ES2950736T3 - Vectores de nanoplásmidos virales y no virales con una producción mejorada - Google Patents
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Abstract
Se proporciona un método para mejorar la replicación de un plásmido circular cerrado covalentemente. El método incluye proporcionar un plásmido circular covalentemente cerrado que tiene un origen de replicación dependiente de Pol I, y un inserto que incluye una secuencia de ADN estructurada seleccionada del grupo que consiste en secuencia repetida invertida, secuencia repetida directa, secuencia repetida homopolimérica, origen de replicación eucariótico o secuencia potenciadora del promotor eucariótico, en la que la secuencia de ADN estructurado está situada a una distancia de menos de 1000 pb del origen de replicación dependiente de Pol I en la dirección de replicación. El método también incluye modificar la molécula recombinante circular cerrada covalentemente de modo que el origen de replicación dependiente de Pol I se reemplace con un origen de replicación dependiente de Pol III, por lo que el origen de replicación dependiente de Pol III resultante tiene una replicación mejorada. . También se proporciona una molécula de ADN recombinante circular cerrada covalentemente libre de marcador antibiótico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Vectores de nanoplásmidos virales y no virales con una producción mejorada
Campo de la invención
La presente invención se refiere a métodos para mejorar el rendimiento y la calidad de fabricación de vectores virales y no virales, reducir la transfección asociada a la toxicidad, mejorar la transposición de vectores de transposones no virales, mejorar los títulos de envolturas de vectores virales, mejorar la expresión de genes codificados por vectores virales y no virales y para eliminar la transferencia de genes marcadores de selección antibiótico mediados por vectores virales y vectores no virales.
Antecedentes de la invención
Los plásmidos de E. coli han sido durante mucho tiempo una fuente importante de moléculas de DNA recombinante usadas por los investigadores y por la industria. Actualmente, el DNA de plásmidos se está haciendo cada vez más importante a medida que la siguiente generación de productos de biotecnología (por ejemplo, medicinas génicas y vacunas de DNA) entran en el campo de los ensayos clínicos y, finalmente, en el mercado farmacéutico. Las vacunas de DNA de plásmidos pueden encontrar aplicación como vacunas preventivas para enfermedades virales, bacterianas o parasitarias; como agentes inmunizantes para la preparación de productos de globulina hiperinmune; vacunas terapéuticas para enfermedades infecciosas o como vacunas para el cáncer. Los plásmidos son utilizados también en la terapia génica o en aplicaciones de sustitución génica, de modo que el producto génico deseado es expresado a partir del plásmido después de una administración a un paciente. Los plásmidos son utilizados también en vectores de transposones no virales para una terapia génica o para aplicaciones de sustitución génica, de modo que el producto génico deseado es expresado a partir del genoma después de la transposición, a partir de la integración del plásmido y el genoma. Los plásmidos son utilizados también en vectores virales para una terapia génica o para aplicaciones de sustitución génica, de modo que el producto génico deseado es empaquetado en una partícula de virus de transducción después de la transfección de una línea celular de producción y seguidamente es expresado a partir del virus en una célula diana después de una transducción viral.
Los plásmidos de vectores no virales y virales contienen normalmente un origen de replicación pMB 1, ColE1 o pBR322. Los derivados de números de copias elevados comunes tienen mutaciones que afectan a la regulación del número de copias, como una deleción ROP (gen represor o cebador), con una mutación de segundo sitio que aumenta el número de copias (por ejemplo, mutación del punto pMB 1 pUC G a A o ColE1 pMM1). Se pueden emplear temperaturas más elevadas (42° C) para inducir una ampliación de plásmidos selectiva con orígenes de replicación de pUC y pMM1.
Carnes, AE and Williams, JA, 2011 patente de EE.UU. 7943377 describen métodos para una fermentación de alimentación discontinua, en la que se hacen crecer células de E. coli que contienen plásmidos a una temperatura reducida durante parte de la fase de alimentación discontinua durante la cual se restringió la velocidad de crecimiento, seguida de una elevación de la temperatura y un crecimiento continuado a temperatura elevada con el fin de acumular plásmido; el ascenso de la temperatura a una velocidad de crecimiento restringida mejoró el rendimiento y la pureza del plásmido. Otros procedimientos de fermentación para la producción de plásmidos se describen por Carnes A.E. 2005 BioProcess Intl 3:36-44.
La técnica enseña que una de las limitaciones de la aplicación de terapias de plásmidos y vacunas de plásmidos son las preocupaciones por la seguridad de la agencia reguladora (por ejemplo, Food and Drug Administration, European Medicines Agency) en lo que respecta a: 1) la transferencia y replicación de plásmidos en la flora bacteriana endógena, o 2) la expresión de marcadores de selección codificados por plásmidos en células humanas, o flora bacteriana endógena. Adicionalmente, las normas de la agencia reguladora recomendaron la supresión de todas las secuencias no esenciales en un vector. Los plásmidos que contienen un origen de replicación derivado de MB1, ColE1 o pBR322 se pueden replicar promiscuamente en hospedantes de E. coli. Esto plantea una preocupación de seguridad en cuanto que un gen o antígeno terapéutico del plásmido será transferido y replicado en la flora endógena de un paciente. Idealmente, un plásmido terapéutico o de vacuna sería incompetente para la replicación en cepas de E. coli endógenas. Esto requiere la sustitución del origen de replicación derivado de pMB1, ColE1 o pBR322 con un origen de replicación que requiere una línea celular especializada para la propagación. También, las agencias reguladoras, como la e MeA y la FDA, tienen preocupaciones con la utilización de marcador de resistencia de antibióticos o marcador de proteínas o alternativos en una terapia génica y en vectores de vacunas génicas, debido a preocupaciones de que el gen (marcador de resistencia de antibióticos o marcador de proteínas) puede ser expresado en las células de un paciente. Idealmente, las terapias de plásmidos y las vacunas de plásmidos: 1) serían incompetentes para una replicación en cepas de E.coli endógenas, 2) no codificarían un marcador de selección basado en proteínas y 3) serían minimalizados para eliminar todas las secuencias no esenciales.
La técnica enseña además que una de las limitaciones de la aplicación de vectores de plásmidos es que la
duración de la expresión transgénica, a partir de vectores de plásmidos, se reduce debido a la inactivación de promotores mediada por la región bacteriana (es decir, la región que codifica el origen de replicación bacteriana y el marcador seleccionable) del vector (Chen ZY, Hc CY, Meuse L, Kay MA. 2004. Gene Ther 11:856-864; Suzuki M, Kasai K, Saeki Y. 2006. J Virol 80:3293-3300). Esto da lugar a una expresión transgénica de corta duración. Una estrategia para mejorar la duración de la expresión transgénica es separar la región bacteriana del plásmido. Por ejemplo, se han desarrollado vectores minicirculares que no contienen una región bacteriana. La supresión de la región bacteriana en vectores minicirculares mejoró la duración de la expresión transgénica (Chen et al., Supra, 2004). El los vectores minicirculares, la señal de poliadenilación de la región eucariota está covalentemente unida al promotor de la región replicación eucariota a través de un separador corto, normalmente de menos de 200 bp comprendido por los sitios de unión recombinados. Esta conexión (región separadora) puede tolerar una secuencia separadora mucho más larga, ya que mientras que los separadores largos > 1 kb de longitud dieron lugar a un silenciado de la expresión transgénica in vivo, los separadores más cortos ≤ 500 bp exhibieron unos modelos de expresión transgénica similares a los vectores de DNA minicirculares convencionales (Lu J, Zhang F, Xu S, Fire AZ, Kay MA. 2012. Mol Ther. 20:2111-9).
Williams, 2014. Plásmidos de DNA con expresión mejorada. La solicitud de patente internacional WO 2014035457 describe vectores de nanoplásmidos® minimalizados que utilizan la selección exenta de antibióticos de RNA-OUT y sustituyen el origen de replicación pUC de 1000 bp con un nuevo origen de R6K de 300 bp. La reducción de la conexión de la región separadora en los extremos 5' y 3' del cassette de expresión transgénica hasta < 500 bp, con cadenas principales de RNA-OUT con origen de R6K, mejoró la duración de la expresión respecto a vectores de DNA minicirculares convencionales expresados a partir de las enseñanzas de Lu et al., Supra, 2012.
El separador de selección exenta de antibióticos de tRNA con origen pUC del vector bFAR4 de 1,1 kb tiene una duración de la expresión mejorada en comparación con la región del separador del marcador de selección antibiótico de kanR con origen pUC de 2,2 kb Quiviger, M, Arfi A, Mansard D, Delacotte L, Pastor M, Scherman D, Marie C. 2014. Gene Therapy 21: 1001-1007). Esto muestra que puede ser obtenida una duración de expresión mejorada con algunas regiones bacterianas de hasta 1,1 kb.
La mejora del nivel de expresión en comparación con vectores de plásmidos se observa también con algunas regiones separadoras ≤ 1,1 kb. Por ejemplo, los derivados de pV AXl con la cadena bacteriana de 2 kb reducida a 1,2, 1,1 o 0,7 mostraron una expresión mejorada > 2 veces en comparación con el vector pVAXI parental (tabla 1). Los derivados de NTC8685 con la cadena principal de 1,5 kb reducida hasta 0,9 kb, 466 bp, o 281 bp (vectores Nanoplasmid®) mostraron una expresión mejorada de > 2 veces en comparación con el vector NTC 8685 parental (Tabla 2).
Esto muestra que puede ser obtenido un nivel de expresión mejorado con regiones bacterianas cortas de hasta 1,2 kb.
Tabla 1: Nivel de expresión de derivados de región separadora (SR) de vectores de expresión de mamíferos
Tabla 2: Nivel de expresión de derivados de la región separadora (SR) del vector de expresión de mamíferos NTC 8685
Diversos investigadores han identificado que los vectores minicirculares son superior de vectores de plásmidos para la producción de vectores AAV (rotulaciones de unidades de transducción mejoradas - Tabla 3) y vectores de transposones (transposición aumentada - Tabla 3). El rendimiento mejorado debido a la duración de expresión mejorada con vectores minicirculares de cadena corta debería ser observado también con vectores de plásmidos de cadena bacteriana corta de hasta 1,1 kb.
De hecho, se describió una transposición de tipo Bella durmiente mejorada 2 veces en células humanas con el vector de transposón pFAR4 SB de cadena bacteriana de 1,1 kb/ combinación de vectores de transposasa SB100x, en comparación con el vector de transposón SB de plásmido pT2 de cadena bacteriana de 2,8 kb/ combinación de vectores de transposasa/SB 100x (Pastor, M, Johnen S, Harmening N, Quiviger M, Pailloux J, Kropp, M, Walter P, Ivics Z, Izsvak Z, Thumann G, Scherman D. 2018 Molecular Therapy 11: 57-67).
Sin embargo, los vectores virales como AAV, vectores lentivirales y retrovirales y vectores de transposones contenían secuencias de DNA estructurado en sus terminaciones. Por ejemplo, los vectores de transposones de tipo Bella durmiente contienen secuencias de IR/DR flanqueantes, ITR que contienen vectores AAV y vectores lentivirales y retrovirales que contienen LTR flanqueantes. La estrecha proximidad del origen pUC a la secuencia de DNA estructurado da lugar a una terminación de replicación aberrante, dando lugar a intermedios de replicación que reducen de forma inaceptable la calidad de los plásmidos (Levy J. 2004. Patente de EE.UU. 6709844). Levy expone que se forman intermedios de replicación cuando cualquier origen de replicación de copias elevadas está a < 1 kb de una secuencia de DNA estructurado, como un potenciador LTR o IRES, pero no cuando el origen de replicación de copias está más allá de < 1,5 kb. Como el origen pUC en sí mismo es de 1 kb, no hay una configuración para preparar AAV de región bacteriana, vector de transposón lentiviral o retroviral que contenga el origen pUC, pero no está previsto que se produzcan intermedios de replicación.
Lu J, Williams JA, Luke J, Zhang F, Chu K, and Kay MA. 2017. Human Gene Therapy 28: 125-34 describen vectores de AAV de plásmidos mini-intrónicos (MIP) exentos de antibióticos y sugieren que los vectores AAV tienen una cadena de vector que ha sido retirada para crear un vector AAV de cadena corta. Los intentos de crear una región separadora de 6 o 10 bp de tipo minicircular en vectores AAV de plásmidos mini-intrónicos fueron tóxicos (véase la Tabla 7, nota a pie e) debido supuestamente a la creación de un palíndromo largo mediante esta yuxtaposición estrecha de las ITR AAV. Aunque se pueden preparar vectores de MIP con regiones separadoras < 1 kb, un inconveniente de la estrategia de intrones de MIP es que requiere la clonación de un intrón codificador de replicación y selección en la región eucariota, lo cual no es posible o deseado con muchos vectores.
Un inconveniente de la estrategia minicircular para crear vectores de AAV, lentivirales, retrovirales o de transposones bacterianos cortos es que los métodos para fabricar vectores minicirculares son caros y no pueden ser llevados fácilmente a escala. Para los vectores minicirculares, han sido desarrollados sistemas de fabricación basados en E. coli en los que después de la producción del plásmido, la región bacteriana y la región eucariota son separadas y circularizadas en forma de un minicírculo (región eucariota) y un círculo de región bacteriana a través de la acción de recombinasas de fagos o secuencias de reconocimiento en el plásmido. En algunos métodos, se utiliza seguidamente una enzima de restricción para digerir el círculo de la región bacteriana en un sitio único para eliminar esta dificultad para separar contaminantes. Estos procedimientos de producción son muy ineficaces. Por ejemplo, una fabricación óptima de vectores minicirculares produce solamente 5 mg de minicírculo por litro de cultivo (Kay MA, Hc CY, Chen ZY. 2010. Nat Biotechnol 28:1287-1289).
