JPWO2019088208A1 - ヒト非アルコール性脂肪性肝炎モデル - Google Patents
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Abstract
Description
また、コリン欠乏メチオニン含有飼料でラットを飼育することによりNASHを誘発できることも知られている。しかし、種差の影響が強く、この飼料をマウスに与えても、NASHに特徴的な線維化は観察されない(非特許文献1)。
また、これらのモデル動物の肝臓は非ヒト動物の肝臓であるため、ヒトNASHを完全に再現した動物モデルではなく、肝臓での代謝活性も非ヒト動物型である。従って、ヒトのNASHの薬効評価に適したモデルとは言い難い。
しかし、特許文献1が教えるキメラ非ヒト動物のNASH症状は再現性が低く、NASH治療薬のスクリーニングなどに広く用いるための動物モデルとしては実用し難い。また、この方法では、ヒトの肝細胞を移植することによりNASHを作製するために、ヒト肝細胞が移植された非NASH群、つまりコントロール群を設定することができないという難点もある。
このような状況下で、ヒト肝細胞キメラげっ歯類動物に、上記調整飼料を与えることで、ヒト肝細胞に特異的に障害を与え、ヒトNASHに特徴的な病変を強く発現できたことは驚くべきことである。
〔1〕 肝細胞の一部又は全部がヒト肝細胞で置換されたキメラげっ歯類動物を、下記(a)、(b)、及び(c)の1以上の特性を有する調整飼料で飼育することにより得られる動物を含む、ヒト非アルコール性脂肪性肝炎モデル。
(a)コリン又はその塩の配合量が、調整飼料の全量に対して、0.01重量%以下
(b)メチオニンの配合量が、調整飼料の全量に対して、0.5重量%以下
(c)脂肪含有量が、調整飼料に含まれるタンパク質、炭水化物、及び脂肪の合計熱量に対して、25 kcal%以上
〔2〕 キメラげっ歯類動物が初代キメラげっ歯類動物、又は継代移植キメラげっ歯類動物である〔1〕に記載のヒト非アルコール性脂肪性肝炎モデル。
〔3〕 調整飼料で1週間以上飼育する〔1〕又は〔2〕に記載のヒト非アルコール性脂肪性肝炎モデル。
〔4〕 肝細胞の一部又は全部がヒト肝細胞で置換されたキメラげっ歯類動物を、下記(a)、(b)、及び(c)の1以上の特性を有する調整飼料で飼育することにより得られる動物を、ヒト非アルコール性脂肪性肝炎モデルとして使用する方法。
(a)コリン又はその塩の配合量が、調整飼料の全量に対して、0.01重量%以下
(b)メチオニンの配合量が、調整飼料の全量に対して、0.5重量%以下
(c)脂肪含有量が、調整飼料に含まれるタンパク質、炭水化物、及び脂肪の合計熱量に対して、25 kcal%以上
〔5〕 キメラげっ歯類動物が初代キメラげっ歯類動物、又は継代移植キメラげっ歯類動物である〔4〕に記載の方法。
〔6〕 調整飼料で1週間以上飼育する〔4〕又は〔5〕に記載の方法。
〔7〕 肝細胞の一部又は全部がヒト肝細胞で置換されたキメラげっ歯類動物を、下記(a)、(b)、及び(c)の1以上の特性を有する調整飼料で飼育する工程を含む、ヒト非アルコール性脂肪性肝炎モデルの作製方法。
(a)コリン又はその塩の配合量が、調整飼料の全量に対して、0.01重量%以下
(b)メチオニンの配合量が、調整飼料の全量に対して、0.5重量%以下
(c)脂肪含有量が、調整飼料に含まれるタンパク質、炭水化物、及び脂肪の合計熱量に対して、25 kcal%以上
〔8〕 キメラげっ歯類動物が初代キメラげっ歯類動物、又は継代移植キメラげっ歯類動物である〔7〕に記載の方法。
〔9〕 調整飼料で1週間以上飼育する〔7〕又は〔8〕に記載の方法。
〔10〕 肝細胞の一部又は全部がヒト肝細胞で置換されたキメラげっ歯類動物を、下記(a)、(b)、及び(c)の1以上の特性を有する調整飼料で飼育する工程を含む方法により得られる動物に被験物質を投与する工程と、投与前後の非アルコール性脂肪性肝炎の症状の程度を比較するか、又は被験物質を投与したキメラげっ歯類動物と被験物質を投与していないキメラげっ歯類動物との間で非アルコール性脂肪性肝炎の症状の程度を比較する工程とを含む、ヒト非アルコール性脂肪性肝炎治療剤のスクリーニング方法。
