JPWO2019168198A1 - 新規無蛍光性ローダミン類 - Google Patents
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Abstract
Description
一方で、ローダミン類の一部には何らかの消光メカニズムによって無蛍光性を示すものが存在する。このような「無蛍光性ローダミン類」は、FRETのアクセプターとしてドナー分子の蛍光を消光させるクエンチャーとして利用されているだけでなく、その無蛍光性のメカニズムを解明し、特定の生命現象をスイッチに無蛍光性を解除する適切な分子設計を行うことで、新たな蛍光制御原理に基づく蛍光プローブの開発が可能となる。
具体的には、強蛍光性を示す一般的なローダミンであるテトラメチルローダミン(TMR)(図2(b))のキサンテン環上ジメチルアミノ基のオルト位に立体障害を引き起こすような置換基を導入し、基底状態である程度のねじれを与えることで、励起状態でのTICT状態の形成が促進され、無蛍光性を示すのではないかと考え、計算化学的手法を用いた検討を行ったところ、分子設計した種々の化合物がTICT状態に起因する無蛍光性を示す可能性が示唆された。この知見を基に、本発明者らは、キサンテン環上のアミノ基の置換基、及び当該置換基と立体障害を引き起こすことができるオルト位における置換基等について種々検討した結果、本発明を完成させるに至った。
[1]以下の一般式(I)で表される化合物又はその塩。
(式中、
R1は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する1ないし3個の同一又は異なる一価の置換基を示し:
R2及びR3は、各々独立に、水素原子又はベンゼン環上に存在する一価の置換基を示し;
R4及びR5は、それぞれ独立に、水素原子、置換又は無置換の炭素数1〜6個のアルキル基、カルボキシル基、エステル基、アミド基又はハロゲン原子を示し;
R6及びR7は、それぞれ独立に、水素原子、置換又は無置換の炭素数1〜6個のアルキル基、カルボキシル基、エステル基、アミド基又はハロゲン原子を示し;
ただし、R4、R5、R6、R7のうちいずれか1以上は水素原子以外の置換基であり;
R8及びR9は、それぞれ独立に、水素原子、又は、置換又は無置換の炭素数1〜14個のアルキル基を示し、
R8及びR9は一緒になってR8及びR9が結合している窒素原子を含む4〜7員のヘテロシクリルを形成してもよく;
Xは、酸素原子、Si(Ra)(Rb)、C(Ra)(Rb)、Ge(Ra)(Rb)、P(=O)Rc、SO2又はSeから選択され、
ここで、Ra及びRbは、それぞれ独立に、炭素数1〜6個のアルキル基又は置換されていてもよいアリール基であり、Rcは、炭素数1〜6個のアルキル基又は置換されていてもよいフェニル基であり;
Yは、−NR10R11又は−OHであり、
ここで、R10及びR11は、それぞれ独立に、水素原子、又は、置換又は無置換の炭素数1〜14個のアルキル基を示し、
R10及びR11は一緒になってR10及びR11が結合している窒素原子を含む4〜7員のヘテロシクリルを形成してもよく;
(i)Yが−NR10R11の場合は、
R8とR9の組、R10とR11の組のいずれか1以上の組において、当該組を構成する2つの基がいずれも水素原子以外の置換基であり、
ここで、
(a)R8とR9の組を構成する2つの基がいずれも水素原子以外の置換基であり、R10とR11の組を構成する少なくとも1つの基が水素原子である場合は、R4、R6のいずれか1以上は水素原子以外の置換基であり、
(b)R10とR11の組を構成する2つの基がいずれも水素原子以外の置換基であり、R8とR9の組を構成する少なくとも1つの基が水素原子である場合は、R5、R7のいずれか1以上は水素原子以外の置換基であり、
(c)R8、R9、R10、R11のいずれも水素原子以外の置換基である場合は、R4、R5、R6、R7のうちいずれか1以上は水素原子以外の置換基であり;
(2)Yが−OHの場合は、
R8及びR9のいずれもが水素原子以外の置換基であり、かつ、R4、R6のいずれか1以上は置換又は無置換の炭素数1〜6個のアルキル基又はハロゲン原子である。)
[2]Yが−NR10R11である、[1]に記載の化合物又はその塩。
[3]R8とR9、R10とR11のいずれかの組において、いずれもが水素原子以外の置換基である、[2]に記載の化合物又はその塩。
[4]R8とR9、R10とR11の両方の組において、いずれもが水素原子以外の置換基である、[2]に記載の化合物又はその塩。
[5]R4とR5のうちいずれか1以上は水素原子以外の置換基であり、R6とR7のうちいずれか1以上は水素原子以外の置換基である、[4]に記載の化合物又はその塩。
[6]R8、R9、R10、R11は、同一又は異なる、置換又は無置換の炭素数1〜6個のアルキル基であって、R4及びR6のうちいずれか1以上、及び/又は、R5及びR7のうちいずれか1以上は、水素原子以外の置換基であり、R8、R9、R10、R11のアルキル基の少なくとも1つが水酸基又はアルコキシ基で置換されているアルキル基である、[2]〜[5]のいずれか1項に記載の化合物又はその塩。
[7]R8とR9、R10とR11のいずれかの組において、いずれもが同一又は異なる置換又は無置換の炭素数1〜6個のアルキル基であり、当該アルキル基の少なくとも1つが水酸基又はアルコキシ基で置換されているアルキル基である、[3]に記載の化合物又はその塩。
[8][1]〜[7]のいずれか1項に記載の化合物又はその塩を含むP450活性検出用蛍光プローブ。
[9]細胞内のP450を検出する方法であって、(a)[8]に記載の蛍光プローブを細胞内に導入する工程、及び(b)当該蛍光プローブが細胞内で発する蛍光を測定する工程、を含む方法。
を提供するものである。
これらの一価の置換基は更に任意の置換基を1個又は2個以上有していてもよい。例えば、R1が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが1個又は2個以上存在していてもよく、例えばR1が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。
また、例えばR1が示すアミド基、アルキルアミド基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基には1個又は2個のアルキル基が存在していてもよい。
R2、R3の一価の置換基としては、好ましくは、炭素数1〜6個のアルキル基、炭素数1〜6個のアルコキシ基、カルボキシル基又はエステル基から選択される。
また、R2、R3がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、スルホニル基、アルコキシ基などが1個又は2個以上存在していてもよい。
R4又はR5のアルキル基の置換基としては、ハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが挙げられ、これらは1個又は2個以上存在していてもよい。R4又はR5が示す置換アルキル基には、例えば、ハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などが挙げられる。
理論に拘束されることを意図するものではないが、本発明においては、キサンテン環上のアミノ基の置換基と立体障害を引き起こすことができる置換基を当該アミノ基に対してオルト位に導入することにより、基底状態である程度のねじれを与えることで、励起状態でのTICT状態の形成が促進され、式(I)の化合物は無蛍光性を示すものと考えられる。立体障害を引き起こすことができる置換基としては、置換又は無置換の炭素数1〜6個のアルキル基、カルボキシル基(−COOH)、エステル基(COOR)、アミド基(CONR)又はハロゲン原子である(Rはアルキル基である)。好ましくは、置換又は無置換の炭素数1〜6個のアルキル基又はハロゲン原子であり、より好ましくは、メチル基、エチル基、i−プロピル基、三フッ化メチル基、塩素原子、フルオロ基等が挙げられる。