No han sido descritos métodos para la fabricación con rendimientos elevados de vectores de pFAR; este sistema utiliza un gen de tRNA supresor soportado en plásmido para complementar la mutación antisentido ámbar de TAG del gen thyA para complementar la auxotrofia de timidina y permitir el crecimiento celular en medios mínimos (Marie et al., Supra, 2010).
Se necesita una solución para desarrollar un vector de AAV, lentiviral, retroviral o de transposones que contenga regiones separadoras cortas, preferentemente de menos de 1000 bp que pueda ser eficazmente fabricado sin intermedios de replicación o una producción escasa. Estos vectores no deben codificar un
marcador de selección basado en proteínas y deben ser minimalizados para eliminar todas las secuencias no esenciales.
Sumario de la invención
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para mejorar la replicación de un plásmido circular covalentemente cerrado, que comprende las siguientes etapas:
a) proporcionar un plásmido circular covalentemente cerrad que comprende:
i. un origen dependiente de Pol I y
ii. un inserto que comprende una secuencia de DNA estructurado seleccionada entre el grupo que consiste en una secuencia repetida invertida, una secuencia repetida directa, una secuencia repetida homopolímera o un origen eucariota de replicación, de modo que la secuencia de DNA estructurado está ubicada a una distancia de menos de 1000 bp del origen de replicación dependiente de Pol I en la dirección de la replicación; y b) modificar el plásmido circular covalentemente cerrado del apartado a. de forma que el origen de replicación dependiente de Pol I es sustituido con un origen de replicación gamma de R6K, de modo que el plásmido circular covalentemente cerrado del origen de replicación gamma de R6K resultante tiene una replicación mejorada a partir del grupo que consiste en la producción reducida de intermedios de replicación y un número de copias de plásmidos aumentado con relación al plásmido circular covalentemente cerrado del apartado a, de modo que el origen de replicación gamma de R6K no requiere Pol I, de modo que la secuencia de DNA estructurado está ubicada a una distancia de menos de 1000 bp del origen de replicación gamma de R6K en la dirección de la replicación.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método para mejorar la replicación de un plásmido circular covalentemente cerrado, que comprende las siguientes etapas:
a. proporcionar un plásmido circular covalentemente cerrado que comprende:
i. una región de replicación-selección bacteriana que comprende un origen dependiente de Pol I de replicación y un marcador seleccionable de antibióticos y
ii. un inserto que comprende una secuencia de DNA estructurado seleccionada entre el grupo que consiste en una secuencia repetida invertida, una secuencia repetida directa, una secuencia repetida homopolímera, un origen de replicación eucariota, de modo que la secuencia de DNA estructurado está ubicada a una distancia de menos de 1000 bp del origen de replicación dependiente de Pol I en la dirección de la replicación; y b. modificar el plásmido circular covalentemente cerrado del apartado a. de forma que el marcador seleccionable de antibióticos sea sustituido con un marcador seleccionable de RNA y el origen de replicación dependiente de Pol I sea sustituido con un origen de replicación gamma de R6K, de modo que el plásmido circular cerrado covalentemente del origen de replicación gamma de R6K resultante tiene una replicación mejorada seleccionada entre el grupo que consiste en una producción reducida de intermedios de replicación y un número de copias de plásmidos aumentado con relación al plásmido circular covalentemente cerrado del apartado a, de modo que el origen de replicación gamma de R6K no requiere Pol I, de modo que la secuencia de DNA estructurado está ubicada a una distancia de menos de 1000 bp del origen de replicación gamma de R6K en la dirección de la replicación.
En una realización, el origen de replicación dependiente de Pol I puede ser seleccionado entre el grupo que consiste en un origen pMB1 y un origen ColE.
En una realización, dicho origen de replicación gamma de R6K puede ser un origen de replicación gamma de R6K con una identidad de secuencias de al menos 95% respecto a una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en ID SEC n° 1, ID SEC n° 2, ID SEC n° 4 y ID SEC n° 18.
En una realización, dicha secuencia de DNA estructurado puede ser:
a. una unidad de repetición homopolímera, de modo que la repetición homopolímera es una repetición de poliA; b. un origen de replicación eucariota, de modo de que el origen de replicación eucariota es un origen con origen ColE;
c. una secuencia repetida directa, de modo de que la secuencia repetida directa se selecciona entre el grupo que consiste en LTR lentiviral o una LTR retroviral; o
d. una secuencia repetida invertida, de modo que la secuencia repetida invertida se selecciona entre el grupo que consiste en una repetición IR/DR de transposones, una repetición IR/DR de transposones de tipo Bella durmiente, una ITR AAV, una ITR de transposones o una ITR de transposones o una ITR de transposones de reserva.
En una realización, dicho marcador seleccionables de RNA puede ser una variante funcional de RNA-OUT reguladora de RNA-IN con una identidad de secuencias de al menos 95% respecto a una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en ID SEC n° 5 y ID SEC n° 7.
En una realización, dicho marcador seleccionable de RNA puede ser un marcador seleccionable de RNA RNA-OUT que codifica un RNA de RNA-OUT regulador de RNA-IN con una identidad de secuencias de al menos 95% respecto a ID SEC n° 6.
En una realización, dicha región de replicación-selección bacteriana comprende un origen de replicación dependiente de Pol I y un marcador seleccionable de antibióticos puede ser sustituido con una región de replicación-selección bacteriana de un marcador seleccionable de RNA de RNA-OUT con origen de R6K dependiente de Pol III con una identidad de secuencias de al menos 95% respecto a una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en ID SEC n° 8, ID SEC n° 9, ID SEC n° 10, ID SEC n° 11, ID SEC n° 12, ID SEC n° 13, ID SEC n° 14, ID SEC n° 15, ID SEC n° 16 y ID SEC n° 17.
Los plásmidos con origen de replicación dependiente de Pol III proporcionados por la invención tienen una calidad y rendimiento de fabricación sorprendentemente mejorados respecto al vector de plásmido de expresión con origen de replicación derivado de pMB1, ColE1 o pBR322 parental.
Otros objetos y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de una consideración de los dibujos y la descripción que siguen.
Breve descripción de las figuras
Las Figs. 1A-1F exponen el origen de R6K (Figs. 1A, 1E y 1F), marcador seleccionable de RNA-OUT (Fig. 1B) y cadenas bacterianas de R6K-RNA-OUT de 14 y 3 CpG R6K-RNA-OUT (Figs. 1C y 1D);
Las Figs. 2A-2B exponen el vector de transposón de tipo Bella durmiente con origen pUC dependiente de Pol I (Fig. 2A) y el vector de transposón de tipo Bella durmiente con origen de R6K dependiente de Pol III (Fig. 2B); Las Figs. 3A - 3C exponen vectores AAV con origen pUC dependiente de Pol I (Figs. 3A y 3B) y un vector AAV con origen de R6K dependiente de Pol III (Fig. 3C); y
Las Figs. 4A- 4F exponen vectores de mRNA que codifican repeticiones A60 poliA con origen pUC dependiente de Pol I (Figs. 4A- 4B), un vector de mRNA que codifica repeticiones de A60 poliA con origen de R6K dependiente de Pol III (Fig. 4C), vectores de mRNA que codifican repeticiones de A99 poliA con origen pUC dependientes de Pol I (Figs. 4D - 4E) y un vector de mRNA que codifica repeticiones de A99 poliA con origen de R6K dependiente de POL III (Fig. 4F).
Tabla 1: nivel de expresión de derivados de la región separadora (SR) de vectores de expresión de mamíferos pVAX1
Tabla 2: nivel de expresión de derivados de la región separadora (SR)de vectores de expresión de mamíferos NTC8685
Tabla 3: aplicaciones minicirculares con diversas plataformas de vectores virales y no virales
Tabla 4: vectores de marcadores de selección de RNA-OUT conn origen de R6K flanqueados por sitios de clonación múltiples pNTC
Tabla 5: vectores lentivirales con origen SV40: rendimientos/calidad de producción en frasco de agitación con origen pUC frente a R6K
Tabla 6: vectores de transposón de tipo Bella durmiente: rendimientos/calidad de producción en frascos de agitación con origen pUC frente R6K
Tabla 7: vectores AAV: rendimientos/calidad de producción en frascos de agitación con origen pUC frente a R6K
Tabla 8: rendimientos/calidad de fermentación de DH5a HyperGRO con origen pUC frente a R6K
Tabla 9: vectores helper AAV: rendimientos/calidad de producción de plásmidos con origen pUC frente a R6K ID SEC n° 1: origen gamma de R6K
ID SEC n°2: origen gamma de CpG R6K
ID SEC n° 3: origen gamma de R6K exento de CpG
ID SEC n° 4: origen gamma de R6K extendido
ID SEC n° 5: marcador seleccionable de RNA-OUT
ID SEC n° 6: RNA represor antisentido de RNA-OUT
ID SEC n° 7 : marcador seleccionable de RNA-OUT de 2CpG
ID SEC n° 8: región bacteriana de RNA-OUT gamma con origen de R6K flanqueada por sitios de restricción NheI and KpnI
ID SEC n° 9: región bacteriana de RNA-OUT de 2 CpG con origen gamma de R6K de 1 CpG flanqueada por sitios de restricción NheI y KpnI
ID SEC n° 10: cassette de clonación policonector de trpA R6K-RNA-OUT policonector de pNTC-NP1: EcoRI/HindIII
ID SEC n° 11: cassette de clonación policonector de trpA R6K-RNA-OUT policonector de pNTC-NP2: EcoRI/HindIII
ID SEC n°12: cassette de clonación de policonector de trpA R6K-RNA-OUT policonector de pNTC-NP3: EcoRI/HindIII
ID SEC n°13: cassette de clonación policonector de trpA R6K-RNA policonector de pNTC-NP4: EcoRI/HindIII ID SEC n° 14: cassette de clonación de policonector de trpA R6K-RNA-OUT de policonector de pNTC-NP5 ID SEC n° 15: cassette de clonación policonector trpA R6K-RNA-OUT policonector de pNTC-NP6
ID SEC n° 16: cassette de clonación policonector de trpA R6K-RNA-OUT policonector de pNTC-NP7: BssHII-BssHII
ID SEC n° 17: cassette de clonación policonector de R6K-RNA-OUT policonector de pNTC-3xCpG NP1: HindIII-EcoRI
ID SEC n° 18: origen gamma de R6K (iterón 7)
ID SEC n° 19: repetición iterones de 22 bp con origen gamma de R6K
ID SEC n° 20: repetición iterones de 22 bp con origen gamma de R6K
ID SEC n° 21: repetición iterones de 22 bp con origen gamma de R6K
ID SEC n° 22: repetición iterones de 22 bp con origen gamma de R6K
ID SEC n° 23: repetición iterones de 22 bp con origen gamma de R6K
Definición de términos
Vector AAV: vector de virus adeno-asociado, un vector viral episomal. Incluye vectores de virus adenoasociados autocomplementarios (sc) (scAAV) y vectores de virus adenoasociados de cadena única (ss) (scAAV)
AF: exento de antibióticos
amp: ampicilina
ampR: gen de resistencia a ampicilina
marcador seleccionable de antibióticos: un gen que confiere resistencia a un antibiótico, por ejemplo, gen de resistencia a la ampicilina, gen de resistencia a la kanamicina, gen de resistencia al cloranfenicol, gen de resistencia a la tetraciclina
aproximadamente: como se usa en la presente memoria descriptiva, el término “aproximadamente” o “alrededor de”, como se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es igual o similar a un valor de referencia establecido
región bacteriana: región de un vector de plásmido necesaria para la propagación y selección en el hospedante bacteriano
bp: pares de bases
ccc: circular covalentemente cerrado
cl: represor Lambda
clTs857: represor Lambda que incorpora adicionalmente una mutación de C a T (Ala a Thr) que confiere sensibilidad a la temperatura. cITs857 es un represor funcional a 28-30° C pero es mayormente inactivo a 37 42° C. También denominado CI857
CatR: gen de resistencia a cloranfenicol
cmv: citomegalovirus
metilación dem: metiltransferasa de E. coli que metiló las secuencias CC(A/T)GG en la posición C5 de la segunda citosina
replicón de DNA: un elemento genético que puede replicar bajo su propio control; ejemplos incluyen plásmidos, cósmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BACs), bacteriófagos, vectores virales y sus híbridos E. coli: Escherichia coli, una bacteria gran negativa
EGFP: proteína fluorescente verde potenciada
EP: electroporación
Vector de expresión eucariota: un vector para la expresión de mRNA, antígenos de proteínas, agentes terapéuticos de proteínas, shRNA, RNA o genes de microRNA en un organismo eucariota diana usando promotores de polimerasa I, II o III de RNA
Región eucariota: la región de un plásmido que codifica secuencias eucariotas y/o secuencias requeridas para la función de plásmidos en el organismo diana. Esto incluye la región de un vector de plásmido necesario para la expresión de uno o más transgenes en el organismo diana que incluye potenciadores Pol II de RNA, promotores, transgenes y secuencias de poliA. Esto incluye también la región de un vector de plásmido requerida para la expresión de uno más transgenes en el organismo diana usando promotores Pol I de RNA o Pol III de RNA, transgenes expresados Pol III de RNA o RNAs. La región eucariota puede incluir opcionalmente otras secuencias funcionales, como terminadores transcripcionales eucariotas, estructuras desestabilizadas dúplex de DNA inducidas por superenrollamiento (SIDD), S/MARs, elementos de contorno, etc. En un vector lentiviral o retroviral, la región eucariota contiene LTRs de repetición directa flanqueante, en un vector AAV la región eucariota contiene repeticiones terminales invertidas flanqueantes, mientras que en un vector de transposón las regiones eucariotas contienen repeticiones terminales invertidas de transposones flanqueantes o terminaciones de IR/DR (por ejemplo, bella durmiente). En vectores de integración de genoma, la región eucariota puede codificar brazos de homología para dirigir una integración a diana
Exón: una secuencia de nucleótidos codificada por un gen que es transcrito y está presente en un producto de mRNA maduro después de que se ha completado la escisión de RNA para separar intrones
Vector de expresión: un vector para la expresión de genes de mRNA, antígenos de proteínas, agentes terapéuticos de proteínas, shRNA, RNA o microRNA en un organismo diana
g: gramos, kg para kilogramo
gen de interés: gen que va a ser expresado en el organismo diana. Incluye genes de mRNA que codifican antígenos de proteínas o péptidos, agentes terapéuticos de proteínas o péptidos y mRNA, shRNA, RNA o
microRNA que codifican agentes terapéuticos de RNA y mRNA, shRNA, RNA o microRNA que codifican vacunas de RNA, etc.
