JPWO2019183248A5

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Publication number: JPWO2019183248A5
Application number: JP2020551263A
Authority: JP
Publication date: 2022-03-29

Description

図4A～4Fは、以下の注釈付きマップを示す。図4A）Pol I依存性pUC起点-アンピシリン選択A60 polyA反復をコードするmRNAベクターpGEM4Z T7 A60 pA（表8参照）；図4B）Pol I依存性pUC起点-RNA-OUT抗生物質不含選択A60 polyA反復をコードするmRNAベクターNTC8-T7 A60 pA（表8参照）；図4C）Pol III依存性R6K起点-RNA-OUT抗生物質不含選択A60 polyA反復をコードするmRNAベクターNTC8-T7 A60 pA（表8参照）；図4D）Pol I依存性pUC起点-アンピシリン選択A99 polyA反復をコードするmRNAベクターpT3/T7 A99 pA（表8を参照）；図4E）Pol I依存性pUC起点-kanR選択A99 polyA反復をコードするmRNAベクターNTC7-T7 A99 pA（表8を参照）；図4F）Pol III依存性R6K起点-RNA-OUT抗生物質不含選択A99 polyA反復をコードするmRNAベクターNTC9-T7 A99 pA（表8を参照）。細菌骨格複製起点及び選択マーカーに対するA60又はA99 polyA反復の位置が示されている。
本発明は、例えば以下の実施形態を包含する：
［実施形態１］共有結合閉環状プラスミドの複製を改善する方法であって、
a.以下：
i.Pol I依存性複製起点、及び
ii.逆方向反復配列、定方向反復配列、ホモポリマー反復配列、真核生物複製起点又は真核生物プロモーターエンハンサー配列からなる群から選択される構造化DNA配列を含む挿入物であって、構造化DNA配列が複製の方向におけるPol I依存性複製起点から1000bp未満の距離に位置する、上記挿入物
を含む共有結合閉環状プラスミドを提供するステップ、並びに
b.a.の共有結合閉環状組換え分子を修飾して、Pol I依存性複製起点をPol III依存性複製起点に置換するステップを含み、それにより、得られたPol III依存性複製起点により共有結合閉環状プラスミドは複製が改良される、上記方法。
［実施形態２］前記Pol I依存性複製起点が、pUC起点、pMB1起点、及びColE1起点からなる群から選択される、実施形態1に記載の方法。
［実施形態３］前記Pol III依存性複製起点がR6Kガンマ複製起点である、実施形態1に記載の方法。
［実施形態４］前記Pol III依存性複製起点が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4及び配列番号18からなる群から選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有するR6Kガンマ複製起点である、実施形態1に記載の方法。
［実施形態５］前記構造化DNA配列が、ポリA反復、SV40複製起点、ウイルスLTR、レンチウイルスLTR、レトロウイルスLTR、トランスポゾンIR/DR反復、スリーピング・ビューティトランスポゾンIR/DR反復、AAV ITR、トランスポゾンITR、PiggyBacトランスポゾンITR、CMVエンハンサー、及びSV40エンハンサーからなる群から選択される、実施形態1に記載の方法。
［実施形態６］前記改良された複製が、複製中間体の生成の減少及びプラスミドコピー数の増加からなる群から選択される、実施形態1に記載の方法。
［実施形態７］共有結合閉環状プラスミドの複製を改良する方法であって、
a.以下：
i.Pol I依存性複製起点及び抗生物質選択マーカーを含む細菌複製-選択領域、及び
ii.逆方向反復配列、定方向反復配列、ホモポリマー反復配列、真核生物複製起点、及び真核生物プロモーターエンハンサー配列からなる群から選択される構造化DNA配列を含む挿入物であって、構造化DNA配列が複製の方向におけるPol I依存性複製起点から1000bp未満の距離に位置する、上記挿入物
を含む共有結合閉環状プラスミドを提供するステップ、並びに
b.a.の共有結合閉環状組換え分子を修飾して、抗生物質選択マーカーをRNA選択マーカーに置換し、Pol I依存性複製起点をPol III依存性複製起点に置換するステップを含み、それにより、得られたPol III依存性複製起点により共有結合閉環状プラスミドは複製が改良される、上記方法。
［実施形態８］前記Pol I依存性複製起点が、pUC起点、pMB1起点、及びColE1起点からなる群から選択される、実施形態7に記載の方法。
