JP2016512602A - 品質管理試薬及び方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、器具類の品質管理のための試薬及びそれを使用する方法を提供する。具体的には、質量分析（ＭＳ）及び／又は液体クロマトグラフィー（ＬＣ）の機能性を有する機器の性能を評定するための、ペプチド又は他の分子のセットが提供される。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年２月１３日出願の米国仮特許出願第６１／７６４，３１２号に対する優先権を主張するものであり、そのすべての内容は参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、器具類の品質管理のための試薬及びそれを使用する方法を提供する。具体的には、質量分析（ＭＳ）及び／又は液体クロマトグラフィー（ＬＣ）の機能性を有する機器の性能を評定するための、ペプチド又は他の分子のセットが提供される。

質量分析は、分子又は分子の混合物の分子質量の決定のための迅速かつ高感度な技術を提供する。ペプチド及びタンパク質の分析において、質量分析は、例えば、元の分子の分子質量（「分子量」又は「ＭＷ」とも称される）、元の分子のタンパク質分解によって生成されたペプチドの分子質量、元の分子のイオン化中に生成された断片の分子質量、ならびに元の分子及びその断片の均一なペプチド配列情報に関する詳細な情報を提供することができる。質量スペクトル計は非常に精密であり、系統誤差が誤ったｍ／ｚ値又は感度の変化を生じ得るため、それらの性能及び較正は、注意深く監視されなければならない。質量スペクトル計の較正のための方法及びキットは、種々の特許及び出願（例えば、米国特許第４，８４７，４９３号、米国特許出願公開第２００２／００３３４４７号、米国特許出願公開第２００２／００４５２６９号、米国特許出願公開第２００３／００６２４７３号を参照されたい）に記載されており、また市販されてもいる（例えば、ＰＲＯＴＥＯＭＡＳＳ Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＭＡＬＤＩ−ＭＳ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，ＵＳＡ）、Ｍａｓｓ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）、ＭＡＳＳＰＲＥＰ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．，ＵＳＡ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｉ ２０，０００−７０，０００ Ｄａ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａｓｓ．，ＵＳＡ）、Ａｌｌ−ｉｎ−１ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）を参照されたい）。しかしながら、これらのキットは、単一の実行処理における機器感度又はダイナミックレンジの測定を直接提供しない。

いくつかの実施形態では、本発明は、２以上の別個の構造（例えば、配列）の分子（例えば、ペプチド、核酸、ペプチド核酸、ポリマー等）のそれぞれの２以上の別個の質量のバージョンを含む試薬を提供する。本発明の多くの実施形態が、ペプチド試薬を含むものとして、又はそれと共に使用するために記載されるが、これらの実施形態は、他の分子及び／又はポリマーを含む品質管理及び性能評定試薬に適用されるものとして、より広く考えられるべきである。いくつかの実施形態では、本発明は、ペプチド試薬に限定されない。

いくつかの実施形態では、本発明は、２以上の別個の配列のペプチドのそれぞれの２以上の別個の質量のバージョンを含むペプチド混合物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、２以上の別個の配列のペプチドのそれぞれの２以上の別個の質量のバージョンからなるか、又は本質的になるペプチド混合物を提供する。いくつかの実施形態では、別個の配列のペプチドのそれぞれは、別個の疎水性度のペプチドである。いくつかの実施形態では、別個の配列のペプチドのうちのいずれかの別個の質量のバージョンのすべては、別個の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、別個の配列のペプチドのうちのいずれかの別個の質量のバージョンは、少なくとも０．１ｎＭの低さから少なくとも１００μＭの高さの範囲の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、別個の配列のペプチドのうちのいずれかの別個の質量のバージョンは、１ｎＭ〜１０μＭの範囲の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、別個の配列のペプチドのうちのいずれかの別個の質量のバージョンは、ゼプトモル〜ピコモルの総ペプチドで試薬中に存在する。いくつかの実施形態では、別個の配列のペプチドは、それらの異なる疎水性度又は他の化学特性（例えば、電荷、大きさ、もしくは親水性度）に基づいて、液体クロマトグラフィーによって分離可能である。いくつかの実施形態では、ペプチド混合物は、３〜２０の別個の配列のペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ペプチド混合物は、５〜１０の別個の配列のペプチドを含む。いくつかの実施形態では、別個の配列のペプチドのうちのいずれかの別個の質量のバージョンは、質量分析によって区別可能である。いくつかの実施形態では、別個の配列のペプチドのうちのいずれかの別個の質量のバージョンは、安定同位体標識されたアミノ酸の異なる組み合わせの結果である。いくつかの実施形態では、別個の配列のペプチドのうちのいずれかの別個の質量のバージョンは、構成原子の安定同位体の異なる組み合わせの結果である。いくつかの実施形態では、別個の配列のペプチドのうちのいずれかの別個の質量のバージョンのそれぞれは、異なる数の均一安定同位体標識されたアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチド混合物は、別個の配列のペプチドのそれぞれの３〜２０の別個の質量のバージョンを含む。いくつかの実施形態では、ペプチド混合物は、別個の配列のペプチドのそれぞれの５〜１０の別個の質量のバージョンを含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）及び質量分析（ＭＳ）の機能性の両方を有する機器の性能を評価するための方法であって、（ａ）ペプチド混合物を機器に導入することであって、そのペプチド混合物が、２以上の別個の配列のペプチドのそれぞれの２以上の別個の質量のバージョンを含むことと、（ｂ）ＬＣ（Ｃ₁₈、ＳＣＸ、ＨＩＬＩＣ等を含むがこれらに限定されない種々の移動相からなる）によってペプチド混合物を分析することと、（ｃ）ＭＳ（限定されないが、ＥＳＩ又はＭＡＬＤＩ法のイオン化からなる）によってペプチド混合物を分析することと、及び（ｄ）ステップ（ｂ）及び（ｃ）の結果に基づいて機器のＬＣ及びＭＳの機能性の性能を評価することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ペプチド混合物は、精製されたペプチドである。いくつかの実施形態では、ペプチド混合物の精製されたペプチドは、ステップ（ａ）において機器に導入される唯一のペプチドである。いくつかの実施形態では、ペプチド混合物は、１以上の不純物の存在下でペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ペプチド混合物は、１個以上の他のペプチド（例えば、バックグラウンド、汚染物質等）の存在下で機器に導入される。いくつかの実施形態では、ペプチド混合物は、２以上の別個の配列のペプチドのそれぞれの２以上の別個の質量のバージョンを含むペプチド混合物である。いくつかの実施形態では、機器のＬＣ及びＭＳの機能性の性能を評価することは、保持時間、ピーク高さ、ピーク幅、ピーク分解能、及びピーク対称性から選択される、各ペプチド配列に対する１以上のＬＣパラメータ、又は質量精度、質量分解能、感度、ダイナミックレンジ、線形応答、ＭＳ／ＭＳスペクトル品質及びサンプリング、ならびに／又は単離効率から選択される１以上のＭＳパラメータを報告することを含む。いくつかの実施形態では、機器のＬＣ及びＭＳの機能性の性能を評価することは、分解能、質量精度、ならびに「ニート」混合物の感度、複合混合物内の感度、機器的サンプリング、及びダイナミックレンジから選択される、ペプチド配列のうちの１以上の各々別個の質量のバージョンに対する１以上のＭＳパラメータを報告することを含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ及び／又はＭＳ性能の評価は、ソフトウェアプログラムによって提供される。いくつかの実施形態では、ソフトウェアは、単一分析からのＬＣ及び／もしくはＭＳパラメータ、機器の性能履歴、又は複数のＬＣ及び／もしくはＭＳ機器又は機器プラットフォームの間の比較を報告する。いくつかの実施形態では、ソフトウェアは、ＬＣ及び／又はＭＳ機器の性能スコアを提供する。いくつかの実施形態では、感度及び／又は性能は、ニート試料（例えば、実質的なバックグラウンド原因薬剤を含まない試薬）に対して評定される。いくつかの実施形態では、感度及び／又は性能は、複合試料（例えば、試薬及びバックグラウンド原因薬剤／ペプチド）に対して評定される。

