JPWO2020023420A5

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Publication number: JPWO2020023420A5
Application number: JP2021503558A
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Publication date: 2022-08-01
Anticipated expiration: 2039-07-22

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本明細書において引用されている特許、特許出願、ウェブサイト、他の刊行物または文書、受託番号などは全て、各個別の項目が参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されたものと同じく、あらゆる目的に関してその全体が参照により組み込まれる。異なるバージョンの配列が違う時間に受託番号に関連付けられている場合、本出願の有効な出願日に受託番号に関連付けられたバージョンが意図される。有効な出願日とは、実際の出願日よりも前または該当する場合には受託番号を参照する優先出願の出願日を意味する。同様に、異なるバージョンの刊行物、ウェブサイトなどが違う時間に公開されている場合、別段の指定のない限り、本出願の有効な出願日のごく最近に公開されたバージョンが意図される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
対象における腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）を決定する方法であって、
（ａ）前記対象由来の試料中の１つまたは複数の核酸から得られた配列情報から観測変異カウントを決定するステップと、
（ｂ）前記核酸の腫瘍割合および／またはカバレッジを決定して、シーケンシングパラメータを生成するステップと、
（ｃ）前記シーケンシングパラメータを考慮して予測変異割合および／または前記予測変異割合の予測分布を決定して、予測結果を生成するステップと、
（ｄ）前記予測結果を考慮して前記観測変異カウントを調整して、調整された結果を生成し、それにより、前記対象における前記ＴＭＢを決定するステップと
を含む方法。
(項目２)
対象における腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）を決定する方法であって、
（ａ）前記対象由来の試料を提供するステップと、
（ｂ）前記試料中の核酸を増幅させて、増幅した核酸を生成するステップと、
（ｃ）前記増幅した核酸のシーケンシングを行って、配列情報を生成するステップと、
（ｄ）前記配列情報から観測変異カウントを決定するステップと、
（ｅ）前記核酸の腫瘍割合および／またはカバレッジを決定して、シーケンシングパラメータを生成するステップと、
（ｆ）前記シーケンシングパラメータを考慮して予測変異割合および／または前記予測変異割合の予測分布を決定して、予測結果を生成するステップと、
（ｇ）前記予測結果を考慮して前記観測変異カウントを調整して、調整された結果を生成し、それにより、前記対象における前記ＴＭＢを決定するステップと
を含む方法。
(項目３)
対象におけるがんを処置するために１つまたは複数のカスタマイズされた療法を選択する方法であって、
（ａ）前記対象由来の試料中の１つまたは複数の核酸から得られた配列情報から観測変異カウントを決定するステップと、
（ｂ）前記核酸の腫瘍割合および／またはカバレッジを決定して、シーケンシングパラメータを生成するステップと、
（ｃ）前記シーケンシングパラメータを考慮して予測変異割合および／または前記予測変異割合の予測分布を決定して、予測結果を生成するステップと、
（ｄ）前記予測結果を考慮して前記観測変異カウントを調整して、調整された結果を生成するステップと、
（ｅ）前記調整された結果を、１つまたは複数の療法を指し示す１つまたは複数の比較用結果と比較して、前記対象に対する１つまたは複数のカスタマイズされた療法を識別するステップと
を含む方法。
(項目４)
対象におけるがんを処置する方法であって、
（ａ）前記対象由来の試料中の１つまたは複数の核酸から得られた配列情報から観測変異カウントを決定するステップと、
（ｂ）前記核酸の腫瘍割合および／またはカバレッジを決定して、シーケンシングパラメータを生成するステップと、
（ｃ）前記シーケンシングパラメータを考慮して予測変異割合および／または前記予測変異割合の予測分布を決定して、予測結果を生成するステップと、
（ｄ）前記予測結果を考慮して前記観測変異カウントを調整して、調整された結果を生成するステップと、
（ｅ）前記調整された結果を、１つまたは複数の療法を指し示す１つまたは複数の比較用結果と比較して、前記対象に対する１つまたは複数のカスタマイズされた療法を識別するステップと、
（ｆ）前記調整された結果と前記比較用結果が実質的にマッチする場合に、識別されたカスタマイズされた療法の少なくとも１つを前記対象に施行して、それにより、前記対象におけるがんを処置するステップと
を含む方法。
(項目５)
対象におけるがんを処置する方法であって、１つまたは複数のカスタマイズされた療法を前記対象に施行し、それにより、前記対象におけるがんを処置することを含み、前記カスタマイズされた療法が、
（ａ）前記対象由来の試料中の１つまたは複数の核酸から得られた配列情報から観測変異カウントを決定するステップと、
（ｂ）前記核酸の腫瘍割合および／またはカバレッジを決定して、シーケンシングパラメータを生成するステップと、
（ｃ）前記シーケンシングパラメータを考慮して予測変異割合および／または前記予測変異割合の予測分布を決定して、予測結果を生成するステップと、
（ｄ）前記予測結果を考慮して前記観測変異カウントを調整して、調整された結果を生成するステップと、
（ｅ）前記調整された結果を、１つまたは複数の療法を指し示す１つまたは複数の比較用結果と比較するステップと、
（ｆ）前記調整された結果と前記比較用結果が実質的にマッチする場合に、前記対象に対する１つまたは複数のカスタマイズされた療法を識別するステップと
によって識別されたものである、方法。
