸酯由式-O-CH2-PO(OH)2或-O-CH2-PO(OR)2表示，其中R独立地选自H、CH3、烷基、CH2CH2CN、CH2OCOC(CH3)3、CH2OCH2CH2Si(CH3)3或保护基。在某些实施方案中，所述烷基是CH2CH3。更通常地，R独立地选自H、CH3或CH2CH3。
在某些实施方案中，连接至寡核苷酸的磷酸酯类似物是甲氧基膦酸酯(MOP)。在某些实施方案中，连接至寡核苷酸的磷酸酯类似物是5′单甲基保护的MOP。在某些实施方案中，可以使用包含磷酸酯类似物的下述尿苷核苷酸，例如，在引导(反义)链的第一个位置：
所述修饰的核苷酸被称作[Me膦酸酯-4O-mU]或5'-甲氧基膦酸酯-4'氧基- 2'-O-甲基尿苷。
c. 修饰的核苷酸内键
在某些实施方案中，磷酸酯修饰或取代可以导致寡核苷酸包含至少一个(例如，至少1个、至少2个、至少3个或至少5个)包含修饰的核苷酸间键。在某些实施方案中，本文中公开的寡核苷酸中的任一种包含1-10 (例如，1-10、2-8、4-6、3-10、5-10、1-5、1-3或1-2)个修饰的核苷酸间键。在某些实施方案中，本文中公开的寡核苷酸中的任一种包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个修饰的核苷酸间键。
修饰的核苷酸间键可以是二硫代磷酸酯键、硫代磷酸酯键、磷酸三酯键、硫羰烷基膦酸酯键、硫代烷基磷酸三酯键、氨基亚磷酸酯键、膦酸酯键或硼代磷酸酯键。在某些实施方案中，本文中公开的任一种寡核苷酸的至少一个修饰的核苷酸间键是硫代磷酸酯键。
在某些实施方案中，本文描述的寡核苷酸具有以下一个或多个之间的硫代磷酸酯键：有义链的位置1和2，反义链的位置1和2，反义链的位置2和3，反义链的位置3和4，反义链的位置20和21，和反义链的位置21和22。在某些实施方案中，本文描述的寡核苷酸具有以下每个之间的硫代磷酸酯键：有义链的位置1和2，反义链的位置1和2，反义链的位置2和3，反义链的位置20和21，和反义链的位置21和22。
d. 碱基修饰
在某些实施方案中，本文提供的寡核苷酸具有一个或更多个经修饰的核碱基。在某些实施方案中，经修饰的核碱基(在本文中也被称作碱基类似物)连接在核苷酸糖部分的1′位置。在某些实施方案中，经修饰的核碱基是含氮碱基。在某些实施方案中，经修饰的核碱基不含有氮原子(参见，例如，美国专利公开20080274462)。在某些实施方案中，经修饰的核苷酸包含通用碱基。但是，在某些实施方案中，修饰的核苷酸不含有核碱基(脱碱基)。
在某些实施方案中，通用碱基是位于修饰的核苷酸中核苷酸糖部分的1′位置的杂环部分，或核苷酸糖部分取代中的等效位置，当存在于双链体中时，其可以位于超过一种类型的碱基的对侧，而不显著改变双链体的结构。在某些实施方案中，相对于与靶核酸完全互补的参考单链核酸(例如，寡核苷酸)，含有通用碱基的单链核酸与靶核酸形成双链体，其具有与用互补核酸形成的双链体相比更低的Tm。但是，在某些实施方案中，与其中通用碱基已被碱基替换以产生单个错配的参考单链核酸相比，含有通用碱基的单链核酸与靶核酸形成双链体，其具有比用包含错配碱基的核酸形成的双链体更高的Tm。
通用结合核苷酸的非限制性实例包括肌苷、1-β-D-呋喃核糖基-5-硝基吲哚和/或1-β-D-呋喃核糖基-3-硝基吡咯(美国专利公开号20070254362; Van Aerschot等人,Nucleic Acids Res.1995, 23(21):4363-70; Loakes等人, Nucleic Acids Res. 1995,23(13):2361-6; Loakes和Brown, Nucleic Acids Res., 1994, 22(20):4039-43。为了它们与碱基修饰有关的公开内容，前述每一篇通过引用并入本文)。
e. 可逆的修饰
虽然可以进行某些修饰以在寡核苷酸到达靶细胞之前保护其免于体内环境，但一旦寡核苷酸到达靶细胞的胞质溶胶，它们就可以降低寡核苷酸的效力或活性。可以进行可逆修饰，使得分子在细胞外保留所需的特性，然后在进入细胞的胞质环境后将其去除。例如，通过细胞内酶的作用或通过细胞内部的化学条件(例如，通过细胞内谷胱甘肽的还原)，可以去除可逆修饰。
在某些实施方案中，可逆地修饰的核苷酸包含谷胱甘肽敏感部分。通常，核酸分子已用环状二硫键部分进行化学修饰，以掩盖由核苷酸间二磷酸酯键产生的负电荷并改善细胞摄取和核酸酶抗性(参见，例如，美国专利公开20110294869, 国际专利公开WO2015188197; Meade等人, Nature Biotechnology, 2014, 32:1256-1263；国际专利公开WO2014088920；关于它们对这样的修饰的公开内容，它们中的每一篇通过引用并入)。核苷酸间二磷酸酯键的这种可逆修饰被设计为通过胞质溶胶的还原环境(例如，谷胱甘肽)在细胞内裂解。早期的例子包括中和磷酸三酯修饰，据报道所述修饰在细胞内可裂解(Dellinger等人, J. Am. Chem. Soc., 2003, 125:940-950)。
在某些实施方案中，这样的可逆的修饰允许在体内施用期间保护(例如，通过血液和/或细胞的溶酶体/胞内体隔室运输)，其中寡核苷酸将暴露于核酸酶和其它恶劣的环境条件(例如，pH)。当释放到其中谷胱甘肽水平高于细胞外空间的细胞的胞质溶胶中时，修饰被逆转，且结果是裂解的寡核苷酸。与使用不可逆的化学修饰可得到的选项相比，使用可逆的、谷胱甘肽敏感的部分，可将在空间上更大的化学基团引入感兴趣的寡核苷酸中。这是因为，这些较大的化学基团将在胞质溶胶中被去除，且因此不会干扰细胞的胞质溶胶内的寡核苷酸的生物活性。因此，可以对这些较大的化学基团进行工程改造以赋予核苷酸或寡核苷酸各种优点，诸如核酸酶抗性、亲脂性、电荷、热稳定性、特异性和降低的免疫原性。在某些实施方案中，谷胱甘肽敏感部分的结构可以被工程改造以改变其释放的动力学。
在某些实施方案中，谷胱甘肽敏感部分连接至核苷酸的糖。在某些实施方案中，谷胱甘肽敏感部分连接至修饰的核苷酸的糖的2’碳。在某些实施方案中，谷胱甘肽敏感部分位于糖的5'-碳处，特别是当修饰的核苷酸是寡核苷酸的5'-端核苷酸时。在某些实施方案中，谷胱甘肽敏感部分位于糖的3'-碳处，特别是当修饰的核苷酸是寡核苷酸的3'-端核苷酸时。在某些实施方案中，谷胱甘肽敏感部分包含磺酰基(参见，例如，国际专利公开WO2018039364，关于其有关的公开内容，它们的内容通过引用并入本文)。
v. 靶向配体
在某些实施方案中，可能合乎需要的是，将本公开内容的寡核苷酸靶向一种或多种细胞或一种或多种器官。这样的策略可以帮助避免在其它器官中的不希望的影响，或可以避免寡核苷酸过度损失到对寡核苷酸无益的细胞、组织或器官。因此，在某些实施方案中，本文公开的寡核苷酸可以被修饰以促进特定组织、细胞或器官的靶向，例如以促进寡核苷酸向肝脏的递送。在某些实施方案中，可以修饰本文公开的寡核苷酸以促进寡核苷酸向肝脏的肝细胞的递送。在某些实施方案中，寡核苷酸包含缀合至一种或多种靶向配体的核苷酸。
靶向配体可以包含碳水化合物、氨基糖、胆固醇、肽、多肽、蛋白或蛋白的一部分(例如，抗体或抗体片段)或脂质。在某些实施方案中，靶向配体是适体。例如，靶向配体可以是用于靶向肿瘤脉管系统或神经胶质瘤细胞的RGD肽、靶向肿瘤脉管系统或间质(stoma)的CREKA肽、转铁蛋白(transferring)、乳铁蛋白或靶向在CNS脉管系统上表达的转铁蛋白受体的适体、或靶向神经胶质瘤细胞上的EGFR的抗-EGFR抗体。在某些实施方案中，靶向配体是一个或多个GalNAc部分。
在某些实施方案中，寡核苷酸的1个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个)核苷酸各自缀合至单独的靶向配体。在某些实施方案中，寡核苷酸的2至4个核苷酸各自缀合至单独的靶向配体。在某些实施方案中，靶向配体缀合至在有义或反义链的任一端的2至4个核苷酸(例如，配体缀合至有义或反义链的5’或3’末端的2至4个核苷酸突出端或延伸)，使得靶向配体类似于牙刷的刷毛，并且寡核苷酸类似于牙刷。例如，寡核苷酸可以在有义链的5’或3’末端包含茎-环，且茎的环的1、2、3或4个核苷酸可以单独缀合至靶向配体。