いくつかの実施形態では、本発明は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）及び質量分析（ＭＳ）の機能性の両方を有する機器の性能を評価するための方法であって、（ａ）ペプチド混合物を機器に導入することであって、そのペプチド混合物が、２以上の別個の配列のペプチドのそれぞれの２以上の別個の質量のバージョンを含み、そのペプチド混合物が、２以上の別個の配列のペプチドのそれぞれの２以上の別個の質量のバージョンを含むことと、（ｂ）ＬＣによってペプチド混合物を分析することと、（ｃ）ＭＳによってペプチド混合物を分析することと、及び（ｄ）ステップ（ｂ）及び（ｃ）の結果に基づいて機器のＬＣ及びＭＳの機能性の性能を評価することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、別個の配列のペプチドは、別個の疎水性度であり、ＬＣによって分離可能である。いくつかの実施形態では、本発明は、重同位体標識されたアミノ酸の異なる組み合わせを含む別個の質量のバージョンを提供し、ＭＳによって分解される。いくつかの実施形態では、ＬＣ及びＭＳ性能の評価は、ソフトウェアプログラムによって提供される。いくつかの実施形態では、ソフトウェアは、単一分析からのＬＣ及びＭＳパラメータ、機器の性能履歴、又は複数のＬＣ及びＭＳ機器間の比較を報告する。いくつかの実施形態では、ソフトウェアは、ＬＣ及び／又はＭＳ機器の性能スコアを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、質量分析（ＭＳ）及び／もしくは液体クロマトグラフィー（ＬＣ）の機能性を有する機器の品質管理ならびに／又は性能の評価のための試薬及び／又は方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＭＳ及びＬＣの両方の機能性が、評価される。いくつかの実施形態では、ＭＳ及びＬＣの機能性の一方のみが評価される。いくつかの実施形態では、機器は、ＭＳ及びＬＣの両方の機能性を有するが、一方のみが評価される。いくつかの実施形態では、機器は、ＭＳ及びＬＣの機能性の一方のみを有する。いくつかの実施形態では、ＭＳ及びＬＣの機能性は、単一ユニットで提供される。いくつかの実施形態では、ＭＳ及びＬＣの機能性は、別のユニットで提供される。

いくつかの実施形態では、ＬＣ及び／又はＭＳの機能性の性能の評価は、ソフトウェアによって行われる。いくつかの実施形態では、ソフトウェアは、性能スコアを生成する。いくつかの実施形態では、性能スコアは、試験される機器（又は試験される機器の型）に固有である。いくつかの実施形態では、性能スコアは、所与の時間で、及び／又は経時的に試験される機器（又は試験される機器の型）の評価のために使用することができる。他の実施形態では、性能スコアは、他の類似の及び／又は異なる機器（例えば、ＬＣ及び／又はＭＳの機能性を有するもの）の性能スコアに相当する。いくつかの実施形態では、性能スコアは、所与の時間で、及び／又は経時的に試験される機器（又は試験される機器の型）と、他の類似の及び／又は異なる機器との比較のために使用することができる。いくつかの実施形態では、ソフトウェアを使用して、機器の履歴性能を追跡する。いくつかの実施形態では、機器の性能パラメータ（例えば、スコア）の報告が生成される。

いくつかの実施形態では、本発明は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）及び質量分析（ＭＳ）の機能性の両方を有する機器の性能を評価するための方法であって、（ａ）ペプチド混合物を機器に導入すること（例えば、注入すること）であって、ペプチド混合物が、２以上の別個の配列のペプチドのそれぞれの２以上の別個の質量のバージョンを含むことと、（ｂ）ＬＣによってペプチド混合物を分離又は分析することと、（ｃ）ＭＳによってペプチド混合物を分析することと、及び（ｄ）ソフトウェアを使用して、ステップ（ｂ）及び（ｃ）の結果に基づいて機器のＬＣ及びＭＳの機能性の性能を評価することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ペプチド混合物は、２以上の別個の配列のペプチドのそれぞれの２以上の別個の質量のバージョンを含むペプチド混合物である。いくつかの実施形態では、別個の配列のペプチドの各々別個の質量のバージョンは、異なる濃度で存在する。いくつかの実施形態では、機器のＬＣ及びＭＳの機能性の性能を評価することは、保持時間、ピーク高さ、ピーク幅、ピーク分解能、及びピーク対称性から選択される、各ペプチド配列に対する１以上のＬＣパラメータを報告することを含む。いくつかの実施形態では、機器のＬＣ及びＭＳの機能性の性能を評価することは、単一分析実験における、分解能、質量精度、「ニート」試料の感度、複合試料内の感度、ダイナミックレンジ、質量分解能、単離効率、ＭＳ／ＭＳスペクトル品質、及び線形応答から選択される、ペプチド配列のうちの１以上の各々別個の質量のバージョンに対する１以上のＭＳパラメータを報告することを含む。いくつかの実施形態では、性能は、性能スコアを生成するソフトウェアによって評価される。

