JP2021520798A - ワクチン設計のためのエピトープ選択ツールとしての哺乳動物mhcペプチドディスプレイ - Google Patents
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Abstract
Description
したがって、APCにより効率的に提示されるペプチド、特にTSAを確実に決定するための手段および方法を提供する必要がある。
(ii)このようなライブラリーを、対応するMHCアルファおよび/またはベータ鎖と一緒に適切なレポーター細胞株に形質導入すること;
(iii)前記細胞表面上に1つまたはそれを超えるMHC−ペプチド複合体を発現する細胞を検出および単離すること;
(iv)それらの細胞表面上に1つまたはそれを超えるMHC−ペプチド複合体を提示する細胞からDNAを単離すること;
(v)前記細胞表面上にMHC−ペプチド複合体を提示する細胞から単離された前記DNAに組み込まれたベクターによりコードされる候補ペプチドの配列を決定すること
を含む、態様1に記載の方法。
(ii)このようなライブラリーを、対応するMHCアルファおよび/またはベータ鎖と一緒に適切なレポーター細胞株に形質導入すること;
(iii)前記細胞表面上に1つまたはそれを超えるMHC−ペプチド複合体を発現する細胞を検出および単離すること;
(iv)前記1つまたはそれを超えるMHC−ペプチド複合体の細胞表面発現のレベルを決定すること
(v)それらの細胞表面上に1つまたはそれを超えるMHC−ペプチド複合体を提示する細胞からDNAを単離すること;
(vi)前記細胞表面上にMHC−ペプチド複合体を提示する細胞から単離された前記DNAに組み込まれたベクターによりコードされる候補ペプチドの配列を決定すること
を含む、態様3に記載の方法。
(ii)このようなライブラリーを、対応するMHCアルファまたはベータドメインと一緒に適切なレポーター細胞株に形質導入すること;
(iii)それらの細胞表面上に1つまたはそれを超えるMHC−ペプチド複合体を提示する細胞を検出すること、
(iv)このような提示/発現のレベルを決定すること
を含む、態様31に記載の方法。
(i)候補ペプチドを含むライブラリー、特に、組換えMHCベータおよび/またはアルファ鎖の上流にインフレームでクローニングされた候補ペプチドを含むライブラリーを生成する工程;
(ii)このようなライブラリーを、対応するMHCアルファおよび/またはベータ鎖と一緒に適切なレポーター細胞株に形質導入する工程;
(iii)細胞表面上に1つまたはそれを超えるMHC−ペプチド複合体を提示する細胞を検出する工程;
(iv)それらの細胞表面上に1つまたはそれを超えるMHC−ペプチド複合体を提示する細胞からDNAを単離する工程;
(v)前記細胞表面上に提示されたMHC−ペプチド複合体内の前記候補ペプチドの配列を決定する工程
を含む方法に関する。
(i)組換えMHCベータおよび/またはアルファ鎖の上流にインフレームでクローニングされた候補ペプチドを含むライブラリーを生成する工程;
(ii)このようなライブラリーを、対応するMHCアルファおよび/またはベータ鎖と一緒に適切なレポーター細胞株に形質導入する工程;
(iii)前記細胞表面上に1つまたはそれを超えるMHC−ペプチド複合体を発現する細胞を検出および単離する工程;
(iv)前記1つまたはそれを超えるMHC−ペプチド複合体の細胞表面発現のレベルを決定する工程
(v)それらの細胞表面上に1つまたはそれを超えるMHC−ペプチド複合体を提示する細胞からDNAを単離する工程;
(vi)前記細胞表面上にMHC−ペプチド複合体を提示する細胞から単離された前記DNAに組み込まれたベクターによりコードされる候補ペプチドの配列を決定する工程
を含む方法に関する。
(i)膜貫通領域に接続された組換えMHCアルファまたはベータドメインの上流にクローニングされた候補ペプチドを含むライブラリーを生成すること;
(ii)このようなライブラリーを、対応するMHCアルファまたはベータドメインと一緒に適切なレポーター細胞株に形質導入すること;
(iii)それらの細胞表面上に1つまたはそれを超えるMHC−ペプチド複合体を提示する細胞を検出すること、
(iv)このような提示/発現のレベルを決定すること
を含む方法に関する。
本発明者らは、TCRの膜貫通ユニットに融合されたMHCのネイティブ細胞外ドメインに連結されたペプチドから構成されるMHC−TCR融合タンパク質(MCR)を構築した(図1;国際公開第2016/097334号も参照のこと)。特に、共有結合的に連結されたインフルエンザマトリックスタンパク質1ペプチド(MP1103−120)、MP162−72またはインフルエンザcDNA由来ペプチドのライブラリーを有するベータ鎖と共に、ヒトMHC分子のアルファおよびベータ鎖を有するMCR(HLA−DRB1_4、DRB1_15、およびDRB5_1)をコードする構築物を生成した。標準的なプロトコールにしたがって、エコトロピックフェニックスパッケージング細胞株でレトロウイルス含有上清を生産し、これを使用して、レポーター細胞株および選別細胞に感染させた。MHCクラスII欠損細胞株(T細胞ハイブリドーマ)の形質導入後、抗HLA−DR APC抗体を使用してFACSによりMCR表面発現を測定した(図2)。HLA DRB1_4にテザーされたアミノ酸103〜120を含むMP1由来ペプチドは、哺乳動物レポーター細胞株の表面上におけるMCRの効率的な発現をもたらす。HLA DRB1_15にテザーされた同じペプチドは、非常に低いMCR発現をもたらし、HLA DRB5_1の状況では全く発現されない(図2a)。しかしながら、アミノ酸62〜72を含む別のMP1由来ペプチドは、試験した他のHLA以外のHLA DRB5−1を含有するMCRの効率的な発現をもたらす(図2b)。