WO2022092279A1 - ｓｉＲＮＡ及び医薬組成物並びに予防及び／又は治療剤 - Google Patents
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Definitions
- the present invention comprises a novel siRNA (small interfering RNA) that suppresses the expression of BAZF (BCL6 associated zinc finger protein), a prophylactic and / or therapeutic agent for intraocular angiogenesis and the like containing the siRNA as an active ingredient, and the siRNA. It relates to a pharmaceutical composition as an active ingredient.
- siRNA small interfering RNA
- BAZF BCL6 associated zinc finger protein
- vascular endothelial growth factor (VEGF) is involved in the neovascularization (Non-Patent Document 1). ).
- Patent Document 1 describes that BAZF is the key to control the angiogenesis-promoting action of VEGF.
- Patent Document 2 describes specific sequences of double-stranded siRNA that can suppress the expression of BAZF (SEQ ID NOS: 1 and 2 of Patent Document 2).
- the siRNA described in Patent Document 2 targets the vicinity of positions 1827 to 1845 further downstream from the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (positions 1468 to 1486) in the present invention, and is the same as the siRNA of the present invention. It's different.
- the present inventors have found a siRNA sequence that effectively suppresses the expression of BAZF, and further used it as an active ingredient.
- the present invention has been completed by finding that the drug used to suppress angiogenesis due to the angiogenesis-promoting action of VEGF, particularly intraocular blood vessel formation, through suppression of BAZF expression.
- novel siRNAs pharmaceutical compositions and prophylactic and / or therapeutic agents for intraocular angiogenic diseases and the like.
- SEQ ID NO: 1 ACACCAAAGUGCACUACCA
- RNA according to the first invention which has a sequence for overhanging one or several bases at the 3'end.
- ⁇ Third invention> The siRNA according to the first invention or the second invention, wherein the hydroxyl group at the 2'position of at least a part of the sugar (ribose) constituting the siRNA is chemically modified.
- siRNA according to any one of the first to fourth inventions which is a double-stranded RNA composed of a combination of any of the following SEQ ID NOs. i) SEQ ID NOs: 2 (sense strand) and 3 (antisense strand) ii) SEQ ID NOs: 4 (sense strand) and 5 (antisense strand) iii) SEQ ID NOs: 6 (sense strand) and 7 (antisense strand)
- the siRNA according to the fifth invention which is a double-stranded RNA composed of a combination of SEQ ID NOs: 4 and 5.
- the siRNA according to the fifth invention which is a double-stranded RNA composed of a combination of SEQ ID NOs: 6 and 7.
- ⁇ Eighth invention> A pharmaceutical composition comprising the siRNA according to any one of the first to seventh inventions.
- ⁇ Ninth invention A prophylactic and / or therapeutic agent for a disease caused by angiogenesis, which comprises the siRNA according to any one of the first to seventh inventions.
- a prophylactic and / or therapeutic agent for intraocular angiogenic disease which comprises the siRNA according to any one of the first to seventh inventions.
- Intraocular angiogenesis disease is selected from diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity, branch retinal vein occlusion, central retinal vein occlusion, angiogenic glaucoma, angiogenic macular degeneration, diabetic macular edema and age-related macular degeneration.
- the prophylactic and / or therapeutic agent according to the tenth invention which is a disease.
- the siRNA of the present invention is a disease in which the angiogenesis-promoting action of VEGF is involved, for example, diabetic retinopathy such as proliferative diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity, retinal branch vein occlusion, central retinal vein occlusion, angiogenic glaucoma, Vascular neoplasia, diabetic macular edema, age-related macular degeneration and the like can be prevented and / or treated by suppressing the expression of BAZF.
- diabetic retinopathy such as proliferative diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity, retinal branch vein occlusion, central retinal vein occlusion, angiogenic glaucoma, Vascular neoplasia, diabetic macular edema, age-related macular degeneration and the like can be prevented and / or treated by suppressing the expression of BAZF.
- FIG. 1 is a diagram showing the inhibitory effect of BAZF expression by siRNA (siBAZF # 5, siBAZF # 5-4 and siBAZF # 5-6) of the present invention.
- siRNA of the present invention has a sequence having a nucleotide sequence common to humans and monkeys shown in SEQ ID NO: 1 as a target gene sequence, and is characterized by significantly suppressing the angiogenesis-promoting action of VEGF. ..
- siRNA # 5 the site of BAZF (BCL6B; Ref Seq (mRNA); NM 181844), and as a result of various studies, it is shown in SEQ ID NO: 1. It has been found that siRNA for the site of # 5 below (hereinafter, may be referred to as siBAZF # 5 or the like) is extremely effective.
- siRNA double strand
- a sequence (sense strand) consisting of a 19-base sequence corresponding to positions 1468 to 1486 (SEQ ID NO: 1) in the nucleic acid sequence of the BAZF (BCL6B) gene.
- siRNA of the present invention includes the above-mentioned A) and / or B) with the following various modifications and modifications as long as A) and B) can form a double strand. ..
- Modification of nucleic acid sequence The above-mentioned modification of A) and / or B) is more specifically, substitution, deletion, addition and addition of one or several bases (nucleotides) to the nucleic acid sequences of A) and / or B). / Or means that insertion, etc. (hereinafter, may be referred to as modification) has been performed.
- the base to be substituted, added and / or inserted may be one that is bound to deoxyribose as well as one that is bound to ribose, such as dTdT described later.
- substitutions, deletions, additions and / or insertions are preferably such that the siRNA effect is not lost, and for example, a poly that can hybridize with the target RNA sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions.
- Examples include nucleotides.
- Stringent conditions refer to conditions in which specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
- J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 1989) (especially Section 11.45 “Conditions for Hybridization of oligonucleotide Probes, etc.) and Elbashir SM, Lendeckel W, Tuschl T., Genes Dev. 2001 Jan 15; 15 (2): 188-200.
- Doi: 10.1101 / gad.862301 The described conditions and the like can be mentioned.
- the siRNA of the present invention preferably has a sequence for overhanging one or several bases at the 3'end of the above siRNA.
- the sequence for overhang is for projecting mainly the 3'end side of the sense strand and / or the antisense strand when it becomes a double-stranded siRNA consisting of a sense strand and an antisense strand by annealing.
- the 1 or several bases are generally, but are not limited to, 2 bases.
- sequence for overhang a known sequence can be used, but for example, dTdT or the like is preferable in that the effect of overhang is established.
- the siRNA of the present invention contains at least a part of sugar (ribose) constituting siRNA in terms of improving the ability to form a stable hybrid with a nucleic acid having a complementary base sequence and / or improving nuclease resistance. It is preferable that the hydroxyl group at the 2'position is chemically modified.
- the chemical modification means substituting the hydroxyl group at the 2'position of the sugar (ribose) with the following substituents.
