JPWO2018225864A1 - 膜透過性の高い環状ペプチド化合物、及びこれを含むライブラリ - Google Patents

膜透過性の高い環状ペプチド化合物、及びこれを含むライブラリ Download PDF

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Abstract

本発明者らは、標的分子に特異的に結合できる環状ペプチド化合物をスクリーニングする際に、長い側鎖を環状部に有する環状ペプチド化合物を含むライブラリを用いることで、標的分子に特異的に結合できる環状ペプチド化合物のヒット率が向上し得ることを見出した。一方で、本発明者らは、従来経口低分子医薬品に採用されていたインドール骨格やヒドロキシフェニル基を有するアミノ酸残基であるトリプトファンやチロシン残基が、高い膜透過性を狙うペプチドには適さないことを見出した。

Description

本発明は、膜透過性の高い環状ペプチド化合物、これを含むライブラリ、及びそれらの製造方法、並びにスクリーニング方法等に関する。
近年、中分子化合物(分子量：500〜2000)は、tough targetにアクセスできる点で低分子化合物よりも優れており、細胞内に移行できる点で抗体よりも優れている可能性があることから注目を集めている。天然物であるシクロスポリンAはその代表例であり、細胞内標的であるサイクロフィリンを阻害する経口投与可能なペプチドである。
これまで創薬されてきた中分子化合物のほとんどが天然物やその誘導体であり、複雑な化学合成が必要になることが多い。そのため、低分子化合物(分子量500以下）を用いた創薬と比較して中分子創薬のドラッグライクネス（代謝安定性と膜透過性が優れた性質）の解明は進んでいないのが現状である。中分子化合物の代表的な分子種としてペプチドがあるが、ペプチドは一般的に代謝安定性、膜透過性が低いとされてきた。しかし、近年中分子ペプチドがドラッグライクネスを満たすために必要な条件（例えば、環状部を有すること、Ｎ置換アミノ酸数、アミノ酸残基数の範囲、脂溶性)が報告されている（特許文献１）。また、非天然アミノ酸であるＮ−メチルアミノ酸に着目し、翻訳合成によりＮ−メチルペプチドライブラリを作製したとの報告もある（特許文献２）。
一方、ライブラリのデザインに関しては、既知の巨大環状分子の解析結果に基づき、合成巨大環状分子ライブラリをデザインするためのガイドラインが提唱されている（非特許文献１）。しかし、これはペプチド以外の分子を含む巨大環状分子から導き出されたガイドラインであるため、ペプチドに対してこのガイドラインをどのように適用し得るのか明らかではない。
国際公開第２０１３／１００１３２号 国際公開第２０１２／０３３１５４号
Villar et al., Nat Chem Biol. 2014 September; 10(9): 723-731
本発明は、このような状況を鑑みてなされたものであり、非限定的な一側面において、細胞膜透過性（「膜透過性」ともいう。）の高い環状ペプチド化合物をスクリーニングするための、環状ペプチド化合物のライブラリを提供することを課題とする。また、本発明は、非限定的な一側面において、標的分子に特異的に結合できる環状ペプチド化合物を効率的にスクリーニングするための、環状ペプチド化合物のライブラリを提供することを課題とする。本発明は、他の側面において、膜透過性の高い環状ペプチド化合物、又はその製造方法、若しくはスクリーニング方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、標的分子に特異的に結合できる環状ペプチド化合物をスクリーニングする際に、長い側鎖を環状部に有する環状ペプチド化合物を含むライブラリを用いることで、標的分子に特異的に結合できる環状ペプチド化合物のヒット率が向上し得ること、すなわちスクリーニングの効率を高め得ることを見出した。
一方で、従来経口低分子医薬品に採用されていたインドール骨格やヒドロキシフェニル基を有するアミノ酸残基であるトリプトファンやチロシン残基が、実は、高い膜透過性を狙うペプチドには適さないこと、つまり、同構造を有するペプチドは高い膜透過性を発揮することが難しくなることを驚くべきことに見出した。
特に、トリプトファンやチロシン残基のような長い側鎖を有するアミノ酸残基を有する環状ペプチド化合物を含むライブラリを用いて、標的分子に結合できる化合物のパニングを繰り返すと、膜透過性の低い環状ペプチド化合物がヒット化合物として濃縮されることを、本発明者らは見出した。
また、特定の理論に拘束されることを必ずしも意図しないが、上記により濃縮された環状ペプチド化合物から、hit to leadにより高い膜透過性を有する環状ペプチド化合物を得ようとしても、標的分子との結合に寄与すると考えられる長い側鎖自体が、高い膜透過性を発揮しにくい構造を有することから、（ｉ）標的分子との結合親和性と（ｉｉ）高い膜透過性を両立できる可能性は低いと考えられる。
そこで、本発明者らは、膜透過性が高く、標的分子に特異的に結合できる環状ペプチド化合物を効率よくスクリーニングすることができるライブラリの一態様として、環状部に長い側鎖を有し、かつ、高い膜透過性を発揮しにくい側鎖を有しない環状ペプチド化合物のライブラリを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、非限定の具体的な一態様において以下を包含する。
〔Ａ１〕環状ペプチド化合物であって、
（１）その環状部の側鎖に、メチルチオ基、チオール基、インドール骨格、及び、置換又は無置換のヒドロキシフェニル基を有さず；
（２）その環状部に酸性の側鎖を有する場合、該酸性の側鎖のpKaが3.5〜10であり；
（３）その環状部に塩基性の側鎖を有する場合、該塩基性の側鎖のBasic pKaが4.0〜10であり；
（４）その環状部に側鎖の長さが6.0〜13オングストロームの長側鎖を有し；
（５）該長側鎖がＲ１を含み、ここでＲ１は、
（ａ）フェニル基、若しくは、（ｂ）酸素原子及び窒素原子からなる群より独立に選択されるヘテロ原子を環内に１〜３個有している４〜６員の複素環基、
ここで（ａ）及び（ｂ）は下記Ａ群より独立に選択される置換基を少なくとも一つ有していてもよく、
Ａ群：オキソ、ハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−Ｃ４アルキル基、及びＣ１−Ｃ４ジアルキルアミノ基（ここで、Ｃ１−Ｃ４アルキル基中の隣接しない１又は２個のメチレン基が酸素原子で置換されていてもよい）、
又は、
（ｃ）以下の一般式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、若しくは（ＩＶ）：
Figure 2018225864
[式中、
Ｘ１は単結合、又は下記Ｂ群より独立して選択される置換基を少なくとも一つ有していてもよいＣ１−Ｃ２アルキレン基を表し、
Ｘ２は単結合、又は下記Ｂ群より独立して選択される置換基を少なくとも一つ有していてもよいＣ１−Ｃ２アルキレン基を表し、
Ｙ１は単結合、酸素原子、カルボニル基（−ＣＯ−）、又はスルホニル基（−ＳＯ２−）を表し、
Ｙ２は単結合、Ｃ１−Ｃ４アルキル基で置換されていてもよいＣ１−Ｃ２アルキレン基、カルボニル基（−ＣＯ−）、又はスルホニル基（−ＳＯ２−）を表し、
Ｚ１は単結合、下記Ｂ群より独立して選択される置換基を少なくとも一つ有していてもよいメチレン基、又は酸素原子を表し、
Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ２−Ｃ４アルケニル基、又はＣ２−Ｃ４アルキニル基を表し、ここで該Ｃ１−Ｃ６アルキルは、ハロゲン原子で置換されていてもよく、また、該Ｃ１−Ｃ６アルキル基中の隣接しない１若しくは２個のメチレン基が酸素原子で置換されていてもよく、
Ｒ２及びＲ３、又はＲ２及びＸ１が結合して４〜６員環の環状構造を形成していてもよく、この場合に該環状構造は、Ｃ１−Ｃ４アルキル基又はハロゲン原子で置換されていてもよく、環内に酸素原子を有していてもよく、該環状構造は部分的に不飽和であってもよく、
Ｒ４はＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ２−Ｃ６アルケニル基、Ｃ２−Ｃ６アルキニル基、又はＣ１−Ｃ６アルカノイル基を表し、
Ｒ５は水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ２−Ｃ６アルケニル基、又はＣ２−Ｃ６アルキニル基を表し、Ｒ４及び／又はＲ５のＣ１−Ｃ６アルキル基中の隣接しない１若しくは２個のメチレン基が酸素原子で置換されていてもよく、
あるいはＲ４及びＲ５、又はＲ５及びＸ２はそれらが結合している原子と一緒になって４〜６員環の環状構造を形成していてもよく、この場合に該環状構造は、Ｃ１−Ｃ４アルキル基又はハロゲン原子で置換されていてもよく、環内に酸素原子を有していてもよく、該環状構造は部分的に不飽和であってもよく、
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ４アルキル基、Ｃ２−Ｃ４アルケニル基、又はＣ２−Ｃ４アルキニル基を表し、該Ｃ１−Ｃ４アルキル基中の隣接しない１若しくは２個のメチレン基が酸素原子で置換されていてもよく、
Figure 2018225864
は結合点を表す。
Ｂ群：ハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ４アルキル基、及びＣ１−Ｃ２アルコキシ基]
で表される基である、
前記環状ペプチド化合物。
〔Ａ２〕前記長側鎖が以下一般式（Ｉ−３）：
−(ＣＨ２)ｎ−Ｒ１ （Ｉ−３）
［式中、
ｎは１〜５の整数であり；
アルキレン基の隣接しない１又は２個のメチレン基が酸素原子で置換されていてもよく；
Ｒ１は〔Ａ１〕の記載と同義である。]
で表される側鎖である、〔Ａ１〕に記載の環状ペプチド化合物。
〔Ａ３〕前記複素環基が、ピリジル基、ピペリジノ基、モルホリノ基、及びアゼチジニル基からなる群より選択される基であって、これらの基は前記Ａ群より独立に選択される置換基を少なくとも一つ有していてもよい、〔Ａ１〕又は〔Ａ２〕に記載の環状ペプチド化合物。
〔Ａ４〕前記環状部の側鎖に、２以上の芳香環による縮環構造を有しない〔Ａ１〕〜〔Ａ３〕のいずれかに記載の環状ペプチド化合物。
〔Ａ５〕前記酸性の側鎖のpKaが5.0〜10である、〔Ａ１〕〜〔Ａ４〕のいずれかに記載の環状ペプチド化合物。
〔Ａ６〕前記塩基性の側鎖のBasic pKaが4.0〜7.5である、〔Ａ１〕〜〔Ａ５〕のいずれかに記載の環状ペプチド化合物。
〔Ａ７〕環状部を構成するアミノ酸の数が５〜１５である、〔Ａ１〕〜〔Ａ６〕のいずれかに記載の環状ペプチド化合物。
〔Ａ８〕核酸連結部以外のペプチド部位を構成するアミノ酸の数が５〜２０である、〔Ａ１〕〜〔Ａ７〕のいずれかに記載の環状ペプチド化合物。
〔Ａ９〕核酸連結部以外のペプチド部位を構成するＮ置換アミノ酸の数が３以上である、〔Ａ１〕〜〔Ａ８〕のいずれかに記載の環状ペプチド化合物。
〔Ａ１０〕核酸連結部以外のペプチド部位を構成する非天然アミノ酸の数が４以上である、〔Ａ１〕〜〔Ａ９〕のいずれかに記載の環状ペプチド化合物。
〔Ａ１１〕ClogP/total aaが１．０〜１．８である、〔Ａ１〕〜〔Ａ１０〕のいずれかに記載の環状ペプチド化合物。
〔Ａ１２〕環化部にアミド結合を有する、〔Ａ１〕〜〔Ａ１１〕のいずれかに記載の環状ペプチド化合物。
〔Ａ１３〕Ｐａｐｐが１．０×１０−６ｃｍ／秒以上である、〔Ａ１〕〜〔Ａ１２〕のいずれかに記載の環状ペプチド化合物。
〔Ａ１４〕前記環状部の側鎖に含まれる芳香環の数が０〜３である、〔Ａ１〕〜〔Ａ１３〕のいずれかに記載の環状ペプチド化合物。
〔Ａ１５〕前記環状部の側鎖に含まれる芳香環の数が１〜３である、〔Ａ１〕〜〔Ａ１３〕のいずれかに記載の環状ペプチド化合物。
〔Ａ１６〕前記長側鎖に含まれる芳香環の数が１〜３である、〔Ａ１〕〜〔Ａ１５〕のいずれかに記載の環状ペプチド化合物。
〔Ａ１７〕前記長側鎖に含まれる芳香環の数が２〜３である、〔Ａ１〕〜〔Ａ１５〕のいずれかに記載の環状ペプチド化合物。
〔Ａ１８〕前記長側鎖が、その側鎖上にアミド結合を含まないか、又は１個のアミド結合を含む側鎖である、〔Ａ１〕〜〔Ａ１７〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ａ１９〕前記長側鎖が、以下のＣ群より選択される少なくとも一つのアミノ酸に含まれる最も長い側鎖である、〔Ａ１〕〜〔Ａ１８〕のいずれかに記載の環状ペプチド化合物：
Ｃ群：表２−１〜表２−６に記載されたアミノ酸。
〔Ａ２０〕表２６に記載のｐｄ１００〜ｐｄ２４７およびｐｄ３００〜ｐｄ５０４から選択される、環状ペプチド化合物。
また本発明は、非限定の具体的な一態様において以下を包含する。
〔Ｂ１〕〔Ａ１〕〜〔Ａ２０〕のいずれかに記載の環状ペプチド化合物を含有するライブラリ。
〔Ｂ２〕環状ペプチド化合物のライブラリであって、前記ライブラリが、環状部の側鎖にインドール骨格を有しない環状ペプチド化合物から実質的になる、ライブラリ。
〔Ｂ３〕環状ペプチド化合物のライブラリであって、前記ライブラリが、環状部の側鎖に、２以上の芳香環による縮環構造を有しない環状ペプチド化合物から実質的になる、ライブラリ。
〔Ｂ４〕前記ライブラリが、環状部の側鎖に置換又は無置換のヒドロキシフェニル基を有しない環状ペプチド化合物から実質的になる、〔Ｂ１〕〜〔Ｂ３〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ５〕前記ライブラリに、環状部に酸性の側鎖を有する環状ペプチド化合物が含まれる場合、同環状ペプチド化合物が、該酸性の側鎖のpKaが3.5〜10である環状ペプチド化合物から実質的になる、〔Ｂ１〕〜〔Ｂ４〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ６〕前記pKaが4.5〜10である〔Ｂ５〕に記載のライブラリ。
〔Ｂ７〕前記pKaが5.0〜10である〔Ｂ５〕に記載のライブラリ。
〔Ｂ８〕前記ライブラリに、環状部に塩基性の側鎖を有する環状ペプチド化合物が含まれる場合、同環状ペプチド化合物が、該塩基性の側鎖のBasic pKaが4.0〜10である環状ペプチド化合物から実質的になる、〔Ｂ１〕〜〔Ｂ７〕に記載のライブラリ。
〔Ｂ９〕前記Basic pKaが4.0〜9.5である〔Ｂ８〕に記載のライブラリ。
〔Ｂ１０〕前記Basic pKaが4.0〜9.0である〔Ｂ８〕に記載のライブラリ。
〔Ｂ１１〕前記Basic pKaが4.0〜8.5である〔Ｂ８〕に記載のライブラリ。
〔Ｂ１２〕前記Basic pKaが4.0〜7.5である〔Ｂ８〕に記載のライブラリ。
〔Ｂ１３〕前記Basic pKaが4.0〜7.2である〔Ｂ８〕に記載のライブラリ。
〔Ｂ１４〕前記ライブラリが、長さが5.4〜13オングストロームの長側鎖を環状部に有する環状ペプチド化合物を含む、〔Ｂ１〕〜〔Ｂ１３〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ１５〕前記ライブラリが、長さが6.0〜13オングストロームの長側鎖を環状部に有する環状ペプチド化合物を含む、〔Ｂ１〕〜〔Ｂ１３〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ１６〕前記ライブラリが、長さが6.0〜10オングストロームの長側鎖を環状部に有する環状ペプチド化合物を含む、〔Ｂ１〕〜〔Ｂ１３〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ１７〕前記長側鎖が、その側鎖上にアミド結合を含まないか、又は１個のアミド結合を含む側鎖である、〔Ｂ１４〕〜〔Ｂ１６〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ１８〕前記ライブラリが、環状部の側鎖に芳香環を有する環状ペプチド化合物を含む、〔Ｂ１〕〜〔Ｂ１７〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ１９〕前記長側鎖の少なくとも一種が芳香環を有する側鎖である、〔Ｂ１４〕〜〔Ｂ１８〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ２０〕前記長側鎖の二種以上が芳香環を有する側鎖である、〔Ｂ１４〕〜〔Ｂ１８〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ２１〕前記ライブラリが、その環状部の側鎖にメチルチオ基を有しない環状ペプチド化合物から実質的になる、〔Ｂ１〕〜〔Ｂ２０〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ２２〕前記ライブラリが、その環状部の側鎖にチオール基を有しない環状ペプチド化合物から実質的になる、〔Ｂ１〕〜〔Ｂ２１〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ２３〕前記ライブラリに含まれる環状ペプチド化合物の環状部を構成するアミノ酸の数の平均が５〜１５である、〔Ｂ１〕〜〔Ｂ２２〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ２４〕前記ライブラリに含まれる環状ペプチド化合物の環状部を構成するアミノ酸の数の平均が８〜１３である、〔Ｂ１〕〜〔Ｂ２２〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ２５〕前記ライブラリに含まれる環状ペプチド化合物の環状部を構成するアミノ酸の数の平均が８〜１１である、〔Ｂ１〕〜〔Ｂ２２〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ２６〕前記ライブラリに含まれる環状ペプチド化合物の核酸連結部以外のペプチド部位を構成するアミノ酸の数の平均が、５〜２０である、〔Ｂ１〕〜〔Ｂ２５〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ２７〕前記ライブラリに含まれる環状ペプチド化合物の核酸連結部以外のペプチド部位を構成するアミノ酸の数の平均が、８〜１３である、〔Ｂ１〕〜〔Ｂ２５〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ２８〕前記ライブラリに含まれる環状ペプチド化合物のClogPの平均が、４〜１８である、〔Ｂ１〕〜〔Ｂ２７〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ２９〕前記ライブラリに含まれる環状ペプチド化合物のClogP/total aaの平均が、１．０〜１．８である、〔Ｂ１〕〜〔Ｂ２８〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ３０〕前記ライブラリに含まれる環状ペプチド化合物の核酸連結部以外のペプチド部位に含まれる非天然アミノ酸の数の平均が４以上である、〔Ｂ１〕〜〔Ｂ２９〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ３１〕前記ライブラリに含まれる環状ペプチド化合物の核酸連結部以外のペプチド部位に含まれるアミノ酸の数に占めるＮ置換アミノ酸の数の割合の平均が３０％以上である、〔Ｂ１〕〜〔Ｂ３０〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ３２〕前記ライブラリに含まれる環状ペプチド化合物の核酸連結部以外のペプチド部位に含まれるＮ置換アミノ酸の数の平均が３以上である、〔Ｂ１〕〜〔Ｂ３０〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ３３〕前記ライブラリに含まれる環状ペプチド化合物が、環化部にアミド結合を有する環状ペプチド化合物である、〔Ｂ１〕〜〔Ｂ３２〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ３４〕前記ライブラリが、標的分子に特異的に結合できる化合物の同定に使用するためのライブラリである、〔Ｂ１〕〜〔Ｂ３３〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ３５〕前記ライブラリが、経口投与可能な化合物、又はその前駆体の同定に使用するためのライブラリである、〔Ｂ１〕〜〔Ｂ３４〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ３６〕前記ライブラリが、Ｐａｐｐが１．０×１０−６以上の環状ペプチド化合物の取得に使用するためのライブラリである、〔Ｂ１〕〜〔Ｂ３５〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ３７〕前記ライブラリが、１×１０４以上の多様性を有する、〔Ｂ１〕〜〔Ｂ３６〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ３８〕前記ライブラリが、１×１０１０以上の多様性を有する、〔Ｂ１〕〜〔Ｂ３６〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ３９〕前記ライブラリに含まれる環状ペプチド化合物の分子量の平均が５００〜２０００である、〔Ｂ１〕〜〔Ｂ３８〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ４０〕前記長側鎖がＲ１を含み、ここでＲ１は〔Ａ１〕の記載と同義である、〔Ｂ１〕及び〔Ｂ１４〕〜〔Ｂ３９〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ４１〕前記長側鎖が以下一般式（Ｉ−３）：
−(ＣＨ２)ｎ−Ｒ１ （Ｉ−３）
［式中、
ｎは１〜５の整数であり；
アルキレン基の隣接しない１又は２個のメチレン基が酸素原子で置換されていてもよく；
Ｒ１は〔Ｂ４０〕と同義である。]
で表される側鎖である、〔Ｂ１〕及び〔Ｂ１４〕〜〔Ｂ４０〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ４２〕前記複素環基が、ピリジル基、ピペリジノ基、モルホリノ基、及びアゼチジニル基からなる群より選択される基であって、これらの基は前記Ａ群より独立に選択される置換基を少なくとも一つ有していてもよい、〔Ｂ４０〕又は〔Ｂ４１〕に記載のライブラリ。
〔Ｂ４３〕前記Ｒ１が、前記（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される少なくとも一つの基である、〔Ｂ４０〕〜〔Ｂ４２〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ４４〕前記Ｒ１が、以下の（１）〜（６）から選択される基である、〔Ｂ４０〕〜〔Ｂ４２〕のいずれかに記載のライブラリ：
（１）前記一般式（ＩＩ）であって、Ｙ１が単結合、又は酸素原子であり、Ｘ１は単結合、又は置換されていてもよいＣ１−Ｃ２アルキレン基であり、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子、又はＣ１−Ｃ６アルキル基を表し、ここで該Ｃ１−Ｃ６アルキル基は、ハロゲン原子で置換されていてもよく；
（２）前記一般式（ＩＩＩ）であって、Ｒ５が水素原子であり、Ｙ２は単結合、カルボニル基又はスルホニル基であり、Ｘ２は置換されていてもよいＣ１−Ｃ２アルキレン基であり、Ｚ１は酸素原子である；
（３）前記一般式（ＩＩＩ）であって、Ｒ５がＣ１−Ｃ６アルキル基で、環状構造を形成しておらず、Ｙ２は単結合、置換されていてもよいＣ１−Ｃ２アルキレン基、カルボニル基又はスルホニル基であり、X２は単結合又は置換されていてもよいＣ１−Ｃ２アルキレン基であり、Ｚ１は単結合又は置換されていてもよいメチレン基である；
（４）前記一般式（ＩＩＩ）であって、Ｒ４及びＲ５はそれらが結合している原子と一緒になって４〜６員環の環状構造を形成しており、該環内に酸素原子を有していてもよく、該環状構造は、Ｃ１−Ｃ４アルキル基又はハロゲン原子で置換されていてもよく、Ｘ２は単結合、又は置換されていてもよいＣ１−Ｃ２アルキレン基であり、Ｙ２は単結合、又は置換されていてもよいＣ１−Ｃ２アルキレン基であり、Ｚ１は単結合、置換されていてもよいメチレン基、又は酸素原子である；
（５）前記一般式（ＩＩＩ）であって、Ｒ５及びＸ２はそれらが結合している原子と一緒になって４〜６員環の環状構造を形成しており、該環内に酸素原子を有していてもよく、該環状構造は、Ｃ１−Ｃ４アルキル基又はハロゲン原子で置換されていてもよく、Ｙ２は単結合、又は置換されていてもよいＣ１−Ｃ２アルキレン基であり、Ｚ１は酸素原子であり、Ｒ４はＣ１−Ｃ４アルキル基である；
（６）前記一般式（ＩＶ）であって、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０が、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、又はエチル基である。
〔Ｂ４５〕前記長側鎖が、〔Ａ１９〕に記載のＣ群より選択される少なくとも一つのアミノ酸に含まれる最も長い側鎖である、〔Ｂ１〕及び〔Ｂ１４〕〜〔Ｂ４４〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ４６〕前記長側鎖の少なくとも一種が、芳香環を含む側鎖である、〔Ｂ１〕及び〔Ｂ１４〕〜〔Ｂ４４〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ４７〕前記Ｒ１が、前記Ａ群より独立に選択される置換基を少なくとも一つ有していてもよいフェニル基である、〔Ｂ４０〕又は〔Ｂ４１〕に記載のライブラリ。
〔Ｂ４８〕前記長側鎖が、ハロフェニル基、及びＣ１−Ｃ４ハロアルキルフェニル基からなる群より選択される少なくとも一つの基を含む側鎖である、〔Ｂ１〕、〔Ｂ１４〕〜〔Ｂ４７〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ４９〕前記ライブラリに含まれる環状ペプチド化合物の環状部の側鎖に含まれる芳香環の数の平均が０〜３である、〔Ｂ１〕〜〔Ｂ４８〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ５０〕前記ライブラリに含まれる環状ペプチド化合物の環状部を構成するアミノ酸の数に占める芳香環の数の割合の平均が４０％以下である、〔Ｂ１〕〜〔Ｂ４９〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ５１〕前記ライブラリに含まれる環状ペプチド化合物の環状部の長側鎖に含まれる芳香環の数の平均が１〜３である、〔Ｂ１〕〜〔Ｂ５０〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ５２〕前記ライブラリが、核酸ディスプレイライブラリである、〔Ｂ１〕〜〔Ｂ５１〕のいずれかに記載のライブラリ。
〔Ｂ５３〕〔Ｂ１〕〜〔Ｂ５２〕に記載の環状ペプチド化合物のライブラリをコードする核酸のライブラリ。
また本発明は、非限定の具体的な一態様において以下を包含する。
〔Ｃ１〕以下の工程を含む、標的分子に特異的に結合できる環状ペプチド化合物のスクリーニング方法：
（ｉ）〔Ｂ１〕〜〔Ｂ５２〕のいずれかに記載のライブラリに含まれる環状ペプチド化合物と該標的分子を接触させる工程；及び
（ｉｉ）該標的分子に特異的に結合できる環状ペプチド化合物を選択する工程。
〔Ｃ２〕前記標的分子がタンパク質である、〔Ｃ１〕に記載の方法。
また本発明は、非限定の具体的な一態様において以下を包含する。
〔Ｄ１〕ペプチド化合物を製造するための無細胞翻訳系であって、以下（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくとも一つを実質的に含まない無細胞翻訳系：
（ａ）側鎖にインドール骨格を有するアミノ酸、又は該アミノ酸をコードする核酸；
（ｂ）側鎖に２以上の芳香環による縮環構造を有するアミノ酸、又は該アミノ酸をコードする核酸；及び
（ｃ）側鎖に置換又は無置換のヒドロキシフェニル基を有するアミノ酸、又は該アミノ酸をコードする核酸。
〔Ｄ２〕〔Ｄ１〕に記載の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を実質的に含まない、〔Ｄ１〕に記載の無細胞翻訳系。
〔Ｄ３〕〔Ｄ１〕又は〔Ｄ２〕に記載の無細胞翻訳系であって、該翻訳系が酸性の側鎖を有するアミノ酸がアシル化されたｔＲＮＡ、及び該アミノ酸をコードする核酸を含む場合、該アミノ酸の側鎖のpKaが3.5〜10である、前記無細胞翻訳系。
〔Ｄ４〕〔Ｄ１〕〜〔Ｄ３〕のいずれかに記載の無細胞翻訳系であって、該翻訳系が塩基性の側鎖を有するアミノ酸がアシル化されたｔＲＮＡ、及び該アミノ酸をコードする核酸を含む場合、該アミノ酸の側鎖のBasic pKaが4.0〜10である、前記無細胞翻訳系。
〔Ｄ５〕前記pKaが5.0〜10である〔Ｄ３〕又は〔Ｄ４〕に記載の無細胞翻訳系
〔Ｄ６〕前記Basic pKaが4.0〜7.5である〔Ｄ４〕又は〔Ｄ５〕に記載の無細胞翻訳系。
〔Ｄ７〕長さが5.4〜13オングストロームの長側鎖を有するアミノ酸を含む〔Ｄ１〕〜〔Ｄ６〕のいずれかに記載の無細胞翻訳系。
〔Ｄ８〕前記長側鎖の長さが6.0〜10オングストロームである〔Ｄ７〕に記載の無細胞翻訳系。
〔Ｄ９〕前記長側鎖の少なくとも一種が芳香環を有する側鎖である〔Ｄ７〕又は〔Ｄ８〕に記載の無細胞翻訳系。
〔Ｄ１０〕前記長側鎖の二種以上が芳香環を有する側鎖である〔Ｄ７〕又は〔Ｄ８〕に記載の無細胞翻訳系。
〔Ｄ１１〕前記翻訳系に含まれるアミノ酸の種類の数のうち、４０％以上がＮ置換アミノ酸である、〔Ｄ１〕〜〔Ｄ１０〕のいずれかに記載の無細胞翻訳系。
〔Ｄ１２〕前記ペプチド化合物が環状ペプチド化合物である、〔Ｄ１〕〜〔Ｄ１１〕のいずれかに記載の無細胞翻訳系。
〔Ｄ１３〕前記翻訳系に含まれるアミノ酸の種類の数に占める芳香環を有するアミノ酸の種類の数の割合が４０％以下である、〔Ｄ１〕〜〔Ｄ１２〕のいずれかに記載の無細胞翻訳系。
〔Ｄ１４〕８〜１１個のアミノ酸から構成される環状部を有する環状ペプチド化合物の環状部の側鎖に含まれる芳香環の数の平均が０〜３になるように調整された無細胞翻訳系。
また本発明は、非限定の具体的な一態様において以下を包含する。
〔Ｅ１〕ペプチド化合物のライブラリの製造方法であって、以下（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される少なくとも一つの工程を含む、方法：
（ａ）側鎖にインドール骨格を有するアミノ酸を実質的に含まないアミノ酸プールを用意し、該プールに含まれるアミノ酸の一部又は全部を構成アミノ酸としてペプチド化合物を合成する工程；及び
（ｂ）側鎖にインドール骨格を有するアミノ酸をコードする核酸を実質的に含まない鋳型プールを用意し、該鋳型プールからペプチド化合物を合成する工程。
〔Ｅ２〕前記工程（ａ）及び（ｂ）のプールが、それぞれ、側鎖に２以上の芳香環による縮環構造を有するアミノ酸、及び該アミノ酸をコードする核酸、を実質的に含まないプールである、〔Ｅ１〕に記載の方法。
〔Ｅ３〕前記工程（ａ）及び（ｂ）のプールが、それぞれ、側鎖に置換又は無置換のヒドロキシフェニル基を有するアミノ酸、及び該アミノ酸をコードする核酸を実質的に含まないプールである、〔Ｅ１〕又は〔Ｅ２〕に記載の方法。
〔Ｅ４〕ペプチド化合物の合成の際に使用されるアミノ酸プールに酸性の側鎖を有するアミノ酸が含まれ、かつ鋳型プールに該アミノ酸をコードする核酸が含まれる場合、該アミノ酸の側鎖のpKaが3.5〜10である、〔Ｅ１〕〜〔Ｅ３〕のいずれかに記載の方法。
〔Ｅ５〕前記pKaが5.0〜10である、〔Ｅ４〕に記載の方法。
〔Ｅ６〕ペプチド化合物の合成の際に使用されるアミノ酸プールに塩基性の側鎖を有するアミノ酸が含まれ、かつ鋳型プールに該アミノ酸をコードする核酸が含まれる場合、該アミノ酸の側鎖のBasic pKaが4.0〜10である、〔Ｅ１〕〜〔Ｅ５〕のいずれかに記載の方法。
〔Ｅ７〕前記Basic pKaが4.0〜7.5である、〔Ｅ６〕に記載の方法。
〔Ｅ８〕ペプチド化合物の合成の際に使用されるアミノ酸プールが、長さが5.4〜13オングストロームの長側鎖を有するアミノ酸を含むプールである、〔Ｅ１〕〜〔Ｅ７〕のいずれかに記載の方法。
〔Ｅ９〕ペプチド化合物の合成の際に使用されるアミノ酸プールが、長さが6.0〜10オングストロームの長側鎖を有するアミノ酸を含むプールである、〔Ｅ１〕〜〔Ｅ７〕のいずれかに記載の方法。
〔Ｅ１０〕前記長側鎖の少なくとも一種が芳香環を有する側鎖である、〔Ｅ８〕又は〔Ｅ９〕に記載の方法。
〔Ｅ１１〕ペプチド化合物の合成の際に使用されるアミノ酸プールに含まれるアミノ酸の種類の数のうち、５０％以上が非天然アミノ酸である、〔Ｅ１〕〜〔Ｅ１０〕のいずれかに記載の方法。
〔Ｅ１２〕ペプチド化合物の合成の際に使用されるアミノ酸プールに含まれるアミノ酸の種類の数のうち、４０％以上がＮ置換アミノ酸である、〔Ｅ１〕〜〔Ｅ１１〕のいずれかに記載の方法。
〔Ｅ１３〕前記ペプチド化合物が環状ペプチド化合物である、〔Ｅ１〕〜〔Ｅ１２〕のいずれかに記載の方法。
〔Ｅ１４〕以下（ｃ）及び（ｄ）からなる群より選択される少なくとも一つの工程を含む、〔Ｅ１３〕に記載の方法：
（ｃ）翻訳合成される環状ペプチド化合物において、環状部を構成するアミノ酸の数に占める芳香環を有するアミノ酸の数の割合の平均が４０％以下になるように調整されたアミノ酸プールを用意し、該プールに含まれるアミノ酸の一部又は全部を構成アミノ酸としてペプチド化合物を合成する工程；
（ｄ）翻訳合成される環状ペプチド化合物において、環状部を構成するアミノ酸の数に占める芳香環を有するアミノ酸の数の割合の平均が４０％以下になるように調整された鋳型プールを用意し、該鋳型プールからペプチド化合物を合成する工程。
〔Ｅ１５〕〔Ｄ１〕〜〔Ｄ１４〕のいずれかに記載の無細胞翻訳系を使用してペプチド化合物を合成する工程を含む、ペプチド化合物のライブラリの製造方法。
〔Ｅ１６〕〔Ｄ１〕〜〔Ｄ１４〕のいずれかに記載の無細胞翻訳系を使用してペプチド化合物を合成する工程を含む、〔Ｅ１〕〜〔Ｅ１３〕のいずれかに記載の方法。
〔Ｅ１７〕前記ライブラリが１×１０４以上の多様性を有する、〔Ｅ１〕〜〔Ｅ１６〕のいずれかに記載の方法。
〔Ｅ１８〕前記ライブラリが核酸ディスプレイライブラリである、〔Ｅ１〕〜〔Ｅ１７〕のいずれかに記載の方法。
〔Ｅ１９〕〔Ｂ１〕〜〔Ｂ４４〕のいずれかに記載のライブラリを製造するための、〔Ｅ１〕〜〔Ｅ１８〕のいずれかに記載の方法。
〔Ｅ２０〕〔Ｅ１〕〜〔Ｅ１９〕のいずれかに記載の方法によって得られるライブラリ。
〔Ｅ２１〕〔Ｅ２０〕に記載のライブラリを構成する環状ペプチド化合物。
また本発明は、非限定の具体的な一態様において以下を包含する。
〔Ｆ１〕以下の工程を含む、環状ペプチド化合物の製造方法：
（ｉ）〔Ｂ１〕〜〔Ｂ５２〕のいずれかに記載のライブラリに含まれる環状ペプチド化合物と標的分子を接触させる工程；
（ｉｉ）該標的分子に結合できる環状ペプチド化合物を選択する工程；及び
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で選択された環状ペプチド化合物のアミノ酸配列に基づき、環状ペプチド化合物を製造する工程。
〔Ｆ２〕〔Ｆ１〕に記載の方法によって製造される環状ペプチド化合物。
また本発明は、非限定の具体的な一態様において以下を包含する。
〔Ｇ１〕長さが5.4〜13オングストロームの長側鎖を有するアミノ酸であって、該長側鎖がＲ１を含み、ここでＲ１は〔Ａ１〕の記載と同義である、前記アミノ酸。
〔Ｇ２〕長さが5.4〜13オングストロームの長側鎖を有するアミノ酸。
〔Ｇ３〕表２−１〜表２−６に記載されたアミノ酸からなる群より選択されるアミノ酸。
〔Ｇ４〕主鎖アミノ基が保護基により保護されている、〔Ｇ１〕〜〔Ｇ３〕に記載のアミノ酸。
〔Ｇ５〕主鎖アミノ基がFmoc基により保護されている、〔Ｇ１〕〜〔Ｇ３〕に記載のアミノ酸。
〔Ｇ６〕環状ペプチド化合物の合成に使用するための、〔Ｇ１〕〜〔Ｇ５〕のいずれかに記載のアミノ酸。
〔Ｇ７〕〔Ｇ１〕〜〔Ｇ５〕に記載のアミノ酸のカルボキシ基にｐｄＣｐＡまたはｐＣｐＡがエステル結合で連結されたｐｄＣｐＡアミノ酸、又はｐＣｐＡアミノ酸。
〔Ｇ８〕環状ペプチド化合物の翻訳に使用するための、〔Ｇ１〕〜〔Ｇ５〕、及び〔Ｇ７〕のいずれかに記載のアミノ酸。
〔Ｈ１〕以下の一般式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）で表される基を側鎖に有するアミノ酸：
Figure 2018225864
[式中、
Ｘ１は単結合、下記Ｂ群より独立して選択される置換基を少なくとも一つ有していてもよいＣ１−Ｃ２アルキレン基を表し、
Ｘ２は単結合、又は下記Ｂ群より独立して選択される置換基を少なくとも一つ有していてもよいＣ１−Ｃ２アルキレン基を表し、
Ｙ１は単結合、酸素原子、カルボニル基（−ＣＯ−）、又はスルホニル基（−ＳＯ２−）を表し、
Ｙ２は単結合，Ｃ１−Ｃ４アルキル基で置換されていてもよいＣ１−Ｃ２アルキレン基、カルボニル基（−ＣＯ−）、又はスルホニル基（−ＳＯ２−）を表し、
Ｚ１は酸素原子を表し、
Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ２−Ｃ４アルケニル基、又はＣ２−Ｃ４アルキニル基を表し、ここで該Ｃ１−Ｃ６アルキル基は、ハロゲン原子で置換されていてもよく、また、該Ｃ１−Ｃ６アルキル基中の隣接しない１若しくは２個のメチレン基が酸素原子で置換されていてもよく
Ｒ２及びＲ３、又はＲ２及びＸ１が結合して４〜６員環の環状構造を形成していてもよく、この場合に該環状構造は、Ｃ１−Ｃ４アルキル基又はハロゲン原子で置換されていてもよく、環内に酸素原子を有していてもよく、該環状構造は部分的に不飽和であってもよく、
Ｒ４はＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ２−Ｃ６アルケニル基、Ｃ２−Ｃ６アルキニル基、又はＣ１−Ｃ６アルカノイル基を表し、
Ｒ５は水素原子を表し、Ｒ４のＣ１−Ｃ６アルキル基中の隣接しない１若しくは２個のメチレン基が酸素原子で置換されていてもよく、
Figure 2018225864
は結合点を表す。
Ｂ群：ハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ４アルキル基、及びＣ１−Ｃ２アルコキシ基]。
〔Ｈ２〕表２−１〜表２−６に記載されたアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸を含むペプチド化合物を含むペプチド化合物ライブラリ。
〔Ｈ３〕表２−１〜表２−６に記載されたアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸を含むペプチド化合物を含むペプチド化合物ライブラリの製造方法であって、以下(i)および(ii)を含む無細胞翻訳系でペプチド化合物を翻訳合成する工程を含む方法：