(a)コリン又はその塩の配合量が、調整飼料の全量に対して、0.01重量%以下
(b)メチオニンの配合量が、調整飼料の全量に対して、0.5重量%以下
(c)脂肪含有量が、調整飼料に含まれるタンパク質、炭水化物、及び脂肪の合計熱量に対して、25 kcal%以上
〔11〕 キメラげっ歯類動物が初代キメラげっ歯類動物、又は継代移植キメラげっ歯類動物である〔10〕に記載の方法。
〔12〕 調整飼料で1週間以上飼育する〔10〕又は〔11〕に記載の方法。
〔13〕 肝細胞の一部又は全部がヒト肝細胞で置換されたキメラげっ歯類動物を、下記(a)、(b)、及び(c)の1以上の特性を有する調整飼料で飼育することにより得られる動物の、ヒト非アルコール性脂肪性肝炎モデルとしての使用。
(a)コリン又はその塩の配合量が、調整飼料の全量に対して、0.01重量%以下
(b)メチオニンの配合量が、調整飼料の全量に対して、0.5重量%以下
(c)脂肪含有量が、調整飼料に含まれるタンパク質、炭水化物、及び脂肪の合計熱量に対して、25 kcal%以上
〔14〕 肝細胞の一部又は全部がヒト肝細胞で置換された継代移植キメラげっ歯類動物を含む、ヒト単純性脂肪肝モデル。
また、通常飼料を与えたヒト肝細胞キメラげっ歯類動物は、単純性脂肪肝は有するが、NASHに進展しないため、本発明のヒトNASH動物モデルは、この単純性脂肪肝を有するヒト肝細胞キメラげっ歯類動物をコントロール動物として用いることができる。なお、初代キメラげっ歯類動物が単純性脂肪肝の症状を呈することは、本発明者らが見出し、特許文献1に報告しているが、継代移植キメラげっ歯類動物が単純性脂肪肝の症状を呈することは、本発明で見出したことである。
このように、本発明のヒトNASH動物モデルは、再現性高くヒトNASH病態を形成し、コントロール動物と比較できる点において、特許文献1で報告したヒト肝細胞キメラげっ歯類動物を用いたNASHモデルよりも優れたモデルといえる。
これらのことから、本発明のモデルは、ヒトNASHの病態を正確に反映した病態モデル動物として、NASHの発症メカニズムの研究やその予防又は治療剤のスクリーニングなどに好適に使用できる。
本発明のヒト非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)モデルの作製方法は、肝細胞の一部又は全部がヒト肝細胞で置換されたキメラげっ歯類動物を、(a)コリン又はその塩の配合量が0.01重量%以下、(b)メチオニンの配合量が0.5重量%以下、及び(c)脂肪含有量が25 kcal%以上、からなる群より選ばれる少なくとも1の特性を有する調整飼料で飼育する工程を含む方法である。
肝細胞の一部又は全部がヒト肝細胞で置換されたキメラげっ歯類動物は、免疫不全肝障害げっ歯類動物にヒト肝細胞を移植することにより作製できる(初代キメラ動物)。また、継代移植キメラげっ歯類動物は、初代キメラげっ歯類動物の体内で増殖したヒト肝細胞を上記の免疫不全肝障害げっ歯類動物と同種の免疫不全肝障害げっ歯類動物に移植することにより得ることができる。キメラげっ歯類動物体内で増殖したヒト肝細胞の移植は、1回又は複数回行うことができる。
げっ歯類動物としては、マウス、ラットのようなネズミ、モルモット、リス、ハムスターなどが挙げられるが、実験動物として汎用されているマウス、ラットのようなネズミが使用し易い。
雄、雌の何れでもよいが、雄が好ましい。
免疫不全肝障害げっ歯類動物は、異種動物由来の細胞に対して拒絶反応を示さない免疫不全であるとともに、そのげっ歯類動物本来の肝臓の細胞が障害を受けている動物である。その動物本来の細胞が障害を受けていることにより、ヒト肝細胞を移植すれば、その肝機能は移植されたヒト肝細胞によって保たれ、ヒト肝細胞の個体内機能を正確に反映した動物となる。また、移植するヒト肝細胞が増殖し易くなる。