(項目６)
前記観測変異カウントおよび／または前記腫瘍割合が、前記核酸において識別される複数の同義変異、複数の非同義変異、および／または複数の非コード変異を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目７)
前記観測変異カウントおよび／または前記腫瘍割合が、一塩基バリアント（ＳＮＶ）、挿入または欠失（インデル）、コピー数バリアント（ＣＮＶ）、融合、塩基転換、転座、フレームシフト、重複、反復伸長、およびエピジェネティックバリアントからなる群から選択される複数の変異を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目８)
前記観測変異カウントおよび／または前記腫瘍割合から、ドライバー変異および／またはクローン性造血由来変異が除外される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目９)
前記観測変異カウントを決定するために、所与の一塩基バリアント（ＳＮＶ）または所与の挿入もしくは欠失（インデル）に関して検出限界を下回る１つまたは複数の可能性のある変異のプールされたエビデンスを使用することを含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目１０)
前記予測変異割合を実際の変異カウントの観測割合として使用することを含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目１１)
前記観測変異カウントおよび／または前記腫瘍割合が、前記核酸において識別される複数の体細胞変異を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目１２)
前記観測変異カウントから１つまたは複数の既知のがんドライバーおよび／またはパッセンジャー変異が除外される、項目１１に記載の方法。
(項目１３)
前記配列情報を１つまたは複数の参照配列と比較して、前記観測変異カウントを識別することを含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目１４)
前記参照配列が、ｈｇ１９および／またはｈｇ３８の少なくとも部分配列を含む、項目１３に記載の方法。
(項目１５)
前記腫瘍割合が、前記核酸において識別される全ての体細胞変異の最大変異対立遺伝子割合（ＭＡＦ）を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目１６)
前記腫瘍割合が、前記試料中の全ての核酸の約０．０５％未満、約０．１％未満、約０．２％未満、約０．５％未満、約１％未満、約２％未満、約３％未満、約４％未満、または約５％未満である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目１７)
前記カバレッジを決定するために、前記核酸における所与のヌクレオチド位を含む複数の独特のｃｆＤＮＡ断片を識別することを含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目１８)
前記カバレッジを決定するために、前記核酸における所与のヌクレオチド位を構成する独特の細胞外遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）分子の数の中央値を識別することを含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目１９)
前記カバレッジが、前記試料中に存在する前記核酸における所与のヌクレオチド位において１０個から５０，０００個の間のｃｆＤＮＡ断片である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目２０)
前記予測変異割合および／または前記予測変異割合の前記予測分布が、前記変異割合に関して約９５％またはそれよりも大きな信頼区間を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目２１)
前記予測変異割合の９５％信頼区間の上限を使用して、前記観測変異カウントの下限を生成することを含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目２２)
所与の変異対立遺伝子割合（ＭＡＦ）における変異が予測ＭＡＦの分布にわたって識別される確率を算出して、前記予測変異割合を決定することを含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目２３)
予測相対的ＭＡＦの分布に前記腫瘍割合を掛けて、ＭＡＦを生成することを含む、項目２２に記載の方法。
(項目２４)
予測ＭＡＦの前記分布が、以下の二項比率の信頼区間を使用して算出される、項目２２または２３に記載の方法：

（式中、ｆは、コールされる変異の予測割合であり、ｎ＿真は、予測される実際の変異であり、これはｆを考慮して観測される変異の数と等しく、ｚは信頼水準である）。
(項目２５)
ｆが閾値 _ｆ未満の場合、ＴＭＢは決定されない、項目２４に記載の方法。
(項目２６)
ｆが閾値 _ｆを超える場合、ＴＭＢが決定される、項目２４に記載の方法。
(項目２７)
以下の方程式：
観測された変異の割合＝Σ _ＭＡＦ（Ｐ（変異のコール｜ＭＡＦ）×Ｐ（ＭＡＦにおける変異））
（式中、Ｐは確率であり、ＭＡＦは変異対立遺伝子割合である）
を使用して前記予測結果を決定することを含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目２８)
相対的ＭＡＦの予測分布が、対照試料データセットの１つまたは複数のデータセットから得られる、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目２９)
前記対照試料データセットが、少なくとも約２５、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１，０００、少なくとも約５，０００、少なくとも約１０，０００、少なくとも約１５，０００、少なくとも約２０，０００、少なくとも約２５，０００、少なくとも約３０，０００、またはそれよりも多くの対照試料を含む、項目２８に記載の方法。
