CN116200490A - 一种检测实体瘤微小残留病灶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测实体瘤微小残留病灶的方法，包括通过142基因的检测panel(MRDPanel)对实体瘤患者检测ctDNA突变信息；以及通过低深度WGS测序评估实体瘤患者的基因组不稳定性；结合ctDNA突变信息及基因组不稳定性结果,得到ctDNA含量的估计，并给出对应的风险分级。本发明提供了一种检测实体瘤微小残留病灶的方法，本发明提出了可同时检测ctDNA突变信息及基因组不稳定性的检测流程，通过同时评估两个指标,可显著提升MRD检出率,降低假阴性。

Description

一种检测实体瘤微小残留病灶的方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤基因检测领域，具体为一种检测实体瘤微小残留病灶的方法,特别是涉及基于突变信息(SNV,Indel,Fusion,CNV)及基因组不稳定性信息来评估肿瘤微小残留病灶(MRD),用于判断患者体内肿瘤负荷，肿瘤术后复发风险评估,疗效预测等。
背景技术：
世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布了2020年全球最新癌症负担数据。数据显示，2020年全球新发癌症病例1929万例,2020年全球癌症死亡病例996万例,全球癌症负担依然严峻；
早期,手术切除是肿瘤最佳的治疗方式,但相当一部分患者在根治性切除后仍会复发。肿瘤微小残留病灶(Minimal Residual Disease,MRD)被认为是复发的主要原因。目前临床上主要采用影像学方法来评估微小残留病灶是否存在，但由于检测灵敏度限制，影像学检测到残留病灶，可能预示着肿瘤已经复发。高灵敏度，实时检测微小残留病灶可为肿瘤患者术后管理提供理想的指导方案。在分子层面检测肿瘤来源信号，包括:甲基化、突变、拷贝数变化等，来捕捉影像学上看不见的微小残留病灶信息，从而评估患者的肿瘤负荷及复发风险，有益于对患者实施精准治疗。
目前在分子层面通过ctDNA评估实体瘤肿瘤微小残留病灶的方法总体如下:
申请号为CN202110469995；6，名称为一种筛查结直肠癌术后微小残留病灶及预测复发风险的循环肿瘤DNA检测系统及应用，公开了在循环肿瘤DNA(ctDNA)层面检测肿瘤来源信号，首先利用开源数据库或者自建数据库，筛选肿瘤特异性基因信息，构建检测Panel，用该panel进行样本的突变信息(包括SNV，indel,fusion,CNV等)检测,通过二代测序的方式(NGS)进行测序,最终通过生物信息学算法分析出ctDNA层面的变异结果，如果变异阳性,说明MRD阳性,存在微小残留病灶；如果变异阴性，说明MRD阴性，在当前检测阶段肿瘤负荷很低或不存在；申请号为CN201780007871；8，名称为基于变体的疾病诊断和追踪，通过纵向追踪患者中的遗传变体来追踪患者健康的方法，使得可以提供肿瘤或突变分类标志。纵向追踪提高了在早期检测微小残留病变(MRD；治疗后和/或缓解期间患者体内保留的少量细胞)和/或治疗响应的能力，这两者可帮助指导治疗决策和防止遗漏患者中不同的肿瘤内/肿瘤间响应。涉及鉴定和追踪单个肿瘤和/或患者的遗传多样性，以便预测和理解治疗抗性并生成可以作为宿主免疫应答的靶的新抗原。这些改变代表了肿瘤的区别和基本标志，其最终可用于对肿瘤进行分类并预测进展和治疗功效；申请号为CN201910074640X，公开了一种基于二代测序的用于泛癌种靶向、化疗及免疫用药的检测panel、检测试剂盒及其应用。其中，该检测panel包括泛癌种分型、治疗、预后相关的基因突变，肿瘤突变负荷计算相关的外显子区域和微卫星不稳定性位点。