６の別個の配列のペプチドを含む試薬のクロマトグラムの図示（上部パネル）、及び５の別個の質量のバージョンで構成されているそれらの別個の配列のペプチドのうちの１の質量スペクトル（下部パネル）を示す。別個の配列のペプチドは、例えば、アセトニトリル／０．１％（ギ酸又はトリフルオロ酢酸のような）有機酸グラジエントを使用して、Ｃ₁₈逆相カラム上で分析される場合、標準クロマトグラフィーグラジエントにわたって（比較的）均等に離間されるように設計される。クロマトグラフィーの観点から、生成物は、６のペプチドのみを含有するように見えるだろう。しかしながら、質量スペクトルは、ペプチド配列に対応する各ピークが、配列においては同一であるが、少なくとも４ダルトンの質量間隔によって明確に識別される５の異性体ペプチドに対応することを明らかにする。 ペプチド配列の５の別個の質量のバージョン及びそれらのそれぞれの質量の表を示す（右）。これらのペプチドの例示的な質量スペクトルが提供される（左）。いくつかの実施形態では、７〜１０ダルトンの質量間隔が提供され、高分解能及び低分解能ＭＳ機器の両方において、間隔分解能を可能にする。この質量区別（すなわち、別個の質量異型）を実現するために、安定重同位体が豊富なアミノ酸が組み込まれる。 ペプチド配列の別個の質量のバージョンが異なる濃度で提供される、本発明の一実施形態の図示を示す。それらの量が正確に知られているため、個別の（別個の質量）ペプチドは、カラム上の相対強度対モル量のプロットが補正強度のログ（倍数差）としてプロットされる場合、線形であるような割合で混合され得る。提供される例において、最も軽いペプチド（すなわち、重標識されたアミノ酸を１しか有しないペプチド）が、最も豊富である。それぞれの順次重くなるペプチドは、濃度が１０倍だけ低くなり、ゆえに、所望の線形関係が得られる。 ６つの別個の配列のペプチドのそれぞれの５個の別個の質量のバージョンを含む、本発明の一実施形態の図示を示す。上部パネルは、別個の配列のそれぞれに対して別個のピークが確認できる試薬のクロマトグラムを示す。下部パネルは、各々別個の質量のバージョンが別々に識別可能である、各配列の質量スペクトルを示す。ゆえに、この実施形態において、全混合物は、３０のペプチド混合物である。 ペプチドのＬＣカラムへの結合に対する負荷時間の影響を示すグラフを示す。 各異性体ペプチドが、質量にかかわらず、カラムから共溶出することを実証する、ペプチドの５同位体種混合のＬＣ分析を示す。 異なるクロマトグラフィーグラジエント（緩衝液Ａ＝水中０．１％のギ酸、及び緩衝液Ｂ＝アセトニトリル中０．１％のギ酸）を使用するペプチド混合のＬＣ分析を示す。グラジエントにかかわらず、分離及びピーク形状が、すべての事例において保持される。 ペプチド定量に使用される補正係数を計算するために使用されたグラフを示す。補正係数は、すべてのピーク強度を正規化し、天然に生じる重同位体の分布を補正するために必要とされる。補正係数は、単一同位体ｍ／ｚ強度対総同位体分布強度の割合を表し、すべての同位体を完全に検出できない際に、イオンの補正強度を導出するために使用される。 単一のペプチド配列の５の別個の質量のバージョンの代表的な質量スペクトルを示す。これらの質量（二重荷電ペプチドである）は、ユニット分解機器で容易に分解される。これは、この例において、高分解能であるにもかかわらず、特に明瞭である。 ６の別個の配列のペプチドのそれぞれの５の別個の質量のバージョンを含むペプチド試薬のＭＳ分析の結果を示す。 単一のペプチド配列の５の別個の質量のバージョンを含む試薬の質量スペクトルの線形分析を示す。 ６の別個の配列のペプチドのそれぞれの５の別個の質量のバージョンを含む試薬の質量スペクトルの線形分析を示す。 ６の別個の配列のペプチドのそれぞれの５の別個の質量のバージョンを含む試薬の質量スペクトルの線形分析を示す（図１２の反転濃度）。 単一のペプチド配列の５の別個の質量のバージョンのＭＳ分析を示し、各々順次により重くなっていくバージョンが、直ぐ隣のより軽いバージョンを１０倍濃度超過して存在する。 ６の別個の配列のペプチドのそれぞれの５の別個の質量のバージョンを含む試薬のＭＳ分析を示し、各ペプチドの各々順次により重くなっていくバージョンが、直ぐ隣のより軽いバージョンを１０倍濃度超過して存在する。 ６の別個の配列のペプチドのそれぞれの５の別個の質量のバージョンを含む試薬のＭＳ分析を示し、各ペプチドの各々順次により軽くなっていくバージョンが、直ぐ隣のより軽いバージョンを１０倍濃度超過して存在する。 酵母トリプシン消化の複合のバックグラウンドにスパイクした場合の、すべてのペプチドのクロマトグラフィー検出を示す。 酵母トリプシン消化バックグラウンド（開始濃度、２ｆｍｏｌ）中の、６の別個の配列のペプチドのそれぞれの５の別個の質量のバージョンを含む試薬の最低検出可能ペプチド量（ＬＤＰＱ）分析を示す。この混合物において、ペプチドのすべてが、より高度な複合混合物中に存在するにもかかわらず、２００ａｍｏｌに至るまで検出可能であることに留意する。 酵母バックグラウンド（２００ｆｍｏｌの開始濃度）中の、６の別個の配列のペプチドのそれぞれの５個の別個の質量のバージョンを含む試薬の定量限界（ＬＯＱ）分析を示す。 第２希釈に続く酵母バックグラウンド（２０ｆｍｏｌの開始濃度）中の、６の別個の配列のペプチドのそれぞれの５の別個の質量のバージョンを含む試薬の定量限界（ＬＯＱ）分析を示す。 第２希釈に続く酵母バックグラウンド（２ｆｍｏｌの開始濃度）中の、６の別個の配列のペプチドのそれぞれの５の別個の質量のバージョンを含む試薬の定量限界（ＬＯＱ）分析を示す。

定義
本明細書で使用される場合、別途指示がない限り、「ペプチド」という用語は、ペプチドアミド結合（−−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−−）によって主鎖を通して連結された２以上のアミノ酸のポリマー化合物を指す。「ポリペプチド」という用語と併せて、又はそれと比較して使用される場合、「ペプチド」という用語は、典型的には、短いアミノ酸ポリマー（例えば、２５個未満のアミノ酸を有する鎖）を指すのに対し、「ポリペプチド」という用語は、より長いアミノ酸ポリマー（例えば、２５個を超えるアミノ酸を有する鎖）を指す。

本明細書で使用される場合、「別個の配列のペプチド」という用語は、同一性及び／又はそれらのアミノ酸の順によって互いに区別することができるペプチドの一群（例えば、２以上）を指す。例えば、「３の別個の配列のペプチド」は、他の特性を共有する場合があるが、それぞれが、互いに少なくとも１個のアミノ酸の違い、及び場合によっては、多くのアミノ酸の違い（例えば、ＬＬＳＬＧＡＬＥＦＫ、ＬＳＳＬＧＡＬＥＦＫ、及びＡＡＰＧＥＤＳＲＫＹ）を含む、３のアミノ酸鎖である。

本明細書で使用される場合、「別個の質量ペプチド」という用語は、配列によって区別することができない場合であっても、質量によって互いに区別することができるペプチドの一群（例えば、２以上）を指す。「ペプチドの別個の質量のバージョン」とは、アミノ酸配列によって区別することができない（例えば、ペプチドが同じアミノ酸配列を有する）場合であっても、質量によって互いに区別することができるペプチドの一群を指す。例えば、「ペプチドの３の別個の質量のバージョン」は、同じアミノ酸配列を有するが、異なる質量を有するようにタグ付けされるか、又は標識される（例えば、安定した重同位体で標識される）３つのアミノ酸鎖である（例えば、ＬＬＳＬＧＡＬＥＦＫ、Ｌ＊ＬＳＬＧＡＬＥＦＫ、及びＬ＊Ｌ＊ＳＬＧＡＬＥＦＫ、＊は先行するアミノ酸の均一の同位体標識を示す）。

本明細書で使用される場合、「異性体ペプチド」という用語は、同じアミノ酸配列を有するペプチドの一群（例えば、２以上）を指す。ペプチドは、タグ又は化学修飾の点においては異ならないが、典型的には、様々な度合いの安定した重同位体標識（例えば、¹³Ｃ、¹⁵Ｎ、¹⁸Ｏ、²Ｈ等）を含有する。一対の異性体ペプチドは、それらが含有する均一に¹³Ｃ／¹⁵Ｎで標識されたアミノ酸の数において異なる。例えば、Ｌ＊ＬＳＬＧＡＬＥＦＫ及びＬ＊Ｌ＊ＳＬＧＡ＊ＬＥＦＫ（＊は、先行するアミノ酸の均一な¹³Ｃ／¹⁵Ｎ標識を示す）は、異性体ペプチドである（それらは、また、配列ＬＬＳＬＧＡＬＥＦＫの「別個の質量ペプチド」及び「ペプチドの別個の質量のバージョンでもある）。

本明細書で使用される場合、「重い」という用語は、天然存在度において最も一般的である同位体（例えば、¹²Ｃの代わりに¹³Ｃ、¹Ｈの代わりに²Ｈ、¹⁴Ｎの代わりに¹⁵Ｎ、¹⁶Ｏの代わりに¹⁸Ｏ等）よりも高い分子質量を有する、元素の同位体、又はそのような同位体のうちの１以上を含むあらゆる化学物質（例えば、ペプチド、分子等）を指す。