遺伝的免疫不全肝障害動物としては、肝障害遺伝子及び免疫不全遺伝子が、それぞれホモまたはヘテロ接合体である動物を用いることができる。
免疫不全肝障害動物の性別は特に限定されない。また、移植時の免疫不全肝障害動物の日齢は、特に限定されないが、マウスが低週齢のときにヒト肝細胞を移植すると、マウスの成長とともにヒト肝細胞がより活発に増殖することができる点で、生まれた直後〜6週齢程度の動物を使用するのが好ましい。
移植後の動物を、常法により、飼育すればよい。例えば移植後3〜30週間程度飼育することにより、肝細胞の一部又は全部がヒト肝細胞で置換された初代キメラ動物が得られる。
回収された肝細胞の中には、キメラ動物体内で増殖したヒト肝細胞の他、肝非実質細胞や、レシピエント動物の肝細胞も少量含まれる。従って、回収した肝細胞をそのまま移植に使用してもよいが、ヒト肝細胞あるいはレシピエント動物肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いてヒト肝細胞の純度を上げることもできる。
初代キメラ動物から分離したヒト肝細胞のげっ歯類動物の肝臓への移植、増殖方法は、初代キメラ動物の作製と同様である。
本発明で使用する調整飼料がコリン又はその塩の配合量を抑えたものである場合、コリン又はその塩の配合量は、調整飼料の全量に対して(即ち、最終濃度が)、0.01重量%以下が好ましく、0.001重量%以下がより好ましく、コリン又はその塩を配合しない、又は実質的に配合しないことが最も好ましい。これにより、NASH症状を十分に誘発することができる。また、コリン又はその塩を配合しなくても、生育に支障はない。
ここでいうコリン又はその塩の配合量は、飼料へのコリン又はその塩の添加量である。げっ歯類動物を飼育するための飼料中の素材が本来微量のコリン又はその塩を含む可能性はあるが、その含有量は、通常、無視できる。
コリンは、下記式(1)
コリン塩としては、それには限定されないが、塩化物、水酸化物、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、炭酸塩、炭酸水素塩、硫酸塩のような無機塩;酒石酸塩、酒石酸水素塩(重酒石酸塩)、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩のような有機酸塩に代表される有機塩が挙げられる。調整飼料中では、コリンは、通常、塩として存在する。
ここでいうメチオニン配合量は、飼料へのメチオニンの添加量である。げっ歯類動物を飼育するための飼料中の素材が本来微量のメチオニンを含む可能性はあるが、その含有量は、通常、無視できる。また、ペプチドを構成するメチオニンは、ここでいうメチオニン配合量に含まない。
植物性油脂としては、それには限定されないが、コーン油、大豆油、ゴマ油、菜種油、米油、糠油、椿油、ベニバナ油、ヤシ油、綿実油、ひまわり油、エゴマ油、アマニ油、オリーブ油、落花生油、アーモンド油、アボガド油、ヘーゼルナッツ油、ウォルナッツ油、グレープシード油、カカオ脂、ピーナッツバターなどが挙げられる。動物性油脂としては、鯨油、鮫油、肝油、馬油、豚脂、牛脂、馬脂、乳脂、それらの硬化油脂などが挙げられる。
ヒト肝細胞置換率は、例えば、キメラ動物の肝臓切片を作製し、染色(例えば、ヘマトキシリン・エオジン染色)してヒト肝細胞の面積比を測定するか、又はヒト肝細胞特異的な抗体(例えば、サイトケラチン8/18抗体又はSTEM121抗体)を用いて免疫染色を行い、ヒト肝細胞面積比(ヒトサイトケラチン8/18又はSTEM121陽性面積比)を測定することにより求めることができる。キメラ動物の肝臓切片を肝臓の全7葉から採取し、ヒト肝細胞面積比の平均値を求めることで、ヒト肝細胞置換率を正確に把握できる。外側右葉切片のヒト肝細胞置換率は、全7葉の切片のヒト肝細胞置換率の平均値と相関性が高いため、外側右葉切片を用いてヒト肝細胞置換率を求めることもできる。
