WO2023166801A1 - 新規時間分解蛍光イメージングプローブ - Google Patents

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WO2023166801A1
WO2023166801A1 PCT/JP2022/044054 JP2022044054W WO2023166801A1 WO 2023166801 A1 WO2023166801 A1 WO 2023166801A1 JP 2022044054 W JP2022044054 W JP 2022044054W WO 2023166801 A1 WO2023166801 A1 WO 2023166801A1
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compound
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compounds
fluorescent probe
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泰照 浦野
久史 大野
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国立大学法人 東京大学
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/78—Ring systems having three or more relevant rings
    • C07D311/80—Dibenzopyrans; Hydrogenated dibenzopyrans
    • C07D311/82—Xanthenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D413/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
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    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
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    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • the present invention relates to novel fluorescent probes. More specifically, it relates to a group of fluorescent probes having the same fluorophore and an open-ring lifetime ⁇ sp that can be traced with an epifluorescence microscope, and compounds constituting the group of fluorescent probes.
  • Multi-color imaging which can simultaneously visualize multiple target molecules using probes with different fluorescence wavelengths, is becoming an essential technology for understanding biological phenomena mediated by a large number of biomolecules.
  • the width of the absorption spectrum and fluorescence spectrum of one fluorescent organic small molecule usually occupies 50 to 100 nm, the combination of probes that do not overlap in absorption spectrum and fluorescence spectrum is limited, and probes that can be detected at the same time are limited. limited in number. Therefore, signal separation based on fluorescence filters is generally limited to 4-5 colors simultaneously detectable in the visible region (color barrier). Development of multiple imaging technology that overcomes this color barrier is strongly desired.
  • FLIM fluorescence lifetime imaging method
  • ⁇ Fl compound-specific fluorescence lifetime
  • the multiple imaging method using FLIM has the problem that the number of distinguishable components in the same wavelength range cannot be increased.
  • the time range for the fluorescence lifetime of fluorescent organic small molecules is as narrow as 1 to several nanoseconds, and the difference in fluorescence lifetime between probes is small. It has become. Since the fluorescence lifetime depends on the lifetime of the excited singlet state, it is also difficult to increase the number of distinguishable components by extending the time range of the fluorescence lifetime. For these reasons, the multiple imaging method using FLIM has not spread widely.
  • Rhodamine is widely used as a scaffold for fluorescent probes due to its high water solubility, fluorescence quantum yield, and strong photobleaching resistance. .
  • the laboratory of the present inventors has so far developed various fluorescent probes with hydroxymethylrhodamines (HMRs) as the core.
  • HMRs hydroxymethylrhodamines
  • the non-fluorescent intramolecular spirocyclized form (closed form) and the fluorescent open form are in equilibrium, and 99% exists as the intramolecular spirocyclized form (closed form).
  • the ratio of the ring-opened form (ring-opened state) increases transiently, and this shows a T-type photochromic characteristic that returns to a thermal equilibrium state (see FIG. 1) (Non-Patent Literature). 1).
  • the resulting open-ring isomer exhibits an exponential decrease of 1/e for every ⁇ sp on returning to equilibrium.
  • HMRs have T-type photochromic properties, but have not been used in multiple imaging techniques.
  • the present invention aims to construct a multiple fluorescence imaging technique using ⁇ sp as an index, and constitutes a group of fluorescent probes with the same fluorophore and a lifetime ⁇ sp in an open ring state that can be traced with an epifluorescence microscope, and the group of fluorescent probes.
  • the object is to provide a compound that
  • the problem is that the fluorescence lifetime has a narrow time range, and the number of distinguishable components cannot be increased. Therefore, the present inventors paid attention to the open-ring state lifetime ⁇ sp of HMRs, which can take a wider time range than the fluorescence lifetime.
  • ⁇ sp open-ring state lifetime
  • the existing HMRs have the following two problems, and it was considered necessary to overcome these problems in order to develop the group of fluorescent probes aimed at by the present invention.
  • Wavelength of trigger light Most of the probes developed by the present inventors, including HMSiR, have short absorption in the closed ring state and can be excited only at 308 nm or less. It is necessary to develop a probe that functions at around 355 to 365 nm that can be output by a high-pressure mercury lamp or UV LED, considering its incorporation into epifluorescence microscopes, which are commonly used, and its application to live-cell imaging. .
  • Time range of lifetime ⁇ sp in the open ring state As described above, the frame rate of the camera mounted on a general epi-illumination microscope is about 0.1 to 100 msec, so the ⁇ sp of the probe group to be developed is It must be msec or longer. However, the time range of ⁇ sp for probes reported so far is limited to the order of msec. To facilitate fluorescence microscopy measurements and increase the number of distinguishable probes, the time range needs to be extended to the order of seconds.
  • the present inventors have completed the present invention as a result of extensive studies aimed at overcoming the above-mentioned problems of existing HMRs.
  • R 1 represents the same or different monovalent substituents present on the benzene ring;
  • the monovalent substituent includes an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkoxyl group having 1 to 6 carbon atoms, a halogen atom, a carboxyl group, an alkyl group having a carboxyl group, an ester group, an alkyl ester group, an amino group, an amide groups, alkylamino groups, isothiocyanate groups, sulfonyl chloride groups, haloalkyl groups, haloacetamide groups, azide groups, alkyl azide groups, alkynyl groups, tagged protein reactive sites that may have linkers, have linkers may be selected from the group consisting of a group comprising a labeling moiety or a target accumulation site, etc.;
  • [5] The compound or salt thereof according to any one of [1] to [3], wherein L is a cyclopentyl ring represented by the following formula. (In the formula, * and ** indicate the bonding site with the benzene ring and the bonding site with the hydroxyl group, respectively.)
  • [6] The compound according to any one of [1] to [5], wherein most of the compound of general formula (I) exists as an intramolecular spirocyclized form (closed form) at physiological pH, or the salt.
  • [7] The compound or salt thereof according to any one of [1] to [5], which has a pK cycle of 7 or less.
  • the tag protein reactive site optionally with a linker of R 1 is an N-hydroxysuccinimide ester, Halo tag ligand (e.g., 2-(2-((6-chlorohexyl)oxy)ethoxy)ethane amino group ), weakly basic amines, maleimides, isothiocyanate groups, sulfonyl chloride groups, haloalkyl groups, haloacetamide groups, azide groups, alkynyl groups, benzylguanine derivatives or benzylcytosine derivatives, etc.
  • Halo tag ligand e.g., 2-(2-((6-chlorohexyl)oxy)ethoxy)ethane amino group
  • weakly basic amines e.g., maleimides, isothiocyanate groups, sulfonyl chloride groups, haloalkyl groups, haloacetamide groups, azide groups, alkynyl groups, benzy
  • Groups containing label moieties or target accumulation moieties for R 1 include N-hydroxysuccinimide esters, Halo tag ligands (e.g., 2-(2-((6-chlorohexyl)oxy)ethoxy)ethaneamino groups), weak having a label site or target accumulation site selected from the group consisting of basic amines, maleimide groups, isothiocyanate groups, sulfonyl chloride groups, haloalkyl groups, haloacetamide groups, azide groups, alkynyl groups, benzylguanine derivatives, benzylcytosine derivatives, etc.
  • Halo tag ligands e.g., 2-(2-((6-chlorohexyl)oxy)ethoxy)ethaneamino groups
  • weak having a label site or target accumulation site selected from the group consisting of basic amines, maleimide groups, isothiocyanate groups, sulfonyl chlor
  • the linker that the group containing the tag protein reaction site, label site or target accumulation site can have is an alkylene group (provided that one or more —CH 2 — of the alkylene group is —O—, —S—, optionally substituted with —NH— or —CO—), arylene (including heteroarylene), cycloalkylene, alkoxyl group, polyethylene glycol chain, amide group, alkyl cysteinate, and groups thereof
  • the compound or a salt thereof according to any one of [1] to [9] which is selected from the group consisting of groups formed by optionally bonding two or more groups.
  • a compound having any one of the following structures or a salt thereof [12] A fluorescent probe containing the compound or a salt thereof according to any one of [1] to [11]. [13] A fluorescent probe containing two or more compounds or salts thereof according to any one of [1] to [11], Two or more of the compounds or salts thereof are fluorescent probes that satisfy the following conditions. (1) Two or more kinds of compounds or salts thereof have fluorescent mother nuclei with the same or very similar fluorescent wavelengths. (2) The two or more compounds or salts thereof each have a different ⁇ sp (where ⁇ sp is the transition from the open form of each compound to the closed form of the spirocyclization) is the reciprocal of the rate constant (k O ⁇ C )).
  • the compounds or salts thereof included in the fluorescent probe group have fluorophores having the same or very similar fluorescence wavelengths.
  • Each of the compounds or salts thereof included in the fluorescent probe group has a different ⁇ sp (where ⁇ sp varies from the open form of each compound to the closed form of spirocyclization). ) is the reciprocal of the rate constant (k O ⁇ C ) to ).
  • k O ⁇ C rate constant
  • a transient non-equilibrium state is generated by irradiating the object to be measured with an appropriate trigger light in a wavelength range of 355 nm or more, and a plurality of molecules can be identified and identified simultaneously by utilizing the difference in relaxation rate therefrom.
  • Fluorescent probe imaging method that can be quantified.
  • Two or more compounds or salts thereof according to any one of [1] to [11] are bound to two or more different antibodies, respectively, and immobilized with an antibody labeled with the compound.
  • a fluorescent immunostaining method comprising distinguishing each antigen of the fixed cells by using ⁇ sp possessed by each compound as an index by performing fluorescent immunostaining of the fixed cells.
  • Applying at least one fluorescent probe containing the compound or salt thereof according to any one of [1] to [11] to cells or tissues that may contain cancer cells, and then By irradiating the cell or tissue with an appropriate trigger light in the above wavelength range and observing the increase in fluorescence intensity derived from the fluorescent probe, a cancer cell (tumor)-specific increase in fluorescence is extracted.
  • a fluorescence imaging method comprising: [25] The fluorescence imaging method of [24], which is used for endoscopic or laparoscopic examination or surgery.
  • the schematic diagram which shows the T-type photochromic characteristic of HMSiR The schematic diagram which shows the subject which the existing HMR has. 1 shows a conceptual diagram of the molecular design of the present invention.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of the fluorescent immunostaining method of the present invention.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of the fluorescence imaging method of the present invention.
  • FIG. The results of measurement of absorption spectra of compounds 2-4 and 2-7 are shown.
  • Schematic diagram of transient absorption measurement by Laser Flash Photolysis (LFP) method The results of measuring the transient absorption of compounds 2-4 and 2-7 are shown.
  • the absorption spectra and pK cycles of compounds 2-19 and 2-20 are shown.
  • the absorption spectrum and fluorescence spectrum (Ex.
  • the absorption spectrum and fluorescence spectrum (Ex. 520 nm) of compound 3-11N, and the relationship between absorbance at 567 nm and pH are shown.
  • the absorption spectrum and fluorescence spectrum (Ex. 520 nm) of Compound 3-11B, and the relationship between absorbance at 568 nm and pH are shown.
  • 4 shows the results of transient absorption measurement of CHP-NOxaR in BSA solution.
  • a phosphate buffer solution was prepared by mixing and dissolving three probes, HM-, CHP-, and HE-NOxaR, at 20 ⁇ M each, and the results of transient absorption measurement by the LFP method are shown.
  • Fig. 2 shows the results of imaging images of endoplasmic reticulum in living cells using HE-NOxaR.
  • alkyl may be straight chain, branched chain, cyclic, or an aliphatic hydrocarbon group consisting of a combination thereof.
  • the number of carbon atoms in the alkyl group is not particularly limited, but for example, 1 to 6 carbon atoms (C 1-6 ), 1 to 10 carbon atoms (C 1-10 ), ) and 1 to 20 carbon atoms (C 1-20 ).
  • the number of carbon atoms is specified, it means “alkyl” having the number of carbon atoms within the specified range.
  • C 1-8 alkyl includes methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neo-pentyl, n-hexyl, isohexyl, n-heptyl, n-octyl and the like are included.
  • an alkyl group may have one or more optional substituents.
  • substituents include, but are not limited to, alkoxy groups, halogen atoms, amino groups, mono- or di-substituted amino groups, substituted silyl groups, acyl, and the like.
  • alkyl group When an alkyl group has more than one substituent, they may be the same or different.
  • alkyl moieties of other substituents containing alkyl moieties eg, alkoxy groups, arylalkyl groups, etc.
  • halogen atom may be fluorine, chlorine, bromine or iodine, preferably fluorine, chlorine or bromine.
  • substituents include, but are not limited to, alkyl groups, alkoxy groups, hydroxyl groups, carboxyl groups, halogen atoms, sulfo groups, amino groups, alkoxycarbonyl groups, and oxo groups. These substituents may further have a substituent. Examples of such groups include, but are not limited to, halogenated alkyl groups, dialkylamino groups, and the like.
  • a compound represented by the general formula (I) or a salt thereof is a compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof (hereinafter also referred to as "the compound of the present invention") .
  • the present inventors have developed (i) a probe that functions at a trigger light wavelength of about 355 to 365 nm, which can be output by a high-pressure mercury lamp or UVLED. and (ii) to develop a probe with an open ring state lifetime ( ⁇ sp ) of msec (milliseconds) or longer.
  • the ring size that is, the chain length of the alkylene group that forms the spiro ring
  • the alkylene group is substituted.
  • R 1 if present, represents the same or different monovalent substituents present on the benzene ring.
  • the monovalent substituent of R 1 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkoxyl group having 1 to 6 carbon atoms, a halogen atom, a carboxyl group, an alkyl group having a carboxyl group, an ester group, an alkyl ester group, and an amino group.
  • alkyl group represented by R 1 may contain one or more halogen atoms, hydroxyl groups, amino groups, alkoxy groups and the like. group, aminoalkyl group, or the like.
  • Tag protein reactive sites that may have linkers for R 1 include N-hydroxysuccinimide esters, Halo tag ligands (e.g., 2-(2-((6-chlorohexyl)oxy)ethoxy)ethaneamino groups), weak It is selected from the group consisting of basic amine, maleimide, isothiocyanate group, sulfonyl chloride group, haloalkyl group, haloacetamide group, azide group, alkynyl group, benzylguanine derivative, benzylcytosine derivative and the like.
  • Halo tag ligands e.g., 2-(2-(6-chlorohexyl)oxy)ethoxy)ethaneamino groups
  • weak It is selected from the group consisting of basic amine, maleimide, isothiocyanate group, sulfonyl chloride group, haloalkyl group, haloacetamide group, azide group, alky
  • Groups containing labeling or targeting moieties for R 1 include N-hydroxysuccinimide esters, Halo tag ligands (e.g., 2-(2-((6-chlorohexyl)oxy)ethoxy)ethaneamino groups), weakly basic amines. , a maleimide group, an isothiocyanate group, a sulfonyl chloride group, a haloalkyl group, a haloacetamide group, an azide group, an alkynyl group, a benzylguanine derivative, a benzylcytosine derivative, and the like. Groups containing label moieties or target accumulation moieties can also have linkers.
  • Halo tag ligands e.g., 2-(2-((6-chlorohexyl)oxy)ethoxy)ethaneamino groups
  • weakly basic amines e.g., 2-(2-(6-chlorohexy
  • the group containing the label site or target accumulation site has a linking group (e.g., amino group, carbonyl group, carboxyl group, amide group, propargyl group, etc.) that links the label site or target accumulation site to the benzene ring. can be done.
  • a linking group e.g., amino group, carbonyl group, carboxyl group, amide group, propargyl group, etc.
  • the linker that the group containing the tag protein reactive site, the label site or the target accumulation site can have is an alkylene group (provided that one or more -CH 2 - of the alkylene group is -O-, -S-, -NH- , or optionally substituted with -CO-), arylene (including heteroarylene), cycloalkylene, alkoxyl group, polyethylene glycol chain, amide group, alkyl cysteinate, one or more alkylene groups. It is selected from the group consisting of a linker containing 1,2,3-triazole as a partial structure, and a group formed by optionally bonding two or more groups selected from these groups.
  • n is an integer of 0 to 4, and when m is 2 or more, each R 1 may be the same or different.
  • substituents include alkyl groups having 1 or more carbon atoms, preferably alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms (eg, methyl group), halogen atoms such as chlorine atoms, and alkyl azide groups having 1 or more carbon atoms. group, preferably an alkyl azide group having 1 to 6 carbon atoms (eg, a methyl azide group).
  • R 1 at the 3-position of the benzene ring of the general formula (I) is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms (eg, methyl group), halogen such as chlorine atom, Atoms or C 1-6 alkyl azide groups (eg, methyl azide groups) are introduced.
  • halogen such as chlorine atom, Atoms or C 1-6 alkyl azide groups (eg, methyl azide groups)
  • R 1 at the 3-position of the benzene ring of the general formula (I) is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms (eg, methyl group), halogen such as chlorine atom, Atoms or C 1-6 alkyl azide groups (eg, methyl azide groups) are introduced.
  • the above-mentioned monovalent substituent as R 1 may be introduced also at other sites of the benzene ring.
  • the group containing the tag protein reaction site, label site or target accumulation site of R 1 can be introduced at any site of the benzene ring of general formula (I).
  • L is represented by -(CR a R b ) n -.
  • n is an integer of 1-2.
  • the rate of cyclization reaction is slower than when n is 1, so ⁇ sp tends to have a longer lifetime.
  • R a and R b are each independently at each occurrence independently a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • R a and R b When alkyl groups are introduced as R a and R b , the conformation that can accelerate the cyclization rate due to steric repulsion between the hydroxyl group and the alkyl group bound to L becomes dominant (gauche conformation). It is possible to shorten the life of ⁇ sp compared to the case where b is all hydrogen atoms.
  • the alkyl group of R a and R b includes methyl group, ethyl group, n-propyl group and i-propyl group, preferably methyl group.
  • n is 2, and one or two methyl groups are introduced at the 1-position of the hydroxyethylene group.
  • L is -(CH 2 )- or -(CH 2 ) 2 -.
  • each one of R a or R b bonded to each adjacent carbon may be bridged to form a ring structure together with the two carbons to which they are bonded.
  • the ring structure formed is preferably a five- or six-membered ring. Without intending to be bound by theory, the introduction of such a ring structure accelerates the kinetics of spirocyclization by reducing the conformational freedom of the hydroxyethylene group (HE group). However, the life can be shortened compared to the case where all of R a and R b are hydrogen atoms.
  • L When a five-membered ring (cyclopentyl ring, etc.) or a six-membered ring (cyclohexyl ring, etc.) is introduced as L, it may be either a cis-type or trans-type stereoisomer.
  • Compounds into which a five-membered ring or six-membered ring has been introduced may be diastereomers and racemates.
  • L is a cyclopentyl ring represented by the formula below.
  • * and ** indicate the bonding site with the benzene ring and the bonding site with the hydroxyl group, respectively.
  • L is a cyclohexyl ring represented by the formula below.
  • * and ** indicate the bonding site with the benzene ring and the bonding site with the hydroxyl group, respectively.
  • R 2 and R 3 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or a halogen atom.
  • the alkyl group may contain 1 or more of a halogen atom, a hydroxyl group, an amino group, an alkoxy group, etc.
  • R 2 or R 3 may be a halogenated alkyl group, a hydroxyalkyl group, or the like.
  • R2 and R3 are each independently a hydrogen atom or a halogen atom, more preferably both R2 and R3 are hydrogen atoms.
  • R 4 is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or a halogen atom, and the details are the same as those described for R 2 and R 3 .
  • R4 is a hydrogen atom or a halogen atom, more preferably a hydrogen atom.
  • R 5 and R 6 each independently represent a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or —CO—R (that is, form an amide group together with the nitrogen atom bonded to the xanthene ring) or -CO-OR (ie, forms a carbamate group with the nitrogen atom attached to the xanthene ring).
  • R is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • R 5 and R 6 are also substituents containing, together with the nitrogen atom to which they are attached, one or more heteroatoms selected from the group consisting of an oxygen atom, a nitrogen atom, a sulfur atom and a phosphorus atom.
  • An optional 5- to 7-membered heterocyclyl may be formed.
  • Heterocyclyl includes optionally substituted morpholine ring, N,N-dimethylpiperazine, 1,1-dioxothiomorpholine, 4-methyl-1,4-azaphosphinane 4-oxide and the like, preferably is a morpholine ring optionally having a substituent.
  • the site of —NR 5 R 6 that binds to the xanthene ring has the function of a pK cycle regulating site (see FIG. 3), and introduction of the above-mentioned heterocyclyl such as morpholine into this pK cycle regulating site It is believed that the electrophilicity of the rhodamine skeleton is increased, which can reduce the pK cycle .
  • Y is —NR c R d , an amide group (—NH—CO—R), a carbamate group (—NH—CO—OR) or a julolidyl group.
  • R c and R d are each independently a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • R is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • X is an oxygen atom or SiR7R8 .
  • R 7 and R 8 are each independently an alkyl group or an aryl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • R 7 and R 8 are preferably each independently an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, and more preferably both R 7 and R 8 are methyl groups.
  • the alkyl group represented by R 7 and R 8 may contain one or more of halogen atoms, hydroxyl groups, amino groups, alkoxy groups, etc.
  • the alkyl group may be a halogenated alkyl group, a hydroxyalkyl group, etc.
  • R 7 and/or R 8 is an aryl group
  • the aryl group may be either a monocyclic aromatic group or a condensed aromatic group, and the aryl ring is composed of one or more rings. It may contain a heteroatom (for example, a nitrogen atom, an oxygen atom, a sulfur atom, etc.).
  • a phenyl group is preferred as the aryl group.
  • One or more substituents may be present on the aryl ring. As substituents, for example, one or more of halogen atoms, hydroxyl groups, amino groups, alkoxy groups and the like may be present.
  • One preferred embodiment of the compound of the present invention is a compound represented by the following general formula (Ia) or a salt thereof.
  • R 9 is a substituted or unsubstituted alkyl group of 1 to 6 carbon atoms.
  • the majority of compounds of general formula (I) or general formula (Ia) exist as an intramolecular closed form. This allows fluorescence imaging by measurement of the effective open ring state lifetime ⁇ sp at physiological pH.
  • the compound of general formula (I) or general formula (Ia) has a pK cycle of 7 or less.
  • the pK cycle means that the compound of the general formula (I) or the general formula (Ia) has an abundance ratio of 1:1 in the aqueous solution of the spirocyclic closed ring state (closed form) and the open ring (open form). means pH.
  • the proportion of the spirocyclized closed form is greater than the open form.
  • the absorption spectrum of the compound is measured at various pH values in a buffer solution such as sodium phosphate having a predetermined concentration, and the compound has an n-valent acid-base equilibrium.
  • the pKa value can be determined by fitting the absorbance (Abs) pH profile to the following equation.
  • the calculations are based on Gaussian 09 (M. J. Frisch, G. W. Trucks, H. B. Schlegel, G. E. Scuseria, M. A. Robb, J. R. Cheeseman, G. Scalmani, V. Barone, G. A. Petersson, H. Nakatsuji, X. Li, M.
  • Non-limiting examples of compounds of the invention are as follows.
  • the compounds represented by general formulas (I) and (Ia) can exist as acid addition salts or base addition salts.
  • Acid addition salts include, for example, mineral salts such as hydrochlorides, sulfates and nitrates, or methanesulfonates, p-toluenesulfonates, oxalates, citrates, tartrates, trifluoroacetates and the like.
  • base addition salts include metal salts such as sodium salts, potassium salts, calcium salts and magnesium salts, ammonium salts, and organic amine salts such as triethylamine salts. . In addition to these, it may form a salt with an amino acid such as glycine.
  • the compounds represented by formulas (I) and (Ia) or salts thereof may exist as hydrates or solvates, and these substances can also be used in the present invention.
  • the compounds represented by general formulas (I) and (Ia) may have one or more asymmetric carbon atoms depending on the type of substituent.
  • stereoisomers such as optically active isomers based on the asymmetric carbon of , and diastereoisomers based on two or more asymmetric carbons, arbitrary mixtures and racemates of stereoisomers can also be used.
  • the method for producing the compound of the present invention is not particularly limited, the method for synthesizing representative compounds among the compounds encompassed by general formula (I) is specifically shown in the examples of the present specification.
  • a person skilled in the art can refer to the examples of the present specification and the following schemes, and if necessary, modify or modify the starting materials, reaction reagents, reaction conditions, etc., to obtain a compound encompassed by the general formula (I). can be manufactured.
  • Fluorescent Probe and Fluorescent Probe Group Another embodiment of the present invention is a fluorescent probe containing a compound represented by formula (I) or a salt thereof (hereinafter also referred to as "fluorescent probe I of the present invention").
  • the method of using the fluorescent probe of the present invention is not particularly limited, and it can be used in the same manner as conventionally known fluorescent probes.
  • the compound of general formula (I) is added to an aqueous medium such as physiological saline or a buffer solution, or a mixture of a water-miscible organic solvent such as ethanol, acetone, ethylene glycol, dimethylsulfoxide and dimethylformamide and an aqueous medium.
  • the salt may be dissolved, the solution may be added to an appropriate buffer containing cells or tissues, and the fluorescence spectrum may be measured.
  • the fluorescent probe of the present invention may be used in the form of a composition in combination with suitable additives.
  • the concentration of the compound of general formula (I) in the fluorescent probe of the present invention can be determined appropriately according to the type of cells to be measured, measurement conditions, and the like.