- TLR Toll-like receptor, Toll-like receptor
- methoxy group OMe conversion of OH
- RNAi activity in order to fully exert RNAi activity (siRNA effect), only some, but not all, of the 2'-hydroxyl groups of the sugar (ribose) constituting the target siRNA molecule must be chemically modified. Is preferable.
- a part or all of the amidite containing a specific base is used as a raw material amidite.
- OMe-forming only the 2'-position hydroxyl group it is possible to prevent the 2'-position hydroxyl group of all sugars (ribose) constituting the siRNA molecule from being chemically modified.
- the chemical modification may be performed in at least one of A) and B) above.
- siRNA of the present invention include, but are not limited to, double-stranded RNA composed of any of the following combinations, but the double-stranded RNA is not necessarily limited thereto.
- the modification of the base itself as described above substitution, deletion, addition and / or insertion of one or several bases (nucleotides)). The ones that have been given are also included.
- fine print represents RNA and bold dT represents DNA (sequence for overhang).
- Um and Gm in Table 1 mean that the hydroxyl group at the 2'position of the sugar (ribose) to which each base is bonded is substituted with a methoxy group, and this substitution is 2'OMe. It may be expressed as (or 2'-O-Methyl) or the like.
- siRNA (siBAZF) of the present invention is a method for artificially synthesizing using, for example, an automatic nucleic acid synthesizer, a transformed cell, or the like. How to extract naturally occurring polynucleotides, Methods of deleting, substituting, adding and / or inserting some of the bases of naturally extracted polynucleotides, A method of synthesizing a target sequence by reverse transcriptase, RNA polymerase, etc. using a sequence complementary to the target sequence. Alternatively, it can be manufactured by a method such as a method combining these.
- nucleic acid automatic synthesizer examples include, but are not limited to, a phosphoramidite method using amidite.
- the siRNA of the present invention in which the hydroxyl group at the 2'position of at least a part of the sugar (ribose) constituting the siRNA is chemically modified constitutes the sugar (ribose) in the amidite as a material or the nucleotide after synthesis.
- the hydroxyl groups at the 2'position of sugar (ribose) are substituted (protected) with the above-mentioned substituents according to a known method, and some of the substituents are deprotected as necessary. It can be done by things such as.
- siRNA of the present invention can be used as a pharmaceutical composition of the present invention described later, a preventive and / or therapeutic agent, and also as an experimental / research reagent (BAZF expression inhibitor or angiogenesis inhibitor) in a laboratory. It is of high value.
- composition of the present invention is characterized by containing the above-mentioned siRNA of the present invention. Specifically, those described in detail in the section of the preventive and / or therapeutic agents of the present invention below are given as an example of the pharmaceutical composition.
- the prophylactic and / or therapeutic agent for the disease of the present invention is characterized by containing the siRNA of the present invention, and is a disease in which the angiogenesis-promoting action of VEGF is involved, for example, diabetic retinopathy such as proliferative diabetic retinopathy.
- diabetic retinopathy such as proliferative diabetic retinopathy.
- compositions of the present invention or the prophylactic and / or therapeutic agent of the present invention are the active ingredient of the siRNA of the present invention alone or siRNA is pharmaceutically acceptable.
- a pharmaceutical composition or the like is the active ingredient of the siRNA of the present invention alone or siRNA is pharmaceutically acceptable.
- Each can be formulated by use with the additives to be added.
- Examples of the pharmaceutically acceptable additive include, but are not limited to, the following.
- Organic excipients such as sucrose and starch Cellulose, binders such as methyl cellulose Starch, disintegrants such as carboxymethyl cellulose Lubricants such as magnesium stearate and aerodil (lubricants) Fragrances such as menthol Preservatives such as sodium benzoate and sodium bisulfite Stabilizers such as citric acid and sodium citrate Suspendants such as polyvinylpyrrolidone Dispersants such as surfactants Diluting water, physiological saline, etc. Agent
- a known reagent for introducing a nucleic acid can be further contained in a pharmaceutical composition or the like containing the siRNA of the present invention, an experimental reagent or the like.
- reagent for introducing nucleic acid examples include, but are not limited to, the following.
- PEI polyethyleneimine
- compositions and the like of the present invention can also be used as a combination drug with the following molecular-targeted drugs related to angiogenesis control or in combination utilizing their respective characteristics.
- Human monoclonal antibody drug for VEGF RNA aptamer drug for VEGF, Notch1, Notch1 gene, CBF-1, CBF-1 gene, HEY1, HEY1 gene, HEY2, HEY2 gene, HES1, HES1 gene, etc.
- dosage form examples of the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention include injections such as intravitreal injections, eye drops, inhalation preparations and the like.
- composition of the present invention varies depending on the dosage form and cannot be unconditionally limited. Just choose.
- compositions and the like of the present invention can be formulated by a well-known method using the above-mentioned components.
- Examples of the method for encapsulating siRNA in liposomes include, but are not limited to, known methods such as the following.
- Lipid film method (vortex method), reverse phase evaporation method, surfactant removal method, freeze-thaw method, remote loading method, etc.
- the administration route of the pharmaceutical composition of the present invention includes systemic administration and local administration.
- intravenous administration such as intravenous injection, intramuscular administration such as intramuscular injection, nasal administration, intradermal administration, and subcutaneous administration.
- Administration, mucosal administration, inhalation, intraocular administration and the like can be mentioned, and can be appropriately selected depending on the disease, symptoms and the like for the purpose of treatment.
- intravitreal administration or local administration such as eye drops is preferable.
- the administration method is not particularly limited, and a conventionally known delivery system can be used as appropriate.
- a local administration method using atelocollagen and a systemic administration method are preferable.
- atelocollagen has already been clinically applied as a local hemostatic agent, for example, and the local administration method of siRNA using the atelocollagen has been shown to be significant in animal experiments targeting VEGF. Y et al., Cancer Res 64 (10): 3365-3370, 2004).
- a siRNA expression vector expressing the double-stranded siRNA of the present invention can be constructed, and a delivery system utilizing a gene therapy technique can be used.
- the dose of the pharmaceutical composition or the like of the present invention varies depending on the route of administration, symptoms, age, gender, body weight, form of the pharmaceutical composition, etc., and therefore cannot be unconditionally defined. It is preferable that the amount of the component (siRNA) is 0.0001 to 100 mg, preferably 0.001 to 10 mg, or the like as a gene, once every few days to several months.
- CS-C Complete Medium manufactured by Cell systems
- Culture boost registered trademark
- siRNAiMAX Lipofectamine (registered trademark) RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific) to control siRNA (siRNA that does not target BAZF, MISSION (registered trademark) siRNA Universal Negative Control (SIC001) manufactured by Sigma-Aldrich, hereinafter referred to as siCont. )
- SiBAZF # 5, siBAZF # 5-4 and siBAZF # 5-6 shown in Table 1 were added to a final concentration of 25 nM and cultured for 24 hours.
- the medium was replaced with a medium containing 10% FBS (not containing Culture boost (registered trademark)), and the cells were cultured for 6 hours.