本発明の1つの好ましい側面においては、Xは、酸素原子又はSi(Ra)(Rb)である。
Ra及びRbが示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが1個又は2個以上存在していてもよく、例えばRa及びRbが示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。
Ra及びRbがアリール基を示す場合には、アリール基は単環の芳香族基又は縮合芳香族基のいずれであってもよく、アリール環は1個又は2個以上の環構成ヘテロ原子(例えば窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子など)を含んでいてもよい。アリール基としてはフェニル基が好ましい。アリール環上には1個又は2個以上の置換基が存在していてもよい。置換基としては、例えばハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが1個又は2個以上存在していてもよい。
合成上の導入のし易さの点から、Rcは、好ましくはメチル基又はフェニル基である。また、Rcがメチル基である方が水溶性は高いため、より好ましい。
アルキル基の置換基としては、ハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが挙げられる。
また、R8及びR9は一緒になってR8及びR9が結合している窒素原子を含む4〜7員(好ましくは5員)のヘテロシクリルを形成してもよい。
アルキル基の置換基としては、ハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが挙げられる。
また、R10及びR11は一緒になってR10及びR11が結合している窒素原子を含む4〜7員(好ましくは5員)のヘテロシクリルを形成してもよい。
ここで、(a)R8とR9の組を構成する2つの基がいずれも水素原子以外の置換基であり、R10とR11の組を構成する少なくとも1つの基が水素原子である場合は、R4、R6のいずれか1以上は水素原子以外の置換基である。
また、(b)R10とR11の組を構成する2つの基がいずれも水素原子以外の置換基であり、R8とR9の組を構成する少なくとも1つの基が水素原子である場合は、R5、R7のいずれか1以上は水素原子以外の置換基である。
また、(c)R8、R9、R10、R11のいずれも水素原子以外の置換基である場合は、R4、R5、R6、R7のうちいずれか1以上は水素原子以外の置換基である。
この実施態様では、キサンテン環上の両方のアミノ基において、アミノ基の置換基と各アミノ基に対してオルト位にある置換基との間で立体障害が引き起こされ、無蛍光性のレベルが非常に高くなり、優れた消光団として用いることができる。
この実施態様では、キサンテン環上の一方のアミノ基において、アミノ基の置換基と当該アミノ基に対してオルト位にある置換基との間で立体障害が引き起こされる。
このような実施態様は、高い無蛍光性のレベルを有し、また、例えば、P450を作用させてそのN−脱アルキル活性によってアミノ基上のアルキル基が外れることによって立体障害の緩和が起こり、蛍光性を回復させるような場合は、反応点が1点であることからP450の検出に有効に用いることができる。
ここで、R8、R9、R10、R11の置換又は無置換のアルキル基としては、好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基である。
また、R8及びR9、及び/又は、R10及びR11は、一緒になってR8及びR9、又は、R10及びR11が結合している窒素原子を含む4〜7員(好ましくは5員)のヘテロシクリルを形成してもよい。
この場合、水酸基で置換されているアルキル基が結合しているキサンテン環上のアミノ基に対してオルト位にある置換基(即ち、R8及び/又はR9が水酸基で置換されているアルキル基である場合はR4、R6を、R10及び/又はR11が水酸基で置換されているアルキル基である場合はR5、R7を意味する)の少なくとも1つは水素原子以外の置換基であることが好ましい。水素原子以外の置換基は、上記と同様に、置換又は無置換の炭素数1〜6個のアルキル基、ハロゲン原子、カルボキシル基(−COOH)、エステル基(COOR)、アミド基(CONR)又はハロゲン原子であり(Rはアルキル基である)、好ましくは、置換又は無置換の炭素数1〜6個のアルキル基又はハロゲン原子であり、更に好ましくは、メチル基、エチル基、i−プロピル基、三フッ化メチル基、塩素原子、フッ素原子等である。
水酸基で置換されているアルキル基としては、例えば、ヒドロキシエチル基等が挙げられるが、これらに限定されない。
また、R8、R9、R10、R11のうち、水酸基で置換されているアルキル基以外のアルキル基は無置換であっても置換されていてもよい。無置換のアルキル基としては、好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基である。
R8、R9、R10、R11のアルキル基の少なくとも1つが水酸基で置換されているアルキル基である場合は、本発明の化合物の構造の他の部分(オルト位の置換基や、キサンテン骨格に結合したベンゼン環の置換基等)の組み合わせによって、無蛍光性ローダミンが、主要なP450分子種の中でもCYP3Aに対して選択性を示す場合があり、好ましい。
この場合、アルコキシ基で置換されているアルキル基が結合しているキサンテン環上のアミノ基に対してオルト位にある置換基(即ち、R8及び/又はR9がアルコキシ基で置換されているアルキル基である場合はR4、R6を、R10及び/又はR11がアルコキシ基で置換されているアルキル基である場合はR5、R7を意味する)の少なくとも1つは水素原子以外の置換基であることが好ましい。水素原子以外の置換基は、上記と同様に、置換又は無置換の炭素数1〜6個のアルキル基、ハロゲン原子、カルボキシル基(−COOH)、エステル基(COOR)、アミド基(CONR)又はハロゲン原子であり(Rはアルキル基である)、好ましくは、置換又は無置換の炭素数1〜6個のアルキル基又はハロゲン原子であり、更に好ましくは、メチル基、エチル基、i−プロピル基、三フッ化メチル基、塩素原子、フッ素原子等である。
また、R8、R9、R10、R11のうち、アルコキシ基で置換されているアルキル基以外のアルキル基は無置換であっても置換されていてもよい。無置換のアルキル基としては、好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基である。
アルコキシ基で置換されているアルキル基の炭素数の合計は2〜12、好ましくは2〜10である。
アルコキシ基で置換されているアルキル基としては、例えば、メトキシエチル基、エトキシエチル基、プロポキシエチル基、ブトキシエチル基、ペンタキシエチル基等が挙げられるが、これらに限定されない。
R8、R9、R10、R11のアルキル基の少なくとも1つがアルコキシ基で置換されているアルキル基である場合は、本発明の化合物の構造の他の部分(オルト位の置換基や、キサンテン骨格に結合したベンゼン環の置換基等)の組み合わせによって、無蛍光性ローダミンが、主要なP450分子種の中でもCYP3Aに対して選択性を示す場合があり、好ましい。
ここで、R8及びR9のいずれもが、同一又は異なる、置換又は無置換の炭素数1〜6個のアルキル基である場合は、R4及びR6のうちいずれか1以上は、置換又は無置換の炭素数1〜6個のアルキル基、カルボキシル基(−COOH)、エステル基(COOR)、アミド基(CONR)又はハロゲン原子であり(Rはアルキル基である)、好ましくは、置換又は無置換の炭素数1〜6個のアルキル基又はハロゲン原子であり、更に好ましくは、メチル基、エチル基、i−プロピル基、三フッ化メチル基、塩素原子、フルオロ基等である。
