JPWO2019197671A5

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Publication number: JPWO2019197671A5
Application number: JP2020555207A
Authority: JP
Publication date: 2022-03-10

Description

実施例４－アルファ鎖に融合されたペプチドを含有するＭＣＲの表面発現の検出。
本発明者らは、アルファ鎖にテザーされたランダムペプチドを有するマウスＭＣＲのライブラリーを構築した。ＭＨＣクラスＩＩ欠損細胞株（Ｔ細胞ハイブリドーマ）の形質導入後、抗ＭＨＣ抗体を使用して、ＦＡＣＳによりＭＣＲ表面発現を測定した（図７）。多くの異なるペプチドを有するＭＣＲの効率的な発現が検出されたが、これは、ＭＣＲのアルファ鎖に連結されたペプチドもまた、表面発現に十分なほどにＭＨＣ複合体を安定化し得ることを示している。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）により提示される候補ペプチドを識別するための方法であって、レポーター細胞株において、共有結合的に結合された候補ペプチドを含む組換えＭＨＣ－ペプチド複合体を発現させること、前記ＭＨＣ－ペプチド複合体の表面発現を示すレポーター細胞を検出すること、および前記細胞表面に提示された候補ペプチドの配列を決定することを含む、方法。
(項目２)
（ｉ）組換えＭＨＣベータおよび／またはアルファ鎖の上流にインフレームでクローニングされた候補ペプチドを含むライブラリーを生成すること；
（ｉｉ）このようなライブラリーを、対応するＭＨＣアルファおよび／またはベータ鎖と一緒に適切なレポーター細胞株に形質導入すること；
（ｉｉｉ）前記細胞表面上に１つまたはそれを超えるＭＨＣ－ペプチド複合体を発現する細胞を検出および単離すること；
（ｉｖ）それらの細胞表面上に１つまたはそれを超えるＭＨＣ－ペプチド複合体を提示する細胞からＤＮＡを単離すること；
（ｖ）前記細胞表面上にＭＨＣ－ペプチド複合体を提示する細胞から単離された前記ＤＮＡに組み込まれたベクターによりコードされる候補ペプチドの配列を決定すること
を含む、項目１に記載の方法。
(項目３)
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）により提示される候補ペプチドを識別するための方法であって、レポーター細胞株において、共有結合的に結合された候補ペプチドを含む組換えＭＨＣ－ペプチド複合体を発現させること、前記ＭＨＣ－ペプチド複合体の表面発現を示すレポーター細胞を検出すること、ならびに前記ＭＨＣ－ペプチド複合体の表面発現のレベル、および前記細胞表面に提示された候補ペプチドの配列を決定することを含む、方法。
(項目４)
（ｉ）組換えＭＨＣベータおよび／またはアルファ鎖の上流にインフレームでクローニングされた候補ペプチドを含むライブラリーを生成すること；
（ｉｉ）このようなライブラリーを、対応するＭＨＣアルファおよび／またはベータ鎖と一緒に適切なレポーター細胞株に形質導入すること；
（ｉｉｉ）前記細胞表面上に１つまたはそれを超えるＭＨＣ－ペプチド複合体を発現する細胞を検出および単離すること；
（ｉｖ）前記１つまたはそれを超えるＭＨＣ－ペプチド複合体の細胞表面発現のレベルを決定すること
（ｖ）それらの細胞表面上に１つまたはそれを超えるＭＨＣ－ペプチド複合体を提示する細胞からＤＮＡを単離すること；
（ｖｉ）前記細胞表面上にＭＨＣ－ペプチド複合体を提示する細胞から単離された前記ＤＮＡに組み込まれたベクターによりコードされる候補ペプチドの配列を決定すること
を含む、項目３に記載の方法。
(項目５)
前記ＭＨＣ分子が、細胞外ＭＨＣクラスＩＩアルファ鎖および膜貫通ドメインならびに細胞外ＭＨＣクラスＩＩベータ鎖および膜貫通ドメインを含むＭＨＣクラスＩＩ分子である、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
(項目６)
前記ＭＨＣ分子が、前記細胞外ＭＨＣクラスＩアルファ鎖および膜貫通ドメインならびにベータ－２ミクログロブリンを含むＭＨＣクラスＩ分子である、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
(項目７)
前記ＭＨＣ－ペプチド複合体が、前記候補ペプチド、ベータ－２マクログロブリン、前記細胞外ＭＨＣクラスＩアルファ鎖および膜貫通ドメインを含む融合タンパク質である、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
(項目８)
前記ＭＨＣアルファ鎖がＹ８４Ａ突然変異を有する、項目６または７に記載の方法。
(項目９)
ＭＨＣ分子の各鎖が膜貫通ドメインを含む、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
