JP6718450B2 - キメラ抗原受容体及びその使用方法 - Google Patents
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Description
− 採用されるT細胞治療の安全性を評価するのに役立つかもしれないし、
− 自己免疫疾患、癌の治療において及び新しいワクチンの開発において、新しいアプローチを可能にするかもしれない。
アミノ酸配列はアミノ末端からカルボン酸末端へ向かって与えられる。配列位置についての大文字記載は1文字コードのL−アミノ酸を指す(ストライヤー, Biochemistry,第3版p.21)。アミノ酸配列位置について小文字の記載は対応するD−または(2R)−アミノ酸を指す。
i.複数の哺乳類細胞を提供することであり、ここで、
− 該複数の哺乳類細胞の各々は、ライブラリーのメンバーを発現し、
− 該ライブラリーの各メンバーは、トランスジェニック抗原受容体分子をコードし、
− 該トランスジェニック抗原受容体分子は、
・MHC1またはMHC2の細胞外部位、
・該細胞外部位配列のポリペプチド配列中(配列中という用語は、該オリゴペプチドが細胞外部位配列のN及びC境界の間のいずれかに、またはその各末端のいずれかに含まれ得ることを意味する。)に含まれるオリゴペプチド、ここで該オリゴペプチドは該ライブラリーの各メンバーについて異なり、及びここで、該オリゴペプチドはT細胞受容体による認識に適した方法で提示され、
・T細胞受容体(TCR)の膜貫通部位、及び
・TCRの細胞内部位、
を含み、
− 前記トランスジェニック抗原受容体分子はレポータータンパク質に機能的に連結しており、これにより同種T細胞受容体の該トランスジェニック抗原受容体への結合がレポーター遺伝子の活性化をもたらす。
ii.複数の哺乳類細胞を、Tリンパ球の表面に発現するT細胞受容体を介して該トランスジェニック抗原受容体中に含まれるオリゴペプチド配列へ結合可能なTリンパ球の調製物と、接触させること。
iii.検出可能なレポータータンパク質のレベルにしたがって、前記複数の哺乳類細胞から検出可能なレポータータンパク質を有する細胞を分離し、活性化細胞を得ること。
iv.該活性化細胞から発現したライブラリーメンバーをコードするDNAを単離すること。
v.該活性化細胞中で発現したトランスジェニック抗原受容体中に含まれるオリゴペプチド配列の配列を決定すること。該オリゴペプチドの決定された配列は該TCRの認識可能なペプチド配列である。
が提供される。該方法は以下を含む:
i.哺乳類細胞を提供することであり、ここで、
− 該哺乳類細胞はトランスジェニック抗原受容体分子を発現し、
− 該トランスジェニック抗原受容体分子は、
・T細胞受容体による認識に適した方法で提示されるオリゴペプチドを含むMHC1またはMHC2の細胞外部位、
・T細胞受容体(TCR)の膜貫通部位、及び
・TCRの細胞内部位
を含み、
− 該トランスジェニック抗原受容体分子はレポータータンパク質と機能的に連結しており、それによってT細胞受容体のトランスジェニック抗原受容体への結合が前記レポーター遺伝子の活性化をもたらす。
ii.哺乳類細胞を、Tリンパ球の表面に発現しているT細胞受容体を介してトランスジェニック抗原受容体に含まれるオリゴペプチドへ結合可能なTリンパ球の調製物と、接触させること。T細胞受容体のトランスジェニック抗原受容体への結合は、レポーター遺伝子を活性化させ、活性化した哺乳類細胞が得られる。
iii.該活性化した哺乳類細胞から発現したライブラリーメンバーをコードするDNAを単離する。
iv.トランスジェニック抗原受容体中に含まれるオリゴペプチド配列の配列を決定する。
a.該第1のポリペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体I(MHCクラスI)α鎖の細胞外部位を含み、及び該第2のポリペプチドは、β2ミクログロブリン部位を含み、または
b.該第1のポリペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体II(MHCクラスII)α鎖の細胞外部位を含み、及び該第2のポリペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体II(MHCクラスII)β鎖の細胞外部位を含む。
a.該第1のポリペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体I(MHCクラスI)α鎖の細胞外部分を含み、及び該第2のポリペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体I(MHCクラスI)関連β2ミクログロブリン部位を含み、または
b.該第1のポリペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体II(MHCクラスII)α鎖の細胞外部位を含み、及び該第2のポリペプチドは主要組織適合遺伝子複合体II(MHCクラスII)β鎖を含む。