(i) 表２−１〜表２−６に記載されたアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸が結合したtRNA；
(ii) 前記ペプチド化合物ライブラリをコードする核酸ライブラリ、
ここで該核酸ライブラリには前記tRNAのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含む核酸が含まれる。
〔Ｈ４〕以下(i)および(ii)を含む、表２−１〜表２−６に記載されたアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸を含むペプチド化合物を製造するための無細胞翻訳系：
(i) 表２−１〜表２−６に記載されたアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸が結合したtRNA；
(ii) 前記ペプチド化合物をコードする核酸、
ここで該核酸は前記tRNAのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含む。
〔Ｈ５〕以下(i)および(ii)を含む、表２−１〜表２−６に記載されたアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸を含むペプチド化合物の翻訳合成方法：
(i) 表２−１〜表２−６に記載されたアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸が結合したtRNAを用意する工程；
(ii) 前記tRNAのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含む核酸を無細胞翻訳系で翻訳し、前記ペプチド化合物を得る工程。
本発明の一態様によれば、標的分子に特異的に結合できる環状ペプチド化合物を効率的にスクリーニングすることが可能になる。また、本発明の一態様によれば、高い細胞膜透過性を有する環状ペプチド化合物を得ることが可能になる。
膜透過性の測定方法の一態様における概略を示した図である。 Caco-2細胞を用いた細胞膜透過性測定の前提と実際を示した概念図である。 翻訳合成された非天然アミノ酸を含むペプチド化合物のマススペクトルを示した図である。 図３−１の続きを示す図である。 図３−２の続きを示す図である。 翻訳合成された非天然アミノ酸を含むペプチド化合物のマススペクトルを示した図である。 翻訳合成された非天然アミノ酸を含むペプチド化合物のマススペクトルを示した図である。 翻訳合成された非天然アミノ酸を含むペプチド化合物のマススペクトルを示した図である。 従来法に準じ、Caco-2細胞を３時間までインキュベートした際のTEERの推移を示した図である。 改良法によりCaco-2細胞を２４時間までインキュベートした際のTEERの推移を示した図である。 従来法により測定したPappとFaの相関を示した図である。 改良法により測定したPappとFaの相関を示した図である。改良法では、従来法に比べ、Faとの高い相関が示された。 Trpの側鎖を有しない環状ペプチド化合物を母集団とした場合のClogP/total AAとPappの関係を示した図である。 Trpの側鎖を有する環状ペプチド化合物を母集団とした場合のClogP/total AAとPappの関係を示した図である。 Phe(4-CF3)の側鎖を有する環状ペプチド化合物を母集団とした場合のClogP/total AAとPappの関係を示した図である。 環状ペプチド化合物のＡＲＣと細胞膜透過性の関係を示した図である。
以下に、本開示の好ましい非限定的な実施態様を説明する。
後述する本実施例に記載されるあらゆる要素(element)は、本特許出願の権利化を意図する国における、実施例に記載の内容を限定的に解釈しようとし得るいかなる特許実務、慣習、法令等の制限に縛られることなく、本「発明を実施するための形態」においても同等に記載されていると当然にみなされることを意図して記載される。
本開示におけるいずれかに記載の一又は複数の要素(element)の一部又は全部を任意に組み合わせたものも、当業者の技術常識に基づいて技術的に矛盾しない限り、本開示に含まれることが意図され、かつ、当業者には当然に理解されるものとして記載される。
本明細書では、以下の略号を用いる。Ａｌａ（アラニン）、Ａｒｇ（アルギニン）、Ａｓｎ（アスパラギン）、Ａｓｐ（アスパラギン酸）、Ｃｙｓ（システイン）、Ｇｌｕ（グルタミン酸）、Ｇｌｎ（グルタミン）、Ｇｌｙ（グリシン）、Ｈｉｓ（ヒスチジン）、Ｉｌｅ（イソロイシン）、Ｌｅｕ（ロイシン）、Ｌｙｓ（リシン）、Ｍｅｔ（メチオニン）、Ｐｈｅ（フェニルアラニン）、Ｐｒｏ（プロリン）、Ｓｅｒ（セリン）、Ｔｈｒ（トレオニン）、Ｔｒｐ（トリプトファン）、Ｔｙｒ（チロシン）、Ｖａｌ（バリン）。また、これらに加えて、表２−１〜表２−６及び表４−１〜表４−３２に記載した略号を用いる。
本明細書において「アルキル」とは、脂肪族炭化水素から任意の水素原子を１個除いて誘導される１価の基であり、骨格中にヘテロ原子（炭素及び水素原子以外の原子をいう。）または不飽和の炭素−炭素結合を含有せず、水素及び炭素原子を含有するヒドロカルビルまたは炭化水素基構造の部分集合を有する。該アルキル基は直鎖状、又は分枝鎖状のものを含む。アルキル基としては、炭素原子数１〜２０（Ｃ１−Ｃ２０、以下「Ｃｐ−Ｃｑ」とは炭素原子数がｐ〜ｑ個であることを意味する。）のアルキル基であり、好ましくはＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ５アルキル基、Ｃ１−Ｃ４アルキル基、Ｃ１−Ｃ３アルキル基などが挙げられる。アルキルとしては、具体的には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、１−メチルプロピル基、１，１−ジメチルプロピル基、２，２−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、１，１，２−トリメチルプロピル、１，２，２−トリメチルプロピル、１，１，２，２−テトラメチルプロピル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、イソペンチル、ネオペンチル等が挙げられる。
本明細書において「アルケニル」とは、少なくとも１個の二重結合（２個の隣接ＳＰ２炭素原子）を有する１価の基である。二重結合及び置換分（存在する場合）の配置によって、二重結合の幾何学的形態は、エントゲーゲン（Ｅ）またはツザンメン（Ｚ）、シスまたはトランス配置をとることができる。アルケニルとしては、直鎖状または分枝鎖状のものが挙げられ、内部オレフィンを含む直鎖などを含む。好ましくはＣ２−Ｃ１０アルケニル、さらに好ましくはＣ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ４アルケニルが挙げられる。
このようなアルケニルとして、具体的には、たとえば、ビニル、アリル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル（シス、トランスを含む）、３−ブテニル、ペンテニル、ヘキセニルなどが挙げられる。
本明細書において「アルキニル」とは、少なくとも１個の三重結合（２個の隣接ＳＰ炭素原子）を有する、１価の基である。直鎖状または分枝鎖状のアルキニルが挙げられ、内部アルキレンを含む。好ましくはＣ２−Ｃ１０アルキニル、さらに好ましくはＣ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ２−Ｃ４アルキニルが挙げられる。アルキニルとしては具体的には、たとえば、エチニル、１−プロピニル、プロパルギル、３−ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、３−フェニル−２−プロピニル、３−（２'−フルオロフェニル）−２−プロピニル、２−ヒドロキシ−２−プロピニル、３−（３−フルオロフェニル）−２−プロピニル、３−メチル−（５−フェニル）−４−ペンチニルなどが挙げられる。
本明細書において「シクロアルキル」とは、飽和または部分的に飽和した環状の１価の脂肪族炭化水素基を意味し、単環、ビシクロ環、スピロ環を含む。好ましくはＣ３−Ｃ１０シクロアルキルが挙げられる。シクロアルキル基は、部分的に不飽和であってもよい。シクロアルキルとしては具体的には、たとえば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチルなどが挙げられる。
本明細書において「アリール」とは１価の芳香族炭化水素環を意味し、好ましくはＣ６−Ｃ１０アリールが挙げられる。アリールとしては具体的には、たとえば、フェニル、ナフチル（たとえば、１−ナフチル、２−ナフチル）などが挙げられる。
本明細書において「ヘテロアリール」とは、環を構成する原子中（本明細書において「環内」ともいう。）に好ましくは１〜５個のヘテロ原子を含有する芳香族性の環の１価の基を意味し、部分的に飽和されていてもよい。環は単環、または２個の縮合環（たとえば、ベンゼンまたは単環へテロアリールと縮合した２環式ヘテロアリール）であってもよい。環を構成する原子の数は好ましくは５〜１０である（５員−１０員ヘテロアリール）。ヘテロアリールとしては具体的には、たとえば、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピリダジニル、ピラジニル、トリアジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾイミダゾリル、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ベンゾジオキソリル、インドリジニル、イミダゾピリジルなどが挙げられる。
本明細書において「アリールアルキル（アラルキル）」とは、アリールとアルキルを共に含む基であり、例えば、前記アルキルの少なくとも一つの水素原子がアリールで置換された基を意味し、好ましくは、「Ｃ５−Ｃ１０アリールＣ１−Ｃ６アルキル」が挙げられる。たとえば、ベンジルなどが挙げられる。
本明細書において「アルキレン」とは、前記「アルキル」からさらに任意の水素原子を１個除いて誘導される二価の基を意味し、アルキレンとしては好ましくはＣ１−Ｃ２アルキレン、Ｃ１−Ｃ３アルキレン、Ｃ１−Ｃ４アルキレン、Ｃ１−Ｃ５アルキレン、Ｃ１−Ｃ６アルキレンが挙げられる。アルキレンとして具体的には、たとえば、メチレン、１，２−エチレン、１，１−エチレン、１，３−プロピレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレンなどが挙げられる。
本明細書において「アリーレン」とは、前記アリールからさらに任意の水素原子を１個除いて誘導される２価の基を意味する。アリーレンは、単環でも縮合環でもよい。環を構成する原子の数は特に限定されないが、好ましくは６〜１０である（Ｃ６−Ｃ１０アリーレン）。アリーレンとして具体的には、たとえば、フェニレン、ナフチレンなどが挙げられる。
本明細書において「ヘテロアリーレン」とは、前記ヘテロアリールからさらに任意の水素原子を１個除いて誘導される２価の基を意味する。ヘテロアリーレンは、単環でも縮合環でもよい。環を構成する原子の数は特に限定されないが、好ましくは５〜１０である（５員〜１０員ヘテロアリーレン）。ヘテロアリーレンとして具体的には、ピロールジイル、イミダゾールジイル、ピラゾールジイル、ピリジンジイル、ピリダジンジイル、ピリミジンジイル、ピラジンジイル、トリアゾールジイル、トリアジンジイル、イソオキサゾールジイル、オキサゾールジイル、オキサジアゾールジイル、イソチアゾールジイル、チアゾールジイル、チアジアゾールジイル、フランジイル及びチオフェンジイルなどが挙げられる。
本明細書において「アルキレンアリーレン」とは、前記アルキレンと前記アリーレンとが任意の位置で結合した２価の基であって、基本骨格側にアルキレンが結合した基を意味する。アルキレンアリーレンとして具体的には、−Ｃ１−Ｃ６アルキレン−Ｃ６−Ｃ１０アリーレンなどが挙げられる。
本明細書において「アリーレンアルキレン」とは、前記アリーレンと前記アルキレンとが任意の位置で結合した２価の基であって、基本骨格側にアリーレンが結合した基を意味する。アリーレンアルキレンとして具体的には、−Ｃ６−Ｃ１０アリーレン−Ｃ１−Ｃ６アルキレンなどが挙げられる。
本明細書において「アルキレンヘテロアリーレン」とは、前記アルキレンと前記ヘテロアリーレンとが任意の位置で結合した２価の基であって、基本骨格側にアルキレンが結合した基を意味する。アルキレンヘテロアリーレンとして具体的には、−Ｃ１−Ｃ６アルキレン−５員−１０員ヘテロアリーレンなどが挙げられる。
本明細書において「ヘテロアリーレンアルキレン」とは、前記ヘテロアリーレンと前記アルキレンとが任意の位置で結合した２価の基であって、基本骨格側にヘテロアリーレンが結合した基を意味する。ヘテロアリーレンアルキレンとして具体的には、−５員−１０員ヘテロアリーレン−Ｃ１−Ｃ６アルキレンなどが挙げられる。
本明細書において「活性エステル」とは、アミノ基と反応してアミド結合を生成するカルボニルを含む基であって、該カルボニルに、たとえばＯＢｔ、ＯＡｔ、ＯＳｕ、ＯＰｆｐ、ＳＲ１などが結合した基であり、アミンとの反応を促進しうる基である。
本明細書において「反応補助基」とは、望みの位置で選択的に反応を起こさせるために、結合させる官能基の近傍に導入されて、該官能基を結合反応に対して活性化する基であり、たとえば、カルボニルとアミンを反応させるため、カルボニルとアミン側のいずれか、あるいは両方に反応補助基を導入させることができる。このような反応補助基は、結合反応とともに、あるいは結合反応後に脱離させることもできる。
本明細書における「アミノ酸」には、天然アミノ酸、及び非天然アミノ酸が含まれる。本明細書における「天然アミノ酸」とは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏを指す。非天然アミノ酸は特に限定されないが、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、Ｄ型アミノ酸、Ｎ置換アミノ酸、α，α−二置換アミノ酸、側鎖が天然と異なるアミノ酸、ヒドロキシカルボン酸などが例示される。本明細書におけるアミノ酸としては、任意の立体配置が許容される。アミノ酸の側鎖の選択は特に制限を設けないが、水素原子の他にも例えばアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基、シクロアルキル基から自由に選択され、これらの基の中の隣接しない１又は２個のメチレン基は酸素原子、カルボニル基（−ＣＯ−）、又はスルホニル基（−ＳＯ２−）で置換されていてもよい。それぞれには置換基が付与されていてもよく、それら置換基も制限されず、例えば、ハロゲン原子、Ｏ原子、Ｓ原子、Ｎ原子、Ｂ原子、Ｓｉ原子、又はＰ原子を含む任意の置換基の中から独立して１つ又は２つ以上自由に選択されてよい。すなわち、置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基、シクロアルキル基などが例示される。また、本明細書におけるアミノ酸は、後述する「長側鎖」を側鎖として有していてもよい。非限定の一態様において、本明細書におけるアミノ酸は、同一分子内にカルボキシ基とアミノ基を有する化合物であってよい（この場合であっても、プロリン、ヒドロキシプロリンのようなイミノ酸もアミノ酸に含まれる）。
アミノ酸の主鎖アミノ基は、非置換（ＮＨ２基）でもよく、置換されていてもよい（即ち、−ＮＨＲ基：Ｒは置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、シクロアルキルを示し、これらの基の中の隣接しない１又は２個のメチレン基は酸素原子、カルボニル基（−ＣＯ−）、又はスルホニル基（−ＳＯ２−）で置換されていてもよく、またプロリンのようにＮ原子に結合した炭素鎖とα位の炭素原子とが環を形成していてもよい。）。前記Ｒの置換基は、上述のアミノ酸側鎖における置換基と同様に選択される。主鎖アミノ基が置換されている場合の前記Ｒは、本明細書における「アミノ酸の側鎖」に含まれる。該Ｒは、後述する「長側鎖」であってもよい。このような主鎖アミノ基が置換されているアミノ酸を、本明細書において「Ｎ置換アミノ酸」と称する。本明細書における「Ｎ置換アミノ酸」としては、好ましくはＮ−アルキルアミノ酸、Ｎ−Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ酸、Ｎ−Ｃ１−Ｃ４アルキルアミノ酸、Ｎ−メチルアミノ酸、長側鎖を有するＮ置換アミノ酸が例示されるが、これらに限定されるものではない。
本明細書におけるペプチド化合物を構成する「アミノ酸」にはそれぞれに対応する全ての同位体を含む。「アミノ酸」の同位体は、少なくとも１つの原子が、原子番号（陽子数）が同じで，質量数（陽子と中性子の数の和）が異なる原子で置換されたものである。本発明のペプチド化合物を構成する「アミノ酸」に含まれる同位体の例としては、水素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、リン原子、硫黄原子、フッ素原子、塩素原子などがあり、それぞれ、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６Ｃｌ等が含まれる。
本明細書におけるハロゲン原子としては、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩが挙げられ、Ｆ又はＣｌが好ましく例示される。ハロゲン原子を含む置換基としては、限定はされないがフルオロ（−Ｆ）、クロロ（−Ｃｌ）、ブロモ（−Ｂｒ）、ヨウド（−Ｉ）などが挙げられる。また、これらで１つ以上置換された、ハロゲンを置換基に有するアルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基などが例示され、より具体的には、フルオロアルキル、ジフルオロアルキル、トリフルオロアルキルなどが例示される。
Ｏ原子を含む置換基としては、ヒドロキシ（−ＯＨ）、オキシ（−ＯＲ）、カルボニル（−Ｃ＝Ｏ−Ｒ）、カルボキシ（−ＣＯ２Ｈ）、オキシカルボニル（−Ｃ＝Ｏ−ＯＲ）、カルボニルオキシ（−Ｏ−Ｃ＝Ｏ−Ｒ）、チオカルボニル（−Ｃ＝Ｏ−ＳＲ）、カルボニルチオ（−Ｓ−Ｃ＝Ｏ−Ｒ）、アミノカルボニル（−Ｃ＝Ｏ−ＮＨＲ）、カルボニルアミノ（−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ−Ｒ）、オキシカルボニルアミノ（−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ−ＯＲ）、スルホニルアミノ（−ＮＨ−ＳＯ２−Ｒ）、アミノスルホニル（−ＳＯ２−ＮＨＲ）、スルファモイルアミノ（−ＮＨ−ＳＯ２−ＮＨＲ）、チオカルボキシル（−Ｃ（＝Ｏ）−ＳＨ）、カルボキシルカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＯ２Ｈ）などの基が挙げられる。
オキシ（−ＯＲ）の例としては、アルコキシ、シクロアルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アラルキルオキシなどが挙げられる。アルコキシとしては、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ２アルコキシが好ましく、なかでもメトキシ、又はエトキシが好ましい。
カルボニル（−Ｃ＝Ｏ−Ｒ）の例としては、ホルミル（−Ｃ＝Ｏ−Ｈ）、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、アラルキルカルボニルなどが挙げられる。
オキシカルボニル（−Ｃ＝Ｏ−ＯＲ）の例としては、アルキルオキシカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニル、アルキニルオキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシカルボニル、アラルキルオキシカルボニルなどが挙げられる。
カルボニルオキシ（−Ｏ−Ｃ＝Ｏ−Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルオキシ、シクロアルキルカルボニルオキシ、アルケニルカルボニルオキシ、アルキニルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、ヘテロアリールカルボニルオキシ、アラルキルカルボニルオキシなどが挙げられる。
チオカルボニル（−Ｃ＝Ｏ−ＳＲ）の例としては、アルキルチオカルボニル、シクロアルキルチオカルボニル、アルケニルチオカルボニル、アルキニルチオカルボニル、アリールチオカルボニル、ヘテロアリールチオカルボニル、アラルキルチオカルボニルなどが挙げられる。
カルボニルチオ（−Ｓ−Ｃ＝Ｏ−Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルチオ、シクロアルキルカルボニルチオ、アルケニルカルボニルチオ、アルキニルカルボニルチオ、アリールカルボニルチオ、ヘテロアリールカルボニルチオ、アラルキルカルボニルチオなどが挙げられる。
アミノカルボニル（−Ｃ＝Ｏ−ＮＨＲ）の例としては、アルキルアミノカルボニル（例えば、Ｃ１−Ｃ６又はＣ１−Ｃ４アルキルアミノカルボニル、なかでもエチルアミノカルボニル、メチルアミノカルボニルなどが例示される。）、シクロアルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル、アルキニルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、ヘテロアリールアミノカルボニル、アラルキルアミノカルボニルなどが挙げられる。これらに加えて、−Ｃ＝Ｏ−ＮＨＲ中のＮ原子と結合したＨ原子が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された化合物が挙げられる。
カルボニルアミノ（−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ−Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルアミノ、シクロアルキルカルボニルアミノ、アルケニルカルボニルアミノ、アルキニルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ、アラルキルカルボニルアミノなどが挙げられる。これらに加えて−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ−Ｒ中のＮ原子と結合したＨ原子が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された化合物が挙げられる。
オキシカルボニルアミノ（−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ−ＯＲ）の例としては、アルコキシカルボニルアミノ、シクロアルコキシカルボニルアミノ、アルケニルオキシカルボニルアミノ、アルキニルオキシカルボニルアミノ、アリールオキシカルボニルアミノ、ヘテロアリールオキシカルボニルアミノ、アラルキルオキシカルボニルアミノなどが挙げられる。これらに加えて、−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ−ＯＲ中のＮ原子と結合したＨ原子がアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された化合物が挙げられる。
スルホニルアミノ（−ＮＨ−ＳＯ２−Ｒ）の例としては、アルキルスルホニルアミノ、シクロアルキルスルホニルアミノ、アルケニルスルホニルアミノ、アルキニルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、アラルキルスルホニルアミノなどが挙げられる。これらに加えて、−ＮＨ−ＳＯ２−Ｒ中のＮ原子と結合したＨ原子がアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された化合物が挙げられる。
アミノスルホニル（−ＳＯ２−ＮＨＲ）の例としては、アルキルアミノスルホニル、シクロアルキルアミノスルホニル、アルケニルアミノスルホニル、アルキニルアミノスルホニル、アリールアミノスルホニル、ヘテロアリールアミノスルホニル、アラルキルアミノスルホニルなどが挙げられる。これらに加えて、−ＳＯ２−ＮＨＲ中のＮ原子と結合したＨ原子がアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された化合物が挙げられる。
スルファモイルアミノ（−ＮＨ−ＳＯ２−ＮＨＲ）の例としては、アルキルスルファモイルアミノ、シクロアルキルスルファモイルアミノ、アルケニルスルファモイルアミノ、アルキニルスルファモイルアミノ、アリールスルファモイルアミノ、ヘテロアリールスルファモイルアミノ、アラルキルスルファモイルアミノなどが挙げられる。さらに、−ＮＨ−ＳＯ２−ＮＨＲ中のＮ原子と結合した２つのＨ原子はアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群より独立して選択される置換基で置換されていてもよく、またこれらの２つの置換基は環を形成しても良い。
Ｓ原子を含む置換基としては、チオール（−ＳＨ）、チオ（−Ｓ−Ｒ）、スルフィニル（−Ｓ＝Ｏ−Ｒ）、スルホニル（−ＳＯ２−Ｒ）、スルホ（−ＳＯ３Ｈ）などの基が挙げられる。
チオ（−Ｓ−Ｒ）の例としては、アルキルチオ、シクロアルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、アラルキルチオなどの中から選択される。
スルホニル（−ＳＯ２−Ｒ）の例としては、アルキルスルホニル、シクロアルキルスルホニル、アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、アラルキルスルホニルなどが挙げられる。
Ｎ原子を含む置換基として、アジド（−Ｎ３、「アジド基」ともいう）、シアノ（−ＣＮ）、１級アミノ（−ＮＨ２）、２級アミノ（−ＮＨ−Ｒ；モノ置換アミノともいう。）、３級アミノ（−ＮＲ（Ｒ'）；ジ置換アミノともいう。）、アミジノ（−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ２）、置換アミジノ（−Ｃ（＝ＮＲ）−ＮＲ'Ｒ"）、グアニジノ（−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ２）、置換グアニジノ（−ＮＲ−Ｃ（＝ＮＲ'''）−ＮＲ'Ｒ"）、アミノカルボニルアミノ（−ＮＲ−ＣＯ−ＮＲ'Ｒ"）、ピリジル、ピペリジノ、モルホリノ、アゼチジニルなどの基が挙げられる。
２級アミノ（−ＮＨ−Ｒ；モノ置換アミノ）の例としては、アルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、アリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、アラルキルアミノなどが挙げられる。
３級アミノ（−ＮＲ（Ｒ'）；ジ置換アミノ）の例としては、例えばアルキル（アラルキル）アミノなど、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルなどの中からそれぞれ独立して選択される、任意の２つの置換基を有するアミノ基が挙げられ、これらの任意の２つの置換基は環を形成しても良い。具体的には、ジアルキルアミノ、なかでもＣ１−Ｃ６ジアルキルアミノ、Ｃ１−Ｃ４ジアルキルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノなどが例示される。本明細書において「Ｃｐ−Ｃｑジアルキルアミノ基」とは、アミノ基にＣｐ−Ｃｑアルキル基が２個置換された基をいい、両Ｃｐ−Ｃｑアルキル基は同一であっても異なっていてもよい。
置換アミジノ（−Ｃ（＝ＮＲ）−ＮＲ'Ｒ"）の例としては、Ｎ原子上の３つの置換基Ｒ、Ｒ'、およびＲ"が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルの中からそれぞれ独立して選択された基、例えばアルキル（アラルキル）（アリール）アミジノなどが挙げられる。
置換グアニジノ（−ＮＲ−Ｃ（＝ＮＲ'''）−ＮＲ'Ｒ"）の例としては、Ｒ，Ｒ'、Ｒ"、およびＲ'''が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルの中からそれぞれ独立して選択された基、あるいはこれらが環を形成した基などが挙げられる。
アミノカルボニルアミノ（−ＮＲ−ＣＯ−ＮＲ'Ｒ"）の例としては、Ｒ、Ｒ'、およびＲ"が、水素原子、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルの中からそれぞれ独立して選択された基、あるいはこれらは環を形成した基などが挙げられる。
本明細書において、「ヘテロ原子を環内に有する」とは、環を構成する原子中にヘテロ原子を含有することを意味し、そのような基としては、ピリジル基などのヘテロアリール基、ピペリジノ基、モルホリノ基、アゼチジニル基などが例示される。また、前記ヘテロ原子が酸素原子の場合に、「環内に酸素原子を有する」などと表記される。
本明細書では、「翻訳アミノ酸」又は「翻訳可能なアミノ酸」とは、「アミノ酸」のうち、翻訳させることのできる側鎖を有するものを指す。非限定の一態様において、本明細書におけるアミノ酸は、翻訳可能なアミノ酸であってもよい。
本明細書において「ドラッグライクネス」あるいは「ドラッグライク」とは、代謝安定性と膜透過性が優れた性質をいう。本明細書において「ドラッグライクなアミノ酸」とは、α、β及びγアミノ酸であり、主鎖アミノ基（ＮＨ２基）の水素原子２つのうちの１つ、又は主鎖メチレン基（−ＣＨ２−基）の水素原子のうち１つあるいは２つはアルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基などで置換されていてもよい。これら置換基は、さらに「ドラッグライクネスに寄与する置換基」で置換されていてもよい。後述する「長側鎖」を有するアミノ酸が、ドラッグライクなアミノ酸として好ましく例示される。また、ドラッグライクなアミノ酸は、Ｌ型アミノ酸、Ｄ型アミノ酸、α、α−二置換アミノ酸、Ｎ置換アミノ酸等であってもよい。ドラッグライクなアミノ酸は、翻訳可能な必要は必ずしも無い。「翻訳アミノ酸」から得られたペプチドの側鎖部分（例えばD−チロシンにてヒット化合物が取得された場合には、そこから化学修飾させたD型のアミノ酸、β−アラニンにてヒット化合物が取得された場合には、そこから化学修飾させたβ−アミノ酸）、あるいはNメチルアミノ酸の化学変換によるN置換部分の構造最適化により化学的に合成し得るアミノ酸を含む。これらのアミノ酸はドラッグライクなペプチド化合物の構成要素として機能するため、翻訳後に実施する化学修飾によって得られるペプチド化合物がドラッグライクとなるような範囲から選択される。以下にて述べるとおり、例えばアミノアルキル基を有するリジンは、アミノ基が翻訳後修飾に関与しない場合にはドラッグライクなアミノ酸には含まれない。しかしながら、リジンのアミノ基を翻訳後修飾の反応性官能基として活用する場合（例えば交差ユニット）にはリジンユニットをドラッグライクなアミノ酸のユニットとして含む。このように、「ドラッグライクなアミノ酸」に該当するかどうかは、翻訳後の修飾によって変換された後の官能基にて判断される。このような置換基になり得る例として、別途上で定義した置換基の中から、例えばエステル基（−ＣＯ−ＯＲ）、チオエステル基（−ＣＯ−ＳＲ）、チオール基（−ＳＨ）、あるいは保護されたチオール基、アミノ基（−ＮＨ２）、モノ置換アミノ基（−ＮＨ−Ｒ）あるいはジ置換アミノ基（−ＮＲＲ'）、あるいは保護されたアミノ基、置換スルホニルアミノ基（−ＮＨ−ＳＯ２−Ｒ）、アルキルボラン基（−ＢＲＲ'）、アルコキシボラン基（−Ｂ（ＯＲ）（ＯＲ'））、アジド基（−Ｎ３）、ケト酸基（−ＣＯ−ＣＯ２Ｈ）、チオカルボン酸基（−ＣＯ−ＳＨ）、ホスホリルエステル基（−ＣＯ−ＰＯ（Ｒ）（Ｒ'））、アシルヒドロキシアミノ基（−ＮＨ−Ｏ−ＣＯ−Ｒ）などが挙げられる。詳細は後述するが、本開示における一態様では、インドール骨格、及び／又は、置換若しくは無置換のヒドロキシフェニル基は、本開示におけるドラッグライクなアミノ酸に含まれない。前記ドラッグライクなアミノ酸の側鎖に含まれる隣接しない１又は２個のメチレン基は、酸素原子、カルボニル基（−ＣＯ−）、又はスルホニル基（−ＳＯ２−）で置換されていてもよい。
本明細書における「ドラッグライクネスに寄与する置換基」としては、例えば、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ等）、ヒドロキシ（−ＯＨ）、アルコキシ基（−ＯＲ）、オキシ（−ＯＲ）、アミド（−ＮＲ−ＣＯＲ'もしくは−ＣＯ−ＮＲＲ'）、スルホニル（−ＳＯ２−Ｒ）、スルフィニル（−ＳＯＲ）、オキシアミノ（−ＮＲ−ＯＲ'）、アミノオキシ（−Ｏ−ＮＲＲ'）、オキシカルボニル（−ＣＯ−ＯＲ）、チオカルボニル（−ＣＯ−ＳＲ）、チオール（−ＳＨ）、チオ（−ＳＲ）、１級アミノ（−ＮＨ２）、２級アミノ（−ＮＨＲ）あるいは３級アミノ（−ＮＲＲ'）、スルホニルアミノ（−ＮＨ−ＳＯ２−Ｒ）、ボリル（−ＢＲＲ'）、ジオキシボリル（−Ｂ（ＯＲ）（ＯＲ'））、アジド（−Ｎ３）、カルボキシカルボニル（−ＣＯ−ＣＯ２Ｈ）、ホスホリルカルボニル（−ＣＯ−ＰＯ（Ｒ）（Ｒ'））、カルボニルオキシアミノ（−ＮＨ−Ｏ−ＣＯ−Ｒ）、ヒドロキシアミノ（−ＮＲ−ＯＲ'）、アミノヒドロキシ（−Ｏ−ＮＲＲ'）等の置換基が例示される。
本明細書において「縮環構造」とは、二つまたはそれ以上の環をもつ環式化合物において、複数の環が２個またはそれ以上の原子を共有している環式構造をいう。「２以上の芳香環による縮環構造」とは、二つまたはそれ以上の芳香環をもつ環式化合物において、複数の芳香環が２個またはそれ以上の原子を共有している環式構造をいう。限定を意図しないが、縮環構造としては、インドール骨格、ベンゾフラン骨格、ベンゾイミダゾール骨格、キノリン骨格、ビシクロ[4.4.0]デカンなどが例示される。
本明細書において「置換のヒドロキシフェニル基」とは、ヒドロキシフェニル基の芳香環の少なくとも一つの水素原子が置換基で置換された基をいう。該置換基は、上述のアミノ酸側鎖における置換基と同様に選択されるが、好ましくはハロゲンが例示され、中でもフッ素が好ましい。限定を意図しないが、置換のヒドロキシフェニル基としては、３−フルオロ−４−ヒドロキシフェニル基が例示される。なお、本明細書における芳香環の水素原子に、ヒドロキシフェニル基におけるヒドロキシ基（−ＯＨ）のＨは含まれない。例えば、メトキシフェニル基は、本明細書における「置換のヒドロキシフェニル基」、及び「無置換のヒドロキシフェニル基」のいずれにも含まれない。
本明細書において「無置換のヒドロキシフェニル基」とは、置換基を有しないヒドロキシフェニル基を意味する。また、置換のヒドロキシフェニル基及び無置換のヒドロキシフェニル基を合わせて、「置換又は無置換のヒドロキシフェニル基」と呼ぶことがある。
本明細書において「置換又は無置換のＸＸ基を有しない」とは、置換のＸＸ基、及び無置換のＸＸ基のいずれをも有しないことを意味する。
本明細書において「複素環基」とは、ヘテロ原子（例えばＮ、Ｏ、Ｓなど）を環内に少なくとも一つ有する基をいう。ヘテロ原子としてはＮ又はＯが好ましく、ヘテロ原子の数は１又は２個が好ましく、４〜６員環であることが好ましい。複素環基としては、ピリジル基、ピペリジノ基、モルホリノ基、及びアゼチジニル基が好ましく例示される。
本明細書において「翻訳合成」とは、ペプチド部位をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）から、該ペプチド部位を翻訳して合成することを意味する。翻訳とは、リボソームの作用によってｍＲＮＡを鋳型にアミド結合及び／又はエステル結合反応を繰り返すことによって直鎖ペプチドを得る工程である。
本明細書において「翻訳後修飾」とは、翻訳後にリボソームの作用以外で自動的にあるいは、酵素や試薬により生じさせる化学反応を意味し、限定を意図しないが、例えば脱アミノ酸反応、環化反応、脱硫反応、脱保護反応、直鎖部を形成するための反応を挙げることができる。
本明細書において、「〜から実質的になる」とは、そこに挙げられた成分（環状ペプチド化合物、アミノ酸、核酸などが例示されるが、これらに限定されない。）が主たる成分であり、その他の成分については、本発明の一態様における効果に負の影響を与えない成分、又は負の影響を与えない量、若しくは態様であれば含んでいてもよいことを意味する。例えば、本発明の一態様における効果に負の影響を与えない成分、又は負の影響を与えない量、若しくは態様であれば、そこに挙げられていない成分（例えば、副反応物、未反応物等）を含んでいてもよい。
本明細書において、「〜を実質的に含まない」とは、そこに挙げられた成分（環状ペプチド化合物、アミノ酸、核酸などが例示されるが、これらに限定されない。）を含まないか、又は含んでいたとしても、その成分が本発明の一態様における効果に負の影響を与えない成分であるか、又は負の影響を与えない量、若しくは態様であることを意味する。例えば、本発明の一態様における効果に負の影響を与えない成分、又は影響を与えない量、若しくは態様であれば、そこに挙げられた成分であっても含んでいてもよい。
本明細書において、発明の効果に関する文脈で使用される「負の影響」とは、発明の効果を打ち消してしまうような影響をいう。例えば、本来発揮されるはずの発明の効果を１００％とした場合に、その効果が３０％、２０％、１０％、又は５％以下になるような場合に「負の影響」があるとすることができる。
例えば、パニングによって本来得られるはずのヒット率が１％であった場合に、そのヒット率が０．３％以下になるような場合に負の影響があるとすることができる。また、本来はパニングによって得られるTrpを含まないヒット化合物の割合が１００％である場合に、Trpを含まないヒット化合物の割合が３０％以下になるような場合に負の影響があるとすることができるが、これらに限定されるものではない。
ペプチド化合物