h: hora(s)
ID: intradérmico
IM: intramuscular
Respuesta inmune: respuestas celulares de reactivos antígenos (por ejemplo, células T de reactivos antígenos) o de anticuerpos (por ejemplo, IgG reactivo antígeno)
Intrón: Una secuencia de nucleótidos codificada por un gen que es transcrito y sustancialmente retirado de un producto de mRNA maduro mediante escisión de RNA
IR/DR: repeticiones invertidas que están cada una 2 veces repetidas directamente. Por ejemplo, repeticiones de IR/DR de transposones de tipo Bella durmiente
Iterón: secuencias de DNA directamente repetidas en un origen de replicación que son necesarias para el inicio de la replicación. Las repeticiones de iterones con origen de R6K son de 22 bp
ITR: terminación invertida
Kan: kanamicina
Kan R: gen de resistencia a la kanamicina
Kd: kilodáltones
Secuencia kozak: secuencia de DNA de consenso optimizada gccRccATG (R = G o A) inmediatamente en dirección ascendente de un codón de partida ATG que asegura un inicio de traducción eficiente. Un sitio Sall (GTCGAC) inmediatamente en dirección al ascendente del codón de partida ATG (GTCGACATG) es una secuencia kozac efectiva
Vector lentiviral: vector viral integrador que puede infectar células que se dividen y que no se dividen. También se denomina plásmido de transferencia lentiviral. El plásmido codifica una unidad de expresión flanqueada por LTR lentiviral. El plásmido es transfectado en forma de producción de células junto con plásmidos de envoltura y de empaquetamiento lentivirales necesarios para preparar partículas virales
Vector de envoltura lentiviral: plásmido que codifica glicoproteína de envoltura
Vector de empaquetamiento lentiviral: uno o dos plásmidos que expresan funciones gag, pol, Rev necesarios para empaquetar el vector de transferencia lentiviral.
Minicírculo: derivados de plásmidos circulares covalentemente cerrados en los que la región bacteriana ha sido retirada del plásmido parental mediante recombinación específica del sitio in vivo o in vitro o digestión/ligadura de restricción in vitro. Los vectores minicirculares son incompetentes para la replicación en células bacterianas mRNA: RNA mensajero
mSEAP: fosfatasa alcalina secretada por múridos
NA: no aplicable
Vector Nanoplasmid®: vector que combina un marcador seleccionable de RNA con un origen de replicación relacionado de R6K, ColE2 o ColE2. Por ejemplo, vectores NTC9385C, NTC9685C, NTC9385R, NTC9685R descritos por Williams, Supra, 2014
NTC8385: los plásmidos NTC8385, NTC8485 y NTC8685 son vectores con origen pUC exentos de antibiótico que contienen un marcador seleccionable de RNA(RNA-OUT) corto en lugar de un marcador de resistencia a antibióticos como kanR. La creación y aplicación de estos vectores exentos de antibióticos basados en RNA-OUT se describe por Williams, JA 2008 solicitud de patente internacional WO2008153733
NTC8485: NTC8485 es un vector con origen pUC exento de antibióticos que contiene un marcador seleccionable de RNA corto (RNA-OUT) en lugar de un marcador de resistencia a antibióticos como kanR. La creación y aplicación de NTC8485 se describe por Williams, JA 2010 Solicitud de patente de EE.UU.
20100184158
NTC8685: NTC8685 es un vector con origen pUC exento de antibióticos que contiene un marcador seleccionable de RNA corto (RNA-OUT) en lugar de un marcador de resistencia a antibióticos como kanR. La creación y aplicación de NTC8685 se describe por Williams, Supra, 2010
NTC9385R: El vector Nanoplasmid® NTC9385R es descrito por Williams, Supra, 2014 tiene una región bacteriana - Kpnl de RNA-OUT con origen de R6K de terminación codificada por Nhel-trpA (ID SEC n° 8) conectada a través de los sitios flanqueantes Nhel y Kpnla la región eucariota
OD600: Densidad óptica a 600 nm
PAS: sitio de ensamblaje primosomal. Cebado de síntesis de DNA en un sitio ID SEC n° 6 de DNA de cadena única. PAS de 0X174: secuencia de horquilla de DNA que se une a priA que, a su vez recluta las proteínas restantes para formar el preprimosoma [priB, dnaT, recluta de dnaB (suministrado por dnaC)],que seguidamente recluta también primasa (dnaG) que a su vez, finalmente constituye un sustrato de RNA corto para DNA-polimerasa I. PAS de tipo ABC: horquilla de dna que se une a dnaA, recluta dnaB (suministrado por dnaC) que a su vez recluta también primasa (dnaG) que a su vez, finalmente, constituye un sustrato de RNA corto para DNA-polimerasa I. Por ejemplo, el sitio de ensamblaje primosomal ssiA exento de CpG de plásmido de R6K o sitios de ensamblaje primosomales alternativos de tipo 0X174 o de tipo ABC
PAS-BH: sitio de ensamblaje primosomal en la cadena pesada (conductora)
Región de PAS-BH: región con origen pBR322 entre ROP y PAS-BL (aproximadamente pBR3222067-2351) PAS-BL: sitio de ensamblaje primosomal de la cadena ligera (retrasada)
PBS: Solución salina tamponada con fosfato
PCR: reacción de cadena de polimerasa
pDNA: DNA de plásmido
transposón de tipo PiggyBac: transposón de PB. Un sistema de transposones que integra un transposón PB flanqueado por ITR en el genoma mediante un corte simple y mecanismo de pegado mediado por PB transposasa. El vector de transposón contiene normalmente un cassette de expresión de promotor-transgenpoliA entre PB ITRs que es cortado e integrado en el genoma
vector pINT pR μL: el vector de expresión de integración pINT pR μL attHK022 se describe por Luke et al., 2011 Mol Biotechnol 47:43. El gen diana que va a ser expresado es clonado en dirección ascendente del promotor μL. El vector codifica el represor CI8587 inducible por temperatura, permitiendo una expresión génica dirigida a diana inducible por calor
Promotor Pl: promotor Lambda izquierdo. Pl es un promotor fuerte que es reprimido por el represor cl que se une a sitios de unión de represores OL1, OL2 y OL3. El represor CI857 sensible a la temperatura permite el control de la expresión génica mediante inducción de calor, ya que a 30° C el represor CI857 es funcional y reprime la expresión génica, pero a 37-42° C el represor es inactivado por lo que la expresión del gen prosigue Promotor Pl (OL1 G a T): Promotor Lambda izquierdo. Pl es un promotor fuerte que es reprimido por el represor cl que se une a sitios de unión a represores OL1, OL2 y OL3. El represor CI857 sensible a la temperatura permite el control de la expresión génica mediante inducción de calor, ya que a 30° C el represor CI857 es funcional y reprime la expresión génica, pero a 37-42° C el represor es inactivado por lo que la expresión del gen continúa. El represor cl que se une a OL1 es reducido por la mutación de OL1 G a T dando lugar a una actividad aumentada del promotor a 30° C y 37-42° C, como se describe por Williams, Supra, 2014.
Plásmido: una molécula de DNA extracromosómico separada del DNA cromosómico que es capaz de replicarse independientemente del DNA cromosómico
Número de copias de plásmido: El número de copias de un plásmido por célula. Los aumentos en el número de copias del plásmido aumentan el rendimiento de producción de plásmido.
Pol: polimerasa
Pol I: polimerasa I de Escherichia coli
Origen de replicación dependiente de Pol I: Un origen de replicación que requiere Pol I, por ejemplo, el pMB1,
ColE1 o pBR322 o derivados como el origen pUC de copias elevadas. Para estos orígenes, el cebador de RNAII forma un RNA: el bucle R del DNA es escindido por RNasa H para crear un cebador para la síntesis de DNA dirigida por DNA Pol I. La síntesis de DNA lo convierte seguidamente en DNA Pol III. Numerosos orígenes de replicación de Pol I adicionales son conocidos en la técnica, muchos de los cuales se resumen en la publicación de Solar et al., 1998 Microbiol. Mol. Biol. Rev 62:434-464
Pol III: DNA-polimerasa III de Escherichia coli
Origen de replicación dependiente de Pol III: Un origen de replicación que no requiere Pol I, por ejemplo, el origen de replicación gamma de R6K dependiente de proteínas REP. Numerosos orígenes de replicación dependientes de PolII adicionales son conocidos en la técnica, muchos de los cuales son resumidos en la publicación de Solar et al., Supra, 1998
poliA: Señal o sitio de poliadenilación. La poliadenilación es la adición de una cola de poli(A) a una molécula de RNA. La señal de poliadenilación contiene el resto de secuencias reconocido por el complejo de escisión de RNA. La mayoría de las señales de poliadenilación humana contienen un resto AAUAAA y secuencias conservadas en 5' y 3' al mismo. Las señales de polyA comúnmente utilizadas son derivadas de la globina p de conejo, hormona de crecimiento bovina, señales de polyA de SV40 temprano o SV40 tardío
Origen pUC: Origen de replicación derivado de pBR322, con transición de G a A que aumenta el número de copias a temperatura elevada y la deleción del regulador negativo de ROP
Exento de pUC: plásmido que no contiene el origen pUC. Pueden estar incluidos fragmentos no replicadores del origen pUC, por ejemplo, el marcador seleccionable de RNAI
Plásmido de pUC: plásmido que contiene el origen pUC
Plásmido de R6K: vectores NTC9385R, NTC9685R, NTC9385R2-O1, NTC9385R2-O2, NTC9385R2a-01, NTC9385R2a-02, NTC9385R2b-01, NTC9385R2b-O2, NTC9385Ra-01, NTC9385Ra-02, NTC9385RaF, y NTC9385RbF así como modificaciones y vectores alternativos que contienen un origen de replicación de R6K que fueron descritos por Williams, Supra, 2014. Los vectores de R6K alternativos conocidos en la técnica incluyen, pero sin limitación vectores pCOR (Gencell), vectores libres de pCpG (Invivogen) y vectores de la Universidad de Oxford que incluyen pGM169
Origen de replicación de R6K: una región que es específicamente reconocida por la proteína R6K Rep para iniciar la replicación de DNA. Incluye, pero sin limitación la secuencia con origen de replicación gamma de R6K descrita como ID SEC n° 1, ID SEC n° 2, ID SEC n°4 y ID SEC n°18. También, incluye tres versiones de CpG (por ejemplo, ID SEC n° 3) como se describe por Drocourt et al., patente de Estados Unidos 7244609 Región bacteriana RNA-OUT del origen de replicación de R6K: contiene un origen de replicación de R6K para la propagación del marcador seleccionable de RNA-OUT (por ejemplo, ID SEC n° 8, ID SEC n°9, ID SEC n°10, ID SEC n°11, ID SEC n° 12, ID SEC n° 13, ID SEC n° 14, ID SEC n° 15, ID SEC n° 16, ID SEC n° 17) Rep: replicación
Intermedios de replicación: fragmento de DNA lineal que resultan de la terminación prematura de la replicacón de plásmidos
Plásmido dependiente de proteína Rep: Un plásmido en el que la replicación es dependiente de una proteína de replicación (Rep) proporcionada en Trans . Por ejemplo, plásmidos con origen de replicación relacionado de R6K, un origen de replicación ColE2-P9 y un origen de replicación relacionado con ColE2 en los que la proteína Rep es expresada a partir del genoma de la cepa hospedante. Numerosos plásmidos dependientes de proteínas Rep adicionales son conocidas en la técnica, a muchos de los cuales se resumen en la publicación de Solar et al., Supra, 1998
Vector retroviral: Vector viral integrador que puede infectar células que se dividen. También se denomina plásmido de transferencia. El plásmido codifica la unidad de expresión flanqueada por LTR retroviral. El plásmido de transferencia es transfectado en células de producción a lo largo de plásmidos de envoltura y de empaquetamiento requeridos para preparar partículas virales
Vector de envoltura retroviral: glicoproteína de envoltura que codifica plásmido
Vector de empaquetamiento retroviral: plásmido que codifica genes retrovirales gag Pol para empaquetar el vector de transferencia retroviral
RNA-IN: RNA-IN codificado por secuencia de inserción 10 (IS10), un RNA complementario y antisentido
respecto a un RNA RNA-OUT. Cuando el RNA-IN es clonado en el líder sin traducir de un mRNA, la reasociación de RNA-IN a RNA-OUT reduce la traducción del gen codificado en dirección descendente de RNA-IN
Marcador seleccionable regulado por RNA-IN: Un marcador seleccionable regulado por RNA-IN genómicamente expresado. En presencia de RNA represor antisentido de RNA-OUT portado por plásmido (ID SEC n° 6), se reprime la expresión de una proteína codificada en dirección ascendente de RNA-IN. Un marcador seleccionable regulado de RNA-IN está configurado de forma que el RNA-IN regula 1) una proteína que es letal o tóxica para dicha célula por sí misma generando una sustancia tóxica (por ejemplo, SacB) o 2) una proteína represora que es letal o tóxica para dicha célula bacteriana reprimiendo la transcripción de un gen que es esencial para el crecimiento de dicha célula (por ejemplo, gel esencial murA regulado por el gen represor tetR de RNA - IN)). Por ejemplo, las líneas celulares RNA-IN-SacB genómicamente expresadas para la selección/propagación de plásmido de RNA-OUT son descritas por Williams, Supra, 2008. Marcadores de selección alternativos descritos en la técnica pueden sustituir a SacB
RNA-OUT: RNA-OUT codificada por secuencia de inserción 10 (IS 10), un RNA antisentido que se hibrida y reduce la transcripción del gen transposones expresado en dirección descendente de RNA-IN. La secuencia de RNA RNA-OUT (ID SEC n° 6) y líneas celulares de RNA-IN-SacB genómicamente expresadas en SacB de RNA-IN complementario pueden ser modificadas para incorporar pares de unión de RNA-IN/RNA-OUT funcionales alternativos, como los descritos por Mutalik et al., 2012 Nat Chem Biol 8:447 que incluyen, pero sin limitación el par RNA-OUT A08/ RNA-IN S49, el par RNA-OUT A08/RNAIN S08 y las modificaciones exentas de CpG de RNA-OUT A08 que modifica la secuencia 5' TTCGC de RNA-OUT a una secuencia que no es de CpG. Un ejemplo de un marcador de selección de RNA-OUT exento de CpG, en el que dos restos de CpG en el RNA de RNA-OUT (uno de los cuales está presente en la región complementaria de RNA-IN) están separados, fue descrito por la publicación de Williams 2015. Réplicative minicircle vectors with improved expression. Solicitud de patente de EE.UU. 2015/0275221. Se puede utilizar una multitud de sustituciones alternativas para retirar los dos restos de CpG (mutación de cada CpG a CpA, CpC, CpT, ApG, GpG, o TpG) para preparar RNA-OUT exento de CpG
Marcador seleccionable de RNA-OUT: Un fragmento de DNA de marcador seleccionable de RNA-OUT que incluye promotor de transcripción de E. coli y secuencias terminadoras que flanquean un RNA de RNA-OUt . Un marcador seleccionable de RNA-OUT, que utiliza el promotor de RNA-OUT y secuencias terminadoras que está flanqueado por sitios de enzimas de restricción DraIII y Kpnl y líneas celulares de RNA-IN-SacB diseñadoras genómicamente expresadas para la propagación de plásmido de RNA-OUT son descritas por Williams, Supra, 2008. El promotor de RNA-OUT y las secuencias terminadoras en ID SEC n° 5 que flanquean el RNA de RNA-OUT (ID SEC n° 6, Fig. 1B) pueden estar sustituidas con promotor heterólogo y secuencias terminadoras. Por ejemplo, el promotor de r NA-OUT puede estar sustituido con un promotor exento de CpG conocido en la técnica, por ejemplo, el promotor I-EC2K o los promotores p5/6 5/6 o P5/6 6/6 descritos por Williams, Supra, 2008. Un marcador seleccionable de RNA-OUT de dos CpG en el que dos restos de CpG en el promotor de RNA-OUT son retirados se proporciona como la ID SEC n° 7. Un ejemplo de una unidad de transcripción de RNA-OUT exenta de CpG, en la que los dos restos de CpG en el RNA de RNA-OUT (uno de los cuales está presente en la región complementaria de RNA-IN) y los dos restos de CpG en el promotor de RNA-OUT están retirados se describió por Williams, Supra, 2015. Los vectores que incorporan marcador seleccionable de RNA-OUT exento de CpG pueden ser seleccionados para una resistencia a la sacarosa usando líneas celulares de RNA-IN-SacB Para la propagación de plásmido de RNA-OUT descrito por Williams, Supra, 2008. Alternativamente, la secuencia de RnA-IN en estas líneas celulares puede ser modificada para incorporar el cambio de uno bp necesario para una perfecta coincidencia de la región de RNA-OUT exenta de CpG complementaria a RNA-IN.