检测panel包括泛癌种分型、治疗、预后相关的基因突变、肿瘤突变负荷计算相关的外显子区域和微卫星不稳定性位点，其包括的基因信息全面，能够直接对多种肿瘤变异进行联合检测，应用于靶向药、化疗药或免疫药的伴随诊断可以得到精准的结果；上述方案中肿瘤的分子特征除了突变之外,还包括染色体层面的结构变异及甲基化信息等，如果仅仅使用突变信息去评估微小残留病灶,会存在漏检的现象,导致假阴性结果，也就是说采用了大Panel(425基因)+NGS+生物信息分析的方式进行微小残留病灶的检测,仅能检测SNV,indel,Fusion,及基因层面的CNV,而无法检测基因组层面的染色体变化，如果肿瘤样本只发生染色体层面的变化,会导致上述方法MRD判断阴性,存在假阴性的现象，因此肿瘤微小残留病灶检测,需求检测marker更全面的覆盖肿瘤分子特征。
发明内容：
针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种检测实体瘤微小残留病灶的方法，本发明提出了可同时检测ctDNA突变信息及基因组不稳定性的检测流程,通过同时评估两个指标,可显著提升MRD检出率,降低假阴性。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种检测实体瘤微小残留病灶的方法，包括通过142基因的检测panel对实体瘤患者检测ctDNA突变信息；以及通过低深度WGS测序评估实体瘤患者的基因组不稳定性；结合ctDNA突变信息及基因组不稳定性结果,得到ctDNA含量的估计,并给出对应的风险分级。
作为本发明进一步的方案，所述142基因的检测panel的构建步骤包括：确认覆盖癌症类型；确认覆盖基因信息；调取自有数据库中实体瘤患者NGS检测结果进行有效区域筛选。
作为本发明进一步的方案，所述确认覆盖基因信息包括：用药敏感及耐药基因、MRD检测及动态监测区域、肿瘤驱动基因、I/II类基因变异、MSI位点、化疗位点，涵盖CFDA、FDA、NCCN指南推荐及临床研究阶段信息来源。
作为本发明进一步的方案，所述调取自有数据库中实体瘤患者NGS检测结果进行有效区域筛选具体包括：按照癌种类型将数据进行分类,获得各癌种样本数量，针对各癌种数据，在142基因全部编码外显子范围内，以外显子为单位进行评估，如果当前外显子中包含体细胞突变且在当前癌种中人群突变频率>＝5％,保留该外显子；在其他癌种及外显子中进行同样的迭代评估，保留符合条件的外显子区域，去掉不符合条件的外显子区域,获得筛选后的Panel区域。
作为本发明进一步的方案，所述基因组不稳定性的评估算法包括：全局拷贝数校正估计和特殊染色体校正。
作为本发明进一步的方案，所述全局拷贝数校正估计包括基于低覆盖度的全基因组测序数据，数据比对到人类参考基因组GRch37，基因组被分割为1Mb大小的区段i，计算区段内平均覆盖度；覆盖深度校正：对区域覆盖深度进行校正，校正因素包括GC含量G和比对度M，计算每个区段内的GC含量和比对度M，使用loess回归拟合：d～αG+βM估算loess回归的参数系数，得到拟合模型的参数计算出校正后的覆盖度d，拷贝数估计：校正后对每个区段i计算平均比值r：
Figure BDA0003894689380000041
该平均比值和区段i的拷贝数Ci和肿瘤纯度p相关：
Figure BDA0003894689380000042
通过EM算法估计最大程度拟合ri的拷贝数C和肿瘤纯度p，可以计算出每个区段的估计拷贝数C。
作为本发明进一步的方案，所述特殊染色体校正包括：对于染色体19的校正因素包括PCR轮数pn和起始DNA量m，Cnorm＝αpn+βm经过校正后的拷贝数Cnorm合并入最终结果，判定基因组存在不稳定性的标准为p>0且至少有>10M的片段拷贝数C！＝2。
本发明具有以下有益效果：本发明提出了可同时检测ctDNA突变信息及基因组不稳定性的双指标MRD检测方法,通过同时评估两个指标,可显著提升MRD检出率,降低假阴性。