限定を意図しないが、本開示における「ペプチド化合物」には、鎖状ペプチド化合物、及び環状ペプチド化合物が含まれる。また、本開示におけるペプチド化合物には、ペプチド、ペプチドと核酸の複合体（ペプチド−核酸複合体）、ペプチドとリボソームと核酸の複合体等が含まれる。限定を意図しないが、本開示におけるペプチド化合物には、鎖状ペプチド、環状ペプチド、鎖状ペプチド部位と核酸の複合体（鎖状ペプチド−核酸複合体）、及び環状ペプチド部位と核酸の複合体（環状ペプチド−核酸複合体）が含まれる。非限定の一態様において、環状ペプチド化合物の環状部は、翻訳合成されたペプチド化合物を環化反応に供することにより形成される。本明細書において、ペプチドそのもの、又はペプチド−核酸複合体におけるペプチドの部分を「ペプチド部位」と記載する場合がある。また、本開示における「核酸」にはＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びｔＲＮＡが含まれる。本明細書において、ペプチド化合物を構成する「アミノ酸」を「アミノ酸残基」ということがある。本明細書において、環状部を有するペプチド化合物を「環状ペプチド化合物」とよぶことがある。本明細書において、ペプチド化合物の「環状部」とは、２以上のアミノ酸残基が連結され、形成されている環状の部分を意味する。本明細書において、環状ペプチド化合物の部分構造を指す際に使用される「直鎖部」とは、環状部の主鎖構造に含まれない部分であって、該部分の鎖上に少なくとも一つのアミド結合及び／又はエステル結合を有するものをいう。また、本明細書における「ペプチド化合物」には、その薬学的に許容される塩が含まれてもよい。
本明細書におけるペプチド化合物の「ペプチド部位」とは、２〜１００個、３〜５０個、又は４〜３０個のアミノ酸が、アミド結合及び／又はエステル結合により連結されている部位をいう。ただし、ペプチド部位が環状部を含む場合には、環化部の結合様式は特に限定されない。環化部の結合様式としては、例えば、アミド結合、炭素−炭素結合、ジスルフィド結合、エステル結合、チオエステル結合、チオエーテル結合、ラクタム結合、トリアゾール構造を介した結合、フルオロフォア構造を介した結合などの共有結合を介して環化されていることが好ましく、中でも代謝安定性が高いことから、アミド結合が好ましい。すなわち、一態様において、本開示における環状ペプチド化合物は、環化部にアミド結合を有することが好ましい。「環化部の結合様式」とは、環化反応により環化が形成された部位の結合様式のことである。
本明細書において「環化反応」とは、ペプチド化合物のペプチド部位に環状部を形成させる反応をいう。一態様において、環化反応により環状部が形成されたペプチド化合物を更に化学修飾、又は反応させて得られるペプチド化合物も、本開示におけるペプチド化合物に含まれる。また、環化反応の前に化学修飾等を行ってもよい。
スキームＡは、本開示におけるペプチド化合物のペプチド部位の環化反応の一例である。白丸（○）ユニット（交差ユニット）、黒丸（●）ユニット（環状部主鎖ユニット）、四角（■）ユニット（直鎖部主鎖ユニット）、三角（▲）ユニット（環化Ｎ末端ユニット）はそれぞれペプチド部位を構成するアミノ酸残基を意味する。それぞれのユニットは同一のアミノ酸であっても、異なるアミノ酸であってもよい。
Figure 2018225864
本明細書における「ユニット」とは、本開示における鎖状ペプチド化合物の合成後環化前のアミノ酸、環化後のアミノ酸、環化後の化学修飾が完了した時点でのアミノ酸のいずれかを意味する。環化後の化学修飾が完了した時点でのアミノ酸残基には、例えば、１つのｔＲＮＡによって翻訳されたアミノ酸残基が、翻訳後の化学修飾により、化学変換や骨格変換されたアミノ酸残基が含まれる。
スキームＡにおいては、環状部とは１つの三角ユニットと８つの黒丸ユニット及び１つの白丸ユニットからなる部位であり、直鎖部とは６つの四角ユニットからなる部位である。スキームＡの曲線部分が、環化される部位（本明細書において「環化部」又は「翻訳後環化部」ともいう。）である。
一態様において、本開示におけるペプチド化合物のペプチド部位は、スキームＡに記載の三角ユニットや交差ユニットに反応性官能基を要求するため、環化前のペプチド化合物においては、三角ユニットや交差ユニットには必ずしもドラッグライクなアミノ酸が選択されない。
一態様において、環化前のペプチド化合物において、三角ユニットや交差ユニットがドラッグライクなアミノ酸ではない場合や本来は好ましくないアミノ酸である場合であっても、環化後に化学修飾等を行うことによって、三角ユニットや交差ユニットをドラッグライクなアミノ酸や好ましいアミノ酸とすることができる。
一態様において、本開示におけるペプチド化合物の環化前のペプチド部位における三角ユニット（環化前Ｎ末端ユニット）には、チオール基をアミノ基近傍に有するアミノ酸残基であって、チオール基とアミノ基の両方が保護基によって保護されたものを利用することができる。
一態様において、本開示におけるペプチド化合物の環化前のペプチド部位における交差ユニットには、三角ユニットのアミノ酸が有する官能基（第一の反応点）と反応することで環化できる官能基（第二の反応点）を側鎖に有するアミノ酸を用いるのが好ましい。交差ユニットでは、主鎖のアミノ基、及びカルボキシ基が翻訳合成等で他のアミノ酸残基との共有結合形成に使用され、かつ第三の官能基が環化に必要であるため、合計３つ以上の官能基を有することが好ましい。この中で、環化反応には、交差ユニットの側鎖部位の官能基を用いるのが好ましい。
交差ユニットは、環化可能な位置であれば、環化前ペプチド部位中の任意の位置に組み込むことが可能であるが、環化、もしくは環化後の翻訳後修飾が施された後の環状部のアミノ酸の数が５〜２０、又は７〜２０となるような位置に組み込むことが好ましく、５〜１３、８〜１３となる位置に組み込むことがより好ましく、８〜１１となる位置に組み込むことが更に好ましい。すなわち、本開示におけるペプチド化合物の交差ユニットは、三角ユニットから少なくとも４アミノ酸残基（例えば、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸残基）Ｃ末端側の位置に組み込むことが好ましい。
黒丸ユニット、四角ユニットはアミノ酸より選択され、好ましくはドラッグライクなアミノ酸から選択される。
非限定の一態様において、本開示における環状ペプチド化合物のペプチド部位は、１以上、又は２以上の直鎖部を有していてもよく、直鎖部の数としては０、１、又は２個が例示される。本開示における環状ペプチド化合物は、特に限定されないが、例えば、スキームＡ−１又はＡ−２のように記載することができる。
Figure 2018225864
本明細書において「アミノ酸の数」とは、ペプチドを構成するアミノ酸残基（アミノ酸ユニット）の数のことであり、アミノ酸を連結しているアミド結合、エステル結合、及び環化部の結合を切断した際に生じるアミノ酸ユニットの数を意味する。したがって、ペプチド化合物又はペプチド部位のアミノ酸の数（ペプチド化合物又はペプチド部位を構成するアミノ酸の数ともいう。）とは、核酸部位を除いた、環状部及び直鎖部を含むペプチド部位全体に含まれるアミド結合、エステル結合、及び環化部の結合を切断した際に生じるアミノ酸ユニット数をいう。
本明細書において「環状部を構成するアミノ酸」（「環状部のアミノ酸」ともいう。）とは、環状ペプチド化合物のペプチド部位に存在するアミド結合、エステル結合、及び、環化部の結合を切断した場合に生じるアミノ酸のうち、環状部の主鎖上に存在するアミノ酸をいい、直鎖部を構成するアミノ酸はこれに含めない。本明細書において「環状部を構成するアミノ酸の数」とは、前記環状部の主鎖上に存在するアミノ酸ユニット数をいう。
本開示における環状ペプチド化合物における、ペプチド部位を構成するアミノ酸の数は、特に限定されないが、３０以下が好ましい。高い膜透過性を獲得するためには、核酸連結部以外のペプチド部位のアミノ酸の数は、２０以下が好ましく、１８以下、１６以下、１５以下、又は１４以下がより好ましく、１３以下が特に好ましく、具体的には、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、及び１８が例示される。高い代謝安定性を獲得するためには、核酸連結部以外のペプチド部位のアミノ酸の数は、８以上であることが好ましく、９以上がより好ましく、１０以上が更に好ましく、１１以上が特に好ましい。膜透過性と代謝安定性の両立を考慮すると、核酸連結部以外のペプチド部位のアミノ酸の数は、５〜２０、又は７〜２０が好ましく、７〜１７、８〜１６、９〜１６、又は１０〜１６がより好ましく、８〜１３、１０〜１５、１１〜１５、１０〜１４、１０〜１３、又は１１〜１４がさらに好ましく、１１〜１３が特に好ましい。
本明細書において「核酸連結部以外のペプチド部位」とは、環状ペプチド−核酸複合体において、核酸が連結されている直鎖部（「核酸連結部」ともいう。）を除いた部分を指す。また、核酸連結部を有しないペプチド化合物においては、ペプチド部位全体を「核酸連結部以外のペプチド部位」と称する。例えば、前記スキームＡ−２において、直鎖部１の先端に核酸が連結されている場合には、該直鎖部１以外の部分、すなわち環状部及び直鎖部２を合わせた部分が「核酸連結部以外のペプチド部位」となる。よって、環状ペプチド−核酸複合体における「核酸連結部以外のペプチド部位を構成するアミノ酸の数」又は「核酸連結部以外のペプチド部位のアミノ酸の数」とは、ペプチド部位を構成するアミノ酸から、核酸が連結されている直鎖部のアミノ酸を除いた部分のアミノ酸ユニット数をいう。「核酸連結部以外のペプチド部位」としては、環状ペプチド−核酸複合体において、核酸連結部を除いた部分であることが好ましい。
本開示における環状ペプチド化合物の環状部を構成するアミノ酸の数は限定されないが、例えば、４以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、２０以下、１８以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、及び１６が挙げられる。膜透過性と代謝安定性の両立を考慮すると、前記環状部を構成するアミノ酸の数は、５〜１５が好ましく、５〜１４、７〜１４、又は８〜１４がより好ましく、８〜１３、９〜１３、８〜１２、８〜１１、又は９〜１２がさらに好ましく、９〜１１が特に好ましい。
非限定の一態様において、直鎖部のアミノ酸の数（ユニットの数）は０〜８であることが好ましく、０〜５がより好ましく、０〜３がより好ましい。なお、非限定の一態様において、本明細書における「直鎖部」には天然アミノ酸や非天然アミノ酸（化学修飾や骨格変換されたアミノ酸を含む）が含まれる場合がある。
非限定の一態様において、本開示における環状ペプチド化合物の核酸連結部以外のペプチド部位に含まれる非天然アミノ酸の数は、２以上が好ましく、４以上、５以上、又は６以上がより好ましく、７以上が更に好ましく、８以上が特に好ましく、また、２０以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１０以下、９以下が好ましく例示される。本開示における環状ペプチド化合物に含まれる非天然アミノ酸の数としては、環状部を構成するアミノ酸の数、又は核酸連結部以外のペプチド部位に含まれるアミノ酸の数の３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上が例示される。
非限定の一態様において、本開示における環状ペプチド化合物の核酸連結部以外のペプチド部位に含まれるＮ置換アミノ酸の数は、３以上が好ましく、４以上、５以上、又は６以上がより好ましく、７以上が更に好ましく、８以上が特に好ましく、また、２０以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１０以下、９以下が好ましく例示される。本開示における環状ペプチド化合物に含まれるＮ置換アミノ酸の数としては、環状部を構成するアミノ酸の数、又は核酸連結部以外のペプチド部位に含まれるアミノ酸の数の３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上が例示される。ここでいうＮ置換アミノ酸は、好ましくはＮ−アルキルアミノ酸、より好ましくはＮ−メチルアミノ酸であってよい。すなわち、非限定の一態様においては、前記Ｎ置換アミノ酸の数は、Ｎ−アルキルアミノ酸の数、又はＮ−メチルアミノ酸の数として、例示されるが、この場合であっても、核酸連結部以外のペプチド部位にその他のＮ置換アミノ酸が含まれることは否定されない。
限定を意図しないが、後述の実施例に示されるように、核酸連結部以外のペプチド部位、環状部、又は環状部の側鎖に含まれる芳香環の数、又は割合は、環状ペプチド化合物の膜透過性に影響を与え得る。トリプトファンやチロシン残基を含まない環状ペプチド化合物であっても、核酸連結部以外のペプチド部位、環状部、又は環状部の側鎖に含まれる芳香環の数、又は割合が一定数を超えると、高い膜透過性を有する化合物が得られる確率が低下し得る。
非限定の一態様において、高い膜透過性のためには、本開示における環状ペプチド化合物の核酸連結部以外のペプチド部位、環状部、又は環状部の側鎖に含まれる芳香環の数は３以下であることが好ましく、０、１、２、又は３が好ましく例示され、０〜３、１〜３が好ましい範囲として例示される。また、核酸連結部以外のペプチド部位、又は環状部を構成するアミノ酸の数に対する、核酸連結部以外のペプチド部位、環状部、又は環状部の側鎖に含まれる芳香環の数の割合としては、４０％以下が好ましく、３５％以下、３０％以下、２７％以下、２５％以下、２０％以下が好ましく例示される。
非限定の一態様において、高い膜透過性のためには、本開示における環状ペプチド化合物に含んでよい芳香環の数に制限があることから、標的分子との結合に寄与し得る部位である環状部の長側鎖に芳香環を有しているのが好ましい。すなわち、一態様において、本開示における環状ペプチド化合物の環状部の長側鎖に含まれる芳香環の数として、１、２、又は３が例示され、１〜３又は２〜３の範囲が例示される。また、本開示における環状ペプチド化合物の核酸連結部以外のペプチド部位、環状部、又は環状部の側鎖に含まれる芳香環の数に対する、環状部の長側鎖に含まれる芳香環の数の割合としては、３０％以上、４５％以上、６０％以上、８０％以上、又は１００％が例示される。
本明細書において「芳香環の数」（「Aromatic Ring Count」（ＡＲＣ）ともいう。）とは、環状ペプチド化合物の核酸連結部以外のペプチド部位、環状部、又は環状部の側鎖に含まれる芳香環の数をいい、例えば、フェノール基は１個、インドール骨格のような二環式縮環は２個、アントラセンのような三環式縮環は３個と数える。
非限定の一態様において、本開示における環状ペプチド化合物のClogPは、４以上が好ましく、５以上がより好ましく、６以上が更に好ましく、８以上が特に好ましく、１８以下、１７以下、１６以下が好ましく例示され、４〜１８、５〜１７、及び６〜１６が例示される。本明細書におけるClogPは、コンピューターで計算した分配係数であって、Daylight Chemical Information Systems, Inc.のDaylight Version 4.9を用いて計算できる。
非限定の一態において、本開示における環状ペプチド化合物のClogP/total aaは、１.０以上が好ましく、１．１以上がより好ましく、１．２以上が更に好ましく、１．８以下、１．７以下、１．６以下、１．５以下が好ましく例示され、１．０〜１．８、１．０〜１．７、１．１〜１．６、及び１．１〜１．５が例示される。本明細書において「total aa」 (「total AA」とも表記される。) とは、ペプチド化合物の核酸連結部以外のペプチド部位を構成するアミノ酸の数を意味する。例えば、環状部が１０個のアミノ酸からなり、核酸が連結していない直鎖部が１個のアミノ酸からなる環状ペプチド化合物のtotal aaは１１である。本明細書においてClogP/total aaとは、ClogPをtotal aaで除することにより算出される。
非限定の一態様において、本開示における環状ペプチド化合物、又はその核酸連結部以外のペプチド部位の分子量は５００〜２０００であってよい。
本明細書において「側鎖」とは、アミノ酸の側鎖、又は環状ペプチド化合物の環状部の側鎖などの文脈で使用され、それぞれの主鎖構造に含まれない部分を側鎖と称する。ただし、環状ペプチド化合物のペプチド部位に核酸が結合している場合には、その核酸部分及び核酸連結部は環状部の側鎖に含まれない。
本明細書におけるアミノ酸の側鎖には、アミノ酸に含まれる炭素原子（例えば、α、β、又はγ−炭素原子）に結合している鎖、及び窒素原子に結合している鎖が含まれる。本明細書において、アミノ酸の側鎖の長さは、以下の方法により求めることができる。すなわち、アミノ酸単位のＮ末をアセチル基、Ｃ末をメチルアミノ基でキャッピングし、分子モデリングソフトＭＯＥ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ社）のＬｏｗＭｏｄｅＭＤにより配座を発生させ、側鎖部位が結合している原子（天然アミノ酸の場合はα−炭素原子（Ｃα炭素））から最も遠い同側鎖の原子（水素原子は除く）までの距離を測定することで求めることができる。例としてＰｈｅまたはnBuGlyの側鎖の長さの求め方を以下に示す。
Figure 2018225864
また、アミノ酸側鎖が主鎖構造の一部と環を形成している場合は、側鎖部分が結合している原子が複数個存在することになる。その場合の側鎖の長さは上記と同様の計算をそれぞれの側鎖部分が結合している原子と最も遠い側鎖の原子（水素原子は除く）に対して行い、求めた距離のうち最も長いものとする。例としてＨｙｐ（Ｅｔ）を示すと、窒素原子からもとめた側鎖の距離は６．０４Å、Ｃα炭素から求めた側鎖の距離は６．０９Åであることから、Ｈｙｐ（Ｅｔ）の側鎖の距離は６．０９Åとする。
Figure 2018225864
上述の方法により算出したアミノ酸の側鎖の長さを表１−１および表１−２に示す。
Figure 2018225864
Figure 2018225864
本明細書において「環状部の側鎖」とは、環状ペプチド化合物の環状部の主鎖構造に含まれない部分をいう。環状部の側鎖の起点（側鎖部位が結合している原子）は特に限定されず、環状部を構成する炭素原子、及び窒素原子が例示され、このうち炭素原子としては、環状部を構成するアミノ酸のα、β、及びγ−炭素原子が例示される。環状ペプチド化合物の環状部の側鎖の長さは、環状部を構成する各アミノ酸について、上述したアミノ酸の側鎖の長さの算出方法を用いて算出できる。本明細書における「環状部の側鎖」は、その側鎖上にアミド結合及び／又はエステル結合を有していてもよい。例えば、環状ペプチド化合物が、３個以上のアミノ酸から構成される直鎖部（例えば、３個の四角ユニットから構成される、スキームＡ−２の直鎖部２）を有する場合であって、該直鎖部が核酸と連結されていないときには、該直鎖部は「環状部の側鎖」にもなり得る。本明細書において「ペプチド部位の側鎖」とは、ペプチド部位を構成するアミノ酸の側鎖を意味する。
非限定の一態様において、本開示における環状ペプチド化合物の環状部又はペプチド部位を構成するアミノ酸には、長側鎖を有するアミノ酸が少なくとも一つ、二つ、又は三つ含まれていてよい。また、長側鎖を有するアミノ酸は連続して存在してよく、間に他のアミノ酸を挟んでいてもよい。本開示における環状ペプチド化合物は、その環状部又はペプチド部位に長側鎖を少なくとも一つ、二つ、又は三つ含んでいてよい。一態様において、本開示における環状ペプチド化合物は、その環状部又はペプチド部位に長側鎖を有してよい。この長側鎖により、標的分子との高い結合親和性を有し得る。また、一態様において、長側鎖を適切に選択することで、標的分子との結合親和性を維持しつつ、膜透過性の高い環状ペプチド化合物を得ることが出来る。
本明細書において「長側鎖」とは、５．４オングストローム以上の長さの側鎖をいう。前記側鎖の長さとしては、５．８オングストローム以上、又は６．０オングストローム以上が好ましく、６．２オングストローム以上がより好ましく、６．４オングストローム以上が特に好ましい。前記側鎖の長さの上限は特に限定されないが、２０オングストローム以下，１５オングストローム以下、１３オングストローム以下、１２オングストローム以下、１１オングストローム以下、１０オングストローム以下、９．０オングストローム以下、８．８オングストローム以下、８．５オングストローム以下、及び８．０オングストローム以下が例示される。前記側鎖の長さとしては、５．４〜２０オングストローム、５．４〜１５オングストローム５．４〜１３オングストローム、５．４〜１０オングストローム、５．４〜９．０オングストローム、６．０〜２０オングストローム、６．０〜１５オングストローム、６．０〜１３オングストローム、６．０〜１０オングストローム、６．０〜９．０オングストローム、６．０〜８．５オングストローム、６．０〜８．０オングストロームが例示される。一態様において「長側鎖」は、（ｉ）その側鎖上にアミド結合を含まないか又は１個のアミド結合を含む側鎖がより好ましく、（ｉｉ）その側鎖上にアミド結合を含まない側鎖であってもよい。すなわち、非限定の一態様において、その側鎖に２個以上のアミド結合を有さず、かつ、長さが６．０〜１０オングストロームの長側鎖を環状部に有する環状ペプチド化合物が好ましく例示される。本開示における長側鎖は、芳香環を有していても、有していなくてもよい。非限定の一態様において、本開示における環状ペプチド化合物は、環状部に含まれる少なくとも一種、又は二種以上の長側鎖に芳香環を有していてよい。
本明細書において「長側鎖」は、側鎖部位が結合している原子（天然アミノ酸の場合はα−炭素原子）から最も遠い同側鎖の原子（水素原子は除く）までの鎖上の原子数が６以上、７以上、８以上であってよく、１５以下、１３以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下であってよい。具体的な原子数としては、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、及び１５以下が例示される。前記「側鎖部位が結合している原子から最も遠い同側鎖の原子までの鎖上の原子数」を数える際には、側鎖部位が結合している原子（天然アミノ酸の場合はα−炭素原子であるが、例えばＮ置換アミノ酸の場合は窒素原子であってよい。）を算入する。すなわち、例えばＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒにおいては、それぞれ４、６、７となる。
非限定の一態様において、本明細書における長側鎖は、以下で定義されるＲ１を含んでいてよい。
非限定の一態様において、本明細書における長側鎖は、以下一般式（Ｉ−１）又は（Ｉ−２）で表される側鎖であってよい。
Figure 2018225864
本明細書において、
Figure 2018225864
は結合点を表し、
Figure 2018225864
は窒素又は炭素原子との結合点を表し、
Figure 2018225864
は炭素原子との結合点を表す。
Figure 2018225864
が結合する炭素原子は、
Figure 2018225864
が結合する炭素原子と同一であっても、異なっていてもよい。
前記Ｂ１としては、単結合、置換されていてもよいＣ１−Ｃ５アルキレン基、又はＣ３−Ｃ８シクロアルキレン基が好ましく、該アルキレン基又はシクロアルキレン基の隣接しない１又は２個のメチレン基が酸素原子で置換されていてもよい。Ｂ１がアルキレン基の場合、本明細書における長側鎖は、以下一般式（Ｉ−３）でも表される。
―（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１ （Ｉ−３）
[式中、
ｎは１〜５の整数であり；
アルキレン基の隣接しない１又は２個のメチレン基が酸素原子で置換されていてもよい。]
前記Ｂ２としては、以下一般式（Ｉ−４）又は（Ｉ−５）で表される基が好ましい。
Figure 2018225864
［式中、
ｑは１〜３の整数であり；
Ｍ１は置換されていてもよいＣ１−Ｃ４アルキレン基を表し、該アルキレン基の隣接しない１又は２個のメチレン基が酸素原子で置換されていてもよく；
Ｍ２は水素原子、又は置換されていてもよいＣ１−Ｃ４アルキル基を表し；
Ｍ１とＭ２がそれらが結合している原子と一緒になって３〜６員環の環状構造を形成していてもよく、該環状構造はＣ１−Ｃ４アルキル基又はハロゲン原子で置換されていてもよく、環内に酸素原子を有していてもよい。]
一般式（Ｉ−４）において、Ｍ１とＭ２がそれらが結合している原子と一緒になって３〜６員環の環状構造を形成した場合の側鎖を有するアミノ酸の部分構造としては、以下のものが例示される。
Figure 2018225864
非限定の一態様において、本開示におけるＲ１は、
（ａ）フェニル基、若しくは、（ｂ）酸素原子及び窒素原子からなる群より独立に選択されるヘテロ原子を環内に１〜３個有している４〜６員の複素環基、
ここで（ａ）及び（ｂ）は下記Ａ群より独立に選択される置換基を少なくとも一つ有していてもよく、
Ａ群：オキソ、ハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−Ｃ４アルキル基、及びＣ１−Ｃ４ジアルキルアミノ基、（ここで、Ｃ１−Ｃ４アルキル基中の隣接しない１又は２個のメチレン基が酸素原子で置換されていてもよい）
又は、
（ｃ）以下の一般式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、若しくは（ＩＶ）：
Figure 2018225864
[式中、
Ｘ１は単結合、又は下記Ｂ群より独立して選択される置換基を少なくとも一つ有していてもよいＣ１−Ｃ２アルキレン基を表し、
Ｘ２は単結合、又は下記Ｂ群より独立して選択される置換基を少なくとも一つ有していてもよいＣ１−Ｃ２アルキレン基を表し、
Ｙ１は単結合、酸素原子、カルボニル基（−ＣＯ−）、又はスルホニル基（−ＳＯ２−）を表し、
Ｙ２は単結合、Ｃ１−Ｃ４アルキル基で置換されていてもよいＣ１−Ｃ２アルキレン基、カルボニル基（−ＣＯ−）、又はスルホニル基（−ＳＯ２−）を表し、
Ｚ１は単結合、下記Ｂ群より独立して選択される置換基を少なくとも一つ有していてもよいメチレン基、又は酸素原子を表し、
Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ２−Ｃ４アルケニル基、又はＣ２−Ｃ４アルキニル基を表し、ここで該Ｃ１−Ｃ６アルキル基は、ハロゲン原子で置換されていてもよく、また、該Ｃ１−Ｃ６アルキル基中の隣接しない１若しくは２個のメチレン基が酸素原子で置換されていてもよくていてもよく、
Ｒ２及びＲ３、又はＲ２及びＸ１はそれらが結合している原子と一緒になって４〜６員環の環状構造を形成していてもよく、この場合に該環状構造は、Ｃ１−Ｃ４アルキル基又はハロゲン原子で置換されていてもよく、環内に酸素原子を有していてもよく、該環状構造は部分的に不飽和であってもよく、
Ｒ４はＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ２−Ｃ６アルケニル基、Ｃ２−Ｃ６アルキニル基、又はＣ１−Ｃ６アルカノイル基を表し、
Ｒ５は水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ２−Ｃ６アルケニル基、又はＣ２−Ｃ６アルキニル基を表し、Ｒ４及び／又はＲ５のＣ１−Ｃ６アルキル基中の隣接しない１若しくは２個のメチレン基が酸素原子で置換されていてもよく、
Ｒ４及びＲ５、又はＲ５及びＸ２はそれらが結合している原子と一緒になって４〜６員環の環状構造を形成していてもよく、この場合に該環状構造は、Ｃ１−Ｃ４アルキル基又はハロゲン原子で置換されていてもよく、環内に酸素原子を有していてもよく、該環状構造は部分的に不飽和であってもよく、
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ４アルキル基、Ｃ２−Ｃ４アルケニル基、又はＣ２−Ｃ４アルキニル基を表し、該Ｃ１−Ｃ４アルキル基中の隣接しない１若しくは２個のメチレン基が酸素原子で置換されていてもよい。
Ｂ群：ハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ４アルキル基、及びＣ１−Ｃ２アルコキシ基]
であってよい。
一態様において、前記Ｍ１とＭ２がそれらが結合している原子と一緒になって環状構造を形成している場合のＲ１は、上記の他に、ハロゲン原子、置換されていてもよいＣ１−Ｃ４アルキル基、及びＣ１−Ｃ４アルコキシ基からなる群より選択される基であってもよい。
非限定の一態様において、前記一般式（ＩＩ）のＹ１は酸素原子が好ましく、Ｘ１としては置換されていてもよいＣ１−Ｃ２アルキレン基、なかでも無置換のＣ１−Ｃ２アルキレン基が好ましく、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子、又はＣ１−Ｃ６アルキル基が好ましく、ここで該Ｃ１−Ｃ６アルキル基は、ハロゲン原子で置換されているものが好ましい。
非限定の一態様において、前記一般式（ＩＩＩ）のＲ５が水素原子の場合、Ｙ２は単結合、カルボニル基又はスルホニル基、なかでもカルボニル基が好ましく、Ｘ２は置換されていてもよいＣ１−Ｃ２アルキレン基、なかでも無置換のＣ１−Ｃ２アルキレン基が好ましく、Ｚ１は酸素原子が好ましい。
非限定の一態様において、前記一般式（ＩＩＩ）のＲ５がＣ１−Ｃ６アルキル基で、環状構造を形成していない場合、Ｙ２は単結合、置換されていてもよいＣ１−Ｃ２アルキレン基、カルボニル基又はスルホニル基、中でも無置換のＣ１−Ｃ２アルキレン基又はカルボニル基が好ましく、Ｘ２は単結合、置換されていてもよいＣ１−Ｃ２アルキレン基、又は無置換のＣ１−Ｃ２アルキレン基が好ましく、Ｚ１は単結合、置換されていてもよいメチレン基、又は無置換のメチレン基が好ましい。
非限定の一態様において、前記一般式（ＩＩＩ）のＲ４及びＲ５がそれらが結合している原子と一緒になって４〜６員環の環状構造を形成していている場合、該環内に酸素原子を有していてもよく、該環状構造は、一又は二以上のＣ１−Ｃ４アルキル基及び／又はハロゲン原子で置換されていてもよく、Ｘ２は単結合、置換されていてもよいＣ１−Ｃ２アルキレン基、又は無置換のＣ１−Ｃ２アルキレン基が好ましく、Ｙ２は単結合、置換されていてもよいＣ１−Ｃ２アルキレン基、なかでも無置換のＣ１−Ｃ２アルキレン基が好ましく、Ｚ１は単結合、置換されていてもよいメチレン基、無置換のメチレン基、又は酸素原子が好ましい。
非限定の一態様において、前記一般式（ＩＩＩ）のＲ５及びＸ２がそれらが結合している原子と一緒になって４〜６員環の環状構造を形成していている場合、該環内に酸素原子を有していてもよく、該環状構造は、一又は二以上のＣ１−Ｃ４アルキル基及び／又はハロゲン原子で置換されていてもよく、Ｙ２は単結合、又は置換されていてもよいＣ１−Ｃ２アルキレン基、なかでも無置換のＣ１−Ｃ２アルキレン基が好ましく、Ｚ１は酸素原子が好ましく、Ｒ４はＣ１−Ｃ４アルキル基が好ましい。
非限定の一態様において、前記一般式（ＩＶ）のＲ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、又はエチル基が好ましい。ハロゲン原子としては、Ｆ又はＣｌが好ましく、Ｆがより好ましい。
非限定の一態様において、前記Ｒ１における、（ａ）フェニル基が置換基を有する場合の置換基としては、ハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル基、又はＣ１−Ｃ４ジアルキルアミノ基が好ましく、なかでもＦ、Ｃｌ、フルオロメチル基（トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基など）、又はジメチルアミノ基が好ましい。複数の置換基が選択される場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。
非限定の一態様において、前記Ｒ１における、（ｂ）酸素原子及び窒素原子からなる群より独立に選択されるヘテロ原子を環内に１〜３個有している４〜６員の複素環基としては、ピリジル基、ピペリジノ基、モルホリノ基、又はアゼチジニル基が好ましく、これらの基は以下Ａ群より独立に選択される置換基を少なくとも一つ有していてもよい：
Ａ群：オキソ、ハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−Ｃ４アルキル基、及びＣ１−Ｃ４ジアルキルアミノ基（ここで、Ｃ１−Ｃ４アルキル基中の隣接しない１又は２個のメチレン基が酸素原子で置換されていてもよい）。
ハロゲン原子としては、Ｆ及びＣｌが好ましく、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−Ｃ４アルキル基としては、フルオロメチル基（トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基など）、メチル基、及びエチル基がより好ましく、Ｃ１−Ｃ４ジアルキルアミノ基としてはジメチルアミノ基が好ましく例示される。複数の置換基が選択される場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。
非限定の一態様において、本開示における置換されていてもよいフェニル基としては、無置換のフェニル基、ハロゲン原子が１〜５個、好ましくは１〜３個置換したフェニル基（ハロフェニル基）、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−Ｃ４アルキル基（Ｃ１−Ｃ４アルキル基、又はＣ１−Ｃ４ハロアルキル基）で置換されたフェニル基（Ｃ１−Ｃ４アルキルフェニル基、又はＣ１−Ｃ４ハロアルキルフェニル基）、ジアルキルアミノフェニル基が例示される。具体的には、クロロフェニル基（例えば、２−、３−、又は４−クロロフェニル基）、ジクロロフェニル基、トリクロロフェニル基、フルオロフェニル基（例えば、２−、３−、又は４−フルオロフェニル基）、ジフルオロフェニル基、トリフルオロフェニル基、フルオロメチルフェニル基（例えば、トリフルオロメチルフェニル基、ジフルオロメチルフェニル基）、及びジメチルアミノフェニル基が例示される。
非限定の一態様において、本開示における置換されていてもよいピリジル基としては、無置換のピリジル基、クロロピリジル基（例えば、２−、３−、又は４−クロロピリジル基）、フルオロピリジル基（例えば、２−、３−、又は４−フルオロピリジル基）、メチルピリジル基、エチルピリジル基、及びジメチルアミノピリジル基が例示される。
非限定の一態様において、本開示における置換されていてもよいピペリジノ基としては、無置換のピペリジノ基、クロロピペリジノ基（例えば、２−、３−、又は４−クロロピペリジノ基）、ジクロロピペリジノ基（例えば、２,２−、３,３−、又は４,４−ジクロロピペリジノ基）、フルオロピペリジノ基（例えば、２−、３−、又は４−フルオロピペリジノ基）、ジフルオロピペリジノ基（例えば、２,２−、３,３−、又は４,４−ジフルオロピペリジノ基）、メチルピペリジノ基、エチルピペリジノ基が例示される。
非限定の一態様において、本開示における置換されていてもよいモルホリノ基としては、無置換のモルホリノ基、クロロモルホリノ基（例えば、２−、又は３−クロロモルホリノ基）、フルオロモルホリノ基（例えば、２−、又は３−フルオロモルホリノ基）、メチルモルホリノ基、及びエチルモルホリノ基が例示される。
非限定の一態様において、本開示における置換されていてもよいアゼチジニル基としては、無置換のアゼチジニル基、クロロアゼチジニル基（例えば、１−、２−、又は３−クロロアゼチジニル基）、フルオロアゼチジニル基（例えば、１−、２−、又は３−フルオロアゼチジニル基）、メチルアゼチジニル基（例えば、１−、２−、又は３−メチルアゼチジニル基、N-メチルアゼチジニル基）、及びエチルアゼチジニル基（例えば、１−、２−、又は３−エチルアゼチジニル基）が例示される。
本明細書における「長側鎖」は特に限定されないが、該長側鎖を有するアミノ酸を表２−１〜表２−６に例示する。限定を意図しないが、これらのアミノ酸の側鎖部分（１つのアミノ酸に２以上の側鎖がある場合には、最も長い側鎖部分）が、本明細書における長側鎖の好ましい態様として例示される。
Figure 2018225864
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非限定の一態様において、本開示における環状ペプチド化合物が高い膜透過性を達成するためには、膜透過性に負の影響を与える側鎖を有しないことが好ましい。一態様において、環化前のペプチド化合物に、前記膜透過性に負の影響を与える側鎖が含まれる場合であっても、環化後の環状ペプチド化合物にそのような側鎖が含まれていなければ、高い膜透過性を達成することができる。したがって、一態様において、例えば環化反応後に化学修飾等を行うことによって、膜透過性に負の影響を与える側鎖を有しない環状ペプチド化合物を得ることができる。また、非限定の一態様において、標的分子と特異的に結合できる環状ペプチド化合物を得た後の最適化の工程において、膜透過性を高めるための化学修飾等を行うことができ、この際に膜透過性に負の影響を与える側鎖を変更してもよい。
非限定の一態様において、本開示における環状ペプチド化合物は、環状部又は核酸連結部以外のペプチド部位の側鎖に以下（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選択される少なくとも一つを有しない環状ペプチド化合物であってよい：（Ａ）インドール骨格；（Ｂ）２以上の芳香環による縮環構造；（Ｃ）無置換のヒドロキシフェニル基；及び（Ｄ）置換のヒドロキシフェニル基。このうち、環状部の側鎖に前記（Ａ）、（Ｃ）及び（Ｄ）を有しない環状ペプチド化合物が好ましく、環状部の側鎖に前記（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）を有しない環状ペプチド化合物がより好ましい。なお、非限定の一態様において、前記環状部の側鎖は、環状部の長側鎖であってもよい。非限定の一態様において、前記「２以上の芳香環による縮環構造」は、「縮環構造」であってもよい。
非限定の一態様において、本開示における環状ペプチド化合物は、環状部又は核酸連結部以外のペプチド部位の側鎖に以下（Ａ）及び（Ｂ）からなる群より選択される少なくとも一つ、又は両方を有しない環状ペプチド化合物であってよい：（Ａ）メチルチオ基；及び（Ｂ）チオール基。
非限定の一態様において、本開示における環状ペプチド化合物は、高い膜透過性を達成するために、その核酸連結部以外のペプチド部位又は環状部に、中性（例えばpH=7.0）で極度にイオン化される官能基を有しないことが好ましい。本明細書で用いるpKaは別段示さない限り実測値のpKaのことを指す。また、後述するＡＤＭＥＴＰｒｅｄｉｃｔｏｒによって求めたpKa値を計算pKaと称する。本明細書で用いるBasic pKaは別段示さない限り実測値のBasic pKaのことを指す。また、後述するＡＤＭＥＴＰｒｅｄｉｃｔｏｒによって求めたBasic pKa値をBasic計算pKaと称する。
pKa、及びBasic pKaの測定は、常法により求めることができる。例えば、実験化学講座５「熱的測定および平衡」、４６０頁（日本化学会編、丸善株式会社発行）に記載の方法などにより測定することができる。より具体的には，実施例に記載の方法で測定できる。また、測定しようとするアミノ酸の側鎖のpKa値、及びBasic pKa値が他の官能基の影響を受けて求められにくい時は，目的の官能基のpKa、及びBasic pKaのみが測定できるよう、適宜他の官能基を保護基などで保護して測定することができる。