- Recombinant human VEGF (10 ng / ml, manufactured by R & D systems) dissolved in PBS was added, and the cells were further cultured for 1 hour.
- RT-PCR is performed using TBGreenPremixExTaq (registered trademark) II (manufactured by Takara) by a reaction of 30 seconds at 95 ° C for 1 cycle, 95 ° C for 5 seconds, and 60 ° C for 30 seconds for 40 cycles. rice field.
- BAZF forward CGGGAAGTGAATTTTTCAGC (SEQ ID NO: 8)
- BAZF reverse TGGTAAGGCTTTTCCCCTGT (SEQ ID NO: 9)
- GAPDH forward CTTGCACCACCAACTGCTTA (SEQ ID NO: 10)
- GAPDH reverse GGCCATCCACAGTCTTCTGAG (SEQ ID NO: 11) (Made by Eurofins Genomics (Tokyo))
- siRNA used is siBAZF # 5, siBAZF # 5-4, and siBAZF # 5-6 shown in Table 1 above.
- siBAZF (siBAZF # 5, siBAZF # 5-4 and siBAZF # 5-6) targeting SEQ ID NO: 1 (# 5), which is part of the nucleotide sequence of BAZF, especially siBAZF # 5-4.
- Diabetic retinopathy such as proliferative diabetic retinopathy, premature infant retinopathy, retinal branch vein occlusion, central retinal vein occlusion, angiogenic glaucoma, angiogenic macular edema, Diabetic macular edema, age-related macular degeneration, and the like can be prevented and / or treated by suppressing the expression of BAZF.
- the expression of BAZF was suppressed by intravitreal administration of the above siBAZF # 5-4 to cynomolgus monkeys and mRNA analysis of BAZF by qRT-PCR.
- siBAZF # 5 Double-stranded siRNA was prepared as follows.
- Oligonucleotides of the sense strand and antisense strand of siRNA were synthesized using an automatic nucleic acid synthesizer by the phosphoroamidite method using the corresponding amidite reagents for RNA synthesis, and then base deprotection and 2 according to a conventional method.
- the ′ position hydroxyl group was deprotected, the column was purified in a single-stranded state, desalted, then the sense strand and the antisense strand were annealed, and lyophilized to prepare the siRNA shown in Table 1.
- siBAZF # 5-4 Double-stranded siRNA was prepared as follows.
- the sense strand and antisense strand oligonucleotides of siRNA were synthesized using an automated nucleic acid synthesizer by the phosphoroamidite method using the corresponding amidite reagent for RNA synthesis and the 2'-O-Methyl modified amidite reagent, and then synthesized. , Deprotection of the base part and deprotection of the substituent of the ribose 2'position according to a conventional method, column purification in a single chain state, desalting, then annealing of the sense strand and the antisense strand, and freeze-drying. Then, the siRNA shown in Table 1 was prepared.
- siBAZF # 5-6 Double-stranded siRNA (siBAZF # 5-6) was prepared in the same manner as in Example 2 to prepare siRNA shown in Table 1.
- the pharmaceutical agent containing siRNA that suppresses the expression of BAZF of the present invention is a disease in which the angiogenesis promoting action by VEGF is involved, for example, diabetic retinopathy such as proliferative diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity, retinal branch vein occlusion. Diseases, central retinal vein occlusion, angiogenic glaucoma, angiogenic macular edema, diabetic macular edema, age-related macular degeneration, etc. can be prevented and / or treated by suppressing the expression of BAZF.
- diabetic retinopathy such as proliferative diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity, retinal branch vein occlusion.
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Abstract