为更清楚地阐述本发明的结构特征和功效，下面结合附图与具体实施例来对本发明进行详细说明。
附图说明：
图1、图2是本发明提供的一种检测实体瘤微小残留病灶的方法的检测体系流程图。
图3、图4分别为实施例3中2022-01-09(样本ID:S2200039654):染色体不稳定性阳性结果、2022-04-11(样本ID:S2200047668):染色体不稳定性阴性结果示意图。
图5、图6分别为实施例4中2021-11-05(样本ID:PB5968):染色体不稳定性阳性结果和2022-06-07(样本ID:PC3677):染色体不稳定性阴性结果示意图。
图7、图8、图9分别为实施例5中2022-03-14(样本ID:S2200045588):染色体不稳定性阴性结果、2022-04-14(样本ID:S2200047780):染色体不稳定性阴性结果、2022-05-09(样本ID:S2200050210):染色体不稳定性阴性结果示意图。
具体实施方式：
下面将结合附图和有关知识对本发明作出进一步的说明，进行清楚、完整地描述，显然，所描述的应用仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
参照图1-图2所示，一种检测实体瘤微小残留病灶的方法，包括通过142基因的检测panel对实体瘤患者MRD检测；通过评估实体瘤患者是否存在基因组不稳定性,得到ctDNA含量的估计；结合上述检测结果给出风险分级。
其中，142基因的检测panel的构建步骤包括：确认覆盖癌症类型；确认覆盖基因信息；调取自有数据库中实体瘤患者NGS检测结果进行有效区域筛选，进一步优选，确认覆盖基因信息包括：用药指导、MRD检测及动态监测、覆盖用药敏感及耐药基因、肿瘤驱动基因、I/II类基因变异、MSI位点、化疗位点，涵盖CFDA、FDA、NCCN指南推荐及临床研究阶段信息来源；
本发明142基因列表如表1所示：
表1：142基因列表
Figure BDA0003894689380000061
注:去重后,共计142基因。
以及调取自有数据库中实体瘤患者NGS检测结果进行有效区域筛选具体包括：按照癌种类型将数据进行分类,获得各癌种样本数量，针对各癌种数据，在142基因全部编码外显子范围内，以外显子为单位进行评估，如果当前外显子中包含体细胞突变且在当前癌种中人群突变频率>＝5％,保留该外显子；在其他癌种及外显子中进行同样的迭代评估，保留符合条件的外显子区域，去掉不符合条件的外显子区域,获得筛选后的Panel区域。
本发明提出了可同时检测ctDNA突变信息及基因组不稳定性的双指标MRD检测方法,通过同时评估两个指标,可显著提升MRD检出率,降低假阴性。
在本发明中，基因组不稳定性的评估算法包括：全局拷贝数校正估计和特殊染色体校正；
进一步优选，全局拷贝数校正估计包括基于低覆盖度的全基因组测序数据，数据比对到人类参考基因组GRch37，基因组被分割为1Mb大小的区段i，计算区段内平均覆盖度；覆盖深度校正：对区域覆盖深度进行校正，校正因素包括GC含量G和比对度M，计算每个区段内的GC含量和比对度M，
使用loess回归拟合：d～αG+βM估算loess回归的参数系数，得到拟合模型的参数计算出校正后的覆盖度d，拷贝数估计：
校正后对每个区段i计算平均比值r：
Figure BDA0003894689380000071
该平均比值和区段i的拷贝数Ci和肿瘤纯度p相关：/>
Figure BDA0003894689380000072
通过EM算法估计最大程度拟合ri的拷贝数C和肿瘤纯度p，可以计算出每个区段的估计拷贝数C；以及特殊染色体校正包括：对于染色体19的校正因素包括PCR轮数pn和起始DNA量m，Cnorm＝αpn+βm经过校正后的拷贝数Cnorm合并入最终结果，判定基因组存在不稳定性的标准为p>0且至少有>10M的片段拷贝数C！＝2。