非限定の一態様において、本開示における環状ペプチド化合物が環状部に酸性の側鎖を有する場合、その酸性の側鎖のpKaは３．５以上であることが好ましく、３．９以上がより好ましく、４．５以上がより好ましく、５．０以上がより好ましく、５．５以上がより好ましく、５．７以上がより好ましく、１０以下であることが好ましい。前記pKaとしては、３．５〜１０、３．９〜１０、４．５〜１０、５．０〜１０、又は５．５〜１０，５．７〜１０の範囲が好ましく例示される。これらpKaを計算値であらわすと、計算pKaは３．５以上であることが好ましく、４．５以上がより好ましく、５．０以上が好ましく、５．４以上が好ましく、８．０以上が好ましく、８．３以上が好ましく、１０以下であることが好ましい。前記計算pKaとしては、３．５〜１０、４．５〜１０、５．０〜１０、５．４〜１０、８．０〜１０、又は８．３〜１０の範囲が好ましく例示される。
非限定の一態様において、本開示における環状ペプチド化合物が環状部に塩基性の側鎖を有する場合、その塩基性の側鎖のBasic pKaは１０以下であることが好ましく、９．５以下がより好ましく、９．０以下がより好ましく、８．５以下がより好ましく、７．５以下がより好ましく、７．２以下がより好ましく、６．５以下が特に好ましく、４．０以上であることが好ましい。前記Basic pKaとしては、４．０〜１０、４．０〜９．５、４．０〜９．０、４．０〜８．５、４．０〜７．５、４．０〜７．２、４．０〜６．５の範囲が好ましく例示される。これらBasic pKaを計算値であらわすと、Basic計算pKaは１０以下であることが好ましく、９．５以下がより好ましく、９．０以下が好ましく、８．８以下が好ましく、８．６以下が好ましく、８．５以下が好ましく、７．５以下が好ましく、６．５以下が好ましく、４．０以上であることが好ましい。前記Basic計算pKaとしては、４．０〜１０、４．０〜９．５、４．０〜９．０、４．０〜８．８，４．０〜８．６，４．０〜８．５、４．０〜７．５、４．０〜６．５の範囲が好ましく例示される。
本明細書において「酸性の側鎖」とは、pKaが１０以下の側鎖を意味し、「塩基性の側鎖」とは、Basic pKaが４以上の側鎖を意味する。本明細書において、pKaが１０を超える側鎖、Basic pKaが４未満の側鎖は、中性の側鎖と定義される。
本明細書においてアミノ酸の側鎖、又は環状ペプチド化合物の環状部の側鎖の計算pKa及びBasic 計算pKaは、ＡＤＭＥＴＰｒｅｄｉｃｔｏｒ（Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｐｌｕｓ Ｉｎｃ．社、ｖｅｒ．８．０）を用いて求めることができる。計算pKa及びBasic 計算pKaは側鎖β位（主鎖に直結する炭素）から側鎖部分を抜き出した部分構造を用いて計算される。例としてＬｙｓの場合を以下に示す。側鎖β位（主鎖に直結する炭素）を含む部分構造を用いてBasic 計算pKaを計算すると１０．５であった。同様に計算すると、酸としては、Ａｓｐの側鎖力ルボキシ基の計算pKaが４．３であり、Ｔｙｒの側差フェノール性水酸基の計算pKaが９．９であり、３−フルオロチロシン（Ｔｙｒ（３−Ｆ））の側差フェノール性水酸基の計算pKaが８．７であり、テトラゾールの計算pKaが３．７であった。一方、塩基としては、Ａｒｇの側鎖グアニジノ基のBasic 計算pKaが１２．７であり、Ｈｉｓのイミダゾリル基のBasic 計算pKaが７．６であり、ピリジンのBasic 計算pKaが５．４であった。本開示におけるアミノ酸の側鎖、環状ペプチド化合物の環状部の側鎖、長側鎖、および塩基性の側鎖からなる群より選択される少なくとも一つの側鎖は、プロトンドナーを有さない側鎖であってよい。
Figure 2018225864
本明細書に記載の方法でBasic計算 pKaを計算した塩基性側鎖を有するアミノ酸の一部を以下の表に示す。
Figure 2018225864
本明細書に記載の方法でpKaを計算した酸性側鎖を有するアミノ酸の一部を以下の表に示す。
Figure 2018225864
非限定の一態様において、本開示におけるペプチド化合物は、翻訳後修飾を受けていてもよい。翻訳後修飾は、環化前、及び／又は環化後において行われてよい。翻訳後修飾としては、特に限定されないが、脱アミノ酸反応、環化反応、脱硫反応、脱保護反応、直鎖部を形成するための反応が例示される。
限定を意図しないが、本明細書における脱アミノ酸反応としては、Ｎ末端のアミノ酸を除去する反応が挙げられる。Ｎ末端のアミノ酸としては、翻訳開始アミノ酸であってよく、具体的には、ｆＭｅｔ（ホルミルメチオニン）、ｆＮｌｅ（ホルミルノルロイシン）、Ｍｅｔ、及びＮｌｅが例示される。一態様において、ペプチド化合物のＮ末端アミノ酸を除去する反応としては、ペプチドデホルミラーゼ（ＰＤＦ）、及び／又はメチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）で処理する反応が挙げられる。
ペプチド−核酸複合体
一態様において、本開示におけるペプチド化合物は、ペプチドと核酸の複合体（ペプチド−核酸複合体）であってよい。ペプチド−核酸複合体は、ペプチド部位のＣ末端側で核酸と結合し複合体を形成していてよい。ペプチドと核酸の結合方式は、特に限定されないが、リンカー（スペーサー）を介して結合していてよい。一態様において、ペプチド部位と複合体を形成する核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであってよく、ＲＮＡが好ましく、ｍＲＮＡが特に好ましい。一態様において、ペプチドと複合体を形成する核酸は、ペプチド部位の翻訳合成に用いた鋳型であってよく、鋳型としてはｍＲＮＡが好ましい。より具体的な一態様としては、鋳型であるｍＲＮＡの３'末端にアミノアシルｔＲＮＡのアナログである抗生物質ピューロマイシンなどを含むリンカー（スペーサー）を介して、ペプチド部位のＣ末端が連結されたペプチド化合物が、好ましく例示される。
ペプチド化合物の細胞膜透過性
本明細書において「細胞膜透過性」を「膜透過性」ということがある。薬物等の膜透過性の測定方法として、ヒト大腸癌細胞株Caco-2細胞を用いた方法が報告されている（「従来法」ともいう。Artursson, P., 2001. Adv Drug Deliv Rev 46, 27-43.；Mason, A.K., 2013. Drug Metab Dispos 41, 1347-1366.；Polli, J.W., 2001. J Pharmacol Exp Ther 299, 620-628.；Sun, H. 2008. Expert Opin Drug Metab Toxicol 4, 395-411.）。この方法は、細胞培養したCaco-2細胞層の管腔側（Apical側）に測定対象物質（「被験物質」ともいう。）を添加後、基底膜側（Basal側）に移行した被験物質量から算出される膜透過係数（Papp）に基づき、被験物質の膜透過性を測定する方法である（図１参照）。このような実験において評価したCaco-2細胞の透過性はヒトにおける経口吸収率と相関することが明らかとなっており、この相関からヒトにおける経口吸収率を予測することが可能になっている。Caco-2細胞は一定の条件下で培養する事により単層膜を形成し、その単層膜に対する薬物の透過性がヒト経口吸収率と良好な相関を示す事から、in vitroでの経口吸収性評価の方法として広く汎用されている。しかしながら、次に述べるように、この従来法では、脂溶性が高い薬物等の膜透過性を正確に測定することは難しい。
Caco-2細胞を用いた膜透過性試験において以下の数式１を用いて膜透過係数（Papp）を算出するときの前提条件として、薬物の細胞内分布は無視できること、Basal側の薬物濃度は直線的に増加すること、一度透過した薬物は細胞内に戻らないこと（すなわちシンク条件）、Apical側の濃度変化は小さいこと、細胞内への薬物の蓄積は考慮しないこと、などが仮定されている（Bhoopathy, S., et al 2014. Methods Mol Biol 1113, 229-252.；Knipp, G.T., et al 1997. J Pharm Sci 86, 1105-1110.；Korzekwa, K.R., et al 2012. Drug Metab Dispos 40, 865-876.；Sun, H., et al 2008. Drug Metab Dispos 36, 102-123.）。
Figure 2018225864
しかし、前記の数式１を用いてPappを算出するときの前提条件が当て嵌まらない化合物が存在することが報告されている。例えば、尾関らは受動拡散により膜透過する薬物（アテノロール、メトプロロール、プロプラノロール）及びP糖タンパク質（P-gp）の基質（ジゴキシン、シクロスポリン、ベラパミル）についてCaco-2細胞を用いた膜透過性試験を実施し、Apical側、細胞内、Basal側の濃度推移を評価した結果、メトプロロール及びプロプラノロールについてはインキュベーション120分間でApical側の濃度がそれぞれ約20%及び約40%減少していたことを報告している（Ozeki K., et al 2015, Int J Pharm. 495, 963-971.）。
すなわち、Apical側の濃度変化が大きいことが示唆される。また、プロプラノロール、シクロスポリン、ベラパミルはインキュベーション終了時に、添加した薬物の約8%が細胞内に分布しており、細胞内蓄積が示唆される。さらに、シクロスポリンのBasal側濃度推移にはラグタイム（直線領域の近似直線とx軸との交点）が存在し（Ozeki K., et al 2015, Int J Pharm. 495, 963-971.）、直線部分が開始されるまでの時間（ラグタイムの3倍）はApical側に薬物を添加してBasal側からサンプルリングする試験(AtoB)及びBasal側に薬物を添加してApical側からサンプリングする試験(BtoA)のいずれにおいても300分を超え、120分間のインキュベーション時間内に直線領域は存在しないことがわかった。すなわち、Basal側の薬物濃度が直線的に増加しないことが示唆される。AtoB試験における120分後のBasal側濃度のみから数式１を用いて算出したPappは、細胞内分布を加味したモデルの最適値を用いて算出したPappと比較して5倍過小評価していた。これは、シクロスポリンが細胞内マトリックスと強く結合するために、Basal側への出現が遅いためと考察されている（Ozeki K., et al 2015, Int J Pharm. 495, 963-971.）。また、Papp値が2.5x10-5cm/秒の化合物では120分間のインキュベーション時間内に直線領域が終了すること（「頭打ち」ともいう。）が報告されている。さらに、ClogPが大きい薬物は細胞内マトリックスと強く結合するために、直線領域の開始が遅くなるため、脂溶性が高い薬物のPappを正確に評価することは従来法では難しいことが示唆される（図２）。
したがって、ペプチド化合物、特に環状ペプチド化合物の膜透過性を測定するために、従来法の改良法を開発した。実施例に示されるように、この改良法、すなわち本開示における膜透過性の測定方法を用いることで、ペプチド化合物の膜透過性を正確に測定可能となった。なお、同改良法により測定可能な被験物質は、ペプチド化合物に限定されない。
従来法では、被験物質を混在させた状態でのプレインキュベーション工程を経ずに膜透過性の測定が行われる。従来法において、バッファーをなじませるために、膜透過性の測定前に短時間のインキュベーションが行われることがあるが、これは被験物質を混在させた状態でのインキュベーションではないため、本開示におけるプレインキュベーションとは異なる。
本開示における膜透過性の測定方法（「本開示における測定方法」ともいう。）は、非限定の一態様において、Caco-2細胞と被験物質を混在させてプレインキュベートする工程を含む。本開示における測定方法において「プレインキュベーション」や「プレインキュベート」とは、膜透過性の測定工程の前に、Caco-2細胞と被験物質を混在させてインキュベートすることをいう。本明細書において「Caco-2細胞と被験物質を混在させて（プレ）インキュベートする」とは、（プレ）インキュベーションの間にCaco-2細胞と被験物質が共存している状態が存在すれば特に限定されず、例えば、Caco-2細胞と被験物質を培地中に混合し、インキュベーションを開始することにより行われてよい。また、Caco-2細胞層の一方面に被験物質を含む溶液が接するように配置し、当該Caco-2細胞層の他方面に前記被験物質を含まない溶液が接するように配置して、所定時間インキュベートすることであってよい。本明細書においては、特に断りがない限り、プレインキュベーションを開始する時点でApical側の溶液に被験物質を添加し、Basal側の溶液には被験物質を添加していない。
本開示における測定法の非限定の一態様において、プレインキュベーションの際にはCaco-2細胞層のApical側に被験物質を含む溶液を配置してインキュベートしてよく、その逆であってもよい。本開示における測定方法におけるプレインキュベーション時間は特に限定されないが、例えば、２時間以上、４時間以上、６時間以上、８時間以上、１２時間以上、１８時間以上、２０時間以上、２４時間以上が挙げられる。プレインキュベーション時間の上限は、膜透過性の測定に影響を与えない限り限定されないが、Caco-2細胞にダメージが生じない時間が好ましく、例えば、７２時間以下、４８時間以下、３６時間以下、３０時間以下、２６時間、２４時間以下が挙げられる。
本明細書において「プレインキュベーション溶液」とは、プレインキュベーションの際にCaco-2細胞と接触させる溶液をいう。本開示における測定方法のプレインキュベーション溶液は特に限定されないが、プレインキュベーションによってCaco-2細胞にダメージが生じない点で、培地を使用することが好ましい。すなわち、本開示におけるプレインキュベーションは、Caco-2細胞と培地を接触させて行ってよい。本明細書において「Caco-2細胞にダメージが生じない」ことは、Caco-2細胞の経上皮電気抵抗（TEER）を測定することにより確認できる。本明細書において、プレインキュベーション前の初期値に比べて、測定時点におけるTEER値が70%以上、好ましくは80%以上であれば、測定時点においてCaco-2細胞にダメージが生じていないと判断される。TEERは当業者に公知の方法により測定できる。
非限定の一態様において、本開示における測定方法のプレインキュベーションでは、プレインキュベーション溶液として培地を使用してよい。一態様において、本開示におけるプレインキュベーションにおいて、Apical側のプレインキュベーション溶液が培地であってよい。一態様において、プレインキュベーション溶液として、Apical側のみ、又はBasal側のみに培地を使用してもよく、両側に培地を使用してもよいが、少なくともApical側には培地を使用することが好ましい。一態様において、Caco-2細胞のApical側のプレインキュベーション溶液に被験物質を含ませることが好ましい。本明細書において、培地は特に限定されないが、Caco-2細胞にダメージが生じない培地が好ましく、細胞培養培地がより好ましく、非必須アミノ酸含有培地が更に好ましい。培地としては、具体的には、ダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）、MEM、RPMI 1640培地が例示され、中でもDMEMが好ましい。一態様において、培地には他の成分を添加してもよく、添加可能な成分としては特に限定されないが、有機溶媒や可溶化剤等が例示され、具体的にはfasted state simulated intestinal and stomach fluids (FaSSIF)、ジメチルスルホキシド (DMSO)、ジメチルアセトアミド(DMA)、メタノール、アセトニトリル、界面活性剤、Tween等が例示される。本明細書において、「培地がDMEMである」等の記載は、培地に他の成分が含まれることを排除しない。Apical側とBasal側の培地及び／又は添加成分は同一であっても異なっていてもよい。Apical側の培地としては、FaSSIFとDMEMの混合培地、Basal側の培地としては、DMEMが好ましく例示される。非限定の一態様において、プレインキュベーション溶液のpHは特に限定されないが、pH 5.0〜8.0が例示される。プレインキュベーションの温度としては5〜45℃、好ましくは20〜40℃、より好ましくは37℃が例示される。
本開示における測定方法は、膜透過性の測定工程を含む。同工程では、Caco-2細胞層の一方面に被験物質を含む溶液が接するように配置し、当該Caco-2細胞層の他方面に前記被験物質を含まない溶液が接するように配置して、所定時間経過後に、前記他方面側の溶液における前記被験物質の量及び／又は前記一方面側の溶液における前記被験物質の量を測定することにより、被験物質の膜透過性を測定することができる。
本開示における測定方法における前記「膜透過性の測定工程」は、従来法に準じて行うことができる。一態様において、プレインキュベーションの工程の後に、Apical側及びBasal側のプレインキュベーション溶液を吸引除去し、Apical側に被験物質を含む溶液を、Basal側に被験物質を含まない溶液を添加し、膜透過性を測定することができる。膜透過性の測定工程においては、例えばApical側に被験物質を含むFaSSIF及びHanks' Balanced Salt Solutions (HBSS) の混合溶液(1% DMSOを含む。) (pH6.0) を、Basal側にHBSS (4% BSA) (pH 7.4) を添加し、37℃の条件で培養し、所定時間経過後にLC/MSでBasal側の被験物質量を測定し、その透過量から膜透過係数を算出することで、膜透過性を測定できる。
本開示における測定方法により測定される化合物（被験物質）は、特に限定されないが、従来法では膜透過性の正確な測定が困難である、脂溶性が高い化合物が例示される。脂溶性が高い化合物としては、例えばClogPが３以上、４以上、５以上、６以上、８以上の化合物が挙げられる。また、脂溶性が高い化合物としては、例えば、ClogP/total aaが０．８以上、１．０以上、１．１以上、１．２以上、１．３以上の化合物が挙げられる。非限定の一態様において、被験物質はペプチド化合物、好ましくは環状ペプチド化合物であってよい。
非限定の一態様において、本開示における測定方法により複数の被験物質の膜透過性を測定することで、これにより得られた膜透過性のデータに基づいて、前記複数の被験物質から所望の膜透過性を有する被験物質を選択することができる。すなわち、本明細書において、本開示における測定方法を用いた被験物質のスクリーニング方法が開示される。
非限定の一態様において、本開示における測定方法を用いた被験物質のスクリーニング方法により、医薬品としての開発に求められるレベルの膜透過性を有する被験物質を選択することができる。この際に使用されるクライテリアは、標的分子の生体内における存在場所や投与経路等、スクリーニングの目的に応じて選択できるが、膜透過係数（Papp）としては、5.0×10-7 cm/秒以上、8.0×10-7 cm/秒以上、9.0×10-7 cm/秒以上、1.0×10-6 cm/秒以上、3.0×10-6 cm/秒以上が例示される。なお、本明細書において、「10-n」を「E-n」と記載することがある（例えば、1.0×10-6を1.0E-6又は1.0E-06と記載することがある）。
本開示における測定方法（改良法）によれば、従来法では評価が難しかった脂溶性の高い被験物質の膜透過性を適切に評価することが可能である。そのため、脂溶性の高い被験物質においても、従来と同様の基準を用いて被験物質をスクリーニングすることが可能になる。例えば、本開示における測定方法を使用することで、従来同様に、Pappとして1.0×10-6 cm/秒以上を経口薬として開発可能な基準として設定することができる（P. Arturssonand J. et al 1991, Biochem Biophys Res Commun. 175, 880-885.）。
非限定の一態様において、本開示におけるスクリーニング方法により選択される被験物質はペプチド化合物であってよく、環状ペプチド化合物であることが特に好ましい。非限定の一態様において、前記スクリーニング方法により所望の性質を有するペプチド化合物を選択した後、選択されたペプチド化合物のアミノ酸配列に基づき、所望の性質を有するペプチド化合物を製造することができる。
本開示は、上記の本開示における測定方法に含まれる、プレインキュベーション方法をも提供する。すなわち、本開示は、一側面において、膜透過性の測定のプレインキュベーション方法を提供する。本開示におけるプレインキュベーション方法の説明、例示、好ましい範囲、態様等は、上述したとおりである。
本開示における膜透過性の測定方法の非限定的な態様として、以下が挙げられる：
＜１＞Caco-2細胞を用いた被験物質の膜透過性の測定方法であって、Caco-2細胞と該被験物質を混在させてプレインキュベートする工程を含む、前記方法；
＜２＞Caco-2細胞を用いた被験物質の膜透過性の測定方法であって、Caco-2細胞と該被験物質を混在させて２時間以上プレインキュベートする工程を含む、前記方法；
＜３＞Caco-2細胞と該被験物質を混在させて４時間以上プレインキュベートする工程を含む、＜１＞又は＜２＞に記載の方法；
＜４＞Caco-2細胞と被験物質を混在させて６時間以上プレインキュベートする工程を含む＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の方法；
＜５＞Caco-2細胞と被験物質を混在させて８時間以上プレインキュベートする工程を含む＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の方法；
＜６＞Caco-2細胞と被験物質を混在させて１２時間以上プレインキュベートする工程を含む＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の方法；
＜７＞Caco-2細胞と被験物質を混在させて２４時間以上プレインキュベートする工程を含む＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載の方法；
＜８＞前記プレインキュベートする工程におけるプレインキュベーション時間が４８時間以下である、＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載の方法；
＜９＞Caco-2細胞と被験物質を混在させ４時間以上インキュベートすることを含む、膜透過性の測定のプレインキュベーション方法；
＜１０＞Caco-2細胞と被験物質を混在させて２４時間以上インキュベートすることを含む＜９＞に記載の方法；
＜１１＞前記プレインキュベートがCaco-2細胞と培地を接触させて行われる、＜１＞〜＜９＞のいずれかに記載の方法；
＜１２＞前記培地が細胞培養培地である＜１１＞に記載の方法；
＜１３＞前記培地がDMEMである＜１１＞に記載の方法；
＜１４＞前記被験物質が、ClogPが３以上の物質である、＜１＞〜＜１３＞のいずれかに記載の方法；
＜１５＞前記被験物質が、ペプチド化合物である、＜１＞〜＜１４＞のいずれかに記載の方法；
＜１６＞前記被験物質が、環状ペプチド化合物である、＜１＞〜＜１５＞のいずれかに記載の方法；
＜１７＞更に以下の工程を含む、＜１＞〜＜１６＞のいずれかに記載の方法：
Caco-2細胞層の一方面に被検物質を含む溶液が接するように配置し、当該Caco-2細胞層の他方面に前記被検物質を含まない溶液が接するように配置して、所定時間経過後に、前記他方面側の溶液における前記被検物質の量及び／又は前記一方面側の溶液における前記被検物質の量を測定することにより、被検物質の膜透過性を測定する工程；
＜１８＞以下の工程を含む、被験物質のスクリーニング方法：
（ａ）＜１＞〜＜１７＞のいずれかに記載の方法により複数の被験物質の膜透過性を測定する工程；及び
（ｂ）（ａ）で得られた膜透過性のデータに基づいて、前記複数の被験物質から所望の被験物質を選択する工程；
＜１９＞前記（ｂ）の工程が、膜透過係数（Papp）が1.0×10-6 cm/秒以上被験物質を選択することを含む、＜１８＞に記載の方法；
＜２０＞以下の工程を含む、ペプチド化合物の製造方法：
（ｉ）＜１＞〜＜１７＞のいずれかに記載の方法により複数のペプチド化合物の膜透過性を測定する工程；及び
（ｉｉ）（ｉ）で得られた膜透過性のデータに基づいて、前記複数のペプチド化合物から所望のペプチド化合物を選択する工程；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で選択されたペプチド化合物のアミノ酸配列に基づき、ペプチド化合物を製造する工程。
＜２１＞＜２０＞に記載の方法によって製造されるペプチド化合物。
本開示におけるペプチド化合物の膜透過性は、本開示における膜透過性の測定方法により測定することができる。すなわち、以下の方法により測定できる。Apical側の培地として1% DMSOを含むFaSSIFとDMEMの混合培地を、Basal側の培地としてDMEMを添加し、5% CO2, 37℃, 80 rpmの条件で、Caco-2細胞とペプチド化合物を２０〜２４時間プレインキュベートする。その後、Apical側及びBasal側の培地を吸引除去・洗浄し、Apical側の1%DMSOを含むFaSSIF/HBSS buffer (1% DMSO) (pH6.0) にペプチド化合物を含ませ、Basal側に4％BSAを含むHBSS buffer (pH 7.4) を添加し、膜透過性の測定を開始する。各wellは5% CO2, 37℃, 80 rpmで振盪し、開始約180分後にBasal側のサンプルを採取する。LC/MSで該サンプル中のペプチド化合物量を測定し、その透過量から膜透過係数を算出する。透過量から膜透過係数（Papp）を算出する際には、上述の数式１が利用できる。
非限定の一態様において、本開示におけるペプチド化合物の膜透過性を測定する際には、ペプチド部位の鋳型となる核酸部分を有しないペプチド化合物を被験物質とすることが好ましい。一態様において、後述するように、ペプチド−核酸複合体の状態でパニングを行った後に、標的分子に特異的に結合できるペプチド−核酸複合体を選択し、その核酸部分の塩基配列に基づいてペプチド化合物を合成することができる。このように合成されたペプチド化合物を被験物質として膜透過性の測定を行うことが、好ましく例示される。一態様において、前記塩基配列がコードするペプチド化合物の誘導体を合成し、これを被験物質として膜透過性の測定をしてもよく、膜透過性の結果に基づいて被験物質から誘導体を合成し、その誘導体についての膜透過性を測定してもよい。
非限定の一態様において、本開示における環状ペプチド化合物のPappは、5.0×10-7 cm/秒以上、8.0×10-7 cm/秒以上が好ましく、9.0×10-7 cm/秒以上がより好ましく、1.0×10-6 cm/秒以上が更に好ましく、3.0×10-6 cm/秒以上が特に好ましい。
本明細書における「膜透過係数（Ｐａｐｐ）」は、特に断りがない限り、本開示における膜透過性の測定方法（改良法）を用いて測定した値を意味し、より具体的には、実施例に記載の膜透過性試験の改良法を用いて測定した値を意味する。
ペプチド化合物の代謝安定性
非限定の一態様において、本開示におけるペプチド化合物は、良好な代謝安定性を有することが好ましい。良好な代謝安定性のためには、ペプチド化合物中に含まれるアミノ酸の数が８以上であることが好ましく、９以上がより好ましく、１１以上が更に好ましい。また、一態様において、容易に酸化される可能性のあるチオエーテル結合を有しないことが好ましい。また、一態様において、酸化されやすく代謝安定性の妨げとなり得ることから、メチルチオ基を有しないことが好ましい。
核酸
非限定の一態様において、本開示における核酸としては、本開示におけるペプチド化合物をコードする核酸が好ましく例示される。該核酸は、ペプチド部位と連結されていても、連結されていなくてもよい。連結されている場合には、スペーサーやリンカーを介して連結されていてもよい。一態様において、「ペプチド化合物をコードする核酸」とは、該ペプチド化合物を翻訳合成する際に使用される／使用された鋳型の核酸をいう。
ライブラリ
本開示におけるライブラリには、本開示におけるペプチド化合物を含むライブラリ、及び本開示におけるペプチド化合物をコードする核酸を含むライブラリが含まれる。本開示におけるライブラリには、本開示におけるペプチド化合物のライブラリ、ペプチド−核酸複合体のライブラリが含まれ、中でも環状ペプチド化合物、又は環状ペプチド−核酸複合代のライブラリが好ましく、特に環状ペプチド−ｍＲＮＡ複合体のライブラリが好ましい。ライブラリとしては、ディスプレイライブラリが好ましい。ディスプレイライブラリとしては、ディスプレイを利用したライブラリが例示され、中でもｍＲＮＡディスプレイライブラリ、ＤＮＡディスプレイライブラリ、リボソームディスプレイライブラリが好ましく、ｍＲＮＡディスプレイライブラリがより好ましい。
本明細書において、「核酸によりコードされる（環状）ペプチド化合物」とは、該核酸を鋳型として翻訳することにより直接合成されるペプチド化合物に限定されず、翻訳後修飾を受けて合成され得るペプチド化合物を含むことがある。例えば、核酸を翻訳することにより直鎖ペプチド化合物が合成され、その後の環化工程により環状ペプチド化合物が合成される場合、該環状ペプチド化合物を、前記核酸によりコードされる環状ペプチド化合物と呼ぶことがある。また、一態様において、核酸を鋳型として翻訳合成されるペプチド、又はその後に翻訳後修飾を受けたペプチドと該核酸との複合体（ペプチド−核酸複合体）も、核酸によりコードされる（環状）ペプチド化合物に含まれる。
非限定の一態様において、本開示におけるライブラリに含まれる環状ペプチド化合物、又はライブラリに含まれる核酸によりコードされる環状ペプチド化合物の核酸連結部以外のペプチド部位を構成するアミノ酸の数の平均は、特に限定されないが、３０以下が好ましい。高い膜透過性を獲得するためには、核酸連結部以外のペプチド部位のアミノ酸の数の平均は、２０以下が好ましく、１８以下、１６以下、１５以下、又は１４以下がより好ましく、１３以下が特に好ましく、具体的には、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、及び１８が例示される。高い代謝安定性を獲得するためには、核酸連結部以外のペプチド部位のアミノ酸の数の平均は、８以上であることが好ましく、９以上がより好ましく、１０以上が更に好ましく、１１以上が特に好ましい。膜透過性と代謝安定性の両立を考慮すると、核酸連結部以外のペプチド部位のアミノ酸の数の平均は、５〜２０、７〜２０、７〜１７、８〜１６、９〜１６、１０〜１６、８〜１３、９〜１４、９〜１４、９〜１３、１０〜１５、１１〜１５、１０〜１４、１０〜１３、１１〜１４が好ましく、１１〜１３がより好ましい。また、一態様において、核酸連結部以外のペプチド部位は直鎖部を有していてもよく、該直鎖部の数の平均としては、特に限定されないが、１以上、又は２以上が例示され、具体的には０、１、又は２が例示される。
非限定の一態様において、本開示におけるライブラリに含まれる環状ペプチド化合物、又はライブラリに含まれる核酸によりコードされる環状ペプチド化合物の環状部を構成するアミノ酸の数の平均は限定されないが、例えば、４以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、２０以下、１８以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、及び１６が挙げられる。膜透過性と代謝安定性の両立を考慮すると、前記環状部を構成するアミノ酸の数の平均は、５〜１５が好ましく、５〜１４、７〜１４、又は８〜１４がより好ましく、８〜１３、９〜１３、８〜１２、８〜１１、又は９〜１２がさらに好ましく、９〜１１が特に好ましい。
非限定の一態様において、本開示におけるライブラリに含まれる環状ペプチド化合物、又はライブラリに含まれる核酸によりコードされる環状ペプチド化合物の直鎖部のアミノ酸の数（ユニットの数）の平均は０〜８であることが好ましく、０〜５がより好ましく、０〜３がより好ましい。
非限定の一態様において、本開示におけるライブラリに含まれる環状ペプチド化合物、又はライブラリに含まれる核酸によりコードされる環状ペプチド化合物の核酸連結部以外のペプチド部位に含まれる非天然アミノ酸の数の平均は、２以上が好ましく、４以上、５以上、又は６以上がより好ましく、７以上が更に好ましく、８以上が特に好ましい。本開示におけるライブラリに含まれる環状ペプチド化合物、又はライブラリに含まれる核酸によりコードされる環状ペプチド化合物は、環状部を構成するアミノ酸の数に占める非天然アミノ酸の数の平均、又は環状ペプチド化合物の核酸連結部以外のペプチド部位に含まれるアミノ酸の数に占める非天然アミノ酸の数の割合の平均として、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上が例示される。
非限定の一態様において、本開示におけるライブラリに含まれる環状ペプチド化合物、又はライブラリに含まれる核酸によりコードされる環状ペプチド化合物の核酸連結部以外のペプチド部位に含まれるＮ置換アミノ酸の数の平均は、３以上が好ましく、４以上、５以上、又は６以上がより好ましく、７以上が更に好ましく、８以上が特に好ましい。本開示におけるライブラリに含まれる環状ペプチド化合物、又はライブラリに含まれる核酸によりコードされる環状ペプチド化合物は、環状部を構成するアミノ酸の数に占めるＮ置換アミノ酸の数の平均、又は環状ペプチド化合物の核酸連結部以外のペプチド部位に含まれるアミノ酸の数に占めるＮ置換アミノ酸の数の割合の平均として、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上が例示される。ここでいうＮ置換アミノ酸は、好ましくはＮ−アルキルアミノ酸、より好ましくはＮ−メチルアミノ酸であってよい。すなわち、非限定の一態様においては、前記Ｎ置換アミノ酸の数の平均は、Ｎ−アルキルアミノ酸の数、又はＮ−メチルアミノ酸の数の平均として、例示される。
非限定の一態様において、高い膜透過性のためには、本開示におけるライブラリに含まれる環状ペプチド化合物、又はライブラリに含まれる核酸によりコードされる環状ペプチド化合物の核酸連結部以外のペプチド部位、環状部、又は環状部の側鎖に含まれる芳香環の数の平均は３以下であることが好ましく、０〜３、又は１〜３が好ましい範囲として例示される。また、核酸連結部以外のペプチド部位、又は環状部を構成するアミノ酸の数に占める芳香環の数の割合の平均としては、４０％以下が好ましく、３５％以下、３０％以下、２７％以下、２５％以下、２０％以下が好ましく例示される。
非限定の一態様において、高い膜透過性のためには、本開示における環状ペプチド化合物に含んでよい芳香環の数に制限があることから、標的分子との結合に寄与し得る部位である環状部の長側鎖に芳香環を有しているのが好ましい。すなわち、一態様において、本開示における環状ペプチド化合物の環状部の長側鎖に含まれる芳香環の数の平均として、０〜３、１〜３、又は２〜３が例示される。また、本開示における環状ペプチド化合物の核酸連結部以外のペプチド部位、環状部、又は環状部の側鎖に含まれる芳香環の数に対する、環状部の長側鎖に含まれる芳香環の数の割合の平均としては、３０％以上、４５％以上、６０％以上、８０％以上、又は１００％が例示される。
非限定の一態様において、本開示におけるライブラリに含まれる環状ペプチド化合物、又はライブラリに含まれる核酸によりコードされる環状ペプチド化合物に含まれる非天然アミノ酸、Ｎ置換アミノ酸、又は芳香環を有するアミノ酸の数の平均は、ＤＮＡライブラリを合成する際に、前記アミノ酸に当てたコドンの出現頻度にて調整することができる。例えば１０のアミノ酸残基可変箇所を含むペプチドのライブラリでは、アミノ酸が２０種類から選択されると仮定した場合、該２０種類のうちＮ置換アミノ酸を１０種類とすることで、Ｎ置換アミノ酸のコドンユニットが可変箇所１箇所当り10/20(５０％)を占めるように合成することができる。このようにして、本明細書における非天然アミノ酸の数、Ｎ置換アミノ酸の数、芳香環の数、又は芳香環を有するアミノ酸の数の割合の平均を算出してもよい。
非限定の一態様において、本開示におけるライブラリに含まれる環状ペプチド化合物、又はライブラリに含まれる核酸によりコードされる環状ペプチド化合物のClogPの平均は、４以上が好ましく、５以上がより好ましく、６以上が更に好ましく、８以上が特に好ましく、１８以下、１７以下、１６以下が好ましく例示され、４〜１８、５〜１７、及び６〜１６が例示される。
非限定の一態様において、本開示におけるライブラリに含まれる環状ペプチド化合物、又はライブラリに含まれる核酸によりコードされる環状ペプチド化合物のClogP/total aaの平均は、１.０以上が好ましく、１．１以上がより好ましく、１．２以上が更に好ましく、１．３以上が特に好ましく、１．８以下、１．７以下、１．６以下、１．５以下が好ましく例示され、１．０〜１．８、１．０〜１．７、１．１〜１．６、及び１．１〜１．５が例示される。
非限定の一態様において、本開示におけるライブラリは、環状部に長側鎖を少なくとも一つ、又は少なくとも二つ有する環状ペプチド化合物、又はこれをコードする核酸を含んでいてよい。一態様において、本開示におけるライブラリは、環状部を構成するアミノ酸として、長側鎖を有するアミノ酸を少なくとも一つ、又は少なくとも二つ含む環状ペプチド化合物、又はこれをコードする核酸を含んでいてよい。本開示におけるライブラリに含まれる、又はライブラリに含まれる核酸によりコードされる環状ペプチド化合物は、その環状部に長側鎖を有することで、標的分子との高い結合親和性を有し得る。また、一態様において、長側鎖を適切に選択することで、標的分子との結合親和性を維持しつつ、膜透過性の高い環状ペプチド化合物を得ることが出来る。
非限定の一態様において、本開示におけるライブラリは、上述の長側鎖を環状部に有する環状ペプチド化合物、及び／又はこれをコードする核酸を含んでよい。該「長側鎖」とは、上述の例示、好ましい範囲、態様に関する記述がそのまま適用できる。
非限定の一態様において、本開示におけるライブラリに含まれる環状ペプチド化合物、又はライブラリに含まれる核酸によりコードされる環状ペプチド化合物は、その環状部の側鎖に芳香環を有していてもよく、また、その環状部に含まれる少なくとも一種、又は二種以上の長側鎖が、芳香環を含む側鎖であってよい。