(項目１０)
前記膜貫通ドメインが前記ＭＨＣ分子のネイティブ膜貫通ドメインである、項目１～９のいずれか一項に記載の方法。
(項目１１)
前記膜貫通ドメインが、ＴＣＲα／β、ＴＣＲγ／δ、ＣＤ３γ／δ／ε／ζ、ＣＤ４またはＣＤ８α／βなどの異種分子の膜貫通ドメインである、項目１～９のいずれか一項に記載の方法。
(項目１２)
前記レポーター細胞株が哺乳動物細胞株である、項目１～１１のいずれか一項に記載の方法。
(項目１３)
前記レポーター細胞株が、前記ＭＨＣクラスＩＩペプチドローディング機構を欠く細胞株である、項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。
(項目１４)
前記レポーター細胞株がＴ細胞ハイブリドーマである、項目１３に記載の方法。
(項目１５)
前記レポーター細胞株が、機能的ＴＡＰ１、ＴＡＰ２および／またはベータ－２－ミクログロブリン遺伝子を欠く細胞株である、項目１～１４のいずれか一項に記載の方法。
(項目１６)
前記レポーター細胞株が、欠陥または欠失ＴＡＰ１、ＴＡＰ２および／またはベータ－２－ミクログロブリン遺伝子を有するＴ細胞ハイブリドーマである、項目１５に記載の方法。
(項目１７)
前記候補ペプチドが、個々の腫瘍由来突然変異を有する腫瘍特異的ペプチドである、前述の項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目１８)
前記突然変異がＳＮＶである、項目１７に記載の方法。
(項目１９)
前記候補ペプチドが、免疫反応を引き起こす抗原である、項目１～１６に記載の方法。
(項目２０)
前記候補ペプチドが、免疫原性試験を受けている化合物である、項目１～１６に記載の方法。
(項目２１)
それらの表面上にＭＨＣを効率的に発現するレポーター細胞を、ＦＡＣＳベースまたはＭＡＣＳベースの細胞選別により濃縮する、前述の項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目２２)
前記細胞表面に提示された前記候補ペプチドの配列を、ＰＣＲおよびシークエンシングにより決定する、前述の項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目２３)
前記候補ペプチドが、ワクチンとして使用するためのものである、項目１～２２のいずれか一項に記載の方法。
(項目２４)
前記ワクチンが腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）ベースの癌ワクチンである、項目２３に記載の方法。
(項目２５)
前記候補ペプチドが、それが含む前記エピトープの少なくとも１つに対する免疫寛容を誘導するために使用するためのものである、項目１～２２のいずれか一項に記載の方法。
(項目２６)
前記候補ペプチドが、ＭＨＣ分子との関連でＴＣＲを遮断するために使用するためのものである、項目１～２２または２５のいずれか一項に記載の方法。
(項目２７)
前記候補ペプチドが、細胞への、特にＴ細胞へのＭＨＣ媒介性毒素送達に使用するためのものである、項目１～２２または２５のいずれか一項に記載の方法。
(項目２８)
前記候補ペプチドが、ＭＨＣ－ＣＡＲを用いてＴ細胞を再指向させるために使用するためのものである、項目１～２２または２５のいずれか一項に記載の方法。
(項目２９)
前記候補ペプチドが、免疫原性試験に使用するためのものである、項目１～２２のいずれか一項に記載の方法。
(項目３０)
前記候補ペプチドが、Ｔ細胞反応性試験に使用するためのものである、項目１～２２または２９のいずれか一項に記載の方法。
(項目３１)
候補ペプチドのＭＨＣ結合親和性を決定するための方法であって、レポーター細胞株において、共有結合的に結合された候補ペプチドを含む組換えＭＨＣ－ペプチド複合体を発現させること、前記レポーター細胞の表面上に前記ＭＨＣ－ペプチド複合体を提示するレポーター細胞を検出すること、およびこのような提示／発現のレベルを決定することを含む、方法。
(項目３２)
（ｉ）少なくとも１つの膜貫通領域に接続された組換えＭＨＣアルファまたはベータドメインの上流にクローニングされた候補ペプチドを含むライブラリーを生成すること；
（ｉｉ）このようなライブラリーを、対応するＭＨＣアルファまたはベータドメインと一緒に適切なレポーター細胞株に形質導入すること；
（ｉｉｉ）それらの細胞表面上に１つまたはそれを超えるＭＨＣ－ペプチド複合体を提示する細胞を検出すること、
（ｉｖ）このような提示／発現のレベルを決定すること
を含む、項目３１に記載の方法。

Claims

