JPWO2019124348A1 - 新規骨分化誘導方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]多能性幹細胞をフィーダーフリー条件で培養する工程(1)、ROCK阻害剤およびレチノイン酸受容体αまたはβアゴニストを含む、骨分化誘導培地と多能性幹細胞用培地の混合培地を用いて培養する工程(2)、およびレチノイン酸受容体αまたはβアゴニストを含む骨分化誘導培地を用いて培養する工程(3)、を含むことを特徴とする骨分化誘導方法。
[2]工程(2)および工程(3)の合計培養期間が12日間以内である前記[1]に記載の骨分化誘導方法。
[3]工程(2)の培養期間が2日間である前記[1]または[2]に記載の骨分化誘導方法。
[4]多能性幹細胞をフィーダーフリー条件で培養する工程(I)、ROCK阻害剤およびレチノイン酸受容体αまたはβアゴニストを含む、骨分化誘導培地と多能性幹細胞用培地の混合培地を用いて培養する工程(II)、レチノイン酸受容体αまたはβアゴニストおよび被験物質を含む骨分化誘導培地を用いて培養する工程(III)、石灰化結節形成量、カルシウム塩沈着量、I型コラーゲン産生または分泌量、および骨分化関連遺伝子発現量から選択される少なくとも1つを測定する工程(IV)、ならびに被験物質を含まない骨分化誘導培地を用いて培養した細胞の測定値と比較し、骨分化能を亢進させる被験物質を選択する工程(V)、を含むことを特徴とする骨疾患治療薬のスクリーニング方法。
[5]工程(II)および工程(III)の合計培養期間が12日間以内である前記[4]に記載のスクリーニング方法。
[6]工程(II)の培養期間が2日間である前記[4]または[5]に記載のスクリーニング方法。
[7]多能性幹細胞が骨疾患モデル多能性幹細胞である前記[4]〜[6]のいずれかに記載のスクリーニング方法。
[8]骨疾患モデル多能性幹細胞が骨疾患患者の細胞から作製したiPS細胞である前記[7]に記載のスクリーニング方法。
[9]多能性幹細胞が健常ヒト由来の骨疾患に関連する異常を有しない多能性幹細胞である前記[4]〜[6]のいずれかに記載のスクリーニング方法。
本発明は、多能性幹細胞から骨細胞を分化誘導する新規なワンステップ骨分化誘導方法を提供する。本発明の骨分化誘導方法は、以下の各工程を含むものであればよい。
工程(1):多能性幹細胞をフィーダーフリー条件で培養する工程
工程(2):ROCK阻害剤およびレチノイン酸受容体αまたはβアゴニストを含む、骨分化誘導培地と多能性幹細胞用培地の混合培地を用いて培養する工程
工程(3):レチノイン酸受容体αまたはβアゴニストを含む骨分化誘導培地を用いて培養する工程
(1)従来法では多能性幹細胞の段階から3週間以上必要とした骨分化誘導が、10日間という短期間で可能である点
(2)従来の多段階誘導法における、各段階の効率によって最終的な誘導効率が影響を受けるという欠点がなく、誘導効率が安定している点
(3)複数の高価な増殖因子を使用する従来法に比較して、誘導コストが安価である点
(4)(1)〜(3)の利点から、従来法より薬剤スクリーニングに適した方法である点
(5)従来法では明確に示されていない骨細胞への分化が確認されている点
本発明は、上記本発明の骨分化誘導方法を利用して骨疾患治療薬をスクリーニングする方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、以下の各工程を含むものであればよい。
(I)多能性幹細胞をフィーダーフリー条件で培養する工程
(II)ROCK阻害剤およびレチノイン酸受容体αまたはβアゴニストを含む、骨分化誘導培地と多能性幹細胞用培地の混合培地を用いて培養する工程
(III)レチノイン酸受容体αまたはβアゴニストおよび被験物質を含む骨分化誘導培地を用いて培養する工程
(IV)石灰化結節形成量、カルシウム塩沈着量、I型コラーゲン産生または分泌量、および骨分化関連遺伝子発現量から選択される少なくとも1つを測定する工程
(V)被験物質を含まない骨分化誘導培地を用いて培養した細胞の測定値と比較し、骨分化能を亢進させる被験物質を選択する工程
(1)レチノイン酸を用いたワンステップ骨分化誘導方法(図1参照)
(1-1)オンフィーダーiPS細胞を用いる場合(図1上段参照)