非限定の一態様において、本開示における環状ペプチド化合物、又はこれらをコードする核酸のライブラリは、それぞれ、環状部又は核酸連結部以外のペプチド部位の側鎖にインドール骨格を有しない環状ペプチド化合物、又はこれらをコードする核酸から実質的になるライブラリであってよい。また、一態様において、本開示における環状ペプチド化合物、又はこれらをコードする核酸のライブラリは、それぞれ、環状部又は核酸連結部以外のペプチド部位の側鎖にインドール骨格を有する環状ペプチド化合物、又はこれらをコードする核酸を実質的に含まないライブラリであってよい。一態様において、前記環状部の側鎖は、環状部の長側鎖であってもよい。
非限定の一態様において、本開示における環状ペプチド化合物、又はこれらをコードする核酸のライブラリは、それぞれ、環状部又は核酸連結部以外のペプチド部位の側鎖に、２以上の芳香環による縮環構造を有しない環状ペプチド化合物、又はこれらをコードする核酸から実質的になるライブラリであってよい。また、一態様において、本開示における環状ペプチド化合物、又はこれらをコードする核酸のライブラリは、それぞれ、環状部又は核酸連結部以外のペプチド部位の側鎖に、２以上の芳香環による縮環構造を有する環状ペプチド化合物、又はこれらをコードする核酸を実質的に含まないライブラリであってよい。一態様において、前記環状部の側鎖は、環状部の長側鎖であってもよい。非限定の一態様において、前記「２以上の芳香環による縮環構造」は、「縮環構造」であってもよい。
非限定の一態様において、本開示における環状ペプチド化合物、又はこれらをコードする核酸のライブラリは、それぞれ、環状部又は核酸連結部以外のペプチド部位の側鎖に置換又は無置換のヒドロキシフェニル基を有しない環状ペプチド化合物、又はこれらをコードする核酸から実質的になるライブラリであってよい。また、一態様において、本開示における環状ペプチド化合物、又はこれらをコードする核酸のライブラリは、それぞれ、環状部又は核酸連結部以外のペプチド部位の側鎖に置換又は無置換のヒドロキシフェニル基を有する環状ペプチド化合物、又はこれらをコードする核酸を実質的に含まないライブラリであってよい。一態様において、前記環状部の側鎖は、環状部の長側鎖であってもよい。
非限定の一態様において、本開示における環状ペプチド化合物、又はこれらをコードする核酸のライブラリは、それぞれ、環状部又は核酸連結部以外のペプチド部位の側鎖にメチルチオ基を有しない環状ペプチド化合物、又はこれらをコードする核酸から実質的になるライブラリであってよい。また、一態様において、本開示における環状ペプチド化合物、又はこれらをコードする核酸のライブラリは、それぞれ、環状部又は核酸連結部以外のペプチド部位の側鎖に置換又は無置換のメチルチオ基を有する環状ペプチド化合物、又はこれらをコードする核酸を実質的に含まないライブラリであってよい。一態様において、前記環状部の側鎖は、環状部の長側鎖であってもよい。
非限定の一態様において、本開示における環状ペプチド化合物、又はこれらをコードする核酸のライブラリは、それぞれ、環状部又は核酸連結部以外のペプチド部位の側鎖にチオ−ル基を有しない環状ペプチド化合物、又はこれらをコードする核酸から実質的になるライブラリであってよい。また、一態様において、本開示における環状ペプチド化合物、又はこれらをコードする核酸のライブラリは、それぞれ、環状部又は核酸連結部以外のペプチド部位の側鎖に置換又は無置換のチオール基を有する環状ペプチド化合物、又はこれらをコードする核酸を実質的に含まないライブラリであってよい。一態様において、前記環状部の側鎖は、環状部の長側鎖であってもよい。一態様において、前記環状部の側鎖は、環状部の長側鎖であってもよい。
非限定の一態様において、本開示におけるライブラリは、高い膜透過性を達成するために、中性（例えばpH=7.0）で極度にイオン化される官能基を有しない環状ペプチド化合物、及び／又はこれらをコードする核酸から実質的になるライブラリであってよい。
非限定の一態様において、本開示におけるライブラリは、同ライブラリに、環状部に酸性の側鎖を有する環状ペプチド化合物、及び／又はこれらをコードする核酸が含まれる場合、同環状ペプチド化合物が、その酸性の側鎖のpKaが３．５〜１０である環状ペプチド化合物から実質的になるライブラリであってよい。前記酸性の側鎖のpKaは３．５以上であることが好ましく、３．９以上がより好ましく、４．５以上がより好ましく、５．０以上がより好ましく、５．５以上がより好ましく、５．７以上がより好ましく、１０以下であることが好ましい。前記pKaとしては、３．５〜１０、３．９〜１０、４．５〜１０、５．０〜１０，又は５．５〜１０，５．７〜１０の範囲が好ましく例示される。これらpKaを計算値であらわすと，計算pKaは３．５以上であることが好ましく、４．５以上がより好ましく、５．０以上が好ましく、５．４以上が好ましく、８．０以上が好ましく、８．３以上が好ましく、１０以下であることが好ましい。前記計算pKaとしては、３．５〜１０、４．５〜１０、５．０〜１０，５．４〜１０，８．０〜１０，又は８．３〜１０の範囲が好ましく例示される。なお、非限定の一態様において、前記酸性の側鎖は、酸性の長側鎖であってもよい。
非限定の一態様において、本開示におけるライブラリは、同ライブラリに、環状部に塩基性の側鎖を有する環状ペプチド化合物、及び／又はこれらをコードする核酸が含まれる場合、同環状ペプチド化合物が、その塩基性の側鎖のBasic pKaが４．０〜１０である環状ペプチド化合物から実質的になるライブラリであってよい。前記塩基性の側鎖のBasic pKaは１０以下であることが好ましく、９．５以下がより好ましく、９．０以下がより好ましく、８．５以下がより好ましく、７．５以下がより好ましく、７．２以下がより好ましく、６．５以下が特に好ましく、４．０以上であることが好ましい。前記Basic pKaとしては、４．０〜１０、４．０〜９．５、４．０〜９．０、４．０〜８．５、４．０〜７．５、４．０〜７．２、４．０〜６．５の範囲が好ましく例示される。これらBasic pKaを計算値であらわすと、Basic計算pKaは１０以下であることが好ましく、９．５以下がより好ましく、９．０以下が好ましく、８．８以下が好ましく、８．６以下が好ましく、８．５以下が好ましく、７．５以下が好ましく、６．５以下が好ましく、４．０以上であることが好ましい。前記Basic計算pKaとしては、４．０〜１０、４．０〜９．５、４．０〜９．０、４．０〜８．８，４．０〜８．６，４．０〜８．５、４．０〜７．５、４．０〜６．５の範囲が好ましく例示される。なお、非限定の一態様において、前記塩基性の側鎖は、塩基性の長側鎖であってもよい。
本開示における環状ペプチド化合物、及び／又はこれらをコードする核酸のライブラリについて、「〜から実質的になる」とは、該ライブラリに含まれる環状ペプチド化合物、及び／又はこれらをコードする核酸のバリエーションの理論上の総数に対する、そこに挙げられた環状ペプチド化合物、及び／又はこれらをコードする核酸のバリエーションの理論上の数の割合が、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であってよいが、これらに限定されるものではない。
本開示における環状ペプチド化合物のライブラリ、及び／又はこれらをコードする核酸について、「〜を実質的に含まない」とは、該ライブラリに含まれる環状ペプチド化合物、及び／又はこれらをコードする核酸のバリエーションの理論上の総数に対する、そこに挙げられた環状ペプチド化合物、及び／又はこれらをコードする核酸のバリエーションの理論上の数の割合が、１０％以下、７％以下、５％以下、３％以下、２％以下、又は１％以下であってよいが、これらに限定されるものではない。
本開示におけるライブラリにおいて、環状ペプチド化合物の「バリエーションの理論上の（総）数」を求める際、実際に環状ペプチド化合物として製造され得ないものは、理論上の（総）数には算入しない。例えば、以下（１）及び（２）のような場合には、該当するアミノ酸は翻訳合成されないことから、このようなアミノ酸を含むペプチド化合物は、理論上の（総）数に算入しない：（１）ペプチド化合物の材料として翻訳液中にアミノ酸が添加されていても、同アミノ酸をコードする核酸を鋳型として含まない場合；（２）ペプチド化合物の鋳型となる核酸には塩基配列を含むが、これに対応するアミノ酸を含まない翻訳液を使用する場合。また、環状ペプチド化合物を製造する過程での副反応物や未反応物が存在する場合には、これらは前記理論上の（総）数には算入しない。
例えば、計２０種類の天然アミノ酸を用いて、１種のアミノ酸に対して１組のコドンユニットを対応させたコドン表により、前記コドンユニットがランダムに配置された塩基配列から、１１残基のペプチドを翻訳合成する場合において、翻訳開始アミノ酸がメチオニンに固定されていたとすると、バリエーションの理論上の数は、２０１０となる。
非限定の一態様において、本開示におけるライブラリは、環状ペプチド化合物、及び／又はこれらをコードする核酸に加えて、標的分子に特異的に結合できるペプチド化合物のスクリーニングに必要な他の成分を含んでいてよい。また、本開示におけるライブラリの効果に負の影響を与えない範囲で他の成分を含んでよい。
本開示におけるライブラリには、環状ペプチド化合物、又はこれらをコードする核酸が複数含まれる。本明細書において、ライブラリに含まれる環状ペプチド化合物のバリエーション（種類）の数のことを「多様性」という。本開示におけるライブラリに含まれる環状ペプチド化合物、又はこれらをコードする核酸の多様性は特に限定されないが、１０３以上、１０４以上、１０５以上、１０６以上、１０７以上、１０８以上、１０９以上、１０１０以上、１０１１以上、及び１０１２以上が例示される。これら多様性は、実測値に限定されるものではなく、理論値であってよい。
非限定の一態様において、本開示におけるライブラリに含まれる、又はライブラリに含まれる核酸によりコードされるペプチド化合物のClogPの平均は、４以上が好ましく、５以上がより好ましく、６以上が更に好ましく、８以上が特に好ましく、１５以下であることが好ましい。
非限定の一態において、本開示におけるライブラリに含まれる、又はライブラリに含まれる核酸によりコードされるペプチド化合物のClogP/total aaは、０．８以上が好ましく、１．０以上がより好ましく、１．１以上がより好ましく、１．２以上が更に好ましく、１．３以上が特に好ましい。
非限定の一態様において、本開示におけるライブラリに含まれる、又はライブラリに含まれる核酸によりコードされる環状ペプチド化合物の核酸連結部以外のペプチド部位の分子量の平均、又は環状ペプチド化合物の環状部の分子量の平均は５００〜２０００であってよい。
膜透過性
非限定の一態様において、本開示におけるライブラリは、該ライブラリに含まれる、又はライブラリに含まれる核酸によりコードされる環状ペプチド化合物が高い膜透過性を有するか、又は、これらを誘導体化することにより容易に高い膜透過性を獲得できるライブラリであってよい。また、非限定の一態様において、本開示におけるライブラリは、標的分子に特異的に結合できる化合物としてヒットした環状ペプチド化合物が、高い膜透過性を有するか、又は、これらを誘導体化することにより容易に高い膜透過性を獲得できるライブラリであってよい。本明細書において「高い膜透過性」とは、本開示における膜透過性の測定方法により測定した膜透過係数（Papp）が、5.0×10-7 cm/秒以上、好ましくは8.0×10-7 cm/秒以上、又は9.0×10-7 cm/秒以上、より好ましくは1.0×10-6 cm/秒以上、より好ましくは3.0×10-6 cm/秒以上、更に好ましくは5.0×10-6 cm/秒以上であることを意味する。本開示におけるライブラリは非限定の一態様において、経口投与可能な化合物、又はその前駆体を同定するためのライブラリであってよい。本明細書において「経口投与可能な」とは、膜透過係数（Papp）が、1.0×10-6 cm/秒以上、好ましくは3.0×10-6 cm/秒以上、より好ましくは5.0×10-6 cm/秒以上であることを意味する。本明細書において「前駆体」とは、最適化のための化学修飾等を行う前の化合物を意味し、例えばパニングのヒット化合物であって、最適化を行う前のものが挙げられる。
標的分子に特異的に結合できるペプチド化合物のヒット率
非限定の一態様において、本開示におけるライブラリは、標的分子に特異的に結合できる化合物を同定するためのライブラリであってよい。一態様において、本開示におけるライブラリは、従来のライブラリと比較して標的分子に特異的に結合できるペプチド化合物のヒット率が高い。すなわち、本開示におけるライブラリを用いることで、標的分子に特異的に結合できるペプチド化合物を多数得ることができる。また、一態様において、標的分子との結合親和性の高いペプチド化合物を得ることができる。したがって、多数選択されてきたペプチド化合物の中から、代謝安定性や膜透過性等の他の要素を加味して、所望の化合物を選択することが可能となる。本明細書において「ヒット率」とは、ライブラリに含まれる化合物のバリエーションの数に占める、パニングで得られたヒット化合物のバリエーションの数の割合を意味する。ライブラリに含まれる化合物のバリエーションの数は理論上の数であってよい。
非限定の一態様において、ヒット化合物を得るための環状ペプチド化合物としてライブラリ中に存在していないペプチド化合物（例えば、パニングをする前から標的分子との結合能を有しないことが明らかなペプチド化合物）は、本開示におけるライブラリを構成するペプチド化合物とはみなされない。
パニングにより濃縮された環状ペプチド化合物を用いて、アミノ酸の出現頻度を解析することで、標的分子との結合に寄与し得るアミノ酸群を見出すことができる。
ディスプレイライブラリ
ディスプレイライブラリは表現型であるペプチドとその遺伝子型であるペプチドをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡが対応付けられているライブラリである。このライブラリを使用して、標的分子に特異的に結合できるペプチド化合物を同定することができる。例えば、所望の固定した標的にライブラリを接触させ、標的に結合しない分子を洗い流すことで、標的に結合するペプチドの濃縮が可能である(パニング法)。このような過程を経て選択されたペプチドに対応付けられている遺伝子情報を解析することで標的に結合したペプチドの配列を明らかにすることができる。例えば、アミノアシルｔＲＮＡのアナログである抗生物質ピューロマイシンがリボソームによるｍＲＮＡ翻訳伸長中の蛋白質に非特異的に連結されることを利用する方法がmRNAディスプレイ(Proc Natl Acad Sci USA. 1997;94:12297-302. RNA-peptide fusions for the in vitro selection of peptides and proteins. Roberts RW, Szostak JW.)ないしはin vitro virus(FEBS Lett. 1997;414:405-8. In vitro virus: bonding of mRNA bearing puromycin at the 3'-terminal end to the C-terminal end of its encoded protein on the ribosome in vitro. Nemoto N, Miyamoto-Sato E, Husimi Y, Yanagawa H.)として報告されている。
Ｔ７プロモーターなどのプロモーターを含むＤＮＡライブラリから転写にて得たｍＲＮＡのライブラリの３'端にピューロマイシンなどのスペーサーを結合しておき、無細胞翻訳系でｍＲＮＡをタンパク質に翻訳させるとピューロマイシンがリボソームによってアミノ酸と間違ってタンパク質に取り込まれ、ｍＲＮＡとこれにコードされる蛋白質が連結され、ｍＲＮＡとその産物が対応付けられたライブラリになる。この過程では大腸菌などの形質転換を含まないため高い効率が実現され、大規模なディスプレイライブラリを構築することが出来る。パニングで濃縮、選択された分子についている遺伝子情報を含むタグであるｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅し、塩基配列を解析することで結合した蛋白の配列を明らかにすることが出来る。
無細胞翻訳系を利用したディスプレイライブラリには、mRNAディスプレイの他に、ペプチドとピューロマイシンの複合体が結合しているペプチドをコードするｃＤＮＡからなるライブラリであるcDNAディスプレイ(Nucleic Acids Res. 2009;37(16):e108.cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization ofmRNA-protein fusions.Yamaguchi J, Naimuddin M, Biyani M, Sasaki T, Machida M, Kubo T, Funatsu T, Husimi Y, Nemoto N.)、ｍＲＮＡ翻訳中にリボソームと翻訳産物が比較的安定な複合体であることを利用したリボソームディスプレイ(Proc Natl Acad Sci U S A. 1994;91:9022-6. An in vitro polysome display system for identifying ligands from very large peptide libraries. Mattheakis LC, Bhatt RR, Dower WJ.)、bacteriophage endonuclease P2AがDNAと共有結合を形成することを利用したcovalent display(Nucleic AcidsRes. 2005;33:e10.Covalent antibody display--an in vitro antibody-DNA library selection system.Reiersen H, Lobersli I, Loset GA, Hvattum E, Simonsen B, Stacy JE, McGregor D, Fitzgerald K, Welschof M, Brekke OH, Marvik OJ.)、微生物のプラスミドの複製開始蛋白RepAが複製開始点oriに結合することを利用したCIS display(Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101:2806-10. CIS display: In vitro selection of peptides from librariesof protein-DNA complexes. Odegrip R, Coomber D, Eldridge B, HedererR, Kuhlman PA, Ullman C, FitzGerald K, McGregor D.)が知られている。また、DNAライブラリを構成するDNAの1分子毎に転写翻訳系をwater-in-oilエマルジョンやリポソームに封入し、翻訳反応を行うin vitro compartmentalization(Nat Biotechnol. 1998;16:652-6. Man-made cell-like compartments for molecular evolution. Tawfik DS, Griffiths AD.)も知られている。適宜、公知の方法を用いて上記方法を使用することができる。
核酸ライブラリ
本発明における「核酸」には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）あるいは、人工塩基を有するヌクレオチド誘導体を含むこともできる。また、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むこともできる。本発明の核酸は、目的とする遺伝情報が保持される限り、これらの核酸のいずれか、あるいは混成とすることもできる。すなわち、ＤＮＡ−ＲＮＡのハイブリッドヌクレオチドやＤＮＡとＲＮＡのような異なる核酸が一本鎖に連結されたキメラ核酸も本発明における核酸に含まれる。
ペプチド化合物ライブラリに含まれるペプチド化合物の鋳型となる核酸のライブラリとしては、mRNAライブラリ、DNAライブラリ等が例示される。ペプチド配列上でアミノ酸残基を固定しない箇所は塩基を混ぜて合成することによって、核酸ライブラリを得ることができる。例えば、DNAライブラリとしては、A, T, G, C、RNAライブラリとしては、A, U, G, Cのそれぞれ4塩基の混合(N)の３の倍数個の繰り返し、もしくはコドンの一文字目二文字目はN、三文字目はW, M, K, Sなどの2塩基の混合として合成する、さらに導入するアミノ酸の種類を16以下に抑えるのであれば、三文字目を1種類の塩基にする方法もある。また、コドンの3文字に相当するコドンユニットを用意し、これを任意の割合で混合して合成に用いることによってアミノ酸残基の出現頻度を自由に調整できる。
無細胞翻訳系を用いてこれら核酸ライブラリを翻訳することができる。無細胞翻訳系を使用する場合、目的の核酸の下流にスペーサーをコードする配列を含むことが好ましい。スペーサー配列としては、グリシンやセリンを含む配列が挙げられるがこれに限定しない。またピューロマイシン、その誘導体などリボソームによる翻訳時にペプチドに取り込まれる化合物と核酸ライブラリの間には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ヘキサエチレングリコール（ｓｐｃ１８）のポリマー（例えば５つのポリマー）などで形成されるリンカーを含むことが好ましい。
ペプチド化合物、及びライブラリの製造方法
一実施態様において、本開示における製造方法には、ペプチド化合物、及びペプチド化合物を含むライブラリの製造方法が含まれる。これら製造方法としては、特に限定されないが、例えば化学合成、翻訳合成、又はこれらの組み合わせを利用することができる。
ペプチド化合物の化学合成方法
本開示におけるペプチド化合物の化学合成方法としては、液相合成法、Fmoc合成やBoc合成等を用いた固相合成法、及びこれらの組み合わせ等が例示される。Fmoc合成では、主鎖アミノ基がFmoc基により保護され、側鎖官能基が必要に応じてピペリジンなどの塩基性で切断されない保護基で保護され、主鎖カルボン酸を保護しないアミノ酸を基本単位とする。基本単位としては、その他、Fmoc保護されたアミノ基とカルボン酸基を有する組み合わせであれば、特に限定されない。例えばジペプチドを基本単位としてもよい。Ｎ末端に配置させる基本単位は、Fmocアミノ酸以外であってもよい。例えば、Bocアミノ酸であってもよく、アミノ基を有しないカルボン酸類縁体であってもよい。主鎖カルボン酸基を固相担体の官能基との化学反応により固相に担持させる。続いてピペリジンやDBUなどの塩基によりFmoc基を脱保護し、新たに生じたアミノ基と続いて添加される基本単位のカルボン酸を有する保護アミノ酸とを縮合反応させることで、ペプチド結合を生成させる。縮合反応では、DICとHOBｔの組み合わせ、DICとHOAtの組み合わせ、HATUとDIPEAとの組み合わせなど様々な組み合わせが可能である。脱Fmoc基とそれに続くペプチド結合生成反応の繰り返しにより、望みのペプチド配列を生成させることができる。望みの配列が得られた後、固相からの切り出しと必要に応じて導入した側鎖官能基の保護基の脱保護が行われる。また、固相からの切り出しを行う前にペプチドの構造変換や環化を行うことも可能である。固相からの切り出しと、脱保護は同一の条件、例えば９０：１０のＴＦＡ／Ｈ２Ｏで行っても良いし、必要に応じて別々の条件で脱保護しても良い。固相からの切り出しは、１％ ＴＦＡなどの弱酸での切り出しが可能なものもあれば、保護基としてＰｄなどを利用して、両者の化学反応の直行性を利用することが可能である。これらの工程の間もしくは最後に、環化などの工程を実施することもできる。例えば、側鎖カルボン酸とＮ末端主鎖のアミノ基とを縮合させることや、側鎖アミノ基とＣ末端主鎖のカルボン酸を縮合させることができる。この際、Ｃ末端側のカルボン酸と環化させる側鎖カルボン酸の間、もしくはＮ末端側の主鎖アミノ基またはヒドロキシ基と環化させる側鎖アミノ基の間で反応直行性が必要であり、前述のとおり保護基の直行性を考慮して保護基の選択が行われる。このようにして得られた反応物を逆相カラムや、分子ふるいカラムなどで精製することができる。これらの詳細は、例えばメルク株式会社が平成14年5月1日に発行した固相合成ハンドブックなどに記載されている。
ペプチド化合物の翻訳合成方法
本開示におけるペプチド化合物の翻訳合成方法としては、無細胞翻訳系を用いて合成する方法が例示され、同方法には再構成無細胞翻訳系による合成法が含まれる。排除したい因子を除くことができる点で、再構成無細胞翻訳系を利用するのが好ましい。
一局面において、本開示は、表２−１〜表２−６に記載されたアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１種、２種以上、又は３種以上のアミノ酸を含むペプチド化合物の翻訳合成方法を提供する。限定はされないが、このような翻訳合成方法は、以下(i)および(ii)を含んでよい：
(i) 表２−１〜表２−６に記載されたアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１種、２種以上、又は３種以上のアミノ酸が結合したtRNAを用意する工程；
(ii) 前記tRNAのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含む核酸を無細胞翻訳系で翻訳し、前記ペプチド化合物を得る工程。
非限定の一態様において、本開示における翻訳合成方法は、環状ペプチド化合物の翻訳合成方法であってよい。
無細胞翻訳系
本明細書において「無細胞翻訳系」とは、細胞より抽出したリボソームの他、翻訳に関与する蛋白因子群、ｔＲＮＡ、アミノ酸、ＡＴＰなどのエネルギー源、その再生系を組み合わせたもので、ｍＲＮＡを蛋白質に翻訳することが出来るものであれば限定されない。また、翻訳合成反応が進行している間の系も、本明細書における「無細胞翻訳系」に含まれてよい。本明細書における無細胞翻訳系は、ペプチドを翻訳する際の鋳型となる核酸を含んでいてよく、これら以外にも、開始因子、伸長因子、解離因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素などを含むことができる。これらの因子は、種々の細胞の抽出液から精製することによって得ることができる。因子を精製するための細胞は、例えば原核細胞、または真核細胞を挙げることができる。原核細胞としては、大腸菌細胞、高度好熱菌細胞、または枯草菌細胞を挙げることができる。真核細胞としては、酵母細胞、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、植物細胞、昆虫細胞、または動物細胞を材料にしたものが知られている。またｔＲＮＡやアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ARS）は天然に存在するものに加え、人工ｔＲＮＡや非天然アミノ酸を認識する人工アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を用いることもできる。人工ｔＲＮＡや人工アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を用いることにより部位特異的に非天然アミノ酸を導入したペプチドを合成することができる。なお、必要に応じて、無細胞翻訳系にT7 RNA polymeraseなどのRNAポリメラーゼを加えることで、鋳型DNAから転写させることもできる。
本明細書において、「無細胞翻訳系がある物質を含む」とは、翻訳合成の開始時に該物質を含んでいなくても、翻訳合成の過程において系内で該物質が合成され含まれることになる態様も含む。例えば、翻訳合成の過程で、アミノ酸がアシル化されたｔＲＮＡが合成される場合には、無細胞翻訳系が該アミノアシルｔＲＮＡを含むと理解される。
PURESYSTEM（登録商標）(BioComber, Japan)は大腸菌の翻訳に必要な蛋白因子類、エネルギー再生系酵素、リボソームそれぞれを抽出、精製し、tRNA、アミノ酸、ATP、GTPなどと混合した再構成無細胞翻訳系である。不純物の含有量が少ないだけでなく、再構成系であるため排除したい蛋白因子、アミノ酸を含まない系を容易に作製することができる。((i)Nat Biotechnol. 2001;19:751-5. Cell-free translation reconstituted with purified components. Shimizu Y, Inoue A, Tomari Y, Suzuki T, Yokogawa T, Nishikawa K, Ueda T.(ii)Methods Mol Biol. 2010;607:11-21.PURE technology.Shimizu Y, Ueda T.)。
例えば、非天然アミノ酸を導入するコドンとして終止コドンを利用する方法が多く報告されているが、前述のPURESYSTEMを用いることで天然アミノ酸、ARSを除いた合成系を構築できる。これにより、除外する天然アミノ酸をコードするコドンに、非天然アミノ酸を対応付けることが出来る(J Am Chem Soc. 2005;127:11727-35.Ribosomal synthesis of unnatural peptides. Josephson K, Hartman MC, Szostak JW.)。さらにコドンの縮重を解くことにより天然アミノ酸を除外することなく非天然アミノ酸を加えることが出来る（Kwon I,et al. Breaking the degeneracy of the genetic code. J Am Chem Soc. 2003, 125, 7512-3.）。N-メチルアミノ酸を含むペプチドがPURESYSTEMなどの無細胞翻訳系の活用によりリボソームにて合成できる。
より具体的には、翻訳合成は、例えば、大腸菌の翻訳に必要な蛋白因子類（メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ、EF-G、RF1、RF2、RF3、RRF、IF1、IF2、IF3、EF-Tu、EF-Ts、ARS（AlaRS、ArgRS、AsnRS、AspRS、CysRS、GlnRS、GluRS、GlyRS、HisRS、IleRS、LeuRS、LysRS、MetRS、PheRS、ProRS、SerRS、ThrRS、TrpRS、TyrRS、ValRSから必要なものを選ぶ））、リボソーム、アミノ酸、クレアチンキナーゼ、ミオキナーゼ、無機ピロフォスファターゼ、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、E. coli 由来tRNA、クレアチンリン酸、グルタミン酸カリウム、HEPES-KOH pH7.6、酢酸マグネシウム、スペルミジン、ジチオスレイトール、GTP、ATP、CTP、UTPなどを適宜取捨選択して混合したPURESYSTEM等の公知の無細胞翻訳系にmRNAを加えることによって行うことが出来る。また、T7 RNA polymeraseを加えておけば、T7プロモーターを含む鋳型DNAからの転写、翻訳を共役して行なうこともできる。また、所望のアミノアシルtRNA群やアミノアシルtRNA合成酵素（ARS）が許容する非天然アミノ酸群（例えばF-Tyr）を系に添加することによって非天然アミノ酸を含むペプチド化合物を翻訳合成することが出来る（Kawakami T, et al. Ribosomal synthesis of polypeptoids and peptoid-peptide hybrids. J Am Chem Soc. 2008, 130, 16861-3., Kawakami T, et al. Diverse backbone-cyclized peptides via codon reprogramming. Nat Chem Biol. 2009, 5, 888-90.）。さらに、天然のARSに代えて又はこれら加えて、ARSの改変体を系に含めるとともに、非天然アミノ酸群を系に含めることによっても、非天然アミノ酸を含むペプチド化合物を翻訳合成することが出来る。あるいは、リボソームやEF-Tuなどの変異体を利用することによって非天然アミノ酸の翻訳導入の効率を高めることも出来る(Dedkova LM, et al. Construction of modified ribosomes for incorporation of D-amino acids into proteins. Biochemistry. 2006, 45, 15541-51., Doi Y, et al. Elongation factor Tu mutants expand amino acid tolerance of protein biosynthesis system. J Am Chem Soc. 2007, 129, 14458-62., Park HS, et al. Expanding the genetic code of Escherichia coli with phosphoserine. Science. 2011, 333, 1151-4.)。
非限定の一態様において、本開示にける無細胞翻訳系（「本開示における翻訳系」ともいう。）は、ペプチド化合物を製造するための翻訳系であってよく、好ましくは環状ペプチド化合物を製造するための翻訳系である。
非限定の一態様において、本開示におけ翻訳系は、以下（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくとも一つ、二つ、又はすべてを実質的に含まない無細胞翻訳系であってよい：（ａ）側鎖にインドール骨格を有するアミノ酸、又は該アミノ酸をコードする核酸；（ｂ）側鎖に２以上の芳香環による縮環構造を有するアミノ酸、又は該アミノ酸をコードする核酸；及び（ｃ）側鎖に置換又は無置換のヒドロキシフェニル基を有するアミノ酸、又は該アミノ酸をコードする核酸。非限定の一態様において、本開示におけ翻訳系は、以下（ｄ）〜（ｆ）からなる群より選択される少なくとも一つ、二つ、又はすべてを実質的に含まない無細胞翻訳系であってよい：（ｄ）側鎖にインドール骨格を有するアミノ酸をコードする核酸；（ｅ）側鎖に２以上の芳香環による縮環構造を有するアミノ酸をコードする核酸；及び（ｆ）側鎖に置換又は無置換のヒドロキシフェニル基を有するアミノ酸をコードする核酸。非限定の一態様において、本開示におけ翻訳系は、以下（ｇ）〜（ｉ）からなる群より選択される少なくとも一つ、二つ、又はすべてを実質的に含まない無細胞翻訳系であってよい：（ｇ）側鎖にインドール骨格を有するアミノ酸；（ｈ）側鎖に２以上の芳香環による縮環構造を有するアミノ酸；及び（ｉ）側鎖に置換又は無置換のヒドロキシフェニル基を有するアミノ酸。なお、翻訳系にあるアミノ酸や核酸が含まれていたとしても、翻訳合成に利用されないような態様で含まれている場合には、該翻訳系は、該アミノ酸や該核酸を実質的に含まないと理解される。例えば、アミノ酸は存在するものの、対応するＡＲＳが含まれていないために、該アミノ酸が翻訳合成に利用されないような場合等が挙げられる。非限定の一態様において、前記「２以上の芳香環による縮環構造」は、「縮環構造」であってもよい。
非限定の一態様において、本開示における翻訳系は、該翻訳系が酸性の側鎖を有するアミノ酸がアシル化されたｔＲＮＡ、及び該アミノ酸をコードする核酸を含む場合、該アミノ酸の側鎖のpKaが3.5〜10であってよい。一態様において、前記pKaは、３．５〜１０、３．９〜１０、４．５〜１０、５．０〜１０，又は５．５〜１０，５．７〜１０の範囲が好ましく例示される。これらpKaを計算pKaであらわすと、３．５〜１０、４．５〜１０、５．０〜１０，５．４〜１０，８．０〜１０，又は８．３〜１０の範囲が好ましく例示される。
非限定の一態様において、本開示における翻訳系は、該翻訳系が塩基性の側鎖を有するアミノ酸がアシル化されたｔＲＮＡ、及び該アミノ酸をコードする核酸を含む場合、該アミノ酸の側鎖のBasic pKaが4.0〜10であってよい。一態様において、前記Basic pKaは４．０〜１０、４．０〜９．５、４．０〜９．０、４．０〜８．５、４．０〜７．５、４．０〜７．２、４．０〜６．５の範囲が好ましく例示される。これらpKaを計算pKaであらわすと、４．０〜１０、４．０〜９．５、４．０〜９．０、４．０〜８．８，４．０〜８．６，４．０〜８．５、４．０〜７．５、４．０〜６．５の範囲が好ましく例示される。
非限定の一態様において、本開示における翻訳系は、例えば長さが5.4〜13、又は5.4〜10オングストロームの長側鎖を有するアミノ酸を含んでいてよい。一態様における前記「長側鎖」は、「ペプチド化合物」の項目に記載したとおりであってよい。一態様において、長側鎖の少なくとも一種、又は二種以上が、芳香環を有する側鎖であってもよい。
非限定の一態様において、本開示における翻訳系は、５〜３２種類、５〜２８種類、又は５〜２０種類の非天然アミノ酸を含んでいてよく、８〜２０種類、１０〜２０種類、１３〜２０種類が好ましく例示される。一態様において、本開示における翻訳系に含まれるアミノ酸の種類の数のうち、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上が非天然アミノ酸であってよい。
非限定の一態様において、本開示における翻訳系は、５〜２８種類、又は５〜２０種類のＮ置換アミノ酸を含んでいてよく、５〜１８種類、５〜１５種類が好ましく例示される。一態様において、本開示における翻訳系に含まれるアミノ酸の種類の数のうち、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上がＮ置換アミノ酸であってよい。ここでのＮ置換アミノ酸は、Ｎ−アルキルアミノ酸、又はＮ−メチルアミノ酸を意味してもよいが、その場合であっても、本開示における翻訳系に他のＮ置換アミノ酸が含まれることを否定するものではない。
非限定の一態様において、本開示における翻訳系は、該翻訳系を用いて製造される環状ペプチド化合物に含まれる芳香環の数の平均が一定の範囲内となるように調整されていてもよい。例えば、翻訳合成される環状ペプチド化合物において、環状部を構成するアミノ酸の数に占める芳香環を有するアミノ酸の数の割合の平均が４０％以下、３５％以下、３０％以下、２７％以下、２５％以下、若しくは２０％以下になるように、又は、８〜１１個のアミノ酸から構成される環状部を有する環状ペプチド化合物の環状部の側鎖に含まれる芳香環の数の平均が０〜３になるように、本開示における翻訳系を調整してよい。調整方法は特に限定されないが、例えば、翻訳系に含まれるアミノ酸の種類の数に占める芳香環を有するアミノ酸の種類の数を調整することが挙げられる。