【課題】ＢＡＺＦの発現を抑制するｓｉＲＮＡを有効成分とする医薬組成物、具体的にはＢＡＺＦの発現を抑制することを通じてＶＥＧＦによる血管新生促進作用が関与する疾患、例えば増殖糖尿病網膜症等の糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜分枝静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、血管新生緑内障、血管新生黄斑症、糖尿病黄斑浮腫及び加齢黄斑変性症等の各種眼内血管新生疾患の予防及び／又は治療剤を提供すること。 【解決手段】配列番号１に示されるヌクレオチド配列を標的遺伝子配列とすることを特徴とするｓｉＲＮＡ、及びそれを有効成分として含有する医薬組成物である。
Description
本発明は、ＢＡＺＦ（BCL6 associated zinc finger protein）の発現を抑制する新規なｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）及び当該ｓｉＲＮＡを有効成分とする眼内血管新生疾患等の予防及び／又は治療剤並びに当該ｓｉＲＮＡを有効成分とする医薬組成物に関するものである。
眼内血管新生疾患として、例えば増殖糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜静脈閉塞症及び加齢黄斑変性症等の後眼部疾患は、網膜における病的な血管新生により惹起される疾患で不可逆的な視野欠損や失明を引き起こすことが知られており、当該血管新生には血管内皮細胞増殖因子（Vascular endothelial growth factor;ＶＥＧＦ）が関与していることが明らかにされている（非特許文献１）。
特許文献１には、ＶＥＧＦによる血管新生促進作用に対し、ＢＡＺＦが制御の鍵となることが記載されている。
特許文献１には、ＶＥＧＦによる血管新生促進作用に対し、ＢＡＺＦが制御の鍵となることが記載されている。
また、例えば特許文献２には、ＢＡＺＦの発現を抑制し得る、二本鎖ｓｉＲＮＡの具体的な配列が記載されている（特許文献２の配列番号１及び２）。
しかしながら、特許文献２記載のｓｉＲＮＡは、本発明における配列番号１のヌクレオチド配列（１４６８位～１４８６位）よりも更に下流の１８２７位～１８４５位付近を標的とするものであり、本発明のｓｉＲＮＡと相違する。
日薬理誌 １３５、１４９－１５２（２０１０）
本発明者らは、眼内血管新生疾患の予防及び／又は治療に有用な薬剤を見出すべく鋭意検討を行った結果、ＢＡＺＦの発現を有効に抑制するｓｉＲＮＡ配列を見出し、更にそれを有効成分とする薬剤が、ＢＡＺＦの発現の抑制を通じて、ＶＥＧＦによる血管新生促進作用による血管新生、特に眼内血管の新生を抑制することを見出して本発明を完成させたものであって、その目的とするところは、新規なｓｉＲＮＡ、医薬組成物及び眼内血管新生疾患等の予防及び／又は治療剤を提供することにある。
上述の目的は、下記第一の発明から第十一の発明によって、達成される。
＜第一の発明＞
配列番号１に示されるヌクレオチド配列を標的遺伝子配列とすることを特徴とするｓｉＲＮＡ。
配列番号１に示されるヌクレオチド配列を標的遺伝子配列とすることを特徴とするｓｉＲＮＡ。
配列番号１：ACACCAAAGUGCACUACCA
＜第二の発明＞
３’末端に１又は数塩基のオーバーハング用の配列を有することを特徴とする、第一の発明に記載のｓｉＲＮＡ。
３’末端に１又は数塩基のオーバーハング用の配列を有することを特徴とする、第一の発明に記載のｓｉＲＮＡ。
＜第三の発明＞
ｓｉＲＮＡを構成する少なくとも一部の糖（リボース）の２’位の水酸基が、化学修飾されたものであることを特徴とする、第一の発明又は第二の発明に記載のｓｉＲＮＡ。
ｓｉＲＮＡを構成する少なくとも一部の糖（リボース）の２’位の水酸基が、化学修飾されたものであることを特徴とする、第一の発明又は第二の発明に記載のｓｉＲＮＡ。
＜第四の発明＞
化学修飾が、水酸基のメトキシ基による置換であることを特徴とする、第一の発明乃至第三の発明のいずれか１つの発明に記載のｓｉＲＮＡ。
化学修飾が、水酸基のメトキシ基による置換であることを特徴とする、第一の発明乃至第三の発明のいずれか１つの発明に記載のｓｉＲＮＡ。
＜第五の発明＞
下記のいずれかの配列番号の組み合わせより構成される二本鎖ＲＮＡであることを特徴とする、第一の発明乃至第四の発明のいずれか１つの発明に記載のｓｉＲＮＡ。
i）配列番号２（sense鎖）及び３（antisense鎖）
ii）配列番号４（sense鎖）及び５（antisense鎖）
iii）配列番号６（sense鎖）及び７（antisense鎖）
下記のいずれかの配列番号の組み合わせより構成される二本鎖ＲＮＡであることを特徴とする、第一の発明乃至第四の発明のいずれか１つの発明に記載のｓｉＲＮＡ。
i）配列番号２（sense鎖）及び３（antisense鎖）
ii）配列番号４（sense鎖）及び５（antisense鎖）
iii）配列番号６（sense鎖）及び７（antisense鎖）
＜第六の発明＞
配列番号４及び５の組み合わせより構成される二本鎖ＲＮＡであることを特徴とする第五の発明に記載のｓｉＲＮＡ。
配列番号４及び５の組み合わせより構成される二本鎖ＲＮＡであることを特徴とする第五の発明に記載のｓｉＲＮＡ。
＜第七の発明＞
配列番号６及び７の組み合わせより構成される二本鎖ＲＮＡであることを特徴とする第五の発明に記載のｓｉＲＮＡ。
配列番号６及び７の組み合わせより構成される二本鎖ＲＮＡであることを特徴とする第五の発明に記載のｓｉＲＮＡ。
＜第八の発明＞
第一の発明乃至第七の発明のいずれか１つの発明に記載のｓｉＲＮＡを含有することを特徴とする、医薬組成物。
第一の発明乃至第七の発明のいずれか１つの発明に記載のｓｉＲＮＡを含有することを特徴とする、医薬組成物。
＜第九の発明＞
第一の発明乃至第七の発明のいずれか１つの発明に記載のｓｉＲＮＡを含有することを特徴とする、血管新生に起因する疾患の予防及び／又は治療剤。
第一の発明乃至第七の発明のいずれか１つの発明に記載のｓｉＲＮＡを含有することを特徴とする、血管新生に起因する疾患の予防及び／又は治療剤。
＜第十の発明＞
第一の発明乃至第七の発明のいずれか１つの発明に記載のｓｉＲＮＡを含有することを特徴とする、眼内血管新生疾患の予防及び／又は治療剤。
第一の発明乃至第七の発明のいずれか１つの発明に記載のｓｉＲＮＡを含有することを特徴とする、眼内血管新生疾患の予防及び／又は治療剤。
＜第十一の発明＞
眼内血管新生疾患が糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜分枝静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、血管新生緑内障、血管新生黄斑症、糖尿病黄斑浮腫及び加齢黄斑変性症から選択される疾患である第十の発明に記載の予防及び／又は治療剤。
眼内血管新生疾患が糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜分枝静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、血管新生緑内障、血管新生黄斑症、糖尿病黄斑浮腫及び加齢黄斑変性症から選択される疾患である第十の発明に記載の予防及び／又は治療剤。
本発明のｓｉＲＮＡは、ＶＥＧＦによる血管新生促進作用が関与する疾患、例えば増殖糖尿病網膜症等の糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜分枝静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、血管新生緑内障、血管新生黄斑症、糖尿病黄斑浮腫及び加齢黄斑変性症等を、ＢＡＺＦの発現を抑制することを通じて、予防及び／又は治療することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
［本発明のｓｉＲＮＡ］
本発明のｓｉＲＮＡは、配列番号１に示されるヒト・サルに共通なヌクレオチド配列を標的遺伝子配列とする配列を有し、ＶＥＧＦによる血管新生促進作用を有意に抑制することを特徴とするものである。
本発明のｓｉＲＮＡは、配列番号１に示されるヒト・サルに共通なヌクレオチド配列を標的遺伝子配列とする配列を有し、ＶＥＧＦによる血管新生促進作用を有意に抑制することを特徴とするものである。
本願発明者等は、ＢＡＺＦ（ＢＣＬ６Ｂ；Ref Seq（mRNA）；NM 181844）の核酸配列中の、種々の部位をターゲットとして、ｓｉＲＮＡのデザインを行い、種々検討した結果、配列番号１に示した、下記＃５の部位に対するｓｉＲＮＡ（以下、ｓｉＢＡＺＦ＃５等と記載する場合がある。）が、極めて効果的であることを見出した。