实施例1
参照图1所示，一种检测实体瘤微小残留病灶的方法，本发明通过可同时检测ctDNA突变信息及基因组不稳定性的双指标MRD检测方法,通过同时评估两个指标,可显著提升MRD检出率,降低假阴性；
解决了采用大Panel(425基因)+NGS+生物信息分析的方式进行微小残留病灶的检测,仅能检测SNV,Indel,Fusion,及基因层面的CNV,而无法检测基因组层面的染色体变化的问题，如果肿瘤样本只发生染色体层面的变化,会导致上述方法MRD判断阴性,存在假阴性的现象。
具体包括以下方法
步骤1：提供一个包含142基因的检测panel(MRD Panel)，可用于实体瘤患者MRD检测及用药指导,可给出ctDNA含量估计及用药指导信息等，MRD panel构建方法如下；
步骤1；覆盖癌症类型确认：根据最新世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布的2020年全球最新癌症负担数据,确认中国发病率Top10的癌种,同时结合自有知识库信息,增补9个癌种,最终MRD Panel共计覆盖19个癌种；
步骤2；覆盖基因信息确认:该Panel兼具用药指导,MRD检测及动态监测等功能,覆盖用药敏感及耐药基因、肿瘤驱动基因、I/II类基因变异、MSI位点、化疗位点等，涵盖CFDA、FDA、NCCN指南推荐及临床研究阶段等信息来源，最终基因数142个(去重后)；
步骤3；调取自有数据库中约11万例实体瘤患者NGS检测结果进行有效区域筛选。首先按照步骤1；癌种类型将数据进行分类,获得各癌种样本数量(N)。针对各癌种数据，在142基因全部编码外显子范围内，以外显子为单位进行评估，如果当前外显子中包含体细胞突变且在当前癌种中人群突变频率>＝5％(以N为基数),保留该外显子；在其他癌种及外显子中进行同样的迭代评估。保留符合条件的外显子区域，去掉不符合条件的外显子区域,最终获得筛选后的Panel区域；
步骤4；结果比较：覆盖区域,测序深度比较，如下表2所示；
表2
区域大小(Kb) 测序量(G) 测序深度(X)
142基因全部编码外显子(b) 345 8.4 10513
142基因筛选后区域(c) 101 8.4 41942
在本实施例中，142基因的检测panel，发病率排名:根据IARC2020全球癌症报告,给出top10排名,其他癌种无排序,标记NA；
参照表3所示；癌种:癌症类型；基因数:MRD Panel中与当前癌种相关的基因数；样本数(N):自有数据库中相关癌种的样本数；覆盖样本(N)比例:MRD Panel区域与自有数据中每个样本检出的体细胞突变信息位置进行比较,如果MRD Panel包含至少一个已知的体细胞突变,则判定MRD Panel覆盖该样本,获得覆盖样本比例；表3
Figure BDA0003894689380000091
在本实施例中，通过评估实体瘤患者是否存在基因组不稳定性,得到ctDNA含量的估计的具体步骤包括：
全局拷贝数校正估计和特殊染色体校正两个步骤：
全局拷贝数校正估计；基于低覆盖度(～1～2X)的全基因组测序数据。数据比对到人类参考基因组GRch37。基因组被分割为1Mb大小的区段(i)，计算区段内平均覆盖度。覆盖深度校正：对区域覆盖深度进行校正，校正因素包括GC含量(G)和比对度(M)。
计算每个区段内的GC含量和比对度M，使用loess回归拟合：d～αG+βM估算loess回归的参数系数，得到拟合模型的参数计算出校正后的覆盖度(d)。
拷贝数估计：校正后对每个区段i计算平均比值r：
Figure BDA0003894689380000101
该平均比值和区段i的拷贝数(Ci)和肿瘤纯度(p)相关：
Figure BDA0003894689380000102
通过EM算法估计最大程度拟合ri的拷贝数C和纯度p，可以计算出每个区段的估计拷贝数(C)。