在某些实施方案中，合乎需要的是，将减少HMGB1表达的寡核苷酸靶向受试者的肝脏的肝细胞。任意合适的肝细胞靶向部分可以用于该目的。
GalNAc是无唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的高亲和力配体，其主要在肝细胞的窦面上表达，并且在含有末端半乳糖或N-乙酰基半乳糖胺残基的循环糖蛋白(无唾液酸糖蛋白)的结合、内化和随后清除中起主要作用。GalNAc部分与本公开内容的寡核苷酸的缀合(间接或直接)可用于将这些寡核苷酸靶向在这些肝细胞上表达的ASGPR。
在某些实施方案中，本公开内容的寡核苷酸直接地或间接地缀合至单价GalNAc。在某些实施方案中，寡核苷酸直接地或间接地缀合至超过一个单价GalNAc (例如，缀合至2、3或4个单价GalNAc部分，且通常缀合至3或4个单价GalNAc部分)。在某些实施方案中，本公开内容的寡核苷酸缀合至一个或多个二价GalNAc、三价GalNAc或四价GalNAc部分。
在某些实施方案中，寡核苷酸的1个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个)核苷酸各自缀合至GalNAc部分。在某些实施方案中，茎-环的环(L)的2-4个核苷酸各自缀合至单独的GalNAc。在某些实施方案中，靶向配体缀合至在有义或反义链的末端处的2-4个核苷酸(例如，配体缀合至在有义或反义链的5’或3’末端上的2-4个核苷酸的突出端或延伸)，使得GalNAc部分类似于牙刷的刷毛，并且寡核苷酸类似于牙刷。例如，寡核苷酸可以在有义链的5’或3’末端包含茎-环，且茎的环的1、2、3或4个核苷酸可以单独缀合至GalNAc部分。在某些实施方案中，GalNAc部分缀合至有义链的核苷酸。例如，四个GalNAc部分可以缀合至有义链的四环中的核苷酸，其中每个GalNAc部分缀合至一个核苷酸。
在某些实施方案中，本文的寡核苷酸包含连接至胍核苷酸的单价GalNAc，其被称作[ademG-GalNAc]或2'-氨基二乙氧基甲醇-胍-GalNAc，如下所示：
在某些实施方案中，本文的寡核苷酸包含连接至腺嘌呤核苷酸的单价GalNAc，其被称作[ademA-GalNAc]或2'-氨基二乙氧基甲醇-腺嘌呤-GalNAc，如下所示。
对于从5′至3′包含核苷酸序列GAAA (L = 接头，X = 杂原子)茎连接点的环，下面显示了这样的缀合的一个例子。这样的环可以存在于，例如，图1B所示的分子的位置27-30处。在化学式中，
用于描述与寡核苷酸链的连接点。
适当的方法或化学(例如，点击化学)可以用于将靶向配体连接至核苷酸。在某些实施方案中，使用点击接头将靶向配体缀合至核苷酸。在某些实施方案中，使用基于缩醛的接头将靶向配体缀合至本文所述的任一种寡核苷酸的核苷酸。基于缩醛的接头公开在例如国际专利公开WO2016100401中，其关于此类接头的内容通过引用并入本文。在某些实施方案中，接头是不稳定的接头。但是，在其它实施方案中，接头是稳定的。“不稳定的接头”表示可以例如通过酸性pH切割的接头。“稳定的接头”表示不可被切割的接头。
下面显示了从5' 至3' 包含核苷酸GAAA的环的一个例子，其中使用缩醛接头将GalNAc部分连接至环的核苷酸。例如，这样的环可以存在于图10中描述的分子的位置27-30处。在化学式中，
是与寡核苷酸链的连接点。
任何适当的方法或化学(例如，点击化学)可以用于将靶向配体连接至核苷酸。在某些实施方案中，使用点击接头将靶向配体缀合至核苷酸。在某些实施方案中，使用基于缩醛的接头将靶向配体缀合至本文所述的任一种寡核苷酸的核苷酸。基于缩醛的接头公开在例如国际专利公开WO2016100401中，其关于此类接头的内容通过引用并入本文。在某些实施方案中，接头是不稳定的接头。在其它实施方案中，接头是稳定的。
在某些实施方案中，在靶向配体(例如，GalNAc部分)和双链寡核苷酸之间提供双链体延伸(例如，至多3、4、5或6个碱基对长度的双链体延伸)。
III. 制剂
已经开发了多种制剂以促进寡核苷酸使用。例如，使用使降解最小化、促进递送和/或摄取或为制剂中的寡核苷酸提供另一种有益特性的制剂，可以将寡核苷酸递送至受试者或细胞环境。在某些实施方案中，本文提供了包含寡核苷酸(例如，单链或双链寡核苷酸)以减少HMGB1表达的组合物。可以适当地配制这样的组合物，使得当施用于受试者时，无论是进入靶细胞的直接环境中还是全身施用，足够部分的寡核苷酸进入细胞以减少HMGB1表达。多种合适的寡核苷酸制剂中的任一种可以用于递送寡核苷酸以如本文公开的减少HMGB1。在某些实施方案中，将寡核苷酸配制在缓冲溶液诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、脂质体、胶束结构和衣壳中。
具有阳离子脂质的寡核苷酸制剂可以用于促进寡核苷酸向细胞中的转染。例如，可以使用阳离子脂质，诸如脂质体转染、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子(例如，聚赖氨酸)。合适的脂质包括Oligofectamine、Lipofectamine (Life Technologies)、NC388(Ribozyme Pharmaceuticals, Inc., Boulder, Colo.)或FuGene 6 (Roche)，它们都可以根据生产商的说明书使用。
因此，在某些实施方案中，制剂包含脂质纳米颗粒。在某些实施方案中，赋形剂包括脂质体、脂质、脂质复合物、微球、微粒、纳米球或纳米颗粒，或者可以另外配制用于施用给有此需要的受试者的细胞、组织、器官或身体(参见，例如，Remington: The Science andPractice of Pharmacy,第22版, Pharmaceutical Press, 2013)。
在某些实施方案中，本文公开的制剂包含赋形剂。在某些实施方案中，赋形剂赋予组合物改善的稳定性、改善的吸收、改善的溶解性和/或活性成分的治疗增强。在某些实施方案中，赋形剂是缓冲剂(例如，柠檬酸钠、磷酸钠、tris碱或氢氧化钠)或媒介物(例如，缓冲溶液、矿脂、二甲亚砜或矿物油)。在某些实施方案中，将寡核苷酸低压冻干以延长其贮存期限，并然后在使用(例如，施用给受试者)前制成溶液。因此，包含本文所述的任一种寡核苷酸的组合物中的赋形剂可以是冷冻保护剂(例如，甘露醇、乳糖、聚乙二醇或聚乙烯基吡咯烷酮)或塌陷温度调节剂(例如，葡聚糖、聚蔗糖或明胶)。
在某些实施方案中，将药物组合物配制成与它的预期施用途径相容。施用途径的例子包括胃肠外施用，例如静脉内、真皮内、皮下、经口(例如、吸入)、透皮(局部)、透粘膜和直肠施用。
适合于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散体以及用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉剂。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑制细菌的水、Cremophor EL.TM. (BASF, Parsippany, N.J., USA)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇诸如甘露醇、山梨醇、氯化钠。可以如下制备无菌注射溶液：将所需量的寡核苷酸掺入具有上文所列举的一种成分或成分的组合(根据需要)的选定溶剂中，随后过滤除菌。