＃５；１４６８位～１４８６位（配列番号１）
《ｓｉＲＮＡの配列》
従って、本発明の配列番号１に示されるヌクレオチド配列を標的遺伝子配列とするｓｉＲＮＡ（二本鎖）としては、
Ａ）ＢＡＺＦ（ＢＣＬ６Ｂ）遺伝子の核酸配列中の、１４６８位～１４８６位（配列番号１）に相当する１９塩基配列からなる配列（センス鎖）と、
Ｂ）Ａ）と二本鎖を形成し得る配列（アンチセンス鎖）
からなるものが挙げられる。
従って、本発明の配列番号１に示されるヌクレオチド配列を標的遺伝子配列とするｓｉＲＮＡ（二本鎖）としては、
Ａ）ＢＡＺＦ（ＢＣＬ６Ｂ）遺伝子の核酸配列中の、１４６８位～１４８６位（配列番号１）に相当する１９塩基配列からなる配列（センス鎖）と、
Ｂ）Ａ）と二本鎖を形成し得る配列（アンチセンス鎖）
からなるものが挙げられる。
また、本発明のｓｉＲＮＡには、上記のＡ）及び／又はＢ）に、Ａ）とＢ）が二本鎖を形成し得る限りにおいて下記の種々の改変、修飾を施したもの等も含まれる。
尚、二本鎖を形成し得るとは、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができることを意味し、必ずしも、対応する構成塩基同士が完全に相補対を形成している必要は無い。
（核酸配列の改変）
上述のＡ）及び／又はＢ）の改変とは、より具体的には、Ａ）及び／又はＢ）の核酸配列に、１乃至数個の塩基（ヌクレオチド）の、置換、欠失、付加及び／又は挿入等（以下、改変と記載することがある。）が施されていることを意味する。
上述のＡ）及び／又はＢ）の改変とは、より具体的には、Ａ）及び／又はＢ）の核酸配列に、１乃至数個の塩基（ヌクレオチド）の、置換、欠失、付加及び／又は挿入等（以下、改変と記載することがある。）が施されていることを意味する。
置換、付加及び／又は挿入する塩基は、リボースに結合するもののほか、後述するｄＴｄＴ等のように、デオキシリボースに結合しているものであっても良い。
但し、置換、欠失、付加及び／又は挿入は、ｓｉＲＮＡ効果を失わないようなものが好ましく、例えば、標的となる配列番号１のＲＮＡ配列と、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド等が挙げられる。
ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を言い、例えば、J. Sambrookら、Molecular Cloning、 A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)（特に11.45節“Conditions for Hybridization of oligonucleotide Probes等）及び Elbashir SM、Lendeckel W、Tuschl T.、Genes Dev. 2001 Jan 15;15(2):188-200. doi: 10.1101/gad.862301に記載されている条件等が挙げられる。
上記の付加の一例としては、下記のオーバーハング用の配列等が挙げられる。
（オーバーハング用の配列の付加）
本発明のｓｉＲＮＡは、上記のｓｉＲＮＡの３’末端に１又は数塩基のオーバーハング用の配列を有することが好ましい。
本発明のｓｉＲＮＡは、上記のｓｉＲＮＡの３’末端に１又は数塩基のオーバーハング用の配列を有することが好ましい。
オーバーハング用の配列とは、アニーリングによって、センス鎖及びアンチセンス鎖からなる二本鎖ｓｉＲＮＡとなった際に、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の、主に３’末端側を突出させるための配列を意味する。
１又は数塩基とは、具体的には２塩基が一般的であるが、これに限定されるものでは無い。
オーバーハング用の配列としては、公知のものが使用できるが、例えばｄＴｄＴ等が、オーバーハングの効果が確立されているという点で好ましい。
（核酸を構成する糖部分の修飾）
本発明のｓｉＲＮＡは、相補的な塩基配列を有する核酸との安定的なハイブリッドの形成能の向上及び／又はヌクレアーゼ耐性の向上等の点で、ｓｉＲＮＡを構成する少なくとも一部の糖（リボース）の２’位の水酸基が、化学修飾されたものであることが好ましい。
本発明のｓｉＲＮＡは、相補的な塩基配列を有する核酸との安定的なハイブリッドの形成能の向上及び／又はヌクレアーゼ耐性の向上等の点で、ｓｉＲＮＡを構成する少なくとも一部の糖（リボース）の２’位の水酸基が、化学修飾されたものであることが好ましい。
本発明において、化学修飾とは、糖（リボース）の２’位の水酸基を、下記のような置換基で置換することを意味する。
・メトキシ基
・２－メトキシエトキシ基
・３－アミノプロピルオキシ基
・２－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノオキシ）エトキシ基
・フルオロ基
・２－メトキシエトキシ基
・３－アミノプロピルオキシ基
・２－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノオキシ）エトキシ基
・フルオロ基
中でも、例えばＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体、Toll like receptor）を介する免疫応答を回避するためには、メトキシ基で置換（ＯＨのＯＭｅ化）することが好ましい。
また、ＲＮＡｉ活性（ｓｉＲＮＡ効果）を十分に発揮するためには、対象となるｓｉＲＮＡ分子を構成する糖（リボース）の２’位水酸基のうち、全てではなく一部のみが化学修飾されていることが好ましい。
一部のみを化学修飾する方法としては、例えば、ホスホロアミダイト法を用いた核酸自動合成装置を用いてｓｉＲＮＡを合成する場合、原料となるアミダイトとして、特定の塩基を含むアミダイトの一部又は全部の、２’位水酸基のみをＯＭｅ化しておくこと等によって、ｓｉＲＮＡ分子を構成する全ての糖（リボース）の２’位水酸基が化学修飾されることを防ぐことができる。
上記特定の塩基としては、ＴＬＲの活性化を効果的に抑制することが知られている点で、ＵやＧ等が好ましいものとして挙げられる。
化学修飾は、上記Ａ）、Ｂ）の少なくとも一方において施されていれば良い。
本発明のｓｉＲＮＡの具体的としては、例えば下記のいずれかの組み合わせより構成される二本鎖ＲＮＡが、好ましいものとして挙げられるが、必ずしもこれらに限定されるものではなく、これらの二本鎖ＲＮＡに、センス鎖とアンチセンス鎖が二本鎖を形成し得る限りにおいて、上述のような塩基自体の改変（１乃至数個の塩基（ヌクレオチド）の、置換、欠失、付加及び／又は挿入）が施されたもの等も含まれる。
尚、上記表１の配列中、細字はＲＮＡ、太字のｄＴはＤＮＡ（オーバーハング用の配列）を表す。
また、表１中のＵｍ、Ｇｍとは、それぞれの塩基が結合している糖（リボース）２’位の水酸基がメトキシ基で置換されていることを意味するが、この置換は、２’ＯＭｅ（又は２’－Ｏ－Ｍｅｔｈｙｌ）等と表現される場合がある。
《ｓｉＲＮＡの製法》
上述の本発明のｓｉＲＮＡ（ｓｉＢＡＺＦ）は、例えば核酸自動合成装置や形質転換細胞等を用いて人工的に合成する方法、
天然に存在するポリヌクレオチドを抽出する方法、
天然からの抽出ポリヌクレオチドの塩基の一部を欠失、置換、付加及び／又は挿入する方法、
目的とする配列と相補的な配列を用い、逆転写酵素やＲＮＡポリメラーゼ等によって目的の配列のものを合成させる方法、
あるいはこれらを組み合わせた方法
等の方法によって製造することができる。
上述の本発明のｓｉＲＮＡ（ｓｉＢＡＺＦ）は、例えば核酸自動合成装置や形質転換細胞等を用いて人工的に合成する方法、
天然に存在するポリヌクレオチドを抽出する方法、
天然からの抽出ポリヌクレオチドの塩基の一部を欠失、置換、付加及び／又は挿入する方法、
目的とする配列と相補的な配列を用い、逆転写酵素やＲＮＡポリメラーゼ等によって目的の配列のものを合成させる方法、
あるいはこれらを組み合わせた方法
等の方法によって製造することができる。
尚、上記の核酸自動合成装置を用いる方法としては、具体的には、アミダイトを用いたホスホロアミダイト法等が挙げられるが、これに限られるものではない。