  • Another embodiment of the present invention is a fluorescent probe comprising two or more compounds of the present invention or salts thereof, Two or more of the compounds or salts thereof are the fluorescent probes satisfying the following conditions (hereinafter also referred to as "fluorescent probe II of the present invention").
  • fluorescent probe II of the present invention Two or more kinds of compounds or salts thereof have fluorescent mother nuclei with the same or very similar fluorescent wavelengths.
  • the two or more compounds or salts thereof each have a different ⁇ sp (where ⁇ sp is the transition from the open form of each compound to the closed form of the spirocyclization) is the reciprocal of the rate constant (k O ⁇ C )).
  • a fluorophore having the same or a very similar fluorescence wavelength means not only the case where the fluorophore is exactly the same as the fluorophore, but also the fluorescence having a similar wavelength that cannot be separated by ordinary fluorescence observation. Including cases where it is the mother nucleus. This is because even in such cases, it is possible to distinguish them by a strategy that utilizes similar differences in rate constants. If the overlap of fluorescence spectra of two or more compounds or salts thereof is large to some extent, it corresponds to "a fluorescent mother nucleus having very similar fluorescence wavelengths".
  • the fluorophore having very similar fluorescence wavelengths means that the fluorescence peak wavelength ( ⁇ FI ) of the fluorescence spectra of two or more compounds or salts thereof is about ⁇ 20 nm, preferably A difference of about ⁇ 10 nm, more preferably about ⁇ 5 nm, more preferably about ⁇ 3 nm.
  • the different ⁇ sps possessed by the two or more compounds or salts thereof are 10-fold or more different.
  • ⁇ sp when two different dyes are mixed, when comparing a probe with ⁇ sp of 1 msec and a probe with ⁇ sp of 2 msec, 5 msec, and 10 msec, ⁇ sp of 1 msec
  • the open state of the probe decreases to 1% after 5 msec, and at this time, the probes with ⁇ sp of 2 msec, 5 msec and 10 msec become 8%, 37% and 61% (see Table 1 of Examples).
  • Probes with ⁇ sp separated by 10 times can be observed at a fluorescence intensity ratio of about 1:60, so they can be sufficiently distinguished.
  • the lifetime ⁇ sp of the ring-opened state can usually be measured using the Laser Flash Photolysis method (LFP).
  • LFP Laser Flash Photolysis method
  • the ring-opened state generated by the pulsed laser irradiation is thermally converted to the ring-closed state.
  • the open-ring state concentration transiently increases, so a positive transient absorption is observed, and as the time elapses, the open-ring state concentration decreases, so the transient absorption returns to near the value immediately before the pulse laser irradiation.
  • the smallest ⁇ sp among ⁇ sp possessed by two or more compounds or salts thereof is preferably 1 msec or more.
  • the lifetime ⁇ sp of the open ring state can be traced using an epifluorescence microscope, and effective multi-target imaging is possible.
  • the different ⁇ sp that two or more compounds or salts thereof have is different by 10 times or more, and the ⁇ sp that two or more compounds or salts thereof have, the smallest ⁇ sp is 1 msec or more.
  • the Fluorescent Probe II of the present invention is suitable for use in single-wavelength photometric multi-target imaging techniques.
  • a single-wavelength photometric multi-target imaging technique for example, time-lapse imaging is performed using an epifluorescence microscope with a 365 nm light source, and ⁇ sp differs from the decay rate of fluorescence intensity at a single wavelength after irradiation with 365 nm light. Multiple imaging of three or more components can be performed by distinguishing between probes.
  • Fluorescent probe II of the present invention is generally prepared by adding two or more compounds of the present invention or salts thereof to an aqueous medium such as physiological saline or a buffer solution, or water such as ethanol, acetone, ethylene glycol, dimethylsulfoxide or dimethylformamide. It can be dissolved in a mixture of a miscible organic solvent and an aqueous medium or the like, added to an appropriate buffer containing cells or tissues, and used to measure the fluorescence spectrum.
  • the fluorescent probe II of the present invention may be used in the form of a composition in combination with suitable additives. For example, it can be combined with additives such as buffers, solubilizers, and pH adjusters.
  • the concentration of each compound of the present invention in the fluorescent probe II of the present invention can be determined appropriately according to the type of cells to be measured, the measurement conditions, and the like.
  • Another embodiment of the present invention is a fluorescent probe group comprising two or more fluorescent probes containing at least one compound of the present invention or a salt thereof,
  • the compound or salt thereof contained in the fluorescent probe group is the fluorescent probe group that satisfies the following conditions (hereinafter also referred to as "the fluorescent probe group of the present invention").
  • the compounds or salts thereof included in the fluorescent probe group have fluorophores having the same or very similar fluorescence wavelengths.
  • Each of the compounds or salts thereof included in the fluorescent probe group has a different ⁇ sp (where ⁇ sp varies from the open form of each compound to the closed form of spirocyclization). ) is the reciprocal of the rate constant (k O ⁇ C ) to ).
  • the fluorescent probe group of the present invention includes two or more fluorescent probes containing at least one compound of the present invention or a salt thereof, and relates to a set of two or more fluorescent probes.
  • Each fluorescent probe contained in the fluorescent probe group of the present invention usually contains at least one compound of the present invention or a salt thereof in an aqueous medium such as physiological saline or a buffer solution, or ethanol, acetone, ethylene glycol, dimethyl sulfoxide. , a mixture of a water-miscible organic solvent such as dimethylformamide and an aqueous medium.
  • Each fluorescent probe may be combined with appropriate additives and used in the form of a composition. For example, it can be combined with additives such as buffers, solubilizers, and pH adjusters.
  • each compound of the present invention in each fluorescent probe contained in the fluorescent probe group can be determined appropriately according to the type of cells to be measured, measurement conditions, and the like.
  • Each of the two or more fluorescent probes included in the fluorescent probe group of the present invention may contain a fluorescent probe other than the compound of the present invention or a salt thereof.
  • Fluorescent scaffolds having the same or very similar fluorescence wavelength are as described in the Fluorescent Probe II of the present invention.
  • the different ⁇ sps possessed by the compounds or salts thereof contained in the group of fluorescent probes preferably differ by 10-fold or more.
  • the smallest ⁇ sp of the compounds or salts thereof contained in the group of fluorescent probes is preferably 1 msec or longer.
  • the different ⁇ sp possessed by the compound or salt thereof contained in the fluorescent probe group is different by 10 times or more, and the compound or salt thereof contained in the fluorescent probe group has ⁇ sp , the smallest ⁇ sp is greater than or equal to 1 msec.
  • the fluorescent probe group of the present invention is suitably used for single-wavelength photometric multi-target imaging techniques.
  • the group of fluorescent probes of the present invention can be in the form of a kit containing two or more fluorescent probes containing at least one compound of the present invention or a salt thereof. That is, another embodiment of the present invention is a fluorescence measurement kit containing two or more fluorescent probes containing at least one compound of the present invention or a salt thereof, The compound or salt thereof contained in the kit is the kit that satisfies the following conditions. (1a) The compound or its salt contained in the kit has a fluorophore having the same or a very similar fluorescence wavelength. (2a) Each of the compounds or salts thereof included in the kit has a different ⁇ sp (where ⁇ sp is the open form of each compound to the closed form of spirocyclization). is the reciprocal of the rate constant of (k O ⁇ C ).
  • each fluorescent probe is usually prepared as a solution. It can also be applied by dissolving in distilled water or an appropriate buffer solution.
  • kit may contain other reagents and the like as necessary.
  • additives such as dissolution aids, pH adjusters, buffers, tonicity agents, and the like can be used, and the amount of these additives can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • two or more compounds of the present invention or salts thereof satisfying the following conditions are introduced into an object to be measured, (1) Two or more compounds have fluorescent mother nuclei with the same or very similar fluorescent wavelengths. (2) Two or more compounds have different ⁇ sp , where ⁇ sp is the rate constant (k O ⁇ is the reciprocal of C )).
  • a transient non-equilibrium state is generated by irradiating the object to be measured with an appropriate trigger light in a wavelength range of 355 nm or more, and a plurality of molecules can be identified and identified simultaneously by utilizing the difference in relaxation rate therefrom.
  • Fluorescent probe imaging method capable of quantification hereinafter also referred to as “imaging method of the present invention”).
  • High-pressure mercury lamps, UVLEDs, and the like are examples of light sources that irradiate suitable trigger light in a wavelength range of 355 nm or more.
  • Objects to be measured by the imaging method of the present invention include samples such as cells and antibodies, biological samples (for example, biological samples isolated from subjects, biopsy samples, body fluid samples, aqueous solutions), and the like.
  • the biological sample can be a blood sample (eg, a serum sample, or a plasma sample).
  • the sample of cells to be measured can be cells expressing the target enzyme.
  • cancer cells and cancer tissues can be detected or visualized by imaging methods. That is, the fluorescent probe of the present invention, the fluorescent probe I of the present invention, the fluorescent probe group of the present invention, and the imaging method of the present invention can also be used for cancer prediction or diagnosis.
  • Fluorescent mother nuclei having the same or very similar fluorescence wavelength are as described in the Fluorescent Probe II of the present invention. Also, the method for measuring ⁇ sp is as described in the fluorescent probe II of the present invention.
  • aqueous medium such as physiological saline or a buffer solution, or ethanol, acetone, Dissolve in a mixture of a water-miscible organic solvent such as ethylene glycol, dimethylsulfoxide, and dimethylformamide, and an aqueous medium, and add these solutions to an appropriate buffer containing the measurement target such as cells and tissues.
  • a fluorescent probe containing two or more compounds of the present invention or salts thereof may be used in the form of a composition in combination with appropriate additives. For example, it can be combined with additives such as buffers, solubilizers, pH adjusters and the like.
  • the concentration at which two or more compounds of the present invention or salts thereof are added to the measurement object can be determined appropriately according to the type of measurement object such as cells to be measured, the measurement conditions, and the like.
  • a plurality of components for attenuation of transient absorption obtained by performing transient absorption measurement after irradiation with trigger light calculating ⁇ sp for each compound by performing an exponential fitting of .
  • the transient absorption measurement is preferably performed using the Laser Flash Photolysis method (LFP method).
  • LFP method Laser Flash Photolysis method
  • an object to be measured into which the compound of the present invention has been introduced is irradiated with a third harmonic (355 nm) pulsed light (for example, about 0.5 W/cm 2 ) of an Nd-YAG laser, pulsed laser irradiation Since the ring-opened state generated by 1 is thermally converted to the ring-closed state, when the absorbance at the absorption maximum wavelength of the ring-opened state in the series of processes is measured, the concentration of the open-ring state transiently changes immediately after the pulsed laser irradiation.
  • a third harmonic 355 nm
  • Nd-YAG laser for example, about 0.5 W/cm 2
  • the different ⁇ sp values possessed by two or more compounds of the present invention or salts thereof differ by a factor of 10 or more.
  • the smallest ⁇ sp among ⁇ sp possessed by two or more compounds or salts thereof of the present invention is preferably 1 msec or more.
  • the different ⁇ sp possessed by two or more compounds of the present invention or salts thereof are different by 10 times or more, and the ⁇ sp possessed by the two or more compounds of the present invention or salts thereof are Among them, the smallest ⁇ sp is 1 msec or more.
  • the imaging method of the present invention can be suitably used as a single-wavelength photometric multi-target imaging technique.
  • two or more compounds of the present invention or salts thereof are bound to two or more different antibodies, respectively, and fluorescence immunofluorescence of cells immobilized with antibodies labeled with the compounds is performed.
  • It is a fluorescent immunostaining method (hereinafter also referred to as "fluorescent immunostaining method of the present invention"), which includes distinguishing each antigen of fixed cells by staining using ⁇ sp possessed by each compound as an index. ).
  • FIG. 4 shows a schematic diagram of the fluorescent immunostaining method of the present invention.
  • the compound of the present invention or a salt thereof is bound to an antibody with a different target, and the immobilized cells are immunofluorescently stained with an antibody labeled with the compound.
  • Each antigen can be distinguished using ⁇ sp as an index.
  • two or more compounds of the present invention or salts thereof each have a tag protein reaction site optionally having a linker, a linker as R 1 It is preferred to have a group containing an optional labeling moiety or target accumulation moiety.
  • Tag protein reactive sites that may have linkers for R 1 include N-hydroxysuccinimide esters, Halo tag ligands (e.g., 2-(2-((6-chlorohexyl)oxy)ethoxy)ethaneamino groups), weak It is selected from the group consisting of basic amine, maleimide, isothiocyanate group, sulfonyl chloride group, haloalkyl group, haloacetamide group, azide group, alkynyl group, benzylguanine derivative, benzylcytosine derivative and the like.
  • Halo tag ligands e.g., 2-(2-(6-chlorohexyl)oxy)ethoxy)ethaneamino groups
  • weak It is selected from the group consisting of basic amine, maleimide, isothiocyanate group, sulfonyl chloride group, haloalkyl group, haloacetamide group, azide group, alky
  • Groups containing labeling or targeting moieties for R 1 include N-hydroxysuccinimide esters, Halo tag ligands (e.g., 2-(2-((6-chlorohexyl)oxy)ethoxy)ethaneamino groups), weakly basic amines. , a maleimide group, an isothiocyanate group, a sulfonyl chloride group, a haloalkyl group, a haloacetamide group, an azide group, an alkynyl group, a benzylguanine derivative, a benzylcytosine derivative, and the like. Groups containing label moieties or target accumulation moieties can also have linkers.
  • Halo tag ligands e.g., 2-(2-((6-chlorohexyl)oxy)ethoxy)ethaneamino groups
  • weakly basic amines e.g., 2-(2-(6-chlorohexy
  • the group containing the label site or target accumulation site has a linking group (e.g., amino group, carbonyl group, carboxyl group, amide group, propargyl group, etc.) that links the label site or target accumulation site to the benzene ring. can be done.
  • a linking group e.g., amino group, carbonyl group, carboxyl group, amide group, propargyl group, etc.
  • the linker that the group containing the tag protein reactive site, the label site or the target accumulation site can have is an alkylene group (provided that one or more -CH 2 - of the alkylene group is -O-, -S-, -NH- , or optionally substituted with —CO—), arylene (including heteroarylene), cycloalkylene, alkoxyl group, polyethylene glycol chain, amide group, alkyl cysteinate, one or more alkylene groups. It is selected from the group consisting of a linker containing 1,2,3-triazole as a partial structure, and a group formed by optionally bonding two or more groups selected from these groups.
  • the antibody to be labeled with the compound of the present invention is not particularly limited, but examples include HER2, EGFR, and folate receptors. and antibodies against cancer cell-specific surface antigens.
  • Another embodiment of the present invention is to apply a fluorescent probe containing at least one compound of the present invention or a salt thereof to cells or tissues that may contain cancer cells, and then By irradiating the cell or tissue with an appropriate trigger light and observing an increase in fluorescence intensity derived from the fluorescent probe, extracting a cancer cell (tumor)-specific fluorescence increase, It is a fluorescence imaging method (hereinafter also referred to as "fluorescence imaging method of the present invention").
  • FIG. 5 shows a schematic diagram of the fluorescence imaging method of the present invention.
  • a fluorescence endoscope or laparoscope When cells or tissues that may contain cancer cells are examined using a fluorescence endoscope or laparoscope, autofluorescence is emitted, making it difficult to detect tumors due to patchy autofluorescence.
  • the fluorescence imaging method of the present invention when the trigger light is irradiated to the fluorescence imaging method, only the fluorescence derived from the probe increases. It is possible to extract a significant fluorescence increase.
  • the application of the fluorescent probe to cells or tissues that may contain cancer cells can be performed, for example, by locally spraying a solution of the fluorescent probe onto the cells or tissues.
  • Types of cancer cells or cancer tissues targeted by the fluorescence imaging method of the present invention include lung cancer, prostate cancer, ovarian cancer, breast cancer, bladder cancer, brain tumor, esophageal cancer, stomach cancer, bile duct cancer, and liver cancer. Cancer, pancreatic cancer, head and neck cancer, renal cancer, leukemia, skin cancer, thyroid cancer cells or tissues.
  • cancer tissue means any tissue containing cancer cells.
  • tissue should be interpreted in the broadest sense, including a part or the whole of an organ, and should not be interpreted restrictively in any way.
  • the fluorescence imaging method of the present invention is suitably used for endoscopic or laparoscopic examination or surgery.
  • Silica gel column chromatography was performed using Wakogel C-200 (Wako City, Japan), Chromatorex-NH (Fuji Silysia Chemical Co., Ltd. (Kasugai City)), silica gel 60 (Kanto Chemical Co., Ltd.), or silica gel 60N (Kanto Chemical Co., Ltd.). ) was used. Absorption spectrum measurements were performed on a Shimadzu UV-1800.
  • Time-lapse photography was performed using an Olympus IX71 system equipped with a microscope .
  • IX-71 Inverted fluorescence microscope
  • EMCD camera C9100; Hamamatsu Photonics
  • Purpose UlanApon 10x/0, 40, ⁇ /0, 17; Olympus
  • Fluorescent light source U-LH75XEAPO; Olympus
  • Software for system control and image analysis Methodamorph; Molecular Devices
  • ⁇ 365 nm UV-LED C14052-1-A1, L14311-103; Hamamatsu Photonics
  • Time range of lifetime ⁇ sp in the open ring state As described above, the frame rate of the camera mounted on a general epi-illumination microscope is about 0.1 to 100 msec, so the ⁇ sp of the probe group to be developed is It must be msec or longer. However, the time range of ⁇ sp for probes reported so far is limited to the order of msec. To facilitate fluorescence microscopy measurements and increase the number of distinguishable probes, the time range needs to be extended to the order of seconds.
  • the rhodamine skeleton has an antenna site that determines the absorption wavelength in the closed ring state, a ⁇ sp adjustment site that determines the lifetime ⁇ sp of the open ring state, and a pK cycle associated with derivatization.
  • HMR derivatives that introduce three functions of pK cycle -regulating sites that regulate changes in .
  • naphthalene skeleton which has absorption on the longer wavelength side than benzene, for the antenna skeleton, and incorporated it into the xanthene ring to lengthen the absorption wavelength in the closed ring state (see Fig. 3).
  • the resulting residue was dissolved in methanol, pretreated with a Sep-Pak C18 Plus Short Cartridge and the filtrate was evaporated.
  • Example 1 (1) Measurement of Absorption Spectra of Compounds 2-4 and 2-7 Absorption spectra of compounds 2-4 and 2-7 were measured in pH 10 phosphate buffer where the ring closure state becomes major. Both compounds were found to have absorption up to about 370 nm in the ring-closed state due to the incorporation of the naphthalene skeleton (Fig. 6).
  • X in the structural formula of FIG. 6 corresponds to Y in general formula (I).
  • the ring-opened state generated by pulsed laser irradiation is thermally converted to the ring-closed state, measuring the absorbance at the absorption maximum wavelength of the ring-opened state in a series of processes reveals that the ring-opened state concentration is A transient increase in , a positive transient absorption is observed, and the concentration of the ring-open state decreases with the passage of time, so the transient absorption returns to the value immediately before the pulsed laser irradiation.
  • the transient absorption decays exponentially over time, so ⁇ sp was calculated by fitting the equation shown in FIG. 7 to this decay.
  • FIG. 8 shows the transient absorbance measurements of 20 ⁇ M compounds 2-4 and 2-7 in 100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4) containing 50% MeOH and less than 1% DMSO.
  • X in the structural formula of FIG. 8 corresponds to Y in general formula (I).
  • the benzhydrol cation which has a structure similar to rhodamine, is known to increase electrophilicity by changing the substituent on the N atom at the para position to morpholine .
  • a derivative in which morpholine was introduced into was synthesized as follows.
  • 6-Methoxy-1-tetralone 2-8 (2.0711 g, 11.75 mmol) and ethyl formate (3.2 mL, 39.7 mmol) were dissolved in anhydrous toluene (10 mL) under Ar atmosphere. NaH (paraffin liquid dispersion 50%, 1.6016 g, 33.4 mmol) was added to the reaction mixture at 0° C. and stirred at room temperature for 17.5 hours. The reaction was quenched with 1N HClaq (30 mL) and the mixture was extracted with AcOEt (20 mL*3 times). The combined organic layers were dried over Na2SO4 , filtered and evaporated to give a colorless oil .
  • NaH paraffin liquid dispersion 50%, 1.6016 g, 33.4 mmol
  • Example 2 (1) Evaluation of pK cycle The pK cycle of compound 2-19 and compound 2-20, in which the pK cycle control site was unsubstituted or introduced with morpholine, was evaluated.
  • the pK cycle of unsubstituted 2-19 was 0.5 lower than that of Et group-introduced compound 2-4, and the ratio of open ring state at pH 7.5 was also reduced to about 15%.
  • the pK cycle was lowered by 1.5 compared to compound 2-19 into which an Et group was introduced, as expected, and the ratio of the open ring state at pH 7.5 was about 1%. It turned out to be FIG.
  • FIG. 9a shows the absorption spectrum and pK cycle in 100 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing 0.1% DMSO.
  • R in the structural formula of FIG. 9a corresponds to R 5 and R 6 in general formula (I).
  • FIG. 9b also shows the absorption spectrum and fluorescence spectrum (Ex. 520 nm) of compound 2-20 in 100 mM phosphate buffer, and the relationship between the absorption at 567 nm and pH.
  • FIG. 10 shows the results of measuring the transient absorbance of compounds such as 20 ⁇ M of compound 2-20 in 100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4) containing 50% MeOH and less than 1% DMSO.
  • R in the structural formula of FIG. 10 corresponds to R 5 and R 6 in general formula (I). From the above, it was found that the fluorophore having morpholine introduced into the pK cycle control site has both photochromic properties at 355 nm and appropriate electrophilicity.
  • Rhodamine having this fluorophore was named Naphttetrahydro-1,4-Oxaznyl Rhodamine (NOxaR) and was adopted in the subsequent studies.
  • NOxaR Naphttetrahydro-1,4-Oxaznyl Rhodamine
  • HM-NOxaR2-20 having an HM group at the 2-position of the benzene ring was employed as a probe having ⁇ sp on the order of msec.
  • HE-NOxaR Compound 2-22
  • HP-NOxaR Compound 2-24
  • HE group hydroxyethyl group
  • HP group hydroxypropyl group
  • the residue was purified by preparative HPLC.
  • FIG. 11 shows absorption spectra of compounds 2-20, 2-22 and 2-24 in 100 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing 0.1% DMSO.
  • FIG. 12 shows the absorption spectrum and fluorescence spectrum (Ex. 520 nm) of Compound 2-22 in 100 mM phosphate buffer, and the relationship between the absorption at 567 nm and pH.
  • FIG. 13 shows transient absorbance measurements of 20 ⁇ M compounds 2-20, 2-22 and 2-24 in 100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4) containing 50% MeOH and less than 1% DMSO. indicates
  • FIG. 14 shows transient absorption measurements of 20 ⁇ M compounds 2-20 and 2-22 in 30 w/v % BSA solutions containing less than 1% DMSO. From the above, it was strongly suggested that the developed probe functions also in cells.
  • FIG. 15a shows the absorption spectra of 1 ⁇ M compounds 2-22, 2-27 and 2-33 in 100 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing 0.1% DMSO.
  • X in the structural formula of FIG. 15a corresponds to R 1 in general formula (I).
  • FIG. 15b shows the absorption spectrum and fluorescence spectrum (Ex. 520 nm) of compound 2-27 in 100 mM phosphate buffer, and the relationship between absorbance at 573 nm and pH.
  • FIG. 15c shows the absorption and fluorescence spectra (Ex. 520 nm) of compound 2-27 in 100 mM phosphate buffer, and the relationship between absorbance at 571 nm and pH.
  • Propargyl-PEG 5 -Tentagel® (1.7 mg), 2-33 (1 mM DMSO solution, 10 ⁇ L), CuSO 4 (20 mM aqueous solution, 1.3 ⁇ L), THPFA (50 mM aqueous solution, 2.5 ⁇ L) was added to a 0.5 mL tube. 5 ⁇ L) and ascorbic acid (100 mM in water, 5 ⁇ L) were added and the reaction mixture was left at room temperature for 22 hours. The resulting Tentagel®-HE-NOxaR complex was washed with EtOH (0.4 mL x 3), H 2 O (0.4 mL x 4) and dried.
  • FIG. 16 shows an outline of the experimental method.
  • the fluorescence intensity of the Tentagel® moieties increased and showed an exponential decrease. This behavior was observed even when the LED was repeatedly irradiated, and when exponential fitting was performed for each attenuation, ⁇ sp of about 10 to 20 seconds was calculated (FIG. 17).
  • FIG. 17 shows Tentagel®-HE-NOxaR complex Time-lapse imaging in 100 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4.
  • Example 7 From the transient absorption measurement of 1-MeHE-NOxaR (compound 3-4) and 1,1-diHENOxaR (compound 3-7) in which one or two Me groups were introduced at the HE group 1 position of HE-NOxaR, ⁇ sp was calculated. 18 (R 1 in the structural formula in FIG. 18 corresponds to R a and R b in general formula (I))).
  • 1-MeHE-NOxaR into which one Me group was introduced showed almost no change in ⁇ sp compared with HE-NOxaR.
  • 1,1-diMeHE-NOxaR (Compound 3-7), in which two methyl groups were introduced, shortened the lifetime of ⁇ sp due to the Thorpe-Ingold effect as expected.
