JPWO2019169351A5 - - Google Patents
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Description
[0489]本開示の好ましい実施形態が本明細書において示され、記載されてきたが、このような実施形態は、例としてのみ提供される。多数の変化、変更、および置換が、現在、本開示から逸脱することなく当業者に対して生じるであろう。本明細書に記載の本開示の実施形態に対する様々な変更が本開示の実践において用いられ得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲が本開示の範囲を規定し、これらの請求項の範囲内の方法および構造ならびにこれらの均等物がそれらによって網羅されることが意図される。
本明細書は以下の発明の開示を包含する。
[1]膵前駆細胞またはその前駆体の集団をエピジェネティック修飾化合物と接触させるステップを含み、前記接触させるステップが、前記エピジェネティック修飾化合物と接触していない内分泌細胞の対応する集団と比較して、クロモグラニンA陽性(CHGA+)細胞の割合が増加した、またはC-ペプチド陽性かつNKX6.1陽性(C-PEP+、NKX6.1+)の細胞の割合が増加した内分泌細胞の集団をもたらす、方法。
[2]膵前駆細胞またはその前駆体の集団をエピジェネティック修飾化合物と接触させるステップを含み、前記接触させるステップが、前記エピジェネティック修飾化合物と接触していない内分泌細胞の対応する集団と比較して、VMATまたはCdx2を発現する細胞の割合が減少した内分泌細胞の集団をもたらす、方法。
[3]前記エピジェネティック修飾化合物が、DNAメチル化阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、またはブロモドメイン阻害剤のうち1つまたは複数を含む、[1]または[2]に記載の方法。
[4]前記エピジェネティック修飾化合物がヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤を含む、[3]に記載の方法。
[5]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がEZH2阻害剤である、[4]に記載の方法。
[6]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がDZNep、GSK126、およびEPZ6438からなる群から選択される、[4]または[5]に記載の方法。
[7]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がDZNepである、[6]に記載の方法。
[8]前記膵前駆細胞またはその前駆体の集団に接触させる前記DZNepの濃度が、約0.05μM~約50μM、約0.1μM~約10μM、約0.5μM~約5μM、約0.75μM~約2.5μM、または約1μM~約2μMである、[7]に記載の方法。
[9]前記DZNepの前記濃度が少なくとも約0.5μMである、[8]に記載の方法。
[10]前記DZNepの前記濃度が約1μMである、[8]に記載の方法。
[11]前記エピジェネティック修飾化合物がヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤を含む、[1]から[10]のいずれかに記載の方法。
[12]前記HDAC阻害剤がクラスI HDAC阻害剤、クラスII HDAC阻害剤、またはそれらの組合せである、[11]に記載の方法。
[13]前記HDAC阻害剤がKD5170、MC1568、およびTMP195からなる群から選択される、[12]に記載の方法。
[14]前記HDAC阻害剤がKD5170である、[13]に記載の方法。
[15]前記エピジェネティック修飾化合物がHDAC阻害剤およびEZH2阻害剤を含む、[1]または[2]に記載の方法。
[16]前記エピジェネティック修飾化合物がDZNepおよびKD5170を含む、[1]または[2]に記載の方法。
[17]in vitroで実施される、[1]から[16]のいずれかに記載の方法。
[18]前記膵前駆細胞またはその前駆体の集団を(i)SHH経路阻害剤、(ii)レチノイン酸(RA)シグナル伝達経路活性化剤、(iii)γ-セクレターゼ阻害剤、(iv)上皮細胞成長因子(EGF)ファミリーからの成長因子、(v)骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達経路阻害剤、(vi)TGF-βシグナル伝達経路阻害剤、(vii)甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、(viii)プロテインキナーゼ阻害剤、および(ix)ROCK阻害剤からなる群から選択される薬剤と接触させるステップをさらに含む、[1]から[17]のいずれかに記載の方法。
[19](A)前記SHH経路阻害剤がSANT1を含む、
(B)前記RAシグナル伝達経路活性化剤がレチノイン酸を含む、
(C)前記γ-セクレターゼ阻害剤がXXIを含む、
(D)前記EGFファミリーからの成長因子がベータセルリンを含む、
(E)前記BMPシグナル伝達経路阻害剤がLDNを含む、
(F)前記TGF-βシグナル伝達経路阻害剤がAlk5i IIを含む、
(G)前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤がGC-1を含む、
(H)前記プロテインキナーゼ阻害剤がスタウロスポリンを含む、または
(I)前記ROCK阻害剤がチアゾビニンを含む、
[18]に記載の方法。
[20]前記膵前駆細胞またはその前駆体の集団を、ベータセルリン、チアゾビニン、レチノイン酸、SANT1、XXI、Alk5i II、GC-1、LDN、およびスタウロスポリンからなる群から選択される薬剤と接触させるステップを含む、[18]または[19]に記載の方法。
[21]前記接触させるステップが少なくとも3日間である、[18]から[20]のいずれかに記載の方法。
[22]前記接触させるステップが、前記膵前駆細胞またはその前駆体の集団を前記エピジェネティック修飾化合物と3日を超える期間接触させるステップ、および前記期間のうち最初の3日間に前記膵前駆細胞またはその前駆体の集団と前記接触させるステップの後で、前記SHH経路阻害剤、前記RAシグナル伝達経路活性化剤、または前記EGFファミリーからの前記成長因子を除去するステップを含む、[21]に記載の方法。
[23]前記接触させるステップが少なくとも5日間である、[18]から[22]のいずれかに記載の方法。
[24]前記接触させるステップが約7日間である、[18]から[23]のいずれかに記載の方法。
[25]前記膵前駆細胞の集団のうち少なくとも1個の細胞がPDX1およびNKX6-1のうち少なくとも1つを発現する、[1]から[24]のいずれかに記載の方法。
[26]前記膵前駆細胞の集団のうち少なくとも1個の細胞がPDX1およびNKX6-1の両
方を発現する、[1]から[25]のいずれかに記載の方法。
[27]前記内分泌細胞の集団のうち少なくとも1個の細胞がCHGAを発現する、[1]から[26]のいずれかに記載の方法。
[28]前記内分泌細胞の集団のうち少なくとも1個の細胞がC-ペプチドおよびNKX6.1を発現する、[1]から[27]のいずれかに記載の方法。
[29]前記内分泌細胞の集団が、フローサイトメトリーによって測定して、前記エピジェネティック修飾化合物と接触していない内分泌細胞の対応する集団よりも少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、120%、150%、180%、200%、220%、250%、280%、300%、320%、350%、380%、400%、420%、450%、480%、または500%高い割合のCHGA+細胞を含む、[1]から[28]のいずれかに記載の方法。
[30]前記内分泌細胞の集団が、フローサイトメトリーによって測定して、前記エピジェネティック修飾化合物と接触していない内分泌細胞の対応する集団よりも少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、120%、150%、180%、200%、220%、250%、280%、300%、320%、350%、380%、400%、420%、450%、480%、または500%高い割合のC-PEP+、NKX6.1+細胞を含む、[1]から[29]のいずれかに記載の方法。
[31]前記内分泌細胞の集団が、フローサイトメトリーによって測定して、前記少なくとも1つのエピジェネティック修飾化合物と接触していない内分泌細胞の対応する集団よりも少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、120%、150%、180%、200%、220%、250%、280%、300%、320%、350%、380%、または400%低い割合の、VMATまたはCdx2を発現する細胞を含む、[1]から[30]のいずれかに記載の方法。
[32][1]から[31]のいずれかに記載の方法によって生成された細胞。
[33]細胞集団を含む組成物であって、前記細胞集団が、フローサイトメトリーによって測定して、
(a)少なくとも約20%の、C-ペプチドおよびNKX6.1を発現する細胞、
(b)少なくとも約60%の、CHGAを発現する細胞、
(c)多くとも約20%の、Cdx2を発現する細胞、または
(d)多くとも約45%の、VMAT1を発現する細胞
を含む、組成物。
[34]フローサイトメトリーによって測定して、少なくとも約30%のISL1陽性、NKX6.1陽性の細胞および多くとも約20%のISL1陰性NKX6.1陰性の細胞を含む細胞集団を含む組成物。
[35]前記細胞集団が、少なくとも約35%のISL1陽性、NKX6.1陽性の細胞を含む、[34]に記載の組成物。
[36]前記細胞集団が、少なくとも約40%のISL1陽性、NKX6.1陽性の細胞を含む、[34]に記載の組成物。
[37]前記細胞集団が、多くとも約15%のISL1陰性、NKX6.1陰性の細胞を含む、[34]から[36]のいずれかに記載の組成物。
[38]フローサイトメトリーによって測定して、
(a)少なくとも約20%の、C-ペプチドおよびNKX6.1を発現する細胞、
(b)少なくとも約60%の、CHGAを発現する細胞、および
(c)多くとも約20%の、Cdx2を発現する細胞
を含む、[33]から[37]のいずれかに記載の組成物。
[39]フローサイトメトリーによって測定して、多くとも約45%の、VMAT1を発現する細胞を含む、[38]に記載の組成物。
[40]エピジェネティック修飾化合物をさらに含む、[33]から[39]のいずれかに記載の組成物。
[41]前記エピジェネティック修飾化合物が、DNAメチル化阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、またはブロモドメイン阻害剤のうち1つまたは複数を含む、[40]に記載の組成物。
[42]前記エピジェネティック修飾化合物がヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤を含む、[40]に記載の組成物。
[43]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がEZH2阻害剤である、[42]に記載の組成物。