また、ｓｉＲＮＡを構成する少なくとも一部の糖（リボース）の２’位の水酸基が化学修飾された本発明のｓｉＲＮＡは、材料であるアミダイト中の糖（リボース）、又は合成後のヌクレオチドを構成する糖（リボース）の、一部又は全部の２’位の水酸基を、公知の方法に従って、上述の置換基で置換（保護）し、必要に応じて適宜、その一部の置換基を脱保護すること等によって行うことができる。
《ｓｉＲＮＡの用途》
本発明のｓｉＲＮＡは、後述する本発明の医薬組成物や予防及び／又は治療剤として用いることができる他、実験室内における、実験・研究試薬（ＢＡＺＦ発現抑制剤又は血管新生阻害剤）としても利用価値の高いものである。
本発明のｓｉＲＮＡは、後述する本発明の医薬組成物や予防及び／又は治療剤として用いることができる他、実験室内における、実験・研究試薬（ＢＡＺＦ発現抑制剤又は血管新生阻害剤）としても利用価値の高いものである。
［本発明の医薬組成物］
本発明の医薬組成物は、上記の本発明のｓｉＲＮＡを含有することを特徴とするものである。
具体的には、以下の本発明の予防及び／又は治療剤の項で詳述したもの等が、医薬組成物の一例として挙げられる。
本発明の医薬組成物は、上記の本発明のｓｉＲＮＡを含有することを特徴とするものである。
具体的には、以下の本発明の予防及び／又は治療剤の項で詳述したもの等が、医薬組成物の一例として挙げられる。
［本発明の疾患の予防及び／又は治療剤］
本発明の疾患の予防及び／又は治療剤は、上記本発明のｓｉＲＮＡを含むことを特徴とするものであって、ＶＥＧＦによる血管新生促進作用が関与する疾患、例えば増殖糖尿病網膜症等の糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜分枝静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、血管新生緑内障、血管新生黄斑症、糖尿病黄斑浮腫及び加齢黄斑変性症等を、ＢＡＺＦの発現を抑制することを通じて、予防及び／又は治療することができるものである。
本発明の疾患の予防及び／又は治療剤は、上記本発明のｓｉＲＮＡを含むことを特徴とするものであって、ＶＥＧＦによる血管新生促進作用が関与する疾患、例えば増殖糖尿病網膜症等の糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜分枝静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、血管新生緑内障、血管新生黄斑症、糖尿病黄斑浮腫及び加齢黄斑変性症等を、ＢＡＺＦの発現を抑制することを通じて、予防及び／又は治療することができるものである。
（添加剤）
本発明の医薬組成物或いは本発明の予防及び／又は治療剤（以下、医薬組成物等と記載する場合がある。）は、有効成分である本発明のｓｉＲＮＡ単独で、或いはｓｉＲＮＡを医薬上許容される添加剤とともに使用して、各々製剤化することができる。
本発明の医薬組成物或いは本発明の予防及び／又は治療剤（以下、医薬組成物等と記載する場合がある。）は、有効成分である本発明のｓｉＲＮＡ単独で、或いはｓｉＲＮＡを医薬上許容される添加剤とともに使用して、各々製剤化することができる。
医薬上許容される添加剤としては、例えば、下記のようなものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
ショ糖、デンプン等の有機系の賦形剤
セルロース、メチルセルロース等の結合剤
デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤
ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑沢剤（滑剤）
メントール等の芳香剤
安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤
クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤
メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の懸濁剤
界面活性剤等の分散剤
水、生理食塩水等の希釈剤
セルロース、メチルセルロース等の結合剤
デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤
ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑沢剤（滑剤）
メントール等の芳香剤
安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤
クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤
メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の懸濁剤
界面活性剤等の分散剤
水、生理食塩水等の希釈剤
（核酸導入用試薬）
本発明のｓｉＲＮＡの標的細胞内への導入を促進するために、本発明のｓｉＲＮＡを含む医薬組成物等、或いは実験試薬等には、更に公知の核酸導入用試薬を含有させることができる。
本発明のｓｉＲＮＡの標的細胞内への導入を促進するために、本発明のｓｉＲＮＡを含む医薬組成物等、或いは実験試薬等には、更に公知の核酸導入用試薬を含有させることができる。
具体的な核酸導入用試薬としては、例えば下記のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
アテロコラーゲン、リポソーム、ナノパーティクル、リポフェクチン、リポフェクタミン（lipofectamine：登録商標）、ＤＯＧＳ（トランスフェクタム：ジオクトアデシルアミドグリシルスペルミン）、ＤＯＰＥ（Ｌ－α－ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＯＴＡＰ（１,２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、ＤＨＤＥＡＢ（Ｎ，Ｎ－ジ－ｎ－ヘキサアデシル－Ｎ，Ｎ－ジヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＨＤＥＡＢ（Ｎ－ｎ－ヘキサアデシル－Ｎ，Ｎ－ジヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ポリブレン、或いはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）等の陽イオン性脂質等を用いることが出来る。
また、本発明の医薬組成物等は、以下の血管新生制御に係る分子標的薬等との合剤あるいはそれぞれの特性を活かした組み合わせで使用することもできる。
ＶＥＧＦに対するヒト型モノクローナル抗体医薬、ＶＥＧＦに対するＲＮＡアプタマー医薬、Notch1、Notch1遺伝子、CBF-1、CBF-1遺伝子、HEY1、HEY1遺伝子、HEY2、HEY2遺伝子、HES1、HES1遺伝子等に対する各種核酸医薬
（剤形）
本発明の医薬組成物等の剤形は、例えば硝子体内注射剤等の注射剤、点眼薬、吸入製剤等が挙げられる。
本発明の医薬組成物等の剤形は、例えば硝子体内注射剤等の注射剤、点眼薬、吸入製剤等が挙げられる。
（有効成分の含有量）
本発明の医薬組成物等中の、有効成分ｓｉＲＮＡの含有量は、剤形によって様々であり、一概に限定できず、各種剤形化が可能な範囲で、後述する投与量との関係で適宜選択すれば良い。
本発明の医薬組成物等中の、有効成分ｓｉＲＮＡの含有量は、剤形によって様々であり、一概に限定できず、各種剤形化が可能な範囲で、後述する投与量との関係で適宜選択すれば良い。
（製造方法）
本発明の医薬組成物等は、上記の成分を用いて、周知の方法で製剤化することができる。
本発明の医薬組成物等は、上記の成分を用いて、周知の方法で製剤化することができる。
尚、リポソームへのｓｉＲＮＡ封入法としては、例えば下記のような、公知の方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
リピドフィルム法（ボルテックス法）、逆相蒸発法、界面活性剤除去法、凍結融解法、リモートローディング法等