  • FIG. 20a shows the absorption and fluorescence spectra (Ex. 520 nm) of compound 3-11N in 100 mM phosphate buffer, the relationship between absorbance at 567 nm and pH.
  • FIG. 20b shows the absorption and fluorescence spectra (Ex. 520 nm) of compound 3-11B in 100 mM phosphate buffer, the relationship between absorbance at 568 nm and pH.
  • Example 9 Even in the state where the three types of probes examined above are mixed, 20 ⁇ M each of the three probes HM-, CHP-, and HE-NOxaR are mixed to prepare a phosphate buffer solution, and the transient absorption is measured by the LFP method. was performed (Fig. 22). ⁇ sp of each component was calculated by exponential fitting of three components to the attenuation of the transient absorption obtained from the measurement using the three-mixture system. The calculated ⁇ sp of each component showed good agreement with the measured values for HM-NOxaR, CHP-NOxaR and HE-NOxaR respectively.
  • Example 10 Functional Demonstration in Living Cells
  • COS7 cells expressing Halo protein in the endoplasmic reticulum were stained (FIG. 24). Specifically, a Halo ligand was bound to compound 2-33 by click reaction using azide-alkyne, diluted with DMEM medium to 1 ⁇ M, and COS7 cells were stained. After staining, the intracellular pH was adjusted to 7.4 using 10 ⁇ M nigericin and valinomycin, and time-lapse imaging was performed with an epifluorescence microscope.
  • HE-NOxaR can generate an open ring state (open form) dependent on trigger light irradiation even in living cells and return to the closed ring state (closed form) with a certain lifetime ⁇ sp .

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Abstract

【解決課題】　同一蛍光団で落射蛍光顕微鏡で追跡可能な開環状態の寿命τｓｐを有する蛍光プローブ群、及び当該蛍光プローブ群を構成する化合物を提供すること。 【解決手段】　以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。

Description

新規時間分解蛍光イメージングプローブ
　本発明は、新規な蛍光プローブに関する。より詳細には、同一蛍光団で落射蛍光顕微鏡で追跡可能な開環状態の寿命τｓｐを有する蛍光プローブ群、及び当該蛍光プローブ群を構成する化合物に関わる。
　蛍光波長が異なるプローブを用いて複数のターゲット分子を同時に可視化することができるマルチカラーイメージングは、多数の生体分子が介在する生命現象を理解する上で必須技術になりつつある。
　しかしながら、１つの蛍光性有機小分子の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルの幅は通常５０～１００ｎｍを占有するため、吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルに重なりがないプローブの組み合わせが限られており、同時に検出可能なプローブ数に制限を受ける。そのため、蛍光フィルターに基づいたシグナルの分離では、一般的に可視領域で同時に検出できる限界は４～５色までとなっている（ｃｏｌｏｒ　ｂａｒｒｉｅｒ）。このcolor barrierを克服した多重イメージング技術の開発が強く望まれている。
　Color barrier を克服する方法の１つとして、時間軸を取り入れた分析手法である蛍光寿命イメージング法（ＦＬＩＭ）が挙げられる（非特許文献１）。蛍光は光励起された分子が励起一重項状態から基底状態に戻る際に放出され、その蛍光強度は時間経過とともに化合物固有の蛍光寿命(τＦｌ)で減衰する。ＦＬＩＭでは化合物ごとにτＦｌが異なることを利用し、各ピクセルで励起光照射後の蛍光強度の減衰を観測しτＦｌを算出することで、蛍光スペクトルの重なりが大きい蛍光色素同士であっても各色素由来の蛍光を切り分けることを可能にしている。
　しかしながら、ＦＬＩＭを用いた多重イメージング法には、同一波長域の区別可能な成分数を増やせないという課題がある。蛍光性有機小分子の蛍光寿命がとりうる時間範囲（ｔｉｍｅ　ｒａｎｇｅ）は１～数ｎｓｅｃと狭く、プローブ間での蛍光寿命の差が小さいため同一蛍光波長で区別可能なプローブは３種類程度が限界となっている。蛍光寿命は励起一重項状態の寿命に依存するため、蛍光寿命の時間範囲を拡大することで区別可能な成分数を増やすのも困難である。これらの理由によりＦＬＩＭ　を用いた多重イメージング法は広く普及していない。
　ローダミンは高い水溶性、蛍光量子収率、強い光褪色耐性を備えていることから蛍光プローブの母核として汎用されており、これまでにローダミンを母核とした多種多様なプローブが開発されてきた。
　本発明者らの研究室ではこれまでに、ヒドロキシメチルローダミン類（ＨＭＲ類）を母核とする様々な蛍光プローブを開発してきたが、中でもライブ超解像イメージングを可能とするＨＭＳｉＲは生理ｐＨで無蛍光の分子内スピロ環化体（ｃｌｏｓｅｄ　ｆｏｒｍ）と蛍光性の開環体（ｏｐｅｎ　ｆｏｒｍ）が平衡状態にあり、９９％が分子内スピロ環化体（閉環状態）として存在する。
　ここに３０８ｎｍパルス光を照射すると開環体（開環状態）の割合が一過的に上昇し、これが熱的に平衡状態へと戻るＴ型フォトクロミック特性を示す（図１参照）(非特許文献１)。生成した開環体は平衡状態に戻る際にτｓｐが経過するごとに１／ｅになるような指数関数的な減少を示す。
　このようにＨＭＲ類はＴ型フォトクロミック特性を有するものであるが、これを多重イメージング技術に用いることはこれまでなされていない。
M. Y. Berezin, S. Achilefu, Chemical Reviews 2010, 110, 2641-2684. Nature Chem. 6, 681-689 (2014)
　本発明は、τｓｐを指標とした多重蛍光イメージング技法の構築を目指し、同一蛍光団で落射蛍光顕微鏡で追跡可能な開環状態の寿命τｓｐを有する蛍光プローブ群、及び当該蛍光プローブ群を構成する化合物を提供することを目的とする。
　上記のように蛍光寿命はとりうる時間範囲が狭いことが課題となり、区別可能な成分数を増やすことができない。そこで、本発明者らは、蛍光寿命に比べて幅広い時間範囲をとりうるＨＭＲ類の開環状態の寿命τｓｐに着目した。τｓｐの広い時間範囲を活用することで、τｓｐが１０倍以上異なるプローブの開発が可能であり、プローブのシグナルの分離が容易な多重イメージング系が構築できると考えた。
　一方、既存のＨＭＲ類には以下の２つの課題があり、本発明が目的とする蛍光プローブ群を開発するにはこれらを克服する必要があると考えた。
（１）トリガー光の波長
　ＨＭＳｉＲをはじめとした本発明者らがこれまでに開発したプローブのほとんどは閉環状態での吸収が短く、３０８ｎｍ以下でしか励起できない。一般的に普及している落射蛍光顕微鏡に組み込むこと、さらには生細胞イメージングへの適用を考慮し、高圧水銀ランプやＵＶＬＥＤなどで出力可能な３５５～３６５ｎｍ程度で機能するプローブの開発が必要になる。
（２）開環状態の寿命τｓｐの時間範囲
　上記のように一般的な落射顕微鏡に搭載されているカメラのフレームレートは０．１～１００ｍｓｅｃ程度であるため、開発するプローブ群のτｓｐはｍｓｅｃ以上であることが必要である。しかし、今までに報告されているプローブのτｓｐの時間範囲はｍｓｅｃオーダーが上限となっている。蛍光顕微鏡での測定を容易にし、区別可能なプローブ数を増やすうえで、時間範囲を秒オーダーまで拡張する必要がある。
　本発明者らは、既存のＨＭＲ類の上記の課題を克服することを目的に鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は以下の構成を有するものである。
［１］ 以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
（式中、
Ｒ１は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を表し、
当該一価の置換基は、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルコキシル基、ハロゲン原子、カルボキシル基、カルボキシル基を有するアルキル基、エステル基、アルキルエステル基、アミノ基、アミド基、アルキルアミノ基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、アジ化アルキル基、アルキニル基、リンカーを有していてもよいタグたんぱく質反応部位、リンカーを有していてもよいラベル部位又は標的集積部位を含む基等からなる群から選択され； 
ｍは、０～４の整数であり、ｍが２以上の場合は、各々のＲ１は同じであっても異なっていてもよく；
Ｌは、－（ＣＲａＲｂ）ｎ－で表され、
Ｒａ及びＲｂは、各々独立に、各出現において独立に、水素原子又は炭素数１～３のアルキル基であり、ｎは１～２の整数であり、
ここで、隣接する各々の炭素に結合するＲａ又はＲｂのそれぞれの１つは架橋して、これらが結合する２つの炭素と一緒に環構造を形成してもよく；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；。
Ｒ４は、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個の置換または無置換のアルキル基、－ＣＯ－Ｒ又は－ＣＯ－Ｏ－Ｒであり（Ｒは、炭素数１～６のアルキル基である）、
ここで、Ｒ５及びＲ６は、これらが結合している窒素原子と一緒に、酸素原子、窒素原子、硫黄原子及びリン原子からなる群から選択される１以上のヘテロ原子を含む、置換基を有していてもよい５～７員のヘテロシクリルを形成してもよく；
Ｙは、－ＮＲｃＲｄ、アミド基（－ＮＨ－ＣＯ－Ｒ）、カルバメート基（－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｒ）又はジュロリジル基であり、
Ｒｃ及びＲｄは、各々独立に、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒは、炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｘは、酸素原子又はＳｉＲ７Ｒ８であり、
ここで、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基である。）
［２］Ｒ５及びＲ６は、これらが結合している窒素原子と一緒に、置換基を有していてもよいモルホリン環を形成している、［１］に記載の化合物又はその塩。
［３］以下の一般式（Ｉａ）で表される、［１］に記載の化合物又はその塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
（式中、Ｒ１～Ｒ４、Ｌ、ｍは、一般式（Ｉ）で規定した通りであり；
Ｒ９は、存在する場合は、炭素数１～６個の置換または無置換のアルキル基である。）
［４］Ｌは、－（ＣＨ２）－又は－（ＣＨ２）２－である、［１］～［３］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［５］Ｌは、以下の式で表されるシクロペンチル環である、［１］～［３］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
（式中、＊及び＊＊は、夫々、ベンゼン環との結合箇所、及びヒドロキシル基との結合箇所を示す。）
［６］生理的ｐＨにおいて、一般式（Ｉ）の化合物の大部分が分子内スピロ環化体（closed form）として存在する、［１］～［５］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［７］ｐＫｃｙｃｌｅが７以下である、［１］～［５］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。（ここで、ｐＫｃｙｃｌｅとは、一般式（Ｉ）の化合物のスピロ環化閉環状態（closed form）と開環状態（open form）の存在比が１：１になるｐＨを意味する。）
［８］Ｒ１のリンカーを有していてもよいタグたんぱく質反応部位が、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｈａｌｏタグリガンド（例えば、２－（２－（（６－クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エタンアミノ基）、弱塩基性アミン、マレイミド、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、アルキニル基、ベンジルグアニン誘導体又はベンジルシトシン誘導体等からなる群から選択される、［１］～［７］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［９］Ｒ１のラベル部位又は標的集積部位を含む基は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｈａｌｏタグリガンド（例えば、２－（２－（（６－クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エタンアミノ基）、弱塩基性アミン、マレイミド、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、アルキニル基、ベンジルグアニン誘導体又はベンジルシトシン誘導体等からなる群から選択されるラベル部位又は標的集積部位を有する、［１］～［７］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［１０］タグたんぱく質反応部位、ラベル部位又は標的集積部位を含む基が有することができるリンカーは、アルキレン基（但し、アルキレン基の１以上の－ＣＨ２－は、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－、又は－ＣＯ－で置換されていてもよい。）、アリーレン（ヘテロアリーレンを含む）、シクロアルキレン、アルコキシル基、ポリエチレングリコール鎖、アミド基、システイン酸アルキル、及び、これらの基から選択される２種以上の基が任意に結合して構成される基からなる群から選択される、［１］～［９］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［１１］以下のいずれかの構造を有する化合物またはその塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
［１２］［１］～［１１］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。
［１３］２種以上の［１］～［１１］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブであって、
２種以上の前記化合物又はその塩は、以下の条件を満たす、当該蛍光プローブ。
（１）２種以上の化合物又はその塩は、同一の、あるいは酷似した蛍光波長を有する蛍光母核を有する。
（２）２種以上の化合物又はその塩は、各々、異なるτｓｐを有する（ここで、τｓｐは、各化合物の開環状態（open form）からスピロ環化閉環状態（closed form）への速度定数（ｋＯ→Ｃ）の逆数である）。
［１４］前記２種以上の化合物又はその塩が有する異なるτｓｐは、１０倍以上異なる、［１３］に記載の蛍光プローブ。
［１５］前記２種以上の化合物又はその塩が有するτｓｐのうち、最も小さいτｓｐが１ｍｓｅｃ以上である、［１３］又は［１４］に記載の蛍光プローブ。
［１６］一波長測光マルチターゲットイメージング技法に用いられる、［１３］～［１５］のいずれか１項に記載の蛍光プローブ。
［１７］少なくとも１つの［１］～［１１］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブを２以上含む蛍光プローブ群であって、
当該蛍光プローブ群に含まれる前記化合物又はその塩は、以下の条件を満たす、当該蛍光プローブ群。
（１ａ）当該蛍光プローブ群に含まれる化合物又はその塩は、同一の、あるいは酷似した蛍光波長を有する蛍光母核を有する。
（２ａ）当該蛍光プローブ群に含まれる化合物又はその塩は、各々、異なるτｓｐを有する（ここで、τｓｐは、各化合物の開環状態（open form）からスピロ環化閉環状態（closed form）への速度定数（ｋＯ→Ｃ）の逆数である）。
［１８］前記蛍光プローブ群に含まれる化合物又はその塩が有する異なるτｓｐは、１０倍以上異なる、［１７］に記載の蛍光プローブ群。
［１９］前記蛍光プローブ群に含まれる化合物又はその塩が有するτｓｐのうち、最も小さいτｓｐが１ｍｓｅｃ以上である、［１７］又は［１８］に記載の蛍光プローブ群。
［２０］一波長測光マルチターゲットイメージング技法に用いられる、［１７］～［１９］のいずれか１項に記載の蛍光プローブ群。
［２１］以下の条件を満たす２種以上の［１］～［１１］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を測定対象物に導入し、
（１）２種以上の化合物は、同一の、あるいは酷似した蛍光波長を有する蛍光母核を有する。
（２）２種以上の化合物は、異なるτｓｐを有する（ここで、τｓｐは、各化合物の開環状態（open form）からスピロ環化閉環状態（closed form）への速度定数（ｋＯ→Ｃ）の逆数である）。
前記測定対象物に３５５ｎｍ以上の波長領域の適切なトリガー光を照射することにより、一過的非平衡状態を生成させ、そこからの緩和速度の違いを利用することにより、複数分子を同時に識別・定量することが可能な蛍光プローブイメージング法。
［２２］トリガー光を照射した後に、過渡吸収測定を行うことによって得られる過渡吸収の減衰に対して複数（導入した化合物の種類の数に対応する）成分の指数関数fittingを行うことにより、各化合物のτｓｐを算出することを含む、［２１］に記載の蛍光プローブイメージング法。
［２３］２種以上の［１］～［１１］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を、２種以上の異なる抗体とそれぞれ結合させ、当該化合物でラベル化された抗体で固定化した細胞の蛍光免疫染色を行うことによって、固定化した細胞のそれぞれの抗原を、各化合物が有するτｓｐを指標として区別することを含む、蛍光免疫染色法。
［２４］少なくとも１の［１］～［１１］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブを、がん細胞を含む可能性のある細胞又は組織に適用し、その後、３５５ｎｍ以上の波長領域の適切なトリガー光を当該細胞又は組織に照射することにより、前記蛍光プローブに由来する蛍光強度の増大を観測することによって、がん細胞（腫瘍部）特異的な蛍光上昇を抽出することを含む、蛍光イメージング方法。
［２５］内視鏡又は腹腔鏡による検査又は手術に用いられる、［２４］に記載の蛍光イメージング方法。
　本発明により、同一の、あるいは酷似した蛍光波長を有する蛍光団で落射蛍光顕微鏡で追跡可能な開環状態の寿命τｓｐを有するＴ型フォトクロミック蛍光プローブ群、及び当該蛍光プローブ群を構成する化合物を提供することが可能である。
　また、本発明の蛍光プローブ群を用いると、複数のプローブから放出された同一波長域の蛍光を落射蛍光顕微鏡でのtime-lapse撮像からそれぞれのプローブの蛍光を区別することが可能になる。
ＨＭＳｉＲのＴ型フォトクロミック特性を示す模式図。 既存のＨＭＲ類が有する課題を示す模式図。 本発明の分子設計の概念図を示す。 本発明の蛍光免疫染色法の模式図を示す。 本発明の蛍光イメージング法の模式図を示す。 化合物２－４及び２－７の吸収スペクトルの測定結果を示す。 Ｌａｓｅｒ　Ｆｌａｓｈ　Ｐｈｏｔｏｌｙｓｉｓ（ＬＦＰ）法での過渡吸収測定の模式図。 化合物２－４及び２－７の過渡吸収を測定した結果を示す。 化合物２－１９と化合物２－２０の吸収スペクトルとｐＫｃｙｃｌｅを示す。 化合物２－２０の吸収スペクトルと蛍光スペクトル（Ｅｘ．５２０ｎｍ）、５６７ｎｍでの吸光度とｐＨとの関係を示す。 化合物２－２０等の過渡吸収を測定した結果を示す。 化合物２－２０、２－２２及び２－２４の吸収スペクトルを示す。 化合物２－２２の吸収スペクトルと蛍光スペクトル（Ｅｘ．５２０ｎｍ）、５６７ｎｍでの吸光度とｐＨとの関係を示す。 化合物２－２０、２－２２及び２－２４の過渡吸収を測定した結果を示す。 １％未満のＤＭＳＯを含有する３０ｗ／ｖ％ＢＳＡ溶液中での２０μＭの化合物２－２０及び２－２２の過渡吸収の測定結果を示す。 化合物２－２２、２－２７及び２－３３の吸収スペクトルを示す。 化合物２－２７の吸収スペクトルと蛍光スペクトル（Ｅｘ．５２０ｎｍ）、５７３ｎｍでの吸光度とｐＨとの関係を示す。 化合物２－３３の吸収スペクトルと蛍光スペクトル（Ｅｘ．５２０ｎｍ）、５７１ｎｍでの吸光度とｐＨとの関係を示す。 Ｔｅｎｔａｇｅｌ（登録商標）－ＨＥ－ＮＯｘａＲ複合体の落射蛍光顕微鏡による実験方法の概要を示す。 Ｔｅｎｔａｇｅｌ（登録商標）－ＨＥ－ＮＯｘａＲ複合体Ｔｉｍｅ－ｌａｐｓｅイメージングを示す。 化合物３－４化合物３－７の過渡吸収測定から算出したτｓｐを示す。 ＣＨＰ－ＮＯｘａＲのそれぞれのジアステレオマーのｐＫｃｙｃｌｅ及びτｓｐを評価した結果を示す。 化合物３－１１Ｎの吸収スペクトルと蛍光スペクトル（Ｅｘ．５２０ｎｍ）、５６７ｎｍでの吸光度とｐＨとの関係を示す。 化合物３－１１Ｂの吸収スペクトルと蛍光スペクトル（Ｅｘ．５２０ｎｍ）、５６８ｎｍでの吸光度とｐＨとの関係を示す。 ＢＳＡ溶液中でＣＨＰ－ＮＯｘａＲの過渡吸収測定を行った結果を示す。 ＨＭ－、ＣＨＰ－、ＨＥ－ＮＯｘａＲの３つのプローブをそれぞれ２０μＭずつ混合して溶解したリン酸緩衝液を作製し、ＬＦＰ法での過渡吸収測定を行った結果を示す。 ＨＭ－、ＣＨＰ－、ＨＥ－ＮＯｘａＲの３つのプローブのΔＯＤｔ＝０からそれぞれの成分の濃度比を算出した結果を示す。 ＨＥ－ＮＯｘａＲを用いた生細胞内の小胞体のイメージング画像の結果を示す。
発明の実施の形態
　本明細書中において、「アルキル」は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせからなる脂肪族炭化水素基のいずれであってもよい。アルキル基の炭素数は特に限定されないが、例えば、炭素数１～６個（Ｃ１～６）、炭素数１～１０個（Ｃ１～１０）、炭素数１～１５個（Ｃ１～１５）、炭素数１～２０個（Ｃ１～２０）である。炭素数を指定した場合は、その数の範囲の炭素数を有する「アルキル」を意味する。例えば、Ｃ１～８アルキルには、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ｎｅｏ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、イソヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル等が含まれる。本明細書において、アルキル基は任意の置換基を1個以上有していてもよい。そのような置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシルなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アルキル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アルキル部分を含む他の置換基（例えばアルコシ基、アリールアルキル基など）のアルキル部分についても同様である。
　本明細書において「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。
　本明細書において、ある官能基について「置換されていてもよい」と定義されている場合には、置換基の種類、置換位置、及び置換基の個数は特に限定されず、２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらの置換基にはさらに置換基が存在していてもよい。このような例として、例えば、ハロゲン化アルキル基、ジアルキルアミノ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
１．一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩
　本発明の１つの実施態様は、以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である（以下「本発明の化合物」とも言う）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
　上記の通り、本発明者らは、既存のＨＭＲ類の課題を克服するために、（ｉ）トリガー光の波長として高圧水銀ランプやＵＶＬＥＤなどで出力可能な３５５～３６５ｎｍ程度で機能するプローブを開発すること、（ｉｉ）開環状態の寿命（τｓｐ）時間がｍｓｅｃ（ミリ秒）以上のプローブを開発することを目指した。理論に拘束されることを意図するものではないが、本発明者らは、（ｉ）については、ローダミン骨格に閉環状態での吸収波長を決定するアンテナ（antenna）部位の機能を導入すること、（ｉｉ）については、開環状態の寿命τｓｐを決定するτｓｐ調整部位の機能を導入することが重要であると考え、プローブの分子設計及び探索を行った（図３参照）。
　その結果、アンテナ（antenna）骨格として、ベンゼンよりも長波長側に吸収を持つナフタレン骨格を採用し、キサンテン環に組み込むことで閉環状態の吸収波長を長波長化させることを可能とした。また、τｓｐ調整部位については、スピロ環化で形成される環構造を構造に着目し、環の大きさ、即ちスピロ環を形成するアルキレン基の鎖長を最適化し、更に、アルキレン基に置換基を導入することでτｓｐの制御が可能になることを見出した。
　一般式（Ｉ）において、Ｒ１は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を表す。
　Ｒ１の一価の置換基は、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルコキシル基、ハロゲン原子、カルボキシル基、カルボキシル基を有するアルキル基、エステル基、アルキルエステル基、アミノ基、アミド基、アルキルアミノ基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、アジ化アルキル基、アルキニル基、リンカーを有していてもよいタグたんぱく質反応部位、リンカーを有していてもよいラベル部位又は標的集積部位を含む基等からなる群から選択される。
　これらの一価の置換基は更に任意の置換基を１個又は２個以上有していてもよい。例えば、Ｒ１が示すアルキル基にはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ１が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。
　Ｒ１のリンカーを有していてもよいタグたんぱく質反応部位は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｈａｌｏタグリガンド（例えば、２－（２－（（６－クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エタンアミノ基）、弱塩基性アミン、マレイミド、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、アルキニル基、ベンジルグアニン誘導体又はベンジルシトシン誘導体等からなる群から選択される。
　Ｒ１のラベル部位又は標的集積部位を含む基は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｈａｌｏタグリガンド（例えば、２－（２－（（６－クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エタンアミノ基）、弱塩基性アミン、マレイミド、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、アルキニル基、ベンジルグアニン誘導体又はベンジルシトシン誘導体等からなる群から選択されるラベル部位又は標的集積部位を含む。また、ラベル部位又は標的集積部位を含む基はリンカーを有することができる。また、ラベル部位又は標的集積部位を含む基は、当該ラベル部位又は標的集積部位をベンゼン環に連結する連結基（例えば、アミノ基、カルボニル基、カルボキシル基、アミド基、プロパギル基など）を有することができる。
　タグたんぱく質反応部位、ラベル部位又は標的集積部位を含む基が有することができるリンカーは、アルキレン基（但し、アルキレン基の１以上の－ＣＨ２－は、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－、又は－ＣＯ－で置換されていてもよい。）、アリーレン（ヘテロアリーレンを含む）、シクロアルキレン、アルコキシル基、ポリエチレングリコール鎖、アミド基、システイン酸アルキル、１以上のアルキレン基を有することができる１，２，３－トリアゾールを部分構造として含むリンカー、及び、これらの基から選択される２種以上の基が任意に結合して構成される基からなる群から選択される。
　ｍは、０～４の整数であり、ｍが２以上の場合は、各々のＲ１は同じであっても異なっていてもよい。
