JPWO2019202872A1 - 質量分析用キット、微生物識別用キット、試料の調製方法、分析方法および微生物の識別方法 - Google Patents

質量分析用キット、微生物識別用キット、試料の調製方法、分析方法および微生物の識別方法 Download PDF

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Abstract

質量分析用キット（１ａ）は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化により試料をイオン化する質量分析に用いる質量分析用キット（１ａ）であって、固体状態の、マトリックス試薬および／またはマトリックスの添加剤（１１ａ）と、上記マトリックス試薬および／または添加剤がそれぞれ配置された複数の容器（１０ａ）と、を備える。

Description

本発明は、質量分析用キット、微生物識別用キット、試料の調製方法、分析方法および微生物の識別方法に関する。
マトリックス支援レーザー脱離イオン化（以下、ＭＡＬＤＩと呼ぶ）法により試料をイオン化する質量分析は、微生物の識別等の様々な用途に好適に用いられる分析方法である。ＭＡＬＤＩ法を用いた質量分析では、試料プレートの複数の試料配置部位に、それぞれ調製された複数の試料（以下、質量分析用試料と呼ぶ）を配置し、各試料配置部位にレーザーを照射して質量分析用試料をイオン化する。
１つの試料プレートに例えば数十以上の質量分析用試料を配置してから、当該試料プレートを質量分析計に配置して質量分析を行う場合もあり、これらの質量分析用試料の調製には煩雑な作業を要した。
質量分析用試料の調製には、マトリックスに加え、好適なマトリックスの添加剤が用いられることで、より精密な測定データを得られる場合があるが（特許文献１参照）、各試料にマトリックスの添加剤を加える操作を行うと、質量分析用試料の調製はさらに煩雑な作業となる。
日本国特開２００９−１２１８５７号公報
マトリックス支援レーザー脱離イオン化法による質量分析用試料の調製を行う際の、作業の煩雑さが軽減されることが望ましい。
本発明の第１の態様によると、質量分析用キットは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化により試料をイオン化する質量分析に用いる質量分析用キットであって、固体状態の、マトリックス試薬および／またはマトリックスの添加剤と、前記マトリックス試薬および／または前記添加剤がそれぞれ配置された複数の容器と、を備える。
本発明の第２の態様によると、第１の態様の質量分析用キットにおいて、前記複数の容器のそれぞれの容量は、１００μＬ以上５ｍＬ以下であることが好ましい。
本発明の第３の態様によると、第２の態様の質量分析用キットにおいて、前記複数の容器のそれぞれの容量は、２００μＬ以上３ｍＬ以下であることが好ましい。
本発明の第４の態様によると、第１から第３までのいずれかの態様の質量分析用キットにおいて、前記複数の容器の個数は、５以上であることが好ましい。
本発明の第５の態様によると、第１から第４までのいずれかの態様の質量分析用キットにおいて、前記複数の容器のそれぞれにおいて、前記マトリックス試薬と前記添加剤とは混合されて配置されていることが好ましい。
本発明の第６の態様によると、第１から第５までのいずれかの態様の質量分析用キットにおいて、前記マトリックス試薬は、固体マトリックスまたは液体マトリックスを構成する物質を含むことが好ましい。
本発明の第７の態様によると、第１から第６までのいずれかの態様の質量分析用キットにおいて、前記マトリックス試薬および／または前記添加剤が配置された前記複数の容器とは異なる溶媒用容器に配置された溶媒をさらに備えることが好ましい。
本発明の第８の態様によると、第１から第７までのいずれかの態様の質量分析用キットにおいて、前記添加剤は、ホスホン酸基を含む化合物を含むことが好ましい。
本発明の第９の態様によると、微生物識別用キットは、第１から第８までのいずれかの態様の質量分析用キットを備える。
本発明の第１０の態様によると、試料の調製方法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化を行う質量分析に用いる複数の試料の調製方法であって、固体状態の、マトリックス試薬および／またはマトリックスの添加剤がそれぞれ配置された複数の容器を用意することと、前記マトリックス試薬および／または前記添加剤を用いて、前記複数の容器にそれぞれ対応した複数の試料とを含む質量分析用試料を調製することとを備える。
本発明の第１１の態様によると、第１０の態様の試料の調製方法において、前記添加剤が配置された前記複数の容器のそれぞれに前記試料、マトリックス試薬および溶媒を加えて前記質量分析用試料を調製することが好ましい。
本発明の第１２の態様によると、第１０の態様の試料の調製方法において、前記複数の容器のそれぞれにおいて、前記マトリックス試薬と前記添加剤とが混合されて配置されており、前記マトリックス試薬および前記添加剤が配置された前記複数の容器のそれぞれに前記試料および溶媒を加えて前記質量分析用試料を調製することが好ましい。
本発明の第１３の態様によると、分析方法は、第１０から第１２までのいずれかの態様の試料の調製方法により質量分析用試料を調製することと、前記質量分析用試料にレーザーを照射してイオン化することと、イオン化された前記質量分析用試料を質量分析することと、を備える。
本発明の第１４の態様によると、微生物の識別方法は、第１０から第１２までのいずれかの態様の試料の調製方法により微生物に含まれる複数のタンパク質を含む質量分析用試料を調製することと、前記質量分析用試料にレーザーを照射してイオン化することと、イオン化された前記質量分析用試料を質量分析してマススペクトルを作成することと、前記マススペクトルにおけるピークと、データベースに記憶された複数の微生物に含まれるタンパク質のマススペクトルのピークとの比較を行うことと、前記比較に基づいて、前記微生物がいずれの微生物であるかを識別することとを備える。
本発明によれば、マトリックスやマトリックスの添加剤を利用して質量分析用試料の調製を行う際の、作業の煩雑さを軽減することができ、従って効率的に質量分析を行うことができる。