（投与経路）
本発明の医薬組成物等の投与経路としては、全身投与と局所投与があり、具体的には、静注等の静脈投与、筋注等の筋肉内投与、経鼻投与、皮内投与、皮下投与、粘膜投与、吸入、眼内投与等が挙げられ、治療目的の疾患、症状等に応じて、適宜選択することができる。例えば、加齢黄斑変性症のように病巣部が特定されている疾患の場合には、硝子体内投与もしくは点眼等の局所投与が好ましい。
本発明の医薬組成物等の投与経路としては、全身投与と局所投与があり、具体的には、静注等の静脈投与、筋注等の筋肉内投与、経鼻投与、皮内投与、皮下投与、粘膜投与、吸入、眼内投与等が挙げられ、治療目的の疾患、症状等に応じて、適宜選択することができる。例えば、加齢黄斑変性症のように病巣部が特定されている疾患の場合には、硝子体内投与もしくは点眼等の局所投与が好ましい。
（投与方法）
投与方法は、特に制限されず、適宜、従来公知のデリバリーシステムを利用できる。
投与方法は、特に制限されず、適宜、従来公知のデリバリーシステムを利用できる。
例えば、アテロコラーゲンを用いた局所投与法、全身投与法が好ましい。
前記アテロコラーゲンは、例えば、局所止血剤として既に臨床応用されており、また、前記アテロコラーゲンを用いたｓｉＲＮＡの局所投与法は、ＶＥＧＦを分子標的とした動物実験でその有意性が示されている（Ｔａｋｅｉ Ｙら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６４（１０）：３３６５－３３７０、２００４）。
また、その他のデリバリーシステムとして、生体内での分解を防ぎ、細胞内透過性を高めるための化学修飾（Ｒｏｓｓｉ ＪＪ．、Ｎａｔｕｒｅ ４３２（７０１４）：１５５－１５６、２００４； Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ Ｊら、Ｎａｔｕｒｅ ４３２（７０１４）：１７３－１７８、２００４）やカチオニックリポソーム（Ｙａｎｏ Ｊら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １０（２２）：７７２１－７７２６、２００４）を用いたデリバリーシステムを利用しても良い。
さらに、必要に応じて、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡを発現するｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築し、遺伝子治療技術を利用したデリバリーシステムを利用することもできる。
（投与量）
本発明の医薬組成物等の投与量は、投与経路、症状、年齢、性別、体重、医薬組成物等の形態等によって異なるため、一概には規定できないが、例えば、医薬組成物等中の有効成分（ｓｉＲＮＡ）の量が、遺伝子として０．０００１～１００ｍｇ、好ましくは、０．００１～１０ｍｇ等を、数日乃至数ヶ月に１回程度等投与するのが好ましい。
本発明の医薬組成物等の投与量は、投与経路、症状、年齢、性別、体重、医薬組成物等の形態等によって異なるため、一概には規定できないが、例えば、医薬組成物等中の有効成分（ｓｉＲＮＡ）の量が、遺伝子として０．０００１～１００ｍｇ、好ましくは、０．００１～１０ｍｇ等を、数日乃至数ヶ月に１回程度等投与するのが好ましい。
本発明の内容を以下の試験例及び実施例等でさらに詳細に説明するが、本発明はその内容に限定されるものではない。
試験例１
ヒト網膜毛細血管内皮細胞におけるＢＡＺＦの発現抑制効果確認試験
ヒト網膜毛細血管内皮細胞におけるＢＡＺＦの発現抑制効果確認試験
《材料と方法》
ヒト網膜毛細血管内皮細胞（Human retinal microvascular endothelial cells; HRMEC, Cell systems製）を３．０×１０４cells/mlとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。
ヒト網膜毛細血管内皮細胞（Human retinal microvascular endothelial cells; HRMEC, Cell systems製）を３．０×１０４cells/mlとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。
細胞培養には、分裂促進因子（mitogen）の一種であるCulture boost（登録商標）を含むCS-C Complete Medium（Cell systems製）を使用した。２４時間培養後、Lipofectamine（登録商標）RNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてControl ｓｉＲＮＡ（ＢＡＺＦをターゲットとしないｓｉＲＮＡ，MISSION（登録商標）siRNA Universal Negative Control（SIC001）Sigma-Aldrich製，以下ｓｉＣｏｎｔと記載する。）、表１に記載のｓｉＢＡＺＦ＃５、ｓｉＢＡＺＦ＃５－４及びｓｉＢＡＺＦ＃５－６それぞれを終濃度２５ｎＭとなるように添加し２４時間培養した。
更に、１０％ＦＢＳ含有培地（Culture boost（登録商標）を含まない）へ培地交換し、６時間の培養を行った。
ＰＢＳに溶解したＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ、R&D systems製）を添加し、更に１時間培養した。
更に、１０％ＦＢＳ含有培地（Culture boost（登録商標）を含まない）へ培地交換し、６時間の培養を行った。
ＰＢＳに溶解したＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ、R&D systems製）を添加し、更に１時間培養した。
尚、比較対象のためのＶＥＧＦを添加しない群に関しては、ＰＢＳを添加した。
NucleoSpin（登録商標）RNA kit（Takara製）を用いてＲＮＡを抽出し、PrimeScript （登録商標）RT reagent kit （Takara製）を用いてｃＤＮＡを作製した。
ＲＴ－ＰＣＲは、TB Green Premix Ex Taq （登録商標）II（Takara製）を用いて、９５℃で３０秒を１サイクル、９５℃で５秒、６０℃で３０秒を４０サイクルの反応により行った。
尚、使用したプライマーの配列は、以下の通りである。
ＢＡＺＦ forward：CGGGAAGTGAATTTTTCAGC（配列番号８）
ＢＡＺＦ reverse：TGGTAAGGCTTTTCCCCTGT（配列番号９）
ＢＡＺＦ forward：CGGGAAGTGAATTTTTCAGC（配列番号８）
ＢＡＺＦ reverse：TGGTAAGGCTTTTCCCCTGT（配列番号９）
GAPDH forward：CCTGCACCACCAACTGCTTA（配列番号１０）
GAPDH reverse：GGCCATCCACAGTCTTCTGAG（配列番号１１
（Eurofins Genomics社（東京）製）
GAPDH reverse：GGCCATCCACAGTCTTCTGAG（配列番号１１
（Eurofins Genomics社（東京）製）
使用したｓｉＲＮＡは、上述の表１に記載のｓｉＢＡＺＦ＃５、ｓｉＢＡＺＦ＃５－４、ｓｉＢＡＺＦ＃５－６である。
《結果》
結果を図１に示す。
図１に示した通り、ｓｉＢＡＺＦ＃５、ｓｉＢＡＺＦ＃５－４及びｓｉＢＡＺＦ＃５－６は、ＢＡＺＦの発現を有意に抑制した。
結果を図１に示す。
図１に示した通り、ｓｉＢＡＺＦ＃５、ｓｉＢＡＺＦ＃５－４及びｓｉＢＡＺＦ＃５－６は、ＢＡＺＦの発現を有意に抑制した。
従って、ＢＡＺＦのヌクレオチド配列の一部である配列番号１（＃５）を標的とするｓｉＢＡＺＦ（ｓｉＢＡＺＦ＃５、ｓｉＢＡＺＦ＃５－４及びｓｉＢＡＺＦ＃５－６）、なかでも特にｓｉＢＡＺＦ＃５－４は、ＶＥＧＦによる血管新生促進作用が関与する疾患、例えば増殖糖尿病網膜症等の糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜分枝静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、血管新生緑内障、血管新生黄斑症、糖尿病黄斑浮腫及び加齢黄斑変性症等を、ＢＡＺＦの発現を抑制することを通じて、予防及び／又は治療することができる。