(項目３０)
前記対照試料データセットにおいて観測される最大（ｍａｘ）ＭＡＦが、約０．５％、約１％、約２％、約５％または約１０％を構成する、項目２８または２９に記載の方法。
(項目３１)
前記相対的ＭＡＦを、以下の方程式：
Ｆ＝１／（１＋（Ｐ＿５０／相対的－ＭＡＦ） ^ｎ）
（式中、Ｆは、累積分布関数であり、Ｐ＿５０は、相対的ＭＡＦの中央値であり、相対的－ＭＡＦは相対的ＭＡＦであり、ｎは、相対的な分布の形状を当てはめるための指数である）
を使用して曲線に当てはめることを含む、項目２８から３０までのいずれか一項に記載の方法。
(項目３２)
前記試料における前記観測変異カウントを予測変異割合または前記予測変異割合の信頼区間の上限／下限で割って、前記調整された結果を生成することを含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目３３)
前記調整された結果が、変異対立遺伝子割合の範囲にわたって前記核酸において検出される複数の変異を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目３４)
前記観測変異カウントを前記予測結果で割って、前記調整された結果を生成することを含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目３５)
前記調整された結果が、可能性が最も高い実際の変異カウントの予想を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目３６)
前記調整された結果が、可能性が最も低い実際の変異カウントの予想を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目３７)
前記調整された結果が、調整された変異カウントを含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目３８)
前記調整された変異カウントが、前記観測変異カウントよりも大きいかまたはそれと等しい、項目３７に記載の方法。
(項目３９)
前記対象由来の前記試料中の前記核酸から前記配列情報を得ることを含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目４０)
前記配列情報を、前記核酸の標的とされるセグメントから得る、項目３９に記載の方法。
(項目４１)
標的とされるセグメントが、約１から約１００，０００の間の異なるおよび／または重複するゲノム領域を含む、項目３９または４０に記載の方法。
(項目４２)
前記対象由来の前記試料を得ることを含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目４３)
前記試料が、組織、血液、血漿、血清、喀痰、尿、精液、膣液、糞便、滑液、脊髄液、および唾液からなる群から選択される、項目４２に記載の方法。
(項目４４)
前記試料が、組織を含む、項目４２に記載の方法。
(項目４５)
前記試料が、血液、血漿、および／または血清を含む、項目４２に記載の方法。
(項目４６)
前記対象が、哺乳動物対象である、項目４２から４５までのいずれか一項に記載の方法。
(項目４７)
前記哺乳動物対象が、ヒト対象である、項目４６に記載の方法。
(項目４８)
前記核酸が、細胞外遊離核酸を含む、項目４２から４７までのいずれか一項に記載の方法。
(項目４９)
前記核酸が、細胞内核酸を含む、項目４２から４８までのいずれか一項に記載の方法。
(項目５０)
前記核酸が、循環腫瘍核酸を含む、項目４２から４９までのいずれか一項に記載の方法。
(項目５１)
前記核酸を循環腫瘍細胞から得る、項目４２から５０までのいずれか一項に記載の方法。
(項目５２)
前記核酸が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および／またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、項目４２から５１までのいずれか一項に記載の方法。
(項目５３)
前記試料中の前記核酸の少なくとも１つのセグメントを増幅させて、少なくとも１つの増幅した核酸を生成することを含む、項目４２から５２までのいずれか一項に記載の方法。
(項目５４)
前記増幅した核酸のシーケンシングを行って、前記配列情報を生成することを含む、項目５３に記載の方法。
(項目５５)
前記核酸の少なくとも約５０，０００、約１００，０００、約１５０，０００、約２００，０００、約２５０，０００、約５００，０００、約７５０，０００、約１，０００，０００、約１，５００，０００、約２，０００，０００ヌクレオチド、またはそれよりも多くのヌクレオチドのシーケンシングを行って、前記配列情報を生成することを含む、項目５４に記載の方法。
(項目５６)
前記シーケンシングが、標的化シーケンシング、イントロンシーケンシング、エキソームシーケンシング、および全ゲノムシーケンシングからなる群から選択される、項目５４または５５に記載の方法。
(項目５７)
前記カスタマイズされた療法が、少なくとも１つの免疫療法を含む、項目３から５までのいずれか一項に記載の方法。
(項目５８)
前記免疫療法が、少なくとも１つのチェックポイント阻害抗体を含む、項目５７に記載の方法。
(項目５９)
前記免疫療法が、ＰＤ－１、ＰＤ－２、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４０、ＯＸ４０、Ｂ７．１、Ｂ７Ｈｅ、ＬＡＧ３、ＣＤ１３７、ＫＩＲ、ＣＣＲ５、ＣＤ２７、またはＣＤ４０に対する抗体を含む、項目５７または５８に記載の方法。
(項目６０)
前記免疫療法が、少なくとも１つの腫瘍型に対する炎症促進性サイトカインの投与を含む、項目５７から５９までのいずれか一項に記載の方法。
(項目６１)
前記免疫療法が、少なくとも１つの腫瘍型に対するＴ細胞の投与を含む、項目５７から６０までのいずれか一項に記載の方法。
(項目６２)