　一般式（Ｉ）のベンゼン環部位３位に置換基を導入することによってｐＫｃｙｃｌｅを減少させることが可能である。このような置換基としては、炭素数１以上のアルキル基、好ましくは、炭素数１～６のアルキル基（例えば、メチル基等）、塩素原子等のハロゲン原子、炭素数１以上のアジ化アルキル基、好ましくは、炭素数１～６のアジ化アルキル基（例えば、アジ化メチル基）等が挙げられる。
　従って、本発明の化合物の１つの好ましい側面において、一般式（Ｉ）のベンゼン環部位３位にＲ１として、炭素数１～６のアルキル基（例えば、メチル基等）、塩素原子等のハロゲン原子、又は炭素数１～６のアジ化アルキル基（例えば、アジ化メチル基）が導入されている。
　この場合、当該ベンゼン環のその他の部位にも、Ｒ１として上記した一価の置換基が導入されていてもよい。
　また、Ｒ１のタグたんぱく質反応部位、ラベル部位又は標的集積部位を含む基は、一般式（Ｉ）のベンゼン環の任意の部位に導入することができる。
　一般式（Ｉ）において、Ｌは、－（ＣＲａＲｂ）ｎ－で表される。
　ここで、ｎは１～２の整数である。ｎが１の場合は、スピロ環化で形成される環構造は五員環となり、ｎが２の場合は六員環となる。一般に、類似した蛍光母核を有する場合は、ｎが２の場合はｎが１の場合に比べて環化反応の速度が遅くなるためτｓｐが長寿命化する傾向にある。
　Ｒａ及びＲｂは、各々独立に、各出現において独立に、水素原子又は炭素数１～３のアルキル基である。
　Ｒａ、Ｒｂとしてアルキル基を導入すると、Ｌに結合するヒドロキシル基とアルキル基との立体反発により環化速度を加速し得る立体配座（gauche 配座）が優勢になり、Ｒａ及びＲｂが全て水素原子の場合に比べてτｓｐの短寿命化を図ることが可能となる。
　Ｒａ、Ｒｂのアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｉ－プロピル基があり、好ましくはメチル基である。
　本発明の化合物の１つの好ましい側面において、ｎが２であり、ヒドロキシエチレン基の１位にメチル基が１つ又は２つ導入される。
　本発明の好ましい態様において、Ｌは、－（ＣＨ２）－又は－（ＣＨ２）２－である。
　また、ｎが２の場合において、隣接する各々の炭素に結合するＲａ又はＲｂのそれぞれの１つは架橋して、これらが結合する２つの炭素と一緒に環構造を形成してもよい。形成される環構造は五員環又は六員環が好ましい。
　理論に拘束されることを意図するものではないが、このような環構造を導入することにより、ヒドロキシエチレン基（ＨＥ基）の配座自由度を減少させることでスピロ環化の反応速度が加速し、Ｒａ及びＲｂが全て水素原子の場合に比べて短寿命化を図ることが可能である。
　また、Ｌとして五員環（シクロペンチル環等）又は六員環（シクロヘキシル環等）を導入する場合は、ｃｉｓ型、ｔｒａｎｓ型のいずれの立体異性体であってもよい。また、五員環又は六員環を導入した化合物はジアステレオマーおよびラセミ体であってもよい。
　本発明の好ましい態様において、Ｌは、以下の式で表されるシクロペンチル環である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
　上記式中、＊及び＊＊は、夫々、ベンゼン環との結合箇所、及びヒドロキシル基との結合箇所を示す。
　また、本発明の別の好ましい態様において、Ｌは、以下の式で表されるシクロヘキシル環である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
　上記式中、＊及び＊＊は、夫々、ベンゼン環との結合箇所、及びヒドロキシル基との結合箇所を示す。
　Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子である。
　Ｒ２又はＲ３がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ２又はＲ３が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基などであってもよい。
　本発明の１つの側面においては、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であり、より好ましくは、Ｒ２及びＲ３がともに水素原子である。
　Ｒ４は、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり、その詳細についてはＲ２及びＲ３について説明したものと同様である。
　本発明の１つの側面においては、Ｒ４は水素原子又はハロゲン原子であり、より好ましくは、水素原子である。
　Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個の置換または無置換のアルキル基、－ＣＯ－Ｒ（即ち、キサンテン環に結合する窒素原子とともにアミド基を形成する）又は－ＣＯ－Ｏ－Ｒ（即ち、キサンテン環に結合する窒素原子とともにカルバメート基を形成する）である。ここで、Ｒは、炭素数１～６のアルキル基である。
　また、Ｒ５及びＲ６は、これらが結合している窒素原子と一緒に、酸素原子、窒素原子、硫黄原子及びリン原子からなる群から選択される１以上のヘテロ原子を含む、置換基を有していてもよい５～７員のヘテロシクリルを形成してもよい。
　ヘテロシクリルとしては、置換基を有していてもよいモルホリン環、Ｎ，Ｎ－ジメチルピペラジン、１，１－ジオキソチオモルホリン、４－メチル－１，４－アザホスフィナン４－オキシド等が挙げられ、好ましくは置換基を有していてもよいモルホリン環である。
　一般式（Ｉ）においてキサンテン環に結合する－ＮＲ５Ｒ６の部位はｐＫｃｙｃｌｅ調整部位の機能を有し（図３参照）、このｐＫｃｙｃｌｅ調整部位にモルホリン等の上記したヘテロシクリルを導入することローダミン骨格の求電子性が上昇すると考えられ、これによりｐＫｃｙｃｌｅを低減させることが可能である。
　一般式（Ｉ）において、Ｙは、－ＮＲｃＲｄ、アミド基（－ＮＨ－ＣＯ－Ｒ）、カルバメート基（－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｒ）又はジュロリジル基である。
　ここで、Ｒｃ及びＲｄは、各々独立に、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基である。Ｒは、炭素数１～６のアルキル基である。
　Ｘは、酸素原子又はＳｉＲ７Ｒ８である。
　ここで、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基である。
　Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、炭素数１～３個のアルキル基であることが好ましく、Ｒ７及びＲ８がともにメチル基であることがより好ましい。
　Ｒ７及びＲ８が示すアルキル基にはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えば当該アルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基などであってもよい。Ｒ７及び／又はＲ８がアリール基である場合には、アリール基は単環の芳香族基又は縮合芳香族基のいずれであってもよく、アリール環は１個又は２個以上の環構成ヘテロ原子（例えば窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子など）を含んでいてもよい。アリール基としてはフェニル基が好ましい。アリール環上には１個又は２個以上の置換基が存在していてもよい。置換基としては、例えばハロゲン原子、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。
　本発明の化合物の１つの好ましい態様は、以下の一般式（Ｉａ）で表される化合物又はその塩である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
　一般式（Ｉａ）において、Ｒ１～Ｒ４、Ｌ、ｍの詳細については、一般式（Ｉ）で詳述した通りである。
　Ｒ９は、存在する場合は、炭素数１～６個の置換または無置換のアルキル基である。
　本発明の化合物の１つの好ましい側面においては、生理的ｐＨにおいて、一般式（Ｉ）又は一般式（Ｉａ）の化合物の大部分が分子内スピロ環化体（closed form）として存在する。
　これにより、生理的ｐＨにおいて、有効な開環状態の寿命τｓｐの測定による蛍光イメージングが可能となる。
　本発明の１つの好ましい側面において、一般式（Ｉ）又は一般式（Ｉａ）の化合物のｐＫｃｙｃｌｅが７以下である。
　ここで、ｐＫｃｙｃｌｅとは、一般式（Ｉ）又は一般式（Ｉａ）の化合物が水溶液中においてスピロ環化閉環状態（closed form）と開環状（open form）の存在比が１：１になるｐＨを意味する。水溶液中のｐＨがｐＫｃｙｃｌｅよりも高い時、スピロ環化閉環状態（closed form）の割合が開環状（open form）よりも大きくなる。
　ｐＫｃｙｃｌｅの測定方法については、実施例に記載したように、化合物の吸収スペクトルを所定の濃度のりん酸ナトリウム等の緩衝液中で種々のｐＨ値で測定し、ｎ価の酸塩基平衡をもつ化合物（ｎ＝１又は２）について、吸光度（Ａｂｓ）のｐＨプロフィルを次式にあてはめ、ｐＫａ値を求めることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
　ここで、計算は、Ｇａｕｓｓｉａｎ　０９（M. J. Frisch, G. W. Trucks, H. B. Schlegel, G. E. Scuseria, M. A. Robb, J. R. Cheeseman, G. Scalmani, V. Barone, G. A. Petersson, H. Nakatsuji, X. Li, M. Caricato, A. Marenich, J. Bloino, B. G. Janesko, R. Gomperts, B. Mennucci, H. P. Hratchian, J. V. Ort, and D. J. F. Gaussian09 Revision D.01）プログラム等を用いて行うことができるが、これに限定されるものではない。
　本発明の化合物の非限定的な例は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000014
　一般式（Ｉ）及び（Ｉａ）で表される化合物は、酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、トリフルオロ酢酸塩などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。一般式（Ｉ）及び（Ｉａ）で表される化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、本発明においては、これらの物質も用いることができる。
　一般式（Ｉ）及び（Ｉａ）で表される化合物は、置換基の種類により、１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、本発明においては、１個又は２個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や２個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体なども用いることができる。
　本発明の化合物の製造方法は特に限定されないが、一般式（Ｉ）に包含される化合物のうち代表的化合物についての合成方法を本明細書の実施例に具体的に示した。当業者は本明細書の実施例及び下記のスキームを参照しつつ、必要に応じて出発原料、反応試薬、反応条件などを適宜改変ないし修飾することにより、一般式（Ｉ）に包含される化合物を製造することができる。
２．蛍光プローブ及び蛍光プローブ群
　本発明のもう１つの実施態様は、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む蛍光プローブである（以下「本発明の蛍光プローブＩ」とも言う）。
　本発明の蛍光プローブの使用方法は特に限定されず、従来公知の蛍光プローブと同様に用いることが可能である。通常は、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに一般式（Ｉ）の化合物又はその塩を溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、蛍光スペクトルを測定すればよい。本発明の蛍光プローブを適切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤などの添加物と組み合わせることができる。
　また、本発明の蛍光プローブ中の一般式（Ｉ）の化合物の濃度は、測定する細胞等の種類や測定条件等に応じて適切に定めることができる。
　本発明のもう１つの実施態様は、２種以上の本発明の化合物又はその塩を含む蛍光プローブであって、
２種以上の前記化合物又はその塩は、以下の条件を満たす、当該蛍光プローブである（以下「本発明の蛍光プローブＩＩ」とも言う）。
（１）２種以上の化合物又はその塩は、同一の、あるいは酷似した蛍光波長を有する蛍光母核を有する。
（２）２種以上の化合物又はその塩は、各々、異なるτｓｐを有する（ここで、τｓｐは、各化合物の開環状態（open form）からスピロ環化閉環状態（closed form）への速度定数（ｋＯ→Ｃ）の逆数である）。
　ここで、「同一の、あるいは酷似した蛍光波長を有する蛍光母核」とは、蛍光母核として全く同一である場合だけではなく、通常の蛍光観察では分離することが出来ない似た波長の蛍光母核である場合も含む。このような場合であっても、同様の速度定数の違いを活用する戦略で区別可能とすることができるためである。
　２種以上の化合物又はその塩の蛍光スペクトルの重なりがある程度大きければ「酷似した蛍光波長を有する蛍光母核」に該当する。本発明の蛍光プローブＩＩの１つの側面において、酷似した蛍光波長を有する蛍光母核とは、２種以上の化合物又はその塩の蛍光スペクトルの蛍光ピーク波長（λＦＩ）が±２０ｎｍ程度、好ましくは±１０ｎｍ程度、より好ましくは±５ｎｍ程度、更に好ましくは±３ｎｍ程度相違することを言う。
　本発明の蛍光プローブＩＩにおいて、好ましくは、２種以上の化合物又はその塩が有する異なるτｓｐは、１０倍以上異なる。
　異なる２つの色素を混ぜた場合のτｓｐについて本発明者らが検討した結果によると、τｓｐが１ｍｓｅｃのプローブとτｓｐが２ｍｓｅｃ、５ｍｓｅｃ、１０ｍｓｅｃのプローブを比較する場合、τｓｐが１ｍｓｅｃのプローブは５ｍｓｅｃ経過したときに開環状態が１％まで減少し、この時、τｓｐが２ｍｓｅｃ、５ｍｓｅｃ、１０ｍｓｅｃのプローブは８％、３７％、６１％になる（実施例の表１参照）。τｓｐが１０倍離れているプローブであればそれぞれのプローブの蛍光強度比が１：６０程度で観測できるため、十分区別可能である。
　ここで、開環状態の寿命τｓｐは、通常、Ｌａｓｅｒ　Ｆｌａｓｈ　Ｐｈｏｔｏｌｙｓｉｓ法（ＬＦＰ）を用いて測定することができる。
　τｓｐの測定方法の例について、実施例に記載しているが、本発明の化合物を溶解した水溶液に対してＮｄ－ＹＡＧレーザーの３倍波（３５５ｎｍ）パルス光（例えば、約０．５Ｗ／ｃｍ２）を照射すると、パルスレーザー照射によって生成した開環状態は熱的に閉環状態へと変換されるため、一連の過程での開環状態の吸収極大波長での吸光度を測定すると、パルスレーザー照射直後に開環状態濃度が一過的に増加するため正の過渡吸収が観測され、時間経過とともに開環状態の濃度が減少するので過渡吸収はパルスレーザー照射直前の値近くに戻る。この減衰に対してΔＯＤ＝Ａｅ－ｔ／τｓｐの式をフィッティングすることでτｓｐを算出することができる。
　本発明の蛍光プローブＩＩにおいて、好ましくは、２種以上の化合物又はその塩が有するτｓｐのうち、最も小さいτｓｐが１ｍｓｅｃ以上である。
　最も小さいτｓｐが１ｍｓｅｃ以上であると、落射蛍光顕微鏡を用いて開環状態の寿命τｓｐを追跡可能であり、有効なマルチターゲットイメージングが可能である。
　本発明の蛍光プローブＩＩの好ましい態様において、２種以上の化合物又はその塩が有する異なるτｓｐは１０倍以上異なり、かつ、２種以上の化合物又はその塩が有するτｓｐのうち、最も小さいτｓｐが１ｍｓｅｃ以上である。
　本発明の蛍光プローブＩＩは、一波長測光マルチターゲットイメージング技法に好適に用いられる。
　一波長測光マルチターゲットイメージング技法としては、例えば、３６５ｎｍの光源を導入した落射蛍光顕微鏡を用いてtime-lapse撮像を行い、３６５ｎｍ光照射後の単一波長における蛍光強度の減衰速度からτｓｐが異なるプローブ同士を識別することで３成分以上の多重イメージングを行うことができる。
　本発明の蛍光プローブＩＩは、通常、２種以上の本発明の化合物又はその塩を、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、蛍光スペクトルを測定するのに使用することができる。本発明の蛍光プローブＩＩを適切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤などの添加物と組み合わせることができる。
　また、本発明の蛍光プローブＩＩ中の各々の本発明の化合物の濃度は、測定する細胞等の種類や測定条件等に応じて適切に定めることができる。
　本発明のもう１つの実施態様は、少なくとも１つの本発明の化合物又はその塩を含む蛍光プローブを２以上含む蛍光プローブ群であって、
当該蛍光プローブ群に含まれる前記化合物又はその塩は、以下の条件を満たす、当該蛍光プローブ群である（以下「本発明の蛍光プローブ群」とも言う）。
（１ａ）当該蛍光プローブ群に含まれる化合物又はその塩は、同一の、あるいは酷似した蛍光波長を有する蛍光母核を有する。
（２ａ）当該蛍光プローブ群に含まれる化合物又はその塩は、各々、異なるτｓｐを有する（ここで、τｓｐは、各化合物の開環状態（open form）からスピロ環化閉環状態（closed form）への速度定数（ｋＯ→Ｃ）の逆数である）。
　本発明の蛍光プローブ群は、少なくとも１つの本発明の化合物又はその塩を含む２以上の蛍光プローブを含むものであり、２種以上の蛍光プローブの集合に関するものである。
　本発明の蛍光プローブ群に含まれる各々の蛍光プローブは、通常、少なくとも１つの本発明の化合物又はその塩を、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに溶解して調製される。各々の蛍光プローブを適切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤などの添加物と組み合わせることができる。
　また、蛍光プローブ群に含まれる各々の蛍光プローブ中の各々の本発明の化合物の濃度は、測定する細胞等の種類や測定条件等に応じて適切に定めることができる。
　また、本発明の蛍光プローブ群に含まれる２以上の蛍光プローブは、各々、本発明の化合物又はその塩以外の蛍光プローブを含んでもよい。
　「同一の、あるいは酷似した蛍光波長を有する蛍光母核」については、本発明の蛍光プローブＩＩにおいて説明した通りである。
　本発明の蛍光プローブ群において、好ましくは、蛍光プローブ群に含まれる化合物又はその塩が有する異なるτｓｐは、１０倍以上異なる。
　本発明の蛍光プローブ群において、好ましくは、蛍光プローブ群に含まれる化合物又はその塩が有するτｓｐのうち、最も小さいτｓｐが１ｍｓｅｃ以上である。
　本発明の蛍光プローブ群の好ましい態様において、蛍光プローブ群に含まれる化合物又はその塩が有する異なるτｓｐは１０倍以上異なり、かつ、蛍光プローブ群に含まれる化合物又はその塩が有するτｓｐのうち、最も小さいτｓｐが１ｍｓｅｃ以上である。
　本発明の蛍光プローブ群は、一波長測光マルチターゲットイメージング技法に好適に用いられる。
　本発明の蛍光プローブ群は、少なくとも１つの本発明の化合物又はその塩を含む蛍光プローブを２以上含むキットの形態とすることができる。
　即ち、本発明のもう１つの実施態様は、少なくとも１つの本発明の化合物又はその塩を含む蛍光プローブを２以上含む蛍光測定用のキットであって、
　当該キットに含まれる前記化合物又はその塩は、以下の条件を満たす、当該キットである。
　（１ａ）当該キットに含まれる化合物又はその塩は、同一の、あるいは酷似した蛍光波長を有する蛍光母核を有する。
　（２ａ）当該キットに含まれる化合物又はその塩は、各々、異なるτｓｐを有する（ここで、τｓｐは、各化合物の開環状態（open form）からスピロ環化閉環状態（closed form）への速度定数（ｋＯ→Ｃ）の逆数である）。
　当該キットにおいて、通常、各々の蛍光プローブは溶液として調製されているが、例えば、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供され、使用時に注射用蒸留水や適宜の緩衝液に溶解して適用することもできる。
　また、当該キットには、必要に応じてそれ以外の試薬等を適宜含んでいてもよい。例えば、添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。
３．本発明の化合物の利用
　本発明のもう１つの実施態様は、以下の条件を満たす２種以上の本発明の化合物又はその塩を測定対象物に導入し、
（１）２種以上の化合物は、同一の、あるいは酷似した蛍光波長を有する蛍光母核を有する。
（２）２種以上の化合物は、異なるτｓｐを有する（ここで、τｓｐは、各化合物の開環状態（open form）からスピロ環化閉環状態（closed form）への速度定数（ｋＯ→Ｃ）の逆数である）。
前記測定対象物に３５５ｎｍ以上の波長領域の適切なトリガー光を照射することにより、一過的非平衡状態を生成させ、そこからの緩和速度の違いを利用することにより、複数分子を同時に識別・定量することが可能な蛍光プローブイメージング法（以下「本発明のイメージング法」とも言う）。
　３５５ｎｍ以上の波長領域の適切なトリガー光を照射する光源としては、高圧水銀ランプやＵＶＬＥＤなどが挙げられる。
　本発明のイメージング法の測定対象物には、細胞や抗体等の試料、生体試料（例えば、被検者から単離された生体試料、生検試料、体液試料、水溶液）等である。ある態様では、生体試料は、血液試料（例えば、血清試料、または血漿試料）であり得る。
　測定対象である細胞の試料は、標的酵素を発現している細胞であることができるが、かかる細胞が標的酵素を発現しているがん細胞やがん組織である場合には、本発明のイメージング法によって、がん細胞やがん組織を検出又は可視化することができる。すなわち、本発明の蛍光プローブ、本発明の蛍光プローブＩ、本発明の蛍光プローブ群、及び本発明のイメージング法は、がんの予測または診断に用いることも可能である。
　「同一の、あるいは酷似した蛍光波長を有する蛍光母核」については、本発明の蛍光プローブＩＩにおいて説明した通りである。また、τｓｐの測定方法については、本発明の蛍光プローブＩＩにおいて説明した通りである。
　２種以上の本発明の化合物又はその塩を測定対象物に導入するには、これら化合物を、予め、別々に、或いは一緒に、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに溶解し、細胞や組織などの測定対象物を含む適切な緩衝液中にこれらの溶液を添加することにより行うことができる。
　また、２種以上の本発明の化合物又はその塩を含む蛍光プローブは、適切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤などの添加物と組み合わせることができる。
　２種以上の本発明の化合物又はその塩を測定対象物に添加する濃度は、測定する細胞等の測定対象物の種類や測定条件等に応じて適切に定めることができる。
　本発明のイメージング法の１つの好ましい側面においては、トリガー光を照射した後に、過渡吸収測定を行うことによって得られる過渡吸収の減衰に対して複数（導入した化合物の種類の数に対応する）成分の指数関数fittingを行うことにより、各化合物のτｓｐを算出することを含む。
　過渡吸収測定は、Ｌａｓｅｒ　Ｆｌａｓｈ　Ｐｈｏｔｏｌｙｓｉｓ法（ＬＦＰ法）を用いて行うのが好ましい。
　測定方法の例として、本発明の化合物を導入した測定対象物に対してＮｄ－ＹＡＧレーザーの３倍波（３５５ｎｍ）パルス光（例えば、約０．５Ｗ／ｃｍ２）を照射すると、パルスレーザー照射によって生成した開環状態は熱的に閉環状態へと変換されるため、一連の過程での開環状態の吸収極大波長での吸光度を測定すると、パルスレーザー照射直後に開環状態濃度が一過的に増加するため正の過渡吸収が観測され、時間経過とともに開環状態の濃度が減少するので過渡吸収はパルスレーザー照射直前の値近くに戻る。Ｔ型フォトクロミック特性を有する分子では時間経過とともに指数関数的に過渡吸収が減衰するので、この減衰に対してΔＯＤ＝Ａｅ－ｔ／τｓｐの式をフィッティングすることでτｓｐを算出する。
　また、多成分の指数関数fittingは、以下の式で行う。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000015
　本発明の本発明のイメージング法において、好ましくは、２種以上の本発明の化合物又はその塩が有する異なるτｓｐは、１０倍以上異なる。
　本発明のイメージング法において、好ましくは、２種以上の本発明の化合物又はその塩が有するτｓｐのうち、最も小さいτｓｐが１ｍｓｅｃ以上である。
　本発明のイメージング法の好ましい態様において、２種以上の本発明の化合物又はその塩が有する異なるτｓｐは１０倍以上異なり、かつ、２種以上の本発明の化合物又はその塩が有するτｓｐのうち、最も小さいτｓｐが１ｍｓｅｃ以上である。
　本発明のイメージング法は、一波長測光マルチターゲットイメージング技法として好適に用いることができる。
　本発明のもう１つの実施態様は、２種以上の本発明の化合物又はその塩を、２種以上の異なる抗体とそれぞれ結合させ、当該化合物でラベル化された抗体で固定化した細胞の蛍光免疫染色を行うことによって、固定化した細胞のそれぞれの抗原を、各化合物が有するτｓｐを指標として区別することを含む、蛍光免疫染色法である（以下「本発明の蛍光免疫染色法」とも言う）。
　図４に本発明の蛍光免疫染色法の模式図を示す。
　図４に示すように、本発明の化合物又はその塩をターゲットが異なる抗体と結合させ、当該化合物でラベル化された抗体で固定化した細胞の蛍光免疫染色を行うことによって、固定化した細胞のそれぞれの抗原をτｓｐを指標として区別することができる。 
　また、本発明の化合物又はその塩のラベル化にＨａｌｏ　ｔａｇ（登録商標）などのタグタンパク質やビオチン－ストレプトアビジンなどのｃｌｉｃｋ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを用いることで生細胞でもイメージングも可能になる。
　本発明の蛍光免疫染色法に用いられる場合には、２種以上の本発明の化合物又はその塩は、それぞれ、Ｒ１として、リンカーを有していてもよいタグたんぱく質反応部位、リンカーを有していてもよいラベル部位又は標的集積部位を含む基を、有することが好ましい。
　Ｒ１のリンカーを有していてもよいタグたんぱく質反応部位は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｈａｌｏタグリガンド（例えば、２－（２－（（６－クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エタンアミノ基）、弱塩基性アミン、マレイミド、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、アルキニル基、ベンジルグアニン誘導体又はベンジルシトシン誘導体等からなる群から選択される。
　Ｒ１のラベル部位又は標的集積部位を含む基は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｈａｌｏタグリガンド（例えば、２－（２－（（６－クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エタンアミノ基）、弱塩基性アミン、マレイミド、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、アルキニル基、ベンジルグアニン誘導体又はベンジルシトシン誘導体等からなる群から選択されるラベル部位又は標的集積部位を有する。また、ラベル部位又は標的集積部位を含む基はリンカーを有することができる。また、ラベル部位又は標的集積部位を含む基は、当該ラベル部位又は標的集積部位をベンゼン環に連結する連結基（例えば、アミノ基、カルボニル基、カルボキシル基、アミド基、プロパギル基など）を有することができる。
　タグたんぱく質反応部位、ラベル部位又は標的集積部位を含む基が有することができるリンカーは、アルキレン基（但し、アルキレン基の１以上の－ＣＨ２－は、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－、又は－ＣＯ－で置換されていてもよい。）、アリーレン（ヘテロアリーレンを含む）、シクロアルキレン、アルコキシル基、ポリエチレングリコール鎖、アミド基、システイン酸アルキル、１以上のアルキレン基を有することができる１，２，３－トリアゾールを部分構造として含むリンカー、及び、これらの基から選択される２種以上の基が任意に結合して構成される基からなる群から選択される。
　本発明のτｓｐを指標として区別することができる蛍光免疫染色法において、本発明の化合物でラベル化する抗体としては、特に限定されるものではないが、例えば、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、葉酸受容体などのがん細胞特異的表面抗原に対する抗体などが挙げられる。
　本発明のもう１つの実施態様は、少なくとも１の本発明の化合物又はその塩を含む蛍光プローブを、がん細胞を含む可能性のある細胞又は組織に適用し、その後、３５５ｎｍ以上の波長領域の適切なトリガー光を当該細胞又は組織に照射することにより、前記蛍光プローブに由来する蛍光強度の増大を観測することによって、がん細胞（腫瘍部）特異的な蛍光上昇を抽出することを含む、蛍光イメージング方法である（以下「本発明の蛍光イメージング法」とも言う）。
　本発明の蛍光イメージング法の模式図を図５に示す。
　蛍光内視鏡又は腹腔鏡を用いてがん細胞を含む可能性のある細胞又は組織を検査すると、自家蛍光が出てしまうため斑状の自家蛍光に埋もれて腫瘍部の検出が困難であるという問題がある。これに対して、本発明の蛍光イメージング法においては、トリガー光を蛍光イメージング法に照射するとプローブ由来の蛍光のみが増大することから、トリガー光照射前後の画像を引き算することで、腫瘍部特異的な蛍光上昇を抽出することが可能である。
　蛍光プローブを、がん細胞を含む可能性のある細胞又は組織に適用するには、例えば、蛍光プローブの溶液を局所的に当該細胞又は組織にスプレーすることによって行うことができる。
　本発明の蛍光イメージング法の対象となるがん細胞又はがん組織の種類として、肺がん、前立腺がん、卵巣がん、乳がん、膀胱がん、脳腫瘍、食道がん、胃がん、胆管がん、肝がん、膵がん、頭頚部がん、腎がん、白血病、皮膚がん、甲状腺がんの細胞又は組織が挙げられる。
　本明細書において、「がん組織」の用語はがん細胞を含む任意の組織を意味している。「組織」の用語は臓器の一部又は全体を含めて最も広義に解釈しなければならず、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。