Promotor de RNA polimerasa II: promotor que recluta RNA polimerasa II para sintetizar mRNAs, mayormente RNAs nucleares pequeños y microRNAs. Por ejemplo, promotores constitutivos como el promotor CMV humano o de múridos, promotor de factor 1 de alargamiento (EF1), promotor de p-actina de pollo, promotor de p-actina de otras especies, el promotor de factor-1 de alargamiento a (EF1 a), el promotor de fosfogliceroquinasa (p Gk ), el promotor del virus de sarcoma de Rous (RSV), el promotor del albumina de suero humano (SA), el promotor del virus formador de foco del bazo (SFFV), el promotor de antitripsina a-1 (ATT), el promotor de globulina de unión a tiroxina (TBG), el promotor del citocromo T450 E21 (CYP2E1), etc. Los vectores pueden utilizar también promotores de combinación como el promotor potenciador de p-actina/CMV de pollo (CAG), los elementos potenciadores derivados de CMV humano o de múridos combinados con promotores del factor de alargamiento 1 a (EF1 a), versiones exentas de CpG de los elementos potenciadores derivados de CMV humano o de múridos combinados con los promotores del factor de alargamiento 1 a (EF1 a), el promotor de albúmina combinado con un potenciador MERII de a-cetoproteína, etc., o la diversidad de promotores específicos o inducibles de tejidos conocidos en la técnica como los promotores específicos musculares quinasa de creatina muscular (MCK) y C5-12 o la apolipoproteína promotora específica hepática A-1 (ApoAI), etc.
Promotor de RNA polimerasa III: Promotor que recluta RNA polimerasa III para sintetizar tRNAs, RNA ribosomal
5s y otros RNAs pequeños. Por ejemplo, promotores de clase I como el promotor de rRNA 5s, promotor de clase II como promotores de tRNA, promotores de clase III como el promotor de RNA nuclear pequeño U6 o el promotor de RNasa nuclear P H1, etc.
Marcador seleccionable de RNA: un marcador seleccionable de RNA es un RNAno traducido expresado portado en plásmido que regula un gen diana expresado cromosómicamente para proporcionar la selección. Este puede ser un tRNA supresor de no sentido protado en plásmido que regula una diana cromosómica seleccionable supresible de no sentido como se describe por Crouzet J y Soubrier F 2005 patente de EE.UU.
6.977.174. Este puede ser también un RNA represor antisentido portado en plásmido, una lista no limitante incluye RNA-OUT que reprime dianas reguladas por RNA-IN (Williams, Supra, 2008), RNAI codificado en un origen de plásmido pMB1 que reprime dianas reguladas por RNAII (Grabherr R, Pfaffenzeller I. 2006, solicitud de patente de EE.UU. US20060063232; Cranenburgh RM. 2009; patente de EE.UU. 7.611.883), RNAI codificado en origen por pMU720 de plásmido IncB que reprime dianas reguladas por RNA II (Wilson IW, Siemering KR, Praszkier J, Pittard AJ. 1997. J Bacterial 179:742-53), Sok del lugar de ParB que reprime dianas reguladas por Hok, FlmB del lugar Flm de plásmido que reprime dianas reguladas por FlmA (Morsey MA, 1999 patente de EE.UU. US5922583). Un marcador seleccionable de RNA puede ser otros RNAs represores antisentido naturales conocidos en la técnica como los descritos por Wagner EGH, Altuvia S, Romby P. 2002. Adv Genet 46:361-98 y Franch T, y Gerdes K. 2000. Current Opin Microbiol 3:159-64. Un marcador seleccionable de RNA puede ser también un RNAs represores tratados por ingeniería genética como andamiajes de SgrS, MicC o MicF expresados en RNAs pequeños sintéticos como se describe por Na D, Yoo SM, Chung H, Park H, Park JH, Lee SY. 2013. Nat Biotechnol 31:170-4. Un marcador seleccionable de RNA puede ser también un RNA represor tratado por ingeniería genética como parte de un marcador seleccionable que reprime un RNA diana fusionado a un gen diana para ser regulado como SacB, como se describe por Williams, Supra, 2015
ROP: represor de cebador
RSM: marcador seleccionable de RNA
SacB: gen estructural que codifica levansucrasa de Bacillus subtilis. La expresión de SacB en bacterias gran negativas es tóxica en presencia de sacarosa
SD: desviación típica
SEAP: fosfatasa alcalina secretada
Marcador seleccionable: un marcador seleccionable, por ejemplo, un gen de resistencia a la kanamicina o marcador seleccionable de RNA
Marcador de selección: Un marcador seleccionable, por ejemplo, gen de resistencia a la kanamicina o un marcador seleccionable de RNA
SIDD: Estructuras desestabilizadas doble de DNA inducidas por superenrollamiento (SIDD). Estos sitios, cuando son incorporados en un vector, pueden alterar la susceptibilidad de otras secuencias en el vector que va a ser desestabilizado. Esto puede alterar la función. Por ejemplo, la adición de un sitio de SIDD a un vector de expresión puede reducir la desestabilización helicoidal de un promotor. Esto puede aumentar o disminuir la actividad del promotor, dependiendo del promotor, ya que algunos promotores tienen una expresión aumentada con la desestabilización helicoidal del promotor, mientras que otros tienen una expresión reducida con la desestabilización helicoidal del promotor
shRNA: RNA de horquilla corto
S/MAR: región unida a andamiaje/matriz. Secuencias eucariotas que median en la unión de DNA a la matriz nuclear
Transposón de tipo Bella durmiente: transposón SB. Un sistema de transposones que integra un transposón de SB flanqueado por IR/DR en el genoma mediante un corte simple y mecanismo de pegado mediado por transposasa de SB. El vector de transposón contiene normalmente un cassette de promotor-transgen-poliA entre las IR/DRs que es escindido e integrado en el genoma
Región separadora: como se usa en la presente memoria descriptiva, una región separadora es la región que conecta los extremos en 5' y 3' de las secuencias de la región eucariota. Los extremos 5' y 3' de la región eucariota están separados normalmente por el origen de replicación bacteriana y el marcador seleccionable bacteriano en vectores de plásmidos (región bacteriana) por lo que muchas regiones separadoras consisten en la región bacteriana. En el origen dependiente de Pol III de los vectores de replicación de la invención, la región separadora tiene preferentemente menos de 1000 bp
SR: región separadora
ssi: secuencias de inicio encadenadas
Secuencia de DNA estructurado: como se usa en la presente memoria descriptiva, una secuencia de DNA que es capaz de formar estructuras secundarias que inhiben la replicación (Mirkin and Mirkin, 2007. Microbiology and Molecular Biology Reviews 71: 13-35). Esto incluye, pero sin limitación, repeticiones invertidas, políndromos, repeticiones directas, IR/DRs, repeticiones homopolímeras o potenciadores de promotores eucariotas, u origen de replicaciones eucariotas que contienen repeticiones.
Origen SV40: DNA genómico 40 de virus de simio que contiene el origen de replicación
Potenciador de SV40: DNA genómico 40 de virus de simios que contiene 72 bp y, opcionalmente, repeticiones de potenciadores de 21 bp
Antígeno diana: proteína inmunógena o epitopo péptido o combinación de proteínas y epitopos, contra los cuales se puede disponer una respuesta inmune. Los antígenos diana pueden ser derivados de un agente patógeno para una enfermedad infecciosa o aplicaciones de alergias o derivada de un organismo hospedante para aplicaciones como enfermedades de cáncer, alergia o enfermedades autoinmunes. Los antígenos dianas están bien definidos en la técnica. Algunos ejemplos son descritos por Williams, Supra, 2008
Tampón de TE: una solución que contiene Tris-aproximadamente 10 mM, pH 8 y EDTA 1 mM
TetR: gen de resistencia a la tetraciclina
Transposón Tol2: Un sistema de transposones que integra un transposón Tol2 flanqueado por ITR en el genoma mediante un corte simple y mecanismo de pegado mediado por Tol2 transposasa. El vector de transposón contiene normalmente un cassette de expresión de promotor-transgen-poliA entre las Tol2 ITRs que es escindido e integrado en el genoma
Terminador de transcripción: Bacteriano: una secuencia de DNA que marca el final de un gen u operón para una transcripción. Esta puede ser terminador de transcripción intrínseco o terminador de transcriptor dependiente Rho. Para un terminador intrínseco, como el terminador trpA, una estructura de horquilla se forma con el transcripto que interrumpe el complejo ternario de RNA-polimerasa de mRNA-DNA. Alternativamente, los terminadores transcripcionales dependientes de RHO requieren el factor RHO, un complejo de proteína de RNA helicasa, para interrumpir el complejo ternario de DNA-RNA-polimerasa de mRNA naciente. Eucariota: las señales de poliA no son “terminadores” en lugar de ello una escisión interna para sitios de poliA deja un extremo en 5' sin rematar en el 3'UTR RNA para la digestión de nucleasa. La nucleasa se equipara a RNA Pol II y provoca la terminación. La terminación puede ser favorecida con una región corta del sitio de poliA mediante la introducción de sitios de pausa de RNA Pol II (terminador de transcripción eucariota). El pausado de RNA Pol II permite que la nucleasa introducida en el 3'TUR RNA después de la escisión de poliA se equipare a RNA Pol II en el sitio de pausa. Una lista no limitativa de terminadores de transcripción eucariotas conocidos en a técnica incluye el C2x4 y el terminador de gastrina. Los terminadores de transcripción eucariotas pueden elevar los niveles de mRNA potenciando un tratamiento de mRNA en el extremo 3' apropiado
Transfección: método para suministrar ácidos nucleicos en células [por ejemplo, poli(láctido-co-glicólido) (PLGA), ISCOMs, liposomas, niosomas, virosomas, polímeros de bloques, copolímeros de bloques plurónicos, quitosano y otros polímeros biodegradables, micropartículas, microesferas, nanopartículas de fosfato de calcio, nanopartículas, nanocápsulas, nanoesferas, nanoesferas de poloxamina, electroporación, nucleofección, permeabilización piezoeléctrica, ozonoporación, iontoforesis, ultrasonidos, disrupción de membrana mediada por deformación celular a velocidad elevada SQC, plasma corona, suministro facilitado por plasma, plasma tolerable por tejidos, microporación láser, energía de ondas de choque, campos magnéticos, magnetopermeabilización sin contacto, biolística, microagujas, microdermabrasión, suministro hidrodinámico, inyección en vena de la cola a presión elevada, etc.] como es conocido en la técnica
Transgen: gen de interés que es clonado en un vector para la expresión en un organismo diana
Vector de transposasa: un vector que codifica una transposasa
Vector de transposón: un vector que codifica un transposón que es un sustrato para la integración de genes mediada por transposasa
ts: sensible a la temperatura
μg: microgramos
|jl: microlitros
UTR: región no traducida de un mRNA (5' o 3' respecto a la región codificadora)
Vector: un vehículo de suministro de genes, que incluye vectores virales (por ejemplo, alfavirus, poxvirus, lentivirus, retrovirus, adenovirus, virus relacionado con adenovirus, etc.) y no viral (por ejemplo, plásmido, MIDGE, fragmento de PCR transcripcionalmente activo, minicírculos, bacteriófagos, etc.). Estos son bien conocidos en la técnica
Esqueleto del vector: región eucariota y región bacteriana de un vector, sin la región que codifica el transgen o antígeno diana.
