JP5868403B2

JP5868403B2 - 体重調節作用を有する物質をスクリーニングするための方法

Info

Publication number: JP5868403B2
Application number: JP2013521622A
Authority: JP
Inventors: 中島　利博; 利博中島
Original assignee: 中島　利博; 利博中島
Priority date: 2011-06-22
Filing date: 2012-06-22
Publication date: 2016-02-24
Anticipated expiration: 2032-06-22
Also published as: JPWO2012176860A1; EP2725106A1; WO2012176860A1; CN103635588A; EP2725106B1; RU2603745C2; CN103635588B; RU2014101723A; HK1197269A1; EP2725106A4; US20140127705A1; US9429567B2

Description

本発明は、体重調節作用を有する物質をスクリーニングするための方法に関する。

シノビオリンは、リウマチ患者由来滑膜細胞で過剰発現している膜タンパク質として発見されたタンパク質である（特許文献１）。そして、遺伝子改変動物を用いた研究により、シノビオリンは関節リウマチの発症に必須の分子であることが判明した。

タンパク質構造予測システムにより、シノビオリンはRING fingerモチーフを有することが示唆されている。このモチーフはタンパク質のユビキチン化に重要な役割を果たすＥ３ユビキチンライゲースという酵素に多く見出されているが、実際、シオビオリンがＥ３ユビキチンライゲースの特徴のひとつである自己ユビキチン化活性を有することが証明されている（特許文献１）。しかし、シノビオリンのインビボでの機能の多くは不明である。より具体的には、シノビオリン遺伝子の破壊が、体重減少を引き起こすことについては、何らの報告もない。

肥満は、運動不足や習慣的な過食、あるいは遺伝的原因や内分泌疾患による代謝傷害などによって引き起こされる。肥満は、心筋梗塞や動脈硬化など種々の成人病を誘発するリスクファクターとなり、それらの疾患を悪化させる要因ともなることから、早期の治療や予防が非常に重要である。肥満の薬物療法には、従来、ホルモン剤や代謝促進剤などが用いられているが、安全に体重を減少させ、あるいは体重増加を抑制することができる薬物はほとんど知られていない。

国際公開第０２／０５２００７号パンフレット

以上の現状により、体重調節作用を有する物質の開発が望まれている。

発明者は、シノビオリン遺伝子のコンディショナルノックアウトマウスを用いて、シノビオリン遺伝子の破壊が、体重減少を引き起こすことを、初めて見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］被検物質をシノビオリン遺伝子発現細胞に接触させること、及び被検物質が、シノビオリン遺伝子の発現に影響するか否かを確認することを含む、体重調節作用を有する物質をスクリーニングするための方法。
［２］シノビオリン遺伝子の発現への影響が、シノビオリン遺伝子の発現抑制又は発現タンパク質の不活性化である、［１］に記載の方法。
［３］シノビオリン遺伝子の発現への影響が、シノビオリン遺伝子の発現促進又は発現タンパク質の活性化である、［１］に記載の方法。
［４］シノビオリン遺伝子の転写産物に相補する２０〜２５の連続する塩基配列からなる核酸であって、シノビオリン遺伝子の発現を抑制する核酸を含む、体重調節のための医薬組成物。
［５］シノビオリンタンパク質のユビキチン化活性阻害剤を含む、体重調節のための医薬組成物。
［６］被検物質をシノビオリン遺伝子発現細胞に接触させること、及び被検物質が、シノビオリン遺伝子の発現に影響するか否かを確認することを含む、脂肪組織量調節作用を有する物質をスクリーニングするための方法。
［７］シノビオリン遺伝子の発現への影響が、シノビオリン遺伝子の発現抑制又は発現タンパク質の不活性化である、［６］に記載の方法。
［８］シノビオリン遺伝子の発現への影響が、シノビオリン遺伝子の発現促進又は発現タンパク質の活性化である、［６］に記載の方法。
［９］シノビオリン遺伝子の転写産物に相補する２０〜２５の連続する塩基配列からなる核酸であって、シノビオリン遺伝子の発現を抑制する核酸を含む、脂肪組織量調節のための医薬組成物。
［１０］シノビオリンタンパク質のユビキチン化活性阻害剤を含む、脂肪組織量調節のための医薬組成物。
［１１］被検物質をシノビオリン遺伝子発現細胞に接触させること、及び被検物質が、シノビオリン遺伝子の発現に影響するか否かを確認することを含む、脂肪細胞分化誘導調節作用を有する物質をスクリーニングするための方法。
［１２］シノビオリン遺伝子の発現への影響が、シノビオリン遺伝子の発現抑制又は発現タンパク質の不活性化である、［１１］に記載の方法。
［１３］シノビオリン遺伝子の発現への影響が、シノビオリン遺伝子の発現促進又は発現タンパク質の活性化である、［１１］に記載の方法。
［１４］シノビオリン遺伝子の転写産物に相補する２０〜２５の連続する塩基配列からなる核酸であって、シノビオリン遺伝子の発現を抑制する核酸を含む、脂肪細胞分化誘導調節のための医薬組成物。
［１５］シノビオリンタンパク質のユビキチン化活性阻害剤を含む、脂肪細胞分化誘導調節のための医薬組成物。