　本発明の蛍光イメージング法は、内視鏡又は腹腔鏡による検査又は手術に好適に用いられる。
　以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらに限られるものではない。
１．材料及び方法
試薬
　一般化学品は、オルドリッチ化学、東京化学工業、和光純薬が供給する入手可能な最良のグレードのもので、それ以上精製することなく使用した。特殊化学物質:分光分析に用いられたジメチルスルホキシド (同仁堂) は蛍光等級であった。他の溶媒は適切な蒸留または精製後に使用した。
機器
　ＮＭＲスペクトルは、ＪＥＯＬ　ＪＮＭ－ＬＡ３００装置（１ＨＮＭＲについては３００ＭＨｚ、１３ＣＮＭＲについては７５ＭＨｚで）、または、ＪＥＯＬ　ＪＮＭ－ＬＡ４００装置（１ＨＮＭＲについては４００ＭＨｚ、１３ＣＮＭＲについては１００ＭＨｚで）測定した。すべての化学シフト（δ）は、内部標準テトラメチルシラン（δ＝０．０ｐｐｍ）に対するｐｐｍ、又は残留溶媒ＣＤＣｌ３（１Ｈについては７．２６ｐｐｍ、１３Ｃについては７７．１６ｐｐｍ）、ＣＤ３ＯＤ（１Ｈは３．３１ｐｐｍ、１３Ｃは４９．００ｐｐｍ）又はＤＭＳＯ－ｄ６（１Ｈは２．５０ｐｐｍ、１３Ｃは３９．５２ｐｐｍ）に対するｐｐｍである。カップリング定数はＨｚで示している。
　質量スペクトルは、ＪＥＯＬ　ＡｃｃｕＴＯＦ　４　ＧＬＣプラス質量分析計を用いて、ＥＳＩ＋及びＥＳＩ－について測定した。
　ＨＰＬＣ分析は、ポンプ（ＰＵ－２０８０、ＪＡＳＣＯ）と検出器（ＭＤ－２０１５、ＪＡＳＣＯ）からなるＨＰＬＣシステムを用いて、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ－３（４．５×２５０ｍｍ）カラム（ＧＬサイエンス株式会社）で行った。分取ＨＰＬＣは、溶離液Ａ（０．１％　ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を含むＨ２Ｏ）及び溶離液Ｂ（２０％　Ｈ２Ｏを含むＣＨ３ＣＮ）を用い、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ－３（１０．０ｍｍ×２５０ｍｍ）逆相カラム（ＧＬサイエンス株式会社）を用いて、Ｊａｓｃｏ　ＰＵ－１５８７Ｓ２系で行った。
　シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、Ｗａｋｏｇｅｌ　Ｃ－２００（和光市、日本）、Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ－ＮＨ（富士シリシアケミカル（株）（春日井市））、シリカゲル６０（関東化学株式会社）、又はシリカゲル６０Ｎ（関東化学株式会社）を用いて行った。
　吸収スペクトル測定は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ　ＵＶ－１８００で行った。
ｐＫ ｃｙｃｌｅ 値の決定
　化合物の吸収スペクトルを０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液中で種々のｐＨ値で測定した。ｎ価の酸塩基平衡をもつ化合物（ｎ＝１又は２）について、吸光度（Ａｂｓ）のｐＨプロフィルを次式にあてはめ、ｐＫａ値を求めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000016
計算の詳細
　Ｇａｕｓｓｉａｎ　０９（M. J. Frisch, G. W. Trucks, H. B. Schlegel, G. E. Scuseria, M. A. Robb, J. R. Cheeseman, G. Scalmani, V. Barone, G. A. Petersson, H. Nakatsuji, X. Li, M. Caricato, A. Marenich, J. Bloino, B. G. Janesko, R. Gomperts, B. Mennucci, H. P. Hratchian, J. V. Ort, and D. J. F. Gaussian09 Revision D.01）プログラムを用いて計算を行った。静止点は対称性の仮定なしに最適化し、厳密な収束基準を使用した。
レーザーフラッシュ光分解によるτ ｓｐp の定量
　励起源としてＳｕｒｅｌｉｔｅ　ＩＩ－１０　ＱスイッチＮｄ－ＹＡＧレーザー（コンティニュアス、パルス幅４～６ｎｓ、３５５ｎｍ）を用いた。過渡信号は分光器（ＵＳＰ－ＭＦ２００、ユニソク）で記録した。実験は２２℃で行った。０．１－１％の無水ＤＭＳＯを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液または１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液：ＭｅＯＨ＝１：１（ｖ／ｖ）に化合物を溶解した。開環状態の寿命（τｓｐ）は、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ４．５を使用して減衰曲線を単一の指数関数にフィッティングすることによって決定された。
顕微鏡
　以下を搭載したオリンパスＩＸ７１システムを用いてｔｉｍｅ－ｌａｐｓｅ撮影を行った。
・倒立蛍光顕微鏡（ＩＸ－７１；オリンパス）
・ＥＭＣＣＤカメラ（Ｃ９１００；浜松ホトニクス）
・目的（ＵＰｌａｎＡｐｏｎ　１０ｘ／０，４０，∞／０，１７；オリンパス）
・蛍光光源（Ｕ－ＬＨ７５ＸＥＡＰＯ；オリンパス）
・システム制御及び画像解析用ソフトウェア（Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ；　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）
・３６５ｎｍ　ＵＶ－ＬＥＤ（Ｃ１４０５２－１－Ａ１、Ｌ１４３１１－１０３；浜松ホトニクス）
２．分子設計
　本発明が目的とするＴ型フォトクロミック蛍光プローブ群を開発するうえで既存のＨＭＲ類が抱える以下の２つの課題を克服する必要がある（図２参照）。
（１）トリガー光の波長
　ＨＭＳｉＲをはじめとした本発明者らがこれまでに開発したプローブのほとんどは閉環状態での吸収が短く、３０８ｎｍ以下でしか励起できない。一般的に普及している落射蛍光顕微鏡に組み込むこと、さらには生細胞イメージングへの適用を考慮し、高圧水銀ランプやＵＶＬＥＤなどで出力可能な３６５ｎｍで機能するプローブの開発が必要になる。
（２）開環状態の寿命τｓｐの時間範囲
　上記のように一般的な落射顕微鏡に搭載されているカメラのフレームレートは０．１～１００ｍｓｅｃ程度であるため、開発するプローブ群のτｓｐはｍｓｅｃ以上であることが必要である。しかし、今までに報告されているプローブのτｓｐの時間範囲はｍｓｅｃオーダーが上限となっている。蛍光顕微鏡での測定を容易にし、区別可能なプローブ数を増やすうえで、時間範囲を秒オーダーまで拡張する必要がある。
　上記の２つの課題を克服するために、ローダミン骨格に閉環状態での吸収波長を決定するアンテナ（antenna）部位、開環状態の寿命τｓｐを決定するτｓｐ調整部位、誘導体化に伴うｐＫｃｙｃｌｅの変化を調整するｐＫｃｙｃｌｅ調整部位の３つの機能を導入したＨＭＲ誘導体を設計した。それぞれの部位を最適化することで前述の課題を克服したＴ型フォトクロミック特性を示す蛍光プローブ群を開発した。また、アンテナ骨格にはベンゼンよりも長波長側に吸収を持つナフタレン骨格を採用し、キサンテン環に組み込むことで閉環状態の吸収波長を長波長化させることとした（図３参照）。
（Ａ）アンテナ構造の検討
　ナフタレンは導入する官能基の種類によって吸収波長が変化することから、まず、アンテナ部位の置換基の最適化を行った。アンテナ部位にアミノ基、ジメチルアミノ基を導入した化合物２－４及び化合物２－７を以下の通り合成した。
［合成実施例１］
化合物２－４及び２－７の合成
　以下のスキームに則り、化合物２－４及び２－７を合成した。
スキーム１
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000017
（１） 化合物２－３の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000018
　化合物２－１（５６１．８ｍｇ、１．７９２ｍｍｏｌ）と化合物２－２（２８７．５ｍｇ、１．８０６ｍｍｏｌ）をＭｓＯＨ（２ｍＬ）に溶解した。反応混合物を１９時間撹拌し、室温まで冷却した。反応混合物をＨ２Ｏ（２０ｍＬ）に流し込み、ＣＨ　２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝１：１（１０ｍＬ×３）で抽出した。結合した有機層を蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝９９／１～９５／５、０．１％ＡｃＯＨ含有）で精製し、化合物２－３を青色固体（５２７．０ｍｇ、５９％）として得た。
1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ8.44(d,J=9.1Hz,1H),8.11-8.08(m,1H),7.68-7.64(m,1H),7.28-7.22(m,2H),7.13 (d,J=9.6 Hz,1H),7.08(dd,J=9.1,2.3Hz,1H),7.01 (d,J=2.3Hz,1H),6.95-6.87 (m,3H),3.60(q,J=7.0Hz,4H),1.25(t,J=7.0 Hz,6H)
HRMS Calcd for C28H25N2O3: 437.18597(M+); Found: 437.18453.
（２） 化合物２－４の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000019
　Ａｒでフラッシュした火炎乾燥したフラスコに、化合物２－３（６０．６ｍｇ、０．１２３２ｍｍｏｌ）と無水ＴＨＦ（４ｍＬ）を加えた。１Ｍ ＢＨ３－ＴＨＦ錯体溶液（０．５０ｍＬ、０．４９２８ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を１４．５時間還流した。反応を２ＮＨＣｌａｑで急冷し、懸濁液にクロラニル（３０．１ｍｇ、０．１２３２ｍｍｏｌ）とＤＣＭ（１０ｍＬ）を加えた。得られた混合物を０．５時間撹拌し、ＤＣＭ（１０ｍＬ×３）で抽出した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝９９／１）で予備精製し、蒸発させた。得られた残留物をメタノールに溶解し、Ｓｅｐ－Ｐａｋ　Ｃ　１８Ｐｌｕｓ　Ｓｈｏｒｔ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅで前処理し、ろ液を蒸発させた。Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＦＡ）、Ａ／Ｂ＝２０／８０（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＥＡＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％　ＴＥＡＡ）、Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）　～０／１００（５０分）の線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％　ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＦＡ）の条件下で、残留物を分取ＨＰＬＣによって精製した。化合物２－４は青色固体（６．６ｍｇ、１８％）として得られた。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD+KOD)δ8.26(d, J=9.1Hz,1H),7.41 (d,J=7.8Hz,1H),7.35(t,J =7.8,1H),7.24(t,J=7.8Hz,1H),7.14(d,J=8.7Hz,1H),7.08(dd,J=9.1,2.3Hz,1H),6.92 (d,J=2.3Hz,1H),6.78(d,J=7.8Hz,1H),6.74(d,J=8.7Hz,1H),6.72(d,J=8.9Hz,1H),6.58(d,J=2.5Hz,1H),6.45(dd,J=8.9,2.5Hz,1H),5.26(s,2H),3.39 (q,J=7.0Hz,4H),1.16 (t,J=6.9Hz,6H)
13C-NMR(100MHz,CD3OD+KOD) δ151.6,148.8,146.9,146.1,145.1,138.9,136.0,129.6,128.1,127.8,125.5,123.7,122.8,120.5,120.5,118.0,117.2,115.5,114.3,111.2,108.5,108.2,85.1,71.4,44.1,11.6
HRMS Calcd for C28H27N2O2 423.20670: (M+); Found: 423.20106.
　精製後のＨＰＬＣクロマトグラムを以下に示す。（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＦＡ。Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配。１．０　ｍＬ／ｍｉｎの流量。５７０ｎｍでの検出）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000020
（３） 化合物２－６の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000021
　化合物２－１（１７５．６ｍｇ、０．５６０４ｍｍｏｌ）と化合物２－５（１００．２ｍｇ、０．４９７９ｍｍｏｌ）をＭｓＯＨ（２ｍＬ）に溶解した。反応混合物を１９時間撹拌し、室温まで冷却した。反応混合物をＨ２Ｏ（２０ｍＬ）に流し込み、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝１：１（１０ｍＬ×３）で抽出した。結合した有機層を蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝９９／１～９５／５、０．１％ＡｃＯＨ含有）で精製し、化合物２～６を青色固体（７９．４ｍｇ、２８％）として得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.52 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 8.14-8.12 (m, 1H), 7.67 (m, 2H), 7.38 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.30-7.24 (m, 2H), 7.16 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.03 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.97 (dd, J = 9.6,2.3 Hz, 1H), 6.93-6.90 (m, 2H), 3.62 (q, J = 7.2 Hz, 4H), 3.14 (s, 6H), 1.27 (t, J = 7.2 Hz, 6H)
HRMS Calcd for C30H29N2O3: 465.21727 (M+); Found: 465.21607
（４） 化合物２－７の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000022
　Ａｒでフラッシュした火炎乾燥フラスコに、化合物２－６（２７．８ｍｇ、０．０５９８４ｍｍｏｌ）と無水ＴＨＦ（４ｍＬ）を加えた。１ＭＢＨ３－ＴＨＦ錯体溶液（０．１８ｍＬ、０．１７９５ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を１５．５時間還流した。反応を２ＮＨＣｌａｑで急冷し、懸濁液にクロラニル（１６．３ｍｇ、０．５６０４　ｍｍｏｌ）とＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）を加えた。得られた混合物を０．５時間撹拌し、ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ×３）で抽出した。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝９９／１）で予備精製し、蒸発させた。得られた残留物をメタノールに溶解し、Ｓｅｐ－Ｐａｋ　Ｃ１８　Ｐｌｕｓ　Ｓｈｏｒｔ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅで前処理し、ろ液を蒸発させた。Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＦＡ）、Ａ／Ｂ＝２０／８０（０分）　～０／１００（５０分）の線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＥＡＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＥＡＡ）、Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＦＡ）の条件下で、残留物を分取ＨＰＬＣによって精製した。化合物２－７は青色の固体（１２．４ｍｇ、３７％）として得られた。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD+KOD) δ 8.37 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.39 (t, J =7.1 Hz, 1H), 7.32-7.25 (m, 3H), 6.93 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 6.77 (m, 2H), 6.62(d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.49 (dd, J = 8.9, 2.3 Hz, 1H), 5.30 (s, 2H), 3.43 (q, J = 7.0 Hz, 4H), 3.06 (s, 6H), 1.19 (t, J = 7.0 Hz, 6H)
13C-NMR (100 MHz, CD3OD+KOD) δ 152.6, 150.7, 149.8, 147.0, 146.1, 139.8, 136.8, 130.6, 129.1,128.8, 126.5, 124.6, 123.6, 122.0, 121.5, 117.3, 116.6, 115.3, 112.1, 109.5, 107.2, 98.2, 86.0, 72.3,45.1, 40.6, 12.6
HRMS Calcd for C30H31N2O2 451.23800: (M+); Found: 451.23569.
　精製後のＨＰＬＣクロマトグラムを以下に示す。（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＦＡ。Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配。１．０　ｍＬ／ｍｉｎの流量。６０１ｎｍでの検出）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000023
［実施例１］
（１）化合物２－４及び２－７の吸収スペクトルの測定
　上記で化合物２－４及び２－７について閉環状態がmajorになるｐＨ１０のリン酸緩衝液中での吸収スペクトルを測定した。どちらの化合物もナフタレン骨格を組み込んだことにより閉環状態で３７０ｎｍ程度まで吸収を持つことが分かった（図６）。ここで、図６の構造式のＸは、一般式（Ｉ）のＹに対応する。
（２）Ｌａｓｅｒ　Ｆｌａｓｈ　Ｐｈｏｔｏｌｙｓｉｓ法を用いたτｓｐの評価
　化合物２－４及び２－７の開環状態の寿命τｓｐを評価した。τｓｐはＬａｓｅｒ　Ｆｌａｓｈ　Ｐｈｏｔｏｌｙｓｉｓ（ＬＦＰ）法での過渡吸収測定で評価を行った。具体的には、図７に示すように、まずプローブ溶液に対してＮｄ－ＹＡＧレーザーの３倍波（３５５ｎｍ）　パルス光（約０．５Ｗ／ｃｍ２）を照射する。パルスレーザー照射によって生成した開環状態は熱的に閉環状態へと変換されるため、一連の過程での開環状態の吸収極大波長での吸光度を測定すると、パルスレーザー照射直後に開環状態濃度が一過的に増加するため正の過渡吸収が観測され、時間経過とともに開環状態の濃度が減少するので過渡吸収はパルスレーザー照射直前の値近くに戻る。Ｔ型フォトクロミック特性を有する分子では時間経過とともに指数関数的に過渡吸収が減衰するので、この減衰に対して図７に記載の式をフィッティングすることでτｓｐを算出した。
　化合物２－４及び２－７のそれぞれの吸収極大波長５７０ｎｍ、６０１ｎｍでの過渡吸収変化をＬＦＰ法で測定した。観測された過渡吸収の減衰に対して指数関数ｆｉｔｔｉｎｇを行った結果、２－４と２－７のどちらもτｓｐは７ｍｓｅｃ前後であった。
　図８は、５０％ＭｅＯＨ及び１％未満のＤＭＳＯを含有する１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中で２０μＭの化合物２－４及び２－７の過渡吸収を測定した結果を示す。ここで、図８の構造式のＸは、一般式（Ｉ）のＹに対応する。
　期待通り、アンテナ骨格としてナフタレンを組み込むことでＨＭＳｉＲよりも長波長の３５５ｎｍでフォトクロミック特性を示すようになることが明らかになった。また、以下の検討では、より高い水溶性示すことを期待してアンテナ部位の官能基としてアミノ基を採用した。
（Ｂ）ｐＫ ｃｙｃｌｅ 調整部位の最適化
　上記で合成した化合物２－４はＴ型フォトクロミック特性を有することを見出したが、化合物２－４のｐＫｃｙｃｌｅは７．３であり７よりも若干高かった。そこで、ｐＫｃｙｃｌｅ調整部位の最適化の検討を行った。
　本発明者らは、まず、Ｓｉ－ローダミンとＯ－ローダミンを比較すると、前者は後者よりもキサンテン環のＬＵＭＯが低下しており、求電子性が高いためｐＫｃｙｃｌｅが小さくなる傾向があることに着目し、化合物２－４をベースにしてキサンテン環のＬＵＭＯを低下させることを検討した。ここで、ローダミンと類似した構造を持つベンズヒドロールカチオンではパラ位のＮ原子上の置換基をモルホリンに変更することで求電子性が上昇することが知られていることから、ｐＫｃｙｃｌｅ調整部位にモルホリンを導入した誘導体の合成を以下のように行った。
［合成実施例２］
　以下のスキームに則り、化合物２－２（ＨＭ－ＮＯｘａＲ）を合成した。
スキーム２
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000024
（１） 化合物２－９の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000025
　６－メトキシ－１－テトラロン２－８（２．０７１１ｇ、１１．７５ｍｍｏｌ）とギ酸エチル（３．２ｍＬ、３９．７ｍｍｏｌ）をＡｒ雰囲気下で無水トルエン　（１０ｍＬ）に溶解した。反応混合物にＮａＨ（パラフィン液分散５０％、１．６０１６ｇ、３３．４ｍｍｏｌ）を０℃で加え、室温で１７．５時間攪拌した。反応を１ＮＨＣｌａｑ（３０　ｍＬ）でクエンチし、混合物をＡｃＯＥｔ（２０ｍＬ＊３回）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、蒸発させて無色の油を得た。油を１，４－ジオキサン（５０ｍＬ）に溶解し、ＤＤＱ（２．１９２８ｇ、９．６６０ｍｍｏｌ）を反応混合物に加えた。得られた溶質を室温で５時間撹拌し、セライトでろ過した。ろ液を蒸発させ、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝８５／１５～５０／５０）で精製して、化合物２－９を無色の固体（２．１０３１ｇ、８９％）として得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.88 (s, 1H), 8.32 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.23 (d,J = 8.7 Hz, 1H), 7.16 (dd, J = 9.1, 2.3 Hz, 1H), 7.06 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 3.94 (s, 3H)
13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 195.8, 162.2, 161.7, 139.9, 127.7, 126.3, 119.2, 118.5, 118.4, 113.4,
106.4, 55.6
（２）化合物２－１０の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000026
　化合物２－９（１．９８５７ｇ、９．８２０ｍｍｏｌ）とＫ２ＣＯ３（２．０１６８ｇ、１４．７３ｍｍｏｌ）をＡｒ雰囲気下で無水アセトン（１５ｍＬ）に溶解した。この混合物にＭｅＩ（１．２ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を加え、得られた反応混合物を４．５時間還流した。反応混合物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝９０／１０～８０／２０）で直接精製し、化合物２－１０を無色の固体（１．８３１７ｇ、８６％）として得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.88 (s, 1H), 8.32 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.23 (d,J = 8.7 Hz, 1H), 7.16 (dd, J = 9.1, 2.3 Hz, 1H), 7.06 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 3.94 (s, 3H)
13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 195.8, 162.2, 161.7, 139.9, 127.7, 126.3, 119.2, 118.5, 118.4, 113.4,106.4, 55.6
（３）化合物２－１１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000027
　１－ブロモ－２，４－ジメトキシベンゼン（０．５１ｍＬ、３．５ｍｍｏｌ）をＡｒ雰囲気下で無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解した。混合物を－７８℃に冷却した後、同じ温度でｎ－ＢｕＬｉ（１．５８Ｍ、１．８ｍＬ、２．８ｍｍｏｌ）を滴下し、混合物を３０分間攪拌した。反応混合物２－１０（５０６．７ｍｇ、２．３４３ｍｍｏｌ）に無水ＴＨＦ（５ｍＬ）を－７８°Ｃで滴下し、室温で４時間攪拌した。反応を１ＮＨＣｌａｑ（３０ｍＬ）でクエンチし、混合物をＤＣＭ（１５ｍＬ×４回）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝８０／２０～６０／４０）で精製し、化合物２－１１を無色の固体（７１４．８ｍｇ、８６％）として得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.99 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.50 (s, 1H), 7.48 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.17-7.13 (m, 2H), 7.04 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.53 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 6.48 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.40 (dd, J =8.2, 2.3 Hz, 1H), 3.91 (s, 3H), 3.87 (s, 3H), 3.82 (s, 3H), 3.77 (s, 3H), 3.15 (d, J = 4.1 Hz, 1H)
13C-NMR (101 MHz, CDCl3) δ 160.4, 158.0, 157.9, 153.4, 136.0, 129.0, 128.6, 126.4, 124.4, 124.1,123.2, 123.1, 118.7, 106.1, 104.0, 98.8, 66.4, 62.6, 55.5, 55.4, 55.4
HRMS Calcd for C21H21O4: 337.14344 (M-OH+); Found: 337.14224
（４）化合物２－１２の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000028
　化合物２－１１（１８０．５ｍｇ、０．５０９３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解した。反応混合物にＭｎＯ２（８９２ｍｇ、１０．１９ｍｍｏｌ）を加え、懸濁液を室温で１８時間撹拌した。懸濁液をセライトでろ過し、ろ液を蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝８０／２０～５０／５０）で精製し、化合物２－１２を無色の固体（７１４．８ｍｇ、８６％）として得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.11 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.49 (d, J = 8.7Hz, 1H), 7.46 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.16 (dd, J = 9.1, 2.3 Hz, 1H), 7.12 (d, J = 2.3Hz, 1H), 6.51 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H), 6.46 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 3.93 (s, 3H), 3.86 (s, 3H), 3.78 (s,3H), 3.64 (s, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 194.6, 164.2, 160.9, 159.2, 156.2, 137.8, 133.5, 127.4, 125.2, 123.2,122.6, 122.0, 119.0, 106.0, 104.6, 98.7, 63.7, 55.8, 55.6, 55.5
HRMS Calcd for C21H21O5: 353.13835 ([M+H]+); Found: 353.13888.