本明細書で使用される場合、「均一に重標識される」という用語は、分子物質内の１以上の元素の実質的にすべてが、天然存在度において最も一般的な同位体の代わりに重同位体として存在する分子物質（例えば、ペプチド、アミノ酸等）を指す。例えば、均一に¹³Ｃ／¹⁵Ｎで標識されたアミノ酸は、実質的にすべての炭素及び窒素（例えば、９５％超、９８％超、９９％超、９９．９％超）が、¹²Ｃの代わりに¹³Ｃ及び¹⁴Ｎの代わりに¹⁵Ｎとして存在するものである。いくつかの実施形態では、「重標識されたペプチド」は、１以上の均一に重標識されたアミノ酸を含み得る。

本発明は、器具類の品質管理のための試薬及びそれを使用する方法を提供する。具体的には、質量分析（ＭＳ）及び／又は液体クロマトグラフィー（ＬＣ）の機能性を有する機器の性能を評定するための、ペプチド又は他の分子のセットが提供される。

特定の実施形態では、分析機器（例えば、ＨＰＬＣ（ＵＶ又は他の検出モードを有する）、ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ等）の較正、性能評定、性能監視、システム適合性、品質管理（ＱＣ）等のための試薬が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ＱＣ試薬は、ＬＣ、ＭＳ、又は両方によって予想通りに分離及び／又は分析され得る１セットのペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される試薬のペプチドは、それらを使用してＬＣ機器の全分離範囲を探索できるように、広い範囲の疎水性度又は他の化学特性を呈する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるペプチド試薬は、それらを使用してＭＳ機器の質量／電荷（ｍ／ｚ）比の範囲を探索できるように、広い範囲の質量を呈する。いくつかの実施形態では、（例えば、手動で、又はソフトウェアによって自動的に）本発明の試薬の分析を確認することによって、分析機器の性能が評定される。（例えば、同じペプチド試薬に関する）現在及び過去の性能評定を比較することによって、機器性能の変化を、数日間から数カ月間の範囲の期間にわたって同定、監視、及び／又は記録することができる。

ある特定の実施形態では、本発明は、２以上の別個の配列のペプチド（例えば、２の配列、３の配列、４の配列、５の配列、６の配列、７の配列、８の配列、８の配列、１０の配列…１５の配列…２０の配列…２５の配列…３０の配列…５０の配列、又はそれ以上）を含む試薬を提供する。ある特定の実施形態では、試薬は、３以上の別個の配列のペプチド、４以上の別個の配列のペプチド、５以上の別個の配列のペプチド、６以上の別個の配列のペプチド、７以上の別個の配列のペプチド、８以上の別個の配列のペプチド、９以上の別個の配列のペプチド、１０以上の別個の配列のペプチド、１２以上の別個の配列のペプチド、１５以上の別個の配列のペプチド、２０以上の別個の配列のペプチド等を含む。

いくつかの実施形態では、別個の配列のペプチドの一群の各ペプチド配列は、検出可能に異なる疎水性度のペプチドである。ある特定の実施形態では、別個の配列のペプチドの一群の各ペプチド配列は、固有の疎水性度を有する（例えば、各ペプチドは、ＬＣによってその他のすべてから分離可能である）。他の実施形態では、別個の配列のペプチドの一群の１以上のペプチド配列は、固有の疎水性度を有する（例えば、１以上であるがすべてではないペプチドが、ＬＣによってその他のすべてから分離可能である）。いくつかの実施形態では、疎水性度の違いは、液体クロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））によって検出することができる。ある特定の実施形態では、各々別個の配列のペプチドは、他の別個の配列のペプチドのピークから識別可能なクロマトグラフィーピークを生じる。いくつかの実施形態では、別個の配列のペプチドは、それらが、ＬＣカラムを通した単一の実行処理において識別（例えば、分離）することができるような疎水性度範囲に及ぶ。

いくつかの実施形態では、ペプチドの別個の質量のバージョンが提供される。いくつかの実施形態では、２以上の別個の質量であり、同じ配列のペプチドが提供される。特定の実施形態では、同じペプチド配列の別個の質量のバージョンは、異なる同位体標識を含む。例えば、同じペプチド配列の別個の質量のバージョンは、異なる度合いの重同位体標識を含み得る。ある特定の実施形態では、ペプチド中のすべて又は一部のアミノ酸は、天然存在度レベルを超える量の重同位体（例えば、²Ｈ、¹³Ｃ、¹⁵Ｎ、¹⁸Ｏ等）を含む。いくつかの実施形態では、同じ配列のペプチドは、すべて又は一部のそれらのアミノ酸の重同位体標識の度合いに基づいて異なる質量を有する（例えば、天然存在度でペプチド中のすべてのアミノ酸、ペプチド中のすべてのアミノ酸の２５％が¹³Ｃ／¹⁵Ｎで標識される、ペプチド中のすべてのアミノ酸の５０％が¹³Ｃ／¹⁵Ｎで標識される、ペプチド中のすべてのアミノ酸の７５％が¹³Ｃ／¹⁵Ｎ−標識される、ペプチド中のすべてのアミノ酸の９９％超が¹³Ｃ／¹⁵Ｎで標識される等）。他の実施形態では、同じ配列のペプチドは、それぞれのペプチド中の完全に（例えば、均一に¹³Ｃ／¹⁵Ｎで標識された）重同位体標識されたアミノ酸の数（例えば、０個のアミノ酸が均一に標識される、１個のアミノ酸が均一に標識される、２個のアミノ酸が均一に標識される、３個のアミノ酸が均一に標識される、４個のアミノ酸が均一に標識される、５個のアミノ酸が均一に標識される、６個のアミノ酸が均一に標識される、又はそれ以上）に基づいて、異なる質量を有する。いくつかの実施形態では、同じ配列のペプチドの質量の違いは、同位体的に標識されたアミノ酸の数及びそれらが標識される度合い（３個のアミノ酸が５０％¹³Ｃ／¹⁵Ｎで標識される、すべてのアミノ酸が９９％非交換可能²Ｈで標識されている、６個のアミノ酸が７５％¹⁸Ｏで標識される等）の組み合わせによって生じる。また、質量−タグ及び他の標識もしくは修飾が、アミノ酸配列を変更することなくペプチドの質量を変えるために用いられてもよい。

いくつかの実施形態では、単一のペプチド配列の２以上の別個の質量のバージョンが提供される。いくつかの実施形態では、複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上）の別個の配列のペプチドのそれぞれの２以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上）別個の質量のバージョンが、提供される。

種々の実施形態では、ペプチド（例えば、別個の配列のペプチド）の別個の質量のバージョンは、液体クロマトグラフィーによって識別することができない（例えば、ペプチドの別個の質量のバージョンのすべてが、単一のピークでクロマトグラフィーカラム（例えば、ＨＰＬＣカラム）から溶出する）。種々の実施形態では、ペプチド配列の別個の質量のバージョンのすべては、実質的に同一の疎水性度を呈する。いくつかの実施形態では、異性体ペプチドは、同一又は実質的に同一の疎水性度を有し、単一のピークにおいてクロマトグラフィーカラム（例えば、ＨＰＬＣカラム）から溶出する。