本発明の方法によって、新規の体重調節作用を有する物質を提供することができる。

遺伝子ターゲッティングベクターの設計図である。飼育日数による体重の変化である。飼育日数による生存率の変化である。シノビオリン遺伝子ノックアウトマウスおよび対照マウスの、タモキシフェン投与後１６日目の脂肪組織病理切片である。（１）白色脂肪組織、（２）褐色脂肪組織。３Ｔ３−Ｌ１細胞株の脂肪細胞分化誘導に対する、シノビオリン遺伝子抑制の影響である。○：分化した脂肪細胞、□：正常な脂肪細胞ではない脂肪滴。

本発明で用いる被検物質は、任意の物質を使用することができる。被検物質の種類は特に限定されず、低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、合成ペプチドでもよい。あるいは、被検物質は、また化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーから選択することができる。

本発明において、体重調節作用とは、処置の前後で、体重を有意差をもって変化させることを意味する。体重調節作用は、例えば脂肪組織量調節や脂肪細胞分化誘導調節を通して作用する。

シノビオリンは、小胞体関連分解で機能するＥ３ユビキチンライゲースであり、哺乳動物に普遍的に存在する。また、シノビオリンの塩基配列は、公知のデータベースより取得可能である。例えば、ヒトのシノビオリンのAccession Numberは、AB024690である。

シノビオリン遺伝子のノックアウトマウスとは、シノビオリン遺伝子領域の配列が人為的に改変されたことによって、その正常な発現が阻害されていること、その結果、生体においてシノビオリンが正常に機能していないことを意味する。

また、シノビオリン遺伝子は、一部又は全部を改変又は欠損することができる。ここで、「全部」とは、シノビオリンゲノムＤＮＡのエクソン１の５'端から最後のエクソンの３'端までの領域をいう。また、「一部」とは、この領域の一部であって、シノビオリン遺伝子の正常な発現を阻害するのに必要な長さの領域をいう。
さらに、「改変」とは、単一または複数のヌクレオチドを置換、欠失、挿入、及び／又は転位させることにより、ゲノムＤＮＡ中の対象領域の塩基配列を他の塩基配列に改変することをいう。

シノビオリン遺伝子の一部又は全部を改変又は欠損しているノックアウト動物は、公知の方法で作製することができる。例えば、下記実施例の記載のように遺伝子ターゲッティング法を用いて作製することができる。同方法において、シノビオリン遺伝子のエクソン１の少なくとも開始コドンを含む領域を相同組換えにより他の塩基配列に置換することにより、シノビオリンの正常な発現を阻害できる。また、本発明のスクリーニング方法に用いるノックアウト動物は、同方法によって作製されたノックアウト動物のみならず、さらにその子孫をも含む。