図１は、一実施形態の質量分析用キットを示す概念図である。 図２は、一実施形態に係る試料の調製方法を示す概念図である。 図３は、一実施形態に係る微生物の識別方法の流れを示すフローチャートである。 図４は、変形例の質量分析用キットを示す概念図である。 図５は、変形例に係る試料の調製方法を示す概念図である。 図６は、変形例に係る微生物の識別方法の流れを示すフローチャートである。 図７は、変形例の質量分析用キットを示す概念図である。 図８は、変形例の質量分析用キットを示す概念図である。 図９は、実施例１において、マトリックスの添加剤を用いないで皮膚常在菌から調製した質量分析用試料のマススペクトルである。 図１０は、実施例１において、マトリックスの添加剤としてＭＤＰＮＡを含む質量分析用キットを用いて皮膚常在菌から調製した質量分析用試料のマススペクトルである。 図１１は、実施例２において、マトリックスの添加剤としてＭＤＰＮＡを含む質量分析用キットを用いて乳酸菌から調製した質量分析用試料のマススペクトル（上段）と、マトリックスの添加剤を用いないで乳酸菌から調製した質量分析用試料のマススペクトル（下段）である。
以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明する。
図１は、本実施形態の質量分析用キットを示す概念図である。質量分析用キット１ａは、固体状態の、マトリックスの添加剤（以下、適宜、単に添加剤と呼ぶ）１１ａと、添加剤１１ａが格納された複数の容器（以下、添加剤用容器と呼ぶ）１０ａと、溶媒２１が格納された容器（以下、溶媒用容器と呼ぶ）２０を備える。添加剤用容器１０ａは、添加剤用容器本体１２と、添加剤用容器蓋部１３とを備える。
なお、質量分析用キット１ａは、質量分析で用いられるその他の物品を含んでもよい。また、質量分析用キット１ａは、添加剤１１ａを含む添加剤用容器１０ａを備えれば、溶媒２１を含まなくてもよい。
添加剤用容器１０ａの容量は、ＭＡＬＤＩ法によるイオン化を行う質量分析の際に、試料プレート上の試料を配置する部位（以下、試料配置部位と呼ぶ）に滴下される、質量分析用試料の量に基づくことが好ましい。これにより、添加剤用容器１０ａに試料およびマトリックス試薬を加えて質量分析用試料を好適に調製することができる。
なお、添加剤用容器１０ａにおいて添加剤１１ａを含む溶液（以下、添加剤溶液と呼ぶ）を調製してから他の容器に分注し、当該他の容器において質量分析用試料を調製してもよい。
ＭＡＬＤＩにおいて、１種類の質量分析用試料を１つの添加剤用容器１０ａ内で調製し、数か所の試料配置部位に配置する場合、１か所あたり１μＬの質量分析用試料を滴下すると、数μＬの質量分析用試料が必要となる。試料配置部位に配置される質量分析用試料の量は、０．２μＬや１．５μＬ等の１μＬとは異なる値が設定され得ることを考慮しても、添加剤用容器１０ａの容量はそれほど大きい必要は無い。従って、保管の際に占める空間を節約する観点から、添加剤用容器１０ａの容量は、５ｍＬ以下が好ましく、２ｍＬ以下がより好ましく、１．５ｍＬ以下がより一層好ましく、１．０ｍＬ以下がさらに好ましく、０．５ｍＬ以下がさらに一層好ましい。
添加剤用容器１０ａの容量があまり小さすぎると、取扱いが難しくなるため、添加剤用容器１０ａの容量は、１００μＬ以上が好ましく、２００μＬ以上がより好ましい。
図１には、添加剤用容器１０ａが２４個示されているが、質量分析用キット１ａに含まれる添加剤１１ａが格納された添加剤用容器１０ａの個数は特に限定されない。
ＭＡＬＤＩ用の試料プレートでは、例えば９６か所や３８４か所等の試料配置部位が設置されているものが販売されており、試料プレートを一度質量分析計に配置すると、その状態で較正等を行った後、数か所〜数百か所の試料配置部位に配置された試料の分析を行うこともある。従って、質量分析用キット１ａに含まれる添加剤用容器１０ａの個数は、２以上が好ましく、５以上がより好ましく、１０以上がより一層好ましく、２０以上がさらに好ましい。質量分析用キット１０ａに含まれる添加剤用容器１０ａの個数が多い程、添加剤１１ａが格納された添加剤用容器１０ａを購入等して補充するための作業を減らすことができる。
質量分析用キット１ａに含まれる添加剤用容器１０ａの個数が多すぎると、保管期間が長くなって添加剤１１ａが活性を失ったり、保管する空間を広くとる必要があるため他の物品を収納する空間が狭くなる等の問題が発生するため、当該個数は、適宜１０００以下または５００以下等にすることができる。
添加剤用容器１０ａの形状等は、特に限定されず、添加剤用容器蓋部１３が添加剤用容器本体１２と一体として形成されていてもよいし、添加剤用容器蓋部１３と添加剤用容器本体１２とが切り離された複数の部品としてそれぞれ形成されていてもよい。また、添加剤用容器１０ａは、他の添加剤用容器１０ａと一体として形成されていてもよく、例えば８連チューブのように所定の個数の添加剤用容器１０ａごとに、添加剤用容器本体１２および／または添加剤用容器蓋部１３が一体として形成されていてもよい。
各添加剤用容器１０ａに配置された添加剤１１ａは、マトリックスを含む質量分析用試料の調製に用いられ、質量分析において、ノイズを低下させたり分析対象のイオンの検出感度を高くしたり等の何らかの効果が期待されるものであれば特に限定されない。
好適には、添加剤１１ａは、ホスホン酸基を含む化合物を含む。ホスホン酸基を１個含む化合物としては、ホスホン酸（Phosphonic acid）、メチルホスホン酸（Methylphosphonicacid）、フェニールホスホン酸（Phenylphosphonic acid）、１−ナフチルメチルホスホン酸（1-Naphthylmethylphosphonic acid）等が好ましい。
ホスホン酸基を２個以上含む化合物としては、メチレンジホスホン酸（Methylenediphosphonic acid；以下ＭＤＰＮＡと呼ぶ）、エチレンジホスホン酸（Ethylenediphosphonic
acid）、エタン−１−ヒドロキシ−１，１−ジホスホン酸（Ethane-1-hydroxy-1,1-diphosphonic acid）、ニトリロトリホスホン酸（Nitrilotriphosphonic acid）、エチレンジアミノテトラホスホン酸（Ethylenediaminetetraphosphonic acid）等が好ましく、メチレンジホスホン酸（ＭＤＰＮＡ）がより好ましい。