（５）化合物２－１３の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000029
　化合物２－１２（１３５．８ｍｇ、０．３８５４ｍｍｏｌ）と塩化ピリジニウム（１．４８６９ｇ、１２．８７ｍｍｏｌ）を１８０℃で２０時間撹拌した。混合物を冷却し、Ｈ２Ｏを加えた。懸濁液をろ過し、化合物２－１３を淡褐色の固体（９９．５ｍｇ、９３％）として得た。
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.92 (s, 1H), 10.42 (s, 1H), 8.44 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.00 (d, J =8.7 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.26-7.23 (m, 2H), 7.04 (d, J = 2.3 Hz,1H), 6.90 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H)
13C-NMR (101 MHz, DMSO- d6) δ 174.9, 163.9, 159.4, 157.6, 153.7, 138.7, 128.1, 125.1, 123.1,121.8, 119.7, 117.4, 115.1, 115.0, 114.9, 110.5, 103.0
HRMS Calcd for C17H9O4: 277.05063 ([M-H]-); Found: 277.05077.
（６）化合物２－１４の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000030
　化合物２－１３（１５２．０ｍｇ、０．５４６３ｍｍｏｌ）とピリジン（０．５３　ｍＬ、６．５５６ｍｍｏｌ）をＡｒ雰囲気下で無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解した。反応混合物にＴｆ２Ｏ（０．３６ｍＬ、２．１８５ｍｍｏｌ）を０℃で加え、得られた混合物を室温で１５時間撹拌した。反応を１ＮＨＣｌａｑ（２０ｍＬ）　でクエンチし、混合物をＤＣＭ（１５ｍＬ＊３回）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝９０／１０～０／１００）で精製し、化合物２－１４を無色の固体（２７２．７ｍｇ、９２％）として得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.78 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 8.52 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.37 (d, J = 8.7 Hz,1H), 7.88 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.83 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.69 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.62 (dd, J = 9.1, 2.3Hz, 1H), 7.40 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H)
HRMS Calcd for C19H9F6O8S2: 542.96375 ([M+H]+); Found: 542.96035.
（７）化合物２－１５の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000031
　化合物２－１４（１１６．０ｍｇ、０．２１７９ｍｍｏｌ）、Ｐｄ２（ｄｂａ）３　（２８．９ｍｇ、０．０２１８ｍｍｏｌ）、キサントホス（４１．２ｍｇ、０．６５４ｍｍｏｌ）及びＣｓ２ＣＯ３（３６４．５ｍｇ、１．０９０ｍｍｏｌ）をＡｒ雰囲気下で無水トルエン（５ｍＬ）に溶解した。この混合物にベンゾフェノンイミン（０．１５ｍＬ、０．８７ｍｍｏｌ）を加え、得られた反応混合物を１９時間還流した。Ｈ２Ｏ（２０ｍＬ）を混合物に加え、懸濁液をＡｃＯＥｔ（１５ｍＬ×３回）とＡｃＯＥｔ（１５ｍＬ×４回）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、蒸発させた。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（アミノシリカゲル、ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝９０／１０～５０／５０）で精製し、化合物２－１５を黄色の固体（７０．０ｍｇ、０．１１６ｍｍｏｌ、５３％）として得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.38 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 8.13 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.80-7.76 (m, 4H),7.53-7.40 (m, 8H), 7.26-7.14 (m, 10H), 7.08-7.05 (m, 1H), 6.93 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.73 (dd, J = 8.2,1.8 Hz, 1H)
13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 176.3, 169.5, 169.4, 157.5, 156.5, 153.8, 152.6, 139.2, 138.8, 137.4,135.8, 135.4, 131.5, 131.3, 130.2, 129.7, 129.6, 129.5, 129.4, 129.1, 128.4, 128.3, 128.2, 127.2, 123.6,123.5, 122.1, 122.0, 120.2, 118.2, 118.0, 117.8, 116.8, 108.5
HRMS Calcd for C43H29N2O2S: 605.22235 ([M+H]+); Found: 605.22608.
（８）化合物２－１６の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000032
　化合物２－１４（２５０．０ｍｇ、０．４６９６ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＳＯ（４　ｍＬ）に７０℃で溶解し、混合物にモルホリン（０．２０ｍＬ、２．３４８ｍｍｏｌ）を加え、得られた反応混合物を７０℃で３時間撹拌した。反応をＨ２Ｏ（３０　ｍＬ）でクエンチし、得られた沈殿をろ過で集めた。沈殿をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～８５／１５）で精製し、化合物２－１６を淡黄色の固体（１８６．４ｍｇ、８３％）として得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.72 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 8.37 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.23 (d, J = 9.1 Hz,1H), 7.82 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.54 (dd, J = 9.1, 2.3 Hz, 1H), 6.99 (dd, J = 9.1,2.3 Hz, 1H), 6.92 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 3.91 (m, 4H), 3.43 (m, 4H)
HRMS Calcd for C22H17F3NO6S: 480.07232 ([M+H]+); Found: 480.06900.
（９）化合物２－１７の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000033
　化合物２－１６（１７８．９ｍｇ、０．３７３２ｍｍｏｌ）、Ｐｄ２（ｄｂａ）３（７７．０ｍｇ、０．０３７３ｍｍｏｌ）、キサントホス（３８．７ｍｇ、０．１１２ｍｍｏｌ）及びＣｓ２ＣＯ３（１．２７４４ｇ、３．９１１４ｍｍｏｌ）をＡｒ雰囲気下で無水１，４－ジオキサン（１０ｍＬ）に溶解した。この混合物にベンゾフェノンイミン（０．６３ｍＬ、３．７ｍｍｏｌ）を加え、得られた反応混合物を１７時間還流した。Ｈ２Ｏ（２０ｍＬ）を混合物に加え、懸濁液をＡｃＯＥｔ（１５ｍＬ×３回）とＤＣＭ（２０ｍＬ×４回）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（アミノシリカゲル、ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝９０／１０～６０／４０）で精製し、化合物２－１７を無色の油（１８５．２ｍｇ、０．３６２７ｍｍｏｌ、９７％）として得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.41 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 8.22 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.16 (d, J = 8.7 Hz,1H), 7.80 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.60-7.40 (m, 5H), 7.25-7.15 (m, 5H), 7.07 (dd, J = 8.7, 1.8 Hz, 1H),6.95 (dd, J = 9.1, 2.3 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 3.89 (t, J = 5.0 Hz, 4H), 3.39 (t, J = 5.0 Hz,4H),
13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 175.9, 169.4, 157.8, 155.5, 153.7, 152.3, 139.3, 137.3, 135.8, 132.5,131.2, 130.2, 129.6, 129.5, 129.1, 128.4, 128.2, 127.8, 123.4, 123.3, 122.1, 122.1, 120.3, 117.8, 116.9,114.6, 112.1, 100.2, 66.6, 47.6
HRMS Calcd for C34H27N2O3: 511.20162 ([M+H]+); Found: 511.20294
（１０）化合物２－１９の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000034
　Ａｒでフラッシュしたフラスコに、化合物２－１８（６５．４ｍｇ、０．３５０ｍｍｏｌ）と無水ＴＨＦ（４ｍＬ）を加えた。混合物を－７８℃に冷却し、１．５６Ｍのｎ－ＢｕＬｉ（０．４５ｍＬ、０．７０ｍｍｏｌ）を加えた。さらに無水ＴＨＦ（１．５ｍＬ）中のキサントン２－１５（４．８ｍｇ、０．００７９ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で１時間撹拌した後、反応を２ＮＨＣｌａｑでクエンチし、蒸発させた。得られた残留物をメタノールに溶解し、Ｓｅｐ－Ｐａｋ　Ｃ１８　Ｐｌｕｓ　Ｓｈｏｒｔ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅで前処理し、ろ液を蒸発させた。Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＦＡ）、Ａ／Ｂ＝２０／８０（０分）　～０／１００（５０分）の線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％　ＴＥＡＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＥＡＡ）、Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％　ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％　ＴＦＡ）の条件下で、残留物を分取ＨＰＬＣによって精製した。化合物２－１９を青色固体（３．０ｍｇ、０．００６２ｍｍｏｌ、７９％）として得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD+KOD) δ 8.21 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.36 (t, J =7.8 Hz, 1H), 7.23 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.14 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.75-6.64 (m,5H), 6.45 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 5.26 (s, 2H)
HRMS Calcd for C24H19N2O2: 367.14410: (M+); Found: 367.14372.
　精製後のＨＰＬＣクロマトグラムを以下に示す。（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％　ＴＦＡ。Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配。１．０ｍＬ／ｍｉｎの流量。５３４ｎｍでの検出）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000035
（１１）化合物２－２０の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000036
　Ａｒでフラッシュしたフラスコに、化合物２－１８（８７．１ｍｇ、０．４６５７ｍｍｏｌ）と無水ＴＨＦ（６ｍＬ）を加えた。混合物を－７８℃に冷却し、１．５６Ｍのｎ－ＢｕＬｉ（０．６０ｍＬ、０．９３ｍｍｏｌ）を加えた。さらに無水ＴＨＦ（２ｍＬ）中のキサントン２－１７（９．７ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で１時間撹拌し、反応を２ＮＨＣｌａｑでクエンチし、蒸発させた。得られた残渣をメタノールに溶解し、Ｓｅｐ－Ｐａｋ　Ｃ１８　Ｐｌｕｓ　Ｓｈｏｒｔ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅで前処理し、ろ液を蒸発させた。Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＦＡ）、Ａ／Ｂ＝２０／８０（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＥＡＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＥＡＡ）、Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＦＡ）の条件下で、残渣を分取ＨＰＬＣによって精製した。化合物２－２０を青色固体（７．４ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ、７１％）とし得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD+KOD) δ 8.27 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.36 (t, J =7.3 Hz, 1H), 7.23 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.16 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.08 (d, J = 9.1, 2.3 Hz, 1H), 6.92 (d, J= 2.3 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.83 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.76 (m, 2H), 6.71 (dd, J = 8.7, 2.3Hz, 1H), 5.30 (s, 2H), 3.81 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 3.18 (t, J = 4.8 Hz, 4H)
13C NMR (100 MHz, CD3OD+KOD): δ 152.4, 151.0, 147.1, 145.9, 145.1, 138.7, 136.0, 129.5, 128.1,127.9, 125.4, 123.5, 122.7, 120.8, 120.6, 118.0, 117.0, 115.5, 114.2, 111.8, 108.1, 101.5, 84.6, 71.7,66.5, 48.7
HRMS Calcd for C28H25N2O3: 437.18597 (M+); Found: 437.18542.
　精製後のＨＰＬＣクロマトグラムを以下に示す。（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＦＡ。Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配。１．０　ｍＬ／ｍｉｎの流量。５６７ｎｍでの検出）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000037
［実施例２］
（１）ｐＫｃｙｃｌｅの評価
　ｐＫｃｙｃｌｅ調整部位が無置換もしくはモルホリンを導入した化合物２－１９と化合物２－２０のｐＫｃｙｃｌｅを評価した。無置換の２－１９のｐＫｃｙｃｌｅはＥｔ基を導入した化合物２－４と比較して０．５低下して、ｐＨ７．５での開環状態の割合も１５％程度まで低下していた。モルホリンの導入した化合物２－２０ではＥｔ基を導入した化合物２－１９と比較して期待通りｐＫｃｙｃｌｅが１．５低下しており、ｐＨ７．５での開環状態の割合も１％程度になることが分かった。
　図９ａは、０．１％ＤＭＳＯを含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中での吸収スペクトルとｐＫｃｙｃｌｅを示す。ここで、図９ａの構造式のＲは、一般式（Ｉ）のＲ５、Ｒ６に対応する。
　また、図９ｂは、１００ｍＭリン酸緩衝液中での化合物２－２０の吸収スペクトルと蛍光スペクトル（Ｅｘ．５２０ｎｍ）、５６７ｎｍでの吸収とｐＨとの関係を示す。　
（２）過渡吸収測定
　続いて、化合物２－１９及び２－２０に対して過渡吸収測定を行ったところ、化合物２－１９と２－２０の両方で過渡吸収の指数関数的減衰が観測された。図１０は、５０％ＭｅＯＨ及び１％未満のＤＭＳＯを含有する１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中で２０μＭの化合物２－２０等の過渡吸収を測定した結果を示す。ここで、図１０の構造式のＲは、一般式（Ｉ）のＲ５、Ｒ６に対応する。
　以上からｐＫｃｙｃｌｅ調整部位にモルホリンを導入した蛍光団は３５５ｎｍでのフォトクロミック特性と適切な求電子性を兼ね備えていることが分かった。
　この蛍光団を有するローダミンをＮａｐｈｔｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－１，４－Ｏｘａｚｎｙｌ　Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ＮＯｘａＲ）と命名し、以降の検討で採用した。また、ベンゼン環部位２位にＨＭ基を有するＨＭ－ＮＯｘａＲ２－２０をｍｓｅｃオーダーのτｓｐを有するプローブとして採用した。
（Ｃ）τ ｓｐ の時間範囲の拡張の検討
　次にτｓｐの時間範囲（time range）の拡張を検討した。求核基がＨＭ基であるときスピロ環化で形成される環の大きさは５員環になる。環化反応の性質の経験則であるＢｏｌｄｗｉｎ則によると一般的に環化反応の速度は５員環＞６員環＞７員環の順に遅くなる。そこで、環拡大によるτｓｐの長寿命化について検討した。メチレン鎖を伸ばすことで閉環状態で形成される環を（ｎ＋４）員環まで拡大することができる。求核基としてヒドロキシエチル基（以下ＨＥ基と記述）およびヒドロキシプロピル基（以下ＨＰ基と記述）を導入したＨＥ－ＮＯｘａＲ（化合物２－２２）及びＨＰ－ＮＯｘａＲ（化合物２－２４）を以下の通り合成した。
［合成実施例３］
化合物２－２２の合成
　以下のスキームに則り、化合物２－２２を合成した。
スキーム３
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000038
　Ａｒでフラッシュしたフラスコに、化合物２－２１（４０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）と無水ＴＨＦ（３ｍＬ）を加えた。混合物を－７８℃に冷却し、１．５６Ｍのｎ－ＢｕＬｉ（０．２６ｍＬ、０．４０ｍｍｏｌ）を加えた。さらに無水ＴＨＦ（２ｍＬ）　中のキサントン２－１７（４．７ｍｇ、０．００９２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で１時間撹拌し、反応を２ＮＨＣｌａｑでクエンチし、蒸発させた。得られた残渣をメタノールに溶解し、Ｓｅｐ－Ｐａｋ　Ｃ１８　Ｐｌｕｓ　Ｓｈｏｒｔ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅで前処理し、ろ液を蒸発させた。Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）～０／１００（５０分）線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＦＡ）、Ａ／Ｂ＝２０／８０（０分）～０／１００（５０分）線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＥＡＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＥＡＡ）、Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）～０／１００（５０分）線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ）の条件で、残渣を分取ＨＰＬＣで精製した。溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＦＡ）。化合物２－２２を青色固体（２．４ｍｇ、０．００４３ｍｍｏｌ、４６％）として得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD+KOD) δ 8.29 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.22 (td, J =7.3, 1.3 Hz, 1H), 7.14 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.10-7.03 (m, 2H), 6.95 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 2.3Hz, 1H), 6.80 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 6.74 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.70-6.68 (m, 2H), 6.70-6.66 (m, 2H),4.00-3.86 (m, 2H), 3.81 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 3.23-3.14 (m, 4H), 3.07 (qd, J = 8.2, 5.1 Hz, 1H), 2.95 (dt,J = 16.5, 4.6 Hz, 1H)
13C-NMR (100 MHz, CD3OD+KOD) δ 152.3, 152.1, 147.2, 146.9, 139.1, 135.9, 135.5, 130.4, 129.7,127.9, 126.7, 126.5, 126.0, 122.7, 120.0, 118.1, 117.3, 117.0, 116.0, 110.6, 108.0, 102.0, 74.1, 66.5,59.3, 48.8, 28.9
HRMS Calcd for C29H27N2O3: 451.20162 (M+); Found: 451.20213.
　精製後のＨＰＬＣクロマトグラムを以下に示す。（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＦＡ。Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配。１．０ｍＬ／ｍｉｎの流量。５６７ｎｍでの検出）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000039
［参考合成実施例１］
化合物２－２４の合成
　以下のスキームに則り、化合物２－２４を合成した。
スキーム４
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000040
　Ａｒでフラッシュしたフラスコに、化合物２－２３（１１４．０ｍｇ、０．５３００ｍｍｏｌ）と無水ＴＨＦ（５ｍＬ）を加えた。混合物を－７８℃に冷却した後、１．５６Ｍのｎ－ＢｕＬｉ（０．６８ｍＬ、１．１ｍｍｏｌ）を溶液に加えた。さらに無水ＴＨＦ（２ｍＬ）中のキサントン２－１７（９．６ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で１時間撹拌し、反応を２ＮＨＣｌａｑでクエンチし、蒸発させた。得られた残渣をメタノールに溶解し、Ｓｅｐ－Ｐａｋ　Ｃ１８　Ｐｌｕｓ　Ｓｈｏｒｔ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅで前処理し、ろ液を蒸発させた。Ａ／Ｂ＝７０／３０　（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％　ＴＦＡ）、Ａ／Ｂ＝２０／８０　（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＥＡＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％　ＴＥＡＡ）、Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＦＡ）の条件下で、残渣を分取ＨＰＬＣによって精製した。化合物２－２４を青色の固体（４．０ｍｇ、３７％）として得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.62 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.64-7.58 (m, 2H), 7.51-7.44 (m, 2H), 7.41-7.34 (m, 2H), 7.28 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.24-7.09 (m, 2H), 7.01 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.96 (d, J = 1.8Hz, 1H), 3.84 (m, 8H), 3.53 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.66-2.62 (m, 2H), 2.44-2.40 (m, 2H), 1.83-1.76 (m,2H), 1.58-1.52 (m, 2H)
HRMS Calcd for C30H29N2O3: 465.21727 (M+); Found: 465.21857.
　精製後のＨＰＬＣクロマトグラムを以下に示す。（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＦＡ。Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配。１．０ｍＬ／ｍｉｎの流量。５６７　ｎｍでの検出）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000041
［実施例３］
（１）ｐＫｃｙｃｌの評価
　ＨＥ－ＮＯｘａＲ（化合物２－２２）及びＨＰ－ＮＯｘａＲ（化合物２－２４）のｐＫｃｙｃｌを算出したところ、ＨＥ－ＮＯｘａＲはＨＭＮＯｘａＲ（化合物２－２０）と比較してｐＫｃｙｃｌが約１上昇しており、ｐＨ７．５では約８０％が閉環状態になった（図１１）。一方で、スピロ環部分を７員環まで拡大したＨＰ－ＮＯｘａＲ　（化合物２－２４）ではｐＫｃｙｃｌが１１．３まで上昇しており、ｐＨ７．５でほぼすべてが開環状態になった。
　図１１は、０．１％ＤＭＳＯを含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中での化合物２－２０、２－２２及び２－２４の吸収スペクトルを示す。
　図１２は、１００ｍＭリン酸緩衝液中での化合物２－２２の吸収スペクトルと蛍光スペクトル（Ｅｘ．５２０ｎｍ）、５６７ｎｍでの吸収とｐＨとの関係を示す。
（２）過渡吸収測定
　続いて、ＨＥ－ＮＯｘａＲ（化合物２－２２）及びＨＰ－ＮＯｘａＲ（化合物２－２４）に対して過渡吸収測定を行ったところ、ＨＥ－ＮＯｘａＲでは過渡吸収の指数関数的減衰が観測されたがＨＰ－ＮＯｘａＲでは観測されなかった。スピロ環部分を６員環まで拡大したＨＥ－ＮＯｘａＲでは、期待通り開環状態が長寿命化しｓｅｃオーダーの減衰が観測された。一方で、ＨＰ－ＮＯｘａＲはｐＨ７．４でほとんどが開環状態になるため、過渡吸収の指数関数的減衰は観測されず、代わりに３５５ｎｍパルスレーザー照射直後に劇的な過渡吸収の減少が観測された。これは、３５５ｎｍパルスレーザーによって開環状態の光褪色することで開環状態濃度が低下したためだと考えられる。以上からスピロ環部分の拡大により期待通りτｓｐの時間範囲をｓｅｃオーダーまで拡大することに成功した。
　図１３は、５０％ＭｅＯＨ及び１％未満のＤＭＳＯを含有する１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中で２０μＭの化合物２－２０、２－２２及び２－２４の過渡吸収を測定した結果を示す。
［実施例４］
３０ｗ／ｖ％ＢＳＡ溶液中での検討
　ここまでｍｓｅｃ、ｓｅｃオーダーのτｓｐを有するＨＭ－ＮＯｘａＲ（化合物２－２０）、ＨＥ－ＮＯｘａＲ（化合物２－２２）を開発し、水溶液中で機能することを示した。次に、細胞内環境に似た条件で開発したプローブが機能するか検討した。ｐＨ７．２の３０ｗ／ｖ％ＢＳＡ溶液に対して各プローブを２０μＭ溶解させて過渡吸収測定を行った。ＨＭ－ＮＯｘａＲとＨＥ－ＮＯｘａＲの両方でＢＳＡ溶液中でも過渡吸収の減衰が観測された。過渡吸収減衰のフィッティングから算出したτｓｐは希釈溶液中と同程度の値を示した。
　図１４は、１％未満のＤＭＳＯを含有する３０ｗ／ｖ％ＢＳＡ溶液中での２０μＭの化合物２－２０及び２－２２の過渡吸収の測定結果である。
　以上から、開発したプローブは細胞内でも機能することを強く示唆された。
（Ｄ）ベンゼン環部位３位への置換基導入によるｐＫ ｃｙｃｌ の調整
　次に、ベンゼン環部位３位へ置換基を導入することによりｐＫｃｙｃｌを更に減少させる検討を行った。ベンゼン環部位３位にＣｌ基とアジ化メチル基を導入した３－ＣｌＨＥ－ＮＯｘａＲ（化合物２－２７）及び３－Ｎ３ＭｅＨＥ－ＮＯｘａＲ（化合物２－３３）を以下の通り合成した。
［合成実施例４］
化合物２－２７（３－ＣｌＨＥ－ＮＯｘａＲ）の合成
　以下のスキームに則り、化合物２－２７を合成した。
スキーム５
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000042
（１） 化合物２－２６の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000043
　Ａｒでフラッシュしたフラスコに、１－ブロモ－３－クロロ－２－ヨードベンゼン２－２５（３２４．０ｍｇ、１．０２１ｍｍｏｌ）と無水トルエン（１０ｍＬ）　を加えた。混合物を－７８℃に冷却した後、１．５６Ｍのｎ－ＢｕＬｉ（０．６５　ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ）を溶液に滴下し、得られた混合物を１時間撹拌した。さらにエチレンオキシド（１．０Ｍ ＴＨＦ溶液、１．０ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を－７８℃で５分間撹拌し、ＢＦ３－ＯＥｔ２（０．１３ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ）を混合物に加えた。得られた混合物を－７８℃で５分間撹拌し、反応を飽和ＮａＨＣＯ３ａｑ（１ｍＬ）でクエンチした。懸濁液に２ＮＨＣｌａｑ　（２０ｍＬ）を加え、懸濁液をＡｃＯＥｔ（１５ｍＬ×３回）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（アミノシリカゲル、ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝９０／１０～７５／２５）で精製し、化合物２－２６を無色の油（１６３．７ｍｇ、０．６９５１ｍｍｏｌ、６８％）として得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.46 (dd, J = 8.0, 1.1 Hz, 1H), 7.32 (dd, J = 8.0, 1.1 Hz, 1H), 7.01 (t, J= 8.0 Hz, 1H), 3.86 (dd, J = 7.3, 5.5 Hz, 2H), 3.28 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.52 (t, J = 5.5 Hz, 1H)
13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 135.8, 135.7, 131.7, 129.0, 128.7, 126.2, 61.1, 37.3
（２） 化合物２－２７の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000044
　Ａｒでフラッシュしたフラスコに、化合物２－２６（７８．１ｍｇ、０．３３１６ｍｍｏｌ）と無水ＴＨＦ（６ｍＬ）を加えた。混合物を－７８℃に冷却した後、１．５６Ｍのｎ－ＢｕＬｉ（０．４０ｍＬ、０．６３ｍｍｏｌ）を溶液に加えた。さらに無水ＴＨＦ（２ｍＬ）中のキサントン２－１７（１１．９ｍｇ、０．０２３３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で１時間撹拌し、反応を２ＮＨＣｌａｑでクエンチし、蒸発させた。得られた残渣をメタノールに溶解し、Ｓｅｐ－Ｐａｋ　Ｃ１８　Ｐｌｕｓ　Ｓｈｏｒｔ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅで前処理し、ろ液を蒸発させた。Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）～０／１００（５０分）線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＦＡ）、Ａ／Ｂ＝２０／８０（０分）～０／１００（５０分）線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＥＡＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％　ＴＥＡＡ）、Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）～０／１００（５０分）線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ）の条件で、残留物を分取ＨＰＬＣで精製した。溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＦＡ）。化合物２－２７は青色の固体（２．５　ｍｇ、１８％）として得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD+KOD) δ 8.29 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.14 (d, J =9.1 Hz, 1H), 7.09 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H), 7.04 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 6.94 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.92 (d,J = 1.8 Hz, 1H), 6.77 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.68 (m, 3H), 3.99-3.87 (m, 2H), 3.81-3.790 (m, 4H), 3.19-3.16 (m, 4H), 3.02 (t, J = 5.9 Hz, 2H)
HRMS Calcd for C29H26ClN2O3: 485.16265, 487.15970 (M+); Found: 485.15962, 487.16470.