重要なことに、インフルエンザcDNA由来ペプチドのライブラリーをHLA DBR1_4またはHLA DRB1_15にテザーしたところ、同様のレベルの表面発現が観察されたが、これは、HLA1_4およびHLA1_15が両方とも、MCRの一部として細胞表面上に効率的に発現され得ることを示している(図2c)。公開されている研究(Schmidら、Immunity 2007)から、アミノ酸103〜117および107〜121を含むMP1ペプチドは、HLA DRB1−4により効率的に提示されることが公知であるが、これは、共有結合的に付着されたペプチドがMHCペプチド結合溝に効率的に結合する場合にのみ、MHC複合体は、抗体染色で検出され得る表面発現について十分に安定であることを示唆している。図6はさらに、コアMP1107−117ペプチドが、隣接ペプチド領域にかかわらず、HLA−DRB1_4上にのみ効率的に提示され得ることを示す。
異なるペプチド(pep1、pep2およびpep3)を有する様々なHLAベータ鎖を含有するMCRの表面発現を、抗HLA−DRおよび抗CD3eを使用した抗体染色で検出し、BDFortessaフローサイトメーターで分析した(図3)。二重陽性染色は、両抗体が、MCR表面発現の検出において効率的であること、および抗CD3e染色を普遍的に使用して、異なるHLA対立遺伝子を有するMCRを検出し得ることを示す。さらに、対角線形状の集団は、MCRとCD3鎖との効率的な会合を示す。
免疫エピトープデータベース(IEDB)分析リソースを使用して、MP1103−120に対するMHC結合親和性が予測された(Wang,Pら、A Systematic Assessment of MHC Class II Peptide Binding Predictions and Evaluation of a Consensus Approach.PLoS Comput Biol 4,e1000048(2008);Wang,Pら、Peptide binding predictions for HLA DR,DP and DQmolecules.BMC Bioinformatics 11,568(2010))。MP1103−121について、本発明の方法は、HLA DRB 4_1が最も結合してHLAの高い表面発現をもたらし、HLA DRB 1_15が中程度に結合して低い表面発現をもたらし、HLA DRB 5_1が全く結合しないことを示した。しかしながら、IEDB分析リソースを使用したところ、ペプチド結合予測分析は、HLA DRB5_1が最良のMP1103−120結合物であることを示した(図5)。
本発明者らは、アルファ鎖にテザーされたランダムペプチドを有するマウスMCRのライブラリーを構築した。MHCクラスII欠損細胞株(T細胞ハイブリドーマ)の形質導入後、抗MHC抗体を使用して、FACSによりMCR表面発現を測定した(図7)。多くの異なるペプチドを有するMCRの効率的な発現が検出されたが、これは、MCRのアルファ鎖に連結されたペプチドもまた、表面発現に十分なほどにMHC複合体を安定化し得ることを示している。
Claims (32)
- 主要組織適合遺伝子複合体(MHC)により提示される候補ペプチドを識別するための方法であって、レポーター細胞株において、共有結合的に結合された候補ペプチドを含む組換えMHC−ペプチド複合体を発現させること、前記MHC−ペプチド複合体の表面発現を示すレポーター細胞を検出すること、および前記細胞表面に提示された候補ペプチドの配列を決定することを含む、方法。
- (i)組換えMHCベータおよび/またはアルファ鎖の上流にインフレームでクローニングされた候補ペプチドを含むライブラリーを生成すること;
(ii)このようなライブラリーを、対応するMHCアルファおよび/またはベータ鎖と一緒に適切なレポーター細胞株に形質導入すること;
(iii)前記細胞表面上に1つまたはそれを超えるMHC−ペプチド複合体を発現する細胞を検出および単離すること;
(iv)それらの細胞表面上に1つまたはそれを超えるMHC−ペプチド複合体を提示する細胞からDNAを単離すること;
(v)前記細胞表面上にMHC−ペプチド複合体を提示する細胞から単離された前記DNAに組み込まれたベクターによりコードされる候補ペプチドの配列を決定すること
を含む、請求項1に記載の方法。 - 主要組織適合遺伝子複合体(MHC)により提示される候補ペプチドを識別するための方法であって、レポーター細胞株において、共有結合的に結合された候補ペプチドを含む組換えMHC−ペプチド複合体を発現させること、前記MHC−ペプチド複合体の表面発現を示すレポーター細胞を検出すること、ならびに前記MHC−ペプチド複合体の表面発現のレベル、および前記細胞表面に提示された候補ペプチドの配列を決定することを含む、方法。
- (i)組換えMHCベータおよび/またはアルファ鎖の上流にインフレームでクローニングされた候補ペプチドを含むライブラリーを生成すること;
(ii)このようなライブラリーを、対応するMHCアルファおよび/またはベータ鎖と一緒に適切なレポーター細胞株に形質導入すること;
(iii)前記細胞表面上に1つまたはそれを超えるMHC−ペプチド複合体を発現する細胞を検出および単離すること;
(iv)前記1つまたはそれを超えるMHC−ペプチド複合体の細胞表面発現のレベルを決定すること
(v)それらの細胞表面上に1つまたはそれを超えるMHC−ペプチド複合体を提示する細胞からDNAを単離すること;
(vi)前記細胞表面上にMHC−ペプチド複合体を提示する細胞から単離された前記DNAに組み込まれたベクターによりコードされる候補ペプチドの配列を決定すること