ホスホン酸基を含む化合物を含む添加剤１１ａを用いて調製された質量分析用試料を質量分析することにより、ノイズを減らしたり、微生物の、特に細胞質成分等に含まれるタンパク質等の検出感度を高めたり、リン酸化ペプチド等のペプチドの検出感度を高めたりすることができる。質量分析において正イオンを検出する場合でも負イオンを検出する場合でもこのような効果が奏される。
添加剤１１ａは固体状態でそれぞれの添加剤用容器１０ａに格納されている。これにより、溶媒に溶解され溶質として保存されている場合よりも長く活性を維持することができる。
添加剤１１ａを含む添加剤用容器１０ａの製造方法は以下の通りである。適当な溶媒を用いて添加剤１１ａを所定の濃度で含む溶液を調製した後、ピペットや分注装置等を用いて所定の量の当該溶液がそれぞれの添加剤用容器１０ａに分注される。添加剤１１ａを含む溶液が分注された添加剤用容器１０ａを乾燥させると、固体状態の添加剤１１ａを含む添加剤用容器１０ａが得られる。添加剤１１ａを含む溶液の乾燥方法は特に限定されず、添加剤用容器１０ａの添加剤用容器蓋部１３を開けたまま放置してもよいし、さらに真空乾燥器等による減圧を行ってもよい。
質量分析用キット１ａにおいて、添加剤用容器１０ａとは異なる溶媒用容器２０に格納された溶媒２１は、質量分析用試料の調製の際に、マトリックス試薬を含む溶液（以下、マトリックス溶液と呼ぶ）や添加剤溶液等を調製するために適宜用いられる。
溶媒２１は、有機溶媒か、有機溶媒と水系溶媒とを混合して得られた溶媒が好ましく、有機溶媒や水系溶媒の種類は特に限定されない。一例を挙げると、溶媒２１は０％以上１％以下等の所定の体積パーセント濃度で調製されたトリフルオロ酢酸（TFA）と任意の濃度のアセトニトリル（ACN）とを含む水溶液で構成される。アセトニトリルの体積パーセント濃度は、数十％、特に５０％等に適宜設定することができる。このように有機溶媒を含んで調製された溶媒２１を用いて試料やマトリックス試薬等を含む溶液を調製することにより、マトリックス試薬を容易に溶解することができ、また、試料がグラム陰性菌等の場合には、細胞壁を破砕し、得られる質量分析用試料をよりイオン化されやすくすることができる。
溶媒２１を格納する溶媒用容器２０の形状、容量等は特に限定されず、任意の大きさのバイアル等の容器を溶媒用容器２０として用いることができる。
図２は、質量分析用キット１ａを用いた試料の調製方法を示す概念図である。添加剤用容器１０ａにマトリックス試薬が含まれている場合については、変形例で後述するため、ここでは、添加剤用容器１０ａにマトリックス試薬が含まれていないものとする。
図２の方法では、試料およびマトリックス試薬を含む溶液（以下、マトリックス含有試料溶液と呼ぶ）Ｓｍが添加剤用容器１０ａ以外の不図示の容器で調製された後、添加剤用容器１０ａに加えられる（矢印Ａ１１）。マトリックス試薬の種類は、イオン化が適切に行われれば特に限定されず、以下の変形例に挙げたもの等を適宜用いることができる。分析を行う質量分析用キット１ａのユーザ（以下、単にユーザと呼ぶ）は、添加剤用容器１０ａに含まれる添加剤１１ａに、マトリックス含有試料溶液ＳｍをピペットＰ１や不図示の分注装置等を用いて加える。
その後、添加剤１１ａとマトリックス含有試料溶液とがミキサー等を適宜用いてよく混合され、質量分析用試料Ｓｍａが調製される（矢印Ａ１２）。調製された質量分析用試料Ｓｍａは、試料プレート４０のそれぞれの試料配置部位４１にピペットＰ２や不図示の分注装置等を用いて配置される（矢印Ａ１３）。このように、質量分析用キット１ａを用いると、小分けにされた添加剤１１ａに溶液を加えて直接質量分析用試料Ｓｍａを調製できるので、この調製の際の作業の煩雑さを軽減できる。
なお、マトリックス試薬に溶媒２１等の溶媒を加えてマトリックス溶液を調製した後、マトリックス溶液を添加剤用容器１０ａに加える等して添加剤含有マトリックス溶液を調製し、調製した添加剤含有マトリックス溶液に試料を加えて質量分析用試料Ｓｍａを調製してもよい。
以下では、本実施形態の質量分析用キットを好適に用いた分析の一例として、質量分析による微生物の識別方法を説明する。質量分析用キット１ａは、微生物識別用キットとして用いられる。
なお、本実施形態の質量分析用キットは、添加剤を用いて質量分析用試料を作成する場合であれば、微生物の識別を目的とする以外にも用いることができる。
図３は、本実施形態の質量分析用キットを含む試料の調製方法、分析方法および微生物の識別方法の流れを示すフローチャートである。
ステップＳ１００１において、マトリックス試薬を含む容器と、固体状態の添加剤１１ａがそれぞれ配置された複数の容器（添加剤用容器１０ａ）と、マトリックス試薬および添加剤１１ａを溶解するための溶媒と、微生物に含まれるタンパク質を含む試料とが用意される。当該試料は、微生物を培養して得た単一のコロニーから採取した微生物や、微生物からギ酸等を用いて抽出した抽出液であることが好ましい。例えば、食品等に含まれる微生物の識別の場合、食品から抽出した、微生物を含む液体を培地等に塗布した後、培養が行われ、得られたコロニーから微生物を含む菌体抽出物を抽出することができる。ステップＳ１００１が終了したら、ステップＳ１００３が開始される。
ステップＳ１００３において、マトリックス試薬を含む容器に溶媒を加えてマトリックス溶液が調製される。マトリックス溶液は、溶媒２１を用いて調製されることが質量分析用キット１ａを効果的に利用する点で好ましいが、イオン化が適切に行われるのであればマトリックス試薬を溶解させる溶媒は特に限定されない。ステップＳ１００３が終了したら、ステップＳ１００５が開始される。ステップＳ１００５において、マトリックス溶液に試料が加えられる。ステップＳ１００５が終了したら、ステップＳ１００７が開始される。
ステップＳ１００７において、試料を含むマトリックス溶液が添加剤１１ａが配置された複数の容器（添加剤用容器１０ａ）に加えられ、試料、マトリックス試薬、および添加剤１１ａが混合され、質量分析用試料Ｓｍａが調製される。ステップＳ１００７が終了したら、ステップＳ１００９が開始される。ステップＳ１００９において、調製された質量分析用試料Ｓｍａが試料プレート４０に滴下され、乾燥させられる。ステップＳ１００９が終了したら、ステップＳ１０１１が開始される。
ステップＳ１０１１において、乾燥した質量分析用試料Ｓｍａにレーザーが照射され、イオン化される。試料プレート４０が質量分析計に配置され、当該質量分析計のレーザー装置からレーザーが質量分析用試料Ｓｍａに照射されてイオン化される。レーザーの波長等はイオン化が適切にされれば特に限定されず、Ｎ２レーザ（波長３３７ｎｍ）等を適宜用いることができる。ステップＳ１０１１が終了したら、ステップＳ１０１３が開始される。