いくつかの実施形態では、１セット（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上）の別個の質量異性体ペプチドが、提供される。いくつかの実施形態では、各異性体は、同じ又は実質的に同じ疎水性度を有し、液体クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）から共溶出する。いくつかの実施形態では、各異性体は、安定同位体標識の別個のパターン（例えば、異なる数）（例えば、均一な¹³Ｃ／¹⁵Ｎで標識されたアミノ酸の異なる組み合わせ）を含有し、そのため、質量分析によって識別することができる。いくつかの実施形態では、１セット中の別個の質量異性体は、任意の好適な濃度（例えば、１０ｐＭ…１００ｐＭ…１ｎＭ…１０ｎＭ…１００ｎＭ…１μＭ…１０μＭ…１００μＭ）で提供される。別個の質量異性体は固有の濃度のものであってもよく、又は同じセットの１以上の他の別個の質量ペプチドと同じ濃度であってもよい。ある特定の実施形態では、１セット中の各々別個の質量異性体は、同じ濃度（例えば、１０ｐＭ…１００ｐＭ…１ｎＭ…１０ｎＭ…１００ｎＭ…１μＭ…１０μＭ…１００μＭ）で提供される。他の実施形態では、１セット中の各々別個の質量異性体は、異なる濃度で提供される（例えば、それぞれ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、及び１０μＭで提供される１セットの５の別個の質量の異性体）。

いくつかの実施形態では、本発明は、２以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上）別個の質量異性体ペプチドの２以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上）別個の配列のセットを提供する。表１は、４個の別個の質量のバージョンそれぞれ（０、１、２、又は３個の標識されたアミノ酸）の６個の別個の配列のセット（配列Ａ〜Ｆ）を含む一般的なペプチドを示す。

表１は１配列当たり０〜３個の標識されたアミノ酸を示すが、より大きい数の標識されたアミノ酸を有するセットも企図される（例えば、０〜５、０〜１０等）。いくつかの実施形態では、試薬の別個の配列のペプチドは、それぞれ、同じ数の別個の質量のバージョンで存在し得る（表１に示される）。他の実施形態では、試薬の２以上の別個の配列のペプチドは、異なる数の別個の質量のバージョンを含む。

表２は、６の別個の質量異性体ペプチドそれぞれの６の別個の配列のセット（ＶＴＳＧＳＴＳＳＲ（配列番号１）、ＬＡＳＶＳＶＳＲ（配列番号２）、ＹＶＹＶＡＤＶＡＡＫ（配列番号３）、ＶＶＧＧＬＶＡＬＲ（配列番号４）、ＬＬＳＬＧＡＧＥＦＫ（配列番号５）、ＬＧＦＴＤＬＦＳＫ（配列番号６））を含む、本発明の一実施形態を示す。
＊は、先行するアミノ酸の均一な¹³Ｃ／¹⁵Ｎ標識を示す）

別個の配列のセットは、様々な度合いの疎水性度を呈し、そのため、各セットは、液体クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）によって分析されるとき、独立して溶出する。各々別個の質量異性体の別個の配列のセットは、同じ疎水性度を有し、そのため、液体クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）によって分析されるとき、共溶出する。別個の質量異性体の別個の配列のセットの任意の他の好適な組み合わせは、本発明の範囲内である。いくつかの実施形態では、本発明は、ペプチドの長さ、配列、数、又は標識によって制限されない。

いくつかの実施形態では、別個の配列のペプチドの１セット内のペプチドは、ピーク強度、ピーク幅、ピークのまとまり具合（狭さ）、ＬＣ保持時間（例えば、試薬中の別のペプチドと重複しない）、生成物の不安定性に寄与すると考えられる除外されるアミノ酸の不在（例えば、Ｐ、Ｍ、Ｗ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、及び／又はＮ末端Ｅ）、十分な数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上）の安定同位体標識されたアミノ酸（例えば、市販の安定同位体標識されたアミノ酸）の組み込みの実現可能性、安定性、高度（例えば、９０％超、９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超）の純度の実現の容易さ等が挙げられるが、これらに限定されない基準に基づいて選択される。いくつかの実施形態では、ペプチドは、１以上の均一に同位体的に¹³Ｃ／¹⁵Ｎで標識されたアミノ酸、例えば、表３から選択されるものを含む。

いくつかの実施形態では、分析機器（例えば、ＵＶ及び／又はＭＳ検出を有する液体クロマトグラフ）の検証、較正、性能評価、及び／又は性能監視のための試薬（例えば、ペプチド混合物）ならびにそれを使用する方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、試薬は、機器性能を監視するために使用される性能メーターを提供する。試薬及び方法は、初期の機器性能の評価、機器履歴の監視、機器間のパラメータの比較、機器性能の検証（例えば、使用前又は使用後）等を提供する。

いくつかの実施形態では、試薬は、いくつか（例えば、５）の別個の質量異性体ペプチドそれぞれの複数（例えば、５）の別個の配列のセットを含む。試薬は、液体クロマトグラフィーによって分析され、別個の配列のセットのそれぞれをそれらの異なる疎水性度によって互いに分離する。試薬は、続いて、質量分析によって分析され、各セット内の別個の質量異性体をそれらの質量対電荷比によって特徴付ける。同じ配列異性体間の質量差（例えば、３〜５ダルトン）は、このようなＭＳ特徴評価から明らかである。いくつかの実施形態では、１セット内の異なる異性体は、ある範囲の異なる濃度で提供される。各セット内の異性体間の濃度の違いは、ＭＳ分析及び／又はアミノ酸分析に基づいて明らかである。いくつかの実施形態では、機器のＬＣ及びＭＳ構成要素の両方による単一の試薬の分析は、同時性能分析を提供する。他の実施形態では、試薬は、まずＬＣによって分析され、次いで、ＭＳによって分析される。いくつかの実施形態では、試薬は、ＬＣ及びＭＳによって同時に分析される（例えば、同じ試薬の２の部分が、それぞれ、１の技術による分析に供される）。

いくつかの実施形態では、試薬中のすべてのペプチドは、同じ濃度で提供される。いくつかの実施形態では、ペプチド配列の各々別個の質量のバージョンは、同じ濃度である。いくつかの実施形態では、ペプチド配列の各々別個の質量のバージョンは、異なる濃度である。いくつかの実施形態では、ペプチド配列の別個の質量のバージョンは、ある範囲の濃度で提供される。特定の実施形態では、試薬中の各ペプチド配列の別個の質量のバージョンは、同じ範囲の濃度で提供される。いくつかの実施形態では、各々別個の配列のペプチド（例えば、同じペプチド配列の別個の質量のバージョンの合計）は、同じ濃度で提供される。いくつかの実施形態では、各々別個の配列のペプチド（例えば、同じペプチド配列の別個の質量のバージョンの合計）は、固有の濃度で提供される。いくつかの実施形態では、別個の配列のペプチド（例えば、同じペプチド配列の別個の質量のバージョンの合計）は、範囲の濃度（例えば、ある範囲にわたって線形又は非線形分布）で提供される。

いくつかの実施形態では、試薬は、ＬＣ及び／又はＭＳにおける使用に適した緩衝液、溶媒、塩、及び／又は他の添加剤（例えば、マーカー（例えば、放射標識、蛍光色素、クロモホア、質量タグ等）等）を含む。試薬は、重炭酸アンモニウム、トリエチル重炭酸アンモニウム（ＴＥＡＢ）、ＴＡＰＳ、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＥ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、リン酸緩衝液、クエン酸、ＣＨＥＳ、酢酸、ホウ酸等の任意の好適な緩衝液（例えば、ＬＣ及びＭＳ両方における使用に適している）を含み得る。いくつかの実施形態では、試薬は、試薬内のペプチドの可溶性（例えば、尿素、グアニジンＨＣＬ、洗剤、糖類等）、安定性等を促進するための添加剤を含む。いくつかの実施形態では、試薬は、アセトニトリル、メタノール、エタノール、ヘキサン、クロロホルム等において、より多くの溶媒のうちの１つを含む。