i.(該第2のポリペプチドのβ2ミクログロブリンに加えて)該第1のポリペプチドのMHCクラスIα1及びα2及びα3部位、または
ii.該第1のポリペプチドのMHCクラスIIα1及びα2部位、並びに該第2のポリペプチドのMHCクラスIIβ1及びβ2部位、
を含む。
i.本発明の第5の側面に記載の該キメラ抗原受容体ポリペプチド
ii.該キメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体へ機能的に連結したエフェクター機能、
を含む。
i.レポータータンパク質、及び/または
ii.該キメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体へ結合した細胞において、細胞死、特にアポトーシスを誘導する能力。
i.蛍光タンパク質、
ii.ルシフェラーゼタンパク質、
iii.抗原耐性遺伝子、
iv.Creリコンビナーゼ、
v.CAS−9ヌクレアーゼ、または
vi.CAS−9キメラ転写抑制因子または転写活性化因子。
i.患者から得られるTリンパ球の調製物を提供すること、
ii.本発明の第5または第6の側面に記載の哺乳類細胞とTリンパ球調製物とを接触させること、
ここで、該哺乳類細胞は、該エフェクター機能が、該キメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体へ結合した細胞において、細胞死、特にアポトーシスを誘導することができることを特徴とする。
i.本発明の第4の側面に記載の哺乳類細胞の調製物を提供すること、
ii.患者へ該哺乳類細胞を投与すること、
ここで、該哺乳類細胞は、該エフェクター機能が、該キメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体へ結合した細胞の細胞死、特にアポトーシスを誘導することができることを特徴とする。
i.本発明の第4の側面に記載の哺乳類細胞を提供し、ここで前記細胞は、前記キメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体ヘ機能的に連結したレポータータンパク質を含み、
ii.免疫応答に関連するTリンパ球を含む患者の血液サンプルをエクスビボで提供し、
iii.エフェクター機能を実施可能にする条件下で哺乳類細胞を血液サンプルと接触させ、及び、
iv.哺乳類細胞内のレポータータンパク質を検出する。
i.該レポータータンパク質の発現にしたがって哺乳類細胞を分離すること、
ii.分離した哺乳類細胞からDNAを単離すること、及び
iii.本発明の第5の側面に記載の該キメラ抗原−受容体ポリペプチドヘテロ二量体にコードされるオリゴペプチドの配列を決定すること、
の工程をさらに含む。
マウス
C57/Bl6マウスはチャールズリバーから購入した。Smarta2及びOT−IIマウスはRTHマウス施設で繁殖させた。
Bekoは、TCRβ欠損マウス由来の自発性胸腺腫細胞株である。H18.3.13レポーター細胞株は、NFAT−EGFPレポーター(EGFPをコードする配列の上流に挿入された、3つのNFAT結合部位ACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCC(配列番号001)をそれぞれ含む、最小ヒトIL−2プロモーターの4コピーを担持している)をTCR−B6T細胞へレトロウイルス形質導入によって作製した。16.2c11レポーター細胞株は、NFAT−sFTレポーター構成物及びマウスエコトロピックレテロウイルスレセプターSlc7a1をコードするベクターを16.2T細胞ハイブリドーマへ形質移入することによって作製した。
単離したT細胞または胸腺細胞を、2〜3日間マウスIL−2存在下で、プラスチック結合抗CD3ε及び抗CD28抗体を用いて活性化した。等量の活性化T細胞及びTCRα−β−BW5147融合パートナーはPEG−1500を用いて融合し、そして100mMヒポキサンチン、400nMアミノプテリン及び16mMチミジン(HAT)存在下で限界希釈してプレートへ被覆した。
該MCR2α及びβ鎖は標準的な技術によってクローン化され及び以下の部分を含む:
MCR2α鎖:GGSGGSAQ(配列番号002)リンカーによってTCRα鎖定常領域87〜137残基に連結された該MHC−II I−Abα鎖1〜208残基。
MCR2β鎖:AQSGGSGGSAQ(配列番号003)リンカーによってTCRβ鎖定常領域(C1)123〜173残基に連結された該MHC−II I−Abβ鎖1〜217残基。MCR2(gp61)残基において、MHC−II部分の29位及び30位におけるDSは、アミノ酸配列SGLNGPDIYKGVYQFKSVGSGGSGGSGDS(配列番号004)によって置換した。MCR2(OVA)においては、同じ残基はアミノ酸配列SISQAVHAAHAEINEAGRGSGGSGGSGDS(配列番号005、OVAペプチドを含む)によって置換した。