ステップＳ１０１３において、イオン化された質量分析用試料Ｓｍａが質量分析され、マススペクトルが作成される。質量分析の方法は、所望の精度で微生物の識別を可能にするマススペクトルが得られれば特に限定されないが、分子量が数千〜２００００等のタンパク質を精度よく検出する観点から飛行時間型の質量分析が好ましい。従って、この質量分析を行う質量分析計は、フライトチューブ等の飛行時間型の質量分離部を備える質量分析計が好ましい。
上記質量分析においてイオンを検出して得られた検出信号は、Ａ／Ｄ変換器によりＡ／Ｄ変換されてＣＰＵ等を備える処理装置に入力される。処理装置はＡ／Ｄ変換された検出信号からマススペクトルを作成する。飛行時間型質量分析の場合、処理装置は、予め得られた較正データを用いて飛行時間からｍ／ｚを算出し、各ｍ／ｚに対応して検出された強度を算出してマススペクトルを作成する。ステップＳ１０１３が終了したら、ステップＳ１０１５が開始される。
ステップＳ１０１５において、マススペクトルにおけるピークと、データベースに記憶された複数の微生物に含まれるタンパク質のマススペクトルのピークとの比較が行われる。当該データベースには、微生物の菌種（属名および種形容語等）と、マススペクトルにおいて観察されるピークのｍ／ｚとが紐づけられたデータが記憶されている。上述の処理装置は、質量分析の精度に基づいて定められる誤差範囲に基づいて、データベースに示されたｍ／ｚに対応するピークが、質量分析用試料Ｓｍａを質量分析することにより得られたマススペクトルに存在するかを判定し、当該判定に基づいて類似度を算出する。類似度は、データベース上の微生物と質量分析用試料Ｓｍａに対応する微生物とのマススペクトル間の類似の度合を示すパラメータであり、類似度が高い方がマススペクトル同士がより類似すると定義される。ステップＳ１０１５が終了したら、ステップＳ１０１７が開始される。
なお、データベースには、各ｍ／ｚに対応するピークが各微生物の菌種のマススペクトルにおいて観察される割合や確率等に基づいた重みづけ情報を含んでもよく、当該重み付け情報に基づいて類似度が算出されてもよい。
ステップＳ１０１７において、ステップＳ１０１５での比較に基づいて、試料に用いた微生物がいずれの微生物であるかが識別される。上述の処理装置は、算出された類似度が一定以上で、かつ最も高い、データベース上の微生物の菌種を、試料に含まれる微生物の菌種として同定する。同定された菌種は、適宜液晶モニタ等の表示装置により表示される。ステップＳ１０１７が終了したら、処理が終了される。
なお、識別する微生物の分類は、属、種が好ましいが、マススペクトルの差異に基づいて識別可能であれば特に限定されない。微生物の識別の方法は、質量分析キット１ａを質量分析した結果に基づいて行われれば特に限定されない。
上述の実施形態によれば、次の作用効果が得られる。
（１）本実施形態の質量分析用キットは、ＭＡＬＤＩにより試料をイオン化する質量分析に用いる質量分析用キット１ａであって、固体状態の、マトリックスの添加剤１１ａと、添加剤１１ａがそれぞれ配置された複数の添加剤用容器１０ａと、を備える。これにより、添加剤１１ａを利用して質量分析用試料Ｓｍａの調製を行う際の、作業の煩雑さを軽減することができ、従って効率的に質量分析を行うことができる。
（２）本実施形態の質量分析用キットでは、添加剤１１ａが配置された添加剤用容器１０ａとは異なる溶媒用容器２０に配置された溶媒２１をさらに備える。これにより、添加剤溶液やマトリックス溶液等を調製する際に用いることができる溶媒２１がまとめて提供されるため、購入等による補充の手間を削減できる。
（３）本実施形態に係る試料の調製方法は、ＭＡＬＤＩを行う質量分析に用いる複数の試料の調製方法であって、固体状態の添加剤１１ａがそれぞれ配置された複数の添加剤用容器１０ａを用意することと、添加剤１１ａおよびマトリックス試薬を用いて、複数の添加剤用容器１０ａにそれぞれ対応した複数の試料とを含む質量分析用試料を調製することとを備える。これにより、作業の煩雑さを軽減することができ、従って効率的に質量分析を行うことができる。
（４）本実施形態の試料の調製方法において、添加剤１１ａが配置された複数の添加剤用容器１０ａのそれぞれに試料、マトリックス試薬および溶媒が加えられて質量分析用試料Ｓｍａが調製される。これにより、添加剤１１ａを含む添加剤溶液の分注を必要とせず、質量分析用試料Ｓｍａを調製することができる。
（５）本実施形態の分析方法は、上述の試料の調製方法により質量分析用試料Ｓｍａを調製することと、質量分析用試料Ｓｍａにレーザーを照射してイオン化することと、イオン化された質量分析用試料Ｓｍａを質量分析することと、を備える。これにより、添加剤１１ａを利用して質量分析用試料Ｓｍａの調製を行う際の、作業の煩雑さを軽減することができ、従って効率的に質量分析を行うことができる。
（６）本実施形態に係る微生物の識別方法は、上述の試料の調製方法により微生物に含まれる複数のタンパク質を含む質量分析用試料Ｓｍａを調製することと、質量分析用試料Ｓｍａにレーザーを照射してイオン化することと、イオン化された質量分析用試料Ｓｍａを質量分析してマススペクトルを作成することと、マススペクトルにおけるピークと、データベースに記憶された複数の微生物に含まれるタンパク質のマススペクトルのピークとの比較を行うことと、当該比較に基づいて、上記微生物がいずれの微生物であるかを識別することとを備える。これにより、質量分析においてノイズを減らしたり検出感度を上げる添加剤１１ａを利用して質量分析用試料Ｓｍａの調製を行う際の、作業の煩雑さを軽減することができ、従って効率的に微生物の識別を行うことができる。
次のような変形も本発明の範囲内であり、上述の実施形態と組み合わせることが可能である。以下の変形例において、上述の実施形態と同様の構造、機能を示す部位等に関しては、同一の符号で参照し、適宜説明を省略する。
（変形例１）
上述の実施形態における好適な一例として、添加剤用容器は、添加剤１１ａの他に、マトリックス試薬を含んでもよい。
図４は、本変形例の質量分析用キットを示す概念図である。質量分析用キット１ｂは、添加剤用容器１０ｂを備え、添加剤用容器１０ｂが固体状態のマトリックス試薬と固体状態の添加剤１１ａとの混合物１１ｂを備える点で上述の実施形態の質量分析用キット１ａとは異なっている。