いくつかの実施形態では、方法及び試薬は、任意の好適な分析機器（例えば、ＬＣ、ＨＰＬＣ、ＭＳ（例えば、大気圧イオン源（ＡＰＩ）、エレクトロスプレー又は噴霧支援エレクトロスプレー（ＥＳ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）等）、ＬＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ等）の品質管理における使用を見出す。いくつかの実施形態では、試薬は、特定の型の機器（例えば、ＬＣ、ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ、又はＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いた使用のために、選択、調製、及び／又は構成される。他の実施形態では、試薬は、様々な機器を用いて使用されるように、特に選択、調製、及び／又は構成される。いくつかの実施形態では、試薬は、特定の品質管理評価（例えば、較正、性能評定、システム適合性等）を行うために、選択、調製、及び／又は構成される。

いくつかの実施形態では、試薬の分析（例えば、ＬＣ、ＭＳ等）によって生成されるデータは、ユーザーによって、又は訓練された専門家によって手動で分析される。他の実施形態では、試薬分析の自動特徴評価を行うためのソフトウェア及び／又はソフトウェアのパッケージが提供される。いくつかの実施形態では、ソフトウェアは、ＬＣパラメータ（例えば、ピーク分離、ピーク効率、ピーク高さ、ピーク幅、ピーク形状、保持時間等）及び／又はＭＳパラメータ（例えば、質量精度、質量分解能、感度、ダイナミックレンジ、ならびにサンプリング及び／又は単離効率）を分析し、報告する。いくつかの実施形態では、ソフトウェアは、ＬＣ及び／又はＭＳ分析のピークを試薬中のペプチド及び／又はペプチド異性体と相関させる。いくつかの実施形態では、ソフトウェアは、機器の分析に基づいて機器性能に関する結論を引き出す。いくつかの実施形態では、ソフトウェアは、機器性能における変化を監視するために、異なる時点で行われた（例えば、数分、数時間、数日、数週、数年等で分離された）試薬分析を比較する。いくつかの実施形態では、ソフトウェアは、機器データ表示／出力を較正し、経時的な機器性能における変化を相殺する。いくつかの実施形態では、ソフトウェアは、データ分析において分析される個別のペプチド、ペプチド混合、及び／又は試薬に対する識別子を利用する。そのような実施形態では、ソフトウェアは、データを個別のペプチド、ペプチド混合、及び／又は試薬の既知の物理特性と相関させる。ある特定の実施形態では、ソフトウェア分析は、機器感度及び／又はダイナミックレンジに関する決定を自動的に作製する。いくつかの実施形態では、ソフトウェアは、機器性能履歴を報告するだろう。他の実施形態では、ソフトウェアは、複数の機器間の性能の比較を報告する。いくつかの実施形態では、ソフトウェアは、性能スコアを生成する。

いくつかの実施形態では、ペプチド試薬と、追加の試薬、ソフトウェア、容器（複数可）、説明書、追加のペプチド試薬等のうちの１つ以上と、を含む、キットが提供される。いくつかの実施形態では、ペプチド試薬の好適なアリコートが、管又は他の好適な容器に提供される。いくつかの実施形態では、キットは、複数の品質管理手順を行うのに有用な複数の品質管理試薬を提供する。

実験
実施例１
重標識されたペプチドの調製及び評定
本発明の実施形態の開発の間に、親水性及び疎水性ペプチドの両方に結合及び溶出し、機器の感度及びダイナミックレンジの測定を提供し、本明細書で考察されるさらなる機器パラメータに関する情報を提供する、カラムの能力の良好な指標である重標識されたペプチドを開発し、評定するための実験を行った。

ペプチドの選択及び設計：ペプチドを、アルブミン及びＩｇＧを枯渇させたヒト血漿試料由来のトリプシンペプチドの集合体から導出した。データの分析は、約８３００の固有ペプチドの確認を容易にした。Ｗ、Ｍ、Ｃ、Ｐ、Ｎ、Ｑ、及びＮ末端Ｅ／Ｄを含有するペプチドは、安定性の懸念のため、考察から除外した。ヒスチジンを含有するペプチドは、それらがさらなる電荷をペプチドに追加したため、考察しなかった。さらに、完全なトリプシンペプチドのみを考察した（内部リジン及びアルギニンを有するものは、考察から除外した）。さらに、最大で少なくとも７個の安定同位体的に標識された残基を組み込む能力を有し、異型１当たり少なくとも４ダルトンの質量差が可能であるペプチドのみを、さらなる考察のために選択した。

ペプチドを保持時間に基づいて６個の貯蔵箱にグループ化した。次いで、貯蔵箱１箱当たり約２０のペプチドの１セットをシグナル強度に基づいて選択した。粗形態からこれらのペプチドを合成し、１０の混合物に組み合わせ、ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒで独立して分析した。次いで、保持時間、ピーク形状、シグナル強度、最も豊富な電荷状態、及び高品質ＭＳ²データを生成する能力等の特性を、ペプチドの最終ラウンドの選択に使用した。ペプチドの最後のセットは、２８のペプチド（６個の貯蔵箱に散在する）で構成され、次いで、それを使用して、ペプチドの最終セットに達した。ペプチドの最終セット（その濃度はアミノ酸分析（ＡＡＡ）を使用して事前に決定された）の選択において、ペプチドの最終セットは、０．１ｆｍｏｌ（１ｐｍｏｌｅから開始、５桁）に至るまで検出可能であることが必要とされた。いくつかの実施形態では、最終ペプチド候補は、非常に大きいダイナミックレンジ、検出の高感度限度、及び良好なクロマトグラフィーのピーク形状すべてにわたって、検出可能であることが必要とされた。いくつかの実施形態では、最終ペプチド候補のそれぞれは、ペプチドエンベロープ内のすべての同位体のピーク面積の正確な測定値を測定及び積算できるように、試料内の５のペプチド異性体すべてを明確に分解することができるような互いに少なくとも４ダルトンの質量差を有する異型を提供するであろう安定して重同位体的に標識されたアミノ酸の同位体組み込みを容易にすることができる少なくとも７のアミノ酸を含有することが必要とされた。

実験方法：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅで、適切な場合、安定した重同位体（均一な¹³Ｃ／¹⁵Ｎ標識）を有するペプチドを使用して、ペプチドを合成した。以下のアミノ酸が、種々のペプチド（以下の表４を参照されたい）に必要とされ、丸括弧中の数は、質量シフトをダルトンで示す：（Ｖ、＋６）、（Ｔ、＋５）、（Ｓ、＋４）、（Ｌ、＋７）、（Ａ、＋４）、（Ｋ、＋８）、（Ｒ、＋１０）、（Ｆ、＋１０）。精製後、ペプチドをアミノ酸分析に供し、高精度のモル量を決定することができた。３０個のペプチドの混合物を２の形式で調製した（表５を参照されたい）。両方の形式は、６のペプチドの同じセットを含有し、各ペプチドは、５の異性異型の１セット（合計３０のペプチド）を有した。異性体は、配列が同一であったが、異なる質量によって識別することができるように異なる重標識されたアミノ酸を含有した。これらの質量を使用して、機器感度及びダイナミックレンジを決定するために標準曲線を生成した。異型及び混合物の具体的な詳細は、以下の表５に示される。形式番号１は、同一配列（しかし、異性体及び質量に関して変動する）の各セットが、ペプチド量の１０倍の差で異なり得る（量の増加又は減少のいずれか）ペプチドで構成された。形式２は、ある質量から次の質量への減少が、３倍減少であることを除いて、形式１と同様であった。図１６は、ピーク強度の補正後、６個の標準曲線がどのようであるかの一例を提供する。さらに、すべてのペプチドは、ヒト血漿等からの試料を分析する際の等圧阻害を防ぐために、少なくとも１の標識されたアミノ酸を含有した。