［実施形態９］前記Pol III依存性複製起点がR6Kガンマ複製起点である、実施形態7に記載の方法。
［実施形態１０］前記Pol III依存性複製起点が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4及び配列番号18からなる群から選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有するR6Kガンマ複製起点である、実施形態7に記載の方法。
［実施形態１１］前記RNA選択マーカーが、配列番号5及び配列番号7からなる群から選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有するRNA-IN調節RNA-OUT機能性変異体である、実施形態7に記載の方法。
［実施形態１２］前記RNA選択マーカーが、配列番号6と少なくとも95％の配列同一性を有するRNA-IN調節RNA-OUT RNAをコードするRNA-OUT RNA選択マーカーである、実施形態7に記載の方法。
［実施形態１３］Pol I依存性複製起点及び抗生物質選択マーカーを含む前記細菌複製-選択領域が、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、及び配列番号17からなる群から選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有するPol III依存性R6K起点-RNA-OUT RNA選択マーカー細菌複製-選択領域で置換される、実施形態7に記載の方法。
［実施形態１４］前記構造化DNA配列が、ポリA反復、SV40複製起点、ウイルスLTR、レンチウイルスLTR、レトロウイルスLTR、トランスポゾンIR/DR反復、スリーピング・ビューティトランスポゾンIR/DR反復、AAV ITR、トランスポゾンITR、PiggyBacトランスポゾンITR、CMVエンハンサー、及びSV40エンハンサーからなる群から選択される、実施形態7に記載の方法。
［実施形態１５］前記改良された複製が、複製中間体の生成の減少及びプラスミドコピー数の増加からなる群から選択される、実施形態7に記載の方法。
［実施形態１６］抗生物質マーカー不含の共有結合閉環状組換えDNA分子であって、
a.逆方向反復配列、定方向反復配列、ホモポリマー反復配列、真核生物複製起点、及び真核生物プロモーターエンハンサー配列からなる群から選択される構造化DNA配列を含む抗生物質マーカー不含挿入物、
b.配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4及び配列番号18からなる群から選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有するR6Kガンマ複製起点を含む、Pol III依存性複製起点、並びに
c.配列番号6と少なくとも95％の配列同一性を有するRNA-IN調節RNA-OUT RNAを含むRNA-OUT RNA選択マーカー
を含む組換えDNA分子。
［実施形態１７］前記RNA-OUT RNA選択マーカーが、配列番号5及び配列番号7からなる群から選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有するRNA-IN調節RNA-OUT機能性変異体である、実施形態16に記載の組換えDNA分子。
［実施形態１８］前記R6Kガンマ複製起点及び前記RNA-OUT RNA選択マーカーが、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、及び配列番号17からなる群から選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有するR6K起点-RNA-OUT RNA選択マーカー細菌複製-選択領域を含む、実施形態16に記載の組換えDNA分子。
［実施形態１９］前記構造化DNA配列が、ポリA反復、SV40複製起点、ウイルスLTR、レンチウイルスLTR、レトロウイルスLTR、トランスポゾンIR/DR反復、スリーピング・ビューティトランスポゾンIR/DR反復、AAV ITR、トランスポゾンITR、PiggyBacトランスポゾンITR、CMVエンハンサー、及びSV40エンハンサーからなる群から選択される、実施形態16に記載の組換えDNA分子。
［実施形態２０］前記組換えDNA分子が、ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、AAVベクター、Adベクター、非ウイルス性トランスポゾンベクター、スリーピング・ビューティトランスポゾンベクター、PiggyBacトランスポゾンベクター、Tol2トランスポゾンベクター、及びポリA含有mRNAベクターからなる群から選択される、実施形態16に記載の組換えDNA分子。