[44]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がDZNep、GSK126、およびEPZ6438からなる群から選択される、[42]または[43]に記載の組成物。
[45]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がDZNepである、[44]に記載の組成物。
[46]前記膵前駆細胞またはその前駆体の集団に接触させる前記DZNepの濃度が、約0.05μM~約50μM、約0.1μM~約10μM、約0.5μM~約5μM、約0.75μM~約2.5μM、または約1μM~約2μMである、[45]に記載の組成物。
[47]前記DZNepの前記濃度が少なくとも約0.5μMである、[46]に記載の組成物。
[48]前記DZNepの前記濃度が約1μMである、[46]に記載の組成物。
[49]前記エピジェネティック修飾化合物がヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤を含む、[40]から[48]のいずれかに記載の組成物。
[50]前記HDAC阻害剤がクラスI HDAC阻害剤、クラスII HDAC阻害剤、またはそれらの組合せである、[49]に記載の組成物。
[51]前記HDAC阻害剤がKD5170、MC1568、およびTMP195からなる群から選択される、[50]に記載の組成物。
[52]前記HDAC阻害剤がKD5170である、[50]に記載の組成物。
[53]前記エピジェネティック修飾化合物がHDAC阻害剤およびEZH2阻害剤を含む、[40]に記載の組成物。
[54]前記エピジェネティック修飾化合物がDZNepおよびKD5170を含む、[40]に記載の組成物。
[55](i)SHH経路阻害剤、(ii)レチノイン酸(RA)シグナル伝達経路活性化剤、(iii)γ-セクレターゼ阻害剤、(iv)上皮細胞成長因子(EGF)ファミリーからの成長因子、(v)骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達経路阻害剤、(vi)TGF-βシグナル伝達経路阻害剤、(vii)甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、(viii)プロテインキナーゼ阻害剤、および(ix)ROCK阻害剤からなる群から選択される薬剤をさらに含む、[33]から[54]のいずれかに記載の組成物。
[56](A)前記SHH経路阻害剤がSANT1を含む、
(B)前記RAシグナル伝達経路活性化剤がレチノイン酸を含む、
(C)前記γ-セクレターゼ阻害剤がXXIを含む、
(D)前記EGFファミリーからの成長因子がベータセルリンを含む、
(E)前記BMPシグナル伝達経路阻害剤がLDNを含む、
(F)前記TGF-βシグナル伝達経路阻害剤がAlk5i IIを含むか
(G)前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤がGC-1を含む、
(H)前記プロテインキナーゼ阻害剤がスタウロスポリンを含む、または
(I)前記ROCK阻害剤がチアゾビニンを含む、
[55]に記載の組成物。
[57]ベータセルリン、チアゾビニン、レチノイン酸、SANT1、XXI、Alk5i II、GC-1、LDN、およびスタウロスポリンからなる群から選択される薬剤を含む、[55]または[56]に記載の組成物。
[58]膵前駆細胞、およびヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤またはヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤のうち少なくとも1つを含む組成物。
[59]内分泌細胞をさらに含む、[58]に記載の組成物。
[60]前記HDAC阻害剤がクラスI HDAC阻害剤、クラスII HDAC阻害剤、またはそれらの組合せである、[58]または[59]に記載の組成物。
[61]前記HDAC阻害剤がKD5170、MC1568、およびTMP195からなる群から選択される、[60]に記載の組成物。
[62]前記HDAC阻害剤がKD5170である、[61]に記載の組成物。
[63]前記組成物中の前記KD5170の濃度が、約0.05μM~約50μM、約0.1μM~約10μM、約0.5μM~約5μM、約0.75μM~約2.5μM、または約1μM~約2μMである、[62]に記載の組成物。
[64]前記KD5170の前記濃度が少なくとも0.5μMである、[63]に記載の組成物。
[65]前記KD5170の前記濃度が約1μMである、[64]に記載の組成物。
[66]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がEZH2阻害剤である、[58]から[65]のいずれかに記載の組成物。
[67]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がDZNep、GSK126、およびEPZ6438からなる群から選択される、[66]に記載の組成物。
[68]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がDZNepである、[67]に記載の組成物。
[69]前記組成物中の前記DZNepの濃度が、約0.05μM~約50μM、約0.1μM~約10μM、約0.5μM~約5μM、約0.75μM~約2.5μM、または約1μM~約2μMである、[68]に記載の組成物。
[70]前記DZNepの前記濃度が少なくとも約0.5μMである、[69]に記載の組成物。
[71]前記DZNepの前記濃度が約1μMである、[69]に記載の組成物。
[72]前記HDAC阻害剤がKD5170であり、前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がDZNepである、[58]に記載の組成物。
[73]in vitro組成物である、[58]から[72]のいずれかに記載の組成物。
[74](i)SHH経路阻害剤、(ii)レチノイン酸(RA)シグナル伝達経路活性化剤、(iii)γ-セクレターゼ阻害剤、(iv)上皮細胞成長因子(EGF)ファミリーからの成長因子、(v)骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達経路阻害剤、(vi)TGF-βシグナル伝達経路阻害剤、(vii)甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、(viii)プロテインキナーゼ阻害剤、および(ix)ROCK阻害剤からなる群から選択される薬剤をさらに含む、[58]から[73]のいずれかに記載の組成物。
[75](A)前記SHH経路阻害剤がSANT1を含むか、
(B)前記RAシグナル伝達経路活性化剤がレチノイン酸を含むか、
(C)前記γ-セクレターゼ阻害剤がXXIを含むか、
(D)前記EGFファミリーからの成長因子がベータセルリンを含むか、
(E)前記BMPシグナル伝達経路阻害剤がLDNを含むか、
(F)前記TGF-βシグナル伝達経路阻害剤がAlk5i IIを含むか、
(G)前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤がGC-1を含むか、
(H)前記プロテインキナーゼ阻害剤がスタウロスポリンを含むか、または
(I)前記ROCK阻害剤がチアゾビニンを含む、
[74]に記載の組成物。
[76]ベータセルリン、チアゾビニン、レチノイン酸、SANT1、XXI、Alk5i II、GC-1、LDN、およびスタウロスポリンからなる群から選択される薬剤をさらに含む、[74]または[75]に記載の組成物。
[77]膵前駆細胞またはその前駆体を含む細胞集団をヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触させて、内分泌細胞を含む細胞集団を産生させるステップ、および
前記内分泌細胞を含む細胞集団を成熟させて、グルコースチャレンジに対してin vi
troグルコース刺激インスリン分泌応答を呈する少なくとも1個の膵β細胞を得るステップ
を含む方法。
[78]前記細胞集団を(i)SHH経路阻害剤、(ii)レチノイン酸(RA)シグナル伝達経路活性化剤、(iii)γ-セクレターゼ阻害剤、(iv)上皮細胞成長因子(EGF)ファミリーからの成長因子、(v)骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達経路阻害剤、(vi)TGF-βシグナル伝達経路阻害剤、(vii)甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、(viii)プロテインキナーゼ阻害剤、および(ix)ROCK阻害剤からなる群から選択される薬剤と接触させるステップをさらに含む、[77]に記載の方法。
[79](A)前記SHH経路阻害剤がSANT1を含む、
(B)前記RAシグナル伝達経路活性化剤がレチノイン酸を含む、
(C)前記γ-セクレターゼ阻害剤がXXIを含む、
(D)前記EGFファミリーからの成長因子がベータセルリンを含む、
(E)前記BMPシグナル伝達経路阻害剤がLDNを含む、
(F)前記TGF-βシグナル伝達経路阻害剤がAlk5i IIを含む、
(G)前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤がGC-1を含む、
(H)前記プロテインキナーゼ阻害剤がスタウロスポリンを含む、または
(I)前記ROCK阻害剤がチアゾビニンを含む、
[78]に記載の方法。
[80]前記細胞集団をベータセルリン、チアゾビニン、レチノイン酸、SANT1、XXI、Alk5i II、GC-1、LDN、およびスタウロスポリンからなる群から選択される薬剤と接触させるステップを含む、[78]または[79]に記載の方法。
[81]前記細胞集団をヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤と接触させるステップをさらに含む、[77]から[80]のいずれかに記載の方法。
[82]前記HDAC阻害剤がKD5170である、[81]に記載の方法。
[83]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がDZNep、GSK126、およびEPZ6438からなる群から選択される、[77]から[82]のいずれかに記載の方法。
[84]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がDZNepである、[83]に記載の方法。
[85]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触させる前記ステップが、前記内分泌細胞を含み、前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触していない内分泌細胞の対応する集団と比較して、クロモグラニンA陽性(CHGA+)細胞の割合が増加した、またはC-ペプチド陽性かつNKX6.1陽性(C-PEP+、NKX6.1+)の細胞の割合が増加した集団をもたらす、[77]から[84]のいずれかに記載の方法。
[86]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触させる前記ステップが、前記内分泌細胞を含み、前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触していない内分泌細胞の対応する集団と比較して、VMATまたはCdx2を発現する細胞の割合が減少した集団をもたらす、[77]から[85]のいずれかに記載の方法。