混合物１１ｂにおけるマトリックス試薬の種類は、イオン化が適切に行われれば特に限定されない。マトリックス試薬とは、質量分析用試料Ｓｍａにおいて、固体マトリックスまたは液体マトリックスを構成する化合物である。液体マトリックスとは、室温で液体の状態で存在し、その実態は塩である物質をいう。マトリックス試薬が固体マトリックスを構成する場合、マトリックス試薬は、９−アミノアクリジン、４−アミノキナルジン、９−アントラセンカルボン酸、アントラニル酸アミド、カフェイン酸、クルクミン、４−クロロ−α−シアノケイ皮酸、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸、シナピン酸、１，５−ジアミノナフタレン、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、３−ヒドロキシピコリン酸またはｔｒａｎｓ−２−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−２−メチル−２−プロピニリデン］マロノニトリルが好ましい。
マトリックス試薬が液体マトリックスを構成する場合、マトリックス試薬は、アミンおよび有機物質を含み、アミンがプロトンの受容体として働き、有機物質がプロトンの供与体となるものが好ましい。この場合、マトリックス試薬は、液体マトリックスを構成するアミンおよび有機物質が混合されて乾固された状態として添加剤用容器１０ａに配置されることが好ましい。
なお、添加剤用容器１０ａのそれぞれに当該アミンまたは有機物質のいずれかが配置されていてもよい。この場合、質量分析用試料Ｓｍａの調整において、添加剤用容器１０ａにアミンが配置されている場合には有機物質を含む溶液を別途調製して添加剤容器１０ａに加え、添加剤用容器１０ａに有機物質が配置されている場合にはアミンを含む溶液を別途調製して添加剤容器１０ａに加えることができる。
液体マトリックスを構成するアミンは、第１級アミンでは、窒素原子がＯＨ基で置換されていてもよい、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｎ−ヘプチル、イソヘプチル、ｎ−オクチル、イソオクチル、ｎ−ノニル、イソノニル、ｎ−デシル、イソデシル、ｎ−ウンデシル、またはイソウンデシルの残基、あるいはフェニル残基と結合している第１級アミンを含むことが好ましい。
液体マトリックスを構成するアミンは、第２級または第３級アミンでは、窒素原子が、ＯＨ基で置換されていてもよい、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｎ−ヘプチル、イソヘプチル、ｎ−オクチル、およびイソオクチルの残基、ならびにフェニル残基からなる群より選択される、同種でも異種でもよい、２または３個の残基と結合している第２級または第３級アミンを含むことが好ましい。
液体マトリックスを構成するアミンは、３−アミノキノリン、ピリジン、イミダゾール、またはＣ−若しくはＮ−アルキル化イミダゾール誘導体を含むことも好ましい。
液体マトリックスを構成する有機物質は、ｐ−クマル酸イオン、２，５−ジヒドロキシ安息香酸若しくはその異性体（特に２ ，６−ジヒドロキシ安息香酸）、２−ヒドロキシ−５−メトキシ安息香酸若しくはその異性体、ピコリン酸、３−ヒドロキシピコリン酸、ニコチン酸、５−クロロ− ２−メルカプトベンゾチアゾール、６−アザ−２−チオチミン、トリフルオロメタンスルホネート、２’，４’，６’−トリヒドロキシアセトフェノン一水和物、２’，６’− ジヒドロキシアセトフェノン、９Ｈ−ピリド［３ ，４−ｂ］インドール、ジスラノール、ｔｒａｎｓ−３−インドールアクリル酸、オサゾン類、フェルラ酸、２，５−ジヒドロキシアセトフェノン、１−ニトロカルバゾール、７−アミノ−４−メチルクマリン、２−（ｐ−ヒドロキシフェニルアゾ）−安息香酸、８−アミノピレン−２，３，４−トリススルホン酸、２［２Ｅ−３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−フェニル）−２−メチルプロプ− ２−エニリデン］マロノニトリル（ＤＣＴＢ）、４−メトキシ−３−ヒドロキシ桂皮酸、または３，４−ジヒドロキシ桂皮酸を含むことが好ましい。
なお、複数の液体マトリックスを混合して用いてもよい。
以下の実施例に示すように、マトリックス試薬としてシナピン酸等、その添加剤としてＭＤＰＮＡ等の、ホスホン酸基を備える化合物を含む添加剤１１ａを用いて質量分析用試料Ｓｍａを調製した際には、特に質量分析におけるＳ／Ｎ比を高め、より精密に試料の分析を行うことができる。
混合物１１ｂを含む添加剤用容器１０ｂの製造方法は以下の通りである。溶媒２１等のマトリックス溶液の調製に使用可能な溶媒を用いて、添加剤１１ａを所定の濃度で含む添加剤溶液を調製した後、当該添加剤溶液にマトリックス試薬を加え添加剤含有マトリックス溶液を調製する。その後、ピペットや分注装置等を用いて所定の量の添加剤含有マトリックス溶液がそれぞれの添加剤用容器１０ｂに分注される。添加剤含有マトリックス溶液が分注された添加剤用容器１０ｂを乾燥させると、固体状態の混合物１１ｂを含む添加剤用容器１０ｂが得られる。添加剤含有マトリックス溶液の乾燥方法は特に限定されず、添加剤用容器１０ｂの添加剤用容器蓋部１３を開けたまま放置してもよいし、さらに真空乾燥器等による減圧を行ってもよい。
図５は、質量分析用キット１ｂを用いた試料の調製方法を示す概念図である。図５の方法では、試料を含む溶液Ｓが添加剤用容器１０ｂ以外の不図示の容器で調製された後、添加剤用容器１０ｂに加えられる（矢印Ａ２１）。ユーザは、添加剤用容器１０ｂに含まれる混合物１１ｂに、試料を含む溶液ＳをピペットＰ３や不図示の分注装置等を用いて加える。
その後、試料、添加剤１１ａおよびマトリックス試薬がミキサー等を適宜用いてよく混合され、質量分析用試料Ｓｍａが調製される（矢印Ａ２２）。調製された質量分析用試料Ｓｍａは、試料プレート４０のそれぞれの試料配置部位４１にピペットＰ４や不図示の分注装置等を用いて配置される（矢印Ａ２３）。このように、質量分析用キット１ｂを用いると、小分けにされたマトリックス試薬および添加剤１１ａに溶液を加えて直接質量分析用試料Ｓｍａを調製できるので、この調製の際の作業の煩雑さを軽減できる。