前記がんが、胆道がん、膀胱がん、移行上皮癌、尿路上皮癌、脳がん、神経膠腫、星状細胞腫、乳癌、化生性癌、子宮頸がん、子宮頸部扁平上皮癌、直腸がん、結腸直腸癌、結腸がん、遺伝性非ポリポーシス大腸がん、結腸直腸腺癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、子宮内膜癌、子宮内膜間質肉腫、食道がん、食道扁平上皮癌、食道腺癌、眼内黒色腫、ぶどう膜黒色腫、胆嚢癌、胆嚢腺癌、腎細胞癌、腎明細胞癌、移行上皮癌、尿路上皮癌、ウィルムス腫瘍、白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、肝がん、肝癌、ヘパトーマ、肝細胞癌、胆管細胞癌、肝芽腫、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫／白血病、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、上咽頭癌（ＮＰＣ）、神経芽細胞腫、中咽頭がん、口腔扁平上皮癌、骨肉腫、卵巣癌、膵がん、膵管腺癌、偽乳頭状新生物、腺房細胞癌、前立腺がん、前立腺腺癌、皮膚がん、黒色腫、悪性黒色腫、皮膚黒色腫、小腸癌、胃がん、胃癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、子宮がん、および子宮肉腫からなる群から選択される少なくとも１つの腫瘍型を含む、項目３から５までのいずれか一項に記載の方法。
(項目６３)
前記配列情報が、核酸シーケンサーによって生成された前記核酸の配列読み取りを含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目６４)
前記核酸シーケンサーにより前記核酸に対してパイロシーケンシング、単一分子シーケンシング、ナノポアシーケンシング、半導体シーケンシング、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシングまたはハイブリダイゼーションによるシーケンシングを実施して、シーケンシング読み取りを生成する、項目６３に記載の方法。
(項目６５)
シーケンシングの前にゲノムまたはトランスクリプトームから１つまたは複数の領域を選択的に富化させるステップをさらに含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目６６)
選択的に富化された領域をシーケンシングの前に増幅させるステップをさらに含む、項目６５に記載の方法。
(項目６７)
前記配列情報を前記核酸の標的とされるセグメントから得て、前記標的とされるセグメントをシーケンシングの前にゲノムまたはトランスクリプトームから１つまたは複数の領域を選択的に富化させることによって得る、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目６８)
得られた標的とされるセグメントをシーケンシングの前に増幅させるステップをさらに含む、項目６７に記載の方法。
(項目６９)
シーケンシングの前に、分子バーコードを含む１つまたは複数のアダプターを前記核酸に付着させるステップをさらに含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目７０)
前記核酸を一意的にタグ付けする、項目６９に記載の方法。
(項目７１)
前記核酸を非一意的にタグ付けする、項目６９に記載の方法。
(項目７２)
前記アダプターが、２から１，０００，０００の間の分子バーコードを含む、項目６９に記載の方法。
(項目７３)
分子バーコードを含むアダプターを核酸の各末端にランダムに付着させることを含む、項目６９に記載の方法。
(項目７４)
前記アダプターを前記核酸に平滑末端ライゲーションまたは粘着末端ライゲーションによって付着させる、項目６９に記載の方法。
(項目７５)
前記アダプターが、Ｔ尾部を有するおよび／またはＣ尾部を有するアダプターである、項目６９に記載の方法。
(項目７６)
配列読み取りを配列読み取りのファミリーに群分けするステップをさらに含み、各ファミリーが、前記試料中の核酸から生成された配列読み取りを含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目７７)
前記方法の少なくとも一部が、コンピューターにより実行される、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目７８)
１つまたは複数のＴＭＢスコアを提示する電子形式の報告書を作成するステップをさらに含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目７９)
前記試料をＴＭＢ－Ｈｉｇｈ試料に分類するステップをさらに含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目８０)
前記変異カウントを、表２に列挙されている遺伝子を含む遺伝子またはゲノム領域のセットの中で決定する、前記方法項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目８１)
がんを有するか、または有する疑いがある対象由来の細胞外遊離核酸分子の試料を特徴付ける方法であって、
前記試料に対してアッセイを実施して、表２に列挙されているものから選択される少なくとも１００種、２００種、３００種、４００種、または５００種の遺伝子またはゲノム領域に遺伝的バリエーションが存在するかどうかを決定するステップ
を含む方法。
(項目８２)
前記アッセイを１，０００種以下の遺伝子に対して実施する、項目１３９に記載の方法。
(項目８３)
アッセイされた遺伝子のうちの少なくとも１種に遺伝的バリエーションの存在が決定された対象にがん処置を施行するステップをさらに含む、項目１３９に記載の方法。
(項目８４)
前記試料から核酸分子を単離し、前記少なくとも１００種、２００種、３００種、４００種、または５００種の遺伝子に対応する核酸分子を、前記少なくとも１００種、２００種、３００種、４００種、または５００種の遺伝子由来のセグメントを含有するプローブを用いて富化させるステップをさらに含む、項目１３９に記載の方法。
(項目８５)
がんを有するか、またはがんを有する疑いがある対象由来の細胞外遊離ＤＮＡの試料を解析するための方法であって、
表２に列挙されている遺伝子からなる群から少なくとも１００種、２００種、３００種、４００種、または５００種のゲノム領域を選択的に富化させて、富化されたライブラリーを生成するステップと、