[87]前記膵前駆細胞またはその前駆体のうち前記少なくとも1個の細胞がPdx1およびNKX6.1の両方を発現する、[77]から[86]のいずれかに記載の方法。
[88]複数の幹細胞をin vitroで分化させて前記膵前駆細胞またはその前駆体を含む前記細胞集団を得るステップをさらに含む、[77]から[87]のいずれかに記載の方法。
[89][77]から[88]のいずれかに記載の方法によって産生された膵β細胞。
[90](a)Pdx1陰性NKX6.1陰性の原腸管細胞の集団を骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達経路阻害剤およびトランスフォーメーション成長因子β(TGF-β)スーパーファミリーからの成長因子と接触させ、それによりPdx1陽性、NKX6.1陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団を産生させるステップ、および
(b)前記Pdx1陽性、NKX6.1陽性の膵前駆細胞を含む前記細胞集団をエピジェネティック修飾化合物と接触させて、内分泌細胞を含む細胞集団を産生させるステップ
を含む方法。
[91]前記BMPシグナル伝達経路阻害剤がDMH-1、その誘導体、類似体、または変異体を含む、[90]に記載の方法。
[92]前記Pdx1陰性、NKX6.1陰性の原腸管細胞の集団に接触させる前記DMH-1の濃度が、約0.01μM~約10μM、約0.05μM~約5μM、約0.1μM~約1μM、または約0.15μM~約0.5μMである、[91]に記載の方法。
[93]前記Pdx1陰性、NKX6.1陰性の原腸管細胞の集団に接触させる前記DMH-1の濃度が約0.25μMのDMH-1である、[91]に記載の方法。
[94]前記TGF-βスーパーファミリーからの成長因子がアクチビンAを含む、[91]から[93]のいずれかに記載の方法。
[95]前記Pdx1陰性、NKX6.1陰性の原腸管細胞の集団に接触させる前記アクチビンAの濃度が、約0.5ng/mL~約200ng/mL、約1ng/mL~約100ng/mL、約2ng/mL~約50ng/mL、または約5ng/mL~約30ng/mLである、[94]に記載の方法。
[96]前記Pdx1陰性、NKX6.1陰性の原腸管細胞の集団に接触させる前記アクチビンAの濃度が少なくとも約5ng/mLまたは少なくとも約10ng/mLのアクチビンAである、[94]に記載の方法。
[97]前記Pdx1陰性、NKX6.1陰性の原腸管細胞の集団に接触させる前記アクチビンAの濃度が約20ng/mLのアクチビンAである、[94]に記載の方法。
[98]前記Pdx1陰性、NKX6.1陰性の原腸管細胞の集団を接触させる前記ステップが、FGFファミリーからの成長因子、SHH経路阻害剤、RAシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼC活性化剤、およびROCK阻害剤からなる群から選択される薬剤と接触させるステップをさらに含む、[90]から[97]のいずれかに記載の方法。
[99]前記エピジェネティック修飾化合物が、DNAメチル化阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラ
ーゼ阻害剤、およびブロモドメイン阻害剤からなる群から選択される化合物を含む、[90]から[98]のいずれかに記載の方法。
[100]前記エピジェネティック修飾化合物がヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤を含む、[99]に記載の方法。
[101]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がEZH2阻害剤である、[100]に記載の方法。
[102]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がDZNep、GSK126、およびEPZ6438からなる群から選択される、[100]または[101]に記載の方法。
[103]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がDZNepである、[102]に記載の方法。
[104]前記膵前駆細胞またはその前駆体の集団に接触させる前記DZNepの濃度が、約0.05μM~約50μM、約0.1μM~約10μM、約0.5μM~約5μM、約0.75μM~約2.5μM、または約1μM~約2μMである、[103]に記載の方法
[105]前記DZNepの前記濃度が少なくとも約0.5μMである、[104]に記載の方法。
[106]前記DZNepの前記濃度が約1μMである、[104]に記載の方法。
[107]前記エピジェネティック修飾化合物がヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤を含む、[90]から[106]のいずれかに記載の方法。
[108]前記HDAC阻害剤がクラスI HDAC阻害剤、クラスII HDAC阻害剤、またはそれらの組合せである、[107]に記載の方法。
[109]前記HDAC阻害剤がKD5170、MC1568、およびTMP195からなる群から選択される、[108]に記載の方法。
[110]前記HDAC阻害剤がKD5170である、[109]に記載の方法。
[111]in vitroで実施される、[90]から[110]のいずれかに記載の方法。
[112]前記Pdx1陽性、NKX6.1陽性の膵前駆細胞を含む前記集団を(i)SHH経路阻害剤、(ii)レチノイン酸(RA)シグナル伝達経路活性化剤、(iii)γ-セクレターゼ阻害剤、(iv)上皮細胞成長因子(EGF)ファミリーからの成長因子、(v)骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達経路阻害剤、(vi)TGF-βシグナル伝達経路阻害剤、(vii)甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、(viii)プロテインキナーゼ阻害剤、および(ix)ROCK阻害剤からなる群から選択される薬剤と接触させるステップをさらに含む、[90]から[111]のいずれかに記載の方法。
[113](A)前記SHH経路阻害剤がSANT1を含む、
(B)前記RAシグナル伝達経路活性化剤がレチノイン酸を含む、
(C)前記γ-セクレターゼ阻害剤がXXIを含む、
(D)前記EGFファミリーからの成長因子がベータセルリンを含む、
(E)前記BMPシグナル伝達経路阻害剤がLDNを含む、
(F)前記TGF-βシグナル伝達経路阻害剤がAlk5i IIを含むか、
(G)前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤がGC-1を含む、
(H)前記プロテインキナーゼ阻害剤がスタウロスポリンを含む、または
(I)前記ROCK阻害剤がチアゾビニンを含む、
[112]に記載の方法。
[114]前記Pdx1陽性、NKX6.1陽性の膵前駆細胞を含む前記集団をベータセルリン、チアゾビニン、レチノイン酸、SANT1、XXI、Alk5i II、GC-1、LDN、およびスタウロスポリンからなる群から選択される薬剤と接触させるステップを含む、[112]または[113]に記載の方法。
[115]前記接触させるステップが少なくとも3日間である、[112]から[114]のいずれかに記載の方法。
[116]前記接触させるステップが、前記Pdx1陽性、NKX6.1陽性の膵前駆細胞を含む前記集団を前記エピジェネティック修飾化合物と3日を超える期間接触させるステップ、および前記期間のうち最初の3日間に前記膵前駆細胞またはその前駆体の集団と前記接触させるステップの後で、前記SHH経路阻害剤、前記RAシグナル伝達経路活性化剤、または前記EGFファミリーからの成長因子を除去するステップを含む、[115]に記載の方法。
[117]前記接触させるステップが少なくとも5日間である、[112]から[116]のいずれかに記載の方法。
[118]前記接触させるステップが約7日間である、[112]から[116]のいずれかに記載の方法。
[119]前記Pdx1陽性、NKX6.1陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団が、フローサイトメトリーによって測定して多くとも約10%の、Cdx2を発現する細胞を含む、[90]から[118]のいずれかに記載の方法。
[120]前記Pdx1陽性、NKX6.1陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団が、前記骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達経路阻害剤および前記トランスフォーメーション成長因子β(TGF-β)スーパーファミリーからの成長因子と接触していない対応する細胞集団と比較して、より少ない割合の、Cdx2を発現する細胞を含む、[90]から[119]のいずれかに記載の方法。
[121]前記内分泌細胞を含む細胞集団が、フローサイトメトリーによって測定して、少なくとも約40%の、ISL1およびNKX6.1を発現する細胞を含む、[90]から[120]のいずれかに記載の方法。
[122]前記内分泌細胞を含む細胞集団が、前記骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達経路阻害剤および前記トランスフォーメーション成長因子β(TGF-β)スーパーファミリーからの成長因子と前記接触をしていない対応する細胞集団と比較して、より多い割合の、ISL1およびNKX6.1を発現する細胞を含む、[90]から[121]のいずれかに記載の方法。
[123]前記内分泌細胞を含む細胞集団が、フローサイトメトリーによって測定して、多くとも約15%のISL1陰性、NKX6.1陰性の細胞を含む、[90]から[122]のいずれかに記載の方法。
[124]前記内分泌細胞を含む細胞集団が、前記骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達経路阻害剤および前記トランスフォーメーション成長因子β(TGF-β)スーパーファミリーからの成長因子と前記接触をしていない対応する細胞集団と比較して、より少ない割合のISL1陰性、NKX6.1陰性の細胞を含む、[90]から[122]のいずれかに記載の方法。
[125]前記内分泌細胞を含む細胞集団を凍結保存するステップをさらに含む、[90]から[124]のいずれかに記載の方法。
[126]前記内分泌細胞を含む細胞集団が細胞クラスターであり、前記方法が、
(a)前記細胞クラスターから複数の細胞を分離するステップ、および
(b)ステップ(a)からの前記複数の細胞を再凝集培地中で培養して、前記複数の細胞の少なくとも一部に第2の細胞クラスターを形成させるステップ
をさらに含む、[90]から[125]のいずれかに記載の方法。
[127]前記分離するステップが、前記複数の細胞をフローサイトメトリーに供するステップを含まない、[126]に記載の方法。
[128]前記再凝集培地が血清を含まない、[126]または[127]に記載の方法。
[129]前記再凝集培地が外因性分化因子を含まない、[126]から[128]のいずれかに記載の方法。