本発明のノックアウト動物の対象となる動物は、非ヒト動物であり、特に限定されない。例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどの哺乳動物が例示される。これらのうち、実験動物として用いるには、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットが好ましく、なかでも齧歯目がさらに好ましく、近交系が多数作出されており、受精卵の培養、体外受精等の技術を考慮するとマウス及びラットが、特に好ましい。

ターゲッティングベクター構築のため、対象となる動物のシノビオリン遺伝子の一部を単離する。例えば、ノックアウトマウスを作製する場合は、マウスのゲノムＤＮＡライブラリーからシノビオリン遺伝子をスクリーニングする。得られたゲノムＤＮＡクローンを用いて、相同組換えのためのターゲッティングベクターを構築する。ゲノムＤＮＡクローンは遺伝子全長である必要はなく、シノビオリン遺伝子を破壊し、そしてシノビオリンの発現を抑制するために必要な領域のみクローニングすればよい。また、ターゲッティングベクターは、公知の方法により作製することができ、例えば市販のプラスミドをバックボーンとして、上記ゲノムＤＮＡクローン、ポジティブセレクション用のマーカー及びネガティブセレクション用のマーカーなどの各フラグメントを適切に連結することにより作製することができる。

上記方法により作製したターゲッティングベクターを、受精卵、初期胚、又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などの個体形成能（分化全能性）をもつ細胞にエレクトロポレーション法等により導入し、その後、目的とする相同組換えが起こった細胞を選別する。選別は、ポジティブ−ネガティブ選択法により薬剤を用いて選択できる。選択後、目的とする相同組換えが起こった細胞を、サザンブロットやＰＣＲ法などによって確認する。最終的に所望の相同組換えが確認された細胞を、妊娠中の輸卵管または子宮から採取された８細胞期胚または胚盤胞（ブラストシスト）に導入する。

上記８細胞期胚または胚盤胞を常法に従い仮親に移植する。仮親から生まれた生殖系列キメラ動物（好ましくは雄）と、野生型JLP遺伝子をホモで持つ野生型動物（好ましくは雌）とを交配させることにより、第１世代（Ｆ１）として、相同染色体上の一方のJLP遺伝子が相同組換えにより破壊されたヘテロ接合体を得ることができる。さらに、これらヘテロ接合体同士を交配させることにより、第２世代（Ｆ２）として、相同染色体上の双方のJLP遺伝子が破壊されたホモ接合体、即ち本発明のJLPノックアウト動物を得ることができる。ホモ接合体の同定は、体の一部（例えば尻尾）を切断し、ＤＮＡを抽出してサザンブロットやＰＣＲ法などによって遺伝子型を調べればよい。

以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

本実施例のシノビオリンノックアウトマウスの作製に使用した遺伝子ターゲッティングベクターの設計図を図１に示した。図中、上から順に、正常のシノビオリン遺伝子（Wild allele）、シノビオリンノックアウトマウス作製のためのターゲッティングベクター（Targeting Vector）、相同組換えを起こしたアレル（Targeted
allele）、ｌｏｘＰ配列が導入されたアレル（Flox Allele）、ｌｏｘＰ−Ｅｘｏｎ２〜１４−ｌｏｘＰが除去されたアレル（Deleted Allele）の構造をそれぞれ模式的に示す。

マウスシノビオリン遺伝子のエクソン１の上流からエクソン１６の下流の領域である１４．８ｋｂの遺伝子領域をターゲッティングベクター構築のために使用した。ＦＲＴ配列で挟んだＮｅｏ耐性遺伝子をエクソン１とエクソン２との間に挿入した。また、エクソン２の上流及びエクソン１４の下流にｌｏｘＰ配列を導入した。