3日間(D-3〜D0)、マトリゲルコート上でmTeSR(商品名、Stemcell Technology社)によりフィーダーフリー培養した後、ゼラチンコート上に播種し、最初の2日間(D0〜D2)は、ROCK阻害剤(ROCKi)とレチノイン酸(RA)を添加した骨分化誘導培地(OI medium)とmTeSRの混合培地(混合比4対1)で培養した。その後、レチノイン酸(RA)を添加した骨分化誘導培地でD10まで培養した。レチノイン酸を添加しない培地を用いて培養したものを対照とした。
StemFit AK03N(商品名、味の素ヘルシーサプライ社)を用いてラミニンコート上でフィーダーフリー培養したiPS細胞を、最初の2日間(D0〜D2)は、ROCK阻害剤(ROCKi)とレチノイン酸(RA)を添加した骨分化誘導培地(OI medium)とmTeSRの混合培地(混合比4対1)で培養した。その後、レチノイン酸(RA)を添加した骨分化誘導培地でD10まで培養した。レチノイン酸を添加しない培地を用いて培養したものを対照とした。
石灰化結節形成能は、細胞をエチルアルコールで固定後、アリザリンレッド染色溶液を10分間反応させ、洗浄後、陽性結節を定性的に評価した。カルシウム塩の沈着量はo-クレゾールフタレインコンプレキソン(OCPC)液による発光量により定量的に計測した。アリザリンレッド染色の結果を図2に、カルシウム塩沈着量の結果を図3に示した。オンフィーダー細胞(414C2および409B2)およびフィーダーフリー細胞(1231A3)のいずれにおいても、レチノイン酸の添加により、骨分化能が著しく亢進していることが明らかになった。
多能性幹細胞から最終分化細胞までの、各分化段階における代表的な遺伝子の発現をmRNAレベルで経時的に評価した。経時的に細胞を回収して、RNAを抽出しcDNAを合成した。各遺伝子に特異的なプライマーを用いて定量的PCRを行い、発現量を評価した。
結果を図4に示した。レチノイン酸を添加しない培養条件(図中「RA(-)」)では、0日目にiPS細胞に特異的な遺伝子が発現し、10日目に骨細胞前駆細胞(osteoprogenitor)に特異的な遺伝子の発現が認められたが、前骨芽細胞(preosteoblast)以降の各分化段階の代表的な遺伝子の発現は認められなかった。一方、レチノイン酸を添加した培養条件(図中「RA(+)」)では、経時的に、iPS細胞、骨細胞前駆細胞(osteoprogenitor)、前骨芽細胞(preosteoblast)、骨芽細胞(osteoblast)に特異的な遺伝子の発現が認められ、さらに、既存の方法では誘導が困難であった骨細胞(osteocyte)に特異的な遺伝子(SOST)の発現が認められた。したがって、レチノイン酸を用いたワンステップ骨分化誘導方法により、10日間でヒト多能性幹細胞から骨細胞(osteocyte)を分化誘導できることが判明した。
多能性幹細胞から最終分化細胞までの、各分化段階における代表的な遺伝子の発現をタンパク質レベルで評価した。細胞をパラホルムアルデヒドで固定後、各タンパク質に対する抗体を反応させ、洗浄後、蛍光標識された二次抗体を反応させ、蛍光強度により発現を評価した。
結果を図5に示した。mRNAレベルでの発現と一致して、前骨芽細胞(preosteoblast)、骨芽細胞(osteoblast)および骨細胞(osteocyte)に特異的な遺伝子の発現が、タンパク質レベルで確認された。
骨分化誘導7日目と10日目に細胞を基質に包まれたまま回収し、走査型電子顕微鏡で観察を行った。結果を図6に示した。(A)は7日目の観察結果であり、(B)は10日目の観察結果である。7日目の組織中には、比較的球形で突起の少ない細胞が観察されたのに対し、10日目では、多数の細胞突起により周囲の細胞とネットワークを形成している細胞が観察された。いずれも既報における骨芽細胞および骨細胞の形態像と一致していた。
骨芽細胞が主体である7日目の段階で細胞を一塊として回収し、NOD-SCIDマウスの頭蓋骨に作製した径4mmの欠損部に移植した。6週間後に犠死させ、マイクロCTにて骨再生像を観察した。さらに、再生組織の組織標本を作製し、HE染色および抗ヒトオステオポンチン抗体による免疫染色を行った。