[130]前記内分泌細胞をin vitroで成熟させて、グルコースチャレンジに対してin
vitroグルコース刺激インスリン分泌応答を呈する少なくとも1個の膵β細胞を得るステップをさらに含む、[90]から[129]のいずれかに記載の方法。
[131]前記成熟させるステップが無血清培地中で実施される、[130]に記載の方法。
[132]前記成熟させるステップがゼノフリー培地中で実施される、[130]または[131]に記載の方法。
[133]前記成熟させるステップが外因性分化因子を含まない培地中で実施される、[130]から[132]のいずれかに記載の方法。
[134]前記成熟させるステップがヒト血清アルブミン(HSA)の存在下で実施される、[130]から[133]のいずれかに記載の方法。
[135]前記HSAが約0.1%~約5%、約0.5%~約2%の濃度で存在する、[134]に記載の方法。
[136]前記HSAが約1%の濃度で存在する、[134]に記載の方法。
[137](a)集団中の多能性幹細胞をTGF-βスーパーファミリーからの成長因子およびWNTシグナル伝達経路活性化剤と接触させることによって、前記多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるステップ、
(b)前記胚体内胚葉細胞をFGFファミリーからの成長因子と接触させることによって、前記胚体内胚葉細胞の少なくとも一部を原腸管細胞に分化させるステップ、
(c)前記原腸管細胞をROCK阻害剤、FGFファミリーからの成長因子、BMPシグ
ナル伝達経路阻害剤、PKC活性化剤、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、SHH経路阻害剤、およびTGF-βスーパーファミリーからの成長因子と接触させることによって前記原腸管細胞の少なくとも一部をPdx1陽性膵前駆細胞に分化させるステップ、(d)前記Pdx1陽性膵前駆細胞をROCK阻害剤、TGFβスーパーファミリーからの成長因子、FGFファミリーからの成長因子、RAシグナル伝達経路活性化剤、およびSHH経路阻害剤と接触させることによって前記Pdx1陽性膵前駆細胞の少なくとも一部をPdx1陽性、NKX6.1陽性の膵前駆細胞に分化させるステップ、ならびに
(e)前記Pdx1陽性、NKX6.1陽性の膵前駆細胞をTGF-βシグナル伝達経路阻害剤、EGFファミリーからの成長因子、RAシグナル伝達経路活性化剤、SHH経路阻害剤、THシグナル伝達経路活性化剤、γ-セクレターゼ阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ROCK阻害剤、BMPシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物と接触させることによって前記Pdx1陽性、NKX6.1陽性の膵前駆細胞の少なくとも一部を少なくとも1個のNKX6.1+かつC-ペプチド+の細胞を含む細胞集団に分化させるステップ
を含む方法。
[138][90]から[129]のいずれかまたは[137]に記載の方法によって産生された内分泌細胞を含む細胞集団。
[139][130]から[136]のいずれかに記載の方法によって産生されるSC-β細胞を含む細胞集団。
[140]内分泌細胞を含むin vitroの細胞集団を約100rad~約100,000radの線量で約1分~約60分の時間の照射に曝露するステップを含む方法。
[141]幹細胞、胚体内胚葉細胞、原腸管細胞、膵前駆細胞、または内分泌細胞を含む細胞集団を照射に曝露するステップを含み、前記照射が、照射に供されていない対応する細胞集団と比較して増殖能力が低減した細胞集団をもたらす、細胞の増殖を低減させる方法。
[142]前記細胞集団が、約100rad~約50,000rad、約100rad~約25,000rad、約100rad~約10,000rad、約250rad~約25,000rad、約500rad~約25,000rad、約1,000rad~約25,000rad、約2,500rad~約25,000rad、約5,000rad~約25,000rad、または約10,000rad~約15,000radの照射に曝露される、[140]または[141]に記載の方法。
[143]前記細胞集団が約10,000radの照射に曝露される、[140]または[141]に記載の方法。
[144]前記細胞集団が、約1分~約55分、約1分~約50分、約1分~約45分、約1分~約40分、約1分~約35分、約1分~約30分、約1分~約25分、約1分~約20分、約1分~約10分、約1分~約5分、約10分~約55分、約15分~約55分、約20分~約55分、約25分~約55分、約30分~約55分、約20分~約40分、または約25分~約35分、照射に曝露される、[140]から[143]のいずれかに記載の方法。
[145]前記細胞集団が約30分、照射に曝露される、[140]から[143]のいずれかに記載の方法。
[146]前記照射がイオン化照射を含む、[140]から[145]のいずれかに記載の方法
。
[147]前記イオン化照射がガンマ線、X線、紫外線放射、アルファ線、ベータ線、または中性子線を含む、[140]から[146]のいずれかに記載の方法。
[148]前記照射が、前記照射に供されていない対応する細胞クラスターと比較して増殖が低減した細胞集団をもたらす、[140]から[147]のいずれかに記載の方法。
[149]前記細胞集団が、約50μm~約500μm、約50μm~約300μm、約50μm~約200μm、約50μm~約150μm、約600μm~約150μm、約700μm~約150μm、約80μm~約150μm、または約60μm~約100μmの直径を有する第2の細胞クラスターを含む、[140]から[148]のいずれかに記載の方法。
[150](a)第1の細胞クラスターから複数の細胞を分離するステップ、および
(b)ステップ(a)からの前記複数の細胞を再凝集培地中で培養して、前記複数の細胞の少なくとも一部に前記第2の細胞クラスターを形成させるステップ
をさらに含む、[149]に記載の方法。
[151]前記分離するステップが、前記複数の細胞をフローサイトメトリーに供するステップを含まない、[150]に記載の方法。
[152]前記第1の細胞クラスターが、第3の細胞クラスターを分離し、前記第3の細胞クラスターから分離した細胞を培養して、前記第1の細胞クラスターを形成させることによって得られる、[150]または[151]に記載の方法。
[153]前記細胞クラスターが前記照射の前に凍結保存され、前記方法が、凍結保存された前記細胞クラスターを前記照射の前に解凍するステップをさらに含む、[149]に記載の方法。
[154]前記細胞クラスターが前記照射に供されている間に凍結保存される、[149]に記載の方法。
[155]凍結保存された前記細胞クラスターを照射の後に解凍し、前記内分泌細胞の少なくとも一部を分化させるステップをさらに含む、[154]に記載の方法。
[156]膵前駆細胞またはその前駆体をin vitroで分化させることによって前記内分泌細胞を含む前記細胞集団を得るステップをさらに含む、[140]から[155]のいずれかに記載の方法。
[157]幹細胞をin vitroで分化させ、それにより前記内分泌細胞を含む前記細胞集団を産生させるステップをさらに含む、[140]から[156]のいずれかに記載の方法。
[158]前記内分泌細胞の少なくとも一部をin vitroで膵β細胞に成熟させ、それにより細胞集団を産生させるステップをさらに含む、[140]から[157]のいずれかに記載の方法。
[159]前記膵β細胞をそれを必要とする対象に埋め込むステップをさらに含む、[158]に記載の方法。
[160]埋め込まれた前記膵β細胞が、前記対象において少なくとも約50日、60日、70日、80日、90日、またはそれより長く、血中グルコースレベルを制御するように構成されている、[159]に記載の方法。
[161][140]から[157]のいずれかに記載の方法によって産生された内分泌細胞を含む細胞集団。
[162][158]から[160]のいずれかに記載の方法によって産生された膵β細胞を含む細胞集団。
本明細書は以下の発明の開示を包含する。
[1]膵前駆細胞またはその前駆体の集団をエピジェネティック修飾化合物と接触させるステップを含み、前記接触させるステップが、前記エピジェネティック修飾化合物と接触していない内分泌細胞の対応する集団と比較して、クロモグラニンA陽性(CHGA+)細胞の割合が増加した、またはC-ペプチド陽性かつNKX6.1陽性(C-PEP+、NKX6.1+)の細胞の割合が増加した内分泌細胞の集団をもたらす、方法。
[2]膵前駆細胞またはその前駆体の集団をエピジェネティック修飾化合物と接触させるステップを含み、前記接触させるステップが、前記エピジェネティック修飾化合物と接触していない内分泌細胞の対応する集団と比較して、VMATまたはCdx2を発現する細胞の割合が減少した内分泌細胞の集団をもたらす、方法。
[3]前記エピジェネティック修飾化合物が、DNAメチル化阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、またはブロモドメイン阻害剤のうち1つまたは複数を含む、[1]または[2]に記載の方法。
[4]前記エピジェネティック修飾化合物がヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤を含む、[3]に記載の方法。
[5]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がEZH2阻害剤である、[4]に記載の方法。
[6]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がDZNep、GSK126、およびEPZ6438からなる群から選択される、[4]または[5]に記載の方法。
[7]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がDZNepである、[6]に記載の方法。
[8]前記膵前駆細胞またはその前駆体の集団に接触させる前記DZNepの濃度が、約0.05μM~約50μM、約0.1μM~約10μM、約0.5μM~約5μM、約0.75μM~約2.5μM、または約1μM~約2μMである、[7]に記載の方法。
[9]前記DZNepの前記濃度が少なくとも約0.5μMである、[8]に記載の方法。
[10]前記DZNepの前記濃度が約1μMである、[8]に記載の方法。
[11]前記エピジェネティック修飾化合物がヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤を含む、[1]から[10]のいずれかに記載の方法。
[12]前記HDAC阻害剤がクラスI HDAC阻害剤、クラスII HDAC阻害剤、またはそれらの組合せである、[11]に記載の方法。
[13]前記HDAC阻害剤がKD5170、MC1568、およびTMP195からなる群から選択される、[12]に記載の方法。
[14]前記HDAC阻害剤がKD5170である、[13]に記載の方法。
[15]前記エピジェネティック修飾化合物がHDAC阻害剤およびEZH2阻害剤を含む、[1]または[2]に記載の方法。
[16]前記エピジェネティック修飾化合物がDZNepおよびKD5170を含む、[1]または[2]に記載の方法。
[17]in vitroで実施される、[1]から[16]のいずれかに記載の方法。