Claims

共有結合閉環状プラスミドを複製するための方法であって、以下のステップ：
a.以下：
i. Pol III依存性R6K複製起点、及びRNA-OUT RNA選択マーカーを含む骨格であって、1000bp未満である、上記骨格、及び
ii. 構造化DNA配列を含む挿入物
を含む共有結合閉環状プラスミドを含む細胞を提供するステップ、並びに
b.上記細胞を発酵プロセスに供するステップ
を含む、上記方法。
前記細胞が、遺伝子操作された、Repタンパク質を発現する大腸菌株である、請求項1に記載の方法。
前記細胞が、染色体に組み込まれたアラビノース誘導性CI857ts遺伝子を含む、請求項2に記載の方法。
Repタンパク質が、以下の変異：P42L；P106I；F107S；及びP113Sを含む、請求項3に記載の方法。
前記構造化DNA配列が、逆方向反復配列、定方向反復配列、ホモポリマー反復配列、真核生物複製起点及び真核生物プロモーターエンハンサー配列からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
前記挿入物がトランスポゾンベクターである、請求項1に記載の方法。
前記構造化DNA配列が、逆方向反復配列、定方向反復配列、又は真核生物プロモーターエンハンサー配列である、請求項6に記載の方法。
前記挿入物がトランスポザーゼベクターである、請求項1に記載の方法。
前記挿入物がAAVベクターである、請求項1に記載の方法。
前記構造化DNA配列が、逆方向反復配列である、請求項9に記載の方法。
前記挿入物がレンチウイルスベクターである、請求項1に記載の方法。
前記構造化DNA配列が、定方向反復配列又は真核生物複製起点である、請求項11に記載の方法。
前記Pol III依存性R6K複製起点が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4及び配列番号18からなる群から選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有する、請求項1に記載の方法。
前記RNA-OUT RNA選択マーカーが、配列番号5及び配列番号7からなる群から選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有するRNA-IN調節RNA-OUT機能性変異体である、請求項1に記載の方法。
前記構造化DNA配列が、ポリA反復、SV40複製起点、ウイルスLTR、レンチウイルスLTR、レトロウイルスLTR、トランスポゾンIR/DR反復、スリーピング・ビューティトランスポゾンIR/DR反復、AAV ITR、CMVエンハンサー、及びSV40エンハンサーからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
前記発酵プロセスが、アラビノースを含む培地中で細胞を増殖させることを含む、請求項1に記載の方法。
前記細胞が、遺伝子操作された、Repタンパク質を発現する大腸菌株であり、染色体に組み込まれたアラビノース誘導性CI857ts遺伝子を含み、前記構造化DNA配列が、ポリA反復、SV40複製起点、ウイルスLTR、レンチウイルスLTR、レトロウイルスLTR、トランスポゾンIR/DR反復、スリーピング・ビューティトランスポゾンIR/DR反復、AAV ITR、CMVエンハンサー、及びSV40エンハンサーからなる群から選択され、前記Pol III依存性R6K複製起点が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4及び配列番号18からなる群から選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有し、前記RNA-OUT RNA選択マーカーが、配列番号5及び配列番号7からなる群から選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有するRNA-IN調節RNA-OUT機能性変異体である、請求項1に記載の方法。
前記発酵プロセス後の前記共有結合閉環状プラスミドの収量が0.5g/L以上である、請求項17に記載の方法。
染色体に組み込まれたアラビノース誘導性CI857ts遺伝子を1コピー以上含む、遺伝子操作された大腸菌細胞。
変異Repタンパク質をさらに含み、変異Repタンパク質が、以下の変異：P42L；P106I；F107S；及びP113Sを含む、請求項19に記載の遺伝子操作された大腸菌細胞。
共有結合閉環状プラスミドをさらに含み、該共有結合閉環状プラスミドがPol III依存性R6K複製起点、及びRNA-OUT RNA選択マーカーを含む骨格を含み、該骨格が1000bp未満である、請求項20に記載の遺伝子操作された大腸菌細胞。
共有結合閉環状プラスミドをさらに含み、該共有結合閉環状プラスミドがPol III依存性R6K複製起点、及びRNA-OUT RNA選択マーカーを含む骨格を含み、該骨格が1000bp未満である、請求項19に記載の遺伝子操作された大腸菌細胞。
前記Pol III依存性R6K複製起点が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4及び配列番号18からなる群から選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有する、請求項22に記載の遺伝子操作された大腸菌細胞。
前記RNA-OUT RNA選択マーカーが、配列番号5及び配列番号7からなる群から選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有するRNA-IN調節RNA-OUT機能性変異体である、請求項22に記載の遺伝子操作された大腸菌細胞。
骨格及び挿入物を含む共有結合閉環状プラスミドであって、該骨格が、Pol III依存性R6K複製起点、及びRNA-OUT RNA選択マーカーを含み、該骨格が1000bp未満であり、該挿入物が構造化DNA配列を含む、上記共有結合閉環状プラスミド。
前記Pol III依存性R6K複製起点が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4及び配列番号18からなる群から選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有する、請求項25に記載の共有結合閉環状プラスミド。
前記RNA-OUT RNA選択マーカーが、配列番号5及び配列番号7からなる群から選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有するRNA-IN調節RNA-OUT機能性変異体である、請求項25に記載の共有結合閉環状プラスミド。
前記構造化DNA配列が、ポリA反復、SV40複製起点、ウイルスLTR、レンチウイルスLTR、レトロウイルスLTR、トランスポゾンIR/DR反復、スリーピング・ビューティトランスポゾンIR/DR反復、AAV ITR、CMVエンハンサー、及びSV40エンハンサーからなる群から選択される、請求項25に記載の共有結合閉環状プラスミド。
前記挿入物がトランスポゾンベクターである、請求項25に記載の共有結合閉環状プラスミド。
前記構造化DNA配列が、逆方向反復配列、定方向反復配列、又は真核生物プロモーターエンハンサー配列である、請求項29に記載の共有結合閉環状プラスミド。
前記挿入物がトランスポザーゼベクターである、請求項25に記載の共有結合閉環状プラスミド。
前記挿入物がAAVベクターである、請求項25に記載の共有結合閉環状プラスミド。
前記構造化DNA配列が、逆方向反復配列である、請求項32に記載の共有結合閉環状プラスミド。
前記挿入物がレンチウイルスベクターである、請求項25に記載の共有結合閉環状プラスミド。
前記構造化DNA配列が、定方向反復配列又は真核生物複製起点である、請求項34に記載の共有結合閉環状プラスミド。
前記Pol III依存性R6K複製起点が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4及び配列番号18からなる群から選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有し、前記RNA-OUT RNA選択マーカーが、配列番号5及び配列番号7からなる群から選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有するRNA-IN調節RNA-OUT機能性変異体である、請求項25に記載の共有結合閉環状プラスミド。