在某些实施方案中，组合物可以含有至少约0.1%的治疗剂(例如，用于减少HMGB1表达的寡核苷酸)或更多，尽管活性成分的百分比可为总组合物的重量或体积的约1%至约80%或更多。制备这类药物制剂的领域技术人员将考虑诸如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产品贮存期限以及其它药理学考虑等因素，因此可能需要多种剂量和治疗方案。
即使许多实施方案涉及本文公开的任何寡核苷酸的肝脏靶向递送，但也考虑其它组织的靶向。
IV. 使用方法
i. 降低细胞中的HMGB1表达
在某些实施方案中，提供了用于向细胞递送有效量的本文公开的任一种寡核苷酸以用于降低细胞中HMGB1表达的目的的方法。本文提供的方法可用于任何合适的细胞类型。在某些实施方案中，细胞是表达HMGB1的任何细胞(例如，肝细胞、巨噬细胞、单核细胞-衍生的细胞、前列腺癌细胞、脑细胞、内分泌组织、骨髓、淋巴结、肺、胆囊、肝、十二指肠、小肠、胰腺、肾、胃肠道、膀胱、脂肪和软组织和皮肤)。在某些实施方案中，细胞是已经从受试者获得的原代细胞，并且其可能已经经历有限次数的传代，使得细胞基本上保持天然表型特性。在某些实施方案中，向其递送寡核苷酸的细胞是离体的或体外的(例如，可以递送至培养中的细胞或细胞所在的生物体)。在具体实施方案中，提供了用于将有效量的本文公开的任一种寡核苷酸递送给细胞以仅在肝细胞中减少HMGB1的表达的方法。
在某些实施方案中，可以使用合适的核酸递送方法引入本文公开的寡核苷酸，包括注射含有寡核苷酸的溶液、用被寡核苷酸覆盖的颗粒轰击、将细胞或生物体暴露于含有寡核苷酸的溶液、或在有寡核苷酸存在下细胞膜的电穿孔。可以使用将寡核苷酸递送至细胞的其它合适方法，例如脂质介导的载体运输、化学介导的运输和阳离子脂质体转染诸如磷酸钙等。
抑制的后果可以通过评价细胞或受试者的一种或多种特性的适当测定来确认，或者通过评价指示HMGB1表达的分子(例如，RNA、蛋白)的生化技术来确认。在某些实施方案中，通过与适当的对照(例如，未向其递送寡核苷酸或已向其递送阴性对照的细胞或细胞群体中的HMGB1表达水平)对比表达水平(例如，HMGB1的mRNA或蛋白水平)，评价本文提供的寡核苷酸减少HMGB1表达水平的程度。在某些实施方案中，HMGB1表达的适当对照水平可以是预定的水平或值，使得不需要每次都测量对照水平。预定的水平或值可以采用多种形式。在某些实施方案中，预定的水平或值可以是单个截止值，诸如中值或平均值。
在某些实施方案中，如本文所述的寡核苷酸的施用导致细胞中HMGB1表达水平的降低。在某些实施方案中，HMGB1表达水平的降低可以是与HMGB1的适当对照水平相比降低至1%或更低、5%或更低、10%或更低、15%或更低、20%或更低、25%或更低、30%或更低、35%或更低、40%或更低、45%或更低、50%或更低、55%或更低、60%或更低、70%或更低、80%或更低或90%或更低。适当对照水平可以是未与本文所述的寡核苷酸接触的细胞或细胞群体中的HMGB1表达水平。在某些实施方案中，在有限时间段之后评估根据本文公开的方法将寡核苷酸递送至细胞的效果。例如，可以在细胞中分析HMGB1的水平至少8小时、12小时、18小时、24小时；或在将寡核苷酸引入细胞后至少1、2、3、4、5、6、7或14天。
在某些实施方案中，以转基因的形式递送寡核苷酸，所述转基因被工程改造以在细胞中表达寡核苷酸(例如，其有义链和反义链)。在某些实施方案中，使用经工程改造成表达本文公开的任何寡核苷酸的转基因递送寡核苷酸。可以使用病毒载体(例如，腺病毒、逆转录病毒、痘苗病毒、痘病毒、腺伴随病毒或单纯疱疹病毒)或非病毒载体(例如，质粒或合成mRNA)来递送转基因。在某些实施方案中，可以将转基因直接注射给受试者。
ii. 治疗方法
本公开内容的方面涉及减少HMGB1表达以减弱受试者中肝纤维化的发作或进展的方法。在某些实施方案中，所述方法可以包括给有此需要的受试者施用有效量的本文中公开的寡核苷酸中的任一种。例如，此类治疗可用于例如减缓或阻止任何类型的肝纤维化。本公开内容提供了处理处于与肝纤维化和/或肝炎症相关的疾病或障碍的风险中(或对其易感)的受试者的预防和治疗方法。
本发明的化合物排它地选择性地靶向肝脏中的HMGB1 mRNA。与其它NASH疗法相比，这种选择性有望增加本发明的HMGB1抑制剂的效力，同时减少脱靶相互作用和潜在的副作用。
在某些方面，本公开内容提供了通过给受试者施用治疗剂(例如，寡核苷酸或编码它们的载体或转基因)来预防受试者中如本文中所述的疾病或障碍的方法。在某些实施方案中，要治疗的受试者是将在治疗上受益于HMGB1蛋白的量的减少(例如在肝脏中)的受试者。可以鉴定处于疾病或障碍的风险中的受试者，例如通过本领域已知的诊断或预后测定中的一种或组合(例如，肝纤维化和/或肝炎症的鉴定)。预防剂的施用可以发生在疾病或障碍的特征性症状的检测或表现之前，从而预防疾病或障碍，或者可替换地，延迟其进展。
在某些实施方案中，本公开内容提供了使用本发明的RNAi寡核苷酸治疗患有或疑似患有肝病症例如胆汁郁积性肝病、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的受试者的方法。
在某些实施方案中，本公开内容提供了用于治疗患有或疑似患有肝病症例如胆汁郁积性肝病、NAFLD和NASH的受试者的本文描述的RNAi寡核苷酸。
在某些实施方案中，本公开内容提供了用于制备药物的RNAi，所述药物用于治疗患有或疑似患有肝病症例如胆汁郁积性肝病、NAFLD和非酒精性脂肪性肝炎NASH的受试者。
本文所述的方法通常包括向受试者施用有效量的寡核苷酸，即能够产生所需治疗结果的量。治疗上可接受的量可以是能够治疗疾病或障碍的量。任何一个受试者的适当剂量将取决于某些因素，包括受试者的大小、体表面积、年龄、要施用的特定组合物、组合物中的活性成分、施用的时间和途径、一般健康状况、和并行地施用的其它药物。
在某些实施方案中，肠内地(例如，经口地、通过胃饲管、通过十二指肠饲管、经胃造口术或直肠地)、胃肠外地(例如，皮下注射、静脉内注射或输注、动脉内注射或输注、骨内输注、肌肉内注射、大脑内注射、脑室内注射、鞘内)、局部地(例如，皮内、吸入、经滴眼剂或通过粘膜)或通过直接注射进靶器官(例如，受试者的肝脏)，给受试者施用本文中公开的任一种组合物。通常，静脉内地或皮下地施用本文中公开的寡核苷酸。
作为一组非限制性实例，通常每季度(每三个月一次)、每两个月(每两个月一次)、每月或每周施用本公开内容的寡核苷酸。例如，可以每周或以两周或三周的间隔施用寡核苷酸。在某些实施方案中，可以每天施用寡核苷酸。
在某些实施方案中，要治疗的受试者是人或非人灵长类动物或其它哺乳动物受试者。其它示例性的受试者包括驯化的动物诸如狗和猫；家畜诸如马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡；和动物诸如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。
实施例
实施例1:GalNAc-缀合的HMGB1寡核苷酸的体内活性
在该实施例中使用的HMGB1寡核苷酸被设计为结合通过算法在人类、猴(均为恒河猴)和小鼠序列(“三重常见”序列)中鉴定的保守序列。在该研究中，以3种不同修饰模式(M1、M2和M3，参见图1A和1B)测试了三种三重常见寡核苷酸序列(S31-AS18、S35-AS22和S36-AS23)。将寡核苷酸以1 mg/kg皮下施用给CD-1小鼠，并在施用后第5天对小鼠实施安乐死。获得肝样品并提取RNA以通过qPCR评价HMGB1 mRNA水平(标准化至HPRT1-F576 (持家基因)。使用基于TAQMAN®的qPCR测定查询剩余HMGB1 mRNA的水平。
使用对HMGB1 mRNA中的不同区域具有特异性的两种不同引物进行qPCR。使用相对于另一种引物在5' 端的引物进行的qPCR被命名为“5’qPCR”。类似地，使用相对于另一种引物在3' 端的引物进行的qPCR被命名为“3’qPCR”。在本实验中，使用了3’qPCR测定(使用引物MmHMGB1-F1541)。数据表明，所有测试的HMGB1寡核苷酸在施用后5天在敲低HMGB1方面是有效的，如在小鼠肝脏中剩余HMGB1 mRNA的量的减少所指示的(标准化至PBS对照处理)(图1A)。