[18]前記膵前駆細胞またはその前駆体の集団を(i)SHH経路阻害剤、(ii)レチノイン酸(RA)シグナル伝達経路活性化剤、(iii)γ-セクレターゼ阻害剤、(iv)上皮細胞成長因子(EGF)ファミリーからの成長因子、(v)骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達経路阻害剤、(vi)TGF-βシグナル伝達経路阻害剤、(vii)甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、(viii)プロテインキナーゼ阻害剤、および(ix)ROCK阻害剤からなる群から選択される薬剤と接触させるステップをさらに含む、[1]から[17]のいずれかに記載の方法。
[19](A)前記SHH経路阻害剤がSANT1を含む、
(B)前記RAシグナル伝達経路活性化剤がレチノイン酸を含む、
(C)前記γ-セクレターゼ阻害剤がXXIを含む、
(D)前記EGFファミリーからの成長因子がベータセルリンを含む、
(E)前記BMPシグナル伝達経路阻害剤がLDNを含む、
(F)前記TGF-βシグナル伝達経路阻害剤がAlk5i IIを含む、
(G)前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤がGC-1を含む、
(H)前記プロテインキナーゼ阻害剤がスタウロスポリンを含む、または
(I)前記ROCK阻害剤がチアゾビニンを含む、
[18]に記載の方法。
[20]前記膵前駆細胞またはその前駆体の集団を、ベータセルリン、チアゾビニン、レチノイン酸、SANT1、XXI、Alk5i II、GC-1、LDN、およびスタウロスポリンからなる群から選択される薬剤と接触させるステップを含む、[18]または[19]に記載の方法。
[21]前記接触させるステップが少なくとも3日間である、[18]から[20]のいずれかに記載の方法。
[22]前記接触させるステップが、前記膵前駆細胞またはその前駆体の集団を前記エピジェネティック修飾化合物と3日を超える期間接触させるステップ、および前記期間のうち最初の3日間に前記膵前駆細胞またはその前駆体の集団と前記接触させるステップの後で、前記SHH経路阻害剤、前記RAシグナル伝達経路活性化剤、または前記EGFファミリーからの前記成長因子を除去するステップを含む、[21]に記載の方法。
[23]前記接触させるステップが少なくとも5日間である、[18]から[22]のいずれかに記載の方法。
[24]前記接触させるステップが約7日間である、[18]から[23]のいずれかに記載の方法。
[25]前記膵前駆細胞の集団のうち少なくとも1個の細胞がPDX1およびNKX6-1のうち少なくとも1つを発現する、[1]から[24]のいずれかに記載の方法。
[26]前記膵前駆細胞の集団のうち少なくとも1個の細胞がPDX1およびNKX6-1の両
方を発現する、[1]から[25]のいずれかに記載の方法。
[27]前記内分泌細胞の集団のうち少なくとも1個の細胞がCHGAを発現する、[1]から[26]のいずれかに記載の方法。
[28]前記内分泌細胞の集団のうち少なくとも1個の細胞がC-ペプチドおよびNKX6.1を発現する、[1]から[27]のいずれかに記載の方法。
[29]前記内分泌細胞の集団が、フローサイトメトリーによって測定して、前記エピジェネティック修飾化合物と接触していない内分泌細胞の対応する集団よりも少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、120%、150%、180%、200%、220%、250%、280%、300%、320%、350%、380%、400%、420%、450%、480%、または500%高い割合のCHGA+細胞を含む、[1]から[28]のいずれかに記載の方法。
[30]前記内分泌細胞の集団が、フローサイトメトリーによって測定して、前記エピジェネティック修飾化合物と接触していない内分泌細胞の対応する集団よりも少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、120%、150%、180%、200%、220%、250%、280%、300%、320%、350%、380%、400%、420%、450%、480%、または500%高い割合のC-PEP+、NKX6.1+細胞を含む、[1]から[29]のいずれかに記載の方法。
[31]前記内分泌細胞の集団が、フローサイトメトリーによって測定して、前記少なくとも1つのエピジェネティック修飾化合物と接触していない内分泌細胞の対応する集団よりも少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、120%、150%、180%、200%、220%、250%、280%、300%、320%、350%、380%、または400%低い割合の、VMATまたはCdx2を発現する細胞を含む、[1]から[30]のいずれかに記載の方法。
[32][1]から[31]のいずれかに記載の方法によって生成された細胞。
[33]細胞集団を含む組成物であって、前記細胞集団が、フローサイトメトリーによって測定して、
(a)少なくとも約20%の、C-ペプチドおよびNKX6.1を発現する細胞、
(b)少なくとも約60%の、CHGAを発現する細胞、
(c)多くとも約20%の、Cdx2を発現する細胞、または
(d)多くとも約45%の、VMAT1を発現する細胞
を含む、組成物。
[34]フローサイトメトリーによって測定して、少なくとも約30%のISL1陽性、NKX6.1陽性の細胞および多くとも約20%のISL1陰性NKX6.1陰性の細胞を含む細胞集団を含む組成物。
[35]前記細胞集団が、少なくとも約35%のISL1陽性、NKX6.1陽性の細胞を含む、[34]に記載の組成物。
[36]前記細胞集団が、少なくとも約40%のISL1陽性、NKX6.1陽性の細胞を含む、[34]に記載の組成物。
[37]前記細胞集団が、多くとも約15%のISL1陰性、NKX6.1陰性の細胞を含む、[34]から[36]のいずれかに記載の組成物。
[38]フローサイトメトリーによって測定して、
(a)少なくとも約20%の、C-ペプチドおよびNKX6.1を発現する細胞、
(b)少なくとも約60%の、CHGAを発現する細胞、および
(c)多くとも約20%の、Cdx2を発現する細胞
を含む、[33]から[37]のいずれかに記載の組成物。
[39]フローサイトメトリーによって測定して、多くとも約45%の、VMAT1を発現する細胞を含む、[38]に記載の組成物。
[40]エピジェネティック修飾化合物をさらに含む、[33]から[39]のいずれかに記載の組成物。
[41]前記エピジェネティック修飾化合物が、DNAメチル化阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、またはブロモドメイン阻害剤のうち1つまたは複数を含む、[40]に記載の組成物。
[42]前記エピジェネティック修飾化合物がヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤を含む、[40]に記載の組成物。
[43]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がEZH2阻害剤である、[42]に記載の組成物。
[44]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がDZNep、GSK126、およびEPZ6438からなる群から選択される、[42]または[43]に記載の組成物。
[45]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がDZNepである、[44]に記載の組成物。
[46]前記膵前駆細胞またはその前駆体の集団に接触させる前記DZNepの濃度が、約0.05μM~約50μM、約0.1μM~約10μM、約0.5μM~約5μM、約0.75μM~約2.5μM、または約1μM~約2μMである、[45]に記載の組成物。
[47]前記DZNepの前記濃度が少なくとも約0.5μMである、[46]に記載の組成物。
[48]前記DZNepの前記濃度が約1μMである、[46]に記載の組成物。
[49]前記エピジェネティック修飾化合物がヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤を含む、[40]から[48]のいずれかに記載の組成物。
[50]前記HDAC阻害剤がクラスI HDAC阻害剤、クラスII HDAC阻害剤、またはそれらの組合せである、[49]に記載の組成物。
[51]前記HDAC阻害剤がKD5170、MC1568、およびTMP195からなる群から選択される、[50]に記載の組成物。
[52]前記HDAC阻害剤がKD5170である、[50]に記載の組成物。
[53]前記エピジェネティック修飾化合物がHDAC阻害剤およびEZH2阻害剤を含む、[40]に記載の組成物。
[54]前記エピジェネティック修飾化合物がDZNepおよびKD5170を含む、[40]に記載の組成物。
[55](i)SHH経路阻害剤、(ii)レチノイン酸(RA)シグナル伝達経路活性化剤、(iii)γ-セクレターゼ阻害剤、(iv)上皮細胞成長因子(EGF)ファミリーからの成長因子、(v)骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達経路阻害剤、(vi)TGF-βシグナル伝達経路阻害剤、(vii)甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、(viii)プロテインキナーゼ阻害剤、および(ix)ROCK阻害剤からなる群から選択される薬剤をさらに含む、[33]から[54]のいずれかに記載の組成物。
[56](A)前記SHH経路阻害剤がSANT1を含む、
(B)前記RAシグナル伝達経路活性化剤がレチノイン酸を含む、
(C)前記γ-セクレターゼ阻害剤がXXIを含む、
(D)前記EGFファミリーからの成長因子がベータセルリンを含む、
(E)前記BMPシグナル伝達経路阻害剤がLDNを含む、
(F)前記TGF-βシグナル伝達経路阻害剤がAlk5i IIを含むか
(G)前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤がGC-1を含む、
(H)前記プロテインキナーゼ阻害剤がスタウロスポリンを含む、または
(I)前記ROCK阻害剤がチアゾビニンを含む、
[55]に記載の組成物。
[57]ベータセルリン、チアゾビニン、レチノイン酸、SANT1、XXI、Alk5i II、GC-1、LDN、およびスタウロスポリンからなる群から選択される薬剤を含む、[55]または[56]に記載の組成物。
[58]膵前駆細胞、およびヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤またはヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤のうち少なくとも1つを含む組成物。
[59]内分泌細胞をさらに含む、[58]に記載の組成物。
[60]前記HDAC阻害剤がクラスI HDAC阻害剤、クラスII HDAC阻害剤、またはそれらの組合せである、[58]または[59]に記載の組成物。
[61]前記HDAC阻害剤がKD5170、MC1568、およびTMP195からなる群から選択される、[60]に記載の組成物。
[62]前記HDAC阻害剤がKD5170である、[61]に記載の組成物。