特殊染色体校正：上述全局的校正和拷贝数估计适用于GC含量没有整体偏移的染色体，对于染色体19，GC含量较正常染色体偏高，因此需要进行进一步校正。
校正因素包括PCR轮数(pn)和起始DNA量(m)Cnorm＝αpn+βm经过校正后的拷贝数(Cnorm)合并入最终结果，最终判定基因组存在不稳定性的标准为p>0且至少有>10M的片段拷贝数C！＝2。本发明通过同时检测ctDNA突变信息及基因组不稳定性的双指标MRD检测方法,通过同时评估两个指标,可显著提升MRD检出率,降低假阴性。
实施例2
一种检测实体瘤微小残留病灶的方法，整体检测流程实施方式如下:
样本量:两管10ml外周血,全部用于血浆分离及cfDNA提取,提取总量>＝20ng可用于后续NGS文库构建，商业化文库构建试剂盒进行WGS文库构建,原有实验条件20度15min(接头连接),修改为4度过夜，100ng文库用于WGS测序,测序数据量6G(2x),剩余文库用于与MRD panel进行杂交捕获；捕获后测序4G(20000x)；突变分析流程进行panel区域内的基因突变分析(SNV,Indel,Fusion,CNV)；基因组不稳定性分析流程进行WGS数据的分析,评估基因组不稳定性；综合判断ctDNA含量及MRD结果。
表4:结果判读
Figure BDA0003894689380000111
本发明提出了可同时检测ctDNA突变信息及基因组不稳定性的双指标MRD检测方法,通过同时评估两个指标,可显著提升MRD检出率,降低假阴性。
实施例3
一种检测实体瘤微小残留病灶的方法，通过MRD panel对乙状结肠癌患者检测ctDNA突变信息；以及通过低深度WGS测序评估该患者的基因组不稳定性，本实施例通过结合ctDNA突变信息及基因组不稳定性结果,得到ctDNA含量的估计,并给出对应的风险分级。样本基本信息参照表5所示；
表5：样本基本信息
Figure BDA0003894689380000121
检测结果汇总参照表6所示
表6：检测结果汇总
Figure BDA0003894689380000122
参照图3:染色体不稳定性阳性结果(样本ID:S2200039654)
每个点表示一个小的染色体区段，横坐标表示在染色体的相应位置，纵坐标表示该染色体区段的拷贝数丰度标准化(取对数log值)后的值，图3中染色体拷贝数正常的区段对应的点为蓝色，发生染色体扩增的区段对应的点为红色，发生染色体缺失的区段对应的点为绿色。(图3-图9,注释信息参考本段信息)
图4:染色体不稳定性阴性结果(样本ID:S2200047668)。
实施例4
用于乳腺癌的微小残留病灶的检测方法:通过MRD panel对乳腺癌患者检测ctDNA突变信息；以及通过低深度WGS测序评估实体瘤患者的基因组不稳定性，本实施例通过结合ctDNA突变信息及基因组不稳定性结果,得到ctDNA含量的估计,并给出对应的风险分级，样本基本信息参照表7所示；
表7：样本基本信息
Figure BDA0003894689380000131
检测结果汇总参照表8所示
表8：检测结果汇总
Figure BDA0003894689380000132
突变阳性结果参照表9所示
表9：突变阳性结果
Figure BDA0003894689380000133
Figure BDA0003894689380000141
参照图5所示，染色体不稳定性阳性结果(样本ID:PB5968)；
参照图6所示，染色体不稳定性阴性结果(样本ID:PC3677)。
实施例5
一种检测直肠癌微小残留病灶的方法，通过MRD panel对直肠癌实体瘤患者检测ctDNA突变信息；以及通过低深度WGS测序评估实体瘤患者的基因组不稳定性，本实施例通过结合ctDNA突变信息及基因组不稳定性结果,得到ctDNA含量的估计,给出对应的风险分级，样本基本信息参照表10所示.