　精製後のＨＰＬＣクロマトグラムを以下に示す。（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＦＡ。Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配。１．０ｍＬ／ｍｉｎの流量。５７３ｎｍでの検出）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000045
［合成実施例５］
化合物２－３３（３－Ｎ３ＭｅＨＥ－ＮＯｘａＲ）の合成
　以下のスキームに則り、化合物２－３３を合成した。
スキーム６
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000046
（１）化合物２－２９の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000047
　Ａｒでフラッシュしたフラスコにジイソプロピルアミン（１．５４ｍＬ、１１．０ｍｍｏｌ）と無水ＴＨＦ（５０ｍＬ）を加えた。混合物を－７８℃に冷却した後、１．５６Ｍのｎ－ＢｕＬｉ（７．０ｍＬ、１０．９ｍｍｏｌ）を溶液に加えた。混合物を－７８℃で０．５時間撹拌し、３－ブロモ－２－メチル安息香酸２－２８（１．０１５０ｇ、４．７２０ｍｍｏｌ）を混合物に加えた。混合物を－７８℃で１時間撹拌し、クロロギ酸エチル（１．７ｍＬ、１８ｍｍｏｌ）を混合物に滴下した。得られた反応混合物を－７８℃で０．５時間撹拌した後、室温で１時間撹拌した。反応を２ＮＨＣｌａｑ（２０ｍＬ）でクエンチし、混合物をＡｃＯＥｔ（１５ｍＬ×３回）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝９５／５～６０／４０）で精製し、化合物２－２９を無色の固体（６１２．３ｍｇ、２．１３３ｍｍｏｌ、４５％）として得た。
（２）化合物２－３０の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000048
　Ａｒでフラッシュしたフラスコに、化合物２－２９（３２１．７ｍｇ、１．１２０ｍｍｏｌ）と無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）を加えた。１Ｍ ＢＨ３－ＴＨＦ錯体溶液（４．４ｍＬ、４．４ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を２１時間還流した。反応を０．２　ＭＨＣｌａｑ（２０ｍＬ）でクエンチし、混合物をＡｃＯＥｔ（１５ｍＬ×３回）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝５０／５０～８０／２０）で精製し、化合物２－３０を無色の固体（１２８．８ｍｇ、５０％）として得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.54 (d, J = 7.8, 1H), 7.27 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.08 (t, J = 7.8 Hz, 1H),4.62 (s, 2H), 3.96 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.13 (t, J = 5.7 Hz, 2H)
13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 142.0, 137.1, 133.2, 129.5, 128.4, 125.9, 63.9, 60.9, 34.8
（３）化合物２－３１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000049
　化合物２－３０（１２３．４ｍｇ、０．５３４０ｍｍｏｌ）、ＴＢＳＣｌ（２５２．１　ｍｇ、１．３３５ｍｍｏｌ）およびイミダゾール（１０９．０ｍｇ、１．６０２ｍｍｏｌ）をＡｒ雰囲気下で無水ＴＨＦ（４ｍＬ）に溶解した。得られた反応混合物を室温で１４時間撹拌した。反応を０．２ＭＨＣｌａｑ（２０ｍＬ）でクエンチし、混合物をＤＣＭ（１５ｍＬ×３回）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝９５／５～９０／１０）で精製し、化合物２－３１を無色の油（１７６．０ｍｇ、７２％）として得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.44 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.40 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.06 (t, J = 7.8 Hz,1H), 4.80 (s, 2H), 3.78 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.99 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 0.93 (s, 9H), 0.84 (s, 9H), 0.10 (s,6H), -0.03 (s, 6H)
13C-NMR (101 MHz, CDCl3) δ 142.5, 135.1, 131.6, 127.8, 126.1, 125.6, 63.5, 62.0, 35.1, 26.0, 18.5,18.4, -5.2, -5.3
（４）化合物２－３２の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000050
　Ａｒでフラッシュしたフラスコに、化合物２－３１（１７１．３ｍｇ、０．３７２７ｍｍｏｌ）と無水ＴＨＦ（６ｍＬ）を加えた。混合物を－７８℃に冷却した後、１．５６Ｍのｎ－ＢｕＬｉ（０．２４ｍＬ、０．３７２７ｍｍｏｌ）を溶液に加え、－７８℃で０．５時間攪拌した。さらに無水ＴＨＦ（４ｍＬ）中のキサントン２－１７（１１．３ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で１時間撹拌した後、反応を２ＮＨＣｌａｑでクエンチし、蒸発させた。得られた残渣をメタノールに溶解し、Ｓｅｐ－Ｐａｋ　Ｃ１８　Ｐｌｕｓ　Ｓｈｏｒｔ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅで前処理し、ろ液を蒸発させた。Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＦＡ）、Ａ／Ｂ＝２０／８０（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＥＡＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＥＡＡ）、Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＦＡ）の条件下で、残渣を分取ＨＰＬＣによって精製した。化合物２－３２を青色固体（１１．２ｍｇ、８５％）として得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD+KOD) δ 8.29 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.33 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 7.12 (d, J =8.7 Hz, 1H), 7.10-7.04 (m, 2H), 6.94 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 8.7 Hz,1H), 6.74 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.68-6.64 (m, 2H), 4.74 (s, 2H), 3.99-3.89 (m, 2H), 3.82-3.80 (m, 4H),3.19-3.17 (m, 4H), 3.05-3.00 (m, 2H)
13C-NMR (100 MHz, CD3OD+KOD) δ 152.3, 152.1, 147.1, 146.9, 139.2, 138.1, 135.9, 133.9, 130.6, 129.2, 126.6, 126.2, 125.5, 122.7, 120.0, 118.1, 117.3, 117.1, 116.2, 110.6, 108.0, 102.0, 74.2, 66.5,61.7, 58.8, 48.8, 25.2
（５）化合物２－３３の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000051
　化合物２－３２（８．９ｍｇ、０．０１５０２ｍｍｏｌ）をＭｅＣＮに溶解し、トルエン（２ｍＬ×３回）と共沸させた。続いて化合物２－３２をＡｒ雰囲気下でＤＢＵ１ｍＬに溶解し、Ｏ－ベンジルエタノールアミン（１滴）を添加した。反応混合物にＤＰＰＡ（０．０３ｍＬ、０．１５０２ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を室温で２２時間撹拌した。反応をＨ２Ｏ１０ｍＬでクエンチし、懸濁液にＡｃＯＥｔ（１０　ｍＬ）を加えた。有機層をＨ２Ｏ（１０ｍＬ×５回）で洗浄し、蒸発させた。得られた残渣をメタノールに溶解し、Ｓｅｐ－Ｐａｋ　Ｃ１８　Ｐｌｕｓ　Ｓｈｏｒｔ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅで前処理し、ろ液を蒸発させた。Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＦＡ）、Ａ／Ｂ＝２０／８０（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＥＡＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＥＡＡ）、Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＦＡ）の条件下で、残渣を分取ＨＰＬＣによって精製した。化合物２－３３を青色の固体（４．７ｍｇ、５１％）として得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD+KOD) δ 8.65 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.70 (dd, J = 7.8, 1.4 Hz, 1H), 7.56 (t,J = 7.8 Hz, 1H), 7.50 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.46 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.41 (dd, J = 9.6, 2.3 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.31 (dd, J = 7.8, 1.4 Hz, 1H), 7.21 (dd, J = 9.1, 2.3 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 9.1 Hz,1H), 6.97 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 4.66 (s, 2H), 3.86-3.83 (m, 8H), 3.35-3.31 (m, 2H), 2.73-2.63 (m, 2H)
13C-NMR (100 MHz, CD3OD+KOD) δ 159.1, 158.3, 157.6, 156.0, 155.4, 141.4, 136.3, 136.1, 133.7,131.9, 131.2, 129.6, 127.1, 126.7, 126.3, 123.2, 118.6, 116.7, 116.5, 116.4, 113.0, 108.1, 97.1, 66.1,61.4, 52.0, 46.6, 33.3
HRMS Calcd for C30H28N5O3: 506.21867 (M+); Found: 506.22213.
　精製後のＨＰＬＣクロマトグラムを以下に示す。（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％　ＴＦＡ。Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配。１．０　ｍＬ／ｍｉｎの流量。５７１ｎｍでの検出）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000052
［実施例５］
　ベンゼン環部位３位にＣｌ基およびアジ化メチル基の導入した３－ＣｌＨＥ－ＮＯｘａＲ（化合物２－２７）及び３－Ｎ３ＭｅＨＥ－ＮＯｘａＲ（化合物２－３３）のｐＫｃｙｃｌを評価したところ期待通り両方の誘導体でｐＫｃｙｃｌが低下して５．５となり、ｐＨ７．５での開環状態の割合が１％以下まで低下した。
　続いて、過渡吸収測定を行ったところ３－ＣｌＨＥ－ＮＯｘａＲ及び３－Ｎ３ＭｅＨＥ－ＮＯｘａＲの両方で過渡吸収の指数関数的減衰が観測された。それぞれの減衰から算出されたτｓｐはＨＥ－ＮＯｘａＲ（化合物２－２２）と同程度であった。
　図１５ａは、０．１％ＤＭＳＯを含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中での１μＭの化合物２－２２、２－２７及び２－３３の吸収スペクトルを示す。ここで、図１５ａの構造式のＸは、一般式（Ｉ）のＲ１に対応する。
　以上から、ベンゼン環部位３位への置換基導入はＨＥ－ＮＯｘａＲ　２－２２　でもｐＫｃｙｃｌを減少させる一方で、Ｃｌ基およびアジ化メチル基程度の立体障害ではτｓｐにほとんど影響がないことが分かった。そのため、ＨＥ－ＮＯｘａＲ（化合物２－２２）をラベル化する際のリンカーをベンゼン環部位３位に導入することで、ｐＫｃｙｃｌの微調整が達成可能であると考えられる。
　図１５ｂは、１００ｍＭリン酸緩衝液中での化合物２－２７の吸収スペクトルと蛍光スペクトル（Ｅｘ．５２０ｎｍ）、５７３ｎｍでの吸光度とｐＨとの関係を示す。
　図１５ｃは、１００ｍＭリン酸緩衝液中での化合物２－２７の吸収スペクトルと蛍光スペクトル（Ｅｘ．５２０ｎｍ）、５７１ｎｍでの吸光度とｐＨとの関係を示す。
［実施例６］
落射蛍光顕微鏡下での検討
　ここまで、ｍｓｅｃ及びｓｅｃオーダーのτｓｐを有するプローブの開発に成功した。続いて、実際にこれらのプローブが落射蛍光顕微鏡下で機能するか検討することとした。落射蛍光顕微鏡でのｔｉｍｅ－ｌａｐｓｅ撮像でも容易に観察可能だと考えられるｓｅｃオーダーのτｓｐを有するＨＥ－ＮＯｘａＲ（化合物２－２２）を用いて検討を行った。プローブの拡散を防ぐためにＨＥ－ＮＯｘａＲ（化合物２－２２）をペプチド合成で汎用されているビーズであるＴｅｎｔａｇｅｌ（登録商標）に結合させ、ビーズに対して３６５ｎｍＬＥＤを照射する様子をｔｉｍｅ－ｌａｐｓｅイメージングで観察した。３６５ｎｍＬＥＤはｗｅｌｌ全体に対して１回あたり１０秒間の照射を行った。
　ＨＥ－ＮＯｘａＲ（化合物２－２２）とＴｅｎｔａｇｅｌ（登録商標）の複合体は、以下のように調製した。
Ｔｅｎｔａｇｅｌ（登録商標）－ＨＥ－ＮＯｘａＲ複合体の調製
　１ｍＬ菅に、Ｔｅｎｔａｇｅｌ（登録商標）（３１．０ｍｇ）、プロパルギル－ＰＥＧ５－ＮＨＳエステル（１０ｍＭ ＤＭＳＯ溶液、２ｍＬ）およびＮＥＴ３（１滴）を加え、反応混合物を室温で２２時間放置した。得られたプロパルギル－ＰＥＧ５－Ｔｅｎｔａｇｅｌ（登録商標）をＭｅＯＨ（１ｍＬ×４）で洗浄し、乾燥させた。０．５ｍＬ菅にプロパルギル－ＰＥＧ５－Ｔｅｎｔａｇｅｌ（登録商標）（１．７ｍｇ）、２－３３（１ｍＭ　ＤＭＳＯ溶液、１０μＬ）、ＣｕＳＯ４（２０ｍＭ水溶液、１．３μＬ）、ＴＨＰＦＡ（５０ｍＭ水溶液、２．５μＬ）およびアスコルビン酸（１００ｍＭ水溶液、５μＬ）を加え、反応混合物を室温で２２時間放置した。生成したＴｅｎｔａｇｅｌ（登録商標）－ＨＥ－ＮＯｘａＲ複合体をＥｔＯＨ（０．４ｍＬ×３）、　Ｈ２Ｏ（０．４ｍＬ×４）で洗浄し、乾燥させた。
　Ｔｒｉｇｇｅｒ光の光源として浜松ホトニクスの３６５ｎｍＵＶＬＥＤを用い、上記で得られた複合体とｐＨ７．４に調整した１００ｍＭ ＮａＰｉ緩衝液０．１ｍＬを１８ｗｅｌｌ　ｓｌｉｄｅに入れて３０分間放置してから光照射実験を行った。図１６に実験方法の概要を示す。
　ビーズに対して３６５ｎｍＬＥＤ光を照射すると、Ｔｅｎｔａｇｅｌ（登録商標）部分の蛍光強度が増大し、指数関数的な減少を示した。この挙動はＬＥＤを繰り返し照射しても観測され、それぞれの減衰に対して指数関数フィッティングを行うと１０～２０秒程度のτｓｐが算出された（図１７）。Ｔｉｍｅ－ｌａｐｓｅイメージングから算出されたτｓｐはＨＥ－ＮＯｘａＲ（化合物２－２２）の値と近いことから落射蛍光顕微鏡下でもＨＥ－ＮＯｘａＲ（化合物２－２２）が機能し、十分観察可能であることが示された。
　図１７は、ｐＨ７．４の１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中でのＴｅｎｔａｇｅｌ（登録商標）－ＨＥ－ＮＯｘａＲ複合体Ｔｉｍｅ－ｌａｐｓｅイメージングを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000053
　多重イメージングを達成するプローブ群を開発する上で、同一蛍光波長領域内に時間分解法で区別可能なシグナルをなるべく多く用意する必要がある。蛍光顕微鏡のフレームレートを考慮すると蛍光強度変化を追跡可能なタイムスケールはｍｓｅｃオーダー以上になるが、誘導体間のτｓｐの差が小さいと２つの成分に分離・検出することが困難になることが想定される。そこでτｓｐが異なる２つの色素を混ぜたときに、どの程度τｓｐの値が離れていれば区別可能かについて検討を行った（表１）。ここで計算を簡単にするためプローブ濃度及び各プローブのｔｒｉｇｇｅｒ光照射直後の吸光度変化ΔＯＤｔ＝０が同じであると仮定した。
　τｓｐが１ｍｓｅｃのプローブとτｓｐが２ｍｓｅｃ、５ｍｓｅｃ、１０ｍｓｅｃのプローブを比較する場合、それぞれのプローブの開環状態の減衰は以下の表のようになる。τｓｐが１ｍｓｅｃのプローブは５ｍｓｅｃ経過したときに開環状態が１％まで減少する。この時、τｓｐが２ｍｓｅｃ、５ｍｓｅｃ、１０ｍｓｅｃのプローブは８％、３７％、６１％になる。τｓｐが１０倍離れているプローブであればそれぞれのプローブの蛍光強度比が１：６０程度で観測できるので、十分区別可能であると判断した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000054
　そこで、分離の容易さを考慮し、τｓｐの差が１０倍程度になることを目安に、ＨＭ－ＮＯｘａＲとＨＥ－ＮＯｘａＲの中間に位置するｓｕｂ　ｓｅｃオーダーのτｓｐを有するプローブ構造を探索した。
（Ｅ－１）ＨＥ基１位へのメチル基の導入
　ここで、環化反応では配座を制御しgauche 配座を優勢にすることで環化速度を加速できることが知られている。代表的な配座制御による環化速度の加速法としてThorpe-Ingold 効果を用いた方法が挙げられる。ＨＥ－ＮＯｘａＲ（化合物２－２２）のスピロ環化反応では開環状態の準安定構造であるgauche 配座を経由する必要がある。Thorpe-Ingold効果では、環構造を形成するアルキル鎖に対してgem-置換基を導入することで、立体反発からgauche 配座をとりやすくなり環化速度の加速効果が得られる。具体的には、ＨＥ基１位にｇｅｍ－Ｍｅ基を導入すると、anti 配座およびgauche 配座はＨＥ基２位のヒドロキシ基とｇｅｍ－Ｍｅ基間での立体反発のために不安定化する。anti 配座の方がgauche 配座よりも不安定化が大きいため、環化に有利なgauche 配座をとりやすくなり環化速度が加速される。
　そこで、ＨＥ基１位にメチル基を導入した化合物３－４及び化合物３－７を以下のように合成した。
［合成実施例６］
化合物３－４の合成
　以下のスキームに則り、化合物３－４を合成した。
スキーム７
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000055
（１）化合物３－２の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000056
　Ａｒでフラッシュしたフラスコにジイソプロピルアミン（１．５４ｍＬ、１１．０ｍｍｏｌ）と無水ＴＨＦ（５０ｍＬ）を加えた。混合物を－７８℃に冷却した後、１．５６Ｍのｎ－ＢｕＬｉ（７．０ｍＬ、１０．９ｍｍｏｌ）を溶液に加えた。混合物を－７８℃で０．５時間撹拌し、２－ブロモフェニル酢酸３－１（１．０７９３ｇ、５．０１９１ｍｍｏｌ）を混合物に加えた。混合物を０℃で３時間撹拌し、ＭｅＩ（０．３２ｍＬ、５．１ｍｍｏｌ）を混合物に滴下した。得られた反応混合物を室温で２１時間撹拌した。反応を２ＮＨＣｌａｑ（２０ｍＬ）でクエンチし、混合物をＡｃＯＥｔ（２０ｍＬ×３回）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝９０／１０～８０／２０）で精製し、化合物３－２を無色の固体（１．０３４１ｇ、４．５１４ｍｍｏｌ、９０％）として得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.57 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.34 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.30 (t, J = 8.2 Hz,1H), 7.12 (t, J = 8.2 Hz, 1H), 4.27 (q, J = 7.3 Hz, 1H), 1.51 (d, J = 7.3 Hz, 3H)
13C-NMR (101 MHz, CDCl3) δ 179.1, 139.5, 133.1, 128.9, 128.5, 127.9, 124.6, 44.5, 17.7
HRMS Calcd for C9H8BrO2: 226.97132, 228.96927 ([M-H]-); Found: 226.96808, 228.96644
（２）化合物３－３の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000057
　Ａｒでフラッシュしたフラスコに、化合物３－２（３３９．４ｍｇ、１．４８２ｍｍｏｌ）と無水ＴＨＦ（５ｍＬ）を加えた。１Ｍ ＢＨ３－ＴＨＦ錯体溶液（２．２ｍＬ、２．２２３ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を２０時間還流した。反応を２ＮＨＣｌａｑでクエンチし、得られた混合物をＡｃＯＥｔ（１５ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝８０／２０～６０／４０）で精製し、化合物３－３を無色の油（１８８．９ｍｇ、５９％）として得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.56 (dd, J = 8.2, 0.9 Hz, 1H), 7.31-7.26 (m, 2H), 7.08 (ddd, J = 8.2,6.2, 1.8 Hz, 1H), 3.80 (dd, J = 10.5, 6.4 Hz, 1H), 3.70 (dd, J = 10.5, 6.4 Hz, 1H), 3.51 (sex, J = 6.4 Hz,1H), 1.28 (d, J = 6.4 Hz, 3H)
13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 142.6, 133.2, 128.1, 127.8, 127.7, 125.3, 67.4, 40.8, 17.1
（３）化合物３－４の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000058
　Ａｒでフラッシュしたフラスコに、化合物３－３（９３．１ｍｇ、０．４３２８ｍｍｏｌ）と無水ＴＨＦ（６ｍＬ）を加えた。混合物を－７８℃に冷却し、１．５６Ｍのｎ－ＢｕＬｉ（０．４０ｍＬ、０．６３ｍｍｏｌ）を加えた。さらに無水ＴＨＦ（２　ｍＬ）中のキサントン化合物２－１７（１１．９ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で撹拌した。１時間、反応を２ＮＨＣｌａｑでクエンチし、蒸発させた。得られた残渣をメタノールに溶解し、Ｓｅｐ－Ｐａｋ　Ｃ１８　Ｐｌｕｓ　Ｓｈｏｒｔ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅで前処理し、ろ液を蒸発させた。Ａ／Ｂ＝７０／３０　（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＦＡ）、Ａ／Ｂ＝２０／８０　（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＥＡＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＥＡＡ）、Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＦＡ）の条件下で、残渣を分取ＨＰＬＣによって精製した。化合物３－４を青色固体（６．９ｍｇ、５３％、ジアステレオマー混合物）として得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD+KOD) δ 8.30 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 7.8 Hz, 0.5H), 7.34 (d, J= 6.9 Hz, 0.5H), 7.27 (m, 1H), 7.17-7.04 (m, 3H), 6.97-6.93 (m, 2H), 6.82-6.64 (m, 4H), 4.08 (dd, J =11.9, 3.7 Hz, 0.5H), 3.99 (dd, J = 11.4, 4.1 Hz, 0.5H), 3.83-3.80 (m, 4H), 3.62-3.49 (m, 1H), 3.21-3.17(m, 4H), 3.07-2.97 (m, 1H), 1.41 (dd, J = 12.6, 7.1 Hz, 3H)
13C-NMR (100 MHz, CD3OD+KOD) δ 152.5, 152.4, 152.1, 147.7, 147.1, 147.0, 146.9, 141.1, 138.2,138.1, 136.0, 135.9, 130.4, 130.3, 129.6, 127.4, 127.0, 126.7, 126.6, 126.4, 125.9, 125.9, 122.7, 120.2,119.7, 118.4, 118.1, 117.3, 117.2, 116.6, 116.1, 115.8, 115.5, 110.8, 110.3, 108.0, 107.9, 102.1, 101.9,74.4, 66.5, 64.9, 64.6, 48.8, 48.8, 32.7, 32.4, 20.1, 18.5
HRMS Calcd for C30H29N2O3: 465.21727 (M+); Found: 465.21648.