前記富化されたライブラリーを増幅させ、シーケンシング反応を実施するステップと、
前記ゲノム領域における遺伝子バリアントの存在について解析するステップと
を含む方法。
(項目８６)
少なくとも部分的にコンピューターを使用して新抗原オーファン免疫受容体情報を生成する方法であって、
（ａ）がんと診断された対象から得た血液試料中の核酸から得られた配列情報をコンピューターにより受け取るステップであって、前記配列情報の少なくとも第１の部分が、前記血液試料中の細胞外遊離核酸（ｃｆＮＡ）から得られたシーケンシング読み取りを含み、前記配列情報の少なくとも第２の部分が、前記血液試料中の１つまたは複数の免疫細胞に由来する核酸から得られたシーケンシング読み取りを含む、ステップと、
（ｂ）前記配列情報の少なくとも前記第１の部分から前記対象の腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）スコアを決定するステップと、
（ｃ）前記配列情報の少なくとも前記第２の部分における免疫レパートリーの１つまたは複数のクローン型を識別するステップと、
（ｄ）前記ＴＭＢスコアと前記１つまたは複数のクローン型を相関させて、前記対象における１つまたは複数の新抗原オーファン免疫受容体を識別し、それにより、前記新抗原オーファン免疫受容体情報を生成するステップと
を含む方法。
(項目８７)
前記新抗原オーファン免疫受容体情報を使用して前記対象に対する１つまたは複数のカスタマイズされた療法を識別するステップをさらに含む、項目８６に記載の方法。
(項目８８)
前記１つまたは複数のカスタマイズされた療法を前記対象に施行するステップをさらに含む、項目８７に記載の方法。
(項目８９)
前記配列情報の前記第１の部分における１つまたは複数のバリアントを識別して、前記ＴＭＢスコアを決定することを含み、前記バリアントが、一塩基バリアント（ＳＮＶ）、挿入または欠失（インデル）、コピー数バリアント（ＣＮＶ）、融合、塩基転換、転座、フレームシフト、重複、反復バリアント、およびエピジェネティックバリアントからなる群から選択される１つまたは複数の変異を含む、項目８６に記載の方法。
(項目９０)
前記反復バリアントが、１つまたは複数のマイクロサテライトバリアントを含む、項目８９に記載の方法。
(項目９１)
前記配列情報の前記第２の部分における１つまたは複数の他のバリアントを識別して、前記ＴＭＢスコアを決定するステップをさらに含み、前記他のバリアントが、前記血液試料中の前記１つまたは複数の免疫細胞に由来する前記核酸における１つまたは複数の体細胞変異を含む、項目８９に記載の方法。
(項目９２)
がんと診断された対象由来の血液試料中の多数の解析物を解析する方法であって、
（ａ）前記血液試料中の細胞外遊離核酸（ｃｆＮＡ）の第１のセットおよび前記血液試料中の１つまたは複数の免疫細胞由来の核酸の第２のセットを単離するステップと、
（ｂ）Ｔ細胞受容体のアルファおよび／またはベータサブユニットの少なくとも一部をコードする核酸の前記第２のセットの１つまたは複数の領域を増幅させて、富化された核酸の第２のセットを生成するステップと、
（ｃ）ｃｆＮＡの前記第１のセットの１つまたは複数の領域および前記富化された核酸の第２のセットの１つまたは複数の領域のシーケンシングを行って、配列情報を作製するステップと、
（ｄ）前記配列情報から前記対象の腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）スコアを決定するステップと、
（ｅ）前記配列情報から免疫レパートリーの１つまたは複数のクローン型を識別するステップと、
（ｆ）前記ＴＭＢスコアと前記１つまたは複数のクローン型を相関させて、前記対象における１つまたは複数の新抗原オーファン免疫受容体を識別し、それにより、がんと診断された前記対象由来の前記血液試料中の前記多数の解析物を解析するステップと
を含む方法。
(項目９３)
少なくとも部分的にコンピューターを使用して対象由来の血液試料中の核酸を解析する方法であって、
（ａ）前記対象由来の前記血液試料中の前記核酸から得られた配列情報をコンピューターによって受け取るステップであって、前記配列情報の少なくとも第１の部分が、前記血液試料中の細胞外遊離核酸（ｃｆＮＡ）から得られたシーケンシング読み取りを含み、前記配列情報の少なくとも第２の部分が、前記血液試料中の１つまたは複数の免疫細胞に由来する核酸から得られたシーケンシング読み取りを含む、ステップと、
（ｂ）前記配列情報の前記第１の部分における１つまたは複数のバリアントおよび前記配列情報の前記第２の部分における免疫レパートリーの１つまたは複数のクローン型を識別し、それにより、前記対象由来の前記血液試料中の前記核酸を解析するステップと
を含む方法。
(項目９４)
（ｉ）前記配列情報の前記第１の部分における観測変異カウントを決定するステップと、
（ｉｉ）前記配列情報の前記第１の部分における少なくとも前記ｃｆＮＡの腫瘍割合および／またはカバレッジを決定して、シーケンシングパラメータを生成するステップと、
（ｉｉｉ）前記シーケンシングパラメータを考慮して予測変異割合および／または前記予測変異割合の予測分布を決定して、予測結果を生成するステップと、
（ｉｖ）前記予測結果を考慮して前記観測変異カウントを調整して、調整された結果を生成し、それにより、前記対象における腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）を決定するステップと
を含む、項目９３に記載の方法。
(項目９５)
（ｉ）前記配列情報の前記第１の部分および／または第２の部分に由来する複数の反復性核酸遺伝子座のそれぞれに存在する複数の異なる反復長を定量して、前記複数の反復性核酸遺伝子座のそれぞれについての部位スコアを生成するステップであって、前記配列情報が、反復性核酸遺伝子座の集団を含む、ステップと
（ｉｉ）所与の反復性核酸遺伝子座の部位スコアが前記所与の反復性核酸遺伝子座についての部位特異的訓練閾値を超える場合、前記所与の反復性核酸遺伝子座を不安定であるとコールして、前記複数の反復性核酸遺伝子座由来の複数の不安定な反復性核酸遺伝子座を含む反復性核酸不安定性スコアを生成するステップと、