使用工具化合物S36-AS23-M2作为对照，在剂量响应分析中进一步测试了具有不同修饰模式(S31-AS18-M3和S35-AS22-M2)的两种GalNAc-缀合的HMGB1寡核苷酸。将三种寡核苷酸以三种不同的剂量(0.5 mg/kg、1 mg/kg和2 mg/kg)皮下施用于CD-1小鼠。在施用后第5天对小鼠实施安乐死。获得肝样品，并提取RNA以通过qPCR评价HMGB1 mRNA水平(标准化至HPRT1-F576 (持家基因)。使用基于TAQMAN®的qPCR测定(使用如上所述的3’测定)查询剩余HMGB1 mRNA的水平。结果表明，在两种修饰模式中，两种测试的GalNAc-缀合的HMGB1寡核苷酸都降低了小鼠肝脏中的肝脏HMGB1 mRNA水平(图2)。所有寡核苷酸表现出约0.5 -1.0 mg/kg的ED50，尤其是如果考虑非肝细胞“地板”。
然后在持续时间研究中在体内测试了两种具有不同修饰模式(S31-AS18-M3和S35-AS22-M2)的GalNAc-缀合的HMGB1寡核苷酸，以评价它们抑制小鼠中HMGB1表达的活性。在该实验中，将PBS用作阴性对照，将工具化合物S36-AS23-M2用作阳性对照。将寡核苷酸以1 mg/kg皮下施用至CD-1小鼠，并在施用后第7、14、21和28天对小鼠实施安乐死。获得肝样品并提取RNA以通过qPCR评价HMGB1 mRNA水平(标准化至HPRT1-F576持家基因)。使用如上所述的3’测定。数据表明，所有测试的HMGB1寡核苷酸在注射后3周有效敲低HMGB1，即使对于1 mg/kg单剂量，如在第7、14、21和28天小鼠肝脏中剩余HMGB1 mRNA的减少量所指示的(标准化至PBS对照处理)(图3)。
实施例2：新HMGB1 RNAi寡核苷酸序列的其它体外筛选以鉴定抑制HMGB1表达的其它RNAi寡核苷酸
在体外活性测定中筛选其它288种三重常见HMGB1 RNAi寡核苷酸(序列参见表4)以鉴定有效抑制HMGB1表达的其它RNAi寡核苷酸序列(图4A-4F)。在该测定中，将Huh-7细胞用指定的寡核苷酸转染。将细胞在转染后维持24小时，使用iScript RT-qPCR样品制备缓冲液分离RNA。使用基于TAQMAN®的qPCR测定查询HMGB1 mRNA。将两种qPCR测定(5′测定和3′测定)用于确定mRNA水平，如分别通过HEX (持家基因- HPRT-F576/SFRS9-F594)和FAM探针所测量的。
5′测定(红色)和3′测定(蓝色)中的每一个都显示了剩余mRNA百分比。与模拟转染对照相比具有最低剩余mRNA百分比的寡核苷酸被视为命中。与人类基因组具有低互补性的寡核苷酸用作阴性对照。
将在筛选中鉴定的二十二(22)个新序列制成具有两种不同修饰模式(分别为M2和M3)的GalNAc-缀合的四环寡核苷酸(序列参见表2和表5)，并测试了它们减少肝HMGB1 mRNA水平的体内活性。在该实验中，PBS用作阴性对照，两种不同修饰模式(S36-AS23-M2和S36-AS23-M3)的工具化合物用作阳性对照。将寡核苷酸以1 mg/kg皮下施用给CD-1小鼠，并在施用后第5天对小鼠实施安乐死。获得肝样品，并提取RNA以通过qPCR评价HMGB1 mRNA水平(标准化至HPRT1-F576 (持家基因)。使用基于TAQMAN®的qPCR测定(使用3’测定)查询剩余HMGB1 mRNA的水平。结果表明，新的GalNAc-缀合的寡核苷酸在抑制肝HMGB1方面具有不同的活性水平，且7种新的GalNAc-缀合的HMGB1寡核苷酸(如箭头所示，S27-AS14、S28-AS15、S29-AS16、S30-AS17、S32-AS19、S33-AS20和S34-AS21)被选择以包括在敲低持续时间研究中，如果在小鼠中3-5 mg/kg的单剂量后3周实现至少50%的HMGB1 mRNA抑制(图5)。
对于敲低持续时间测定，测试了具有不同修饰模式(M2或M3)的7种新的GalNAc-缀合的HMGB1寡核苷酸(S27-AS14、S28-AS15、S29-AS16、S30-AS17、S32-AS19、S33-AS20和S34-AS21)，并与两种先前鉴定的GalNAc-缀合的HMGB1寡核苷酸(S31-AS18-M3和S35-AS22-M2)进行了对比。PBS用作阴性对照，且工具化合物S36-AS23-M2用作阳性对照。将寡核苷酸以4mg/kg皮下施用给CD-1小鼠，并在施用后第21天对小鼠实施安乐死。获得肝样品并提取RNA以通过qPCR评价HMGB1 mRNA水平(标准化至HPRT1-F576 (持家基因)。使用基于TAQMAN®的qPCR测定(使用3’测定)查询剩余的HMGB1 mRNA的水平。在图6中显示了在寡核苷酸施用后21天在肝脏中的剩余HMGB1 mRNA百分比，标准化至PBS对照处理。在注射后3周，所有测试的HMGB1寡核苷酸在敲低HMGB1方面都是有效的。
实施例3: 在原代猴或人肝细胞中测试GalNAc-缀合的HMGB1寡核苷酸
在该实验中测试的GalNAc-缀合的HMGB1寡核苷酸示于图7中。在图7中也显示了用作阳性对照的GalNAc-缀合的LDHA寡核苷酸。在该测定中，将GalNAc-缀合物HMGB1寡核苷酸通过ASGPR受体介导的摄取递送进猴原代肝细胞(图8A和8B)或人肝细胞(图8C)细胞中。
在寡核苷酸递送后将细胞维持24小时。提取RNA以通过qPCR评价HMGB1 mRNA水平(对于猴肝细胞标准化至RhPPIB (持家基因)，且对于人肝细胞标准化至HPRT1-F576 (持家基因))。使用基于TAQMAN®的qPCR测定，查询剩余HMGB1 mRNA的水平。使用RhMHGB1-F457qPCR测定(图8A和8B)和HsHMGB1-F81测定(图8C)。GalNAc-缀合物LDHA-1360寡核苷酸用作测定对照(图8D)，并且通过RhLDHA-F887 qPCR测定测量剩余LDHA mRNA的水平。显示了RhHMGB1的IC50曲线，其标准化至模拟处理。
关于它们在HMGB1敲低中的活性，在非人灵长类动物(猴)体内进一步测试了四种示例性的GalNAc-缀合的HMGB1寡核苷酸(S27-AS14-M2、S33-AS20-M2、S35-AS22-M2和S37-AS24-M2)。在该实验中，PBS用作阴性对照，且工具化合物S36-AS23-M2用作阳性对照。在图7中描绘了S27-AS14-M2、S33-AS20-M2、S35-AS22-M2和S36-AS23-M2的结构。
将寡核苷酸以4 mg/kg、一个单剂量或2 mg/kg、4个重复剂量皮下施用给非人灵长类动物。在施用后的每个时间点进行猴肝活组织检查。获得肝样品并提取RNA以通过qPCR评价HMGB1 mRNA水平。显示了在施用后7、14、25、54、81和112天在猴肝中的剩余HMGB1 mRNA的百分比，标准化至PBS对照处理(图9A-9B)。结果表明，所有测试的寡核苷酸在施用后25天都显著降低了肝HMGB1 mRNA水平。使用4次重复的2 mg/kg剂量，HMGB1敲低效果持续112天(图9B)。
实施例4:在原代猴/人肝细胞中对比HMGB1 RNAi寡核苷酸