また、R10及びR11のいずれもが、同一又は異なる、置換又は無置換の炭素数1〜6個のアルキル基である場合は、R5及びR7のうちいずれか1以上は、置換又は無置換の炭素数1〜6個のアルキル基、カルボキシル基(−COOH)、エステル基(COOR)、アミド基(CONR)又はハロゲン原子である(Rはアルキル基である)。好ましくは、置換又は無置換の炭素数1〜6個のアルキル基又はハロゲン原子であり、より好ましくは、メチル基、エチル基、i−プロピル基、三フッ化メチル基、塩素原子、フルオロ基等である。
ここで、R8、R9、R10、R11の置換又は無置換の炭素数1〜14個のアルキル基のうち、水酸基又はアルコキシ基で置換されているアルキル基以外のアルキル基は無置換であっても置換されていてもよい。無置換のアルキル基としては、好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基である。
ここで、R8及びR9のいずれもが、同一又は異なる、置換又は無置換の炭素数1〜6個のアルキル基である場合は、R4及びR6のうちいずれか1以上は、置換又は無置換の炭素数1〜6個のアルキル基、カルボキシル基(−COOH)、エステル基(COOR)、アミド基(CONR)又はハロゲン原子であり(Rはアルキル基である)、好ましくは、置換又は無置換の炭素数1〜6個のアルキル基又はハロゲン原子であり、更に好ましくは、メチル基、エチル基、i−プロピル基、三フッ化メチル基、塩素原子、フルオロ基等である。
また、R10及びR11のいずれもが、同一又は異なる、置換又は無置換の炭素数1〜6個のアルキル基である場合は、R5及びR7のうちいずれか1以上は、置換又は無置換の炭素数1〜6個のアルキル基、カルボキシル基(−COOH)、エステル基(COOR)、アミド基(CONR)又はハロゲン原子である(Rはアルキル基である)。好ましくは、置換又は無置換の炭素数1〜6個のアルキル基又はハロゲン原子であり、より好ましくは、メチル基、エチル基、i−プロピル基、三フッ化メチル基、塩素原子、フルオロ基等である。
ここで、R8、R9、R10、R11の置換又は無置換のアルキル基としては、好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基である。
また、R8及びR9、及び/又は、R10及びR11は、一緒になってR8及びR9、又は、R10及びR11が結合している窒素原子を含む4〜7員(好ましくは5員)のヘテロシクリルを形成してもよい。
ここで、R8、R9の置換又は無置換のアルキル基としては、好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基である。
本発明のもう1つの実施態様は、一般式(I)〜(III)の化合物又はその塩を含むP450活性検出用蛍光プローブである。
シトクロムP450は薬物代謝の第I相反応における酸化還元反応を担う代謝酵素であり、薬物の体内からの消失において重要な役割を担っている。通常、体に入った薬物の多くは、肝臓においてP450を含む代謝酵素によって水溶性の高い化合物となり、体外へと排出される。一方、薬物の中にはP450の特定のサブタイプに対する阻害や、酵素誘導といった作用を有するものも少なくなく、薬物の併用投与時に、治療効果の変化や重篤な副作用の発現といった薬物間相互作用を引き起こす原因となる。従って、医薬品開発の初期段階において医薬品候補化合物のP450阻害、誘導活性を測定することは極めて重要である。
医薬品開発におけるP450阻害、誘導活性の測定には、例えば、テストステロンやミダゾラムのようなP450基質の代謝産物をLC−MS/MSを用いて定量する方法が用いられているが、これらの方法はサンプル調整や測定に手間と時間を要する。一方、P450分子種によって代謝されることで初めて蛍光、生物発光を示すプローブを用いた手法は、マルチウェルプレート上で多数サンプルを同時に測定が可能であり、創薬初期における多数の薬品候補化合物のP450に対する阻害作用、誘導作用をハイスループットな測定を可能にすることから、様々な蛍光、生物発光基質がこれまでに開発されてきた。しかしながら、これらのプローブの大部分は、特定のP450サブタイプに対する特異性を示さず、その使用はリコンビナントP450に対する阻害活性の検出に限られている。従って、特定のサブタイプに特異的に代謝され、蛍光上昇を示すプローブは、ヒト肝ミクロソームや生細胞中でのP450活性の阻害、及び誘導の検出を可能にする有用なツールとなる。
ところで、既存のP450蛍光検出プローブのほとんどは、O−脱アルキル化を蛍光スイッチング部位として用いるものであり、N−脱アルキル化を直接蛍光検出するような蛍光プローブの報告はごくわずかである。これは、O−脱アルキル化に比べN−脱アルキル化を蛍光変化に結びつけることが難しいためと考えられる。
また、本発明の一般式(I)〜(III)の化合物は、反応前後で高いS/Nが期待できることに加え、ローダミン色素自体が水溶性や波長の長さ、細胞応用といった観点で優れた蛍光母核であるため、この母核を用いたP450活性検出プローブを開発できれば、既存のプローブの性能を上回る蛍光プローブとなることが期待される。
P450活性検出用蛍光プローブ、好ましくは、CYP3A活性検出用蛍光プローブである。
当該プローブにおいては、水酸基又はアルコキシ基で置換されているアルキル基が結合しているキサンテン環上のアミノ基に対してオルト位にある置換基(即ち、R8及び/又はR9が水酸基又はアルコキシ基で置換されているアルキル基である場合はR4、R6を、R10及び/又はR11が水酸基又はアルコキシ基で置換されているアルキル基である場合はR5、R7を意味する)の少なくとも1つは水素原子以外の置換基であることが好ましい。
また、当該プローブにおいては、R8、R9、R10、R11のうち、アルコキシ基で置換されているアルキル基以外のアルキル基は無置換であっても置換されていてもよい。無置換のアルキル基としては、好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基である。
本発明のCYP3A活性検出用蛍光プローブは、CYP3Aを選択的に検出することが可能であり、その有用性は高い。
本発明者らは、強蛍光性を示す一般的なローダミンであるテトラメチルローダミン(TMR)(図2(b))のキサンテン環上ジメチルアミノ基のオルト位に立体障害を引き起こすような置換基を導入し、基底状態である程度のねじれを与えることで、励起状態でのTICT状態の形成が促進され、無蛍光性を示すのではないかと考えた。そこで、本発明者らは、まず計算化学を用いてこの仮説を検証することとした。図3に示すように、一般的に強蛍光性を示すことで知られるTMRに加え、キサンテン環4位、または4,5位にCl基を置換することでジメチルアミノ基との立体障害を生じさせた4−Cl TMR及び4,5−diCl TMRについて計算化学的手法を用いた検討を行った。
分子軌道計算には市販のソフトウェアであるGaussian09を用い、基底関数は6−31G*として計算を行った。それぞれの基底状態での再安定構造を計算した後に時間依存密度半関数法(TD−DFT)によって励起状態での再安定構造の計算を行った。
また、HOMO、LUMOに相当する軌道はキサンテン環とジメチルアミノ基の両方に分布しており、励起状態において二つの軌道が十分に重なることでS1→S0遷移が電子遷移となることが支持された。
また、電子遷移の起こりやすさの指標となる振動子強度fが、f=0.49となったことからも、TMRにおいてS1→S0遷移が電子遷移となり、蛍光性を示すことが計算化学から支持された。
上記の計算化学による検討から、今回設計した化合物がTICT状態に起因する無蛍光性を示す可能性が示唆されたことから、次に本発明者らは、実際にこれらの化合物を合成し、その光学特性を評価することとした。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 2.04 (s, 3H), 3.38 (s, 12H), 6.90 (d, 2H, J = 2.2 Hz), 6.97 (dd, 2H, J = 9.5 Hz, 2.2 Hz), 7.15-7.20 (m, 3H), 7.38-7.45 (m, 2H), 7.50-7,54 (m, 1H).