非限定の一態様において、本開示における翻訳系は、芳香環を有するアミノ酸を含んでいてよく、翻訳系に含まれるアミノ酸の種類の数に占める芳香環を有するアミノ酸の種類の数の割合は４０％以下が好ましく、３５％以下、３０％以下、２７％以下、２５％以下、２０％以下が好ましく例示される。
非限定の一態様において、本開示における無細胞翻訳系は、表２−１〜表２−６に記載されたアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１種、２種以上、又は３種以上のアミノ酸を含むペプチド化合物を製造するための無細胞翻訳系であってよい。限定はされないが、このような無細胞翻訳系は、以下(i)および(ii)を含んでよい：
(i) 表２−１〜表２−６に記載されたアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１種、２種以上、又は３種以上のアミノ酸が結合したtRNA；
(ii) 前記ペプチド化合物をコードする核酸、
ここで該核酸は前記tRNAのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含んでよい。
ｔＲＮＡ
非天然アミノ酸のペプチドへの翻訳導入には、直交性を有し効率よくリボソームに取り込まれるｔＲＮＡ（(i)Biochemistry. 2003;42:9598-608.Adaptation of an orthogonal archaeal leucyl-tRNA and synthetase pair for four-base, amber, and opal suppression. Anderson JC, Schultz PG., (ii)Chem Biol. 2003;10:1077-84.Using a solid-phase ribozyme aminoacylation system to reprogram the genetic code.Murakami H, Kourouklis D, Suga H.）のアミノアシル化が必要である。tRNAをアミノアシル化する方法として以下の５つの方法を用いることができる。
細胞内ではtRNAのアミノアシル化のための酵素として、アミノ酸別にアミノアシルtRNA合成酵素（ARS）が用意されている。そのため第一の方法としては、ある種のARSがN-Me Hisなど非天然アミノ酸を許容することを利用する方法や、非天然アミノ酸を許容する変異アミノアシルtRNA合成酵素を用意し、これを利用する方法が挙げられる（(i)Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99:9715-20. An engineered Escherichia coli tyrosyl-tRNA synthetase for site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in eukaryotic translationand its application in a wheat germ cell-free system.Kiga D, Sakamoto K, Kodama K, Kigawa T, Matsuda T, Yabuki T, Shirouzu M, Harada Y, Nakayama H, Takio K, Hasegawa Y, Endo Y, Hirao I, Yokoyama S.(ii)Science. 2003;301:964-7.An expanded eukaryotic genetic code.Chin JW, Cropp TA, Anderson JC, Mukherji M, Zhang Z, Schultz PG. Chin,JW.(iii) Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103:4356-61.Enzymatic aminoacylation of tRNA with unnatural amino acids.Hartman MC, Josephson K, Szostak JW.）。第二に、試験管内でtRNAをアミノアシル化しその後アミノ酸を化学修飾する方法も用いることができる（J Am Chem Soc. 2008;130:6131-6.Ribosomal synthesis of N-methyl peptides.Subtelny AO, Hartman MC, Szostak JW.）。第三に、tRNAの3'末端のCCA配列からCAを除いたものと別途調製したアミノアシル化したpdCpAとをRNAリガーゼで結合させることでアミノアシルtRNAを得ることが出来る(Biochemistry. 1984;23:1468-73.T4 RNA ligase mediated preparation of novel "chemically misacylated" tRNAPheS.Heckler TG, Chang LH, Zama Y, Naka T, Chorghade MS, Hecht SM.)。種々の非天然アミノ酸の活性エステルをtRNAに担持させるリボザイムであるフレキシザイムによるアミノアシル化もある（J Am Chem Soc. 2002;124:6834-5.Aminoacyl-tRNA synthesis by a resin-immobilized ribozyme.Murakami H, Bonzagni NJ, Suga H.)。第四に、tRNAとアミノ酸活性エステルとをカチオン性ミセル中で超音波混合する方法も用いることができる(Chem Commun (Camb). 2005;(34):4321-3.Simple and quick chemical aminoacylation of tRNA in cationic micellar solution under ultrasonic agitation. Hashimoto N, Ninomiya K, Endo T, Sisido M.)。第五として、tRNAの3'末端付近に相補的なPNAにアミノ酸活性エステルを結合したものをtRNAに加えることによってもアミノアシル化が可能である（J Am Chem Soc. 2004;126:15984-9.In situ chemical aminoacylation with amino acid thioesters linked to a peptide nucleic acid.Ninomiya K, Minohata T, NishimuraM, Sisido M.）。
より具体的には、以下のような方法を用いてアミノアシルtRNAを作製することができる。所望のtRNA配列をコードし、上流にＴ７、Ｔ３もしくはＳＰ６プロモーターを配置した鋳型ＤＮＡを用意し、T7 RNA polymeraseやT3, SP6 RNA polymeraseなどプロモーターに適応したＲＮＡポリメラーゼを利用して転写によってＲＮＡを合成することが出来る。細胞からｔＲＮＡを抽出精製し、ｔＲＮＡの配列の相補配列のプローブを用いて目的の生成ｔＲＮＡを抽出することも出来る。この際目的のｔＲＮＡの発現ベクターで形質転換した細胞をソースにすることも出来る。化学合成によって目的の配列のＲＮＡを合成することも出来る。例えば、このようにして得られた３'末端のＣＣＡ配列からＣＡを除いたｔＲＮＡと別途調製したアミノアシル化したｐｄＣｐＡまたはｐＣｐＡとをＲＮＡリガーゼで結合させることでアミノアシルｔＲＮＡを得ることが出来る（ｐｄＣｐＡ法、ｐＣｐＡ法）。当該ｔＲＮＡは、ペプチド化合物の製造において有用である。あるいは、全長ｔＲＮＡを用意し、種々の非天然アミノ酸の活性エステルをｔＲＮＡに担持させるリボザイムであるフレキシザイムによるアミノアシル化も可能である。また、限定を意図しないが、天然のＡＲＳ又はその改変体を用いて、アミノアシルｔＲＮＡを作製することもできる。天然ＡＲＳ又はその改変体を用いると、翻訳系内で一旦消費されたアミノアシルｔＲＮＡが、天然ＡＲＳやその改変体によって再生成され得るため、予め作製したアミノアシルｔＲＮＡを翻訳系に大量に存在させる必要がない。このようなＡＲＳ改変体は、WO2016/148044に記載される。これらのアミノアシルtRNAの作製方法を適宜組み合わせることもできる。
ペプチド部位の環化方法
非限定的な一態様において、本開示におけるペプチド化合物のペプチド部位は、環状部を有することが好ましい。ペプチド化合物の環化方法は特に限定されないが、例えば、化学合成、又は翻訳合成等によりペプチド化合物を合成した後に、環化反応を行うことができる。例えば、アミド結合、炭素−炭素結合、チオエーテル結合、ジスルフィド結合、エステル結合、チオエステル結合、ラクタム結合、トリアゾール構造を介した結合、フルオロフォア構造を介した結合等を利用した環化が挙げられる。ペプチド化合物の合成工程と環化反応の工程は、分離していても、連続して進行してもよい。環化は、例えばWO2013/100132、WO2008/117833、WO2012/074129等に記載された当業者に公知の方法により行うことができる。
環化部としては、限定されないが、ペプチドのN末端とC末端の結合、ペプチドのN末端と他のアミノ酸残基の側鎖の結合、ペプチドのC末端と他のアミノ酸残基の側鎖の結合、又はアミノ酸残基の側鎖同士の結合のいずれであってもよく、これらの二以上を組み合わせて使用してもよい。C末端側に核酸が連結されているペプチド−核酸複合体を環化させる場合には、ペプチドのN末端と他のアミノ酸残基の側鎖の結合、又はアミノ酸残基の側鎖同士の結合であってよい。
非限定の一態様において本開示における環状ペプチド化合物は、以下の方法により製造できる。例えば、以下の工程を含む製造方法を挙げることができる：
（１）アミノ酸残基、もしくは、アミノ酸残基及びN末端カルボン酸類縁体により構成される非環状のペプチド化合物を、該ペプチド化合物をコードする核酸から翻訳して合成する工程であって、該非環状のペプチド化合物は、C末端側に側鎖の１つに反応点を有するアミノ酸残基、及び、N末端側にもう1つの反応点を有するアミノ酸残基又はN末端カルボン酸類縁体を含む、工程；及び
（２）N末端側のアミノ酸残基、又はN末端カルボン酸類縁体の反応点と、C末端側の側鎖に有するアミノ酸残基の反応点とを結合させ、アミド結合、炭素-炭素結合又はチオエーテル結合を形成させる工程。
なお、これら（１）と（２）の工程は、分離していても、連続して進行してもよい。
アミド結合によるペプチド化合物の環化方法の非限定的な一態様として、Ｎ末端にシステインまたはシステイン類縁体を持ち、Ｃ末端側のアミノ酸の側鎖に活性エステルを持つペプチド化合物を翻訳してネイティブケミカルライゲーションを用いて環化させる方法がある。この環状ペプチド化合物の前駆体であるＮ末端にシステインまたはシステイン類縁体を持つペプチド化合物を翻訳合成する方法は特に制限されない。
一態様において、ペプチド化合物のＮ末端にＭｅｔ又はＮｌｅ以外のアミノ酸を持つペプチド化合物を合成するために、例えば以下の３つの方法が使用できる。
第一に、ホルミルメチオニン又はＭｅｔで開始されたペプチドのＮ末端アミノ酸もしくはＮ末端側ペプチドを、酵素によって切断する方法である。該酵素としては、ペプチドデホルミラーゼ（ＰＤＦ）及び／又はメチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）を使用できる。
第二に、再構築無細胞翻訳系を用い、予め系内からＭｅｔを除き、かつＮ末端から２残基目に、Ｎ末端に配置したいアミノ酸を配置し、開始コドンであるＭｅｔを読み飛ばして翻訳合成を行う方法（イニシエーションリードスルー（initiation readthrough；ｉＲＴ）法と定義する)である。
第三に、Ｍｅｔもしくは翻訳開始メチオニンｔＲＮＡを含まない再構築無細胞翻訳系に、予め開始用のｔＲＮＡとして、Ｎ末端に配置したいアミノ酸をアミノアシル化して調製したアミノアシルｔＲＮＡを加えて翻訳合成を行う方法（イニシエーションサプレッション（Initiation suppression）法（ｉＳＰ）法と定義する)である。
非限定の一態様において、本開示における環状ペプチド化合物のC末端部位はカルボン酸のままではなく、化学修飾されていてよい。例えば、カルボン酸部位をピペリジンなどと反応させ、ピペリジンアミドなどに変換してよい。
ライブラリの製造方法
非限定の一態様において、本開示におけるライブラリを製造する際は、所望の特性に寄与する構成アミノ酸を含ませるとともに、好ましくない性質を有する構成アミノ酸を含ませないことが好ましい。また、一態様においては、できる限りライブラリの多様性を拡大することが望ましい。具体的には、以下（１）〜（４）からなる群より選択される少なくとも一つに寄与し得るアミノ酸を構成アミノ酸として含めるのが好ましい：（１）標的分子と特異的に結合できるペプチド化合物のヒット率向上；（２）標的分子との結合親和性増大；（３）代謝安定性増大；及び（４）膜透過性増大。一方で、前記（１）〜（４）からなる群より選択される少なくとも一つに対して負の影響を与え得るアミノ酸は構成アミノ酸に含めないことが好ましい。
非限定の一態様において、本開示におけるライブラリの製造は、上述した本開示におけるペプチド化合物の製造方法に準じて行うことができ、適宜公知の方法と組み合わせることができる。一態様において、上述した本開示における無細胞翻訳系を使用して本開示におけるペプチド化合物のライブラリを製造できる。すなわち、本開示におけるライブラリの製造方法には、本開示における無細胞翻訳系を使用してペプチド化合物を合成する工程を含んでよい。一態様において、本開示における無細胞翻訳系において記述した、例示、好ましい範囲、態様が、本開示におけるライブラリの製造方法においてもそのまま適用できる。
非限定の一態様において、本開示におけるペプチド化合物のライブラリの製造方法は、以下（ａ）の工程を含んでよい：（ａ）側鎖にインドール骨格を有するアミノ酸を実質的に含まないアミノ酸プールを用意し、該プールに含まれるアミノ酸の一部又は全部を構成アミノ酸としてペプチド化合物を合成する工程。また、一態様において、本開示におけるペプチド化合物のライブラリの製造方法は、以下（ｂ）の工程を含んでよい：（ｂ）側鎖にインドール骨格を有するアミノ酸をコードする核酸を実質的に含まない鋳型プールを用意し、該鋳型プールからペプチド化合物を合成する工程。
本明細書において、アミノ酸プールがあるアミノ酸を含んでいても、そのアミノ酸が翻訳合成に利用されない態様で含まれる場合や極少量しか含まれない場合には、該アミノ酸プールは該アミノ酸を実質的に含まないと理解される。例えば、アミノ酸プールがあるアミノ酸を含んでいても、該アミノ酸に対応するARSを含まないために該アミノ酸が翻訳合成に利用されないような場合には、該アミノ酸プールは、該アミノ酸を実質的に含んでいないと理解される。なお、ARSを含まなくても、翻訳合成に利用される態様で該当するアミノ酸が含まれていれば、アミノ酸プールに該アミノ酸が含まれると理解される。
本明細書において、鋳型プールがあるアミノ酸をコードする核酸を含んでいても、該アミノ酸が翻訳合成に利用されない態様で該核酸が含まれる場合や極少量しか含まれない場合には、該鋳型プールは該核酸を実質的に含まないと理解される。
非限定の一態様において、前記工程（ａ）及び（ｂ）のプールは、それぞれ、側鎖に２以上の芳香環による縮環構造を有するアミノ酸、及び該アミノ酸をコードする核酸、を実質的に含まないプールであってよい。一態様において、前記工程（ａ）及び（ｂ）のプールは、それぞれ、側鎖に置換又は無置換のヒドロキシフェニル基を有するアミノ酸、及び該アミノ酸をコードする核酸、を実質的に含まないプールであってよい。非限定の一態様において、前記「２以上の芳香環による縮環構造」は、「縮環構造」であってもよい。
非限定の一態様において、前記ペプチド化合物の合成の際に使用されるアミノ酸プールに酸性の側鎖を有するアミノ酸が含まれ、かつ鋳型プールに該アミノ酸をコードする核酸が含まれてもよく、この場合、該アミノ酸の側鎖のpKaは３．５〜１０、３．９〜１０、４．５〜１０、５．０〜１０，又は５．５〜１０，５．７〜１０の範囲が好ましく例示される。これらpKaを計算pKaであらわすと、３．５〜１０、４．５〜１０、５．０〜１０，５．４〜１０，８．０〜１０，又は８．３〜１０の範囲が好ましく例示される。
非限定の一態様において、前記ペプチド化合物の合成の際に使用されるアミノ酸プールに塩基性の側鎖を有するアミノ酸が含まれ、かつ鋳型プールに該アミノ酸をコードする核酸が含まれてもよく、この場合、該アミノ酸の側鎖のBasic pKaは４．０〜１０、４．０〜９．５、４．０〜９．０、４．０〜８．５、４．０〜７．５、４．０〜７．２、４．０〜６．５の範囲が好ましく例示される。これらpKaを計算pKaであらわすと、４．０〜１０、４．０〜９．５、４．０〜９．０、４．０〜８．８，４．０〜８．６，４．０〜８．５、４．０〜７．５、４．０〜６．５の範囲が好ましく例示される。
非限定の一態様において、前記ペプチド化合物の合成の際に使用されるアミノ酸プールは、上述の長側鎖を有するアミノ酸を含んでいてよい。該「長側鎖」には、上述の例示、好ましい範囲、態様に関する記述がそのまま適用できる。一態様において、前記アミノ酸プールに含まれる長側鎖の少なくとも一種、二種、又は三種以上が、芳香環を有する側鎖であってもよい。
非限定の一態様において、前記ペプチド化合物の合成の際に使用されるアミノ酸プールは、上述の非天然アミノ酸、Ｎ置換アミノ酸、及び芳香環を有するアミノ酸を含んでいてよく、「無細胞翻訳系」の項目に記載した例示、好ましい範囲、態様がそのまま適用できる。前記アミノ酸プールに含まれるアミノ酸の種類の数に占める、非天然アミノ酸、Ｎ置換アミノ酸、又は芳香環を有するアミノ酸の種類の数の割合は、本開示における翻訳系におけるそれらの割合と同様に選択されてよい。
ｍＲＮＡディスプレイライブラリは、非限定の一態様において、以下のように製造することができる。まずＴ７プロモーターなどのプロモーターの下流に所望の配列を配置したＤＮＡのライブラリを化学合成し、これを鋳型にプライマー伸長反応にて二本鎖ＤＮＡにする。これを鋳型にT7 RNApolymeraseなどのRNAポリメラーゼを用いてｍＲＮＡに転写する。このＲＮＡの３'末端にアミノアシルｔＲＮＡのアナログである抗生物質ピューロマイシンなどがつながったリンカー（スペーサー）を結合させる。これを上記のPURESYSTEMなど公知の無細胞翻訳系に加え、保温することによってｍＲＮＡが翻訳され、ｍＲＮＡとこれにコードされるペプチドがピューロマイシンなどを含むリンカーを介して連結される。このようにしてｍＲＮＡとその産物が対応付けられたｍＲＮＡとその産物の複合体からなるディスプレイライブラリを構築することが出来る。リンカーはさらに、当業者に周知のスペーサーを含むことができる。また、必要に応じて、上述の方法や公知の方法により、環化等の翻訳後修飾を行うことができる。
非限定の一態様において、本開示におけるライブラリは、表２−１〜表２−６に記載されたアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１種、２種以上、又は３種以上のアミノ酸を含むペプチド化合物を含むペプチド化合物ライブラリであってよい。このようなライブラリの製造方法としては、以下(i)および(ii)を含む無細胞翻訳系でペプチド化合物を翻訳合成する工程を含んでよい：
(i) 表２−１〜表２−６に記載されたアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１種、２種以上、又は３種以上のアミノ酸が結合したtRNA；
(ii) 前記ペプチド化合物ライブラリをコードする核酸ライブラリ、
ここで該核酸ライブラリには前記tRNAのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含む核酸が含まれてよい。
スクリーニング方法
非限定の一態様において、本開示におけるライブラリを使用したスクリーニングにより、標的分子に特異的に結合できるペプチド化合物を選択することができる。本開示におけるスクリーニング方法としては、特に限定されないが、例えばｍＲＮＡディスプレイ法を用いることができる。
非限定の一態様において、本開示におけるスクリーニング方法は、本開示における環状ペプチド化合物のライブラリと標的分子を接触させ、標的分子に結合しないペプチド化合物を洗い流すことで標的分子に結合するペプチド化合物を濃縮することができる（パニング）。一態様においては、このようにして選択されたペプチド化合物に含まれる塩基配列情報を含むタグであるｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅し、塩基配列を解析することで、結合したペプチドのアミノ酸配列を明らかにすることができる。なお、一態様において、上記で増幅されたｃＤＮＡを転写することによって、ｍＲＮＡライブラリを得てもよく、これらを鋳型として再度ペプチド化合物のライブラリを製造してもよい。このライブラリは標的分子に結合できるペプチド化合物が濃縮されているため、このライブラリを用いて再度パニングを行うことで、標的分子に特異的に結合できるペプチド化合物を、より濃縮することができる。この工程を複数回繰り返すことにより、目的のペプチド化合物を、更に濃縮することができる。一態様において、このようにして濃縮されたペプチド化合物に含まれる塩基配列情報を基にアミノ酸配列を同定し、標的分子に特異的に結合できるペプチド化合物を製造することができる。一態様において、本開示におけるスクリーニング方法は、in vitroで行うことができる。
非限定の一態様において、本開示におけるスクリーニング方法により得られたペプチド化合物を公知の方法により化学修飾等することで、ペプチド化合物を最適化してもよい。本明細書において「最適化」とは、翻訳合成された化合物中のそれぞれのアミノ酸の構造を変換させることにより、よりドラッグライクなペプチド化合物となるように化学修飾する、より薬効標的に強い活性を有するペプチド化合物となるように化学修飾する、及び/又は、より毒性が回避されたペプチド化合物となるように化学修飾することを意味する。
非限定の一態様において、本開示におけるスクリーニング方法は、以下の工程を含む：
（ａ）本開示におけるライブラリに含まれるペプチド化合物と標的分子を接触させる工程；
（ｂ）前記標的分子に結合できるペプチド化合物を選択する工程。
一態様において、本開示におけるスクリーニング方法は、前記の（ａ）及び（ｂ）の工程を２回以上繰り返すことで、標的分子に特異的に結合できるペプチド化合物を濃縮してもよい。
標的分子
本開示におけるスクリーニング方法に用いられる標的分子は特に限定されず、タンパク質、ペプチド、核酸、糖、脂質などが例示されるが、中でもタンパク質を標的とすることが好ましい。一態様において、本開示におけるスクリーニング方法によれば、タンパク質−タンパク質間の相互作用（ＰＰＩ）を阻害するペプチド化合物を得ることができる。特定の理論に拘束されることを意図しないが、特にＰＰＩの作用面においては、ホットスポットと呼ばれる部位が存在し、ＰＰＩの結合力を高めているとされることから、長側鎖がこの部位に入り込むことによりＰＰＩを阻害することができると考えられる。すなわち、本開示におけるライブラリやスクリーニング方法によれば、標的分子の種類によらず、ＰＰＩを阻害するペプチド化合物が得られると考えられる。
生体内における標的分子の存在場所も特に限定されない。一態様において、本開示におけるライブラリやスクリーニング方法によれば、膜透過性の高い環状ペプチド化合物、又は誘導体化により容易に膜透過性を高めることが可能な環状ペプチド化合物を得ることができるため、細胞内のタンパク質を標的とすることもできる。
非限定の一態様において、本開示におけるスクリーニング方法に用いられる標的分子は、担体に固定して使用される。担体としては、標的分子を固定することができれば特に限定されないが、ビーズ又は樹脂が例示される。標的分子は公知の方法により担体に固定することができる。
上述のとおり、本開示におけるライブラリ及びスクリーニング方法の標的分子は、特に限定されないが、GTPase KRas (KRAS)、Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1 (MEK1)、Mitogen-sctivated protein kinase 3 (ERK1)、インターロイキン６受容体 (IL-6R) が例示される。実施例に記載されるように、本開示におけるライブラリは、様々な標的分子に対し特異的に結合できるペプチド化合物を含むため、一態様において、これまで創薬が困難とされてきたtough targetへの創薬を可能にし得る。
非限定の一態様において、本開示における環状ペプチド化合物の製造方法は、以下の工程を含んでいてよい：
（ｉ）本開示における環状ペプチド化合物のライブラリに含まれる環状ペプチド化合物と標的分子を接触させる工程；
（ｉｉ）該標的分子に結合できる環状ペプチド化合物を選択する工程；及び
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で選択された環状ペプチド化合物のアミノ酸配列に基づき、環状ペプチド化合物を製造する工程。
非限定の一態様において、本開示におけるライブラリの製造方法、ペプチド化合物の製造方法、及び／又はスクリーニング方法はin vitroで行ってよい。
一局面において、本開示は、本明細書で規定する「長側鎖」を側鎖に有するアミノ酸を提供する。そのようなアミノ酸としては、例えば、表２−１〜表２−６に記載されたアミノ酸からなる群より選択されるアミノ酸が例示される。
一局面において、本開示は、以下の一般式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）で表される基を側鎖に有するアミノ酸を提供する。
Figure 2018225864
[式中、
Ｘ１は単結合、下記Ｂ群より独立して選択される置換基を少なくとも一つ有していてもよいＣ１−Ｃ２アルキレン基を表し、
Ｘ２は単結合、又は下記Ｂ群より独立して選択される置換基を少なくとも一つ有していてもよいＣ１−Ｃ２アルキレン基を表し、
Ｙ１は単結合、酸素原子、カルボニル基（−ＣＯ−）、又はスルホニル基（−ＳＯ２−）を表し、
Ｙ２は単結合、Ｃ１−Ｃ４アルキル基で置換されていてもよいＣ１−Ｃ２アルキレン基、カルボニル基（−ＣＯ−）、又はスルホニル基（−ＳＯ２−）を表し、
Ｚ１は酸素原子を表し、
Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ２−Ｃ４アルケニル基、又はＣ２−Ｃ４アルキニル基を表し、ここで該Ｃ１−Ｃ６アルキル基は、ハロゲン原子で置換されていてもよく、また、該Ｃ１−Ｃ６アルキル基中の隣接しない１若しくは２個のメチレン基が酸素原子で置換されていてもよく
Ｒ２及びＲ３、又はＲ２及びＸ１が結合して３〜６員環の環状構造を形成していてもよく、この場合に該環状構造は、Ｃ１−Ｃ４アルキル基又はハロゲン原子で置換されていてもよく、環内に酸素原子を有していてもよく、該環状構造は部分的に不飽和であってもよく、
Ｒ４はＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ２−Ｃ６アルケニル基、Ｃ２−Ｃ６アルキニル基、又はＣ１−Ｃ６アルカノイル基を表し、
Ｒ５は水素原子を表し、Ｒ４のＣ１−Ｃ６アルキル基中の隣接しない１若しくは２個のメチレン基が酸素原子で置換されていてもよく、
Figure 2018225864
は結合点を表す。
Ｂ群：ハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ４アルキル基、及びＣ１−Ｃ２アルコキシ基]
一態様において，本開示は，以下の一般式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）で表される基を側鎖に有するアミノ酸を提供する。
Figure 2018225864
[式中、
Ｘ１は下記Ｂ群より独立して選択される置換基を少なくとも一つ有していてもよいＣ１−Ｃ２アルキレン基を表し、
Ｘ２は下記Ｂ群より独立して選択される置換基を少なくとも一つ有していてもよいＣ１−Ｃ２アルキレン基を表し、
Ｙ１は酸素原子、カルボニル基（−ＣＯ−）、又はスルホニル基（−ＳＯ２−）を表し、
Ｙ２はカルボニル基（−ＣＯ−）、又はスルホニル基（−ＳＯ２−）を表し、
Ｚ１は酸素原子を表し、
Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基を表し、ここで該Ｃ１−Ｃ６アルキル基は、ハロゲン原子で置換されていてもよく、また、該Ｃ１−Ｃ６アルキル基中の隣接しない１若しくは２個のメチレン基が酸素原子で置換されていてもよく
Ｒ２及びＲ３、又はＲ２及びＸ１が結合して３〜６員環の環状構造を形成していてもよく、この場合に該環状構造は、Ｃ１−Ｃ４アルキル基又はハロゲン原子で置換されていてもよく、環内に酸素原子を有していてもよく、該環状構造は部分的に不飽和であってもよく、
Ｒ４はＣ１−Ｃ６アルキル基を表し、
Ｒ５は水素原子を表し、Ｒ４のＣ１−Ｃ６アルキル基中の隣接しない１若しくは２個のメチレン基が酸素原子で置換されていてもよく、
Figure 2018225864
は結合点を表す。
Ｂ群：ハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ４アルキル基、及びＣ１−Ｃ２アルコキシ基]
上記
Ｘ１は、前記Ｂ群より独立して選択される置換基を少なくとも一つ有していてもよいＣ１−Ｃ２アルキレン基が好ましく、
Ｘ２は、前記Ｂ群より独立して選択される置換基を少なくとも一つ有していてもよいＣ１−Ｃ２アルキレン基が好ましく、
Ｙ１は酸素原子が好ましく、
Ｙ２はカルボニル基（−ＣＯ−）が好ましく、
Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子、またはＣ１−Ｃ６アルキル基が好ましく、ここで該Ｃ１−Ｃ６アルキル基は、ハロゲン原子で置換されていてもよく、ここで該ハロゲン原子としてはフッ素が好ましく、
Ｒ４はＣ１−Ｃ６アルキル基が好ましく
前記Ｂ群におけるハロゲン原子としては、フッ素原子が好ましい。
非限定の一態様において、本開示におけるアミノ酸は、カルボキシ基にｐｄＣｐＡまたはｐＣｐＡがエステル結合で連結された、ｐｄＣｐＡアミノ酸、又はｐＣｐＡアミノ酸であってよい。ｐｄＣｐＡおよびｐＣｐＡの構造と、アミノ酸のカルボキシ基とのエステル結合を介した連結点を以下に示す：
Figure 2018225864
[式中、
Figure 2018225864
はアミノ酸のカルボキシ基とのエステル結合を介した連結点を表す]。
このようなアミノ酸は、例えば、実施例に記載の方法を使用して製造できる。
非限定の一態様において、本開示におけるアミノ酸、ｐｄＣｐＡアミノ酸、及び／又はｐＣｐＡアミノ酸の主鎖アミノ基は、保護基により保護されていてもよい。アミノ基の保護基としては、例えば、Fmoc基、Boc基、Cbz基などが使用できるが、これらに限定されない。アミノ基の保護方法としては、当業界で公知の手法を用いることができ、実施例に記載の方法を用いてもよい。
非限定の一態様において、本開示におけるアミノ酸は、ペプチド化合物の化学合成及び／又は翻訳合成に使用してよい。限定はされないが、例えば、ｐｄＣｐＡアミノ酸、及び／又はｐＣｐＡアミノ酸を用いてペプチド化合物を翻訳合成してよく、Fmoc基で保護されたアミノ酸を用いてペプチド化合物を化学合成してよい。ここでのペプチド化合物としては、環状ペプチド化合物が好ましいが、これに限定されない。
一局面において、本開示は、ペプチド化合物の合成に使用するための、「長側鎖」を側鎖に有するアミノ酸を提供する。別の局面において、本開示は、ペプチド化合物の翻訳に使用するための、「長側鎖」を側鎖に有するアミノ酸を提供する。ここでのペプチド化合物としては、環状ペプチド化合物が好ましいが、これに限定されない。
本開示におけるアミノ酸を用いたペプチド化合物の化学合成方法及び翻訳合成方法は、当業界で公知の手法または実施例に記載の方法に準じて行うことができる。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、下記の実施例に限定されるものではない。
実施例中では以下の略号を使用した。
ＡＡ 酢酸アンモニウム
Ａｃｂｚ ４−アジドベンジルオキシカルボニル基
Figure 2018225864
ＡｃＯＮＨ４ 酢酸アンモニウム
ＣＨ２ＣＮ シアノメチル基
ＤＢＵ １，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン
ＤＣＭ ジクロロメタン
ＤＣＥ １，２−ジクロロエタン
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＩＣ Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ Ｎ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミンあるいはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＭｅＣＮ アセトニトリル
ＭｅＯＨ メタノール
ＮＭＰ Ｎ−メチル−２−ピロリドン
ＦＡ ギ酸
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＦＥ ２，２，２−トリフルオロエタノール
ＨＦＩＰ １，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロイソプロピルアルコール
ＨＯＡｔ １−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール
ＨＯＢｔ １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＷＳＣＩ・ＨＣｌ １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
ＴＢＭＥ ｔ−ブチルメチルエーテル
ＴＩＰＳ トリイソプロピルシラン
ＨＡＴＵ Ｏ−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロリン酸塩
Ａｌｌｙｌ アリル基
ｄｂａ ジベンジリデンアセトン
ＤＥＡＤ アゾジカルボン酸ジエチル
ＤＩＡＤ アゾジカルボン酸ジイソプロピル
ＤＡＳＴ ジメチルアミノ三フッ化硫黄
ＤＭＡＰ ４−ジメチルアミノピリジン
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
Ｆｍｏｃ−Ｃｌ カルボノクロリド酸 （９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル
Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ 炭酸（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチルあるいはＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド、あるいは炭酸 Ｎ−スクシンイミジル ９−フルオレニルメチル
Ｆ−Ｐｎａｚ ４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジルオキシカルボニル基
Figure 2018225864
ＧＣ ガスクロマトグラフィー
ＭｅＡｂｕ （Ｓ）−２−（メチルアミノ）ブタン酸
Ｎｓ ノシル基
Figure 2018225864
ｐＣｐＡ リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル
Figure 2018225864
ｐＣｐＡ（ＴＨＦ） リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル
Figure 2018225864
ＰＰＴＳ ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム
ＴＢＡＦ テトラブチルアンモニウムフルオリド
Ｔｆ２Ｏ トリフルオロメタンスルホン酸無水物
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
ＴＭＳＣｌ クロロトリメチルシラン
Ｔ３Ｐ プロピルホスホン酸無水物
Ｔｒｔ トリチル基
ペプチド合成及び、固相合成に用いる反応溶媒はペプチド合成用（渡辺化学、和光純薬から購入）を用いた。例えばＤＣＭ、ＤＭＦ、ＮＭＰ、２％ ＤＢＵ ｉｎ ＤＭＦ、２０％ ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ ｉｎ ＤＭＦなどである。また、水を溶媒として加えない反応では、脱水溶媒、超脱水溶媒、無水溶媒（関東化学、和光純薬などから購入）を用いた。
ＬＣ／ＭＳの分析条件は、下記のとおりである。
Figure 2018225864
Figure 2018225864
Figure 2018225864
Figure 2018225864
Figure 2018225864
Figure 2018225864
Figure 2018225864
実施例１ ペプチド化合物の化学合成
ＷＯ２０１３／１００１３２に記載のＦｍｏｃ法によるペプチド合成法に従い、下記の基本ルートでペプチドの伸長を行った。すなわち、１）Ａｓｐ側鎖のカルボン酸を２−クロロトリチルレジンに担持させたものの、ＡｓｐのＮ末からのＦｍｏｃ法によるペプチド伸長反応、２）２−クロロトリチルレジンからのペプチドの切り出し過程、３）切り出し過程によって２−クロロトリチルレジンから外れて生じたＡｓｐ側鎖のカルボン酸と、ペプチド鎖Ｎ末端（三角ユニット）のアミノ基との縮合によるアミド環化、４）ペプチド鎖に含む側鎖官能基の保護基の脱保護、５）ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅＨＰＬＣによる化合物の精製、の５段階の工程である。本実施例において、特に記述がない限り、この基本ルートをもとにペプチド化合物の合成をおこなった。
Figure 2018225864
１−１．ペプチド合成機によるペプチド合成に用いるＦｍｏｃ−アミノ酸
本明細書内に記載するペプチド合成において、ペプチド合成機による合成には、以下のＦｍｏｃ−アミノ酸を用いた。なおアミノ酸の略語は表４−１〜表４−３２に記載した。