MCRα及びMCRβはpMYiresGFPレトロウイルスベクターにクローニングし、MCRβがGFPで置換するようにした。該研究を通して、我々はこのベクター(pMY−MCRαiresMCRβ)を用いて種々のペプチドを含むMCRを作製し、それらをMCR(「ペプチド」/「MHCハプロタイプ」)と呼んだ。 レトロウイルス含有上清を、エコトロピックPhoenixパッケージング細胞株で産生し、レポーター細胞株を感染させ、細胞を単離するために使用した。
Gp61ミモトープライブラリーを作製するために、MCR2(gp61−RSS−EGFP−RSS/I−Ab)構成物は、MCR2(gp61)構成物中のgp61ペプチドの中間にEGFP及びRAG組換えシグナル配列(RSS)を含むスタッファーフラグメントを挿入することによって作製した(図2a)。この構成物をTst−4/DLL132上で培養し、単離したCD4−CD8−二重陰性(DN)胸腺細胞へ形質導入した。1週間培養後(その間、DN細胞がCD4+CD8+二重陽性(DP)細胞となり、RAGを介した再編成によってRSS−EGFP−RSSスタッファーと同様にそれらのTCR遺伝子が組換わる)、EGFPが低レベル発現の細胞を単離し、cDNAを作製した。組換えMCR2(gp61−RSS−EGFP−RSS/I−Ab)の該ペプチドコード部分を該cDNAかPCR増幅し、MCR2(gp61−RSS/I−Ab)ミモトープライブラリーを作製する空のMCR2(I−Ab)ベクターにクローニングした。
MCR2−LCMV純粋重複ペプチドライブラリーを作製するために、時間を制限してGP及びNPタンパク質をコードするDNAを消化した(タカラ DNA断片化キット)。該断片をクローニング位置に隣接するベクター配列へ相同のリンカーで結合し、PCR増幅し、ギブソンアッセンブリーによってpMY−MCR2ベクターへクローニングし、2×106クローンを作製するバクテリアへ形質移入した。16.2c11細胞へ該ライブラリーを形質導入し、そして0.5×106MCR低細胞及び2.2×104MCR高細胞を単離した。
他に特に記載のない限り、MCR2+Beko細胞は、示したドナーマウスから単離した5倍過剰のCD4+T細胞と共培養した。
他に特に記載のない限り、MCR+細胞は、示したドナーマウスから単離した5倍過剰のCD4+T細胞またはCD4+T細胞ハイブリドーマと8〜12時間共培養した。
第1のポリペプチド、α鎖(配列番号007):
MPRSRALILGVLALTTMLSLCGGEDDIEADHVGTYGISVYQSPGDIGQYTFEFDGDELFYVDLDKKETVWMLPEFGQLASFDPQGGLQNIAVVKHNLGVLTKRSNSTPATNEAPQATVFPKSPVLLGQPNTLICFVDNIFPPVINITWLRNSKSVADGVYETSFFVNRDYSFHKLSYLTFIPSDDDIYDCKVEHWGLEEPVLKHWEPEGGSGGSAQSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
アミノ酸1〜208はMHC2α鎖に由来する。アミノ酸209〜216はリンカー配列である。アミノ酸217−267はTCRαに由来する。
MALQIPSLLLSAAVVVLMVLSSPRTEGGSGGSGGSGDSERHFVYQFMGECYFTNGTQRIRYVTRYIYNREEYVRYDSDVGEHRAVTELGRPDAEYWNSQPEILERTRAELDTVCRHNYEGPETHTSLRRLEQPNVVISLSRTEALNHHNTLVCSVTDFYPAKIKVRWFRNGQEETVGVSSTQLIRNGDWTFQVLVMLEMTPRRGEVYTCHVEHPSLKSPITVEWRAQSGGSGGSAQGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
アミノ酸1〜26はリーダーペプチドである。アミノ酸27と28の間は、提示するオリゴペプチドの挿入部位である。アミノ酸29〜36はリンカー配列である。アミノ酸37〜228は、MHC2βに由来する。アミノ酸229〜236はリンカー配列である。アミノ酸237〜287はTCRβに由来する。
LNGPDIYKGVYQFKSV
ISQAVHAAHAEINEAGR
Claims (16)
- TCRが認識可能なペプチド配列を同定するための方法であって、
i.複数の哺乳類細胞を提供すること、ここで
− 少なくとも2個の哺乳類細胞はライブラリーのメンバーを発現し;
− 前記ライブラリーの少なくとも2個のメンバーはトランスジェニック抗原受容体をコードし;
− 前記トランスジェニック抗原受容体は:
・ MHC1またはMHC2の細胞外部位、
・ 前記細胞外部位内に含まれるオリゴペプチド、ここで該オリゴペプチドは該ライブラリーの少なくとも2個のメンバーについて異なり、及びここで該オリゴペプチドはT細胞受容体による認識に適した方法で提示され、
・ T細胞受容体(TCR)の膜貫通部位、及び
・ TCRα鎖の細胞内部位及びTCRβ鎖の細胞内部位、
を含み;