マイクロCTでの観察結果を図8に示した。(A)は細胞移植を行わなかった群の結果、(B)はレチノイン酸を添加した骨分化誘導培地を用いて培養した細胞を移植した結果、(C)はレチノイン酸を添加しない骨分化誘導培地を用いて培養した細胞を移植した結果である。 (A)の細胞移植を行わなかった群では、欠損は自然修復されなかった。(C)の群では、6匹中4匹で、未分化iPS細胞の残存を示唆する腫瘍の形成を認めた。一方(B)の群では、腫瘍の形成はなく、骨再生像が観察された。なお、(A)および(B)の画像は、頭蓋骨を取り出してCT画像を撮影し、その三次元画像を、欠損部を上から観る方向で再構築したものであり、(C)の画像は、欠損部に形成された腫瘍を周囲の頭蓋骨を含めて取り出してCT画像を撮像し、その三次元画像を横から立体的に観察したものである。
レチノイン酸による骨分化誘導におけるBMPおよびWNTシグナルの意義について検討した。
(1)レチノイン酸によるBMPおよびWNTシグナル分子の発現誘導
誘導開始前(D0)および2日目(D2)の遺伝子発現をマイクロアレイにて網羅的に解析した。結果を図10に示す。それぞれの遺伝子についての経過中の比較で、発現が高いものを赤で、低いものを青で示す。レチノイン酸によってレチノイン酸の下流の分子に加えて、BMPリガンドおよびその下流遺伝子、そしてWNTリガンドとその下流遺伝子の発現が亢進していることが判明した。
次にBMPおよびWNTの骨分化誘導に関して、それぞれの阻害剤を用いて検討した。結果を図11に示す。BMP阻害剤(LDN)およびWNT阻害剤(IWR1)を添加した培地を用いて10日間培養した後のカルシウム塩沈着量を測定したところ、レチノイン酸による増加は阻害された。これらの結果より、レチノイン酸による骨分化誘導においてBMPおよびWNTの両者のシグナルが関与していることが判明した。
レチノイン酸(RA)は核内受容体であるレチノイン酸受容体(RAR)α、RARβまたはRARγと複合体を形成して標的配列に結合することで、その作用を発揮する。そこでワンステップ骨分化誘導方法におけるレチノイン酸の作用を受容体アゴニストにより代替する方法を検討した。
まず全ての受容体に対するアンタゴニスト(pan-RARアンタゴニスト)であるBM493を添加した培地を用いて10日間培養した後のカルシウム塩沈着量を評価するとRAの効果は完全に消去され、RAの効果がRARを介したものであることが確認された(図12)。
次に各RARに対するsiRNAの効果を解析した。その結果、RARγに対するsiRNA(γ#1およびγ#2)の添加は無効であったが、RARαに対するsiRNA(α#1およびα#2)およびRARβに対するsiRNA(β#1およびβ#2)を添加することで骨形性能が低下し、RARαに対するsiRNAとRARβに対するsiRNAを併用(α#1β#1およびα#2β#2)することで更に阻害されることが判明した(図13)。図中、CTLはコントロールsiRNAを添加したもの、(-)はsiRNAを添加していないものを示す。
レチノイン酸(RA)に代えて、レチノイン酸受容体(RAR)に対するアゴニストを添加した骨分化誘導培地を用いてワンステップ骨分化誘導を行い、10日目にカルシウム塩沈着量を評価した。結果を図14に示した。RARαに対するアゴニストであるAm580(200nM)およびAm80(1μM)またはRARβに対するアゴニストであるCD2314(3μM)およびAC55649(3μM)を添加することにより、レチノイン酸添加と同様にカルシウム塩沈着量が亢進したが、RARγに対するアゴニストであるR667(100nM)およびCD437(1μM)にはそのような作用は認められなかった。これらの結果から、レチノイン酸による骨分化誘導能はRARαまたはRARβに対するアゴニストにより代替されることが判明した。
樹立したワンステップ骨分化誘導方法が骨疾患の病態再現に有用であるか否かを、代表的な骨系統疾患である骨形成不全症(以下OI)をモデルとして検討した。
OIはI型コラーゲンの異常により、骨組織が脆弱となり、骨折を繰り返す疾患である。分子病態としては、コラーゲン遺伝子の異常により正常なコラーゲン三重鎖が形成されないことによるコラーゲン分泌の低下、それによる石灰化の低下等の骨形性能の異常と、異常コラーゲンが小胞体(ER)内に蓄積することによるERストレスによる細胞死が主たる病態である。