また、ヒト肝細胞置換率は、キメラ動物の血中ヒトアルブミン濃度を測定し、予め作成しておいた検量線に当て嵌めることにより推定することもできる。
また、調整飼料の投与期間は、1週間以上、2週間以上、3週間以上、又は4週間以上とすることができる。また、40週間以下、30週間以下、20週間以下、又は10週間以下とすることができる。この範囲であれば、十分にNASH症状を誘発することができる。
上記のようにしてヒトNASH症状を呈するヒト肝細胞キメラげっ歯類動物が得られ、この動物は、ヒトNASHモデル(ヒトNASHげっ歯類動物モデル)として使用することができる。
ヒトNASHは、ヒトのアルコール性肝疾患以外の脂肪蓄積性の肝疾患(非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD))の中でも、肝臓において、少なくとも脂肪滴の沈着、炎症性細胞浸潤、及び線維化の症状を示す疾患をいう。
ALT活性値の測定では、マウス肝細胞由来のALTかヒト肝細胞由来のALTかを区別できないが、ALT活性値の測定に加えて、ヒトALT1濃度をELISAなどにより測定すれば、ALT中に占めるヒト肝細胞由来のALTの比率を把握することができる。
本発明のヒトNASHの予防、治療、又は改善剤のスクリーニング方法は、上記説明した本発明のヒトNASHげっ歯類動物モデルに被験物質を投与する工程と、被験物質投与前後のNASH症状の程度を比較するか、又は被験物質の投与群と非投与群との間でNASH症状の程度を比較する工程とを含む方法である。
これらの症状が緩和又は改善されていれば、その被験物質はヒトNASHの治療又は改善に有効であると判定することができる。何れかのNASH症状が有意に緩和又は改善されていれば、その被験物質はヒトNASHの治療又は改善に有効であると判定することができるが、1.3倍以上、1.5倍以上、又は2倍以上の緩和又は改善を指標とすることもできる。また、疾患の治療又は改善に有効な薬剤は、通常、その疾患の予防にも有効であるため、このような被験薬剤は、ヒトNASHの予防にも有効であると判定することができる。
被験物質の投与経路は、特に制限されず、経口投与、腹腔内投与、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、経皮投与などが挙げられる。
被験物質の投与量、及び投与回数などの投与スケジュールは、効果の有無を判定できるように、被験物質ごとに定めることができる。
被験物質を投与した後、例えば1〜8週間後に、NASH症状の程度を確認し、非投与群のNASH症状の程度と比較することができる。或いは、被験物質の投与前後でNASH症状の程度を比較することもできる。
(1)初代ヒト肝細胞キメラマウスの作製
免疫不全肝障害マウスの作製
レシピエント動物として使用したuPA-Tg(+/+)/SCID(+/+)マウスは、株式会社フェニックスバイオにて繁殖させたものを用いた。このマウスは、下記方法により作製したものである。
uPA遺伝子は、マウス肝臓からAGPC法(acid-guanidinium-isothiocyanate-phenol-chloroform)で全RNAを抽出し、RNase-free水に溶解した。前記で得た全RNAを用いて、公開されたデータベースに登録されるuPA遺伝子の配列(アクセッション番号:NM008873より作成したuPA遺伝子特異的プライマー(1341番塩基から1360塩基長のアンチセンス配列)及びLongRange Reverse Transcriptase(Qiagen社製)による逆転写反応を、25℃にて10分間、次いで、42℃にて90分間行い、逆転写酵素不活化処理を85℃にて5分間行った後、RNaseH(Invitrogen社製)を添加して37℃にて20分間処理してmRNAを消化し、cDNAのみを残存させた。合成されたcDNAをPCR反応の鋳型としてPCRを行った。上記反応液を全量の1/10添加し、酵素はPhusion DNA polymerase(Fynnzymes社製)を用いた。