Ｆｍｏｃ−ＭｅＬｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＭｅＴｒｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＭｅＰｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＭｅＩｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＭｅＧｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ｇ−ＭｅＡｂｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＭｅＶａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（Ｃｌｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＣＦ３）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−ＭｅＡｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｉｃ（２）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＥｔＧｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｂｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＨ、ＦｍｏｃＡｌａ（４−Ｐｙｒ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（３−Ｃｌ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｇ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ（Ｏ２）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｎ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｐｈ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ｛＃（ＣＨ２）２｝−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ｂ−ＭｅＡｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（Ｔｈｚ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ などは渡辺化学もしくはＣｈｅｍｐｅｐ社もしくはＣｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ社もしくはＢａｃｈｅｍ社から購入した。またＦｍｏｃ−ｎＰｒＧｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＭｅＰｈｅ（３−Ｃｌ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｌａ（４−Ｔｈｚ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ＤＭＴ）−ＯＨなどはＷＯ２０１３／１００１３２に記載の方法にて合成した。また、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ０１）、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（３−Ｆ，ｔＢｕ）−ＯＨ（化合物ａａ０２）、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（３−Ｆ，Ｐｉｓ）−ＯＨ（化合物ａａ０３）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＰｈｅ（４−Ｃｌ）−ＯＨ（化合物ａａ０４）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（化合物ａａ０５）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ０６）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ（化合物ａａ１０）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｐｈ−ＯＨ（化合物ａａ１１）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）−ＯＨ（化合物ａａ１２）などは以下のとおり合成した。
Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｂｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｂｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−ＭｅＬｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＭｅＮｖａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−（ＰｈＥｔ）ＮＧｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｓｅ（Ｅｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＣＨＦ２）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＯＣＨＦ２）−ＯＨはＡｍａｔｅｋ社、渡辺化学工業、ＣｈｅｍＢｉｏＢａｎｋ社などから購入した。
また、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｎＰｒ）−ＯＨ（化合物ａａ５１）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ｎＰｒ）−ＯＨ（化合物ａａ５２）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）−ＯＨ（化合物ａａ５４）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ｉＰｅｎ）−ＯＨ（化合物ａａ５５）、Ｆｍｏｃ−Ｈｎｌ（７−Ｆ２）−ＯＨ（化合物ａａ５８）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｎｌ（７−Ｆ２）−ＯＨ（化合物ａａ５９）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ＯＨ（化合物ａａ６０）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ＯＨ（化合物ａａ６５）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ（化合物ａａ６７）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ＯＨ（化合物ａａ７２）、Ｆｍｏｃ−Ｈｐｈ（２−Ｃｌ）−ＯＨ（化合物ａａ７３）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｐｈ（２−Ｃｌ）−ＯＨ（化合物ａａ７５）、Ｆｍｏｃ−Ｈｐｈ（３−Ｃｌ）−ＯＨ（化合物ａａ７６）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｐｈ（３−Ｃｌ）−ＯＨ（化合物ａａ７８）、Ｆｍｏｃ−Ｈｐｈ（４−Ｃｌ）−ＯＨ（化合物ａａ７９）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｐｈ（４−Ｃｌ）−ＯＨ（化合物ａａ８１）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＰｈｅ｛＃（ＣＨ２）２｝−ＯＨ（化合物ａａ８２）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｂｎ）−ＯＨ（化合物ａａ８３）、Ｆｍｏｃ−Ｈｙｐ（Ｅｔ）−ＯＨ（化合物ａａ８４）、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ−４−ＮＭｅ２）−ＯＨ（化合物ａａ８８）、Ｆｍｏｃ−ｎＰｅｎＧｌｙ−ＯＨ（化合物ａａ８９）、Ｆｍｏｃ−ｎＨｅｘＧｌｙ（化合物ａａ９０）、Ｆｍｏｃ−（ＥｔＯＥｔ）ＮＧｌｙ−ＯＨ（化合物ａａ９１）、Ｆｍｏｃ−（ＰｈＯＥｔ）ＮＧｌｙ−ＯＨ（化合物ａａ９２）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｍｅ２）−ＯＨ（化合物ａａ９４）など、Ｆｍｏｃ−ＭｅＧｌｎ（Ｍｅ２）−ＯＨ（化合物ａａ９６）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｍｅ）−ＯＨ（化合物ａａ９８）など、Ｆｍｏｃ−ＭｅＧｌｎ（Ｍｅ）−ＯＨ（化合物ａａ１０１）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ（化合物ａａ１０４）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ（化合物ａａ１０５）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｓｅ（Ｅｔ）−ＯＨ（化合物ａａ１０６）、Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ（６−ＯＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ１０７）、Ｆｍｏｃ−Ａｂｕ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ（化合物ａａ１０９）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ（化合物ａａ１１０）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ−３−Ｆ２）−ＯＨ（化合物ａａ１１６）、Ｆｍｏｃ−Ａｂｕ（Ｍｏｒ）−ＯＨ（化合物ａａ１２３）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｂｕ（Ｍｏｒ）−ＯＨ（化合物ａａ１２５）、Ｆｍｏｃ−（２−（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−Ｅｔ）Ｇｌｙ−ＯＨ（化合物ａａ１２６）、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ（化合物ａａ１３０）、Ｆｍｏｃ−ｃｉｓＰｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ（化合物ａａ１３３）、Ｆｍｏｃ−Ａｈｐ（２）（３−Ｒ−ＯＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ１３７）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ１４２）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ１４７）、 Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ１５４）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ１５９）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ１６６）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ１７１）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＨ（化合物ａａ１７３）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ１７４）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ｔＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ１７５）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ＯＨ（化合物ａａ１８１）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ１８２）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ＯＨ（化合物ａａ１８４）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｌａ（３−Ｐｙｒ−４−ＮＭｅ２）−ＯＨ（化合物ａａ１８６）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＰｈｅ（４−ＣＦ３）−ＯＨ（化合物ａａ１８７）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＰｈｅ（４−ＣＨＦ２）−ＯＨ（化合物ａａ１８８）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＰｈｅ（４−ＯＣＨＦ２）−ＯＨ（化合物ａａ１８９）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−４−Ｃｌ）−ＯＨ（化合物ａａ１９０）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｅｔ−２−Ｍｏｒ）−ＯＨ（化合物ａａ１９１）、Ｆｍｏｃ−ｎＢｕＧｌｙ−ＯＨ（化合物ａａ１９２）、Ｆｍｏｃ−ｉＰｅｎＧｌｙ−ＯＨ（化合物ａａ１９３）、Ｆｍｏｃ−Ａｂｕ（５−Ｏｘｏ−Ｏｄｚ）−ＯＨ（化合物ａａ１９４）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｂｕ（５−Ｏｘｏ−Ｏｄｚ）−ＯＨ（化合物ａａ１９６）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＨ（化合物ａａ１９７）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｅｔ−２−ＮＭｅ２）−ＯＨ（化合物ａａ１９８）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｍｓ）−ＯＨ（化合物ａａ１９９）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＨ（化合物ａａ２０１）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＨ（化合物ａａ２０２）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ２０３）、Ｆｍｏｃ−Ｈｎｌ（７−Ｆ３−６−ＯＨ）−ＯＨ（化合物ａａ２０８）は以下のとおり合成した。
Figure 2018225864
Figure 2018225864
Figure 2018225864
Figure 2018225864
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１−２．ペプチド合成機によるペプチド合成に用いるアミノ酸合成
（２Ｓ，３Ｒ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブタン酸（化合物ａａ０１、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（２Ｓ，３Ｒ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−ヒドロキシブタン酸一水和物（Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ−ＯＨの一水和物、東京化成より購入、５．０ｇ、１３．９ｍｍｏｌ）とｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ、０．１７５ｇ、０．７０ｍｍｏｌ）の混合物にトルエン（５０ｍＬ）を加えて、減圧下トルエンを留去することで共沸により含まれている水分を除去した。得られた残渣に超脱水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、２８ｍＬ）と３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（８．８ｍＬ、９７ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、５０度にて４時間攪拌した。ＬＣＭＳ（ＳＱＤＦＡ０５）にて原料の消失を確認後、混合物を２５度まで冷却し、酢酸エチル（３０ｍＬ）を加えた。続いて飽和塩化ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）を加えて有機層を洗浄し、水層を酢酸エチル（３０ｍＬ）で抽出した。得られた全ての有機層を混合し、これをさらに飽和塩化ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）にて２度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムにて乾燥し、溶媒を減圧下留去し、粗生成物（９．３ｇ）を得た。
得られた粗生成物のうち、４．６５ｇをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、３０ｍＬ）に溶解させ、次いでｐＨ８．０に調製した１．０Ｍリン酸緩衝液（３０ｍＬ）を加えた。この混合物を５０度で４時間攪拌した。２５度まで冷却した後、酢酸エチル（３０ｍＬ）を加え、有機層と水層を分離した。水層に酢酸エチル（３０ｍＬ）を加えて抽出を行った後、得られた全ての有機層を混合し、飽和塩化ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）で２度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプにて減圧下、２５度で３０分乾燥させた。
得られた残渣をジエチルエーテル（５０ｍＬ）に溶解させ、次いでヘプタン（５０ｍＬ）を加えた。制御した減圧下（〜１００ｈＰａ）、ジエチルエーテルのみを留去し、得られた混合物をろ過して固体を得た。このヘプタンでの洗浄操作を２度繰り返した。得られた固体をポンプにて減圧下、２５度で２時間乾燥させ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ＴＨＰ）−ＯＨのナトリウム塩（２．８０ｇ、６．２６ｍｍｏｌ）を得た。
得られた全量のＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ＴＨＰ）−ＯＨのナトリウム塩に酢酸エチル（５０ｍＬ）とｐＨ２．１の０．０５Ｍリン酸水溶液（１４０ｍＬ）を加えて、２５度にて５分間攪拌した後、有機層と水層を分離した。水層に酢酸エチル（５０ｍＬ）を加えて抽出した後、得られた全ての有機層を混合し、飽和塩化ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）にて２度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムにて乾燥させ、減圧下溶媒を留去した。残渣をポンプにて減圧下、２５度で２時間乾燥させた後、得られた固体をｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ、５０ｍＬ）に溶解させ、溶媒を減圧下留去した。さらにポンプにて減圧下、２５度で１時間乾燥させることで、（２Ｓ，３Ｒ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブタン酸（化合物ａａ０１、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ＴＨＰ）−ＯＨ、２．７０ｇ、３０ｍｏｌ％のｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）が残留）をＴＨＰ保護上の不斉炭素に由来するジアステレオマーとして得た。得られたＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ＴＨＰ）−ＯＨは−２５度の冷凍庫にて保存した。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４２４．２（Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．８４分、０．８５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−フルオロ−４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸（Ｓ）−メチル（化合物ａａ０７、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（３−Ｆ）−ＯＭｅ）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−２−アミノ−３−（３−フルオロ−４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸（Ｈ２Ｎ−Ｔｙｒ（３−Ｆ）−ＯＨ、Ａｓｔａｔｅｃｈ社より購入、２．０ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）を１０％炭酸ナトリウム水溶液に溶かした後、滴下ロートで、炭酸（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ、３．３９ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）の１．４−ジオキサン（３５ｍＬ）の溶液を０度で添加した。反応液を２５度で４０分攪拌した後、水（３５ｍＬ）、ジエチルエーテル（７０ｍＬ）を加え、ジエチルエーテルで３回洗浄した。５Ｎ塩酸水溶液で水層のｐＨを２〜３に調整した後、酢酸エチルで３回抽出（１００ｍＬ×３）した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させた。更なる精製はせずに得られた残渣（４．０８ｇ）をそのまま次の反応に用いた。
上記の残渣（１．０４ｇ）をメタノール（１０ｍＬ）に溶かし、チオニルクロライド（ＳＯＣｌ２、５３９μＬ、７．３８ｍｍｏｌ）を滴下しながら０度で加えた。反応液を６０度で１時間攪拌した後、室温に冷却し、エバポレーターを用いて溶媒を留去した。得られた残渣に酢酸エチル、水を加え、酢酸エチルで２回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させた。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ｐｕｒｉｆ ｐａｃｋ（登録商標）ＳＩＺＥ２００、ヘキサン／酢酸エチル）で精製し、２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−フルオロ−４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸（Ｓ）−メチル（化合物ａａ０７、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（３−Ｆ）−ＯＭｅ、９００ｍｇ、２．０７ｍｍｏｌ）を２段階収率８４％で得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４３６．４（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−３−フルオロフェニル）プロパン酸（化合物ａａ０２、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（３−Ｆ，ｔＢｕ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−フルオロ−４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸（Ｓ）−メチル（化合物ａａ０７、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（３−Ｆ）−ＯＭｅ、３００ｍｇ、０．６８９ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（６９０μＬ）に２，２，２−トリクロロアセトイミド酸ｔｅｒｔ−ブチル（３０８μＬ、１．７２ｍｍｏｌ）と触媒量のボロントリフルオリド−−エチルエーテルコンプレックス（ＢＦ３−ＯＥｔ２、１３．１μＬ、０．１０３ｍｍｏｌ）を０度にて滴下しながら加えた。反応液を２５度で１時間攪拌した後、同量の２，２，２−トリクロロアセトイミド酸ｔｅｒｔ−ブチル（３０８μＬ、１．７２ｍｍｏｌ）とボロントリフルオリド−−エチルエーテルコンプレックス（ＢＦ３−ＯＥｔ２、１３．１μＬ、０．１０３ｍｍｏｌ）を再び加え、反応液を２５度でさらに１時間攪拌した。反応液をジクロロメタン（ＤＣＭ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた。ジクロロメタンで抽出後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で有機層を洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させた。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ｐｕｒｉｆ ｐａｃｋ（登録商標）ＳＩＺＥ６０、ヘキサン／酢酸エチル）にて精製し、混合物として２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−３−フルオロフェニル）プロパン酸（Ｓ）−メチル（Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（３−Ｆ，ｔＢｕ）−ＯＭｅ）を得た。
上述の得られた混合物（４０ｍｇ）をジクロロエタン（ＤＣＥ）（８１０μＬ）に溶解させ、水酸化トリメチルスズ（ＩＶ）（Ｍｅ３ＳｎＯＨ、２９．４ｍｇ、０．１６３ｍｍｏｌ）を加え、６０度で１時間攪拌した。反応液にギ酸（１５．３５μＬ、０．４０７ｍｍｏｌ）を加えた後、逆相クロマトグラフィー（Ｗａｋｏｓｉｌ ２５Ｃ１８ １０ｇ、０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）により精製することで（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−３−フルオロフェニル）プロパン酸（化合物ａａ０２、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（３−Ｆ，ｔＢｕ）−ＯＨ、２７ｍｇ、５６．５μｍｏｌ）を２段階収率９３％で得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４７８．３（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−フルオロ−４−（（２−フェニルプロパン−２−イル）オキシ）フェニル）プロパン酸（Ｓ）−メチル（化合物ａａ０８、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（３−Ｆ，Ｐｉｓ）−ＯＭｅ）の合成
Figure 2018225864
２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−フルオロ−４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸（Ｓ）−メチル（化合物ａａ０７、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（３−Ｆ）−ＯＭｅ、２００ｍｇ、０．４５９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４６０μＬ）に溶かした後、別途調整した２，２，２−トリクロロアセトイミド酸２−フェニルプロパン−２−イル（化合物ａａ０９、３２２ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ）と触媒量のボロントリフルオリド−−エチルエーテルコンプレックス（ＢＦ３−ＯＥｔ２、８．７３μＬ、０．０６９ｍｍｏｌ）を０度にて滴下しながら加えた。反応液を室温にて３０分攪拌後、同量の２，２，２−トリクロロアセトイミド酸２−フェニルプロパン−２−イル（３２２ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ）と触媒量のボロントリフルオリド−−エチルエーテルコンプレックス（ＢＦ３−ＯＥｔ２、８．７３μＬ、０．０６９ｍｍｏｌ）を０度にて滴下しながら加えた。反応液を室温にて３０分さらに攪拌した後、反応液をジクロロメタンで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を氷冷下加えた。ジクロロメタンで抽出後、飽和食塩水で有機層を洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させた。得られた残渣をジクロロメタン／ヘキサン＝１／１（２０ｍＬ、１０ｍＬ）で２回洗浄し、白色固体をろ過により除いた。得られたろ液を濃縮し、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ｐｕｒｉｆ ｐａｃｋＳＩＺＥ２０、ヘキサン／酢酸エチル、０．１％ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ））にて精製し、２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−フルオロ−４−（（２−フェニルプロパン−２−イル）オキシ）フェニル）プロパン酸（Ｓ）−メチル（化合物ａａ０８、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（３−Ｆ，Ｐｉｓ）−ＯＭｅ、２１０ｍｇ、０．３７９ｍｍｏｌ）を８３％の収率で得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝５５４．４（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．０９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
２，２，２−トリクロロアセトイミド酸２−フェニルプロパン−２−イル（化合物ａａ０９）の調製
Figure 2018225864
２−フェニルプロパン−２−オール（Ｗａｋｏ社より購入、２．０ｇ、１４．７ｍｍｏｌ）のジエチルエーテル（Ｅｔ２Ｏ）溶液（４．８ｍＬ）に１．９ＭＮａＨＭＤＳのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（８５０μＬ、１．６２ｍｍｏｌ）を滴下により２２度で加えた。反応液を同じ温度で２０分攪拌した後、０度に冷却し、２，２，２−トリクロロアセトニトリル（１．４７ｍＬ、１４．７ｍｍｏｌ）を滴下しながら加えた。反応液を０度で１０分攪拌した後、１５度に昇温し、さらに１時間攪拌した。反応液をエバポレーターにより濃縮し、得られた残渣にヘキサン（１．８ｍＬ）とメタノール（６５μＬ）を加え１５度で１５分攪拌した。得られた固体をろ過し、ヘキサン（２．０ｍＬ）で３回洗浄し、２，２，２−トリクロロアセトイミド酸２−フェニルプロパン−２−イル（化合物ａａ０９）を４．１９ｇ得た。更なる精製はせずにこのまま反応に用いた。
１Ｈ ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ４００−ＭＲ、４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１．８９（６Ｈ、ｓ）、７．２８（１Ｈ、ｍ）、７．３６（２Ｈ、ｍ）、７．４３（２Ｈ、ｍ）、８．２０（１Ｈ、ｂｒｓ）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−フルオロ−４−（（２−フェニルプロパン−２−イル）オキシ）フェニル）プロパン酸（化合物ａａ０３、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（３−Ｆ，Ｐｉｓ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−フルオロ−４−（（２−フェニルプロパン−２−イル）オキシ）フェニル）プロパン酸（Ｓ）−メチル（化合物ａａ０８、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（３−Ｆ，Ｐｉｓ）−ＯＭｅ、２１０ｍｇ、０．３７９ｍｍｏｌ）をジクロロエタン（ＤＣＥ）（１．２６ｍＬ）に溶解させ、水酸化トリメチルスズ（ＩＶ）（Ｍｅ３ＳｎＯＨ、１３７ｍｇ、０．３７９ｍｍｏｌ）を加え、６０度で３時間攪拌した。反応液をエバポレーターにより濃縮し、ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ、２．０ｍＬ）と０．０５Ｍリン酸水溶液（ｐＨ２．１、４．０ｍＬ）を加え、２５度で１５分攪拌した。有機層を分離した後、水層をｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ、１ｍＬ）で２回抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させた。得られた残渣を０．１％ギ酸アセトニトリル溶液で溶かし、１５分攪拌した後、得られた溶液を逆相クロマトグラフィー（Ｗａｋｏｓｉｌ ２５Ｃ１８ ３０ｇ、０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル）により精製することで（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−フルオロ−４−（（２−フェニルプロパン−２−イル）オキシ）フェニル）プロパン酸（化合物ａａ０３、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（３−Ｆ，Ｐｉｓ）−ＯＨ、１９０ｍｇ、０．３５２ｍｍｏｌ）を収率９３％で得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝５３８．２（Ｍ−Ｈ）−
保持時間：１．００分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（４−クロロフェニル）プロパン酸（化合物ａａ０４、Ｆｍｏｃ−ＭｅＰｈｅ（４−Ｃｌ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−クロロフェニル）プロパン酸（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−Ｃｌ）−ＯＨ、１７０ｇ、４０２．９６ｍｍｏｌ）のトルエン（２．５Ｌ）溶液にパラホルムアルデヒド（４８ｇ、１．６０ｍｏｌ）と１０−カンファスルホン酸（ＣＳＡ、４．６ｇ、１９．８３ｍｍｏｌ）を加え、１１０度にて１６時間攪拌した。続いて反応溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１．０Ｌ）にて２回、飽和塩化ナトリウム水溶液（１．０Ｌ）にて２回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムにて乾燥させ、固体をろ過にて取り除き、減圧下、溶媒を留去して１６０ｇの４−（４−クロロベンジル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（Ｓ）−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチルを得た。
同様の操作にて調製した別ロットと混合した４−（４−クロロベンジル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（Ｓ）−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（２３０ｇ、５３０．１０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２．５Ｌ）溶液にトリエチルシラン（８８１ｇ、７．５８ｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、２５１８ｇ、２２．２８ｍｏｌ）を混合し、３０度にて１２時間攪拌した。続いて減圧下、溶媒を留去し、得られた残渣をジクロロメタン／ヘキサン（１／１０、ｖ／ｖ）にて再結晶することにより、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（４−クロロフェニル）プロパン酸（化合物ａａ０４、Ｆｍｏｃ−ＭｅＰｈｅ（４−Ｃｌ）−ＯＨ、２０５ｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４３６．３（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（１−トリチル−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロパン酸（化合物ａａ０５、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
３Ｌのフラスコに、（Ｓ）−３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−２−（メチルアミノ）プロパン酸塩酸塩（７５ｇ、３６４．７１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１．０Ｌ）溶液とジクロロジメチルシラン（５１ｇ、３９５．１６ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（４０ｇ、３９５．３０ｍｍｏｌ）を加えた。続いて、（クロロメタントリイル）トリベンゼン（Ｔｒｔ−Ｃｌ、１１１ｇ、３９８．１７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５００ｍＬ）溶液とトリエチルアミン（４０ｇ、３９５．３０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応溶液を加熱還流下、４時間攪拌し、さらに２０度にて２時間攪拌した。反応溶液にメタノールを加えて反応を停止し、続いて減圧下、溶媒を留去した。トリエチルアミンでｐＨを８〜８．５とし、１２５ｇの固体を得た。