在小鼠、猴和人细胞系中对比了五种HMGB1双链RNAi寡核苷酸(表4中的S866-AS887、S869-AS878、S116-AS490、S117-AS491、S871-AS880和S872-AS881)的活性。在该实验中，PBS用作阴性对照，且工具化合物S36-AS23-M2用作阳性对照。在该测定中，将小鼠细胞(Hepa1-6细胞, 图10A和10B)、猴细胞(LLC-MK2细胞, 图10C和10D)和人细胞(Huh-7, 图10E和10F)分别用指定的寡核苷酸转染。将细胞在转染后维持24小时，使用iScript RT-qPCR样品制备缓冲液分离RNA。使用基于TAQMAN®的qPCR测定查询HMGB1 mRNA。使用两种qPCR测定即5′测定(图10A, 10C,和10E)和3′测定(图10B, 10D,和10F)来确定mRNA水平，如分别通过HEX (持家基因- HPRT-F576)和FAM探针所测量的。在小鼠细胞系中的两种测定中，寡核苷酸210、840、852、853在0.1 nM和1 nM浓度显示出超过80%敲低(图10A和10B)。所有RNAi寡核苷酸在0.1 nM和1 nM浓度都显示出超过80%KD(图10C和10D)。寡核苷酸210、840、852、853、932在人细胞系中在0.1 nM和1 nM浓度显示出更好的效力，具有超过约90%KD(图10E和10F)。
实施例5:测试GalXC-HMGB1的HMGB1选择性
在人肝细胞中测试了GalNAc-缀合的HMGB1寡核苷酸S27-AS14-M2、S33-AS20-M2、S35-AS22-M2和S36-AS23-M2对HMGB1、HMGB2和HMGB3的选择性。S27-AS14-M2、S33-AS20-M2、S35-AS22-M2和S36-AS23-M2的结构如图7所示。GalNAc-缀合的LDHA寡核苷酸用作阳性对照。将Huh-7细胞用8种不同浓度(8点4倍稀释，最高浓度为1 nM)的指定寡核苷酸转染。将细胞在转染后维持24小时，使用iScript RT-qPCR样品制备缓冲液分离RNA。使用基于TAQMAN®的qPCR测定查询HMGB1 mRNA。将5′qPCR测定用于确定mRNA水平，如分别通过HEX (持家基因- SFRS9)和FAM探针所测量的。显示了HMGB1 (图11A)、HMGB2(图11B)和HMGB3(图11C)的IC50曲线，标准化至模拟处理。所有四种测试的缀合物对HMGB1具有相似的IC50值(图11A)。没有缀合物(包括LDH对照寡核苷酸)对HMGB2 mRNA水平(图11B)或HMGB3 mRNA水平(图11C)具有任何影响。
实施例6:材料和方法
转染
对于第一次筛选，将Lipofectamine RNAiMAX™用于复合寡核苷酸以进行有效转染。将寡核苷酸、RNAiMAX和Opti-MEM添加到平板中，并在转染前在室温温育20分钟。从活跃传代细胞的烧瓶中抽吸出培养基，并将细胞在有胰蛋白酶存在下在37℃温育3-5分钟。在细胞不再粘附于烧瓶后，加入细胞生长培养基(不含青霉素和链霉素)以中和胰蛋白酶并悬浮细胞。取出10µL等分试样并用血球计数器计数，以每毫米为基础对细胞进行定量。对于HeLa细胞，每孔接种在100µL培养基中的20,000个细胞。用已知的细胞浓度稀释悬浮液以获得要转染的细胞数量所需的总体积。将稀释的细胞悬浮液加入到96孔转染板中，该板已经含有在Opti-MEM中的寡核苷酸。然后将转染板在37℃温育24小时。温育24小时后，从每个孔抽吸出培养基。使用来自Promega RNA Isolation试剂盒的裂解缓冲液裂解细胞。向每个孔加入裂解缓冲液。然后将裂解的细胞转移到Corbett XtractorGENE (QIAxtractor)进行RNA分离或储存在-80℃。
对于后续筛选和实验，例如，二级筛选，将Lipofectamine RNAiMAx用于复合寡核苷酸以进行反向转染。通过在OptiMEM培养基中混合RNAiMAX和siRNA 15分钟来制备复合物。将转染混合物转移至多孔板并将细胞悬浮液加入孔中。温育24小时后，将细胞用PBS洗涤一次，并然后使用来自Promega SV96试剂盒的裂解缓冲液裂解。使用SV96平板在真空歧管中纯化RNA。然后将4微升纯化的RNA在65℃加热5分钟并冷却至4℃。然后使用高容量逆转录试剂盒(Life Technologies)在10微升反应中将RNA用于逆转录。然后用无核酸酶的水将cDNA稀释至50µL，并用于使用多重5’-内切核酸酶测定和SSoFast qPCR主混合物(Bio-Radlaboratories)进行定量PCR。
cDNA合成
使用Corbett X-tractor Gene™(QIAxtractor)从组织培养中的哺乳动物细胞分离RNA。使用改进的SuperScript II方案从分离的RNA合成cDNA。将分离的RNA(大约5 ng/µL)加热至65℃保持5分钟，然后与dNP、随机六聚体、寡聚dT和水一起温育。将混合物冷却15秒。向混合物中加入由水、5X第一链缓冲液、DTT、SUPERase●In™(RNA抑制剂)和SuperScript II Rtase组成的“酶混合物”。将内容物加热至42℃保持1小时，然后加热至70℃保持15分钟，然后使用热循环仪冷却至4℃。然后将所得的cDNA进行基于SYBR®的qPCR。qPCR反应是多路化的，每个反应包含两个5’内切核酸酶测定。
qPCR测定
最初使用基于SYBR®的qPCR筛选引物集合。通过评估熔化曲线以及“负RT”对照来验证测定特异性。来自HeLa和Hepa1-6细胞的cDNA模板的稀释液(每个反应从20 ng到0.02ng的10倍系列稀释液)分别用于测试人(Hs)和小鼠(Mm)测定。在384-孔平板中进行qPCR测定，用MicroAmp薄膜覆盖，并在来自Applied Biosystems的7900HT上运行。试剂浓度和循环条件包括以下：2x SYBR混合液、10 μM正向引物、10 μM反向引物、DD H2O和cDNA模板，至10µL的总体积。
在某些情况下，如指出的，使用基于TAQMAN®的qPCR测定进行qPCR。TAQMAN®探针靶向靶mRNA (例如，HMGB1)的编码区内的两个不同位置(彼此的5' 和3')，通常用于在分析中提供mRNA水平的额外确认。
克隆
根据生产商的说明书，将显示单一熔化曲线的PCR扩增子连接进来自Promega的pGEM®-T Easy载体试剂盒中。按照生产商的方案，用新连接的载体转化JM109 HighEfficiency细胞。然后将细胞铺在含有氨苄西林的LB平板上，并在37℃温育过夜以进行菌落生长。
PCR筛选和质粒小量制备
将PCR用于鉴定已用含有连接的目标扩增子的载体转化的大肠杆菌菌落。在PCR反应中使用位于插入片段侧翼的载体特异性引物。然后将所有PCR产物在1%琼脂糖凝胶上运行，并在染色后通过透射仪成像。对凝胶进行定性评估以确定哪些质粒似乎含有预期大小的连接的扩增子(大约300 bp，包括扩增子和对所用引物具有特异性的侧接载体序列)。
然后将通过PCR筛选确认为转化体的菌落在由2 mL LB液体培养基和氨苄西林组成的培养物中在37℃振荡温育过夜。然后裂解大肠杆菌细胞，并使用Promega的Mini-Prep试剂盒分离目标质粒。通过在260 nm的紫外吸光度确定质粒浓度。
质粒测序和定量
使用BigDye®Terminator测序试剂盒对纯化的质粒进行测序。将载体特异性引物T7用于提供跨越插入片段的读长。将以下试剂用于测序反应：水、5X测序缓冲液、BigDye终止子混合物、T7引物和质粒(100 ng/µL)，体积为10µL。将混合物在96℃保持1分钟，然后进行15个96℃保持10秒、50℃保持5秒、60℃保持1分钟15秒的循环；5个96℃保持10秒、50℃保持5秒、60℃保持1分钟30秒的循环；和5个96℃保持10秒、50℃保持5秒和60℃保持2分钟的循环。然后使用Applied Biosystems的毛细管电泳测序仪对染料终止反应进行测序。
然后对验证过序列的质粒进行定量。使用单一切割限制性内切核酸酶将它们线性化。使用琼脂糖凝胶电泳确认线性。在TE缓冲液(pH 7.5)中制备所有质粒稀释液，每mL缓冲液含有100µg tRNA，以减少质粒与聚丙烯小瓶的非特异性结合。
然后将线性化的质粒从1,000,000到01个拷贝/µL连续稀释并进行qPCR。计算测定效率，且如果效率是在90-110%的范围内，则认为测定是可接受的。
多路测定