Descripción detalla de realizaciones preferidas
La tecnología actual se refiere generalmente a métodos de vectores de DNA de plásmidos de región bacteriana cortos < 1 kb que mejoran el rendimiento y la calidad de fabricación de plásmidos, reducen la toxicidad asociada a la transfección y aumentan la expresión transgénica. La tecnología actual se puede poner en práctica para mejorar la expresión y fabricación de vectores como vectores no virales (vector de transposón, vector de transposasa, vector de transposón de tipo Bella durmiente, vector de transposasa de tipo Bella durmiente, vector de transposón de tipo PiggyBac, vector de transposasa de tipo PiggyBac, vector de expresión, etc.) y vectores virales (por ejemplo, vector AAV, vector de remate repetido AAV, vector helper AAV, vector helper Ad, vector de lentivirus, vector de envoltura lentiviral, vector de empaquetamiento lentiviral, vector retroviral, vector de envoltura retroviral, vector de empaquetamiento retroviral, etc.).
La expresión de plásmidos mejorada se define en la presente memoria descriptiva como el nivel de expresión transgénico y/o la duración de la expresión mejorados in vitro o in vivo en comparación con un plásmido codificador de transgenes que contiene una región bacteriana que codifica el origen de replicación pUC.
Los métodos de modificación de plásmidos de la presente tecnología actual se ha encontrado sorprendentemente que proporcionan una solución para suministrar vectores de regiones separadoras cortas que contienen secuencias de DNA estructurado con una fabricación eficaz de rendimiento elevado.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, la expresión “ identidad de secuencias” se refiere al grado de identidad entre una secuencia de investigación dada, por ejemplo, ID SEC n° 2 y una secuencia objeto del estudio. Una secuencia objeto del estudio puede tener, por ejemplo, al menos 90 por ciento, al menos 95 por ciento o al menos 99 por ciento de identidad de secuencias respecto a una secuencia de investigación dada. Para determinar el porcentaje de identidad de secuencias, una secuencia de investigación (por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos) es alineada a una a una o más secuencias objeto del estudio usando cualquier programa de alineación de secuencias adecuado que sea bien conocido en la técnica, por ejemplo, el programa de ordenador ClustalW (version 1,83, parámetros por defecto), que permite que se lleven a cabo alineaciones de secuencias de ácidos nucleicos a través de la longitud completa (alineamiento global). Chema et al., 2003 Nucleic Acids Res., 31:3497-500. En un método preferido, el programa de alineación de secuencias (por ejemplo, ClustalW) Calcula la mejor coincidencia entre las secuencias de investigación y una o más objeto del estudio y las alinea, de forma que se pueden determinar identidades, analogías y diferencias. Pueden ser insertados huecos de uno o más nucleótidos en una secuencia de investigación, una secuencia objeta de estudio o ambas, para maximizar las alineaciones de secuencias. Para una correcta alineación por pares de secuencias de ácidos nucleicos, se pueden seleccionar parámetros por defecto adecuados que sean apropiados para el programa de alineación particular. El resultado es una alineación de secuencias que refleja la relación entre secuencias. Para determinar adicionalmente el porcentaje de identidad de una secuencia de ácidos nucleicos objeto del estudio respecto a una secuencia de investigación, las secuencias son alineadas usando el programa de alineación, el número de coincidencias idénticas es la alineación dividida por la longitud de la secuencia de investigación y el resultado se multiplica por 100. Debe apreciarse que el índice de porcentaje de identidad puede ser redondeado hasta la decena más próxima. Por ejemplo, 78,11, 78,12, 78,13 y 78,14 son redondeadas a 78,1, mientras que 78,15, 78,16, 78,17, 78,18, y 78,19 son redondeadas a 78,2.
Volviendo ahora a los dibujos, las Figs. 1A - 1F muestran mapas anotados de: Fig. 1A) Origen de R6K con las ubicaciones de las repeticiones de iterones de 22 bp, cajas de DnaA 1 y 2 y las regiones incluidas en las ID SEC n° 1, 2, 3 y 4, orígenes de R6K; Fig. 1B) ID SEC n° 5 marcador seleccionable de RNA-OUT con las ubicaciones del promotor de RNA-OUT de -35 y -10 elementos, ID SEC n° 6 RNA antisentido de RNA OUT con una región de homología complementaria de RNA-IN y una horquilla en 3' de terminación de RNA-OUT; Fig. 1C) Esqueleto bacteriano de R6K-RNA-OUT de 14 CpG compuesto por origen de replicación de R6K ID SEC n° 1 y marcador seleccionable de RNA-OUT ID SEC n° 5 que incluye la terminación bacteriana de trpA en dirección ascendente del origen de R6K y flanqueada por los sitios de clonación Nhel y Kpnl; Fig. 1d) esqueleto bacteriano de R6K-RNA-OUT de 3 CpG compuesto por ID SEC n° 2 origen de replicación de R6K de 1x CpG y marcador seleccionable de RNA-OUT de 2x CpG flanqueado por sitios de clonación Nhel y Kpnl; Fig. 1E)
origen de R6K de ID SEC n° 1, con ubicaciones de 6 iterones resaltadas. Las secuencias de repetición de iterones de 22 bp individuales se muestran debajo del mapa de origen; y Fig. 1F) origen de R6K de ID SEC n° 18, con ubicaciones de los 7 iterones resaltadas. Las secuencias repetidas de iterones de 22 bp individuales se muestran debajo del mapa de origen. En este ejemplo, el iterón 5 del vector de 7 iterones fueron sometidos conjuntamente a duplicación; sin embargo, un vector de 7 iterones de la invención puede ser obtenido mediante la duplicación conjunta de cualquiera de los iterones 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
Las Figs. 2A- 2B muestran mapas anotados de: Fig 2A) vector pUC57-Kan SB1 de transposones de tipo Bella durmiente para selección de kanamicina con origen pUC dependiente de Pol I (véase la Tabla 6); y Fig. 2B) vector NTC9 SB1 de transposones de tipo Bella durmiente de selección exenta de antibióticos de RNA-OUT con origen de R6K dependiente de Pol III (véase la Tabla 6). Se muestran las ubicaciones de las IR/DR de tipo Bella durmiente izquierda y derecha con relación a los orígenes de replicación del esqueleto bacteriano y los marcadores.
Las Figs. 3A-3C muestran mapas anotados de: Fig. 3A) vector pAAV de selección AAV de ampicilina con origen pUC dependiente de Pol I (véase la Tabla 7); Fig. 3B) vector NTC8-AAV de selección AAV exento de antibióticos de RNA-OUT con origen pUC dependiente de Pol I (véase la Tabla 7 y Fig. 3C) Vector NTC9-AAV de selección de AAV exento de antibióticos de RNA-OUT con origen de R6K dependiente de Pol III (véase la Tabla 7). Se muestran las ubicaciones de las ITRs de AAV izquierda y derecha relativas a los orígenes de replicación del esqueleto bacteriano y los marcadores de selección.
Las Fig. 4A- 4F muestran mapas anotados de: Fig. 4A) vector pGEM4Z T7 A60 pA codificador de repetición de poliA A60 de selección de ampicilina con origen pUC dependiente de Pol I (véase la Tabla 8); Fig. 4B) Vector NTC8-T7 A60 pA de mRNA codificación de la repetición de poliA A60 de selección exenta de antibióticos de RNA-OUT con origen en pUC dependiente de Pol I (véase la Tabla 8); Fig. 4C) vector NTC9-T7 A60 pA de mRNA codificador de repetición de poliA A60 de selección exenta de antibióticos de RNA-OUT con origen de R6K dependiente de Pol III (véase la Tabla 8); Fig. 4D) vector pT3/T7 A99 pA de mRNA codificación de repeticiones de poliA A99 de selección de ampicilina con origen pUC dependiente de Pol I (véase la Tabla 8); Fig. 4E) vector NTC7-T7 A49 pA codificador de repeticiones de poliA A99 de selección de kanR con origen pUC dependiente de Pol I (véase la Tabla 8); y Fig. 4F) vector NTC9-T7 A99 pA de mRNA codificador de repeticiones de poliA A99 de selección exenta de antibióticos de RNA-OUT origen de R6K dependiente de Pol III (véase la Tabla 8). Se muestra la ubicación de la repetición de poliA A60 o A99 con relación a los orígenes de replicación y la selección del esqueleto bacteriano.
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para mejorar la replicación de un plásmido circular covalentemente cerrado que comprende las siguientes etapas:
a. proporcionar un plásmido circular covalentemente cerrado que comprende:
iii. un origen de replicación dependiente de Pol I y
iv) un inserto que comprende una secuencia de DNA seleccionada entre el grupo que consiste en una secuencia repetida invertida, una secuencia repetida directa, una secuencia repetida homopolímera o un origen de replicación eucariota, de modo que la secuencia de DNA estructurado está ubicada a una distancia de menos de 1000 bp del origen dependiente de Pol I de replicación en la dirección de la replicación; y
b. Modificar el plásmido circular covalentemente cerrado del apartado a. de forma que el origen de replicación dependiente de Pol I sea sustituido con un origen de replicación gamma de R6K, de modo que el plásmido circular covalentemente cerrado del origen de replicación gamma de R6K resultante tiene una replicación mejorada seleccionada entre el grupo que consiste en una producción reducida de intermedios de replicación y números de copias de plásmidos aumentada con relación al plásmido circular covalentemente cerrado del apartado a, de modo que el origen de replicación gamma de R6K no requiere Pol I, de modo que la secuencia de DNA estructurado está ubicada a una distancia de menos de 1000 bp del origen de replicación gamma de R6K en la dirección de la replicación.
En una realización, dicho origen de replicación dependiente de Pol I se selecciona entre el grupo que consiste en: origen pUC, un origen pMB1 y un origen Col E1. En una realización adicional, dicho origen de replicación gamma de r6K es un origen de replicación gamma de R6K con una identidad de secuencias de al menos 95% con relación a una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en ID SEC n° 1, ID SEC n° 2, ID SEC n° 3, ID SEC n° 4 y ID SEC n° 18. En una realización adicional, dicha secuencia de se selecciona entre el grupo que consiste en una repetición de poliA, un origen de replicación SV40, Una LTR viral LTR lentiviral, una LTR retroviral, repetición de IR/DR de transposón de tipo Bella durmiente, ITR AAV, ITR de transposón y ITR de transposón de tipo PiggyBac.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método para mejorar la replicación de un plásmido circular covalentemente cerrado, que comprende las siguientes etapas:
a. proporcionar un plásmido circular covalentemente cerrado, que comprende:
iii. una región de replicación-selección bacteriana que comprende un origen de replicación dependiente de Pol I y un marcador seleccionable de antibiótico y
iv. un inserto que comprende una secuencia de DNA seleccionada entre el grupo que consiste en una secuencia repetida invertida, una secuencia de repetición directa, una secuencia repetida homopolímera o un origen de replicación homopolímera o un origen de replicación eucariota, de modo que la secuencia de DNA estructurado está ubicada a una distancia de menos de 1000 bp del origen de replicación dependiente de Pol I en la dirección de la replicación;
b. modificar el plásmido circular covalentemente cerrado de forma que el marcador seleccionable de antibiótico se sustituya con un marcador seleccionable de RNA y el origen de replicación dependiente de Pol I se sustituya con un origen de replicación gamma de R6K, de modo que el plásmido circular covalentemente cerrado del origen de replicación gamma de R6K resultante tiene una replicación mejorada seleccionada entre el grupo que consiste en una producción reducida de intermedios de replicación y un número de copias de plásmido aumentado con relación al plásmido circular covalentemente cerrado del apartado a, de modo que el origen de replicación gamma de R6K no requiere Pol I, de modo que la secuencia de DNA estructurado está ubicada a una distancia de menos de 1000 bp del origen de replicación gamma de R6K en la dirección de la replicación.