13C-NMR (75 MHz, CDCL3) δ 19.5, 41.1, 96.8, 113.5, 114.5, 126.1, 128.7, 130.1, 130.7, 131.3, 131.4, 135.7, 157.4, 157.7, 158.3.
HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 357.1967, Found, 357.1938 (-2.9 mmu).
1H-NMR (300 MHz, CD2Cl2) δ 2.99 (s, 6H), 3.09 (s, 6H), 6.56 (d, 1H, J = 2.2 Hz), 6.69 (dd, 1H, J = 8.8 Hz, 2.2 Hz), 6.99 (d, 1H, J = 8.8 Hz) 8.10 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 8.12 (d, 1H, J = 8.8Hz).
13C-NMR (75 MHz, CDCl3) δ40.2, 43.3, 97.1, 109.7, 111.2, 112.6, 114.3, 117.3, 124.9, 127.7, 153.3, 154.7, 155.1, 158.1, 174.9.
HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 317.1057, Found, 317.1072 (+1.5 mmu).
1H-NMR (300 MHz, CD3OD) δ2.06 (s, 3H), 3.35 (s, 6H), 3.46 (s, 6H), 7.14-7.17 (m, 1H), 7.20-7.31, (m, 5H), 7.45-7.61 (m, 3H).
13C-NMR (75 MHz, CDCl3) δ19.7, 41.5, 43.9, 97.9, 108.1, 116.5, 116.6, 117.7, 118.8, 127.3, 129.7, 130.2, 131.5, 132.0, 132.8, 132.9, 137.4, 154.6, 158.3, 159.7, 160.1, 160.3.
HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 391.1577, Found, 391.1607 (+3.0 mmu).
1H-NMR (300 MHz, CD2Cl2) δ3.28 (s, 12H), 7.29 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 8.29 (d, 2H, J = 8.8 Hz).
13C-NMR (100 MHz, CD2Cl2) δ43.4, 112.7, 115.4, 116.5, 125.1, 153.8, 156.1, 174.9..
HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 351.0667, Found, 351.0620 (-4.7 mmu).
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 2.06 (s, 3H), 3.47 (s, 12H), 7.25 (d, 2H, J = 9.5 Hz), 7.29 (m, 1H), 7.33 (d, 2H, J = 9.5Hz), 7.45-7.62 (m, 3H).
13C-NMR (75 MHz, CDCL3) δ 19.7, 44.4, 107.4, 117.4, 120.1, 127.3, 130.2, 130.3, 131.7, 132.0, 132.5, 137.5, 155.5, 159.0, 161.0.
HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 425.1187, Found, 425.1217 (+3.0 mmu).
1H-NMR (300 MHz, CD2Cl2) δ3.18(s, 6H), 3.26 (s, 6H), 6.78 (s, 1H), 6.86 (dd, 1H, J = 9.5Hz, 3.0 Hz), 7.03 (s, 1H), 7.15 (d, 1H, J = 9.5 Hz), 7.13 (s, 1H), 7.25-7.28 (m, 1H), 7.75-7.77 (m, 2H), 8.30-8.32 (m, 1H).
13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ 41.3, 43.7, 97.7, 105.2, 116.1, 116.6, 117.0, 124.2, 130.9, 131.8, 132.0, 132.0, 132.2, 132.5, 134.3, 136.0, 156.1, 158.1, 159.4, 159.8, 168.2.
HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 421.1319, Found, 421.1281 (-3.8 mmu).
1H-NMR (300 MHz, CD2Cl2) δ 2.30 (s, 3H), 3.13 (s, 6H), 3.24 (s, 6H), 6.77 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6.84 (dd, 1H, J = 9.5 Hz, J = 2.7 Hz), 6.94 (s, 1H), 6.97 (s, 1H), 7.11 (d, 1H, J = 9.3Hz), 7.23-7.25 (m, 1H), 7.71-7.77 (m, 2H), 8.32-8.35 (m, 1H).
13C-NMR (75 MHz, CD3OD) δ 17.4, 30.7, 40.8, 94.8, 97.3, 114.7, 115.1, 115.3, 126.8, 130.1, 131.4, 131.5, 131.7, 132.3, 132.5, 133.9, 135.5, 158.4, 158.7, 159.3, 159.5, 161.2, 168.1.
HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 401.1865, Found, 401.1863 (-0.2 mmu).
1H-NMR (300 MHz, CD2Cl2) δ 2.98 (s, 6H), 6.47 (dd, 1H), 6.51 (d, 1H, J = 2.2 Hz), 6.63 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 6.74 (d, 1H, J = 10.3 Hz), 7.22 (m, 1H), 7.34 (d, 1H, J = 6.6 Hz), 7.71 (m, 2H), 8.04 (m, 1H).
13C-NMR (75 MHz, CD2Cl2) δ 40.3, 82.7, 98.4, 104.8, 110.0, 112.9, 116.4 (d, J = 20.4 Hz), 119.1 (q, J = 318.3 Hz), 121.6 (d, J = 5.5 Hz), 124.3, 125.6, 127.0, 128.8, 130.7, 135.8, 137.8 (d, J = 15.4 Hz),148.4, 148.5, 149.7 (d, J = 217.8 Hz), 152.5 152.7 (d, J = 28.4 Hz), 169.1.
HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 510.0635, Found, 510.0626 (-0.9 mmu).
1H-NMR (300 MHz, CD3CN) δ 3.15 (m, 12H), 6.70 (d, 1H, J = 9.5 Hz), 6.73 (d, 1H, J = 2.9 Hz), 6.80-6.86 (m, 2H), 6.94 (d, 1H, J = 9.5 Hz), 7.26-7.29 (m, 1H), 7.72-7.78 (m, 2H), 8.17-8.20 (m, 1H).
13C-NMR (75 MHz, CD3OD) δ 41.1, 43.3 (d, J = 8.1 Hz), 97.3, 101.8 (d, J = 5.0 Hz), 114.6, 114.7, 114.9, 115.2, 115.8, 116.5, 131.3, 131.7, 132.1 (d, J = 8.1 Hz), 132.6, 134.0, 135.0, 150.0, (d, J = 11.2 Hz), 152.1 (d, J = 250.5 Hz), 155.6, 159.4, (d, J = 3.1 Hz), 161.3, 168.0.
HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 405.1615, Found, 405.1590 (-2.5 mmu).
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.63 (s, 3H), 0.65 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 3.42 (s, 12H), 6.64 (dd, 2H, J = 9.5 Hz, 2.9 Hz), 7.06-7.09 (m, 3H), 7.21 (d, J = 2.9 Hz, 2H), 7.31-7.35 (m, 2H), 7.42-7,44 (m, 1H).
13C-NMR (75 MHz, CDCl3) δ -0.3, 0.0, 20.0, 41.8, 114.6, 121.4, 126.2, 128.2, 129.5, 130.9, 136.2, 139.0, 142.1, 149.1, 154.7, 170.5.
HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 399.2257, Found, 399.2266 (+0.9 mmu).
1H-NMR (400 MHz, CD2Cl2): δ 0.74 (s, 3H), 0.75 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 3.13 (s, 6H), 3.48 (br s, 6H), 6.92 (dd, J = 10.1, 2.7 Hz, 1H), 6.96 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.05 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.11 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.14 (d, J = 10.1 Hz, 1H), 7.32-7.43 (m, 2H), 7.46 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 2.3 Hz, 1H).
HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 433.1867; found, 433.1867 (+0.0 mmu).
The HPLC chromatogram after purification is shown below. (A/B = 70/30→0/100, 40 min; A: H2O containing 0.1% TFA (v/v), B: MeCN/H2O = 80/20 containing 0.1% TFA (v/v). 1.0 mL/min flow rate. Detection at 650 nm).
1H-NMR (400 MHz,CD2Cl2): δ 0.79 (s, 6H), 2.89 (s, 12H), 7.20 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 8.31 (d, J = 8.7 Hz, 2H)
13C-NMR (100 MHz, CD2Cl2): δ-1.3, 43.2, 121.0. 129.7, 132.4, 134.6, 140.6, 153.9, 184.7.
HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 393.0957; found, 393.0954 (-0.3 mmu).
1H-NMR (400 MHz, CD2Cl2): δ 0.91 (s, 6H), 3.31 (s, 12H), 3.63 (s, 6H), 6.71 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.79 (d, J = 9.6 Hz, 2H), 7.25 (d, J = 9.1 Hz, 2H),7.50 (t, J = 8.5 Hz, 1H)
13C-NMR (100 MHz, CD2Cl2): δ -2.1, 44.5, 56.4, 104.4, 115.9, 119.3, 131.2, 131.8, 132.0, 140.4, 148.7, 156.9, 157.7, 170.0.
HRMS (ESI+): Calcd for [M]+,513.1532; found, 513.1533 (+0.1 mmu).
1H-NMR (400 MHz, CD2Cl2) δ 3.89 (s, 6H), 6.38 (dd, 1H, J = 8.8 Hz, 2.4 Hz), 6.50-6.54 (m, 2H), 6.71 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 6.94 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.07-7.10 (m, 1H), 7.56-7.61 (m, 2H) 7.90-7.92 (m, 1H).
13C-NMR (100 MHz, CD2Cl2) δ 40.4, 82.7, 98.7, 105.3, 110.3, 116.6, 117.1, 119.0, (q, J = 322 Hz), 122.0, 124.3, 125.5, 127.1, 127.6, 128.8, 130.6, 135.7, 147.0, 149.6, 152.3, 152.7, 153.0, 169.2.
HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 526.0339, Found, 526.0307 (-3.2 mmu).
1H-NMR (300 MHz, CD2Cl2) δ 3.11 (s, 6H), 3.20 (s, 6H), 6.76 (dd, 1H, J = 8.8 Hz, 2.9 Hz), 6.82 (d, 1H, J = 2.9 Hz), 6.87-6.94 (m, 2H), 6.97 (d, 1H, J = 9.5 Hz), 7.20-7.23 (m, 1H), 7.68-7.76 (m, 2H), 8.20-8.23 (m, 1H).
13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ 41.2, 43.8, 98.1, 109.7, 114.8, 116.2, 116.8, 118.0, 129.0, 130.3, 131.4, 131.6, 132.1, 134.4, 153.5, 157.4, 158.6, 159.1, 168.6.
HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 421.1319, Found, 421.1290 (-2.9 mmu).
上記の合成例で合成した化合物について光学特性を評価した。結果を図4に示す。
図4の(a〜c)は、テトラメチルローダミン(TMR)(a)、4−Cl TMR(b)及び4,5−diCl TMR(c)についての化学構造、0.1%TFA含有MeOH中での蛍光量子収率(Φfl)、吸収極大(λabs及び発光極大(λem)を示す。Φflは、EtOHのローダミンB(Φfl=0.65)を基準にして決定した相対蛍光量子収率である。
図4の(d〜f)は、0.1%TFA及び0.1%DMSO含有MeOH中での1μMのTMR(d)、4−Cl TMR(e)及び4,5−diCl TMR(f)の吸収スペクトル及び発光スペクトルである。
次に、今回開発した無蛍光性ローダミンの無蛍光性がTICT状態の生成によるものかを検討するために、蛍光量子収率の溶媒粘度依存性について検討した。具体的には、吸収、蛍光スペクトルおよび蛍光量子収率をMeOH(εr=32.6、η=0.61cP)、エチレングリコール(εr=38.7、η=19.9cP)、グリセロール(εr=42.5、η=1412cP)の3種の溶媒中で測定した。これら3種の溶媒は誘電率εrが近い一方で粘度ηが大きく異なるため化合物の光学特性の粘度依存性を検討することができる。置換基の導入による立体障害によりTICT状態の形成が促進されるならば、MeOH中ではTICT状態の形成により消光する一方で、グリセロール等の粘度の高い溶媒中では分子内ねじれの速度が遅くなりTICT状態への移行が抑制されるため蛍光量子収率が上昇すると予想した。