对于每种靶标，通过两种5’核酸酶测定量化mRNA水平。一般而言，针对每种靶标筛选几种测定。所选的两种测定表现出良好效率、低检测限度和广泛的5’→3’目标基因(GOI)覆盖的组合。当在各种探针上使用不同的荧光团时，针对一种GOI的两种测定可以组合在一个反应中。因此，在测定验证中的最后一步是确定所选测定当在同一qPCR中组合或“多路化”时的效率。
将两种测定的线性化质粒以10倍稀释合并并进行qPCR。如上所述确定每种测定的效率。接受的效率为90-110%。
在使用线性化的质粒标准品验证多路化反应时，还使用cDNA作为模板评估了目标靶标的Cq值。对于人类或小鼠靶标，分别使用HeLa和Hepa1-6 cDNA。在该情况下，cDNA源自从未转染细胞的Corbett(在水中约5 ng/ μL)上分离的RNA。以此方式，从该样品cDNA观察到的Cq值代表了来自96孔板转染的预期Cq值。在Cq值大于30的情况下，寻找表现出目标基因的更高表达水平的其它细胞系。生成了从每个人和小鼠品系的Corbett上通过高通量方法分离的总RNA文库，并用于筛选靶标表达的可接受水平。
寡核苷酸命名法的描述
本文描述的所有寡核苷酸被命名为SN1-ASN2-MN3。下述命名适用：
● N1:有义链序列的序列标识符编号
● N2:反义链序列的序列标识符编号
● N3: 修饰模式的参考编号，其中每个数字代表在寡核苷酸中的修饰的核苷酸的模式。
例如，S1-AS14-M1代表具有由SEQ ID NO: 1示出的有义序列、由SEQ ID NO: 14示出的反义序列并且适用于修饰模式编号1的寡核苷酸。
表1: 先导HMGB1 RNAi寡核苷酸序列。
| 有义(S) - 反义(A)命名 | 有义序列/mRNA序列 | S SEQ ID NO: | 反义序列 | AS SEQ ID NO: |
| S1-AS14 | UGGGCAAAGGAGAUCCUAAA | 1 | UUUAGGAUCUCCUUUGCCCAGG | 14 |
| S2-AS15 | AAAGAGAAAUGAAAACCUAA | 2 | UUAGGUUUUCAUUUCUCUUUGG | 15 |
| S3-AS16 | AAGAAGAUGAUGAUGAUGAA | 3 | UUCAUCAUCAUCAUCUUCUUGG | 16 |
| S4-AS17 | AUGAUGAUGAUGAAUAAGUA | 4 | UACUUAUUCAUCAUCAUCAUGG | 17 |
| S5-AS18 | GAUGAUGAAUAAGUUGGUUC | 5 | GAACCAACUUAUUCAUCAUCGG | 18 |
| S6-AS19 | UGAAUAAGUUGGUUCUAGCA | 6 | UGCUAGAACCAACUUAUUCAGG | 19 |
| S7-AS20 | AAUAAGUUGGUUCUAGCGCA | 7 | UGCGCUAGAACCAACUUAUUGG | 20 |
| S8-AS21 | AUAAGUUGGUUCUAGCGCAA | 8 | UUGCGCUAGAACCAACUUAUGG | 21 |
| S9-AS22 | AGAAAAAAAUUGAAAUGUAA | 9 | UUACAUUUCAAUUUUUUUCUGG | 22 |
| S10-AS23 | UUGUUGUUCUGUUAACUGAA | 10 | UUCAGUUAACAGAACAACAAGG | 23 |
| S11-AS24 | UUCUGAAUGCUUCUAAGUAA | 11 | UUACUUAGAAGCAUUCAGAAGG | 24 |
| S12-AS25 | CUGAAUGCUUCUAAGUAAAA | 12 | UUUUACUUAGAAGCAUUCAGGG | 25 |
| S13-AS26 | GAAUGCUUCUAAGUAAAUAA | 13 | UUAUUUACUUAGAAGCAUUCGG | 26 |
表2: 具有修饰的先导GalNAc-缀合的HMGB1寡核苷酸序列。
表3: RNAi寡核苷酸的修饰关键。
| 符号 | 修饰描述 |
| ademA-GalNAc | 2ʹ-氨基二乙氧基甲醇-GalNAc腺苷 |
| fA | 2ʹ-氟-脱氧腺苷 |
| fAs | 2ʹ-氟-脱氧腺苷，随后是硫代磷酸酯键 |
| fC | 2ʹ-氟-脱氧胞嘧啶 |
| fG | 2ʹ-氟-脱氧鸟苷 |
| fGs | 2ʹ-氟-脱氧鸟苷，随后是硫代磷酸酯键 |
| fU | 2ʹ-氟-尿苷 |
| fUs | 2ʹ-氟-尿苷，随后是硫代磷酸酯键 |
| mA | 2ʹ-O-甲基腺苷 |
| mAs | 2ʹ-O-甲基腺苷，随后是硫代磷酸酯键 |
| mC | 2ʹ-O-甲基胞嘧啶 |
| mCs | 2ʹ-O-甲基胞嘧啶，随后是硫代磷酸酯键 |
| Me膦酸酯-4O-mU | 甲基-4ʹ-O-甲基膦酸酯-2ʹ-O-甲基尿苷 |
| Me膦酸酯-4O-mUs | 甲基-4ʹ-O-甲基膦酸酯-2ʹ-O-甲基尿苷，随后是硫代磷酸酯键 |
| mG | 2ʹ-O-甲基鸟苷 |
| mGs | 2ʹ-O-甲基鸟苷，随后是硫代磷酸酯键 |
| mU | 2ʹ-O-甲基尿苷 |
| mUs | 2ʹ-O-甲基尿苷，随后是硫代磷酸酯键 |
| s | 硫代磷酸酯键 |
表4: 在筛选中包括的HMGB1 RNAi寡核苷酸序列。
表5: 具有修饰的另外的GalNAc-缀合的HMGB1寡核苷酸序列(在图5中测试的)。
在不存在本文未具体公开的任何一个或多个元素、限制的情况下，可以适当地实践本文示例性地描述的公开内容。因此，例如，在本文中的每种情况下，术语“包含”、“基本上由……组成”和”由……组成”中的任何一个可以被其它两个术语中的任何一个替换。已经被采用的术语和表述作为描述而非限制术语使用，并且在这样的术语和表述的应用中不意图排除所示和所述的特征或其部分的任何等同物，但是应当认识到，多种改变在要求保护的发明范围内是可能的。因而，应当理解，虽然已经通过优选的实施方案、任选的特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以对本文公开的概念做出修改和变化，并且这样的修改和变化被认为是在由说明书和所附权利要求限定的本发明的范围内。
另外，在以马库什群组或其它替代群组的方式描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员会认识到，本发明也由此以马库什群组或其它群组的任何个体成员或成员亚组的方式来描述。
术语“一个”和”一种”和”所述”和类似指示物在描述本发明的上下文中(特别是在下述权利要求中)的应用应当解释为覆盖单数和复数，除非在本文中另外指出或与上下文明显矛盾。除非另外指出，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应当解释为开放式的术语(即，意指“包括、但不限于”)。除非在本文中另外指出，否则本文中数值范围的列举仅意图充当个别地提及落入该范围内的每个单独值的速记方法，且每个单独值如同在本文中个别地阐述一样并入说明书中。可以以任意合适的次序执行本文描述的所有方法，除非在本文中另外指出或以其它方式与上下文明显矛盾。本文提供的任意和所有实施例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用，仅仅意图更好地阐释本发明，且不构成对本发明范围的限制，除非另有声明。在说明书中的语言不应解释为，指示任何没有声明的要素是实践本发明所必需的。
本文中描述了本发明的实施方案，包括发明人已知的实现本发明的最佳模式。在阅读前述描述后，那些实施方案的变体对于本领域普通技术人员来说可能变得显而易见。
发明人预见到技术人员会根据需要采用这样的变体，并且发明人预期本发明会以不同于本文具体描述的方式实现。因此，本发明包括适用法律允许的、所附权利要求阐明的主题的所有改进方案和等同方案。此外，本发明包括上述要素以其所有可能变化的任意组合，除非本文另外指明或者以其它方式与上下文明显矛盾。本领域技术人员会认识到或能够使用不超过常规实验确定本文描述的发明的具体实施方案的许多等同方案。这样的等同方案意图由随附的权利要求涵盖。