En una realización dicho origen de replicación dependiente de Pol I se selecciona entre el grupo que consiste en: origen pUC, un origen pMB1 y un origen ColE1. En una realización adicional, dicho origen de replicación gamma de R6K es un origen de replicación gamma de R6K con una identidad de secuencias de al menos 95% respecto a una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en ID SEC n° 1, ID SEC n° 2, ID SEC n°3, ID SEC n° 4 y ID SEC n° 18. En una realización adicional, dicho marcador seleccionable de RNA es una variante funcional de RNA-OUT reguladora de RNA-IN con una identidad de secuencias de al menos 95% respecto a una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en ID SEC n° 5 y ID SEC n° 7. En una realización adicional, dicho marcador seleccionable de RNA es un marcador seleccionable de RNA de RNA-OUT que codifica un RNA de RNA-OUT regulador de RNA-IN con una identidad de secuencias de al menos 95% respecto a ID SEC n° 6. En una realización adicional, dicha región de replicación-selección bacteriana que comprende un origen de replicación dependiente de Pol I y un marcador seleccionable de antibiótico está sustituida con una región de replicación-selección bacteriana de marcador seleccionable de RNA de RNA-OUT con origen de R6K con una identidad de secuencias de al menos 95% respecto a una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en ID SEC n° 8, ID SEC n° 9, ID SEC n° 10, ID SEC n° 11, ID SEC n° 12, ID SEC n° 13, ID SEC n° 14, ID SEC n° 15, ID SEC n° 16 y ID SEC n° 17. En una realización adicional, dicha secuencia de DNA estructurado se selecciona entre el grupo que consiste en una repetición de poliA, un origen de replicación SV40, Una LTR viral, una LTR lentiviral, una LTR retroviral, repetición de IR/DR de transposón, repetición de IR/DR de transposón de tipo Bella durmiente, ITR AAV, ITR de transposón e ITR de transposón de tipo PiggyBac.
Ejemplos
Los métodos de la presente tecnología se ilustran adicionalmente mediante los siguientes ejemplos. Estos se proporcionan a modo de ilustración y no están concebidos en modo alguno para limitar el alcance de la descripción.
Ejemplo 1: replicación y producción de plásmido con origen de replicación pUC y R6K
Fundamento de la replicación y producción del vector origen pUC: la gran mayoría de plásmidos terapéuticos usa el origen pUC que es un derivado de copias elevadas con origen pMB1 (estrechamente relacionado con el origen ColE1). Para la replicación de pMB1, la síntesis de DNA de plásmido es unidireccional y no requiere una proteína iniciadora portadora del plásmido. El origen pUC es una copia hasta el derivado con origen pMB1 que suprime la proteína ROP (rom) accesoria y tiene una mutación adicional sensible a la presión que desestabiliza la interacción RNAI/RNAII. El desplazamiento de un cultivo que contiene estos orígenes desde 32 hasta 42° C conduce a un aumento del número de copias de plásmido. Los plásmidos de pUC pueden ser producidos en una multitud de líneas celulares de E. coli.
Fundamento del marcador seleccionable exento de antibióticos de RNA-OUT: La selección exenta de antibióticos se realiza en cepas de E. coli que contienen pCAH63-CAT RNA-IN-SacB (P5/6 6/6) cromosómicamente integrado en el sitio de unión Lambda del fago que contiene E. coli, como se describe por Williams, Supra, 2008. El SacB (Bacillus subtilis levansucrase) es un marcador contraseleccionable que es letal para las células de E. coli en presencia de sacarosa. La traducción de SacB a partir del transcripto RNA-IN-SacB es inhibida por RNA-OUT codificada por el plásmido (Fig. 1B). Esto facilita la selección del plásmido en presencia de sacarosa, mediante la inhibición de la letalidad mediada por SacB.
Fundamento de la replicación y producción del vector con origen de R6K: el origen de replicación del plásmido gamma de R6K requiere una única proteína de replicación de plásmido n que se une como un monómero iniciador de la replicación a múltiples sitios de “iterones” repetidos (siete repeticiones del núcleo que contienen un consenso de TGAGNG) y como un dímero inhibidor de la replicación para sitios represivos (TGAGNG) y a iterones con afinidad reducida. La replicación requiere múltiples factores de hospedantes que incluyen iHf , dnaA y proteínas de ensamblaje primosomal DnaB, DnaC, DnaG (Abhyankar et al., 2003 J Biol Chem 278:45476-45484). El origen del núcleo de R6K contiene sitios de unión para DnaA y para IHF que afectan a la replicación del plásmido ya que n y DnaA interaccionan para iniciar la replicación.
Han sido utilizadas diversas versiones del origen de replicación gamma de R6K en diversos vectores de expresión eucariotas, por ejemplo, vectores de pCOR (Soubrier et al., 1999, Gene Therapy 6: 1482-88) y una versión exenta de CpG en vectores exentos de pCpG (Invivogen, San Diego CA) y pGM169 (universidad de Oxford). La incorporación del origen de replicación de R6K por sí misma no mejora los niveles de expresión de transgenes en comparación con un vector con origen pUC optimizado (Soubrier et al., Supra, 1999). Sin embargo, el uso de un origen de replicación condicional como gamma de R6K, que requiere una línea celular especializada para la propagación, añade un margen de seguridad ya que el vector no se replicará si es transferido a una flora endógena del paciente.
Un origen de replicación derivado de gamma R6K de 6 iterones altamente minimilizado (ID SEC n°1; Fig. 1E) que contiene secuencias de núcleos requeridas para la replicación (incluida la caja de DnaA y los sitios 1-3 de stb; Wu et al., 1995. J Bacterial. 177: 6338-6345), pero con los sitios de unión de represores dímeros n en dirección ascendente y el promotor n en dirección descendente suprimidos (retirando una copia de los iterones) fue descrito por Williams, Supra, 2014. El origen de R6K contiene 6 iterones de repetición directa combinada (Fig. 1E). El vector Nanoplasmid® NTC9385R, que incluye este origen de R6K minimilizado y el marcador seleccionable de AF de RNA-OUT en la región separadora, fue descrito por Williams, Supra, 2014.
Las cepas de producción de R6K se expresan a partir del genoma del derivado de proteína n PIR 116 que contiene una sustitución de P106L que aumenta el número de copias (reduciendo la dimerización de n, los monómeros de n se activan mientras que se reprimen los dímeros de n). Los resultados de la fermentación con plásmidos pCOR (Soubrier et al., Supra, 1999) y pCpG (Hebel HL, Cai Y, Davies LA, Hyde SC, Pringle IA, Gill Dr .2008. Mol Ther 16: S110) fueron bajos de aproximadamente 100 mg/l en líneas celulares PIR 116.
La mutagénesis de la proteína de replicación PIR-116 y la selección de un número de copias aumentado han sido usadas para preparar nuevas cepas de producción. Por ejemplo, la cepa TEX2pir42 contiene una combinación de P106L y P42L. La mutación de P42L interfiere con la represión de la replicación en bucle de DNA. La línea celular TEX2pir42 mejoró el número de copias y el rendimiento de fermentación con plásmidos pCOR con rendimientos descritos de 205 mg/l (Soubrier F. 2004. Solicitud de patente internacional WO2004033664).
Otras combinaciones de mutantes de números de copias de n que mejoran el número de copias incluyen “P42L y P113S” y “P42L, P106L y F107S” (Abhyankar et al., 2004. J Biol Chem 279:6711-6719).
Williams, Supra, 2014, describe que las cepas hospedantes que expresan el sitio de unión HK022 de fagos integraban proteína de replicación (Rep) mutante de copias elevadas de P42L, P106L y F107S inducibles por calor promotora de μL para la selección y propagación y vectores Nanoplasmid® con origen de R6K. Este es un factor de seguridad adicional de Nanoplasmid®, ya que los vectores con origen de R6K solo pueden replicar con la cepa hospedante de E. coli que expresa proteína Rep tratada por ingeniería genética.
La propagación y fermentaciones de marcador seleccionable de RNA-OUT-plásmido de R6K descritas por Williams, Supra, 2014, se realizaron usando líneas celulares mutantes de número de copias n de “P42L, P106L y F107S” inducibles por calor como la cepa hospedante de DH5 a NTC711772 = DH5a dcm - attA::Ps/66/6-RNA-IN-SacB, catR; attHK022::μL (OL1-G to T) P42L-P106L-F107S (P3-), SpecR StrepR. Se describieron rendimientos de producción de hasta 695 mg/l.
Se crearon líneas celulares adicionales y se describen en la presente memoria descriptiva, que incluyen:
NTC821601 DH5a att*::P5/66/6-RNA-IN- SacB, catR; attHK022:: μL (OL1-G a T) P42L-P106L-F107S (P3-), SpecR StrepR = dcm+ version of NTC711772
NTC940211 DH5a att*::P5/66/6-RNA-IN- SacB, catR; attHK022::μL (OL1-G to T) P42L-P106I-F107S
P113S (P3-), SpecR StrepR = sustitución de copias elevadas de P106I en lugar de P106L combinada con P113S para crear un número de copias cuádruple aumentando el derivado de proteína rep mutante de NTC821601
NTC1050811 DH5a att*::P5/66/6-RNA-IN- SacB, catR; attHK022::μL (OL1-G to T) P42L-P106I-F107S
P113S (P3-), SpecR StrepR; att <^0::pARA-CI857ts, tetR = pARA-CI857ts derivado de NTC940211. Esta cepa contiene una cromosómicamente integrada del sitio de unión ^80 de fagos de un gen CI85ts inducible de arabinosa. La adición de arabinosa a placas o medios (por ejemplo, a una concentración final de 0,2-04%) induce la expresión de represor CI857ts mediada por pARA que reduce el número de copias a 30° C a través de infraregulación mediada por CI857ts de la proteína Rep que expresa el promotor μL [es decir, los CI857ts adicionales median una infraregulación más eficaz del potenciador μL (OL1-G a T) a 30° C]. La inducción del número de copias después del desplazamiento de la temperatura a 37 -42° C no está impedida ya que el represor CI857ts es inactivado a estas temperaturas elevadas. Se usa un derivado DCM (NTC1050811 dcm-) en los casos en los que no es deseable una metilación de DCM.
NTC1011641 Stbl4 attA::P5/66/6-RNA-IN- SacB, catR; attHK022::μL P42L-P106L-F107S (P3-) SpecR StrepR = versión de Stbl4 de NTC661135 (XL1Blue- dcm- attA::P5/66/6-RnA-IN- SacB, catR; attHK022::pR μL P42L-P106L-F107S (P3-) SpecR StrepR descrito por Williams, Supra, 2014
Los rendimientos de producción de Nanoplasmid® son mejorados con el μL inducible por calor mutante cruadruple (OL1-G a T) P42LP106I- F107S P113S (P3-) en comparación μL inducible por calor mutante triple (OL1-G a T) P42L-P106L-F107S (P3-) descrito por Williams, Supra, 2014. Han sido obtenidos rendimientos por encima de 2 g/l de Nanoplasmid® con la línea celular NTC1050811 mutante cuádruple (por ejemplo, 2240 mg/l con NTC9T7 a 99pA, Tabla 8).
El uso de un origen de replicación condicional como estos orígenes de R6K, que requiere una línea celular especializada para la propagación, añade un margen de seguridad ya que el vector no se replicará si es transferido a la flora endógena de un paciente.
Ejemplo 2: Producción de vector con origen pUC y R6K
Producción del matraz de agitación: la producción del matraz de agitación se realizó usando medio de cultivo de agitación de Plasmid+. Se hicieron comenzar cultivos siguientes a partir de reservas o colonias de glicerol y se extendieron en placas de agar con medio LB que contenían 50 mg/ml de antibiótico (para plásmidos de selección ampR o kanR) o 6% de sacarosa para plásmidos de selección de RNA-OUT). Las placas se hicieron crecer a 30-32° C, las células se volvieron a poner en suspensión en medios y se usaron para proporcionar aproximadamente 2,5 inóculos OD600 para los frascos de agitación de Plasmid+ de 500 ml que contenían 50 mg/ml de antibiótico para plásmidos de selección de ampR o kanR o 0,5% de sacarosa para seleccionar plásmidos de RNA-OUt . Los frascos se hicieron crecer con agitación hasta saturación a las temperaturas de crecimiento indicadas en las Tabla 5, 6, 7 y 9.
Producción de la fermentación. Se realizaron fermentaciones usando medios de alimentación discontinua apropiados (NTC3019, medios de HyperGRO) en bioreactores New Brunswick BioFlo 110 (Carnes and Williams, Supra, 2011). Los cultivos de semillas se comenzaron a partir de reservas o colonias de glicerol y se extendieron en placas de agar con medio LB que contenían 50 mg/ml de antibiótico (para Plásmidos de selección ampR o kanR) o 6% de sacarosa (para plásmidos de selección de RNA-OUT). Las placas se hicieron crecer a 30-32° C; las células se volvieron a poner en suspensión en medios y se usaron para proporcionar inóculos de aproximadamente 0,1% para las fermentaciones que contenían 50 mg/ml de antibiótico para plásmidos de selección de ampR o kanR o 0,5 de sacarosa de plásmidos que contenían RNA-OUT. Los desplazamientos de la temperatura de HyperGR son como se describen en las Tabla 8 y 9.
Hospedantes de producción: se realizaron fermentaciones de plásmidos ampR o kanR con origen en pUC en una cepa de E. coli de DH5a ([F- O80lacZAM15 A(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rK-, mK+) phoA supE44 A- thi-1 gyrA96 relA1] (Invitrogen, Carlsbad CA) o Stbl4.
Se realizaron fermentaciones de plásmido de RNA-OUT con origen en pUC exento de antibióticos en la cepa de E. coli DH5a que contenía un sitio de unión Lambda a fagos cromosómicamente integrado pCAH63-CAT RNA-IN SacB (P5/6 6/6) como se describe por Williams, Supra, 2008. La cepa de producción es NTC4862 = DH5a attA::P5/66/6-RNA-IN- SacB, catR.
Se realizaron propagación y fermentaciones de plásmido de RNA-OUT con origen gamma de R6K exento de antibióticos usando hospedantes de selección de RNA-OUT de E. coli que codificaban adicionalmente líneas celulares mutantes con número de copias de n inducibles por calor de promotor μL integradas en el sitio de unión de HK022 de fagos, de los que se describen métodos para la reacción de las mismas por Williams, Supra, 2014.
Cepas de producción:
Hospedantes de selección antibiótico ampR o kanR con origen pUC.