図5の(a)は、グリセロール、エチレングリコール及びMeOH中での4−Cl TMRのΦflである。Φflは、EtOHのローダミンB(Φfl=0.65)を基準にして決定した相対蛍光量子収率である。図5の(b、c)は、グリセロール、エチレングリコール及びMeOH中での1μMの4−Cl TMRの吸収スペクトル(b)及び発光スペクトル(c)である。
次に、今回開発した無蛍光性ローダミン類の消光が立体障害に起因するものであることを確かめるため、立体障害の程度の異なる誘導体を合成し、その光学特性の評価を行った。ここで、本検討では、キサンテン環に直結したベンゼン環の2’位の置換基をMe基からCOOH基へ変更し、さらに、立体障害を引き起こす置換基の置換位置をキサンテン環4位から2位へと変更した誘導体で検討を行った。
まず、キサンテン環2位にCl基を導入した化合物の光学特性を取得した。その結果、2−Cl TMRにおいても4−Cl TMRと同様に無蛍光性を示したことから、立体障害を引き起こす置換基であるCl基はキサンテン環2位に置換された場合もTICT状態の形成による消光が起きることが明らかとなった。
次に、キサンテン環上2位の置換基をCl基以外の置換基に変更した誘導体を合成し、その光学特性を検討することとした。具体的には、置換基の立体的な大きさを表すパラメータとして知られるtaftの立体因子(文献4:藤田稔夫. 有機合成化学 1978, 36 (10), 832-833.)を参考に、Cl基と同等の立体的な大きさを示すMe基、及びCl基、Me基に比べ立体的に小さいF基をキサンテン環2位に置換した誘導体を合成し、蛍光量子収率が置換基の大きさに依存して変化するかを検討した。その結果、Cl基と同等の立体的な大きさ有するCH3基を置換した2−Me TMRでは蛍光量子収率が約1%とほぼ無蛍光性を示したのに対し、より立体障害の影響が緩和されると考えられるF基を置換した2−F TMRは蛍光量子収率が約10%と蛍光性を示した。この結果から、今回開発した無蛍光性ローダミンの消光は、キサンテン環上ジメチルアミノ基とオルト位上置換基との立体障害によって引き起こされることが強く示唆された。
図6の(d〜f)は、0.1%TFA及び0.1%DMSO含有MeOH中での1μMの2−Cl TMR(a)、2−Me TMR(b)及び2−F TMR(c)の吸収スペクトル及び発光スペクトルである。
次に、アミノ基上の置換基をジメチル基からモノメチル基へと変更した化合物を合成し、その光学特性を評価した。この化合物は、消光の原因となるアミノ基上アルキル基とオルト位上置換基との立体障害が緩和されると考えられるため、蛍光性が回復するのではないかと予想した。図7にその結果を示す。
以上の結果から、計算化学に基づく論理的な分子設計を行うことで、従来の分子設計とは異なる構造修飾によるローダミンの無蛍光性化に成功した。次に、これら新規無蛍光性ローダミンを利用することで可能になると考えられる応用例について示す。
本発明の無蛍光性ローダミン類を応用し、新規蛍光消光団(dark quencher)の開発が可能であると考えられる。蛍光消光団は、光によって励起された後に蛍光以外のプロセスで失活する化合物のことであり、代表的な用途としてはFRETのアクセプターとしての利用が挙げられる。既存の蛍光消光団で、市販もされている代表的なものとしては、Dabcyl、Black Hole Quencher(BHQ)、QSYシリーズ等がある。
)も、Dabcylより長波長の蛍光を消光することができる消光団であり、QSY7、QSY9、QSY21はローダミンのキサンテン環上N原子にアリール基が結合したジアリールローダミン類である(図10)。
QSYシリーズと今回の消光団の違いは、N原子にアリール基を導入して消光させるか、オルト位にCl基やMe基といった置換基を導入して消光させるかの違いであるが、この違いによってもたらされる利点としては、以下のようなものが可能性として挙げられる。
・消光に脂溶性の高いアリール基の導入を必要としないため、水溶性が上がりハンドリングの向上が期待される。
・分子サイズがQSYシリーズに比べコンパクトであるためFRET等のアクセプターとして使用する場合に、酵素認識の向上が期待される。
よって、今回開発した無蛍光性ローダミンは、既存の蛍光消光団に比べてより実用的な蛍光消光団になることが期待される。
TICT機構に基づく近赤外蛍光消光団の開発
新規無蛍光性ローダミン類を応用した蛍光消光団の開発において、幅広い波長帯で使用可能な蛍光消光団が開発できることが望ましい。ローダミン類は、キサンテン環10位のO原子をSi原子、C原子、Ge原子、P原子、SO2へと置換することで、様々な吸収波長を示すことが知られており、本発明の分子設計による無蛍光性化が他の10位置換ローダミンにおいても可能であれば、様々な波長にわたる蛍光消光団を開発可能であると考えられる。そこで本発明者らは、これら10位置換ローダミンの一例として、キサンテン環10位にSi原子を置換したSi−ローダミン(SiR)類について本分子設計による無蛍光性化が可能であるかを検討した。SiRはO−ローダミンに比べ約90nm長波長化することが知られており、組織透過性に優れ、光毒性の少ない近赤外領域に吸収を示すローダミン類である。
具体的には、SiRのキサンテン環上4位にCl基を置換した化合物及び4,5位にCl基を置換した化合物を合成し、その光学特性を測定した。なお、4,5−diCl TMSiRは求核種によるキサンテン間9位への求核攻撃を防ぐためにベンゼン環の2’,6’位にOMe基を置換した。
P450のN−脱アルキル活性を検出可能な新規蛍光プローブの開発(1)
本発明の新規無蛍光性ローダミン類を利用して、P450のN−脱アルキル反応を検出可能な新たな蛍光プローブの開発が可能である。
P450は薬物代謝の第I相反応における酸化還元反応を担う代謝酵素であるが、薬物によるP450の阻害や誘導は、薬物間相互作用の原因となるため、創薬プロセスの初期段階において医薬品候補化合物のP450阻害、誘導活性を測定することは極めて重要である。多検体を迅速に調べるためには、医薬品候補化合物のP450に対する阻害作用、誘導作用をハイスループットに測定する必要があるが、このような手法としてP450活性を蛍光で測定する蛍光法が用いられている。
既にP450に代謝されることによって蛍光性を回復する蛍光プローブが開発されているが、多くの蛍光プローブはP450のサブタイプ選択性に乏しく、精製酵素でのP450活性評価にしか用いることができない(文献8:Jurica, J.; Sulcova, A. In Vivo (Brooklyn). 2011.)。また、それらの多くは波長の短さや水溶性の低さから、生細胞や動物個体での応用に適さない場合が多い。
従って、ローダミンをベースとした新たなP450の酵素活性検出蛍光プローブが開発できれば、長波長、高い水溶性、高い光褪色耐性といった優れた特性を有するP450活性検出蛍光プローブとなりうる。
既存のP450活性検出プローブのほとんどはO−脱アルキル反応を蛍光OFF/ONのスイッチに用いている一方で、今回検討したN−脱アルキル化をスイッチとする新たな蛍光プローブは、これまでのプローブと異なる反応性やサブタイプ選択性を示す可能性が考えられる。
実際に初期検討として、今回開発した無蛍光性ローダミン類がP450によって代謝されることで蛍光上昇が観察されるかの検討を行った。結果を図13に示す。
1H-NMR (400 MHz, CD2Cl2): δ 2.20 (s, 3H), 2.95 (s, 6H), 6.39 (dd, J = 8.8 Hz, 2.9 Hz, 1H), 6.45 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 6.58-6.61 (m, 2H), 7.13-7.16 (m, 1H), 7.46 (s, 1H), 7.60-7.66 (m, 2H), 8.01-8.04 (m, 1H).
13C-NMR (100 MHz, CD2Cl2): δ 22.0, 40.1, 83.2, 98.3, 105.5, 108.9, 118.4, 120.5, 123.8, 124.9, 126.0, 126.6, 128.5, 129.0, 129.6, 132.7, 134.9, 149.9, 152.0, 152.1, 153.1, 169.5.