上記ターゲッティングベクターを、ＥＳ細胞に導入した。目的の相同組換えが起こったアレルを有するクローンを、Ｃｒｅ処理によるｌｏｘＰ−エクソン−ｌｏｘＰ配列の除去及びＦＬＰ処理によるＦＲＴ−ネオマイシン−ＦＲＴの除去をＰＣＲ産物の長さで確認することによって、選抜した。

相同組換えが起こった上記ＥＳ細胞のクローンを、公知の方法（たとえば、EMBO J 16:1850-1857）のとおりに、マウス胚に導入することにより、キメラマウスを得た。さらに、このキメラマウスを野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスと交配させ、ネオマイシン配列が除去されたマウスを獲得した。また、ターゲッティングベクターに組み込まれているエクソン−Long arm間のｌｏｘＰ配列は、相同組換え時に欠損している可能性があるため、その存在をＰＣＲで確認した。

得られたネオマイシン除去マウスをＣＡＧ−ＣｒｅＥＲマウスと掛け合わせ、ＣＡＧ−ＣｒｅＥＲｓｙｎｏ^{ｆｌ／ｆｌ}マウスを得た。

得られたＣＡＧ−ＣｒｅＥＲｓｙｎｏ^{ｆｌ／ｆｌ}マウスにタモキシフェンを投与し（２０ｍｇ／ｍｌ（コーンオイル）、５ｍｇ／４０ｇ体重、腹腔内投与、０〜４日の５日連続投与）、ｌｏｘＰ−エクソン−ｌｏｘＰの除去を誘導した（ＣＡＧ−ＣｒｅＥＲ（＋）ｓｙｎｏ^{ｆｌ／ｆｌ}）。対照として、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（溶媒対照、タモキシフェン投与）、（ＣＡＧ−ＣｒｅＥＲ（−）ｓｙｎｏ^{ｆｌ／ｆｌ}）（溶媒対照、タモキシフェン投与）の各群を設けた。

その結果、ＣＡＧ−ＣｒｅＥＲ（＋）ｓｙｎｏ^{ｆｌ／ｆｌ}タモキシフェン投与群では、飼育日数依存的に体重の減少が認められた。一方、いずれの対照群においても、体重の減少は、認められなかった（図２）。ＣＡＧ−ＣｒｅＥＲ（＋）ｓｙｎｏ^{ｆｌ／ｆｌ}タモキシフェン投与群では、飼育１８〜２０日に、全頭が死亡した（図３）。死亡例の剖検においては、腹腔内臓器及び胸腔内臓器で若干の死後変化が認められた。また、脾臓及び胆のうが小さく、通常は薄い黄色である胆汁が無色であった。皮下・腎臓周囲、精巣周囲の脂肪が極めて少なかった。

タモキシフェン投与後飼育１６日目のマウスの組織を、４％ホルムアルデヒドで固定し、パラフィンで包埋し、ミクロトームにより脂肪組織切片を作成した。

その結果、シノビオリンヘテロノックアウトマウス（ＣＡＧ−ＣｒｅＥＲ（＋）ｓｙｎｏ^ｆｌ／＋）と比較して、シノビオリンノックアウトマウス（ＣＡＧ−ＣｒｅＥＲ（＋）ｓｙｎｏ^{ｆｌ／ｆｌ}）においては白色脂肪組織、褐色脂肪組織の減少が認められた（図４）。

３Ｔ３−Ｌ１細胞をＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ，ＨｉｈｇＧｌｕｃｏｓｅ）でｃｏｎｆｌｕｅｎｔに達した後３日間培養した。５００μＭＩＢＭＸ、１μＭＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、５ μｇ／ｍｌＩｎｓｕｌｉｎを添加し分化を誘導した。同時に１０μＭＬＳ−１０２（シノビオリンのユビキチン化活性阻害剤）もしくはＤＭＳＯを添加した。３日間培養後、４μｇ／ｍｌＩｎｓｕｌｉｎを含む培地に置換し１０μＭＬＳ−１０２もしくはＤＭＳＯを添加した。３日間培養後、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ，ＨｉｈｇＧｌｕｃｏｓｅ）に置換し３日間培養した。ｓｉＲＮＡに関しては分化誘導２日前に２００ｐｍｏｌｓｉＲＮＡＳｙｎｏ７７０をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００により導入した。