を含む、請求項3に記載の方法。 - 前記MHC分子が、細胞外MHCクラスIIアルファ鎖および膜貫通ドメインならびに細胞外MHCクラスIIベータ鎖および膜貫通ドメインを含むMHCクラスII分子である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記MHC分子が、前記細胞外MHCクラスIアルファ鎖および膜貫通ドメインならびにベータ−2ミクログロブリンを含むMHCクラスI分子である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記MHC−ペプチド複合体が、前記候補ペプチド、ベータ−2マクログロブリン、前記細胞外MHCクラスIアルファ鎖および膜貫通ドメインを含む融合タンパク質である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記MHCアルファ鎖がY84A突然変異を有する、請求項6または7に記載の方法。
- MHC分子の各鎖が膜貫通ドメインを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記膜貫通ドメインが前記MHC分子のネイティブ膜貫通ドメインである、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記膜貫通ドメインが、TCRα/β、TCRγ/δ、CD3γ/δ/ε/ζ、CD4またはCD8α/βなどの異種分子の膜貫通ドメインである、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レポーター細胞株が哺乳動物細胞株である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レポーター細胞株が、前記MHCクラスIIペプチドローディング機構を欠く細胞株である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レポーター細胞株がT細胞ハイブリドーマである、請求項13に記載の方法。
- 前記レポーター細胞株が、機能的TAP1、TAP2および/またはベータ−2−ミクログロブリン遺伝子を欠く細胞株である、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レポーター細胞株が、欠陥または欠失TAP1、TAP2および/またはベータ−2−ミクログロブリン遺伝子を有するT細胞ハイブリドーマである、請求項15に記載の方法。
- 前記候補ペプチドが、個々の腫瘍由来突然変異を有する腫瘍特異的ペプチドである、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記突然変異がSNVである、請求項17に記載の方法。
- 前記候補ペプチドが、免疫反応を引き起こす抗原である、請求項1〜16に記載の方法。
- 前記候補ペプチドが、免疫原性試験を受けている化合物である、請求項1〜16に記載の方法。
- それらの表面上にMHCを効率的に発現するレポーター細胞を、FACSベースまたはMACSベースの細胞選別により濃縮する、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞表面に提示された前記候補ペプチドの配列を、PCRおよびシークエンシングにより決定する、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記候補ペプチドが、ワクチンとして使用するためのものである、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ワクチンが腫瘍特異的抗原(TSA)ベースの癌ワクチンである、請求項23に記載の方法。
- 前記候補ペプチドが、それが含む前記エピトープの少なくとも1つに対する免疫寛容を誘導するために使用するためのものである、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記候補ペプチドが、MHC分子との関連でTCRを遮断するために使用するためのものである、請求項1〜22または25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記候補ペプチドが、細胞への、特にT細胞へのMHC媒介性毒素送達に使用するためのものである、請求項1〜22または25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記候補ペプチドが、MHC−CARを用いてT細胞を再指向させるために使用するためのものである、請求項1〜22または25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記候補ペプチドが、免疫原性試験に使用するためのものである、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記候補ペプチドが、T細胞反応性試験に使用するためのものである、請求項1〜22または29のいずれか一項に記載の方法。
- 候補ペプチドのMHC結合親和性を決定するための方法であって、レポーター細胞株において、共有結合的に結合された候補ペプチドを含む組換えMHC−ペプチド複合体を発現させること、前記レポーター細胞の表面上に前記MHC−ペプチド複合体を提示するレポーター細胞を検出すること、およびこのような提示/発現のレベルを決定することを含む、方法。
- (i)少なくとも1つの膜貫通領域に接続された組換えMHCアルファまたはベータドメインの上流にクローニングされた候補ペプチドを含むライブラリーを生成すること;
(ii)このようなライブラリーを、対応するMHCアルファまたはベータドメインと一緒に適切なレポーター細胞株に形質導入すること;
(iii)それらの細胞表面上に1つまたはそれを超えるMHC−ペプチド複合体を提示する細胞を検出すること、
(iv)このような提示/発現のレベルを決定すること
を含む、請求項31に記載の方法。
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