− 前記トランスジェニック抗原受容体はレポータータンパク質に機能的に連結しており、それによって、同種T細胞受容体の前記トランスジェニック抗原受容体への結合が前記レポーター遺伝子の活性化をもたらし、
ii.前記複数の哺乳類細胞をTリンパ球の調製物と接触させること、
iii.前記レポータータンパク質の検出可能なレベルにしたがって、前記複数の哺乳類細胞から検出可能なレポータータンパク質を示す細胞を分離し、活性化細胞を得ること、
iv.前記活性化細胞からDNAを単離すること、並びに
v.前記トランスジェニック抗原受容体に含まれる前記オリゴペプチド配列の配列を決定すること、
を含む、TCRが認識可能なペプチド配列を同定するための方法。 - TCRが認識可能なペプチド配列を同定するための方法であって、
i.哺乳類細胞を提供すること、ここで
− 前記哺乳類細胞はトランスジェニック抗原受容体を発現し;
− 前記トランスジェニック抗原受容体分子は
・ T細胞受容体による認識に適した方法で提示されたオリゴペプチドを含むMHC1またはMHC2の細胞外部位、
・ T細胞受容体(TCR)の膜貫通部位、及び
・ TCRα鎖の細胞内部位及びTCRβ鎖の細胞内部位、
を含み;
− 前記トランスジェニック受容体は、レポータータンパク質と機能的に連結し、それによって、同種T細胞受容体の前記トランスジェニック抗原受容体への結合が前記レポーター遺伝子の活性化をもたらし、
ii.前記哺乳類細胞をTリンパ球の調製物と接触させ、それによって、前記レポーター遺伝子の活性化により、活性化した哺乳類細胞を得ること、
iii.前記活性化した哺乳類細胞からDNAを単離すること、並びに
iv.前記トランスジェニックキメラ抗原受容体中にコードされる前記オリゴペプチド配列の配列を決定すること、
を含む、TCR認識ペプチド配列を同定するための方法。 - 前記トランスジェニック抗原受容体が、第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドを含むキメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体であって、ここで
a.前記第1のポリペプチドは主要組織適合遺伝子複合体I(MHCクラスI)α鎖の細胞外部分を含み、及び前記第2のポリペプチドはβ2ミクログロブリン部位を含み、または、
b.前記第1のポリペプチドは主要組織適合遺伝子複合体II(MHCクラスII)α鎖の細胞外部分を含み、及び前記第2のポリペプチドは主要組織適合遺伝子複合体II(MHCクラスII)β鎖の細胞外部分を含み、
ここで、前記第1及び前記第2のポリペプチド鎖の少なくとも1つは、さらに前記細胞外MHC部位へ共有結合したオリゴペプチドを含み;前記第1のポリペプチド及び前記第2のポリペプチドの1つは、さらにT細胞受容体α鎖の細胞内部位または細胞内尾部、膜貫通部位、及びヒンジ領域を含み、並びに、前記第1のポリペプチド及び前記第2のポリペプチドの他方は、T細胞受容体β鎖の細胞内部位、膜貫通部位及びヒンジ領域を含む、
請求項1または2に記載の方法。 - 第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドを含むキメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体であって、ここで、
a.前記第1のポリペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体I(MHCクラスI)α鎖の細胞外部分を含み、及び前記第2のポリペプチドはβ2ミクログロブリン部位を含み、または、
b.前記第1のポリペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体II(MHCクラスII)α鎖の細胞外部分を含み、及び前記第2のポリペプチドは主要組織適合遺伝子複合体II(MHCクラスII)β鎖の細胞外部分を含み、
前記第1のポリペプチド及び前記第2のポリペプチドの1つは、さらにT細胞受容体α鎖の細胞内部位または細胞内尾部、膜貫通部位及びヒンジ領域を含み、並びに、前記第1のポリペプチド及び前記第2のポリペプチドの他方は、T細胞受容体β鎖の細胞内部位、膜貫通部位及びヒンジ領域を含む、
前記第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドを含むキメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体。 - 前記第1及び前記第2のポリペプチド鎖の少なくとも1つは、さらにT細胞受容体によって認識可能なオリゴペプチドを含み、前記オリゴペプチドは前記細胞外MHC部位へ共有結合で連結する、請求項4に記載の第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドを含むキメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体。
- MHC分子の細胞外部分が、
i.前記第1のポリペプチド部分を形成するMHCクラスIα1、α2及びα3の各々、または、