PCRプライマー(39番塩基から61塩基長のセンス配列)は、uPA遺伝子配列(アクセッション番号:NM008873)より作製した。増幅される断片は、PCR反応では塩基番号39-1360の長さである。得られたDNA断片を後述のマウスアルブミンプロモーター/エンハンサーを持った発現プラスミドに導入し「mAlb uPAInt2」を構築した。「mAlb uPAInt2」は、マウスアルブミンのエンハンサー/プロモーターの下流にラビットβグロビンの第2エキソン、イントロン、第3エキソン・マウスuPAのORF部分・ラビットβグロビンの第3エキソン中のpolyAシグナルを結合したものである。
遺伝子導入後5日目から、以下のようにして、出現したG418耐性コロニーを24穴のプレートに継代した。即ち、ピペットマン(ギルソン)を用いてG418耐性コロニーを150 μLのトリプシン/EDTA溶液を含む96穴のマイクロプレートに移し換え、20分間37℃のインキュベーター内で処理した後、ピペットマンでピペッティングすることによって単一細胞にした。この細胞懸濁液を24穴のプレートに移し換え培養を継続した。2日後、24穴のプレート上の細胞を凍結保存用とDNA抽出用の2つに分割した。即ち、細胞にトリプシン/EDTAを500 μL加えて20分間37℃のインキュベーター内で処理し、ES培地を500 μL加えてピペットマンで静かにピペッティングすることによって単一細胞にした。その後、1 mLのES培地の入った24穴プレートに細胞懸濁液の半分を移し、元の24穴プレートにもES培地を1 mL加えた。さらに2日後、片方の24穴プレートの培地を抜いてから、ES培地に終濃度が10%の牛胎児血清と終濃度が10%のジメチルスルホキシド(DMSO)(Sigma社 D-5879)を添加した凍結用培地を1 mL入れて、シールした後-70℃で凍結保存した。
使用したPCRプライマーはラビットβグロビン中に設定した。配列は、センスプライマー:GGGCGGCGGTACCGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAG(配列番号1)、アンチセンスプライマー:GGGCGGCGGTACCAATTCTTTGCCAAAATGATGAGA(配列番号2)である。反応はAmpliTaqGold(ABI社)の添付方法に従って行った。95℃で9分間かけて酵素を活性化した後に94℃にて30秒間(変性)、63℃にて30秒間(アニーリング)、72℃にて1分間(伸長)の反応を40回繰り返した。終了後反応液を2%アガロースゲルで泳動してPCRプロダクトの確認を行った。
遺伝子導入が確認されたES細胞クローンについて、C57BL/6J系マウスの胚盤胞をホスト胚としてキメラ胚を作製し、それを偽妊娠マウスの子宮角に移植して産仔を得た。ホスト胚の採取は、妊娠3日目に、100 μMトリプシン/EDTAを添加したWhitten’s培地で、卵管と子宮を灌流することによって行った。8細胞期胚または桑実胚を24時間Whitten’s培地で培養し、得られた胚盤胞を注入に用いた。注入に用いたES細胞は、継代してから2あるいは3日目にTE処理により分散させ、顕微操作に供するまで4℃で静置した。ES細胞の注入用ピペットとしては、Sutter社製のglass capillary tubing(内径約20 μm)を用いた。胚保定用ピペットとしては、外径1mmの微小ガラス管(NARISHIGE)を微小電極作製器(Sutter社P-97/IVF)を用いて細く引き延ばした後、マイクロフォージ(De Fonburun)を用いて外径50〜100 μmの部分で切断し、さらに口径を10〜20 μmに加工したものを用いた。注入用ピペットと保定用ピペットは、ピエゾシステム(プライムテックPAMS-CT150)を接続したマイクロマニピュレーター(Leica)に接続した。顕微操作に用いたチャンバーとしては、穴あきスライドグラスにカバーグラスを蜜蝋で接着したものを用い、その上に約10 μLの0.3% BSAを加えたHepes-buffered Whitten’s培地のドロップを2個置き、上面をミネラルオイル(シグマ)で覆った。