以下では、本変形例の質量分析用キットを好適に用いた分析の一例として、質量分析による微生物の識別方法を説明する。質量分析用キット１ｂは、微生物識別用キットとして用いられる。なお、本変形例の質量分析用キットは、添加剤を用いて質量分析用試料を作成する場合であれば、微生物の識別を目的とする以外にも用いることができる。
図６は、本変形例の質量分析用キットを含む試料の調製方法、分析方法および微生物の識別方法の流れを示すフローチャートである。
ステップＳ２００１において、固体状態の添加剤１１ａおよび固体状態のマトリックス試薬が共に配置された複数の容器（添加剤用容器１０ｂ）と、微生物に含まれるタンパク質を含む試料が用意される。ステップＳ２００１が終了したら、ステップＳ２００３が開始される。ステップＳ２００３において、試料に溶媒が加えられ、試料を含む溶液Ｓが調製される。試料を含む溶液Ｓは、溶媒２１を用いて調製されることが質量分析用キット１ｂを効果的に利用する点で好ましいが、イオン化が適切に行われるのであれば試料に加える溶媒は特に限定されない。ステップＳ２００３が終了したら、ステップＳ２００５が開始される。
ステップＳ２００５において、添加剤１１ａおよびマトリックス試薬が共に配置された複数の容器１０ｂに試料を含む溶液Ｓが加えられ、混合され、質量分析用試料Ｓｍａが調製される。ステップＳ２００５が終了したら、ステップＳ２００７が開始される。ステップＳ２００７からステップＳ２０１５までは、上述の実施形態におけるフローチャート（図３）のステップＳ１００９からステップＳ１０１７までと同様であるため、説明を省略する。ステップＳ２０１５が終了したら、処理が終了される。
本変形例の質量分析用キットにおいて、複数の添加剤用容器１０ｂのそれぞれにおいて、添加剤１１ａと混合されたマトリックス試薬をさらに備える。これにより、添加剤１１ａを利用して質量分析用試料Ｓｍａの調製を行う際の、作業の煩雑さをさらに軽減することができ、従って効率的に質量分析を行うことができる。
本変形例の試料の調製方法において、複数の添加剤用容器１０ｂは、添加剤１１ａに加えて固体状態のマトリックス試薬をさらに含み、マトリックス試薬および添加剤１１ａが配置された複数の添加剤用容器１０ｂのそれぞれに試料および溶媒を加えて質量分析用試料Ｓｍａが調製される。これにより、マトリックス試薬を含む溶液の分注を必要とせず、質量分析用試料Ｓｍａを調製することができる。
（変形例２）
上述の実施形態において、質量分析用キットが、添加剤１１ａが配置された複数の添加剤用容器１０ａとは異なるマトリックス用バイアルと、このマトリックス用バイアルに配置された固体状態のマトリックス試薬を備えてもよい。マトリックス試薬の種類は特に限定されず、上述の変形例に示した固体マトリックスまたは液体マトリックスを構成する物質とすることができる。
図７は、本変形例の質量分析用キットを示す概念図である。質量分析用キット１ｃは、溶媒２１を備えないが、マトリックス用バイアル２５ａを備え、マトリックス用バイアル２５ａが固体状態のマトリックス試薬２６を備える点で上述の実施形態の質量分析用キット１ａとは異なっている。これにより、添加剤１１ａに加えてマトリックス試薬２６がまとめて提供されるため、購入等による補充の手間を削減でき、また質量分析用試料Ｓｍａにおけるマトリックスの量を柔軟に調整することができる。マトリックス用バイアル２５ａの形状、容量等は特に限定されない。マトリックス試薬２６を添加剤１１ａと同様に小分けにして複数のマトリックス用容器に配置してもよい。
なお、質量分析用キット１ｃは、適宜溶媒２１やその他の消耗品を備えてもよい。また、マトリックス用バイアル２５ａはバイアルに限らず、任意の容器を用いることができる。
（変形例３）
上述の実施形態において、質量分析用キットが、添加剤１１ａを含まず、添加剤用容器１０ａと同様の形状を備えるマトリックス用容器に配置されたマトリックス試薬を備えてもよい。マトリックス試薬の種類は特に限定されず、上述の変形例に示した固体マトリックスまたは液体マトリックスを構成する物質とすることができる。
図８は、本変形例の質量分析用キットを示す概念図である。質量分析用キット１ｄは、溶媒２１を備えないが、上述の実施形態における添加剤用容器１０ａと同様の形状を備えるマトリックス用容器２５ｂを複数備え、このマトリックス用容器２５ｂがそれぞれ固体状態のマトリックス試薬２６を備える点で上述の実施形態の質量分析用キット１ａとは異なっている。これにより、分注等の手間を省き迅速に質量分析用試料を調製することができる。
なお、質量分析用キット１ｄは、添加剤１１ａが小分けにされまたは小分けにされず配置された容器や、溶媒２１等、適宜その他の消耗品を備えてもよい。また、マトリックス用容器２５ｂのそれぞれに液体マトリックスを構成するアミンまたは有機物質のいずれかが配置されていてもよい。この場合、アミンを含む溶液および有機物質を含む溶液をそれぞれ調製して混合することでマトリックス溶液を得ることができる。
保管の際に占める空間を節約する観点から、マトリックス用容器２５ｂの容量は、５ｍＬ以下が好ましく、２ｍＬ以下がより好ましく、１．５ｍＬ以下がより一層好ましく、１．０ｍＬ以下がさらに好ましく、０．５ｍＬ以下がさらに一層好ましい。
マトリックス用容器２５ｂの容量があまり小さすぎると、取扱いが難しくなるため、マトリックス用容器２５ｂの容量は、１００μＬ以上が好ましく、２００μＬ以上がより好ましい。
図８には、マトリックス用容器２５ｂが２４個示されているが、質量分析用キット１ｄに含まれるマトリックス試薬２６が格納されたマトリックス用容器２５ｂの個数は特に限定されない。
質量分析用キット１ｄに含まれるマトリックス用容器２５ｂの個数は、２以上が好ましく、５以上がより好ましく、１０以上がより一層好ましく、２０以上がさらに好ましい。質量分析用キット１ｄに含まれるマトリックス用容器２５ｂの個数が多い程、マトリックス試薬２６が格納されたマトリックス用容器２５ｂを購入等して補充するための作業を減らすことができる。
質量分析用キット１ｄに含まれるマトリックス用容器２５ｂの個数が多すぎると、保管期間が長くなってマトリックス試薬２６が活性を失ったり、保管する空間を広くとる必要があるため他の物品を収納する空間が狭くなる等の問題が発生するため、当該個数は、適宜１０００以下または５００以下等にすることができる。
（変形例４）