Claims (67)
1.一种用于减少HMGB1的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含15-50个核苷酸长度的有义链和15-30个核苷酸长度的反义链，其中所述有义链与所述反义链形成双链体区域，其中所述有义链包含在SEQ ID NO: 1-13中的任一个中所示的序列，且其中所述反义链包含选自SEQ ID NO: 14-26的互补序列。
2.权利要求1的寡核苷酸，其中所述有义链序列包含在SEQ ID NO: 27-39中的任一个中所示的序列或由其组成。
3.权利要求1或权利要求A2的寡核苷酸，其中所述反义链序列由在SEQ ID NO: 14-26中的任一个中所示的序列组成。
4.权利要求1的寡核苷酸，其中所述有义链序列包含在SEQ ID NO: 27中所示的序列且所述反义链序列包含在SEQ ID NO: 14中所示的序列。
5.权利要求1的寡核苷酸，其中所述有义链序列包含在SEQ ID NO: 28中所示的序列且所述反义链序列包含在SEQ ID NO: 15中所示的序列。
6.权利要求1的寡核苷酸，其中所述有义链序列包含在SEQ ID NO: 29中所示的序列且所述反义链序列包含在SEQ ID NO: 16中所示的序列。
7.权利要求1的寡核苷酸，其中所述有义链序列包含在SEQ ID NO: 30中所示的序列且所述反义链序列包含在SEQ ID NO: 17中所示的序列。
8.权利要求1的寡核苷酸，其中所述有义链序列包含在SEQ ID NO: 31中所示的序列且所述反义链序列包含在SEQ ID NO: 18中所示的序列。
9.权利要求1的寡核苷酸，其中所述有义链序列包含在SEQ ID NO: 32中所示的序列且所述反义链序列包含在SEQ ID NO: 19中所示的序列。
10.权利要求1的寡核苷酸，其中所述有义链序列包含在SEQ ID NO: 33中所示的序列且所述反义链序列包含在SEQ ID NO: 20中所示的序列。
11.权利要求1的寡核苷酸，其中所述有义链序列包含在SEQ ID NO: 34中所示的序列且所述反义链序列包含在SEQ ID NO: 21中所示的序列。
12.权利要求1的寡核苷酸，其中所述有义链序列包含在SEQ ID NO: 35中所示的序列且所述反义链序列包含在SEQ ID NO: 22中所示的序列。
13.权利要求1的寡核苷酸，其中所述有义链序列包含在SEQ ID NO: 36中所示的序列且所述反义链序列包含在SEQ ID NO: 23中所示的序列。
14.权利要求1的寡核苷酸，其中所述有义链序列包含在SEQ ID NO: 37中所示的序列且所述反义链序列包含在SEQ ID NO: 24中所示的序列。
15.权利要求1的寡核苷酸，其中所述有义链序列包含在SEQ ID NO: 38中所示的序列且所述反义链序列包含在SEQ ID NO: 25中所示的序列。
16.权利要求1的寡核苷酸，其中所述有义链序列包含在SEQ ID NO: 39中所示的序列且所述反义链序列包含在SEQ ID NO: 26中所示的序列。
17.权利要求1-16中任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸。
18.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的所有核苷酸被修饰。
19.权利要求17或权利要求18的寡核苷酸，其中所述修饰的核苷酸包含2′-修饰。
20.权利要求19的寡核苷酸，其中所述2′-修饰是2′-氟或2′-O-甲基。
21.权利要求17-20中任一项的寡核苷酸，其中有义链的位置1、2、4、6、7、12、14、16、18-27和31-36中的一个或多个、和/或反义链的位置1、4、6、8、9、11、13、15、18和20-22中的一个或多个被2′-O-甲基修饰。
22.权利要求21的寡核苷酸，其中有义链的位置1、2、4、6、7、12、14、16、18-27和31-36的全部和反义链的位置1、4、6、8、9、11、13、15、18和20-22的全部被2′-O-甲基修饰。
23.权利要求17-22中任一项的寡核苷酸，其中有义链的位置3、5、8-11、13、15和17中的一个或多个和/或反义链的位置2、3、5、7、10、12、14、16、17和19中的一个或多个被2′-氟修饰。
24.权利要求23的寡核苷酸，其中有义链的位置3、5、8-11、13、15和17的全部和反义链的位置2、3、5、7、10、12、14、16、17和19的全部被2′-氟修饰。
25.权利要求17-20中任一项的寡核苷酸，其中有义链的位置1-7、12-27和31-36中的一个或多个和/或反义链的位置1、4、6、8、9、11-13和15-22中的一个或多个被2′-O-甲基修饰。
26.权利要求25的寡核苷酸，其中有义链的位置1-7、12-27和31-36的全部和反义链的位置1、4、6、8、9、11-13和15-22的全部被2′-O-甲基修饰。
27.权利要求17-20、25和26中任一项的寡核苷酸，其中有义链的位置8-11中的一个或多个和/或反义链的位置2、3、5、7、10和14中的一个或多个被2′-氟修饰。
28.权利要求27的寡核苷酸，其中有义链的位置8-11的全部和反义链的位置2、3、5、7、10和14的全部被2′-氟修饰。
29.权利要求17-20中任一项的寡核苷酸，其中有义链的位置1、2、4-7、9、11、14-16、18-27和31-36中的一个或多个和/或反义链的位置1、6、8、9、11、13、15、18和20-22中的一个或多个被2′-O-甲基修饰。
30.权利要求29的寡核苷酸，其中有义链的位置1、2、4-7、9、11、14-16、18-27和31-36的全部和反义链的位置1、6、8、9、11、13、15、18和20-22的全部被2′-O-甲基修饰。
31.权利要求17-20、29和30中任一项的寡核苷酸，其中有义链的位置3、8、10、12、13和17中的一个或多个和/或反义链的位置2-5、7、10、12、14、16、17和19中的一个或多个被2′-氟修饰。
32.权利要求31的寡核苷酸，其中有义链的位置3、8、10、12、13和17的全部和反义链的位置2-5、7、10、12、14、16、17和19的全部被2′-氟修饰。
33.权利要求1-32中任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸间键。
34.权利要求33的寡核苷酸，其中所述至少一个修饰的核苷酸间键是硫代磷酸酯键。
35.权利要求33或权利要求34的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有以下一个或多个之间的硫代磷酸酯键：有义链的位置1和2，反义链的位置1和2，反义链的位置2和3，反义链的位置3和4，反义链的位置20和21，和反义链的位置21和22。
36.权利要求35的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有以下每个之间的硫代磷酸酯键：有义链的位置1和2，反义链的位置1和2，反义链的位置2和3，反义链的位置20和21，和反义链的位置21和22。
37.权利要求1-36中任一项的寡核苷酸，其中在所述反义链的第一个位置处的尿苷包含磷酸酯类似物。
38.权利要求37的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含在反义链的位置1处的下述结构：
39.权利要求1-38中任一项的寡核苷酸，其中在有义链上的位置28-30处的-AAA-序列的一个或多个核苷酸缀合至单价GalNAc部分。