ペプチド（合計３０）を溶液中に混合し、２００ｆｍｏｌのこの溶液をＣ₁₈細管ＬＣカラム（７５μｍｘ１５ｃｍ）に装填した。ＬＣグラジエントを、典型的には１時間で、２．５％緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ−水中０．１％のギ酸、及び緩衝液Ｂ−アセトニトリル／０．１％のＦＡ）から４０％Ｂまで勾配させた。ＬＣの直後に、質量スペクトルをリアルタイムで収集した。６０，０００のＭＳ分解能で動作し、３ｐｐｍ以下の較正された質量精度を有するＴｈｅｒｍｏ ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ又はＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量スペクトル計のいずれかですべての質量スペクトルを収集した。多価（＋２／＋３）ペプチドがＭＳ／ＭＳ走査を誘起し得るように、試料を３５０〜１２００ｍ／ｚの質量範囲で得た。

表４のペプチドを、ＬＣ及びＭＳによって、ともに表５に記載される形式で、及び他の組み合わせ（例えば、同位体種混合（例えば、最も軽いバージョンの各ペプチド配列、２番目に軽い各ペプチド配列…最も重いバージョンの各ペプチド配列））で分析し、例えば、ペプチド特性及び分析手順を評価した。

ペプチドのＬＣカラムへの結合に対する負荷時間の影響を検査した（図５を参照されたい）。より短い負荷時間（例えば、２．５分）が、ペプチドのすべて、特に、最も親水性の配列（ＶＴＳＧＳＴＳＴＳＲ）の結合に対して優先的であったことが決定された。

図６は、表４のペプチドの同位体種混合（例えば、最も軽いバージョンの各ペプチド配列、２番目に軽い各ペプチド配列…最も重いバージョンの各ペプチド配列）のＬＣ分析を示す。混合番号１は、各セットからの「最も軽い」ペプチドのみで構成され、各混合は、次第に重くなる異型を用いて調製した。このため、混合番号５は、各ペプチドからの「最も重い」形態を含有した。データは、ペプチドが異なる種類の安定した重標識されたアミノ酸を含有するが、それらが化学的に同一であることを示す（図６を参照されたい）。

６のペプチド配列（すべて等モル）の混合をクロマトグラフィーグラジエントに供した（緩衝液Ａ＝水中０．１％のギ酸、及び緩衝液Ｂ＝アセトニトリル中０．１％のギ酸（６０分グラジエント：２５％Ｂ／６０分、９０分グラジエント：２５％Ｂ／９０分、１２０分：２５％Ｂ／１２０分）。グラジエントにかかわらず、６のペプチド配列すべてに対して十分な分離及び鋭いピーク形状が観察された（図７を参照されたい）。

試料混合物中の所与のペプチドの量を定量するために（例えば、信頼できる線形相関を実現するために）、同位体の広がり（エンベロープ）が同位体組み込みの水準に応じて異なるため、ペプチド異型のそれぞれに対する補正係数を計算した（図８を参照されたい）。補正強度を計算するため、確認できる同位体の強度を合計し、次いでそれぞれの強度の合計を最も高いピークの強度で割る。次いでこの値を各ペプチド異型の補正係数とし、こうして、ピーク強度の正規化が可能となる（図８を参照されたい）。

種々のペプチド配列の質量スペクトルを得た（例えば、図９を参照されたい）。この実施例では、ペプチド配列の各々異なる質量のバージョンを同等の濃度で供給した。結果として、少なくとも７ダルトンの質量分離を有するおよそ同等の強度が観察された（二重荷電ペプチドを観察しており、このため、それぞれ、３．５ダルトンのｍ／ｚ間隔を有する事に留意する）。次に、表４の全３０のペプチドを、ＭＳによって、等モル混合物において分析した。ペプチドのそれぞれのモル量（２００ｆｍｏｌｅ）を、補正シグナル強度のログに対してプロットした（図１０）。均等に混合した場合、ペプチドは、予想通り、同等の強度をもたらす。

等モル試料の分析に加えて、各ペプチド配列の異なる質量のバージョンが順次３倍の濃度差で存在する、表５の形式２をＭＳによって分析した（例えば、図１１を参照されたい）。そのような分析は、質量増加の関数として、３を底とする対数での強度の３倍低下を伴って調製された５個の質量異型間の線形関係を実証する。試験されたすべての配列に対して、類似の線形関係が観察された。（例えば、図１２及び１３を参照されたい）。最も豊富なペプチドが、所与の配列の最も重いペプチド（図１３）又は最も軽いペプチド（図１２）であるかにかかわらず、同じ関係が観察された。順次１０倍の濃度差で存在する各ペプチド配列の異なる質量のバージョンを含有する表５の形式１の混合物のＭＳ分析時に、比例関係が観察された（図１４〜１６を参照されたい）。

ペプチドが１μｇ／μＬ酵母トリプシン消化の複合のバックグラウンドにスパイクされた場合、形式２混合物中のすべてのペプチドの検出が可能であった（図１８を参照されたい）。酵母バックグラウンド中のペプチドセットの定量分析の上限は、検出が２００ａｍｏｌを下回るまでに及ぶことは不可能であろうことを明らかにしたが（図１９を参照されたい）、スパイクした試料の希釈がそのような検出を容易にするであろうことを示した。開始濃度が２００ｆｍｏｌである場合、検出限界は、２．４ｆｍｏｌに至る（図１９を参照されたい）。開始濃度が２０ｆｍｏｌである場合、検出限界は、２５０ａｍｏｌに至る（図２０を参照されたい）。開始濃度が２ｆｍｏｌである場合、検出限界は、２０ａｍｏｌに至る（図２１を参照されたい）。このようにして、絶対的な機器感度（及び場合によっては、ＬＯＤ及びＬＯＱ）を決定するための方法が確立された。

Claims (39)