ii.前記第1のポリペプチド部分を形成するMHCクラスIIα1及びMHCクラスIIα2、並びに前記第2のポリペプチド部分を形成するMHCクラスIIβ1及びMHCクラスIIβ2部位、及び/または、
iii.ここでMHC分子の細胞外部分は、IMGT HLAデータベースに記載されているヒト主要組織適合遺伝子複合体遺伝子ファミリーHLAのメンバーから選択される、
を含む、請求項4又は5に記載のキメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体。 - 前記オリゴペプチド配列が、
a.該MHCα1部位配列の1、2、3、4又は5アミノ酸後に挿入され、及び/または
b.前記オリゴペプチドが、長さが8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30または40アミノ酸である、
請求項4〜6のいずれか1項に記載のキメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体。 - 配列番号007に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を有する第1のポリペプチド及び配列番号008に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を有する第2のポリペプチドを含む、請求項4〜7のいずれか1項に記載のキメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体。
- 請求項4〜8のいずれか1項に記載のキメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体をコードする核酸分子。
- 細胞であって、
i.請求項4〜8のいずれか1項に記載の該キメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体、及び
ii.前記キメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体に機能的に連結したエフェクター機能、を含む、前記細胞。 - 前記エフェクター機能が:
i.レポータータンパク質、及び/または
ii.該キメラ抗原受容体ポリペプチドへ結合した細胞において、細胞死を誘導することができるタンパク質、
である、請求項10に記載の細胞。 - 前記レポータータンパク質が:
iii.蛍光タンパク質、または
iv.ルシフェラーゼタンパク質、または
v.抗生物質耐性遺伝子によってコードされるタンパク質、または
vi.Creリコンビナーゼ、または
vii.CAS−9ヌクレアーゼ、または
viii.CAS−9キメラ転写抑制因子または転写活性化因子
から選択される、
請求項11に記載の細胞。 - 抗原に対して反応性が低下しているTリンパ球の調製物を得る方法であって、
i.患者から得られたTリンパ球の調製物を提供すること、
ii.前記Tリンパ球の調製物を、キメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体を含む請求項10〜12のいずれか1項に記載の細胞の調製物と接触させること、
ここで、前記細胞は、キメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体へ結合した細胞において、エフェクター機能が細胞死を誘導することを特徴とする、
上記工程を含む、抗原に対して反応性が低下しているTリンパ球の調製物を得る方法。 - 移植拒絶、1型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病及び炎症性腸症候群を含む、自己免疫疾患または免疫機能不全の治療または予防に使用するための請求項10〜13のいずれか1項に記載の細胞。
- 患者の抗原ペプチドに対する免疫応答を検出するための方法であって、
i.請求項10〜12のいずれか1項に記載の細胞を提供すること、ここで前記細胞は、前記キメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体へ機能的に連結するレポータータンパク質を含み、
ii.前記患者の血液試料をエクスビボで提供すること、
iii.前記哺乳類細胞を前記血液試料へ接触させること、及び
iv.前記哺乳類細胞中の前記レポータータンパク質を検出すること、
上記工程を含む、
患者の抗原ペプチドに対する免疫応答を検出するための方法。 - i.レポータータンパク質の発現にしたがって、該哺乳類細胞を分離すること、
ii.前記分離した哺乳類細胞からDNAを単離すること、及び
iii.請求項4〜8のいずれか1項に記載のキメラ抗原受容体ポリペプチドヘテロ二量体中にコードされた抗原−ペプチドの配列を決定すること、
上記工程をさらに含む、
請求項15に記載の方法。
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