一方のドロップには、約100個のES細胞を入れ、他方には拡張胚盤胞を20個程度入れ、胚1個あたり約15個のES 細胞を注入した。顕微操作はすべて、倒立顕微鏡下で行った。操作胚は、偽妊娠2日目のICR系受容雌の子宮角に移植した。分娩予定日に至っても産仔を娩出しなかった受容雌については、帝王切開を施し、里親に哺育させた。C57BL/6J系マウスの胚盤胞に、45クローンのES細胞を注入した結果、39クローンにおいて雄キメラマウスが得られた。
フォワードプライマー
5’-GGGCGGCGGTACCGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAG-3’(配列番号3)
リバースプライマー
5’-GGGCGGCGGTACCAATTCTTTGCCAAAATGATGAGA-3’(配列番号4)
また、SCID (+/+)、SCID (+/-)とSCID(-/-)の識別は、PCR-RFLP法により行った。
uPA-Tg(+/+)/SCID(+/+)マウスとSCID/c.b-17マウス(日本チャールスリバー)を掛け合わせ、uPA-Tg(+/-)/SCID(+/+)マウスを得た。uPA-Tg(+/+)/SCID(+/+)マウスを初代用の移植に、uPA-Tg(+/-)/SCID(+/+)マウスを継代用のホストマウスとして用いた。
ヒト肝細胞としては、BD Gentest社より購入した肝細胞(Lot No.BD195、女児、2才)及びBioIVT社より購入した肝細胞(Lot No. IVTJFC、男児、1才)を、それぞれ使用した。これらの凍結肝細胞は「Chise Tateno, Yasumi Yoshizane, Naomi Saito, Miho Kataoka, Rie Utoh, Chihiro Yamasaki, Asato Tachibana, Yoshinori Soeno, Kinji Asahina, Hiroshi Hino, Toshimasa Asahara, Tsuyoshi Yokoi, Toshinori Furukawa, Katsutoshi Yoshizato: Near-completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am J Pathol 165:901-912, 2004」に記載の方法に従って融解して用いた。
移植後、普通飼料であるCRF-1(オリエンタル酵母株式会社)、次亜塩素酸ナトリウム溶液0.0125%添加水道水の自由摂取により約100日間飼育した。
初代キメラマウスの肝臓組織をコラゲナーゼ処理することによりヒト肝細胞を多く含む細胞を回収した。生後3〜5週齢のuPA-Tg(+/-)/SCID(+/+)マウスに、初代キメラマウスから分離した肝細胞1×106個を脾臓から移植した。移植方法は初代キメラマウスへのヒト肝細胞移植と同様である。
移植後、CRF-1(オリエンタル酵母株式会社)、次亜塩素酸ナトリウム溶液0.0125%添加水道水の自由摂取により約100日間飼育した。
得られた継代移植キメラマウスの肝臓におけるヒト肝細胞の置換率は、90〜97%であった。
(3-1)継代移植ヒト肝細胞キメラマウス
血中ヒトアルブミン濃度・血清中ALT活性
前述した通り、肝細胞が障害を受けると、細胞質内の酵素が細胞外に漏出して血液内に入る。ALTは肝臓に最も多く含まれるため、血液中のALT活性の上昇は肝障害の指標となる。また、アルブミンは肝臓で生産されて血液中に存在するため、肝臓が障害を受けると血液中のアルブミン濃度が低下する。従って、血液中のアルブミン濃度の低下は肝障害の指標となる。
試験開始前、2週間後、4週間後、8週後、及び12週後に、それぞれ調整飼料及び普通飼料で飼育した継代移植キメラマウスの尾静脈から採血し、採取した血液2 μlを生理的食塩水200 μLに添加し、ラテックス凝集免疫比濁法(LZテスト’栄研’U-ALB、栄研化学株式会社、東京)を用いて、自動分析装置BioMajestyTM(JCA-BM6050、JEOL、東京)で血中ヒトアルブミン濃度(mg/ml)を測定した。