COL1A1遺伝子の異常を有するOI患者2名(OI#1およびOI#2)よりiPS細胞を樹立した(OI#1-1およびOI#2-1)。更にそれぞれよりゲノム編集技術を用いて変異を修復したiPS細胞(resOI#1-1およびresOI#2-1)を作製した。それぞれと標準的iPS細胞(WT1,414C2;WT2,409B2)をワンステップ骨分化誘導方法に供して骨分化を誘導し、誘導後10日目での石灰化結節形成能、カルシウム塩沈着量、ERストレス関連遺伝子発現量およびI型コラーゲン分泌能について比較した。
アリザリンレッド染色の結果を図15に、カルシウム塩沈着量の結果を図16に、ERストレス関連遺伝子発現量の結果を図17に、I型コラーゲン分泌能の結果を図18にそれぞれ示した。OI#1-1およびOI#2-1をワンステップ骨分化誘導方法に供した場合、アリザリンレッド陽性石灰化結節数はWT1およびWT2と比較して低下し、変異修復細胞(resOI#1-1およびresOI#2-1)で改善した(図15)。この傾向は、カルシウム塩沈着量の定量でより顕著であった(図16)。ERストレス関連遺伝子であるBiP遺伝子の発現に関しても、OI#1-1およびOI#2-1で亢進したものが、resOI#1-1およびresOI#2-1ではWT1およびWT2のレベルまで低下した(図17)。I型コラーゲンの分泌状況を抗I型コラーゲン抗体による免疫染色で検討した結果においても、OI#1-1およびOI#2-1では分泌量が低下し、かつその分布が極めて不規則であったものが、resOI#1-1およびresOI#2-1ではWT1およびWT2と同等の結果が認められた(図18)。これらの結果は、OI#1-1およびOI#2-1で認められた表現型の変化がそれぞれのCOL1A1遺伝子の変異に起因するものであることを示すものであり、ワンステップ骨分化誘導方法と疾患由来iPS細胞を用いて、OIという遺伝性疾患の病態をin vitroで再現できることを実証するものである。
これまでOIに対する治療戦略の1つとして、ラパマイシンによりmTOR蛋白複合体の機能を阻害し、オートファジーを亢進させることで、不良タンパク質の細胞内蓄積を軽減する方法が患者由来初代培養細胞を用いて報告されている。そこでワンステップ骨分化誘導方法で、mTOR阻害剤の効果が再現できるかを検討した。誘導2日目から培地にラパマイシン(10nM)またはエベロリムス(100nM)を添加して、10日目に分化能を評価した。
以上の結果より、ワンステップ骨分化誘導方法は、候補治療薬の有効性を示すことできる方法であると考えられる。
Claims (9)
- 多能性幹細胞をフィーダーフリー条件で培養する工程(1)、
ROCK阻害剤およびレチノイン酸受容体αまたはβアゴニストを含む、骨分化誘導培地と多能性幹細胞用培地の混合培地を用いて培養する工程(2)、および
レチノイン酸受容体αまたはβアゴニストを含む骨分化誘導培地を用いて培養する工程(3)、を含むことを特徴とする骨分化誘導方法。 - 工程(2)および工程(3)の合計培養期間が12日間以内である請求項1に記載の骨分化誘導方法。
- 工程(2)の培養期間が2日間である請求項1または2に記載の骨分化誘導方法。
- 多能性幹細胞をフィーダーフリー条件で培養する工程(I)、
ROCK阻害剤およびレチノイン酸受容体αまたはβアゴニストを含む、骨分化誘導培地と多能性幹細胞用培地の混合培地を用いて培養する工程(II)、
レチノイン酸受容体αまたはβアゴニストおよび被験物質を含む骨分化誘導培地を用いて培養する工程(III)、
石灰化結節形成量、カルシウム塩沈着量、I型コラーゲン産生または分泌量、および骨分化関連遺伝子発現量から選択される少なくとも1つを測定する工程(IV)、ならびに
被験物質を含まない骨分化誘導培地を用いて培養した細胞の測定値と比較し、骨分化能を亢進させる被験物質を選択する工程(V)、を含むことを特徴とする骨疾患治療薬のスクリーニング方法。 - 工程(II)および工程(III)の合計培養期間が12日間以内である請求項4に記載のスクリーニング方法。
- 工程(II)の培養期間が2日間である請求項4または5に記載のスクリーニング方法。
- 多能性幹細胞が骨疾患モデル多能性幹細胞である請求項4〜6のいずれかに記載のスクリーニング方法。
- 骨疾患モデル多能性幹細胞が骨疾患患者の細胞から作製したiPS細胞である請求項7に記載のスクリーニング方法。
- 多能性幹細胞が健常ヒト由来の骨疾患に関連する異常を有しない多能性幹細胞である請求項4〜6のいずれかに記載のスクリーニング方法。
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