ＯｉｌＲｅｄＯ染色
３Ｔ３−Ｌ１細胞をＰＢＳ（−）で洗ったのち、１０％ｆｏｒｍａｌｉｎで固定した。ＰＢＳ（−）で洗浄し６０％Ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌに置換した。１８ｍｇ／ｍｌＯｉｌＲｅｄＯ／Ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌで２０分染色し、６０％Ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ及びＰＢＳ（−）で洗浄し顕微鏡で観察した。

その結果、ＬＳ１０２またはｓｉＲＮＡＳｙｎｏ７７０でシノビオリン遺伝子の活性を阻害した細胞では、対照と比較して、分化した脂肪細胞が少なく、分化が抑制されていることが示唆された（図５）。また、輪環状の正常な脂肪細胞ではない脂肪滴が認められた。

本発明の方法は、体重調節作用を有する物質をスクリーニングするために有用である。

Claims

被検物質をシノビオリン遺伝子発現細胞に接触させること、及び被検物質が、シノビオリン遺伝子の発現に影響するか否かを確認することを含む、体重調節作用を有する物質をスクリーニングするための方法。
シノビオリン遺伝子の発現への影響が、シノビオリン遺伝子の発現抑制又は発現タンパク質の不活性化である、請求項１に記載の方法。
シノビオリン遺伝子の発現への影響が、シノビオリン遺伝子の発現促進又は発現タンパク質の活性化である、請求項１に記載の方法。
シノビオリン遺伝子の転写産物に相補する２０〜２５の連続する塩基配列からなる核酸であって、シノビオリン遺伝子の発現を抑制する核酸を含む、体重調節のための医薬組成物。
シノビオリンタンパク質のユビキチン化活性阻害剤を含む、体重調節のための医薬組成物。
被検物質をシノビオリン遺伝子発現細胞に接触させること、及び被検物質が、シノビオリン遺伝子の発現に影響するか否かを確認することを含む、脂肪組織量調節作用を有する物質をスクリーニングするための方法。
シノビオリン遺伝子の発現への影響が、シノビオリン遺伝子の発現抑制又は発現タンパク質の不活性化である、請求項６に記載の方法。
シノビオリン遺伝子の発現への影響が、シノビオリン遺伝子の発現促進又は発現タンパク質の活性化である、請求項６に記載の方法。
シノビオリン遺伝子の転写産物に相補する２０〜２５の連続する配列からなる核酸であって、シノビオリン遺伝子の発現を抑制する核酸を含む、脂肪組織量調節のための医薬組成物。
シノビオリンタンパク質のユビキチン化活性阻害剤を含む、脂肪組織量調節のための医薬組成物。
被検物質をシノビオリン遺伝子発現細胞に接触させること、及び被検物質が、シノビオリン遺伝子の発現に影響するか否かを確認することを含む、脂肪細胞分化誘導調節作用を有する物質をスクリーニングするための方法。
シノビオリン遺伝子の発現への影響が、シノビオリン遺伝子の発現抑制又は発現タンパク質の不活性化である、請求項１１に記載の方法。
シノビオリン遺伝子の発現への影響が、シノビオリン遺伝子の発現促進又は発現タンパク質の活性化である、請求項１１に記載の方法。
シノビオリン遺伝子の転写産物に相補する２０〜２５の連続する塩基配列からなる核酸であって、シノビオリン遺伝子の発現を抑制する核酸を含む、脂肪細胞分化誘導調節のための医薬組成物。
シノビオリンタンパク質のユビキチン化活性阻害剤を含む、脂肪細胞分化誘導調節のための医薬組成物。