上述の実施形態および変形例では、試料と、マトリックス試薬と、添加剤１１ａとを含む質量分析用試料を調製した後に試料プレートに滴下するプレミックス法に質量分析用キット１ａ，１ｂ，１ｃ，１ｄを適用した。しかし、試料／マトリックス混合結晶を試料プレート上に形成した後に添加剤溶液を加えるオンプレート法に質量分析用キット１ａ，１ｂ，１ｃ，１ｄを適用してもよい。質量分析用キット１ａ，１ｂ，１ｃでは、添加剤１１ａまたはマトリックス試薬２６が小分けにされているため、例えば添加剤１１ａまたはマトリックス試薬２６を冷凍保存する必要がある場合等に、何度も凍結融解を繰り返す必要がなくなり、添加剤１１ａまたはマトリックス試薬２６の活性をより長く維持することができる。
以下に、実施例を示すが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
（実施例１：皮膚常在菌に含まれるタンパク質の質量分析）
＜１−１．試料を含む溶液の調製＞
皮膚をふき取って得た、微生物を含む試料をGAM培地に塗布し、３７℃で嫌気培養した。寒天プレートにできた単一コロニーを２０μＬの、1%トリフルオロ酢酸（TFA）を含む50%アセトニトリル（ACN）溶液に分散させて菌体抽出物を得た。
＜１−２．質量分析用キットの作成＞
シナピン酸（以下、SAと呼ぶ）に1% TFA入り50%ACN水溶液を加え、20 mg/mLのSA溶液を調製した。MDPNAに1% TFA入り50%ACN水溶液を加え、2 mg/100 mL MDPNA溶液を調製した。（１）SAキット（比較例）：上記20 mg/mLのSA溶液を５μＬずつPCRチューブに加えて、溶媒を乾燥させた。従って、１０μＬの溶液を加えると10 mg/mL SA溶液となる。
（２）MDPNA入りSAキット（実施例）：上記20 mg/mLのSA溶液と2 mg/100 mLのMDPNAを等量ずつ混合し、１０μＬずつPCRチューブに加えて溶媒を乾燥させた。従って、１０μＬの溶液を加えるとMDPNA入り10 mg/mL SA溶液となる。
＜１−３．ＭＡＬＤＩによる質量分析＞
（１）菌体抽出物１０μＬを上記SAキットに加えてよく混合し、１μＬずつMALDI試料プレートに滴下し、乾燥させて試料/マトリックス混合結晶を得た。
（２）菌体抽出物１０μＬを上記MDPNA入りSAキットに加えてよく混合し、１μＬずつMALDI試料プレートに滴下し、乾燥させて試料/マトリックス混合結晶を得た。
（１）（２）のそれぞれの試料/マトリックス混合結晶について、リニアーモードにより飛行時間型質量分析を行い、m/z 3000-15000の範囲を測定した。
図９は、SAキットを用いて調製した試料のMALDIマススペクトルを示す図である。試料1から5までのいずれも、ノイズしか検出されず、明瞭なピークは1本も検出されなかった。
図１０は、MDPNA入りSAキットを用いて調製した試料のMALDIマススペクトルを示す図である。MDPNA入りSAキットを用いて調製した試料のマススペクトルでは、明瞭なピークを検出することができた。
（実施例２：乳酸菌に含まれるタンパク質の質量分析）
＜２−１．試料を含む溶液の調製＞
乳酸菌Lactobacillus fermentumを培養し、ジルコニアビーズで破砕処理し、15000rpmで10分間遠心分離してデブリを除去した。得られた上清を1%TFA入り50%ACN水溶液に溶解させ、菌体破砕液を得た。
＜２−２．ＭＡＬＤＩによる質量分析＞
（１）菌体破砕液とマトリックス溶液（SA 10 mg/mL）を1：10の比で混合して混合液を調製し、１μＬずつMALDI試料プレートに滴下して乾燥させ、試料/マトリックス混合結晶を得た（比較例）。
（２）１０μＬの溶媒を加えると1%MDPNA（1 mg/100mL）となるように調製したMDPNAキットに、上記混合液を１０μＬ加えて混合し、１μＬずつMALDI試料プレートに滴下して乾燥させ、MDPNA入り試料/マトリックス混合結晶を得た（実施例）。
（１）（２）のそれぞれの試料/マトリックス混合結晶について、リニアーモードにより飛行時間型質量分析を行い、m/z 4000-20000の範囲を測定した。
図１１は、MDPNAキットを用いて調製したL. fermentumのMALDIマススペクトルを、MDPNAキットを用いないで調製したL.fermentumのマススペクトルと比較して示す図である。上段のMDPNA入りキットを用いて調製した試料が、下段のSAキットを用いたコントロール区に比べて、圧倒的にS/Nの良いピークが観測されていることが分かる。
本発明は上記実施形態の内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。
次の優先権基礎出願の開示内容は引用文としてここに組み込まれる。
日本国特許出願２０１８年第０７８５８４号（２０１８年４月１６日出願）
１ａ，１ｂ，１ｃ，１ｄ…質量分析用キット、１０ａ，１０ｂ…添加剤用容器、１１ａ…添加剤、１１ｂ…混合物、２０…溶媒用容器、２１…溶媒、２５ａ…マトリックス用バイアル、２５ｂ…マトリックス用容器、２６…マトリックス試薬、４０…試料プレート、４１…試料配置部位、Ｓ…試料、Ｓｍ…マトリックス含有試料溶液、Ｓｍａ…質量分析用試料。
本発明の第１の態様によると、質量分析用キットは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化により試料をイオン化する質量分析に用いる質量分析用キットであって、固体状態の、マトリックス試薬と、前記マトリックス試薬がそれぞれ配置された複数の容器と、を備える。
本発明の第２の態様によると、第１の態様の質量分析用キットにおいて、前記複数の容器のそれぞれの容量は、１００μＬ以上５ｍＬ以下であることが好ましい。
本発明の第３の態様によると、第２の態様の質量分析用キットにおいて、前記複数の容器のそれぞれの容量は、２００μＬ以上３ｍＬ以下であることが好ましい。
本発明の第４の態様によると、第１から第３までのいずれかの態様の質量分析用キットにおいて、前記複数の容器の個数は、５以上であることが好ましい。
本発明の第５の態様によると、第１から第４までのいずれかの態様の質量分析用キットにおいて、前記複数の容器のそれぞれにおいて、前記マトリックス試薬とマトリックス添加剤とが混合されて配置されていることが好ましい。
本発明の第６の態様によると、第１から第５までのいずれかの態様の質量分析用キットにおいて、前記マトリックス試薬は、固体マトリックスまたは液体マトリックスを構成する物質を含むことが好ましい。