主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）により提示される候補ペプチドを識別するための方法であって、レポーター細胞株において、共有結合的に結合された候補ペプチドを含む組換えＭＨＣ－ペプチド複合体を発現させること、前記ＭＨＣ－ペプチド複合体の表面発現を示すレポーター細胞を検出すること、および前記細胞表面に提示された候補ペプチドの配列を決定することを含む、方法。
（ｉ）組換えＭＨＣベータおよび／またはアルファ鎖の上流にインフレームでクローニングされた候補ペプチドを含むライブラリーを生成すること；
（ｉｉ）このようなライブラリーを、対応するＭＨＣアルファおよび／またはベータ鎖と一緒に適切なレポーター細胞株に形質導入すること；
（ｉｉｉ）前記細胞表面上に１つまたはそれを超えるＭＨＣ－ペプチド複合体を発現する細胞を検出および単離すること；
（ｉｖ）それらの細胞表面上に１つまたはそれを超えるＭＨＣ－ペプチド複合体を提示する細胞からＤＮＡを単離すること；
（ｖ）前記細胞表面上にＭＨＣ－ペプチド複合体を提示する細胞から単離された前記ＤＮＡに組み込まれたベクターによりコードされる候補ペプチドの配列を決定すること
を含む、請求項１に記載の方法。
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）により提示される候補ペプチドを識別するための方法であって、レポーター細胞株において、共有結合的に結合された候補ペプチドを含む組換えＭＨＣ－ペプチド複合体を発現させること、前記ＭＨＣ－ペプチド複合体の表面発現を示すレポーター細胞を検出すること、ならびに前記ＭＨＣ－ペプチド複合体の表面発現のレベル、および前記細胞表面に提示された候補ペプチドの配列を決定することを含む、方法。
（ｉ）組換えＭＨＣベータおよび／またはアルファ鎖の上流にインフレームでクローニングされた候補ペプチドを含むライブラリーを生成すること；
（ｉｉ）このようなライブラリーを、対応するＭＨＣアルファおよび／またはベータ鎖と一緒に適切なレポーター細胞株に形質導入すること；
（ｉｉｉ）前記細胞表面上に１つまたはそれを超えるＭＨＣ－ペプチド複合体を発現する細胞を検出および単離すること；
（ｉｖ）前記１つまたはそれを超えるＭＨＣ－ペプチド複合体の細胞表面発現のレベルを決定すること
（ｖ）それらの細胞表面上に１つまたはそれを超えるＭＨＣ－ペプチド複合体を提示する細胞からＤＮＡを単離すること；
（ｖｉ）前記細胞表面上にＭＨＣ－ペプチド複合体を提示する細胞から単離された前記ＤＮＡに組み込まれたベクターによりコードされる候補ペプチドの配列を決定すること
を含む、請求項３に記載の方法。
前記ＭＨＣ分子が、細胞外ＭＨＣクラスＩＩアルファ鎖および膜貫通ドメインならびに細胞外ＭＨＣクラスＩＩベータ鎖および膜貫通ドメインを含むＭＨＣクラスＩＩ分子である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
前記ＭＨＣ分子が、前記細胞外ＭＨＣクラスＩアルファ鎖および膜貫通ドメインならびにベータ－２ミクログロブリンを含むＭＨＣクラスＩ分子である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
前記ＭＨＣ－ペプチド複合体が、前記候補ペプチド、ベータ－２マクログロブリン、前記細胞外ＭＨＣクラスＩアルファ鎖および膜貫通ドメインを含む融合タンパク質である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
前記ＭＨＣアルファ鎖がＹ８４Ａ突然変異を有する、請求項６または７に記載の方法。
ＭＨＣ分子の各鎖が膜貫通ドメインを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
前記膜貫通ドメインが前記ＭＨＣ分子のネイティブ膜貫通ドメインである、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
前記膜貫通ドメインが、ＴＣＲα／β、ＴＣＲγ／δ、ＣＤ３γ／δ／ε／ζ、ＣＤ４またはＣＤ８α／βなどの異種分子の膜貫通ドメインである、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
前記レポーター細胞株が哺乳動物細胞株である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
前記レポーター細胞株が、前記ＭＨＣクラスＩＩペプチドローディング機構を欠く細胞株である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
前記レポーター細胞株がＴ細胞ハイブリドーマである、請求項１３に記載の方法。
前記レポーター細胞株が、機能的ＴＡＰ１、ＴＡＰ２および／またはベータ－２－ミクログロブリン遺伝子を欠く細胞株である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