40.权利要求39的寡核苷酸，其中在有义链上的位置28-30处的-AAA-序列的每个核苷酸缀合至单价GalNAc部分。
41.权利要求40的寡核苷酸，其中在有义链上的位置28-30处的-AAA- 基序包含以下结构：
其中：
L代表键、点击化学把手或包含端点在内的1-20个连贯的、共价地键合的原子长度的接头，所述接头选自：被取代的和未被取代的亚烷基、被取代的和未被取代的亚烯基、被取代的和未被取代的亚炔基、被取代的和未被取代的亚杂烷基、被取代的和未被取代的亚杂烯基、被取代的和未被取代的亚杂炔基和它们的组合；且
X是O、S或N。
42.权利要求41的寡核苷酸，其中L是缩醛接头。
43.权利要求41或权利要求42的寡核苷酸，其中X是O。
44.权利要求41-43中任一项的寡核苷酸，其中在有义链上的位置28-30处的-AAA-序列包含以下结构：
45.一种用于减少HMGB1的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含15-30个核苷酸长度的反义链，其中所述反义链具有与HMGB1的互补性区域，该区域与在SEQ ID NO: 1-13中的任一个中所示的序列的至少15个连续核苷酸互补。
46.权利要求45的寡核苷酸，其中所述反义链是19-27个核苷酸长度。
47.权利要求45的寡核苷酸，其中所述反义链是22个核苷酸长度。
48.权利要求45-47中任一项的寡核苷酸，所述寡核苷酸进一步包含15-50个核苷酸长度的有义链，其中所述有义链与所述反义链形成双链体区域。
49.权利要求48的寡核苷酸，其中所述有义链是19-50个核苷酸长度。
50.权利要求48或49的寡核苷酸，其中所述双链体区域是20个核苷酸长度。
51.一种用于减少HMGB1的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含有义链和反义链，其中：
(a)所述有义链包含在SEQ ID NO: 788中所示的序列且所述反义链包含在SEQ ID NO:814中所示的序列；
(b)所述有义链包含在SEQ ID NO: 789中所示的序列且所述反义链包含在SEQ ID NO:815中所示的序列；
(c)所述有义链包含在SEQ ID NO: 790中所示的序列且所述反义链包含在SEQ ID NO:816中所示的序列；
(d)所述有义链包含在SEQ ID NO: 791中所示的序列且所述反义链包含在SEQ ID NO:817中所示的序列；
(e)所述有义链包含在SEQ ID NO: 792中所示的序列且所述反义链包含在SEQ ID NO:818中所示的序列；
(f)所述有义链包含在SEQ ID NO: 793中所示的序列且所述反义链包含在SEQ ID NO:819中所示的序列；
(g)所述有义链包含在SEQ ID NO: 794中所示的序列且所述反义链包含在SEQ ID NO:820中所示的序列；
(h)所述有义链包含在SEQ ID NO: 795中所示的序列且所述反义链包含在SEQ ID NO:821中所示的序列；
(i)所述有义链包含在SEQ ID NO: 796中所示的序列且所述反义链包含在SEQ ID NO:822中所示的序列；
(j)所述有义链包含在SEQ ID NO: 797中所示的序列且所述反义链包含在SEQ ID NO:823中所示的序列；
(k)所述有义链包含在SEQ ID NO: 798中所示的序列且所述反义链包含在SEQ ID NO:824中所示的序列；
(l)所述有义链包含在SEQ ID NO: 799中所示的序列且所述反义链包含在SEQ ID NO:825中所示的序列；
(m)所述有义链包含在SEQ ID NO: 800中所示的序列且所述反义链包含在SEQ ID NO:826中所示的序列；
(n)所述有义链包含在SEQ ID NO: 801中所示的序列且所述反义链包含在SEQ ID NO:827中所示的序列；
(o)所述有义链包含在SEQ ID NO: 802中所示的序列且所述反义链包含在SEQ ID NO:828中所示的序列；
(p)所述有义链包含在SEQ ID NO: 803中所示的序列且所述反义链包含在SEQ ID NO:829中所示的序列；
(q)所述有义链包含在SEQ ID NO: 804中所示的序列且所述反义链包含在SEQ ID NO:830中所示的序列；
(r)所述有义链包含在SEQ ID NO: 805中所示的序列且所述反义链包含在SEQ ID NO:831中所示的序列；
(s)所述有义链包含在SEQ ID NO: 806中所示的序列且所述反义链包含在SEQ ID NO:832中所示的序列；
(t)所述有义链包含在SEQ ID NO: 807中所示的序列且所述反义链包含在SEQ ID NO:833中所示的序列；
(u)所述有义链包含在SEQ ID NO: 808中所示的序列且所述反义链包含在SEQ ID NO:834中所示的序列；
(v)所述有义链包含在SEQ ID NO: 809中所示的序列且所述反义链包含在SEQ ID NO:835中所示的序列；
(w)所述有义链包含在SEQ ID NO: 810中所示的序列且所述反义链包含在SEQ ID NO:836中所示的序列；
(x)所述有义链包含在SEQ ID NO: 811中所示的序列且所述反义链包含在SEQ ID NO:837中所示的序列；
(y)所述有义链包含在SEQ ID NO:812中所示的序列且所述反义链包含在SEQ ID NO:838中所示的序列；或者
(z)所述有义链包含在SEQ ID NO: 813中所示的序列且所述反义链包含在SEQ ID NO:839中所示的序列。
52.一种组合物，其包含权利要求1-51中任一项的寡核苷酸和赋形剂。
53.一种向受试者递送寡核苷酸的方法，所述方法包括向受试者施用根据权利要求52所述的组合物。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述受试者患有肝纤维化或处于患有肝纤维化的风险中。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述受试者患有胆汁郁积性或自身免疫性肝病。
56.根据权利要求53-55中任一项的方法，其中通过给所述受试者施用所述寡核苷酸来减少HMGB1蛋白的表达。
57.一种治疗患有肝纤维化或处于患有肝纤维化的风险中的受试者的方法，所述方法包括给所述受试者施用权利要求1-51中任一项的寡核苷酸。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述受试者患有胆汁郁积性或自身免疫性肝病。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述受试者患有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
60.根据权利要求57-59中任一项的方法，其中在所述受试者向肝毒性试剂的暴露之前施用所述寡核苷酸。
61.根据权利要求57-59中任一项的方法，其中在所述受试者向肝毒性试剂的暴露之后施用所述寡核苷酸。
62.根据权利要求57-59中任一项的方法，其中与所述受试者向肝毒性试剂的暴露同时地施用所述寡核苷酸。
63.根据权利要求57-62中任一项的方法，其中所述施用导致肝HMGB1水平的下降。
64.根据权利要求57-63中任一项的方法，其中所述施用导致血清HMGB1水平的下降。
65.权利要求1-51中任一项的寡核苷酸用于治疗患有肝纤维化或处于患有肝纤维化的风险中的受试者的用途。
66.权利要求65的用途，其中所述受试者患有胆汁郁积性或自身免疫性肝病。
67.权利要求65的用途，其中所述受试者患有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
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