本発明の第７の態様によると、第１から第６までのいずれかの態様の質量分析用キットにおいて、前記マトリックス試薬が配置された前記複数の容器とは異なる溶媒用容器に配置された溶媒をさらに備えることが好ましい。
本発明の第８の態様によると、第１から第７までのいずれかの態様の質量分析用キットにおいて、前記複数の容器のそれぞれは、マトリックスの添加剤として、ホスホン酸基を含む化合物を含むことが好ましい。
本発明の第９の態様によると、微生物識別用キットは、第１から第８までのいずれかの態様の質量分析用キットを備える。
本発明の第１０の態様によると、試料の調製方法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化を行う質量分析に用いる複数の試料の調製方法であって、固体状態の、マトリックス試薬がそれぞれ配置された複数の容器を用意することと、前記マトリックス試薬を用いて、前記複数の容器にそれぞれ対応した複数の試料とを含む質量分析用試料を調製することとを備える。
本発明の第１１の態様によると、第１０の態様の試料の調製方法において、前記マトリックス試薬が配置された前記複数の容器のそれぞれに前記試料および溶媒を加えて前記質量分析用試料を調製することが好ましい。
本発明の第１２の態様によると、第１０の態様の試料の調製方法において、前記複数の容器のそれぞれにおいて、前記マトリックス試薬とマトリックスの添加剤とが混合されて配置されており、前記マトリックス試薬および前記添加剤が配置された前記複数の容器のそれぞれに前記試料および溶媒を加えて前記質量分析用試料を調製することが好ましい。
本発明の第１３の態様によると、分析方法は、第１０から第１２までのいずれかの態様の試料の調製方法により質量分析用試料を調製することと、前記質量分析用試料にレーザーを照射してイオン化することと、イオン化された前記質量分析用試料を質量分析することと、を備える。
本発明の第１４の態様によると、微生物の識別方法は、第１０から第１２までのいずれかの態様の試料の調製方法により微生物に含まれる複数のタンパク質を含む質量分析用試料を調製することと、前記質量分析用試料にレーザーを照射してイオン化することと、イオン化された前記質量分析用試料を質量分析してマススペクトルを作成することと、前記マススペクトルにおけるピークと、データベースに記憶された複数の微生物に含まれるタンパク質のマススペクトルのピークとの比較を行うことと、前記比較に基づいて、前記微生物がいずれの微生物であるかを識別することとを備える。

Claims (14)

  1. マトリックス支援レーザー脱離イオン化により試料をイオン化する質量分析に用いる質量分析用キットであって、
    固体状態の、マトリックス試薬および／またはマトリックスの添加剤と、
    前記マトリックス試薬および／または前記添加剤がそれぞれ配置された複数の容器と、を備える質量分析用キット。
  2. 請求項１に記載の質量分析用キットにおいて、
    前記複数の容器のそれぞれの容量は、１００μＬ以上５ｍＬ以下である質量分析用キット。
  3. 請求項２に記載の質量分析用キットにおいて、
    前記複数の容器のそれぞれの容量は、２００μＬ以上３ｍＬ以下である質量分析用キット。
  4. 請求項１に記載の質量分析用キットにおいて、
    前記複数の容器の個数は、５以上である質量分析用キット。
  5. 請求項１から４までのいずれか一項に記載の質量分析用キットにおいて、
    前記複数の容器のそれぞれにおいて、前記マトリックス試薬と前記添加剤とは混合されて配置されている質量分析用キット。
  6. 請求項１から４までのいずれか一項に記載の質量分析用キットにおいて、
    前記マトリックス試薬は、固体マトリックスまたは液体マトリックスを構成する物質を含む質量分析用キット。
  7. 請求項１から４までのいずれか一項に記載の質量分析用キットにおいて、
    前記マトリックス試薬および／または前記添加剤が配置された前記複数の容器とは異なる溶媒用容器に配置された溶媒をさらに備える質量分析用キット。
  8. 請求項１から４までのいずれか一項に記載の質量分析用キットにおいて、
    前記添加剤は、ホスホン酸基を含む化合物を含む質量分析用キット。
  9. 請求項１から８までのいずれか一項に記載の質量分析用キットを備える微生物識別用キット。
  10. マトリックス支援レーザー脱離イオン化を行う質量分析に用いる複数の試料の調製方法であって、
    固体状態の、マトリックス試薬および／またはマトリックスの添加剤がそれぞれ配置された複数の容器を用意することと、
    前記マトリックス試薬および／または前記添加剤を用いて、前記複数の容器にそれぞれ対応した複数の試料とを含む質量分析用試料を調製することと
    を備える試料の調製方法。
  11. 請求項１０に記載の試料の調製方法において、
    前記添加剤が配置された前記複数の容器のそれぞれに前記試料、マトリックス試薬および溶媒を加えて前記質量分析用試料を調製する試料の調製方法。
  12. 請求項１０に記載の試料の調製方法において、
    前記複数の容器のそれぞれにおいて、前記マトリックス試薬と前記添加剤とが混合されて配置されており、
    前記マトリックス試薬および前記添加剤が配置された前記複数の容器のそれぞれに前記試料および溶媒を加えて前記質量分析用試料を調製する試料の調製方法。
  13. 請求項１０から１２までのいずれか一項に記載の試料の調製方法により質量分析用試料を調製することと、
    前記質量分析用試料にレーザーを照射してイオン化することと、
    イオン化された前記質量分析用試料を質量分析することと、
    を備える分析方法。
  14. 請求項１０から１２までのいずれか一項に記載の試料の調製方法により微生物に含まれる複数のタンパク質を含む質量分析用試料を調製することと、
    前記質量分析用試料にレーザーを照射してイオン化することと、
    イオン化された前記質量分析用試料を質量分析してマススペクトルを作成することと、
    前記マススペクトルにおけるピークと、データベースに記憶された複数の微生物に含まれるタンパク質のマススペクトルのピークとの比較を行うことと、
    前記比較に基づいて、前記微生物がいずれの微生物であるかを識別することと
    を備える微生物の識別方法。
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