表10:样本基本信息
Figure BDA0003894689380000142
检测结果汇总如表11所示:
表11:检测结果汇总
Figure BDA0003894689380000143
Figure BDA0003894689380000151
参照图7所示，染色体不稳定性阴性结果；(样本ID:S2200045588)；
参照图8所示，染色体不稳定性阴性结果；(样本ID:S2200047780)；
参照图9所示，染色体不稳定性阴性结果；(样本ID:S2200050210)。
本发明通过同时检测ctDNA突变信息及基因组不稳定性的双指标MRD检测方法,通过同时评估两个指标,可显著提升MRD检出率,降低假阴性。
以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理，仅是本发明的优选实施方式。本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种检测实体瘤微小残留病灶的方法，其特征在于，包括通过142基因的检测panel对实体瘤患者检测ctDNA突变信息；以及通过低深度WGS测序评估实体瘤患者的基因组不稳定性，结合ctDNA突变信息及基因组不稳定性结果,得到ctDNA含量的估计,并给出对应的风险分级。
2.如权利要求1的一种检测实体瘤微小残留病灶的方法，其特征在于，所述142基因的检测panel的构建步骤包括：确认覆盖癌症类型；确认覆盖基因信息；调取自有数据库中实体瘤患者NGS检测结果进行有效区域筛选。
3.如权利要求2的一种检测实体瘤微小残留病灶的方法，其特征在于，所述确认覆盖基因信息包括：用药敏感及耐药基因、MRD检测及动态监测区域、肿瘤驱动基因、I/II类基因变异、MSI位点、化疗位点，涵盖CFDA、FDA、NCCN指南推荐及临床研究阶段信息来源。
4.如权利要求3的一种检测实体瘤微小残留病灶的方法，其特征在于，所述调取自有数据库中实体瘤患者NGS检测结果进行有效区域筛选具体包括：按照癌种类型将数据进行分类,获得各癌种样本数量，针对各癌种数据，在142基因全部编码外显子范围内，以外显子为单位进行评估，如果当前外显子中包含体细胞突变且在当前癌种中人群突变频率>＝5％,保留该外显子；在其他癌种及外显子中进行同样的迭代评估，保留符合条件的外显子区域，去掉不符合条件的外显子区域,获得筛选后的Panel区域。
5.如权利要求2的一种检测实体瘤微小残留病灶的方法，其特征在于，所述基因组不稳定性的评估算法包括：全局拷贝数校正估计和特殊染色体校正。
6.如权利要求5的一种检测实体瘤微小残留病灶的方法，其特征在于，所述全局拷贝数校正估计包括基于低覆盖度的全基因组测序数据，数据比对到人类参考基因组GRch37，基因组被分割为1Mb大小的区段i，计算区段内平均覆盖度；覆盖深度校正：对区域覆盖深度进行校正，校正因素包括GC含量G和比对度M，计算每个区段内的GC含量和比对度M，
使用loess回归拟合：d～αG+βM估算loess回归的参数系数，α,β分别为回归模型G,M项的拟合系数，得到拟合模型的参数计算出校正后的覆盖度d；拷贝数估计：校正后对每个区段i计算平均比值r：
Figure FDA0003894689370000021
该平均比值和区段i的拷贝数Ci和肿瘤纯度p相关：
Figure FDA0003894689370000022
Lj为全部基因组上第j个区段长度(bp)，
通过EM算法估计最大程度拟合ri的拷贝数和肿瘤纯度p，计算出每个区段的估计拷贝数C。
7.如权利要求6的一种检测实体瘤微小残留病灶的方法，其特征在于，所述特殊染色体校正包括：对于染色体19的校正因素包括PCR轮数pn和起始DNA量m，Cnorm＝αpn+βm经过校正后的拷贝数Cnorm合并入最终结果，判定基因组存在不稳定性的标准为p>0且至少有>10M的片段拷贝数C！＝2。
8.如权利要求6的一种检测实体瘤微小残留病灶的方法，其特征在于，所述142基因列表具体包括
检测点突变+插入缺失+拷贝数变异
Figure FDA0003894689370000023
Figure FDA0003894689370000031
检测点突变+插入缺失变异+融合变异+拷贝数变异
Figure FDA0003894689370000032
化疗用药相关基因
Figure FDA0003894689370000033
去重后,共计142基因。
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