　精製後のＨＰＬＣクロマトグラムを以下に示す。（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＦＡ。Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配。１．０　ｍＬ／ｍｉｎの流量。５６７ｎｍでの検出）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000059
［合成実施例７］
化合物３－７の合成
　以下のスキームに則り、化合物３－７を合成した。
スキーム８
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000060
（１） 化合物３－５の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000061
　Ａｒでフラッシュした火炎乾燥フラスコに、ＮａＨ（パラフィン液分散５０％、９３２．５ｍｇ、３．７０１ｍｍｏｌ）と無水ＤＭＦ（４ｍＬ）を０℃で加え、２－ブロモフェニル酢酸３－１（７９６．０ｍｇ、３．７０１ｍｍｏｌ）をフラスコに加え、反応混合物を１時間攪拌した。反応混合物にＭｅＩ（１．２ｍＬ、１９ｍｍｏｌ）を加え、室温で１７時間撹拌した。反応をＭｅＯＨで急冷し、溶液を蒸発させた。残渣にＨ２Ｏ４０ｍＬを加え、ＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ×３回）で懸濁液を抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝９５／５～９０／１０）で精製し、化合物３－５を無色の油（６８３．５ｍｇ、２．６５８ｍｍｏｌ、７２％）として得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.55 (dd, J = 8.0, 1.1 Hz, 1H), 7.41 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, 1H), 7.31 (td,J = 7.7, 1.1 Hz, 1H), 7.11 (td, J = 7.7, 1.6 Hz, 1H), 3.67 (s, 3H), 1.63 (s, 6H)
13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 177.5, 143.8, 134.4, 128.4, 127.6, 127.2, 123.9, 52.6, 48.1, 26.5
（２）化合物３－６の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000062
　Ａｒでフラッシュしたフラスコに、化合物３－５（３６９．６ｍｇ、１．４３７ｍｍｏｌ）と無水ＴＨＦ（６ｍＬ）を加えた。この溶液にＤＩＢＡＬ（１Ｍ、３．６ｍＬ、３．６００ｍｍｏｌ）を０℃で加え、反応混合物を室温で１５時間撹拌した。反応液を飽和酒石酸カリウムナトリウムａｑ（３０ｍＬ）でクエンチし、混合物をＤＣＭ（１５ｍＬ×３回）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝９０／１０～７０／３０）で精製し、化合物３－６を無色の油（３２１．０ｍｇ、９７％）として得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.59 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, 1H), 7.46 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, 1H), 7.28 (dd,J = 8.0, 1.4 Hz, 1H), 7.06 (td, J = 8.0, 1.4 Hz, 1H), 4.04 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 1.50 (s, 7H), 1.22 (t, J =6.4 Hz, 1H)
13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 143.7, 136.0, 130.2, 128.2, 127.5, 122.4, 69.7, 42.4, 25.3
（３）化合物３－７の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000063
　Ａｒでフラッシュしたフラスコに、化合物３－６（１１０．３ｍｇ、０．４８１４ｍｍｏｌ）と無水ＴＨＦ（６ｍＬ）を加えた。混合物を－７８℃に冷却し、１．５６Ｍのｎ－ＢｕＬｉ（０．４０ｍＬ、０．６３ｍｍｏｌ）を加えた。さらに無水ＴＨＦ（２　ｍＬ）中のキサントン２－１７（１１．９ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で撹拌した。１時間、反応を２ＮＨＣｌａｑでクエンチし、蒸発させた。得られた残渣をメタノールに溶解し、Ｓｅｐ－Ｐａｋ　Ｃ１８　Ｐｌｕｓ　Ｓｈｏｒｔ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅで前処理し、ろ液を蒸発させた。Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＦＡ）、Ａ／Ｂ＝２０／８０（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＥＡＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＥＡＡ）、Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＦＡ）の条件下で、残留物を分取ＨＰＬＣによって精製した。化合物３－７を薄い青色の固体（８．４ｍｇ、７８％）として得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD+KOD) δ 8.30 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.52 (d, J =7.5 Hz, 1H), 7.29 (t, J =7.5 Hz, 1H), 7.14 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.09 (dd, J = 9.1, 2.3 Hz, 1H), 7.05 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.97 (d,J = 2.3 Hz, 1H), 6.94 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.75-6.67 (m, 4H), 3.83-3.80 (m, 4H), 3.64 (d, J = 11.9 Hz,1H), 3.49 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 3.20-3.18 (m, 4H), 1.39 (s, 3H), 1.36 (s, 3H)
13C-NMR (101 MHz, CD3OD+KOD) δ 152.4, 147.5, 147.0, 145.0, 137.2, 136.0, 130.5, 129.5, 127.2,126.5, 125.6, 124.6, 122.7, 120.0, 118.1, 117.3, 116.8, 116.0, 110.5, 108.0, 102.1, 75.0, 69.9, 66.5,48.8, 33.2, 27.2, 25.8
HRMS Calcd for C31H31N2O3: 479.23347 (M+); Found: 479.23214.
　精製後のＨＰＬＣクロマトグラムを以下に示す。（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＦＡ。Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配。１．０ｍＬ／ｍｉｎの流量。２５４　ｎｍでの検出）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000064
［実施例７］
　ＨＥ－ＮＯｘａＲのＨＥ基１位にＭｅ基を１個もしくは２個導入した１－ＭｅＨＥ－ＮＯｘａＲ（化合物３－４）および１，１－ｄｉＭｅＨＥＮＯｘａＲ（化合物３－７）の過渡吸収測定からτｓｐを算出した（図１８（図１８の構造式のＲ１は、一般式（Ｉ）のＲａ、Ｒｂに対応する。））。Ｍｅ基を１個導入した１－ＭｅＨＥ－ＮＯｘａＲはＨＥ－ＮＯｘａＲと比較してτｓｐはほとんど変化しなかった。一方で、メチル基を２個導入した１，１－ｄｉＭｅＨＥ－ＮＯｘａＲ（化合物３－７）は期待通りにＴｈｏｒｐｅ－Ｉｎｇｏｌｄ効果によってτｓｐが短寿命化した。
（Ｅ－２）環構造の導入によるτ ｓｐ の制御
　次に、ＨＥ基の配座自由度を減少させることでスピロ環化の反応速度が加速し１０倍程度が短寿命化すると考え、ＨＥ基のメチレン鎖部分に５員環構造を導入することでｇａｕｃｈｅ配座に固定したＣｉｓ－２－ｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｐｅｎｔｙｌ（以下ＣＨＰ基）を有するＣＨＰ－ＮＯｘａＲを以下のように合成した。
［合成実施例８］
化合物ＣＨＰ－ＮＯｘａＲ（化合物３－１１Ｎ及び３－１１Ｂ）の合成
　以下のスキームに則り、化合物ＣＨＰ－ＮＯｘａＲを合成した。
スキーム９
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000065
（１） 化合物３－９の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000066
　Ｐｄ２（ｄｂａ）３（５９．６ｍｇ、０．０６５１ｍｍｏｌ）、キサントホス（１０７．３ｍｇ、０．１８５４ｍｍｏｌ）及びＣｓ２ＣＯ３（２．６８７７ｇ、８．２４９５ｍｍｏｌ）をＡｒ雰囲気下で無水１，４－ジオキサン（３．４ｍＬ）に溶解した。この混合物に、１－ブロモ－２－ヨードベンゼン３－８（０．４４ｍＬ、３．５３４ｍｍｏｌ）とシクロペンタノン（０．６２ｍＬ、７．０ｍｍｏｌ）を加え、生じた反応混合物を１９時間還流した。混合物にＨ２Ｏ（２０ｍＬ）を加え、懸濁液をＤＣＭ（１５ｍＬ×３回）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝９０／１０～８０／２０）で精製し、化合物３－９を無色の油（２６３．７ｍｇ、１．０１０３ｍｍｏｌ、３１％）として得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.55 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.29-7.26 (m, 1H), 7.15-7.05 (m, 2H), 3.91-4.06 (m, 0.13 H), 3.79-3.74 (m,0.87 H), 2.57-1.93 (m, 6H)
（２） 化合物３－１０の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000067
　Ａｒでフラッシュしたフラスコに、化合物３－９（９０．９ｍｇ、０．３８０ｍｍｏｌ）と無水ＴＨＦ（１ｍＬ）を加えた。混合物を－７８℃に冷却した後、Ｌ－セレクトリド（０．８４ｍＬ、０．８４ｍｍｏｌ）を溶液に滴下した。混合物を－７８℃で７時間撹拌し、その後徐々に反応を室温まで上げた。反応を０．１ＭＨＣｌａｑでクエンチし、混合物をＡｃＯＥｔ（１５ｍＬ×３回）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝９０／１０～８０／２０）で精製し、化合物３－１０を無色の油（６５．２ｍｇ、０．２７０ｍｍｏｌ、３２％）として得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.58 (dd, J = 7.5, 1.1 Hz, 1H), 7.38 (dd, J = 7.5, 1.7 Hz, 1H), 7.29 (td,J = 7.5, 1.1 Hz, 1H), 7.10 (td, J = 7.5, 1.7 Hz, 1H), 4.48 (s, 1H), 3.43-3.38 (m, 1H), 2.20-1.63 (m, 7H)
13C-NMR (101 MHz, CDCl3) δ 138.9, 133.1, 129.8, 128.3, 127.3, 125.8, 73.3, 51.3, 34.1, 27.7, 22.4
（３） 化合物３－１１Ｎ及び３－１１Ｂの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000068
　Ａｒでフラッシュしたフラスコに、化合物３－１０（１３１．７ｍｇ、０．５４６２　ｍｍｏｌ）と無水ＴＨＦ（６ｍＬ）を加えた。混合物を－７８℃に冷却した後、１．５６Ｍのｎ－ＢｕＬｉ（０．７０ｍＬ、１．１ｍｍｏｌ）を溶液に加えた。さらに無水ＴＨＦ（２ｍＬ）中のキサントン２－１７（２０．２ｍｇ、０．０３９６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で撹拌した。１時間、反応を２ＮＨＣｌａｑでクエンチし、蒸発させた。得られた残渣をメタノールに溶解し、Ｓｅｐ－Ｐａｋ　Ｃ１８　Ｐｌｕｓ　Ｓｈｏｒｔ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅで前処理し、ろ液を蒸発させた。Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）～０／１００（５０分）線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＦＡ）、Ａ／Ｂ＝２０／８０（０分）～０／１００（５０分）線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＥＡＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＥＡＡ）、Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＦＡ）。化合物３－１１Ｎ及び３－１１Ｂを青色固体（３－１１Ｎ、９．５ｍｇ、０．０１５７１ｍｍｏｌ、４０％及び３－１１Ｂ、６．４ｍｇ、０．０１０５８ｍｍｏｌ、２７％）として各ジアステレオマーを得た。
化合物３－１１Ｎ
1H-NMR (400 MHz, CD2Cl2+KOD) δ 8.35 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.31 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.23 (td, J =7.3, 1.4 Hz, 1H), 7.12 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.06-7.02 (m, 2H), 6.90 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.85 (d, J = 2.5Hz, 1H), 6.83 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 6.77-6.73 (m, 2H), 6.64 (dd, J = 8.9, 2.5 Hz, 1H), 4.36 (dd, J = 4.3,4.3 Hz, 1H), 3.83-3.81 (m, 4H), 3.20-3.18 (m, 4H), 3.00-2.94 (m, 1H), 2.23-2.16 (m, 1H), 1.89-1.77(m, 3H), 1.66-1.47 (m, 2H)
13C-NMR (100 MHz, CD2Cl2+KOD) δ 152.7, 152.1, 146.6, 145.6, 139.2, 138.4, 135.5, 130.7, 129.3,128.4, 127.7, 126.8, 125.9, 123.5, 119.2, 118.2, 118.0, 117.9, 115.8, 111.3, 107.8, 101.7, 74.1, 72.9,66.8, 48.9, 43.5, 34.2, 33.1, 23.5
HRMS Calcd for C32H31N2O3: 491.23929 (M+); Found: 491.23132.
　精製後のＨＰＬＣクロマトグラムを以下に示す。（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＦＡ。Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配。１．０ｍＬ／ｍｉｎの流量。５６７　ｎｍでの検出）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000069
化合物３－１１Ｂ
1H-NMR (400 MHz, CD2Cl2+KOD) δ 8.32 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.30 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.22 (td, J =7.8, 1.1 Hz, 1H), 7.17 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.05-7.01 (m, 2H), 6.92 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 2.3Hz, 1H), 6.80 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.75 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.70 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 6.57 (dd, J = 8.7,2.3 Hz, 1H), 4.35 (dd, J = 4.3, 4.3 Hz, 1H), 3.83-3.80 (m, 4H), 3.22-3.15 (m, 4H), 2.99-2.94 (m, 1H),2.23-2.17 (m, 1H), 1.92-1.79 (m, 3H), 1.65-1.52 (m, 2H)
13C-NMR (100 MHz, CD2Cl2+KOD) δ 152.0, 151.6, 147.6, 145.6, 138.9, 138.5, 135.6, 131.0, 129.3,128.4, 127.5, 126.8, 125.9, 123.3, 120.4, 117.7, 117.5, 117.2, 115.9, 109.9, 108.2, 102.5, 74.1, 72.7,66.8, 48.8, 43.4, 34.1, 33.1, 23.5
HRMS Calcd for C32H31N2O3: 491.23929 (M+); Found: 491.23041.
　精製後のＨＰＬＣクロマトグラムを以下に示す。（溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、０．１％ＴＦＡ。Ａ／Ｂ＝７０／３０（０分）～０／１００（５０分）の線形勾配。１．０ｍＬ／ｍｉｎの流量。５６８　ｎｍでの検出）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000070
［実施例８］
（１）ｐＫｃｙｃｌ及びτｓｐの評価
　ＣＨＰ－ＮＯｘａＲのそれぞれのジアステレオマーのｐＫｃｙｃｌを測定したところ、いずれもＨＥＮＯｘａＲ（化合物２－２２）に比べて２程度低下していた（図１９）。
　続いて、過渡吸収測定を行ったところ両方のジアステレオマーで指数関数的減衰が観測され、フィッティングから算出されたτｓｐはどちらのジアステレオマーでもＨＥ－ＮＯｘａＲの１／１０程度のｓｕｂ　ｓｅｃオーダーであった。
　図２０ａは、１００ｍＭリン酸緩衝液中での化合物３－１１Ｎの吸収スペクトルと蛍光スペクトル（Ｅｘ．５２０ｎｍ）、５６７ｎｍでの吸光度とｐＨとの関係を示す。
　図２０ｂは、１００ｍＭリン酸緩衝液中での化合物３－１１Ｂの吸収スペクトルと蛍光スペクトル（Ｅｘ．５２０ｎｍ）、５６８ｎｍでの吸光度とｐＨとの関係を示す。
（２）ＣＨＰ－ＮＯｘａＲの３０ｗ／ｖ％ＢＳＡ溶液中での検討
　ＣＨＰ－ＮＯｘａＲが高濃度タンパク溶液中でも機能するか確認するためｐＨ　７．２３０ｗ／ｖ％のＢＳＡ溶液中で過渡吸収測定を行った（図２１）。どちらのジアステレオマーでも過渡吸収の指数関数的な減少が観測された。
　ＨＭ－ＮＯｘａＲ（化合物２－２０）、ＨＥ－ＮＯｘａＲ（化合物２－２２）と比較してτｓｐが１０倍以上離れていることから、これらのプローブとの減衰を切り分ける上では問題はないと判断した。以上からＣＨＰ－ＮＯｘａＲが細胞内でも機能する
ことを強く示唆する結果が得られた。また、以降の検討では８０２ｍｓｅｃのτｓｐを有するＣＨＰＮＯｘａＲ３－１１－Ｎを用いた。
［実施例９］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000071
　上記で検討した３種類のプローブを混合した状態でもＨＭ－、ＣＨＰ－、ＨＥ－ＮＯｘａＲの３つのプローブをそれぞれ２０μＭずつ混合して溶解したリン酸緩衝液を作製し、ＬＦＰ法での過渡吸収測定を行った（図２２）。３種混合系を用いた測定から得られた過渡吸収の減衰に対して３成分の指数関数フィッティングを行い各成分のτｓｐを算出した。算出された各成分のτｓｐは、ＨＭ－ＮＯｘａＲ、ＣＨＰ－ＮＯｘａＲ、ＨＥ－ＮＯｘａＲそれぞれ単独での測定値と良い一致を示した。
　また、３成分の指数関数フィッティングから得られたＴｒｉｇｇｅｒ光照射直後の吸光度変化を示すΔＯＤｔ＝０からそれぞれの成分の濃度比を算出したところプローブの混合比である１：１：１に近い値が得られた（図２３）。このことからフィッティングで分けた３成分は各プローブの減衰を反映したものであることが強く示唆された。
　また、３つのプローブのΔＯＤへの寄与を図中に示すと次のようになる。パルスレーザー照射から２０ｍｓｅｃまではＨＭ－，ＣＨＰ－，ＨＥ－ＮＯｘａＲの３つのプローブが観測され、２０ｍｓｅｃから１ｓｅｃ程度までＣＨＰ－，ＨＥ－ＮＯｘａＲの２つのプローブが、１ｓｅｃ以降はＨＥ－ＮＯｘａＲが観測されていることが分かる。以上から３つのプローブを混合した状態でも測定の時間領域を適切に分けることによって、それぞれのプローブが同じ空間に分布していても区別することができると示唆された。
［実施例１０］
生細胞中での機能実証
　ＨＥ－ＮＯｘａＲが細胞内でも機能することを確認するために、小胞体にＨａｌｏ蛋白を発現させたＣＯＳ７細胞の染色実験を行った（図２４）。具体的には、アジド－アルキンを用いたクリック反応でＨａｌｏリガンドを化合物２－３３に結合させたのちに１μＭになるようにＤＭＥＭ培地で希釈しＣＯＳ７細胞を染色した。染色後に１０μＭのニゲリシンとバリノマイシンを用いて細胞内のｐＨを７．４に調整したのちに落射蛍光顕微鏡でｔｉｍｅ－ｌａｐｓｅ撮像した。Ｔｒｉｇｇｅｒ光（３５５ｎｍ）の照射後において、ＨＥ－ＮＯｘａＲで染色した小胞体でのみ蛍光強度が上昇し、時間経過とともに蛍光強度が指数関数的に減少した。Ｔｒｉｇｇｅｒ光照射後の蛍光強度の減衰から算出されたτｓｐは５．６ｓｅｃであり、ＬＦＰでの測定値と同程度であることがわかった。以上から、ＨＥ－ＮＯｘａＲは生細胞中でもｔｒｉｇｇｅｒ光照射依存的に開環状態（ｏｐｅｎ　ｆｏｒｍ）が生成可能かつ一定の寿命τｓｐで閉環状態（ｃｌｏｓｅｄ　ｆｏｒｍ）に戻ることが示された。

Claims (25)

  1. 　以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
    （式中、
    Ｒ１は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を表し、
    当該一価の置換基は、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルコキシル基、ハロゲン原子、カルボキシル基、カルボキシル基を有するアルキル基、エステル基、アルキルエステル基、アミノ基、アミド基、アルキルアミノ基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、アジ化アルキル基、アルキニル基、リンカーを有していてもよいタグたんぱく質反応部位、リンカーを有していてもよいラベル部位又は標的集積部位を含む基等からなる群から選択され；
    ｍは、０～４の整数であり、ｍが２以上の場合は、各々のＲ１は同じであっても異なっていてもよく；
    Ｌは、－（ＣＲａＲｂ）ｎ－で表され、
    Ｒａ及びＲｂは、各々独立に、各出現において独立に、水素原子又は炭素数１～３のアルキル基であり、ｎは１～２の整数であり、
    ここで、隣接する各々の炭素に結合するＲａ又はＲｂのそれぞれの１つは架橋して、これらが結合する２つの炭素と一緒に環構造を形成してもよく；
    Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；。
    Ｒ４は、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
    Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個の置換または無置換のアルキル基、－ＣＯ－Ｒ又は－ＣＯ－Ｏ－Ｒであり（Ｒは、炭素数１～６のアルキル基である）、
    ここで、Ｒ５及びＲ６は、これらが結合している窒素原子と一緒に、酸素原子、窒素原子、硫黄原子及びリン原子からなる群から選択される１以上のヘテロ原子を含む、置換基を有していてもよい５～７員のヘテロシクリルを形成してもよく；
    Ｙは、－ＮＲｃＲｄ、アミド基（－ＮＨ－ＣＯ－Ｒ）、カルバメート基（－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｒ）又はジュロリジル基であり、
    Ｒｃ及びＲｄは、各々独立に、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒは、炭素数１～６のアルキル基であり；
    Ｘは、酸素原子又はＳｉＲ７Ｒ８であり、
    ここで、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基である。）
  2. Ｒ５及びＲ６は、これらが結合している窒素原子と一緒に、置換基を有していてもよいモルホリン環を形成している、請求項１に記載の化合物又はその塩。
  3. 　以下の一般式（Ｉａ）で表される、請求項１に記載の化合物又はその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
    （式中、Ｒ１～Ｒ４、Ｌ、ｍは、一般式（Ｉ）で規定した通りであり；
    Ｒ９は、存在する場合は、炭素数１～６個の置換または無置換のアルキル基である。）
  4. 　Ｌは、－（ＣＨ２）－又は－（ＣＨ２）２－である、請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
  5. 　Ｌは、以下の式で表されるシクロペンチル環である、請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
    （式中、＊及び＊＊は、夫々、ベンゼン環との結合箇所、及びヒドロキシル基との結合箇所を示す。）
  6. 　生理的ｐＨにおいて、一般式（Ｉ）の化合物の大部分が分子内スピロ環化体（closed form）として存在する、請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
  7. 　ｐＫｃｙｃｌｅが７以下である、請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。（ここで、ｐＫｃｙｃｌｅとは、一般式（Ｉ）の化合物のスピロ環化閉環状態（closed form）と開環状態（open form）の存在比が１：１になるｐＨを意味する。）
  8. 　Ｒ１のリンカーを有していてもよいタグたんぱく質反応部位が、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｈａｌｏタグリガンド（例えば、２－（２－（（６－クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エタンアミノ基）、弱塩基性アミン、マレイミド、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、アルキニル基、ベンジルグアニン誘導体又はベンジルシトシン誘導体等からなる群から選択される、請求項１～７のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
  9. 　Ｒ１のラベル部位又は標的集積部位を含む基は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｈａｌｏタグリガンド（例えば、２－（２－（（６－クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エタンアミノ基）、弱塩基性アミン、マレイミド、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、アルキニル基、ベンジルグアニン誘導体又はベンジルシトシン誘導体等からなる群から選択されるラベル部位又は標的集積部位を有する、請求項１～７のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
  10. 　タグたんぱく質反応部位、ラベル部位又は標的集積部位を含む基が有することができるリンカーは、アルキレン基（但し、アルキレン基の１以上の－ＣＨ２－は、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－、又は－ＣＯ－で置換されていてもよい。）、アリーレン（ヘテロアリーレンを含む）、シクロアルキレン、アルコキシル基、ポリエチレングリコール鎖、アミド基、システイン酸アルキル、及び、これらの基から選択される２種以上の基が任意に結合して構成される基からなる群から選択される、請求項１～９のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
  11. 　以下のいずれかの構造を有する化合物またはその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
  12. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。
  13. 　２種以上の請求項１～１１のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブであって、
    ２種以上の前記化合物又はその塩は、以下の条件を満たす、当該蛍光プローブ。
    （１）２種以上の化合物又はその塩は、同一の、あるいは酷似した蛍光波長を有する蛍光母核を有する。
    （２）２種以上の化合物又はその塩は、各々、異なるτｓｐを有する（ここで、τｓｐは、各化合物の開環状態（open form）からスピロ環化閉環状態（closed form）への速度定数（ｋＯ→Ｃ）の逆数である）。
  14. 　前記２種以上の化合物又はその塩が有する異なるτｓｐは、１０倍以上異なる、請求項１３に記載の蛍光プローブ。
  15. 　前記２種以上の化合物又はその塩が有するτｓｐのうち、最も小さいτｓｐが１ｍｓｅｃ以上である、請求項１３又は１４に記載の蛍光プローブ。
  16. 　一波長測光マルチターゲットイメージング技法に用いられる、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の蛍光プローブ。
  17. 　少なくとも１つの請求項１～１１のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブを２以上含む蛍光プローブ群であって、
    当該蛍光プローブ群に含まれる前記化合物又はその塩は、以下の条件を満たす、当該蛍光プローブ群。
    （１ａ）当該蛍光プローブ群に含まれる化合物又はその塩は、同一の、あるいは酷似した蛍光波長を有する蛍光母核を有する。
    （２ａ）当該蛍光プローブ群に含まれる化合物又はその塩は、各々、異なるτｓｐを有する（ここで、τｓｐは、各化合物の開環状態（open form）からスピロ環化閉環状態（closed form）への速度定数（ｋＯ→Ｃ）の逆数である）。
  18. 　前記蛍光プローブ群に含まれる化合物又はその塩が有する異なるτｓｐは、１０倍以上異なる、請求項１７に記載の蛍光プローブ群。
  19. 　前記蛍光プローブ群に含まれる化合物又はその塩が有するτｓｐのうち、最も小さいτｓｐが１ｍｓｅｃ以上である、請求項１７又は１８に記載の蛍光プローブ群。
  20. 　一波長測光マルチターゲットイメージング技法に用いられる、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の蛍光プローブ群。
  21. 以下の条件を満たす２種以上の請求項１～１１のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を測定対象物に導入し、
    （１）２種以上の化合物は、同一の、あるいは酷似した蛍光波長を有する蛍光母核を有する。
    （２）２種以上の化合物は、異なるτｓｐを有する（ここで、τｓｐは、各化合物の開環状態（open form）からスピロ環化閉環状態（closed form）への速度定数（ｋＯ→Ｃ）の逆数である）。
    前記測定対象物に３５５ｎｍ以上の波長領域の適切なトリガー光を照射することにより、一過的非平衡状態を生成させ、そこからの緩和速度の違いを利用することにより、複数分子を同時に識別・定量することが可能な蛍光プローブイメージング法。
  22. 　トリガー光を照射した後に、過渡吸収測定を行うことによって得られる過渡吸収の減衰に対して複数（導入した化合物の種類の数に対応する）成分の指数関数fittingを行うことにより、各化合物のτｓｐを算出することを含む、請求項２１に記載の蛍光プローブイメージング法
  23. 　２種以上の請求項１～１１のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を、２種以上の異なる抗体とそれぞれ結合させ、当該化合物でラベル化された抗体で固定化した細胞の蛍光免疫染色を行うことによって、固定化した細胞のそれぞれの抗原を、各化合物が有するτｓｐを指標として区別することを含む、蛍光免疫染色法。
  24. 　少なくとも１の請求項１～１１のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブを、がん細胞を含む可能性のある細胞又は組織に適用し、その後、３５５ｎｍ以上の波長領域の適切なトリガー光を当該細胞又は組織に照射することにより、前記蛍光プローブに由来する蛍光強度の増大を観測することによって、がん細胞（腫瘍部）特異的な蛍光上昇を抽出することを含む、蛍光イメージング方法。
  25. 内視鏡又は腹腔鏡による検査又は手術に用いられる、請求項２４に記載の蛍光イメージング方法。
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