ヒト肝細胞Lot No.BD195を移植した継代移植キメラマウスの結果を図1に示す。調整飼料を与えることにより、血中ヒトアルブミン濃度が顕著に減少し、ヒト肝細胞の機能低下を誘発したことがわかる。
ヒト肝細胞Lot No.BD195を移植した継代移植キメラマウスのALT活性の経時的変化を図2に示す。調整飼料で飼育することにより、マウスALT活性は増大しなかったが、ヒトALT活性は2週間後、4週間後で増大し、全ALT活性と並行して推移することが分かった。調整飼料で飼育することにより、ヒト肝細胞に特異的に肝障害が誘発されたことが分かる。
「(2)継代移植ヒト肝細胞キメラマウスの作製」の項目で得た継代移植ヒト肝細胞キメラマウスを、コリン欠乏メチオニン減量高脂肪飼料(CDAHFD)である(超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料・A06071302)(Research Diets, Inc)又は普通飼料であるCRF-1(オリエンタル酵母株式会社)と、次亜塩素酸ナトリウム溶液0.0125%添加水道水の自由摂取により12週間飼育した。
試験開始2週間後、4週間後、8週後、及び12週後に、継代移植キメラマウスの肝臓のパラフィン切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン(HE)染色を行った。ヒト肝細胞Lot No.BD195を移植した継代移植キメラマウスについての倍率40倍の組織像を図3に示す。普通飼料で飼育した場合に比べて、調整飼料で飼育した場合は、2週間後、4週間後において脂肪滴、特に大滴性の脂肪滴が著しく増加した。
ヒト肝細胞Lot No.BD195を移植した継代移植キメラマウスについてのシリウスレッド染色した組織切片上の全面積あたりのシリウスレッド陽性領域(線維化領域)を算出した。結果を図8に示す。調整飼料で飼育することにより、普通飼料で飼育した場合に比べて、線維化された部分が8週後では約1.6倍に増加し、12週後では約2.4倍に増加していることが分かる。
「(1)初代ヒト肝細胞キメラマウスの作製」の項目で得た、ヒト肝細胞Lot No.IVTJFCを移植した初代ヒト肝細胞キメラマウスを、コリン欠乏メチオニン減量高脂肪飼料(CDAHFD)である(超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料・A06071302)(Research Diets, Inc)又は普通飼料であるCRF-1(オリエンタル酵母株式会社)と、次亜塩素酸ナトリウム溶液0.0125%添加水道水の自由摂取により12週間飼育した。
試験開始12週後に、初代移植キメラマウスの肝臓のパラフィン切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン(HE)染色を行った。倍率400倍の組織像を図13に示す。調整飼料で飼育した場合は、普通飼料で飼育した場合と異なり、マクロファージ等の炎症細胞浸潤(矢印)が観察され、細胞質にMallory小体様の構造物を有するBallooning細胞(肝細胞の風船様腫大)(矢頭)が観察された。調整飼料を長期投与することにより、ヒトNASHに特徴的な病変が誘発されたことが分かる。
CCl4は肝臓に障害を誘発することが知られている。同用量のCCl4が肝臓に及ぼす影響を、継代移植ヒト肝細胞キメラマウスと、普通のマウスとの間で比較した。肝障害の指標として、血漿中のALT活性の上昇を測定した。
また、10-12週齢の雄のSCIDマウスを3匹用意し、同様にして、CCl4の経口投与、採血、全ALT活性測定を行った。また、コントロールとして、SCIDマウス3匹を、CCl4を投与せずに8日間飼育し、2日後、4日後、及び8日後に、同様にして、採血、全ALT活性測定を行った。