（ｉｉｉ）前記反復性核酸不安定性スコアが前記血液試料中の反復性核酸遺伝子座の集団についての集団訓練閾値を超える場合、前記血液試料の反復性核酸不安定性の状態を不安定であると分類し、それにより、前記血液試料の前記反復性核酸不安定性の状態を決定するステップと
を含む、項目９３に記載の方法。
(項目９６)
（ｉ）前記配列情報の前記第１の部分および／または第２の部分由来の複数の反復性デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）遺伝子座のそれぞれに存在する複数の異なる反復長を定量して、前記複数の反復性ＤＮＡ遺伝子座のそれぞれについての部位スコアを生成するステップであって、前記配列情報が、反復性ＤＮＡ遺伝子座の集団を含む、ステップと、
（ｉｉ）前記複数の反復性ＤＮＡ遺伝子座のそれぞれについて、所与の反復性ＤＮＡ遺伝子座の部位スコアを前記所与の反復性ＤＮＡ遺伝子座についての部位特異的訓練閾値と比較するステップと、
（ｉｉｉ）前記所与の反復性ＤＮＡ遺伝子座の前記部位スコアが前記所与の反復性ＤＮＡ遺伝子座についての前記部位特異的訓練閾値を超える場合、前記所与の反復性ＤＮＡ遺伝子座を不安定であるとコールして、前記複数の反復性ＤＮＡ遺伝子座由来の複数の不安定な反復性ＤＮＡ遺伝子座を含む反復性ＤＮＡ不安定性スコアを生成するステップと、
（ｉｖ）前記反復性ＤＮＡ不安定性スコアが前記血液試料中の反復性ＤＮＡ遺伝子座の集団についての集団訓練閾値を超える場合、前記血液試料の反復性ＤＮＡ不安定性の状態を不安定であると分類し、それにより、前記血液試料の前記反復性ＤＮＡ不安定性の状態を決定するステップと
を含む、項目９３に記載の方法。
(項目９７)
（ｉ）前記配列情報の前記第１の部分および／または第２の部分由来の複数のマイクロサテライト遺伝子座のそれぞれに存在する複数の異なる反復長を定量して、前記複数のマイクロサテライト遺伝子座のそれぞれについての部位スコアを生成するステップであって、前記配列情報が、マイクロサテライト遺伝子座の集団を含む、ステップと、
（ｉｉ）前記複数のマイクロサテライト遺伝子座のそれぞれについて、所与のマイクロサテライト遺伝子座の部位スコアを前記所与のマイクロサテライト遺伝子座についての部位特異的訓練閾値と比較するステップと、
（ｉｉｉ）前記所与のマイクロサテライト遺伝子座の前記部位スコアが前記所与のマイクロサテライト遺伝子座についての前記部位特異的訓練閾値を超える場合、前記所与のマイクロサテライト遺伝子座を不安定であるとコールして、前記複数のマイクロサテライト遺伝子座由来の複数の不安定なマイクロサテライト遺伝子座を含むマイクロサテライト不安定性スコアを生成するステップと、
（ｉｖ）前記マイクロサテライト不安定性スコアが前記血液試料中のマイクロサテライト遺伝子座の前記集団についての集団訓練閾値を超える場合、前記血液試料のマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）の状態を不安定であると分類し、それにより、前記血液試料の前記ＭＳＩの状態を決定するステップと
を含む、項目９３に記載の方法。
(項目９８)
配列可変標的領域セットとエピジェネティック標的領域セットとを含む、細胞外遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の標的領域の複数のセットを捕捉することを含み、それにより、捕捉されたｃｆＤＮＡ分子のセットが生じ、前記配列可変標的領域セットに対応するｃｆＤＮＡ分子が、前記エピジェネティック標的領域セットに対応するｃｆＤＮＡ分子よりも高い捕捉収率で前記捕捉されたｃｆＤＮＡ分子のセット内に捕捉される、項目９３に記載の方法。
(項目９９)
前記ｃｆＮＡが、細胞外遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む、項目９３に記載の方法。
(項目１００)
前記血液試料中の前記１つまたは複数の免疫細胞に由来する前記核酸が、ｍＲＮＡおよび／またはｇＤＮＡを含む、項目９３に記載の方法。
(項目１０１)
前記血液試料中の前記１つまたは複数の免疫細胞に由来する前記核酸が、抗体、Ｂ細胞受容体、およびＴ細胞受容体からなる群から選択される免疫学的ポリペプチドの少なくとも一部をコードする、項目９３に記載の方法。
(項目１０２)
前記ｃｆＮＡを前記血液試料の血漿画分または血清画分から得ることを含む、項目９３に記載の方法。
(項目１０３)
前記血液試料のバフィーコート画分由来の１つまたは複数の免疫細胞に由来する核酸を得ることを含む、項目９３に記載の方法。
(項目１０４)
通信ネットワークを通じて対象由来の試料中の１つまたは複数の核酸からシーケンシング情報を得る通信インターフェースと、
前記通信インターフェースと通信するコンピューターであって、少なくとも１つのコンピュータープロセッサと、少なくとも１つのコンピュータープロセッサによって実行されると、
（ｉ）がんと診断された対象から得た血液試料中の核酸から得られた配列情報を受け取るステップであって、前記配列情報の少なくとも第１の部分が、前記血液試料中の細胞外遊離核酸（ｃｆＮＡ）から得られたシーケンシング読み取りを含み、前記配列情報の少なくとも第２の部分が、前記血液試料中の１つまたは複数の免疫細胞に由来する核酸から得られたシーケンシング読み取りを含む、ステップと、
（ｉｉ）前記配列情報の少なくとも前記第１の部分から前記対象の腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）スコアを決定するステップと、
（ｉｉｉ）前記配列情報の少なくとも前記第２の部分における免疫レパートリーの１つまたは複数のクローン型を識別するステップと、
（ｉｖ）前記ＴＭＢスコアと前記１つまたは複数のクローン型を相関させて、前記対象における１つまたは複数の新抗原オーファン免疫受容体を識別するステップと
を含む方法を実行する、機械により実行可能なコードを含むコンピューター可読媒体とを含む、コンピューターと
を含むシステム。

Claims

対象における腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）を決定する方法であって、
（ａ）前記対象由来の試料中の１つまたは複数の核酸から得られた配列情報から観測変異カウントを決定するステップと、