HRMS (ESI+): Calcd for [M]+,436.0548; found, 436.0589 (+4.1 mmu).
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.32-8.34 (m, 1H), 7.77-7.86 (m, 2H), 7.38-7.40 (m, 1H), 7.23 (s, 1H), 7.17 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.11 (dd, J = 9.6, 2.3 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.96 (d, J = 0.9 Hz, 1H), 3.81 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.62 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 3.32 (s, 6H), 3.21 (s, 3H), 2.33 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CD2Cl2): d 18.1, 40.4, 41.8, 57.8, 59.4, 98.5, 106.6, 108.4, 109.2, 114.1, 124.3, 125.1, 127.5, 128.8, 129.0, 129.9, 130.2, 135.1, 150.9, 152.7, 153.0, 153.3, 154.7, 169.7; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 431.1971; found, 431.1978 (+0.7 mmu).
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.33 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.82 (dtd, J = 20.2, 7.5, 1.3 Hz, 2H), 7.39 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.17-7.19 (m, 2H), 7.11 (dd, J = 9.6, 2.3 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 6.97 (s, 1H), 3.49 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.32 (s, 6H), 3.14 (s, 3H), 2.31 (s, 3H), 1.29 (t, J = 7.1 Hz, 3H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 415.2022; found, 415.2041 (+1.89 mmu).
The HPLC chromatogram after purification is shown below. (A/B = 80/20→0/100, 25 min; A: H2O containing 0.1% TFA (v/v), B: MeCN/H2O = 80/20 containing 0.1% TFA (v/v). 1.0 mL/min flow rate. Detection at 560 nm).
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.33 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.77-7.86 (m, 2H), 7.39 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.17 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.15 (s, 1H), 7.11 (dd, J = 9.6, 2.3 Hz, 1H), 7.00 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.96 (s, 1H), 3.43 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.31 (s, 6H), 3.16 (s, 3H), 2.31 (s, 3H), 1.69-1.78 (m, 2H), 0.93 (t, J = 7.3 Hz, 3H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 429.2178; found, 429.2194 (+1.6 mmu).
The HPLC chromatogram after purification is shown below. (A/B = 80/20→0/100, 25 min; A: H2O containing 0.1% TFA (v/v), B: MeCN/H2O = 80/20 containing 0.1% TFA (v/v). 1.0 mL/min flow rate. Detection at 560 nm).
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.34-8.37 (m, 1H), 7.81-7.87 (m, 2H), 7.40-7.43 (m, 1H), 7.20 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.17 (s, 1H), 7.13 (dd, J = 10.0, 2.4 Hz, 1H), 7.03 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.99 (s, 1H), 3.49 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.34 (s, 6H), 3.18 (s, 3H), 2.33 (s, 3H), 1.68-1.76 (m, 2H), 1.33-1.42 (m, 2H), 0.96 (t, J = 7.2 Hz, 3H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 443.2335; found, 443.2364 (+3.0 mDa).
The HPLC chromatogram after purification is shown below. (A/B = 80/20→0/100, 25 min; A: H2O containing 0.1% TFA (v/v), B: MeCN/H2O = 80/20 containing 0.1% TFA (v/v). 1.0 mL/min flow rate. Detection at 560 nm).
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.33 (dd, J = 7.8, 1.4 Hz, 1H), 7.82 (dtd, J = 20.1, 7.5, 1.5 Hz, 2H), 7.39 (dd, J = 7.3, 1.4 Hz, 1H), 7.16-7.19 (m, 2H), 7.11 (dd, J = 9.6, 2.3 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.97 (s, 1H), 3.34 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 3.32 (s, 6H), 3.17 (s, 3H), 2.30 (s, 3H), 2.03-2.13 (m, 1H), 0.90 (dd, J = 6.6, 1.6 Hz, 6H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 443.2335; found, 443.2354 (+1.9 mmu).
The HPLC chromatogram after purification is shown below. (A/B = 80/20→0/100, 25 min; A: H2O containing 0.1% TFA (v/v), B: MeCN/H2O = 80/20 containing 0.1% TFA (v/v). 1.0 mL/min flow rate. Detection at 560 nm).
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.34 (dd, J = 7.3 Hz, 1.4 Hz, 1H), 7.77-7.87 (m, 2H), 7.39 (dd, J = 7.3 Hz, 1.4 Hz, 1H), 7.23 (s, 1H), 7.18 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.12 (dd, J = 9.6 Hz, 2.3 Hz, 1H), 7.02 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.95 (s, 1H), 3.69 (s, 4H), 3.44 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.32 (s, 6H), 3.21 (s, 3H), 2.31 (s, 3H), 1.07 (t, J = 6.9 Hz, 3H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 459.2284; found, 459.2234 (-5.0 mmu).
The HPLC chromatogram after purification is shown below. (A/B = 80/20→0/100, 25 min; A: H2O containing 0.1% TFA (v/v), B: MeCN/H2O = 80/20 containing 0.1% TFA (v/v). 1.0 mL/min flow rate. Detection at 560 nm).
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.33 (dd, J = 7.8, 1.4 Hz, 1H), 7.77-7.86 (m, 2H), 7.38 (dd, J = 7.5 Hz, 1.1 Hz, 1H), 7.22 (s, 1H), 7.18 (d, J = 9.6, 1H), 7.11 (dd, J = 9.6 Hz, 2.3 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.95 (s, 1H), 3.66-3.72 (m, 4H), 3.32-3.35 (m, 8H), 3.21 (s, 3H), 2.31 (s, 3H), 1.42-1.51 (m, 2H), 0.81 (t, J = 7.6 Hz, 3H); 13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ 168.0, 162.9, 161.4, 159.5, 159.5, 157.1, 135.4, 133.9, 133.0, 132.5, 132.3, 132.3, 131.6, 131.4, 130.3, 116.6, 116.2, 104.2, 97.3, 73.9, 69.3, 55.5, 41.7, 41.1, 23.9, 21.8, 10.9; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 473.2440; found, 473.2407(-3.3 mmu).
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.36 (dd, J = 7.5, 1.1 Hz, 1H), 7.79-7.89 (m, 2H), 7.40 (dd, J = 7.3, 0.9 Hz, 1H), 7.23 (s, 1H), 7.20 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.13 (dd, J = 9.6, 2.3 Hz, 1H), 7.00 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.98 (s, 1H), 3.67-3.78 (m, 4H), 3.39 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.32 (s, 6H), 3.23 (s, 3H), 2.33 (s, 3H), 1.43-1.50 (m, 2H), 1.22-1.27 (m, 4H), 0.82 (t, J = 7.1 Hz, 3H); 13C-NMR (101 MHz, CD3OD) δ 167.5, 162.5, 161.3, 159.0, 159.0, 156.7, 134.8, 133.5, 132.6, 132.2, 131.9, 131.8, 131.2, 131.0, 129.8, 116.2, 116.1, 115.8, 103.7, 96.9, 71.8, 68.9, 55.1, 41.2, 40.7, 30.1, 29.1, 23.1, 21.5, 14.0; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 501.2753; found, 501.2734 (-1.9 mDa).