1. ２以上の別個の配列のペプチドのそれぞれの２以上の別個の質量のバージョンを含む、ペプチド混合物。
2. 前記別個の配列のペプチドのそれぞれが、別個の疎水性度のペプチドである、請求項１に記載のペプチド混合物。
3. 前記別個の配列のペプチドのうちのいずれかの前記別個の質量のバージョンのすべてが、別個の濃度で存在する、請求項１に記載のペプチド混合物。
4. 前記別個の配列のペプチドのうちのいずれかの前記別個の質量のバージョンが、少なくとも１０ｎＭの低さから少なくとも１μＭの高さの範囲の濃度で存在する、請求項３に記載のペプチド混合物。
5. 前記別個の配列のペプチドのうちのいずれかの前記別個の質量のバージョンが、１ｎＭ（１マイクロリットル当たりのフェムトモル）〜１０μＭの範囲の濃度で存在する、請求項４に記載のペプチド混合物。
6. 前記別個の配列のペプチドが、それらの異なる疎水性度に基づいて液体クロマトグラフィーによって分離可能である、請求項１に記載のペプチド混合物。
7. 前記別個の配列のペプチドが、それらの異なる電荷、大きさ、又は親水性度に基づいて液体クロマトグラフィーによって分離可能である、請求項１に記載のペプチド混合物。
8. ３〜２０の別個の配列のペプチドを含む、請求項１に記載のペプチド混合物。
9. ５〜１０の別個の配列のペプチドを含む、請求項８に記載のペプチド混合物。
10. 前記別個の配列のペプチドのうちのいずれかの前記別個の質量のバージョンが、質量分析によって区別可能である、請求項１に記載のペプチド混合物。
11. 前記別個の配列のペプチドのうちのいずれかの前記別個の質量のバージョンが、安定重同位体標識されたアミノ酸の異なる組み合わせの結果である、請求項１に記載のペプチド混合物。
12. 前記別個の配列のペプチドのうちのいずれかの前記別個の質量のバージョンのそれぞれが、異なる数の均一に安定同位体標識されたアミノ酸を含む、請求項１１に記載のペプチド混合物。
13. 前記別個の配列のペプチドのそれぞれの３〜２０の別個の質量のバージョンを含む、請求項１に記載のペプチド混合物。
14. 前記別個の配列のペプチドのそれぞれの５〜１０の別個の質量のバージョンを含む、請求項１３に記載のペプチド混合物。
15. 液体クロマトグラフィー（ＬＣ）及び質量分析（ＭＳ）の両方の機能性を有する機器の性能を評価するための方法であって、
    （ａ）ペプチド混合物を前記機器に導入することであって、前記ペプチド混合物が、２以上の別個の配列のペプチドのそれぞれの２以上の別個の質量のバージョンを含むことと、
    （ｂ）ＬＣによって前記ペプチド混合物を分離又は分析することと、
    （ｃ）ＭＳによって前記ペプチド混合物を分析することと、及び
    （ｄ）ステップ（ｂ）及び（ｃ）の結果に基づいて、前記機器の前記ＬＣ及びＭＳの機能性の前記性能を評価することと、を含む、前記方法。
16. 前記ペプチド混合物が、精製されたペプチドである、請求項１５に記載の方法。
17. 前記ペプチド混合物が、１以上の不純物の存在下でペプチドを含む、請求項１５に記載の方法。
18. 前記ペプチド混合物は、２以上の別個の配列のペプチドのそれぞれの２以上の別個の質量のバージョンを含む、ペプチド混合物である、請求項１５に記載の方法。
19. 別個の配列のペプチドの各々別個の質量のバージョンが、異なる濃度で存在する、請求項１８に記載の方法。
20. 前記機器の前記ＬＣ及びＭＳの機能性の前記性能を評価することが、保持時間、ピーク高さ、ピーク幅、ピーク分解能、及びピーク対称性から選択される、各ペプチド配列に対する１以上のＬＣパラメータを報告することを含む、請求項１５に記載の方法。
21. 前記機器の前記ＬＣ及びＭＳの機能性の前記性能を評価することが、単一の分析実験における、分解能、質量精度、「ニート」試料の感度、複合試料の感度、ダイナミックレンジ、質量分解能、単離効率、ＭＳ／ＭＳスペクトル品質、及び線形応答から選択される、前記ペプチド配列のうちの１以上の各々別個の質量のバージョンに対する１以上のＭＳパラメータを報告することを含む、請求項１５に記載の方法。
22. 請求項１５に記載の方法、ＬＣ及びＭＳの機能性の前記感度。
23. 前記ＬＣ及びＭＳの機能性の前記性能の前記評価が、ソフトウェアによって行われる、請求項１５に記載の方法。
24. 前記ソフトウェアが、性能スコアを生成する、請求項２３に記載の方法。
25. 液体クロマトグラフィー（ＬＣ）及び質量分析（ＭＳ）の両方の機能性を有する機器の性能を評価するための方法であって、
    （ａ）ペプチド混合物を前記機器に導入することであって、前記ペプチド混合物が、２以上の別個の配列のペプチドのそれぞれの２以上の別個の質量のバージョンを含むことと、
    （ｂ）ＬＣによって前記ペプチド混合物を分析することと、
    （ｃ）ＭＳによって前記ペプチド混合物を分析することと、及び
    （ｄ）ステップ（ｂ）及び（ｃ）の結果に基づいて、前記機器の前記ＬＣ及びＭＳの機能性の前記性能を評価することと、を含む、前記方法。
26. 前記別個の配列のペプチドが、別個の疎水性度であり、ＬＣによって分離可能である、請求項２５に記載の方法。
27. 前記別個の質量のバージョンが、重同位体標識されたアミノ酸の異なる組み合わせを含み、ＭＳによって分離可能である、請求項２６に記載の方法。
28. 別個の配列のペプチドの各々別個の質量のバージョンが、異なる濃度で存在する、請求項２５に記載の方法。
29. 前記ペプチド混合物は、２以上の別個の配列のペプチドのそれぞれの２以上の別個の質量のバージョンを含む、ペプチド混合物である、請求項２５に記載の方法。
30. 前記機器の前記ＬＣ及びＭＳの機能性の前記性能を評価することが、保持時間、ピーク高さ、ピーク幅、ピーク分解能、及びピーク対称性から選択される、各ペプチド配列に対する１以上のＬＣパラメータを報告することを含む、請求項２５に記載の方法。
31. 前記機器の前記ＬＣ及びＭＳの機能性の前記性能を評価することが、単一の分析実験における、分解能、質量精度、「ニート」試料の感度、複合試料の感度、ダイナミックレンジ、質量分解能、単離効率、ＭＳ／ＭＳスペクトル品質、及び線形応答から選択される、前記ペプチド配列のうちの１以上の各々別個の質量のバージョンに対する１以上のＭＳパラメータを報告することを含む、請求項２５に記載の方法。
32. 前記ＬＣ及びＭＳの機能性の前記性能の前記評価が、ソフトウェアによって行われる、請求項２５に記載の方法。
33. 前記ソフトウェアが、性能スコアを生成する、請求項３２に記載の方法。
34. 液体クロマトグラフィー（ＬＣ）及び質量分析（ＭＳ）の両方の機能性を有する機器の性能を評価するための方法であって、
    （ａ）ペプチド混合物を前記機器に導入することであって、前記ペプチド混合物が、２以上の別個の配列のペプチドのそれぞれの２以上の別個の質量のバージョンを含むことと、
    （ｂ）ＬＣによって前記ペプチド混合物を分離又は分析することと、
    （ｃ）ＭＳによって前記ペプチド混合物を分析することと、及び
    （ｄ）ソフトウェアを使用して、ステップ（ｂ）及び（ｃ）の結果に基づいて、前記機器の前記ＬＣ及びＭＳの機能性の前記性能を評価することと、を含む、前記方法。
35. 前記ペプチド混合物は、２以上の別個の配列のペプチドのそれぞれの２以上の別個の質量のバージョンを含む、ペプチド混合物である、請求項３４に記載の方法。
36. 別個の配列のペプチドの各々別個の質量のバージョンが、異なる濃度で存在する、請求項３５に記載の方法。
37. 前記機器の前記ＬＣ及びＭＳの機能性の前記性能を評価することが、保持時間、ピーク高さ、ピーク幅、ピーク分解能、及びピーク対称性から選択される、各ペプチド配列に対する１以上のＬＣパラメータを報告することを含む、請求項３４に記載の方法。
38. 前記機器の前記ＬＣ及びＭＳの機能性の前記性能を評価することが、単一の分析実験における、分解能、質量精度、「ニート」試料の感度、複合試料の感度、ダイナミックレンジ、質量分解能、単離効率、ＭＳ／ＭＳスペクトル品質、及び線形応答から選択される、前記ペプチド配列のうちの１以上の各々別個の質量のバージョンに対する１以上のＭＳパラメータを報告することを含む、請求項３４に記載の方法。
39. 前記ソフトウェアが、性能スコアを生成する、請求項３４に記載の方法。