[63]前記組成物中の前記KD5170の濃度が、約0.05μM~約50μM、約0.1μM~約10μM、約0.5μM~約5μM、約0.75μM~約2.5μM、または約1μM~約2μMである、[62]に記載の組成物。
[64]前記KD5170の前記濃度が少なくとも0.5μMである、[63]に記載の組成物。
[65]前記KD5170の前記濃度が約1μMである、[64]に記載の組成物。
[66]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がEZH2阻害剤である、[58]から[65]のいずれかに記載の組成物。
[67]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がDZNep、GSK126、およびEPZ6438からなる群から選択される、[66]に記載の組成物。
[68]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がDZNepである、[67]に記載の組成物。
[69]前記組成物中の前記DZNepの濃度が、約0.05μM~約50μM、約0.1μM~約10μM、約0.5μM~約5μM、約0.75μM~約2.5μM、または約1μM~約2μMである、[68]に記載の組成物。
[70]前記DZNepの前記濃度が少なくとも約0.5μMである、[69]に記載の組成物。
[71]前記DZNepの前記濃度が約1μMである、[69]に記載の組成物。
[72]前記HDAC阻害剤がKD5170であり、前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がDZNepである、[58]に記載の組成物。
[73]in vitro組成物である、[58]から[72]のいずれかに記載の組成物。
[74](i)SHH経路阻害剤、(ii)レチノイン酸(RA)シグナル伝達経路活性化剤、(iii)γ-セクレターゼ阻害剤、(iv)上皮細胞成長因子(EGF)ファミリーからの成長因子、(v)骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達経路阻害剤、(vi)TGF-βシグナル伝達経路阻害剤、(vii)甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、(viii)プロテインキナーゼ阻害剤、および(ix)ROCK阻害剤からなる群から選択される薬剤をさらに含む、[58]から[73]のいずれかに記載の組成物。
[75](A)前記SHH経路阻害剤がSANT1を含むか、
(B)前記RAシグナル伝達経路活性化剤がレチノイン酸を含むか、
(C)前記γ-セクレターゼ阻害剤がXXIを含むか、
(D)前記EGFファミリーからの成長因子がベータセルリンを含むか、
(E)前記BMPシグナル伝達経路阻害剤がLDNを含むか、
(F)前記TGF-βシグナル伝達経路阻害剤がAlk5i IIを含むか、
(G)前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤がGC-1を含むか、
(H)前記プロテインキナーゼ阻害剤がスタウロスポリンを含むか、または
(I)前記ROCK阻害剤がチアゾビニンを含む、
[74]に記載の組成物。
[76]ベータセルリン、チアゾビニン、レチノイン酸、SANT1、XXI、Alk5i II、GC-1、LDN、およびスタウロスポリンからなる群から選択される薬剤をさらに含む、[74]または[75]に記載の組成物。
[77]膵前駆細胞またはその前駆体を含む細胞集団をヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触させて、内分泌細胞を含む細胞集団を産生させるステップ、および
前記内分泌細胞を含む細胞集団を成熟させて、グルコースチャレンジに対してin vi
troグルコース刺激インスリン分泌応答を呈する少なくとも1個の膵β細胞を得るステップ
を含む方法。
[78]前記細胞集団を(i)SHH経路阻害剤、(ii)レチノイン酸(RA)シグナル伝達経路活性化剤、(iii)γ-セクレターゼ阻害剤、(iv)上皮細胞成長因子(EGF)ファミリーからの成長因子、(v)骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達経路阻害剤、(vi)TGF-βシグナル伝達経路阻害剤、(vii)甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、(viii)プロテインキナーゼ阻害剤、および(ix)ROCK阻害剤からなる群から選択される薬剤と接触させるステップをさらに含む、[77]に記載の方法。
[79](A)前記SHH経路阻害剤がSANT1を含む、
(B)前記RAシグナル伝達経路活性化剤がレチノイン酸を含む、
(C)前記γ-セクレターゼ阻害剤がXXIを含む、
(D)前記EGFファミリーからの成長因子がベータセルリンを含む、
(E)前記BMPシグナル伝達経路阻害剤がLDNを含む、
(F)前記TGF-βシグナル伝達経路阻害剤がAlk5i IIを含む、
(G)前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤がGC-1を含む、
(H)前記プロテインキナーゼ阻害剤がスタウロスポリンを含む、または
(I)前記ROCK阻害剤がチアゾビニンを含む、
[78]に記載の方法。
[80]前記細胞集団をベータセルリン、チアゾビニン、レチノイン酸、SANT1、XXI、Alk5i II、GC-1、LDN、およびスタウロスポリンからなる群から選択される薬剤と接触させるステップを含む、[78]または[79]に記載の方法。
[81]前記細胞集団をヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤と接触させるステップをさらに含む、[77]から[80]のいずれかに記載の方法。
[82]前記HDAC阻害剤がKD5170である、[81]に記載の方法。
[83]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がDZNep、GSK126、およびEPZ6438からなる群から選択される、[77]から[82]のいずれかに記載の方法。
[84]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がDZNepである、[83]に記載の方法。
[85]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触させる前記ステップが、前記内分泌細胞を含み、前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触していない内分泌細胞の対応する集団と比較して、クロモグラニンA陽性(CHGA+)細胞の割合が増加した、またはC-ペプチド陽性かつNKX6.1陽性(C-PEP+、NKX6.1+)の細胞の割合が増加した集団をもたらす、[77]から[84]のいずれかに記載の方法。
[86]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触させる前記ステップが、前記内分泌細胞を含み、前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触していない内分泌細胞の対応する集団と比較して、VMATまたはCdx2を発現する細胞の割合が減少した集団をもたらす、[77]から[85]のいずれかに記載の方法。
[87]前記膵前駆細胞またはその前駆体のうち前記少なくとも1個の細胞がPdx1およびNKX6.1の両方を発現する、[77]から[86]のいずれかに記載の方法。
[88]複数の幹細胞をin vitroで分化させて前記膵前駆細胞またはその前駆体を含む前記細胞集団を得るステップをさらに含む、[77]から[87]のいずれかに記載の方法。
[89][77]から[88]のいずれかに記載の方法によって産生された膵β細胞。
[90](a)Pdx1陰性NKX6.1陰性の原腸管細胞の集団を骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達経路阻害剤およびトランスフォーメーション成長因子β(TGF-β)スーパーファミリーからの成長因子と接触させ、それによりPdx1陽性、NKX6.1陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団を産生させるステップ、および
(b)前記Pdx1陽性、NKX6.1陽性の膵前駆細胞を含む前記細胞集団をエピジェネティック修飾化合物と接触させて、内分泌細胞を含む細胞集団を産生させるステップ
を含む方法。
[91]前記BMPシグナル伝達経路阻害剤がDMH-1、その誘導体、類似体、または変異体を含む、[90]に記載の方法。
[92]前記Pdx1陰性、NKX6.1陰性の原腸管細胞の集団に接触させる前記DMH-1の濃度が、約0.01μM~約10μM、約0.05μM~約5μM、約0.1μM~約1μM、または約0.15μM~約0.5μMである、[91]に記載の方法。
[93]前記Pdx1陰性、NKX6.1陰性の原腸管細胞の集団に接触させる前記DMH-1の濃度が約0.25μMのDMH-1である、[91]に記載の方法。
[94]前記TGF-βスーパーファミリーからの成長因子がアクチビンAを含む、[91]から[93]のいずれかに記載の方法。
[95]前記Pdx1陰性、NKX6.1陰性の原腸管細胞の集団に接触させる前記アクチビンAの濃度が、約0.5ng/mL~約200ng/mL、約1ng/mL~約100ng/mL、約2ng/mL~約50ng/mL、または約5ng/mL~約30ng/mLである、[94]に記載の方法。
[96]前記Pdx1陰性、NKX6.1陰性の原腸管細胞の集団に接触させる前記アクチビンAの濃度が少なくとも約5ng/mLまたは少なくとも約10ng/mLのアクチビンAである、[94]に記載の方法。
[97]前記Pdx1陰性、NKX6.1陰性の原腸管細胞の集団に接触させる前記アクチビンAの濃度が約20ng/mLのアクチビンAである、[94]に記載の方法。
[98]前記Pdx1陰性、NKX6.1陰性の原腸管細胞の集団を接触させる前記ステップが、FGFファミリーからの成長因子、SHH経路阻害剤、RAシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼC活性化剤、およびROCK阻害剤からなる群から選択される薬剤と接触させるステップをさらに含む、[90]から[97]のいずれかに記載の方法。
[99]前記エピジェネティック修飾化合物が、DNAメチル化阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラ
ーゼ阻害剤、およびブロモドメイン阻害剤からなる群から選択される化合物を含む、[90]から[98]のいずれかに記載の方法。
[100]前記エピジェネティック修飾化合物がヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤を含む、[99]に記載の方法。
[101]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がEZH2阻害剤である、[100]に記載の方法。
[102]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がDZNep、GSK126、およびEPZ6438からなる群から選択される、[100]または[101]に記載の方法。