（ｂ）前記核酸の腫瘍割合および／またはカバレッジを決定して、シーケンシングパラメータを生成するステップと、
（ｃ）前記シーケンシングパラメータを考慮して予測変異割合および／または前記予測変異割合の予測分布を決定して、予測結果を生成するステップであって、前記予測変異割合および／または前記予測変異割合の前記予測分布の決定が、所与の変異対立遺伝子割合（ＭＡＦ）における変異が予測ＭＡＦの分布にわたって識別される確率の算出を含み、予測ＭＡＦの前記分布が、相対的ＭＡＦの予測分布から決定される、ステップと、
（ｄ）前記予測結果を考慮して前記観測変異カウントを調整して、調整された結果を生成し、それにより、前記対象における前記ＴＭＢを決定するステップと
を含む方法。
（ａ）前記観測変異カウントが、前記核酸において識別される複数の同義変異、複数の非同義変異、および／もしくは複数の非コード変異を含む、
（ｂ）前記観測変異カウントが、一塩基バリアント（ＳＮＶ）、挿入もしくは欠失（インデル）、コピー数バリアント（ＣＮＶ）、融合、塩基転換、転座、フレームシフト、重複、反復伸長、およびエピジェネティックバリアントからなる群から選択される複数の変異を含む、
（ｃ）前記観測変異カウントから、ドライバー変異および／もしくはクローン性造血由来変異が除外される、ならびに／または
（ｄ）前記観測変異カウントが、前記核酸において識別される複数の体細胞変異を含み、必要に応じて、前記観測変異カウントから１つもしくは複数の既知のがんドライバーおよび／またはパッセンジャー変異が除外される、
請求項１に記載の方法。
（ａ）前記観測変異カウントを決定するために、所与の一塩基バリアント（ＳＮＶ）または所与の挿入もしくは欠失（インデル）に関して検出限界を下回る１つもしくは複数の可能性のある変異のプールされたエビデンスを使用することを含む、
（ｂ）前記予測変異割合を実際の変異カウントの観測割合として使用することを含む、
（ｃ）前記配列情報を１つもしくは複数の参照配列と比較して、前記観測変異カウントを識別することを含み、必要に応じて、前記参照配列が、ｈｇ１９および／もしくはｈｇ３８の少なくとも部分配列を含む、ならびに／または
（ｄ）前記調整された結果を使用して、ＴＭＢスコアを決定することをさらに含む、
請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
前記腫瘍割合が、
（ａ）前記核酸において識別される全ての体細胞変異の最大ＭＡＦを含む、および／または
（ｂ）前記試料中の全ての核酸の約０．０５％未満、約０．１％未満、約０．２％未満、約０．５％未満、約１％未満、約２％未満、約３％未満、約４％未満、もしくは約５％未満である、
請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
（ａ）前記カバレッジを決定するために、前記核酸における所与のヌクレオチド位を含む複数の独特のｃｆＤＮＡ断片を識別すること、および／もしくは前記カバレッジを決定するために、前記核酸における所与のヌクレオチド位を構成する独特の細胞外遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）分子の数の中央値を識別することを含み、
（ｂ）前記カバレッジが、前記試料中に存在する前記核酸における所与のヌクレオチド位において１０個から５０，０００個の間のｃｆＤＮＡ断片である、
（ｃ）前記予測変異割合および／もしくは前記予測変異割合の前記予測分布が、前記変異割合に関して約９５％もしくはそれよりも大きな信頼区間を含む、ならびに／または
（ｄ）前記予測変異割合の９５％信頼区間の上限を使用して、前記観測変異カウントの下限を生成することを含む、
請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
（ａ）以下の方程式：
観測された変異の割合＝Σ _ＭＡＦ（Ｐ（変異のコール｜ＭＡＦ）×Ｐ（ＭＡＦにおける変異））
（式中、Ｐは確率であり、ＭＡＦは変異対立遺伝子割合である）
を使用して前記予測結果を決定することを含む、
（ｂ）予測相対的ＭＡＦの分布に前記腫瘍割合を掛けて、ＭＡＦを生成することを含む、および／または
（ｃ）予測ＭＡＦの前記分布が、以下の二項比率の信頼区間を使用して算出される、

（式中、ｆは、コールされる変異の前記予測割合であり、ｎ＿真は、予測される実際の変異であり、これはｆを考慮して観測される変異の数と等しく、ｚは信頼水準であり、必要に応じて、
（ｉ）ｆが閾値 _ｆ未満の場合、ＴＭＢは決定されない、もしくは
（ｉｉ）ｆが閾値 _ｆを超える場合、ＴＭＢが決定される）
請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
前記相対的ＭＡＦの前記予測分布が、対照試料データセットの１つまたは複数のデータセットから得られ、必要に応じて、
（ａ）前記対照試料データセットが、少なくとも約２５、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１，０００、少なくとも約５，０００、少なくとも約１０，０００、少なくとも約１５，０００、少なくとも約２０，０００、少なくとも約２５，０００、少なくとも約３０，０００、もしくはそれよりも多くの対照試料を含む、
（ｂ）前記対照試料データセットにおいて観測される最大（ｍａｘ）ＭＡＦが、約０．５％、約１％、約２％、約５％もしくは約１０％を構成する、および／または
（ｃ）前記相対的ＭＡＦを、以下の方程式：
Ｆ＝１／（１＋（Ｐ＿５０／相対的－ＭＡＦ） ^ｎ）
（式中、Ｆは、累積分布関数であり、Ｐ＿５０は、相対的ＭＡＦの中央値であり、相対的－ＭＡＦは相対的ＭＡＦであり、ｎは、相対的な分布の形状を当てはめるための指数である）
を使用して曲線に当てはめることを含む、
請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
前記観測変異カウントを
（ａ）前記試料における予測変異割合もしくは前記予測変異割合の信頼区間の上限／下限で割って、前記調整された結果を生成すること、および／または
（ｂ）前記予測結果で割って、前記調整された結果を生成すること
を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
前記調整された結果が、