図3および図4の左に示すように、通常飼料で飼育した継代移植キメラマウスは単純性脂肪肝の病態を示す。また本試験で示されているように、長期間通常飼料で飼育しても、継代移植キメラマウスは単純性脂肪肝からNASHに進行しない。従って、継代移植キメラげっ歯類動物は、ヒト単純性脂肪肝のモデルとして使用できると共に、本発明のNASHモデルのコントロール動物として使用することができる。
Claims (13)
- 肝細胞の一部又は全部がヒト肝細胞で置換されたキメラげっ歯類動物を、下記(a)、(b)、及び(c)の1以上の特性を有する調整飼料で飼育することにより得られる動物を含む、ヒト非アルコール性脂肪性肝炎モデル。
(a)コリン又はその塩の配合量が、調整飼料の全量に対して、0.01重量%以下
(b)メチオニンの配合量が、調整飼料の全量に対して、0.5重量%以下
(c)脂肪含有量が、調整飼料に含まれるタンパク質、炭水化物、及び脂肪の合計熱量に対して、25 kcal%以上 - キメラげっ歯類動物が初代キメラげっ歯類動物、又は継代移植キメラげっ歯類動物である請求項1に記載のヒト非アルコール性脂肪性肝炎モデル。
- 調整飼料で1週間以上飼育する請求項1又は2に記載のヒト非アルコール性脂肪性肝炎モデル。
- 肝細胞の一部又は全部がヒト肝細胞で置換されたキメラげっ歯類動物を、下記(a)、(b)、及び(c)の1以上の特性を有する調整飼料で飼育することにより得られる動物を、ヒト非アルコール性脂肪性肝炎モデルとして使用する方法。
(a)コリン又はその塩の配合量が、調整飼料の全量に対して、0.01重量%以下
(b)メチオニンの配合量が、調整飼料の全量に対して、0.5重量%以下
(c)脂肪含有量が、調整飼料に含まれるタンパク質、炭水化物、及び脂肪の合計熱量に対して、25 kcal%以上 - キメラげっ歯類動物が初代キメラげっ歯類動物、又は継代移植キメラげっ歯類動物である請求項4に記載の方法。
- 調整飼料で1週間以上飼育する請求項4又は5に記載の方法。
- 肝細胞の一部又は全部がヒト肝細胞で置換されたキメラげっ歯類動物を、下記(a)、(b)、及び(c)の1以上の特性を有する調整飼料で飼育する工程を含む、ヒト非アルコール性脂肪性肝炎モデルの作製方法。
(a)コリン又はその塩の配合量が、調整飼料の全量に対して、0.01重量%以下
(b)メチオニンの配合量が、調整飼料の全量に対して、0.5重量%以下
(c)脂肪含有量が、調整飼料に含まれるタンパク質、炭水化物、及び脂肪の合計熱量に対して、25 kcal%以上 - キメラげっ歯類動物が初代キメラげっ歯類動物、又は継代移植キメラげっ歯類動物である請求項7に記載の方法。
- 調整飼料で1週間以上飼育する請求項7又は8に記載の方法。
- 肝細胞の一部又は全部がヒト肝細胞で置換されたキメラげっ歯類動物を、下記(a)、(b)、及び(c)の1以上の特性を有する調整飼料で飼育する工程を含む方法により得られる動物に被験物質を投与する工程と、投与前後の非アルコール性脂肪性肝炎の症状の程度を比較するか、又は被験物質を投与したキメラげっ歯類動物と被験物質を投与していないキメラげっ歯類動物との間で非アルコール性脂肪性肝炎の症状の程度を比較する工程とを含む、ヒト非アルコール性脂肪性肝炎治療剤のスクリーニング方法。
(a)コリン又はその塩の配合量が、調整飼料の全量に対して、0.01重量%以下
(b)メチオニンの配合量が、調整飼料の全量に対して、0.5重量%以下
(c)脂肪含有量が、調整飼料に含まれるタンパク質、炭水化物、及び脂肪の合計熱量に対して、25 kcal%以上 - キメラげっ歯類動物が初代キメラげっ歯類動物、又は継代移植キメラげっ歯類動物である請求項10に記載の方法。
- 調整飼料で1週間以上飼育する請求項10又は11に記載の方法。
- 肝細胞の一部又は全部がヒト肝細胞で置換された継代移植キメラげっ歯類動物を含む、ヒト単純性脂肪肝モデル。
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