DH5a
Stbl4
Hospedantes de selección de sacarosa de RNA-OUT con origen pUC
NTC4862 DH5a attA::Ps/66/6-RNA-IN- SacB, catR
NTC1011592 Stbl4 attA::P5/66/6-RNA-IN- SacB, catR
Hospedantes de Nanoplasmid® de selección de sacarosa de RNA-OUT con origen de R6K
NTC1050811 DH5a attA::Ps/66/6-RNA-IN- SacB, catR; attHK022::μL (OL1-G a T) P42L-P106I-F107S P113S (P3-), SpecR StrepR; att$80::pARA-CI857ts, tetR
NTC1011641 Stbl4 attA::P5/66/6-RNA-IN- SacB, catR; attHK022::μL P42L-P106L-F107S (P3-) SpecR StrepR
Métodos analíticos: Se tomaron muestras de cultivo en puntos clave y a intervalos regulares durante todas las fermentaciones.
Las muestras se analizaron inmediatamente en cuanto a biomasa (OD600) y rendimiento de plásmido. El rendimiento de plásmido se determinó mediante la cuantificación de plásmido obtenido a partir de preparaciones del estuche del ensayo Qiagen Spin Miniprep como está descrito (Carnes and Williams, Supra, 2011). Brevemente, las células fueron lisadas en estado alcalino, clarificada, se purificó mediante columna el plásmido y se eluyó antes de la cuantificación. La calidad del plásmido se determinó mediante análisis de electroforesis sobre gel de agarosa (AGE) y se realizó sobre geles de Tris/acetato/EDTA (TAE) al 0,8 - 1 % como se describe por Carnes y Williams, Supra, 2011.
Ejemplo 3: Construcción y fabricación de vector estructurado con origen pUC y R6K
La región de replicación-selección bacteriana de RNA-OUT (ID SEC n° 5; Fig. 1B) y con origen gamma de R6K (ID SEC n° 1; Fig. 1E) fue clonada en la región policonectora de una diversidad de vectores basados en pUC 57 para crear los vectores pNTC-NP1, pNTC-NP2, pNTC-NP3, pNTC-NP4, pNTC-NP5, pNTC-NP6, pNTC-NP7. Cada vector tiene sitios de restricción flanqueantes diferentes que pueden ser usados para retroadaptar un vector diana a la replicación de R6K- selección de RNA-OUT. Las secuencias policonectoras de 5' y 3' que flanquean el inserto de R6K-RNA-OUT en los vectores pNTC-NP 1-7 se muestran en la Tabla 4. Se creó también una versión basada en pUC57 de la región de replicación-selección bacteriana de RNA-OUT de 2 CpG con origen gamma de R6K de 1 CpG (ID SEC n° 9; Fig.1 D) ((pNTC-3xCpG NP1) y se muestra en la Tabla 4.
El origen gamma de R6K (ID SEC n° 1) es un origen de R6K de 6 iterones tratado por ingeniería genética (Fig. 1E). Se creó también una versión basada en pUC57 de una región de replicación bacteriana de RNA-OUT (ID SEC n° 5; Fig. 1B) con origen gamma de R6K de 7 iterones (ID SEC n° 18; Fig. 1F) y se usó para construir y evaluar la utilidad de iterones adicionales en la fabricación. Análogamente, se obtuvo una fabricación de alta calidad y con rendimiento elevado con vectores que diferían solamente en que contenían el origen gamma de R6K de 7 iterones ID SEC n° 18 o el origen gamma de R6K de seis iterones (ID SEC n° 1). Por ejemplo, se obtuvieron los siguientes rendimientos de producción de recolecta en fermentaciones de HyperGRO con desplazamiento de temperaturas en elevación de 10 h de 30-42° C:
ID SEC n° 1: vector con origen de R6K de 3203 bp de 6 iterones: una biomasa de 120 OD600; titulación de plásmido de 1363 mg/l; rendimiento específico de plásmido de 11,3 mg de plásmido/l/OD600
ID SEC n° 18: Vector con origen de R6K de 3225 bp de 7 iterones: una biomasa de 137 OD600; titulación de plásmido de 1503 mg/l; rendimiento específico de plásmido de 11,0 mg de plásmido/l/OD600
El origen gamma de R6K de 7 iterones en la ID SEC n° 18 es una duplicación conjunta de iterón 5 (Fig. 1F; ID SEC n° 18) pero los vectores con origen gamma de R6K de iterón 7 de la invención pueden ser duplicaciones conjuntas de cualquiera de los iterones proporcionados como ID SEC n°19, ID SEC n° 20, ID SEC n° 21 ID Se C n° 22, ID SEC n° 23 (Fig. 1E) o combinaciones conjuntas de ID SEC n° 19, ID SEC n° 20, ID SEC n° 21, ID SEC n° 22, ID SEC n° 23 en composiciones con origen de R6K de iterón 7, o variantes repetidas de iterones que retienen el consenso de TGAGNG. Están contemplados también derivados de iterones adicionales (por ejemplo, vectores de iterones 8, 9 o 10) para la práctica de la invención.
Tabla 4: vectores marcadores de selección de RNA-OUT con origen de R6K flanqueados por sitios de clonación m li l NT
Retroadaptaciones de esqueletos bacterianos de selección antibiótico con origen pUC de vectores virales y no virales fueron realizadas mediante:
1) selección de sitios de restricción que flanquean el origen pUC y la región marcadora de selección antibiótico en el vector viral y no viral diana;
2) identificación de un cassette de policonector R6K-RNA-OUT- policonector compatible de pNTC-NP (cualquiera de pNTC-NP1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7; Tabla 4);
3) escisión de la región marcadora de selección antibiótico con origen pUC y sustitución con la región de RNA-OUT con origen de R6K seleccionada, usando la propuesta de restricción-digestión seleccionada y clonación mediada por ligasa estándar.
En algunos casos, el origen de R6K y las unidades de RNA-OUT fueron ensamblados en ligaduras de múltiples fragmentos a partir de fragmentos de restricción separados usando el sitio conector DraIII no palindrómico (véase la Tabla 4). En el caso del retroacondicionador Helpler fd6 Ad (Tabla 9), se realizó una ligadura del fragmento 3 usando un gen sintético de 500 bp corto DraIII RNA-OUT-Ad helper AvrII para conectar RNA-OUT a un sitio AvrII único en la región eucarótica de fd6 Ad helper en un fragmento de restricción AvrII-SaII de 12 kb y a un fragmento DraIII con origen SaII-R6K a partir de pNTC-NP4.
Ejemplos de mapas de vectores y características de vectores del vector marcador de selección antibiótico con origen pUC original y los vectores marcadores de selección exenta de antibióticos de RNA-OUT con origen de R6K se muestran para vectores de tipo Bella durmiente (Fig. 2; Tabla 6), AAV (Fig. 3; Tabla 7) y mRNA (Fig. 4; Tabla 8). Las características de los vectores del vector marcador de selección antibiótico con origen pUC original y los vectores marcadores de selección libres de antibióticos de RNA-OUT con origen de R6K retroadaptados se muestran para vectores helper de AAV (Tabla 8). Las características de vectores del vector marcador de selección exenta de antibióticos de RNA-OUT con origen pUC y los vectores marcadores de selección exentos de antibióticos de RNA-OUT con origen de R6K se muestran para vectores lentivirales (Tabla 5) y vectores AAV (Tabla 7).
En todos los casos, el tamaño del esqueleto bacteriano fue < 1 kb en los vectores retroadaptados de marcadores de selección exentos de antibióticos de RNA-OUT con origen de R6K (460-610 bp). Esto está bastante por debajo del límite de tamaño del esqueleto bacteriano de 1,1 kb requerido para mejorar el nivel de expresión de los vectores (Tablas 1-2) y su duración (Quiviger et al., Supra, 2014). En todos los casos, el esqueleto bacteriano de selección antibiótico con origen pUC original tenía < 1,2 kb (2340-2750 bp) así como las readaptaciones de RNA-OUT con origen pUC (1210-1500 bp). Por tanto, estos vectores de retroadaptación de marcadores de selección exentos de antibióticos de AAV, AAV helper, de tipo Bella durmiente y de R6K lentiviral cumplen el requisito de una región separadora corta para un nivel y una duración de expresión mejorados en comparación con el vector marcador de selección antibiótico con origen pUC original. Adicionalmente, estos vectores de retroadaptación de marcadores de selección exentos de antibióticos de AAV, AAV helper, de tipo Bella durmiente y de RNA-OUT con origen de R6K lentiviral no tienen opción de una transferencia de genes de marcadores de antibióticos mediante transducción (AAV, vectores lentivirales) o transposición (vectores de tipo Bella durmiente) debido a la separación del marcador de selección de resistencia a antibióticos de KanR o ampR en el vector parental. Adicionalmente, los vectores de la tecnología actual no requieren la complicada dificultad de las etapas de fabricación a escala adicionales y costosas, necesarias para separar la larga región bacteriana entre el poliA eucariota y promotor con vectores minicirculares (Kay et al., Supra, 2010).
Sin embargo, en un vector lentiviral, la región eucariota contiene LTRs de repetición directa flanqueante, en un vector AAV la región eucariota contiene repeticiones terminales invertidas flanqueantes, mientras que en un vector de transposón de tipo Bella durmiente la región eucariota contiene terminaciones de IR/DR de transposón flanqueante. Estas secuencias flanqueantes son todas secuencias de DNA estructurado.
Levy, Supra, 2004, expone que los intermedios de replicación se forman cuando cualquier origen de replicación procariota de número de copias elevado tiene < 1 kb a partir de una secuencia de DNA estructurado como un potenciador, una LTR o IREs , pero no cuando el origen de replicación de copias elevadas tiene >1,5 kb. De forma congruente con esto, se formaron intermedios de replicación en todos los vectores marcadores de RNA-OUT con origen pUC en los que el origen pUC tenía < 1 kb a partir de una LTR de vector lentiviral (Tabla 5: 400 bp) o un vector marcador de resistencia a antibióticos con origen pUC en el que el origen pUC tenía < 1 kb a partir de IR/DR de tipo Bella durmiente (Tabla 6; 280 bp). Para vectores AAV y de mRNA, los vectores marcadores de selección antibiótico con origen pUC originales tenían el origen pUC de 0 bp a partir de una ITR (vector AAV; Tabla 7) o de 170 bp a partir de una repetición de A99 (vector de mRNA, Tabla 8) que pueden constituir un intermedio de replicación que es demasiado pequeño para ser detectado en un gel de agarosa. Sin embargo, en estos casos, los rendimientos de producción fueron muy bajos, lo que es indicativo de un número de copias de plásmidos bajo debido a un bloqueo de la replicación. Por el contrario, como era de esperar, en el caso de que el origen pUC del vector marcador de selección antibiótico con origen pUC original tuviera >1,5 kb a partir de una secuencia de DNA estructurado (repetición de A60), se obtuvieron rendimientos de producción de plásmidos elevados (Tabla 8: vector de mRNA pGEM4Z T7 A60).
Williams, Supra, 2017, describió que el rendimiento de producción de vectores con origen pUC estaba mejorado
con un origen pUC extendido de PAS-BH cuando el origen pUC tenía < 1 kb a partir de una repetición de A64 C31 homopolímera. Sin embargo, los rendimientos de producción fueron bajos cuando un origen pUC extendido de PAS-BH contenía < 400 bp a partir de la repetición de A64C31 (Tabla 8, véanse las notas a pie de página d y e). Esto pone de manifiesto que la adición de un sitio de ensamblaje primosomal de PAS-BH no supera la replicación dirigida escasa con origen pUC de secuencias de estrechamente ubicadas.
Como el propio origen pUC tiene 1 kb, no hay una configuración para preparar un vector AAV, lentiviral, retroviral o de transposón de región bacteriana que contenga el origen pUC que no esté previsto que produzca intermedios de replicación, como se observó anteriormente y fue predicho por Levy, Supra, 2004 y en este caso se describieron rendimientos de plásmido escasos.
Sorprendentemente, no se observaron intermedios de replicación en cualesquiera vectores retroadaptados de marcadores de selección exentos de antibióticos de RNA-OUT con origen de R6K, incluidos aquellos en los que el origen de R6K tenía < 1 kb a partir de LTR de vector lentiviral (Tabla 5: 400 bp) o una IR/DR de tipo Bella durmiente (Tabla 6; < 40 bp). Además, para vectores AAV, aunque los vectores de marcadores de selección antibiótico con origen pUC original con el origen pUC de 0 bp a partir de ITR tenían rendimientos de producción muy escasos, los dos vectores retroadaptados de marcadores de selección exentos de antibióticos de RNA-OUT con origen de R6K con el origen de R6K de 40 bp a partir de la ITR tenían rendimientos de producción mucho más elevados (Tabla 7). Esta producción mejorada es específica para R6K y no para RNA-OUT, ya que las dos retroadaptaciones de RNA-OUT de pUC de AAV con el origen pUC de 50 bp a partir de la ITR tenían rendimientos de producción de plásmido igualmente escasos, así como el vector de marcador de antibióticos de pUC original (Tabla 7); igualmente la comparación directa de pUC-RNA-OUT con retroadaptaciones de R6K-RNA-OUT ubicadas a 400 bp a partir de la repetición de LTR en un esqueleto lentiviral mostró intermedios de replicación con la totalidad de los tres esqueletos de pUC RNA-OUT pero ninguno de los tres esqueletos de R6K-RNA-OUT (Tabla 5).
Esta mejora sorprendente en el número de copias (rendimientos de producción de plásmido) y calidad (intermedios de replicación eliminados) de plásmido con el vector con origen de R6K implica que el origen de R6K se puede replicar a través de una secuencia de DNA de forma más eficaz que con el origen pUC. Aunque Levy, Supra, 2004 exponen que los intermedios de replicación se forman cuando cualquier origen de replicación procariota con número de copias elevados tiene < 1 kb a partir de una secuencia de DNA estructurado como un potenciador, una LTR o IRES, pero no cuando el origen de replicación de copias elevadas está alejado >1,5 kb los ejemplos proporcionados por Levy, Supra, 2004 fueron todos con plásmidos con origen pUC.