（ａ）変異対立遺伝子割合の範囲にわたって前記核酸において検出される複数の変異、
（ｂ）可能性が最も高い実際の変異カウントの予想、
（ｃ）可能性が最も低い実際の変異カウントの予想、および／または
（ｄ）調整された変異カウントであって、必要に応じて、前記調整された変異カウントが、前記観測変異カウントよりも大きいかもしくはそれと等しい、調整された変異カウント
を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
前記試料が前記対象から得られることを特徴とし、必要に応じて、
（ａ）前記試料が、
（ｉ）組織、血液、血漿、血清、喀痰、尿、精液、膣液、糞便、滑液、脊髄液、および唾液からなる群から選択される、
（ｉｉ）組織を含む、または
（ｉｉｉ）血液、血漿、および／もしくは血清を含む、
（ｂ）前記対象が、哺乳動物対象であり、必要に応じて、前記哺乳動物対象が、ヒト対象である、
（ｃ）前記核酸が、
（ｉ）細胞外遊離核酸を含む、
（ｉｉ）細胞内核酸を含む、
（ｉｉｉ）循環腫瘍核酸を含む、
（ｉｖ）循環腫瘍細胞から得られる、および／もしくは
（ｖ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および／もしくはリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、ならびに／または
（ｄ）前記方法は、前記試料中の前記核酸の少なくとも１つのセグメントを増幅させて、少なくとも１つの増幅した核酸を生成することをさらに含み、必要に応じて、前記増幅した核酸のシーケンシングを行って、前記配列情報を生成することを含み、さらに必要に応じて、
（ｉ）前記核酸の少なくとも約５０，０００、約１００，０００、約１５０，０００、約２００，０００、約２５０，０００、約５００，０００、約７５０，０００、約１，０００，０００、約１，５００，０００、約２，０００，０００ヌクレオチド、もしくはそれよりも多くのヌクレオチドのシーケンシングを行って、前記配列情報を生成し、ならびに／または
（ｉｉ）前記シーケンシングが、標的化シーケンシング、イントロンシーケンシング、エキソームシーケンシング、および全ゲノムシーケンシングからなる群から選択される、
請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
（ａ）前記配列情報が、
（ｉ）前記対象由来の前記試料を提供するステップと、
（ｉｉ）前記試料中の核酸を増幅させて、増幅した核酸を生成するステップと、
（ｉｉｉ）前記増幅した核酸のシーケンシングを行って、前記配列情報を生成するステップと
により得られる、
（ｂ）前記対象由来の前記試料中の前記核酸から前記配列情報を得ることを含み、必要に応じて、前記配列情報が、前記核酸の標的とされるセグメントから得られ、さらに必要に応じて、前記標的とされるセグメントが、約１から約１００，０００の間の異なるおよび／または重複するゲノム領域を含む、
（ｃ）前記配列情報が、核酸シーケンサーによって生成された前記核酸の配列読み取りを含み、必要に応じて、前記核酸シーケンサーにより前記核酸に対してパイロシーケンシング、単一分子シーケンシング、ナノポアシーケンシング、半導体シーケンシング、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシングまたはハイブリダイゼーションによるシーケンシングを実施して、シーケンシング読み取りを生成し、
（ｄ）前記方法は、シーケンシングの前にゲノムまたはトランスクリプトームから１つまたは複数の領域を選択的に富化させるステップをさらに含み、必要に応じて、選択的に富化された領域をシーケンシングの前に増幅させるステップをさらに含む、ならびに／または
（ｅ）前記配列情報を前記核酸の標的とされるセグメントから得て、前記標的とされるセグメントをシーケンシングの前にゲノムまたはトランスクリプトームから１つまたは複数の領域を選択的に富化させることによって得て、必要に応じて、得られた標的とされるセグメントをシーケンシングの前に増幅させるステップをさらに含む、
請求項胃１～１０のいずれか一項に記載の方法。
シーケンシングの前に、分子バーコードを含む１つまたは複数のアダプターを前記核酸に付着させるステップをさらに含み、必要に応じて、
（ａ）前記核酸を一意的にタグ付けする、
（ｂ）前記核酸を非一意的にタグ付けする、
（ｃ）前記アダプターが、２から１，０００，０００の間の分子バーコードを含む、
（ｄ）分子バーコードを含むアダプターを核酸の各末端にランダムに付着させることを含む、
（ｅ）前記アダプターを前記核酸に平滑末端ライゲーションもしくは粘着末端ライゲーションによって付着させる、または
（ｆ）前記アダプターが、Ｔ尾部を有するおよび／またはＣ尾部を有するアダプターである、
請求項１～１１のいずれかに記載の方法。
（ａ）前記配列読み取りを配列読み取りのファミリーに群分けするステップをさらに含み、各ファミリーが、前記試料中の核酸から生成された配列読み取りを含む、
（ｂ）前記方法の少なくとも一部が、コンピューターにより実行される、
（ｃ）１つまたは複数のＴＭＢスコアを提示する電子形式の報告書を作成するステップをさらに含む、
（ｄ）前記試料をＴＭＢ－Ｈｉｇｈ試料に分類するステップをさらに含む、
（ｅ）前記試料の前記ＴＭＢスコアが閾値 _{ＴＭＢスコア} よりも大きい場合、前記試料をＴＭＢ－Ｈｉｇｈ試料に分類し、前記試料の前記ＴＭＢスコアが閾値 _{ＴＭＢスコア} よりも小さい場合、前記試料をＴＭＢ－Ｌｏｗ試料に分類する、および／または
（ｆ）前記変異カウントを、表２に列挙されている遺伝子を含む遺伝子またはゲノム領域のセットの中で決定する、
請求項１～１２のいずれかに記載の方法。
（ａ）前記配列情報の少なくとも前記第２の部分における免疫レパートリーの１つまたは複数のクローン型を識別するステップ、および
（ｂ）前記ＴＭＢスコアと前記１つまたは複数のクローン型を相関させて、前記対象における１つまたは複数の新抗原オーファン免疫受容体を識別するステップ
をさらに含む、請求項１～１３のいずれかに記載の方法。
前記ＴＭＢスコアを前記対象または医師に報告することをさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。