[103]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がDZNepである、[102]に記載の方法。
[104]前記膵前駆細胞またはその前駆体の集団に接触させる前記DZNepの濃度が、約0.05μM~約50μM、約0.1μM~約10μM、約0.5μM~約5μM、約0.75μM~約2.5μM、または約1μM~約2μMである、[103]に記載の方法
[105]前記DZNepの前記濃度が少なくとも約0.5μMである、[104]に記載の方法。
[106]前記DZNepの前記濃度が約1μMである、[104]に記載の方法。
[107]前記エピジェネティック修飾化合物がヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤を含む、[90]から[106]のいずれかに記載の方法。
[108]前記HDAC阻害剤がクラスI HDAC阻害剤、クラスII HDAC阻害剤、またはそれらの組合せである、[107]に記載の方法。
[109]前記HDAC阻害剤がKD5170、MC1568、およびTMP195からなる群から選択される、[108]に記載の方法。
[110]前記HDAC阻害剤がKD5170である、[109]に記載の方法。
[111]in vitroで実施される、[90]から[110]のいずれかに記載の方法。
[112]前記Pdx1陽性、NKX6.1陽性の膵前駆細胞を含む前記集団を(i)SHH経路阻害剤、(ii)レチノイン酸(RA)シグナル伝達経路活性化剤、(iii)γ-セクレターゼ阻害剤、(iv)上皮細胞成長因子(EGF)ファミリーからの成長因子、(v)骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達経路阻害剤、(vi)TGF-βシグナル伝達経路阻害剤、(vii)甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、(viii)プロテインキナーゼ阻害剤、および(ix)ROCK阻害剤からなる群から選択される薬剤と接触させるステップをさらに含む、[90]から[111]のいずれかに記載の方法。
[113](A)前記SHH経路阻害剤がSANT1を含む、
(B)前記RAシグナル伝達経路活性化剤がレチノイン酸を含む、
(C)前記γ-セクレターゼ阻害剤がXXIを含む、
(D)前記EGFファミリーからの成長因子がベータセルリンを含む、
(E)前記BMPシグナル伝達経路阻害剤がLDNを含む、
(F)前記TGF-βシグナル伝達経路阻害剤がAlk5i IIを含むか、
(G)前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤がGC-1を含む、
(H)前記プロテインキナーゼ阻害剤がスタウロスポリンを含む、または
(I)前記ROCK阻害剤がチアゾビニンを含む、
[112]に記載の方法。
[114]前記Pdx1陽性、NKX6.1陽性の膵前駆細胞を含む前記集団をベータセルリン、チアゾビニン、レチノイン酸、SANT1、XXI、Alk5i II、GC-1、LDN、およびスタウロスポリンからなる群から選択される薬剤と接触させるステップを含む、[112]または[113]に記載の方法。
[115]前記接触させるステップが少なくとも3日間である、[112]から[114]のいずれかに記載の方法。
[116]前記接触させるステップが、前記Pdx1陽性、NKX6.1陽性の膵前駆細胞を含む前記集団を前記エピジェネティック修飾化合物と3日を超える期間接触させるステップ、および前記期間のうち最初の3日間に前記膵前駆細胞またはその前駆体の集団と前記接触させるステップの後で、前記SHH経路阻害剤、前記RAシグナル伝達経路活性化剤、または前記EGFファミリーからの成長因子を除去するステップを含む、[115]に記載の方法。
[117]前記接触させるステップが少なくとも5日間である、[112]から[116]のいずれかに記載の方法。
[118]前記接触させるステップが約7日間である、[112]から[116]のいずれかに記載の方法。
[119]前記Pdx1陽性、NKX6.1陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団が、フローサイトメトリーによって測定して多くとも約10%の、Cdx2を発現する細胞を含む、[90]から[118]のいずれかに記載の方法。
[120]前記Pdx1陽性、NKX6.1陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団が、前記骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達経路阻害剤および前記トランスフォーメーション成長因子β(TGF-β)スーパーファミリーからの成長因子と接触していない対応する細胞集団と比較して、より少ない割合の、Cdx2を発現する細胞を含む、[90]から[119]のいずれかに記載の方法。
[121]前記内分泌細胞を含む細胞集団が、フローサイトメトリーによって測定して、少なくとも約40%の、ISL1およびNKX6.1を発現する細胞を含む、[90]から[120]のいずれかに記載の方法。
[122]前記内分泌細胞を含む細胞集団が、前記骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達経路阻害剤および前記トランスフォーメーション成長因子β(TGF-β)スーパーファミリーからの成長因子と前記接触をしていない対応する細胞集団と比較して、より多い割合の、ISL1およびNKX6.1を発現する細胞を含む、[90]から[121]のいずれかに記載の方法。
[123]前記内分泌細胞を含む細胞集団が、フローサイトメトリーによって測定して、多くとも約15%のISL1陰性、NKX6.1陰性の細胞を含む、[90]から[122]のいずれかに記載の方法。
[124]前記内分泌細胞を含む細胞集団が、前記骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達経路阻害剤および前記トランスフォーメーション成長因子β(TGF-β)スーパーファミリーからの成長因子と前記接触をしていない対応する細胞集団と比較して、より少ない割合のISL1陰性、NKX6.1陰性の細胞を含む、[90]から[122]のいずれかに記載の方法。
[125]前記内分泌細胞を含む細胞集団を凍結保存するステップをさらに含む、[90]から[124]のいずれかに記載の方法。
[126]前記内分泌細胞を含む細胞集団が細胞クラスターであり、前記方法が、
(a)前記細胞クラスターから複数の細胞を分離するステップ、および
(b)ステップ(a)からの前記複数の細胞を再凝集培地中で培養して、前記複数の細胞の少なくとも一部に第2の細胞クラスターを形成させるステップ
をさらに含む、[90]から[125]のいずれかに記載の方法。
[127]前記分離するステップが、前記複数の細胞をフローサイトメトリーに供するステップを含まない、[126]に記載の方法。
[128]前記再凝集培地が血清を含まない、[126]または[127]に記載の方法。
[129]前記再凝集培地が外因性分化因子を含まない、[126]から[128]のいずれかに記載の方法。
[130]前記内分泌細胞をin vitroで成熟させて、グルコースチャレンジに対してin
vitroグルコース刺激インスリン分泌応答を呈する少なくとも1個の膵β細胞を得るステップをさらに含む、[90]から[129]のいずれかに記載の方法。
[131]前記成熟させるステップが無血清培地中で実施される、[130]に記載の方法。
[132]前記成熟させるステップがゼノフリー培地中で実施される、[130]または[131]に記載の方法。
[133]前記成熟させるステップが外因性分化因子を含まない培地中で実施される、[130]から[132]のいずれかに記載の方法。
[134]前記成熟させるステップがヒト血清アルブミン(HSA)の存在下で実施される、[130]から[133]のいずれかに記載の方法。
[135]前記HSAが約0.1%~約5%、約0.5%~約2%の濃度で存在する、[134]に記載の方法。
[136]前記HSAが約1%の濃度で存在する、[134]に記載の方法。
[137](a)集団中の多能性幹細胞をTGF-βスーパーファミリーからの成長因子およびWNTシグナル伝達経路活性化剤と接触させることによって、前記多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるステップ、
(b)前記胚体内胚葉細胞をFGFファミリーからの成長因子と接触させることによって、前記胚体内胚葉細胞の少なくとも一部を原腸管細胞に分化させるステップ、
(c)前記原腸管細胞をROCK阻害剤、FGFファミリーからの成長因子、BMPシグ
ナル伝達経路阻害剤、PKC活性化剤、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、SHH経路阻害剤、およびTGF-βスーパーファミリーからの成長因子と接触させることによって前記原腸管細胞の少なくとも一部をPdx1陽性膵前駆細胞に分化させるステップ、(d)前記Pdx1陽性膵前駆細胞をROCK阻害剤、TGFβスーパーファミリーからの成長因子、FGFファミリーからの成長因子、RAシグナル伝達経路活性化剤、およびSHH経路阻害剤と接触させることによって前記Pdx1陽性膵前駆細胞の少なくとも一部をPdx1陽性、NKX6.1陽性の膵前駆細胞に分化させるステップ、ならびに
(e)前記Pdx1陽性、NKX6.1陽性の膵前駆細胞をTGF-βシグナル伝達経路阻害剤、EGFファミリーからの成長因子、RAシグナル伝達経路活性化剤、SHH経路阻害剤、THシグナル伝達経路活性化剤、γ-セクレターゼ阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ROCK阻害剤、BMPシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物と接触させることによって前記Pdx1陽性、NKX6.1陽性の膵前駆細胞の少なくとも一部を少なくとも1個のNKX6.1+かつC-ペプチド+の細胞を含む細胞集団に分化させるステップ
を含む方法。
[138][90]から[129]のいずれかまたは[137]に記載の方法によって産生された内分泌細胞を含む細胞集団。
[139][130]から[136]のいずれかに記載の方法によって産生されるSC-β細胞を含む細胞集団。
[140]内分泌細胞を含むin vitroの細胞集団を約100rad~約100,000radの線量で約1分~約60分の時間の照射に曝露するステップを含む方法。
[141]幹細胞、胚体内胚葉細胞、原腸管細胞、膵前駆細胞、または内分泌細胞を含む細胞集団を照射に曝露するステップを含み、前記照射が、照射に供されていない対応する細胞集団と比較して増殖能力が低減した細胞集団をもたらす、細胞の増殖を低減させる方法。
[142]前記細胞集団が、約100rad~約50,000rad、約100rad~約25,000rad、約100rad~約10,000rad、約250rad~約25,000rad、約500rad~約25,000rad、約1,000rad~約25,000rad、約2,500rad~約25,000rad、約5,000rad~約25,000rad、または約10,000rad~約15,000radの照射に曝露される、[140]または[141]に記載の方法。