Una diferencia fundamental entre estos orígenes de replicación es que el origen pUC es un origen dependiente de Pol I mientras que el origen de R6K es un origen de replicación dependiente de Pol III. Con el origen pUC, el cebador de RNA II forma un bucle R de RNA:DNA que es escindido por RNasa H para crear un cebador para la síntesis de DNA dirigida por DNA Pol I durante la síntesis de cadenas conductoras iniciales. La síntesis de DNA se convierte entonces a partir de Pol I de DNA en Pol III de DNA procesable a partir de 400 bp hasta 1,3 kb en dirección descendente del origen (Allen et al., 2011. Nucleic Acids Research 39:7020-33). La proteína rep del origen de replicación gamma de R6K interacciona con dnaB helicasa y dnaG primasa que crea cebadores de RNA para la replicación de Pol III de DNA sin necesidad de DNA Pol I (Abhyankar et al., Supra, 2003). La zona de replicación de Pol de DNA con origen pUC hasta 1,3 kb del origen corresponde estrechamente con el límite superior definido por Levy, Supra, 2004 de la formación del intermedio de replicación (entre 1 y 1,5 kb del origen). Se supone que la replicación sorprendentemente mejorada que se observó para DNA estructurado cuando está en una estrecha proximidad al origen de R6K, pero no al de pUC es debida a una mejora inesperada de la replicación de las secuencias de DNA estructurado por Pol III de DNA en comparación con Pol I de DNA.
Los métodos y composiciones de vectores descritos en la presente memoria descriptiva demuestran que un origen de replicación dependiente de Pol III, como el origen de R6K, puede ser usado para replicar secuencias de DNA estructurado que son escasamente replicadas por un origen dependiente de Pol I, como el origen pUC.
Estos resultados demuestran que los vectores de la invención son útiles para mejorar el rendimiento y la calidad de la fabricación de vectores virales y no virales.
Ejemplo 4: rendimiento mejorado de vector estructurado con origen de R6K
Los vectores de la invención son adicionalmente útiles para eliminar la transferencia de genes de marcadores de resistencia a antibióticos mediante vectores virales y no virales, reduciendo la toxicidad asociada a la transfección, mejorando la transposición a partir de vectores de transposones no virales, mejorando las titulaciones de empaquetamiento a partir de vectores virales, mejorando la expresión de transgenes codificados por vectores virales y no virales, etc.
Como un ejemplo, los vectores lentivirales de tercera generación con origen de R6K [4 vectores: Tabla 5 transferencia de plásmido, plásmido de empaquetamiento gag pol; plásmido env, plásmido REV (no mostrado)
con origen de R6K y esqueleto bacteriano < 1 kb) de la invención mostraron una toxicidad reducida y titulaciones de empaquetamiento viral mejoradas en comparación vectores con origen pUC comparativos con esqueleto bacteriano de > 1,5 kb. La transfección de la línea celular Lenti-X 293 T (Takara Bio Mountain View, CA) con vectores lentivirales de tercera generación con origen de R6K con un esqueleto bacteriano de < 1 kb o vector marcador de selección antibiótico con testigo de esqueleto bacteriano de >1,5 kb en placas de 24 pocillos, usando Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), como se recomienda por el fabricante, dio lugar a una producción de lentivirus de titulación superior (vectores testigos con origen pUC con esqueleto bacteriano de >1,5 kb: 1,00 x 60,32; vectores con origen de R6K de esqueleto bacteriano de < 1 kb 1 kb 1,45 x 6 0,42) al ser medida usando el estuche de ensayo de titulación rápida Lenti-X p24 (Takara Bio Mountain View, CA), trasnfección de línea celular l Lenti-X 293 T en placas de 24 pocillos con vectores lentivirales de tercera generación de la Tabla 5 (testigo con origen pUC de esqueleto bacteriano de > 1,5 kb o origen de R6K con esqueleto bacteriano de < 1 kb) usando transfección de fosfato de calcio como se describe (Marino MP, Luce MJ, Reiser J. 2003, Methods Mol Biol 229:43-55) dio lugar a una producción superior de titulación de lentivirus (testigo con origen pUC de esqueleto bacteriano de >1,5 kb: 1,00 x 6 0,30; vectores con origen de R6K de esqueleto bacteriano de < 1 kb: 1,32 x 60,19) al ser medida usando el estuche del ensayo de titulación rápida Lenti-X p24 (Takara Bio Mountain View, CA). Significativamente, la transfección con fosfato de calcio de los vectores lentivirales de tercera generación con origen pUC de esqueleto bacteriano de > 1,5 kb dio lugar a una toxicidad de transfección asociada extensiva (muerte celular > 80%) en comparación con los vectores lentivirales de tercera generación con origen de R6K de esqueleto bacteriano de < 1 kb con origen de R6K en esta transfección en placa de 24 pocillos. Esta toxicidad asociada a una transfección reducida debe dar lugar a titulaciones virales enormemente mejoradas en transfecciones a escala de fabricación. Estos resultados demuestran que los vectores de nanoplásmidos con origen de R6K de esqueleto bacteriano de < 1 kb de la invención reducen la toxicidad asociada a la transfección y mejoran las titulaciones de empaquetamiento a partir de vectores virales en comparación con vectores virales de esqueleto bacteriano de >1,5 kb.
Sumario
Aunque la descripción anterior contiene muchos ejemplos, estos no deben ser concebidos como limitaciones del alcance de la descripción, sino que en lugar de ello deben ser considerados como una ilustración de sus realizaciones preferidas. Son posibles muchas otras variaciones.
Por ejemplo, se puede utilizar en los vectores de la presente tecnología diversas orientaciones del origen de replicación dependiente de Pol III y el marcador seleccionable de RNA. Por ejemplo, puede ser usada cualquiera de las ocho orientaciones del origen de replicación dependiente de Pol III y el marcador seleccionable de RNA en vectores de la tecnología actual (es decir, — RSM con origen de replicación de Pol III —■; — origen de replicación de Pol III — RSM; origen de replicación de Pol III - RSM —■; origen de replicación de Pol III —> — RSM; — RSM origen de replicación de Pol III —> ; — RSM — origen de replicación de Pol III; RSM - origen de replicación de Pol III — ; RSM — — origen de replicación de Pol III).
Además, una diversidad de marcadores seleccionables de RNA conocidos en la técnica pueden sustituir a RNA-OUT.
Además, un marcador de resistencia a antibióticos puede sustituir a RNA-OUT, por ejemplo, en el caso de que se desee un retroacondicionamiento simple del origen pUC para el origen de R6K, para mejorar el rendimiento y la calidad de la producción de plásmido.
Por tanto, el lector observará que los vectores con origen de replicación dependientes de Pol III mejorados de la actual tecnología proporcionan una propuesta para reducir la toxicidad asociada a la transfección, mejorar la transposición a partir de vectores de transposón no virales, mejorar las titulaciones de empaquetamiento de vectores virales, mejorar la expresión de genes codificados por vectores virales y no virales y eliminar la transferencia de genes de marcadores de selección antibiótico mediados por vectores virales y vectores no virales (es decir, a través de la incorporación de una región bacteriana preferentemente de menos de 1000 bp) al mismo tiempo que se mejora enormemente la fabricación en comparación con vectores alternativos como plásmidos de pUC y minicírculos.
Claims (11)
1. Un método para mejorar la replicación de un plásmido circular covalentemente cerrado, que comprende las siguientes etapas:
a. proporcionar plásmido circular covalentemente cerrado que comprende:
1. un origen de replicación dependiente de Pol I, y
ii. un inserto que comprende una secuencia de DNA estructurado seleccionada entre el grupo que consiste en una secuencia repetida invertida, una secuencia repetida directa, una secuencia repetida homopolímera o un origen de replicación eucariota, de modo que la secuencia de DNA estructurado está ubicada a una distancia de menos de 1000 bp del origen de replicación dependiente de Pol I en la dirección de la replicación; y
b. modificar el plásmido circular covalentemente cerrado de a. de forma que el origen de replicación dependiente de Pol I sea sustituido con un origen de replicación gamma de R6K, de modo que el plásmido circular covalentemente cerrado del origen de replicación gamma de R6K resultante tiene una replicación mejorada seleccionada entre el grupo que consiste en una producción reducida de intermedios de replicación y un número de copias de plásmido aumentado con relación al plásmido circular covalentemente cerrado del apartado a., de modo que el origen de replicación gamma de R6K no requiere Pol I, y de modo que la secuencia de DNA estructurado está ubicada a una distancia de menos de 1000 bp del origen de replicación gamma de R6K en la dirección de la replicación.
2. El método de la reivindicación 1, en el que el origen de replicación dependiente de Pol I se selecciona entre el grupo que consiste en un origen pUC, un origen pMB1 y un origen ColE1.
3. El método de la reivindicación 1, en el que el origen de replicación gamma de R6K es un origen de replicación gamma de R6K con una identidad de secuencias de al menos 95% respecto a una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en ID SEC n° 1, ID SEC n° 2, ID SEC n° 3, ID SEC n° 4 y ID SEC n° 18.
4. El método de la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de DNA estructurado es:
a. una repetición homopolímera, de modo que la repetición homopolímera es una repetición de poliA;
b. un origen de replicación eucariota, de modo que el origen de replicación eucariota es un origen de replicación SV40;
c. una secuencia repetida directa, de modo que la secuencia repetida directa se selecciona entre el grupo que consiste en una LTR viral, una LTR lentiviral o una LTR retroviral; o
d. una secuencia repetida invertida, de modo que la secuencia repetida invertida se selecciona entre el grupo que consiste en una repetición de IR/DR de transposón, una repetición de IR/DR de transposón de tipo Bella durmiente, una ITR AAV, una ITR de transposón o una ITR de transposón de tipo PiggyBac.
5. Un método para mejorar la replicación de un plásmido circular covalentemente cerrado, que comprende las siguientes etapas:
a. proporcionar un plásmido circular covalentemente cerrado que comprende:
i. una región de replicación-selección bacteriana que comprende un origen de replicación dependiente de Pol I y un marcador seleccionable de antibióticos y
ii. un inserto que comprende una secuencia de DNA estructurado, seleccionada entre el grupo que consiste en una secuencia repetida invertida, una secuencia repetida directa, una secuencia repetida homopolímera o un origen de replicación eucariota, de modo que la secuencia de DNA estructurado está ubicada a una distancia de menos de 1000 bp del origen de replicación dependiente de Pol I en la dirección de la replicación; y
b. modificar el plásmido circular covalentemente cerrado del apartado a. de forma que el marcador seleccionable de antibiótico sea sustituido con un marcador seleccionable de RNA y el origen de replicación dependiente de Pol I sea sustituido con un origen de replicación gamma de R6K, de modo que el plásmido circular covalentemente cerrado del origen de replicación gamma de R6K resultante tiene una replicación mejorada seleccionada entre el grupo que consiste en una producción reducida de intermedios de replicación y un número de copias de plásmido aumentado con relación al plásmido circular covalentemente cerrado del apartado a., de modo que el origen de replicación de gamma de R6K no requiere Pol I, de modo que la secuencia de DNA estructurado está ubicada a una distancia de menos de 1000 bp del origen de replicación gamma de R6K en la dirección de la replicación.
6. El método de la reivindicación 5, en el que dicho origen de replicación dependiente de Pol I se selecciona entre el grupo que consiste en: un origen pUC, un origen pMB1 y un origen Col E1.
7. El método de la reivindicación 5, en el que dicho origen de replicación gamma de R6K es un origen de replicación gamma de R6K con una identidad de secuencias de al menos 95% respecto a una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en ID SEC n° 1, ID SEC n° 2, ID SEC n° 3, ID SEC n° 4 y ID SEC n° 18.
8. El método de la reivindicación 5, en el que dicho marcador seleccionable de RNA es una variante funcional de RNA-OUT reguladora de RNA-IN con una identidad de secuencias de al menos 95% respecto a una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en ID SEC n° 5 y ID SEC n° 7.
9. El método de la reivindicación 5, en el que dicho marcador seleccionable de RNA es un marcador seleccionable de RNA de RNA-OUT que codifica un RNA de RNA-OUT regulador de RNA-IN con unas identidades de secuencia de al menos 95% respecto a ID SEC n° 6.
10. El método de la reivindicación 5, en el que dicha región de replicación-selección bacteriana comprende un origen de replicación dependiente de Pol I y un marcador seleccionable de antibiótico está sustituida con una región de replicación-selección bacteriana de marcador seleccionable de RNA de RNA-OUT con origen de R6K dependiente de Pol III con una identidad de secuencias de al menos 95% respecto a una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en ID SEC n° 8, ID SEC n° 9, ID SEC n° 10, ID SEC n° 11, ID SEC n° 12, ID SEC n° 13, ID SEC n° 14, ID SEC n° 15, ID SEC n° 16 y ID SEC n° 17.
11. El método de la reivindicación 5, en el que dicha secuencia de DNA estructurado es:
a. una repetición homopolímera, de modo que la repetición homopolímera es una repetición de poliA;
b. un origen de replicación eucariota, de modo que el origen de replicación eucariota es un origen de replicación SV40;
c. una secuencia repetida directa, de modo que la secuencia repetida directa se selecciona entre el grupo que consiste en una LTR viral, una LTR lentiviral o una LTR retroviral; o
d. una secuencia repetida invertida, de modo que la secuencia repetida invertida se selecciona entre el grupo que consiste en una repetición de IR/DR de transposón, una repetición de IR/DR de transposón de tipo Bella durmiente, una ITR AAV, una ITR de transposón o una ITR de transposón de tipo PiggyBac.
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