P450のN−脱アルキル活性を検出可能な新規蛍光プローブの開発(2)
合成実施例8〜15で合成した化合物について、実施例6と同様の条件で、P450によって代謝されることで蛍光上昇が観察されるかの検討を行った。結果を図14及び15に示す。
図14に示されるように、これらの化合物は、実施例6の結果と同様に、CYP3Aに代謝されるものの、他のP450分子種にも代謝を受けることが分かる。
図15に示されるように、いくつかの無蛍光性ローダミンが、主要なP450分子種の中でもCYP3Aによって選択的に代謝されることが見出された。
次に、図15に示した化合物の代表として、化合物29(下図)をCYP3A4と反応させたときの、吸収、蛍光スペクトル変化を示す(図16)。RhodamineのN−脱アルキル化に伴う吸収波長の短波長化(a)、及び蛍光強度の大きな上昇が観察された(b、c)。
ここで、図17は、NADPH生成系(MgCl2:1.5mM、グルコース−6−リン酸:3mM、NADP+:0.3mM、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ:0.5U/mL)およびヒト肝臓ミクロソーム(0.05mg/mL)を用いた0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.4)中の化合物29(1μM)の時間依存性蛍光変化を示す(Ex544nm/Em.590nm)。ヒト肝臓ミクロソーム及びNADPH生成系を、化合物29を添加する前に30分間0.1%DMSOまたは10μMケトコナゾールとプレインキュベートし、そして化合物29を添加した直後に測定を開始した。
次に化合物29が生細胞でのCYP3A活性を検出可能か検討した。
株式会社ケー・エー・シーより購入したHepaRG(登録商標)凍結バイアル 8M(HPR116−8M)をメーカーのプロトコルに従い融解、播種し8ウェルチャンバー(松浪:SCC−038 コラーゲンコート)にて六日間培養した後、化合物29でHepaRGのCYP3A活性が検出可能か検討した。
イメージングはコントロール群、阻害剤添加群、誘導体添加群の3種類について行った。
阻害剤としては、ケトコナゾールを用いた。CYP3A活性の誘導剤としてはリファンピシンを用い、イメージングの直前3日間、誘導体添加群にはリファンピシン20μMを添加し、コントロール群、阻害剤添加群にはvehicleとして0.1%DMSOを添加した。
また、それぞれの群から2ウェル×2視野×5細胞の計20細胞をROIで囲い、その蛍光強度の分布を示したグラフを図19に示す。
Arレーザーおよび対物レンズを備えた共焦点顕微鏡を用いて画像を撮影した(40倍)。条件:励起波長514nm、検出波長540〜590nm(PMT1)。
Claims (9)
- 以下の一般式(I)で表される化合物又はその塩。
(式中、
R1は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する1ないし3個の同一又は異なる一価の置換基を示し:
R2及びR3は、各々独立に、水素原子又はベンゼン環上に存在する一価の置換基を示し;
R4及びR5は、それぞれ独立に、水素原子、置換又は無置換の炭素数1〜6個のアルキル基、カルボキシル基、エステル基、アミド基又はハロゲン原子を示し;
R6及びR7は、それぞれ独立に、水素原子、置換又は無置換の炭素数1〜6個のアルキル基、カルボキシル基、エステル基、アミド基又はハロゲン原子を示し;
ただし、R4、R5、R6、R7のうちいずれか1以上は水素原子以外の置換基であり;
R8及びR9は、それぞれ独立に、水素原子、又は、置換又は無置換の炭素数1〜14個のアルキル基を示し、
R8及びR9は一緒になってR8及びR9が結合している窒素原子を含む4〜7員のヘテロシクリルを形成してもよく;
Xは、酸素原子、Si(Ra)(Rb)、C(Ra)(Rb)、Ge(Ra)(Rb)、P(=O)Rc、SO2又はSeから選択され、
ここで、Ra及びRbは、それぞれ独立に、炭素数1〜6個のアルキル基又は置換されていてもよいアリール基であり、Rcは、炭素数1〜6個のアルキル基又は置換されていてもよいフェニル基であり;
Yは、−NR10R11又は−OHであり、
ここで、R10及びR11は、それぞれ独立に、水素原子、又は、置換又は無置換の炭素数1〜14個のアルキル基を示し、
R10及びR11は一緒になってR10及びR11が結合している窒素原子を含む4〜7員のヘテロシクリルを形成してもよく;
(i)Yが−NR10R11の場合は、
R8とR9の組、R10とR11の組のいずれか1以上の組において、当該組を構成する2つの基がいずれも水素原子以外の置換基であり、
ここで、
(a)R8とR9の組を構成する2つの基がいずれも水素原子以外の置換基であり、R10とR11の組を構成する少なくとも1つの基が水素原子である場合は、R4、R6のいずれか1以上は水素原子以外の置換基であり、
(b)R10とR11の組を構成する2つの基がいずれも水素原子以外の置換基であり、R8とR9の組を構成する少なくとも1つの基が水素原子である場合は、R5、R7のいずれか1以上は水素原子以外の置換基であり、
(c)R8、R9、R10、R11のいずれも水素原子以外の置換基である場合は、R4、R5、R6、R7のうちいずれか1以上は水素原子以外の置換基であり;
(2)Yが−OHの場合は、
R8及びR9のいずれもが水素原子以外の置換基であり、かつ、R4、R6のいずれか1以上は置換又は無置換の炭素数1〜6個のアルキル基又はハロゲン原子である。) - Yが−NR10R11である、請求項1に記載の化合物又はその塩。
- R8とR9、R10とR11のいずれかの組において、当該組を構成する2つの基がいずれも水素原子以外の置換基である、請求項2に記載の化合物又はその塩。
- R8とR9、R10とR11の両方の組において、当該組を構成する2つの基がいずれも水素原子以外の置換基である、請求項2に記載の化合物又はその塩。
- R4とR5のうちいずれか1以上は水素原子以外の置換基であり、R6とR7のうちいずれか1以上は水素原子以外の置換基である、請求項4に記載の化合物又はその塩。
- R8、R9、R10、R11は、同一又は異なる、置換又は無置換の炭素数1〜6個のアルキル基であって、R4及びR6のうちいずれか1以上、及び/又は、R5及びR7のうちいずれか1以上は、水素原子以外の置換基であり、R8、R9、R10、R11のアルキル基の少なくとも1つが水酸基又はアルコキシ基で置換されているアルキル基である、請求項2〜5のいずれか1項に記載の化合物又はその塩。
- R8とR9、R10とR11のいずれかの組において、いずれもが同一又は異なる置換又は無置換の炭素数1〜14個のアルキル基であり、当該アルキル基の少なくとも1つが水酸基又はアルコキシ基で置換されているアルキル基である、[3]に記載の化合物又はその塩。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の化合物又はその塩を含むP450活性検出用蛍光プローブ。
- 細胞内のP450を検出する方法であって、(a)請求項8に記載の蛍光プローブを細胞内に導入する工程、及び(b)当該蛍光プローブが細胞内で発する蛍光を測定する工程、を含む方法。
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