[143]前記細胞集団が約10,000radの照射に曝露される、[140]または[141]に記載の方法。
[144]前記細胞集団が、約1分~約55分、約1分~約50分、約1分~約45分、約1分~約40分、約1分~約35分、約1分~約30分、約1分~約25分、約1分~約20分、約1分~約10分、約1分~約5分、約10分~約55分、約15分~約55分、約20分~約55分、約25分~約55分、約30分~約55分、約20分~約40分、または約25分~約35分、照射に曝露される、[140]から[143]のいずれかに記載の方法。
[145]前記細胞集団が約30分、照射に曝露される、[140]から[143]のいずれかに記載の方法。
[146]前記照射がイオン化照射を含む、[140]から[145]のいずれかに記載の方法
。
[147]前記イオン化照射がガンマ線、X線、紫外線放射、アルファ線、ベータ線、または中性子線を含む、[140]から[146]のいずれかに記載の方法。
[148]前記照射が、前記照射に供されていない対応する細胞クラスターと比較して増殖が低減した細胞集団をもたらす、[140]から[147]のいずれかに記載の方法。
[149]前記細胞集団が、約50μm~約500μm、約50μm~約300μm、約50μm~約200μm、約50μm~約150μm、約600μm~約150μm、約700μm~約150μm、約80μm~約150μm、または約60μm~約100μmの直径を有する第2の細胞クラスターを含む、[140]から[148]のいずれかに記載の方法。
[150](a)第1の細胞クラスターから複数の細胞を分離するステップ、および
(b)ステップ(a)からの前記複数の細胞を再凝集培地中で培養して、前記複数の細胞の少なくとも一部に前記第2の細胞クラスターを形成させるステップ
をさらに含む、[149]に記載の方法。
[151]前記分離するステップが、前記複数の細胞をフローサイトメトリーに供するステップを含まない、[150]に記載の方法。
[152]前記第1の細胞クラスターが、第3の細胞クラスターを分離し、前記第3の細胞クラスターから分離した細胞を培養して、前記第1の細胞クラスターを形成させることによって得られる、[150]または[151]に記載の方法。
[153]前記細胞クラスターが前記照射の前に凍結保存され、前記方法が、凍結保存された前記細胞クラスターを前記照射の前に解凍するステップをさらに含む、[149]に記載の方法。
[154]前記細胞クラスターが前記照射に供されている間に凍結保存される、[149]に記載の方法。
[155]凍結保存された前記細胞クラスターを照射の後に解凍し、前記内分泌細胞の少なくとも一部を分化させるステップをさらに含む、[154]に記載の方法。
[156]膵前駆細胞またはその前駆体をin vitroで分化させることによって前記内分泌細胞を含む前記細胞集団を得るステップをさらに含む、[140]から[155]のいずれかに記載の方法。
[157]幹細胞をin vitroで分化させ、それにより前記内分泌細胞を含む前記細胞集団を産生させるステップをさらに含む、[140]から[156]のいずれかに記載の方法。
[158]前記内分泌細胞の少なくとも一部をin vitroで膵β細胞に成熟させ、それにより細胞集団を産生させるステップをさらに含む、[140]から[157]のいずれかに記載の方法。
[159]前記膵β細胞をそれを必要とする対象に埋め込むステップをさらに含む、[158]に記載の方法。
[160]埋め込まれた前記膵β細胞が、前記対象において少なくとも約50日、60日、70日、80日、90日、またはそれより長く、血中グルコースレベルを制御するように構成されている、[159]に記載の方法。
[161][140]から[157]のいずれかに記載の方法によって産生された内分泌細胞を含む細胞集団。
[162][158]から[160]のいずれかに記載の方法によって産生された膵β細胞を含む細胞集団。
Claims (26)
- エピジェネティック修飾化合物、およびPDX1およびNKX6.1を発現する細胞の集団を含む、in vitro組成物。
- エピジェネティック修飾化合物が、DNAメチル化阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、またはブロモドメイン阻害剤のうち1つまたは複数を含む、請求項1に記載のin vitro組成物。
- エピジェネティック修飾化合物が、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤を含む、請求項1に記載のin vitro組成物。
- ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤が、DZNep、GSK126、およびEPZ6438からなる群から選択される、請求項3に記載のin vitro組成物。
- 約0.05μM~約50μM、約0.1μM~約10μM、約0.5μM~約5μM、約0.75μM~約2.5μM、または約1μM~約2μMのエピジェネティック修飾化合物を含む、請求項1~4のいずれか1項に記載のin vitro組成物。
- エピジェネティック修飾化合物が、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤を含む、請求項1に記載のin vitro組成物。
- HDAC阻害剤が、KD5170、MC1568、およびTMP195からなる群から選択される、請求項6に記載のin vitro組成物。
- TGF-βシグナル伝達経路阻害剤さらに含む、請求項1~7のいずれか1項に記載のin vitro組成物。
- TGF-βシグナル伝達経路阻害剤が、Alk5i II、A83-01、SB431542、D4476、GW788388、LY364947、LY580276、SB505124、GW6604、SB-525334、およびSD-208からなる群から選択される、請求項8に記載のin vitro組成物。
- 甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤をさらに含む、請求項1~9のいずれか1項に記載のin vitro組成物。
- 甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤が、T3またはGC-1を含む、請求項10に記載のin vitro組成物。
- ROCK阻害剤をさらに含む、請求項1~11のいずれか1項に記載のin vitro組成物。
- ROCK阻害剤が、チアゾビビン、Y-27632、ファスジル/HA1077、および14-1152からなる群から選択される、請求項12に記載のin vitro組成物。
- 骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達経路阻害剤をさらに含む、請求項1~13のいずれか1項に記載のin vitro組成物。
- 骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達経路阻害剤が、LDN193189またはDMH-Iを含む、請求項14に記載のin vitro組成物。
- レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤をさらに含む、請求項1~15のいずれか1項に記載のin vitro組成物。
- レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤が、レチノイン酸、CD1530、AM580、TTHPB、CD437、Ch55、BMS961、AC261066、AC55649、AM80、BMS753、タザロテン、アダパレン、およびCD2314からなる群から選択される、請求項16に記載のin vitro組成物。
- ソニックヘッジホッグ経路阻害剤をさらに含む、請求項1~17のいずれか1項に記載のin vitro組成物。
- ソニックヘッジホッグ(SHH)経路阻害剤が、SANT1、SANT2、SANT4、SANT4、Cur61414、フォルスコリン、トマチジン、AY9944、トリパラノール、およびシクロパミンからなる群から選択される、請求項16に記載のin vitro組成物。
- γ-セクレターゼ阻害剤をさらに含む、請求項1~19のいずれか1項に記載のin vitro組成物。
- γ-セクレターゼ阻害剤がXXIまたはDAPTを含む、請求項20に記載のin vitro組成物。
- スタウロスポリン、Ro-31-8220、ビスインドリルマレイミド(Bis)化合物、10’-{5”-[(メトキシカルボニル)アミノ]-2”-メチル}-フェニルアミノカルボニルスタウロスポリン、およびスタラログからなる群から選択されるプロテインキナーゼ阻害剤をさらに含む、請求項1~21のいずれか1項に記載のin vitro組成物。
- (a)SANT1、SANT2、SANT4、SANT4、Cur61414、フォルスコリン、トマチジン、AY9944、トリパラノール、およびシクロパミンからなる群から選択されるソニックヘッジホッグ経路阻害剤;
(b)レチノイン酸、CD1530、AM580、TTHPB、CD437、Ch55、BMS961、AC261066、AC55649、AM80、BMS753、タザロテン、アダパレン、およびCD2314からなる群から選択されるレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤;
(c)XXIまたはDAPTを含むγ-セクレターゼ阻害剤;
(d)ベータ-セルリン、またはEGFを含む上皮細胞成長因子ファミリー由来の成長因子;
(e)LDN193189またはDMH-Iを含む骨形成タンパク質シグナル伝達経路阻害剤;
(f)Alk5i II、A83-01、SB431542、D4476、GW788388、LY364947、LY580276、SB505124、GW6604、SB-525334、およびSD-208からなる群から選択されるTGF-βシグナル伝達経路阻害剤;
(g)T3またはGC-1を含む甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤;
(h)スタウロスポリン、Ro-31-8220、ビスインドリルマレイミド(Bis)化合物、10’-{5”-[(メトキシカルボニル)アミノ]-2”-メチル}-フェニルアミノカルボニルスタウロスポリン、およびスタラログからなる群から選択されるプロテインキナーゼ阻害剤;または
(i)チアゾビビン、Y-27632、ファスジル/HA1077、および14-1152からなる群から選択されるROCK阻害剤
をさらに含む、請求項1~17のいずれか1項に記載のin vitro組成物。 - チアゾビビン、レチノイン酸、SANT1、XXI、Alk5i II、GC-1、LDN193189、およびスタウロスポリンをさらに含む、請求項1~7のいずれか1項に記載のin vitro組成物。
- ベータ-セルリンをさらに含む、請求項24に記載のin vitro組成物。
- 細胞集団が、フローサイトメトリーによって測定して、
(a)少なくとも約20%の、C-ペプチドおよびNKX6.1を発現する細胞、
(b)少なくとも約60%の、CHGAを発現する細胞、
(c)多くとも約20%の、Cdx2を発現する細胞、または
(d)多くとも約45%の、VMAT1を発現する細胞
を含む、組成物。
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