前記レポーター細胞株が、欠陥または欠失ＴＡＰ１、ＴＡＰ２および／またはベータ－２－ミクログロブリン遺伝子を有するＴ細胞ハイブリドーマである、請求項１５に記載の方法。
前記候補ペプチドが、個々の腫瘍由来突然変異を有する腫瘍特異的ペプチドである、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
前記突然変異がＳＮＶである、請求項１７に記載の方法。
前記候補ペプチドが、免疫反応を引き起こす抗原である、請求項１～１６に記載の方法。
前記候補ペプチドが、免疫原性試験を受けている化合物である、請求項１～１６に記載の方法。
それらの表面上にＭＨＣを効率的に発現するレポーター細胞を、ＦＡＣＳベースまたはＭＡＣＳベースの細胞選別により濃縮する、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞表面に提示された前記候補ペプチドの配列を、ＰＣＲおよびシークエンシングにより決定する、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
前記候補ペプチドが、ワクチンとして使用するためのものである、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
前記ワクチンが腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）ベースの癌ワクチンである、請求項２３に記載の方法。
前記候補ペプチドが、それが含む前記エピトープの少なくとも１つに対する免疫寛容を誘導するために使用するためのものである、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
前記候補ペプチドが、ＭＨＣ分子との関連でＴＣＲを遮断するために使用するためのものである、請求項１～２２または２５のいずれか一項に記載の方法。
前記候補ペプチドが、細胞への、特にＴ細胞へのＭＨＣ媒介性毒素送達に使用するためのものである、請求項１～２２または２５のいずれか一項に記載の方法。
前記候補ペプチドが、ＭＨＣ－ＣＡＲを用いてＴ細胞を再指向させるために使用するためのものである、請求項１～２２または２５のいずれか一項に記載の方法。
前記候補ペプチドが、免疫原性試験に使用するためのものである、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
前記候補ペプチドが、Ｔ細胞反応性試験に使用するためのものである、請求項１～２２または２９のいずれか一項に記載の方法。
候補ペプチドのＭＨＣ結合親和性を決定するための方法であって、レポーター細胞株において、共有結合的に結合された候補ペプチドを含む組換えＭＨＣ－ペプチド複合体を発現させること、前記レポーター細胞の表面上に前記ＭＨＣ－ペプチド複合体を提示するレポーター細胞を検出すること、およびこのような提示／発現のレベルを決定することを含む、方法。
（ｉ）少なくとも１つの膜貫通領域に接続された組換えＭＨＣアルファまたはベータドメインの上流にクローニングされた候補ペプチドを含むライブラリーを生成すること；
（ｉｉ）このようなライブラリーを、対応するＭＨＣアルファまたはベータドメインと一緒に適切なレポーター細胞株に形質導入すること；
（ｉｉｉ）それらの細胞表面上に１つまたはそれを超えるＭＨＣ－ペプチド複合体を提示する細胞を検出すること、
（ｉｖ）このような提示／発現のレベルを決定すること
を含む、請求項３１に記載の方法。
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）により提示される候補ペプチドを識別するためのシステムであって、
レポーター細胞株において、共有結合的に結合された候補ペプチドを含む組換えＭＨＣ－ペプチド複合体を発現させる手段、
前記ＭＨＣ－ペプチド複合体の表面発現を示すレポーター細胞を検出する手段、および
前記細胞表面に提示された候補ペプチドの配列を決定する手段
を含む、システム。
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）により提示される候補ペプチドを識別するためのシステムであって、
レポーター細胞株において、共有結合的に結合された候補ペプチドを含む組換えＭＨＣ－ペプチド複合体を発現させる手段、
前記ＭＨＣ－ペプチド複合体の表面発現を示すレポーター細胞を検出する手段、ならびに
前記ＭＨＣ－ペプチド複合体の表面発現のレベル、および前記細胞表面に提示された候補ペプチドの配列を決定する手段
を含む、システム。
候補ペプチドのＭＨＣ結合親和性を決定するためのシステムであって、
レポーター細胞株において、共有結合的に結合された候補ペプチドを含む組換えＭＨＣ－ペプチド複合体を発現させる手段、
前記レポーター細胞の表面上に前記ＭＨＣ－ペプチド複合体を提示するレポーター細胞を検出する手段、および
このような提示／発現のレベルを決定する手段
を含む、システム。