また、上記ｓｉＢＡＺＦ＃５－４をカニクイザルに硝子体内投与し、qRT-PCRによるBAZFのmRNA解析を行うことによりBAZFの発現が抑制されることを確認した。
また、上記ｓｉＢＡＺＦ＃５－４をカニクイザルに硝子体内投与し、qRT-PCRによるBAZFのmRNA解析を行うことによりBAZFの発現が抑制されることを確認した。
実施例１
ｓｉＢＡＺＦ＃５
二本鎖のｓｉＲＮＡ（ｓｉＢＡＺＦ＃５）を、以下の通り作成した。
ｓｉＢＡＺＦ＃５
二本鎖のｓｉＲＮＡ（ｓｉＢＡＺＦ＃５）を、以下の通り作成した。
ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖のオリゴヌクレオチドを、それぞれ対応するＲＮＡ合成用アミダイト試薬を用いたホスホロアミダイト法によって核酸自動合成装置を用いて合成し、次いで、常法に従って塩基部脱保護及び２’位水酸基の脱保護を行い、一本鎖の状態でカラム精製し、脱塩、次いでセンス鎖とアンチセンス鎖のアニーリングを行い、凍結乾燥し、表１記載のｓｉＲＮＡを作製した。
実施例２
ｓｉＢＡＺＦ＃５－４
二本鎖のｓｉＲＮＡ（ｓｉＢＡＺＦ＃５－４）を、以下の通り作成した。
ｓｉＢＡＺＦ＃５－４
二本鎖のｓｉＲＮＡ（ｓｉＢＡＺＦ＃５－４）を、以下の通り作成した。
ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖のオリゴヌクレオチドを、対応するＲＮＡ合成用アミダイト試薬および２’－Ｏ－Ｍｅｔｈｙｌ修飾型アミダイト試薬を用いたホスホロアミダイト法によって核酸自動合成装置を用いて合成し、次いで、常法に従って塩基部脱保護及びリボース２’位水酸基の置換基の脱保護を行い、一本鎖の状態でカラム精製し、脱塩、次いでセンス鎖とアンチセンス鎖のアニーリングを行い、凍結乾燥し、表１記載のｓｉＲＮＡを作製した。
実施例３
ｓｉＢＡＺＦ＃５－６
二本鎖のｓｉＲＮＡ（ｓｉＢＡＺＦ＃５－６）を、実施例２の方法と同様にして表１記載のｓｉＲＮＡを作製した。
ｓｉＢＡＺＦ＃５－６
二本鎖のｓｉＲＮＡ（ｓｉＢＡＺＦ＃５－６）を、実施例２の方法と同様にして表１記載のｓｉＲＮＡを作製した。
本発明のＢＡＺＦの発現を抑制するｓｉＲＮＡを有効成分とする医薬は、ＶＥＧＦによる血管新生促進作用が関与する疾患、例えば増殖糖尿病網膜症等の糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜分枝静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、血管新生緑内障、血管新生黄斑症、糖尿病黄斑浮腫及び加齢黄斑変性症等を、ＢＡＺＦの発現を抑制することを通じて、予防及び／又は治療することができる。
Claims (11)
- 配列番号１に示されるヌクレオチド配列を標的遺伝子配列とすることを特徴とするｓｉＲＮＡ。
- ３’末端に１又は数塩基のオーバーハング用の配列を有することを特徴とする、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
- ｓｉＲＮＡを構成する少なくとも一部のリボースの２’位の水酸基が、化学修飾されたものであることを特徴とする、請求項１又は２に記載のｓｉＲＮＡ。
- 化学修飾が、水酸基のメトキシ基による置換であることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
- 下記のいずれかの配列番号の組み合わせより構成される二本鎖ＲＮＡであることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
i）配列番号２（sense鎖）及び３（antisense鎖）
ii）配列番号４（sense鎖）及び５（antisense鎖）
iii）配列番号６（sense鎖）及び７（antisense鎖） - 配列番号４及び５の組み合わせより構成される二本鎖ＲＮＡであることを特徴とする請求項５に記載のｓｉＲＮＡ。
- 配列番号６及び７の組み合わせより構成される二本鎖ＲＮＡであることを特徴とする請求項５に記載のｓｉＲＮＡ。
- 請求項１乃至７のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡを含有することを特徴とする、医薬組成物。
- 請求項１乃至７のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡを含有することを特徴とする、血管新生に起因する疾患の予防及び／又は治療剤。
- 請求項１乃至７のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡを含有することを特徴とする、眼内血管新生疾患の予防及び／又は治療剤。
- 眼内血管新生疾患が糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜分枝静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、血管新生緑内障、血管新生黄斑症、糖尿病黄斑浮腫及び加齢黄斑変性症から選択される疾患である請求項１０に記載の予防及び／又は治療剤。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2020183608A JP2024026903A (ja) | 2020-11-02 | 2020-11-02 | ｓｉＲＮＡ及び医薬組成物並びに予防及び／又は治療剤 |
| JP2020-183608 | 2020-11-02 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2022092279A1 true WO2022092279A1 (ja) | 2022-05-05 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2021/040073 WO2022092279A1 (ja) | 2020-11-02 | 2021-10-29 | ｓｉＲＮＡ及び医薬組成物並びに予防及び／又は治療剤 |
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Citations (2)
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| WO2010018764A1 (ja) * | 2008-08-14 | 2010-02-18 | 国立大学法人愛媛大学 | 血管新生制御剤，及びそのスクリーニング方法，並びにスクリーニング用キット |
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-
2020
- 2020-11-02 JP JP2020183608A patent/JP2024026903A/ja active Pending
-
2021
- 2021-10-29 WO PCT/JP2021/040073 patent/WO2022092279A1/ja active Application Filing
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BUCHBERGER ELISABETH, PAYRHUBER DIETMAR, HARCHI MIRIAM EL, ZAGRAPAN BRANISLAV, SCHEUBA KATHARINA, ZOMMER ANNA, BUGYIK EDINA, DOME : "Inhibition of the transcriptional repressor complex Bcl-6/BCoR induces endothelial sprouting but does not promote tumor growth", ONCOTARGET, vol. 8, no. 1, 3 January 2017 (2017-01-03), pages 552 - 564, XP055926371, DOI: 10.18632/oncotarget.13477 * |
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