得られた固体に１，４−ジオキサン（１．０Ｌ）、炭酸カリウム（８４ｇ、６０３．３９ｍｍｏｌ）、水（１．０Ｌ）を加えた。さらに炭酸（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ、１０２ｇ、３０２．３８ｍｍｏｌ）を加えて、０度にて２時間攪拌した。得られた反応溶液をジエチルエーテル（２．０Ｌ）にて洗浄した後、酢酸を用いて溶液のｐＨを６〜７に調整した。得られた固体をろ過することで、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（１−トリチル−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロパン酸（化合物ａａ０５、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、１５５ｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝６３４．４（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．０７分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）
(2S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-((テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)プロパン酸（化合物ａａ０６、Fmoc-MeSer(THP)-OH）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−ヒドロキシプロパン酸（Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ−ＯＨ）はＷＯ２０１３／１００１３２に記載の方法にて合成した。（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−ヒドロキシプロパン酸（Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ−ＯＨ、１５ｇ、４３．９ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（８８ｍＬ）溶液に、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ、０．５５２ｇ、２．１９７ｍｍｏｌ）と３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（２３．８５ｍＬ）を加え、５０度にて４時間攪拌した。混合物を２５度まで冷却し、酢酸エチル（９０ｍＬ）を加えた。続いて飽和塩化ナトリウム水溶液（９０ｍＬ）にて有機層を洗浄し、水層を酢酸エチル（９０ｍＬ）で抽出した。得られた全ての有機層を混合し、これをさらに飽和塩化ナトリウム水溶液（９０ｍＬ）にて２度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムにて乾燥し、溶媒を減圧下留去した。
得られた残渣のうち、１５．０ｇをテトラヒドロフラン（１７５ｍＬ）に溶解させ、次いでｐＨ８．０に調製した１．０Ｍリン酸緩衝液（１７５ｍＬ）を加えた。この混合物を５０度で３時間攪拌した。２５度まで冷却した後、酢酸エチル（１７５ｍＬ）を加え、有機層と水層を分離した。水層に酢酸エチル（１７５ｍＬ）を加えて抽出を行った後、得られた全ての有機層を混合し、飽和塩化ナトリウム水溶液（１７５ｍＬ）で２度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去した。
得られた残渣をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解させ、次いでヘプタン（２５０ｍＬ）を加えた。制御した減圧下（〜１００ｈＰａ）、ジクロロメタンのみを留去し、得られた混合物をろ過して固体を得た。このヘプタンでの洗浄操作を２度繰り返した。得られた固体をポンプにて減圧下、２５度で２時間乾燥させた。
得られた残渣にｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ、２５０ｍＬ）とｐＨ２．１の０．０５Ｍリン酸水溶液（７００ｍＬ）を加えて、２５度にて５分間攪拌した後、有機層と水層を分離した。水層にｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ、２５０ｍＬ）を加えて抽出した後、得られた全ての有機層を混合し、飽和塩化ナトリウム水溶液（２５０ｍＬ）にて２度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムにて乾燥させ、減圧下溶媒を留去した。残渣をポンプにて減圧下、２５度で２時間乾燥させることで、（２Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロパン酸（化合物ａａ０６、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ＴＨＰ）−ＯＨ、９．０ｇ、３０ｍｏｌ％のｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）が残留）を得た。得られたＦｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ＴＨＰ）−ＯＨは−２５度の冷凍庫にて保存した。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４２６．４（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ）の合成
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ）は下記のルートにて合成した。
Figure 2018225864
（５−フルオロピリジン−３−イル）メタノール（化合物ａａ１４）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、市販の５−フルオロニコチン酸（化合物ａａ１３）（１４．１ｇ、１００ｍｍｏｌ）にＴＨＦ（２００ｍＬ）を加え、メカニカルスターラーを用い撹拌した。次いで、トリエチルアミン（１９．５１ｍＬ、１４０ｍｍｏｌ）を室温にて加え、固体が完全に溶解するまで撹拌した後、反応液を氷浴を用いて冷却した。その後、エチルクロロフォメート（１１．５ｍＬ、１２０ｍｍｏｌ）を滴下しながら加え、氷浴下３０分撹拌した。その後、ドライアイスバスを用い、反応液が−６０℃以下になるように冷却し、ＬｉＡｌＨ４（水素化アルミニウムリチウム）のＴＨＦ溶液（２．５Ｍ、４０ｍＬ、１００ｍｍｏｌ）を反応液が−２０℃を超えないように、５分以上かけて滴下した。反応液を−７８℃で３時間撹拌した後、酢酸エチル（６９ｍＬ）反応液が−２０℃を超えないように加えた。その後、氷浴を用いてさらに１時間撹拌し、水（１８ｍＬ）を加え１５分室温で撹拌した。反応液をＮＨシリカゲルを用いてろ過、減圧濃縮することで（５−フルオロピリジン−３−イル）メタノール（化合物ａａ１４）（９．２８ｇ、７３％）を黄色の油状成分として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝１２８（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．２８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
３−（ブロモメチル）−５−フルオロピリジン臭化水素酸塩（化合物ａａ１５）の合成
Figure 2018225864
丸底フラスコにアセトン／ドライアイスで冷却したコンデンサーを接続し、窒素雰囲気下、（５−フルオロピリジン−３−イル）メタノール（化合物ａａ１４）（８．２１ｇ、６４．６ｍｍｏｌ）、２５％ＨＢｒ酢酸溶液（９６ｍＬ、３８８ｍｍｏｌ）を加えた。なお、反応は開放系で行い、生じたＨＢｒをトラップするために１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いている。反応液を室温から１００℃まで徐々に撹拌しながら昇温し、さらに３時間撹拌した。その後反応液を室温まで冷却し、ジイソプロピルエーテル（４８ｍＬ）をゆっくりと加えることを３回繰り返し、得られた固体をろ過することで３−（ブロモメチル）−５−フルオロピリジン臭化水素酸塩（化合物ａａ１５）（１２．４３ｇ、７１％）を灰色の固体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ４００−ＭＲ、４００ＭＨｚ、ｄ−ＤＭＳＯ）δ４．７７（２Ｈ、ｓ）、７．８５−７．８８（１Ｈ、ｍ）、８．５５−８．５６（２Ｈ、ｍ）
Ｏ−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−Ｎ−トリチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１７、Ｔｒｔ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、ｔ−ペントキサイドナトリウム（ＮａＯｔＰｅｎ）（１３．７ｇ、１２５ｍｍｏｌ）にＴＨＦ（４５．８ｍＬ）を加え撹拌したのち、市販のトリチルセリンのトリエチルアミン塩（Ｔｒｔ−Ｓｅｒ−ＯＨトリエチルアミン塩）（１１．２４ｇ、２５ｍｍｏｌ）を３回に分けて加え、３０分室温にて撹拌した。反応液を反応液を氷浴を用いて１５分撹拌し、冷却した後、３−（ブロモメチル）−５−フルオロピリジン臭化水素酸塩（化合物ａａ１５、８．１３ｇ、３０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１６ｍＬ）を滴下しながら加え、さらにＤＭＦ（１４ｍＬ）を加えた。反応液を氷浴下４５分撹拌した後、３−（ブロモメチル）−５−フルオロピリジン臭化水素酸塩（化合物ａａ１５、２．０３ｇ、７．５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（４．０ｍＬ）を滴下しながら加え、さらにＤＭＦ（４．０ｍＬ）を加えた。その後、反応液を室温にてさらに１時間撹拌し、水（１２５ｍＬ）を加えた。得られた混合液をｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）で洗浄し、有機層を水で抽出した。得られた水層をまとめて、飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液（１５ｍＬ）を用いてｐＨ＝７に調整した後、酢酸エチルを用いて２回抽出した。得られた有機層をまとめて、飽和食塩水を２倍に希釈した溶液を用いて３回洗浄し、その後、飽和食塩水で２回洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過、減圧濃縮し、Ｏ−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−Ｎ−トリチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１７、Ｔｒｔ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ）（１１．０７ｇ、９７％）を黄色のアモルファスとして得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４５５（Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．８６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｏ−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１８、Ｈ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ））の合成
Figure 2018225864
Ｏ−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−Ｎ−トリチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１７、Ｔｒｔ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ）（１０．７６ｇ、２３．５７ｍｍｏｌ）の１．４−ジオキサン溶液（２１．５ｍＬ）に５〜１０％の塩酸／メタノール溶液（６４．２ｍＬ）を室温にて加えた。１０分から２０分室温にて反応液を撹拌した後、１．４−ジオキサン（１３５ｍＬ）を加えた。さらに追加で１．４−ジオキサン（９０ｍＬ）を加えた後、下記に示す通り、事前に少量調製した種晶（５ｍｇ）を加え室温で３０分さらに撹拌した。得られた固体をろ過し、ジイソプロピルエーテル（５０ｍＬ）で４回洗浄し、減圧下乾燥することで、Ｏ−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１８、Ｈ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ））（６．５８ｇ、９５％）を塩酸塩として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝２１３（Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．２４分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）
Ｏ−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１８、Ｈ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ））の種晶の調整
Ｏ−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−Ｎ−トリチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１７、Ｔｒｔ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ）（９８ｍｇ、２．６９ｍｍｏｌ）の１．４−ジオキサン溶液（８１９μＬ）に５〜１０％の塩酸／メタノール溶液（２．４５ｍＬ）を室温にて加え、５時間撹拌した。反応液に１．４−ジオキサン（６．０ｍＬ）を加え、得られた固体をろ過し、ジイソプロピルエーテルで洗浄、減圧下乾燥することでＯ−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１８、Ｈ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ））（２２２．５ｍｇ、８６％）を塩酸塩として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝２１３（Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．２４分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
Ｏ−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１８、Ｈ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ））の塩酸塩（６．３７ｇ、２２．１９ｍｍｏｌ）に水（４２ｍＬ）、１．４−ジオキサン（１１５ｍＬ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１３．５３ｍＬ、７８ｍｍｏｌ）を室温にて加え、撹拌した。その後、反応液に炭酸Ｎ−スクシンイミジル９−フルオレニルメチル（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（７．８６ｇ、２３．３ｍｍｏｌ）を室温にて加え、室温で撹拌した。原料の消失をＬＣ−ＭＳで確認した後、反応液に水（５６．２ｍＬ）を室温にて加え、２５％ｔ−ブチルメチルエーテル（ＭＴＢＥ）／ヘキサン溶液で２回洗浄した。得られた水層を飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液（ＮａＨ２ＰＯ４）を用いてｐＨ＝６．１になるように調整した。その後、酢酸エチルで２回抽出し、得られた有機層をまとめて、飽和食塩水を２倍に希釈した溶液、飽和食塩水で洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過、減圧濃縮し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ）（９．４７ｇ、９８％）を黄色の固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４３７（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８６分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−フェニルブタン酸（化合物ａａ１１、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｐｈ−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、市販の（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−フェニルブタン酸（１００ｇ、２４４．１１ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（１．５Ｌ）にトシル酸（ＴｓＯＨ）（２．５７５ｇ、１４．９５ｍｍｏｌ）、パラホルムアルデヒト（１５．９６ｇ、４８８．７７ｍｍｏｌ）を室温にて加え、１１０℃で１６時間撹拌した。有機層に水を加え、水で３回洗浄した後、得られた有機層と得られた水層を酢酸エチルで抽出した有機層をあわせて無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過、減圧濃縮し、１００ｇの（Ｓ）−５−オキソ−４−フェネチルオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチルを粗生成物として得た。
上記のように得られた（Ｓ）−５−オキソ−４−フェネチルオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）（５０ｇ、１１８．５１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（７００ｍＬ）にトリエチルシラン（Ｅｔ３ＳｉＨ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（７００ｍＬ）を加え、２５℃で１６時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた残渣に炭酸カリウム水溶液を加え、石油エーテルで洗浄した。得られた水層を濃塩酸を用いてｐＨ＝３になるように調整し、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過、減圧濃縮し、得られた残渣にメタノール、ヘキサンを加え再び減圧濃縮し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−フェニルブタン酸（化合物ａａ１１、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｐｈ−ＯＨ）（２９．５ｇ、５８％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４１６（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−クロロフェノキシ）プロパン酸（化合物ａａ１２、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）−ＯＨ）の合成
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−クロロフェノキシ）プロパン酸（化合物ａａ１２、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）−ＯＨ）は下記のルートにて合成した。
Figure 2018225864
３−（３−クロロフェノキシ）−２−（トリチルアミノ）プロパン酸（Ｓ）−メチル（Ｔｒｔ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）−ＯＭｅ）（化合物ａａ２０）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、市販の３−ヒドロキシ−２−（トリチルアミノ）プロパン酸（Ｓ）−メチル（化合物ａａ１９、Ｔｒｔ−Ｓｅｒ−ＯＭｅ）（６．０ｇ、１６．６ｍｍｏｌ）とトリフェニルフォスフィン（ＰＰｈ３）（８．７１ｇ、３３．２ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（３５ｍＬ）に２．２Ｍのジエチルアゾカルボキシレート（ＤＥＡＤ）のトルエン溶液（１５．０６ｍＬ、３３．２ｍｍｏｌ）を室温にて加え、反応液を５０℃で３０分撹拌した。反応液を減圧濃縮した後、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）にて精製し、３−（３−クロロフェノキシ）−２−（トリチルアミノ）プロパン酸（Ｓ）−メチル（Ｔｒｔ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）−ＯＭｅ）（化合物ａａ２０）（４．４３ｇ、５７％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ４００−ＭＲ、４００ＭＨｚ、ｄ−ＤＭＳＯ）δ３．１７（３Ｈ、ｓ）、３．４９−３．５１（１Ｈ、ｍ）、４．０６−４．０８（１Ｈ、ｍ）、４．１９−４．２２（１Ｈ、ｍ）、６．８３−６．８５（１Ｈ、ｍ）、６．９９−７．０１（２Ｈ、ｍ）、７．２０−７．２１（３Ｈ、ｍ）、７．２８−７．３０（７Ｈ、ｍ）、７．４２−７．４４（６Ｈ、ｍ）
（Ｓ）−２−アミノ−３−（３−クロロフェノキシ）プロパン酸（化合物ａａ２１、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
３−（３−クロロフェノキシ）−２−（トリチルアミノ）プロパン酸（Ｓ）−メチル（Ｔｒｔ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）−ＯＭｅ）（化合物ａａ２０）（３．９ｇ、８．２６ｍｍｏｌ）の１．４−ジオキサン溶液（８０ｍＬ）に１．０Ｍ水酸化リチウム／メタノール溶液（８３ｍＬ）を室温にて加え、反応液を５０℃で３時間撹拌した。反応液を減圧濃縮した後、得られた残渣にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（３０ｍＬ）を加え、５０℃で１０分間撹拌した。その後、反応液を減圧濃縮し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル）にて精製し、（Ｓ）−２−アミノ−３−（３−クロロフェノキシ）プロパン酸（化合物ａａ２１、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）−ＯＨ）（８５０ｍｇ、４８％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝２１６（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−クロロフェノキシ）プロパン酸（化合物ａａ１２、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−２−アミノ−３−（３−クロロフェノキシ）プロパン酸（化合物ａａ２１、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）−ＯＨ）（８５０ｍｇ、３．９４ｍｍｏｌ）と炭酸Ｎ−スクシンイミジル９−フルオレニルメチル（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（１．３３ｇ、３．９４ｍｍｏｌ）に１，４−ジオキサン（２０ｍＬ）と水（２０ｍＬ）を室温にて加えた後、炭酸セシウム（２．５６９ｇ、７．８８ｍｍｏｌ）を加え、室温で撹拌した。原料の消失をＬＣ−ＭＳで確認した後、水（２０ｍＬ）を加え、ジエチルエーテル（４０ｍＬ）で２回洗浄した。得られた水層を５Ｎ塩酸水溶液を用いてｐＨ＝２になるまで調整し、酢酸エチルで２回抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過、減圧濃縮し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル）にて精製し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−クロロフェノキシ）プロパン酸（化合物ａａ１２、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）−ＯＨ）（１．４２ｇ、８２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４３８（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｎＰｒ）−ＯＨ（化合物ａａ５１）の合成は、以下のスキームに従って行った。
Figure 2018225864
Ｏ−アリル−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ５０、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ａｌｌｙｌ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−セリン（Ｂｏｃ−Ｓｅｒ−ＯＨ）（５０ｇ、２３４．６５ｍｍｏｌ）を脱水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２５０ｍＬ）に溶解し、氷冷下（１０度以下）で水素化ナトリウム（２２ｇ、９１６．６７ｍｍｏｌ、６０％オイルディスパージョン）を加えた。氷冷下で３０分撹拌した後、氷冷下で３−ブロモプロパ−１−エン（３６．７ｇ、３０３．３７ｍｍｏｌ）を滴下して加えた（１０度以下）。添加後、反応液を２５度で１６時間撹拌した後、氷水（５００ｍＬ）を加えて反応をクエンチし、酢酸エチルで抽出した（５００ｍＬｘ３回）。有機層を飽和食塩水で３回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。ろ過後、減圧濃縮により酢酸エチルを除去し、目的物を含む粗生成物を得た。同様の反応を３回実施し、計４回分の粗生成物をまとめてカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）で精製し、Ｏ−アリル−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ５０、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ａｌｌｙｌ）−ＯＨ）（１９６．７ｇ、８２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ２６８ （Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：０．９０分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ１７）
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−プロピル−Ｌ−セリン（化合物ａａ５１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｎＰｒ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
Ｏ−アリル−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ５０、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ａｌｌｙｌ）−ＯＨ）（１４８ｇ、６０３．４１ｍｍｏｌ）をメタノール（１０００ｍＬ）に溶解し、アンモニアのメタノール溶液（２Ｍ、４５３ｍＬ）を加えて室温で２０分撹拌した。その後、Ｐｄ／Ｃ（２９．６ｇ）を加えて水素雰囲気下（５ａｔｍ）、２５度で１６時間撹拌した。その後、固体をセライトろ過により除去し、減圧濃縮により溶媒を除去することでＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｏ−プロピル−Ｌ−セリン（Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ｎＰｒ）−ＯＨ）（１４６．７ｇ、９８％）を得た。
得られたＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｏ−プロピル−Ｌ−セリン（Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ｎＰｒ）−ＯＨ）（１４６．７ｇ）を１，４−ジオキサン（５００ｍＬ）に溶解し、濃塩酸（２９７ｍＬ）を滴下しながら加えた後、室温で１６時間撹拌した。反応液に炭酸カリウム水溶液を加えてｐＨを７から８に調節し、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（２４０．１７ｇ）および炭酸カリウム（１６５．１ｇ、１．１９ｍｏｌ）を加えて室温で１６時間撹拌した。その後、反応液をヘキサンで３回洗浄し、塩酸水溶液（６Ｍ）を加えて水層のｐＨを１から２に調節し、酢酸エチルで３回抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後に濃縮して溶媒を除去した。得られた粗生成物をヘキサンおよびエーテルで洗浄し、逆相カラムクロマトグラフィーで精製してＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−プロピル−Ｌ−セリン（化合物ａａ５１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｎＰｒ）−ＯＨ）（１０３．２ｇ、２４％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３７０ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：２．１１分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ１８）
化合物ａａ５２の合成は、以下のスキームに従って行った。
Figure 2018225864
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｏ−プロピル−Ｌ−セリン（化合物ａａ５２、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ｎＰｒ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−プロピル−Ｌ−セリン（化合物ａａ５１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｎＰｒ）−ＯＨ）（６７ｇ、１８１．３７ｍｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルホン酸（ＴｓＯＨ）（１．８６ｇ、１０．８０ｍｍｏｌ）およびパラホルムアルデヒド（（ＣＨ２Ｏ）ｎ）（１０．８６ｇ）をトルエン（６７０ｍＬ）に懸濁させ、窒素雰囲気下、１１０度で１６時間撹拌した。その後、反応液を酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過および減圧濃縮することで溶媒を除去し、（Ｓ）−５−オキソ−４−（プロポキシメチル）オキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチルを粗生成物として得た。
得られた粗生成物である（Ｓ）−５−オキソ−４−（プロポキシメチル）オキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（３０ｇ、７８．６５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（ＤＣＭ）（４８０ｍＬ）に溶解し、トリエチルシラン（Ｅｔ３ＳｉＨ）（２８ｇ、２４０．８０ｍｍｏｌ）およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（４８０ｍＬ）を室温で加えた。この反応液を室温で２日間撹拌した後、反応液を減圧濃縮した。得られた残渣を炭酸カリウム水溶液に溶解し、これをヘキサンで２回洗浄した。その後、水層に濃塩酸を加えてｐＨを２から３に調節し、酢酸エチルで２回抽出した。有機層を飽和食塩水で３回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過した。減圧濃縮により溶媒を除去することでＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｏ−プロピル−Ｌ−セリン（化合物ａａ５２、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ｎＰｒ）−ＯＨ）（２４ｇ、８０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３８４ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．６８分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ１９）
化合物ａａ５４（Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）−ＯＨ）の合成は、以下のスキームに従って行った。
Figure 2018225864
Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｏ−（３−メチルブタ−２−エン−１−イル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ５３）の合成
Figure 2018225864
（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−セリン（Ｂｏｃ−Ｓｅｒ−ＯＨ）（５０ｇ、２３４．６５ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２５０ｍＬ）に溶解し、氷冷下（０度）で水素化ナトリウム（２２ｇ、９１６．６７ｍｍｏｌ、６０％オイルディスパージョン）を加えた。氷冷下で３０分撹拌した後、１−ブロモ−３−メチルブタ−２−エン（４４ｇ、２９５．２４ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。添加後、反応液を２５度で１６時間撹拌した後、氷水を加えて反応をクエンチし、塩酸水溶液（５Ｍ）を加えてｐＨを２から３に調節した。その後、酢酸エチルで２回抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。ろ過後、減圧濃縮により酢酸エチルを除去し、目的物を含む粗生成物を得た。この粗生成物を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル＝１００／０→８０／２０）で精製し、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｏ−（３−メチルブタ−２−エン−１−イル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ５３）（３２ｇ、４８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ２９６ （Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：１．３９分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ７）
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−イソペンチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ５４、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｏ−（３−メチルブタ−２−エン−１−イル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ５３）（１８５ｇ、６７６．８５ｍｍｏｌ）、アンモニアのメタノール溶液（２Ｍ、５５５ｍＬ）、Ｐｄ／Ｃ（１８．５ｇ）およびメタノール（１５００ｍＬ）を混合し、水素雰囲気下（５ａｔｍ）、室温で１６時間撹拌した。固体を濾過により除去した後、減圧濃縮により溶媒を除去することでＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｏ−イソペンチル−Ｌ−セリン（Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）−ＯＨ）（１８３ｇ）を得た。
得られたＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｏ−イソペンチル−Ｌ−セリン（Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）−ＯＨ）（１７５ｇ）を１，４−ジオキサン（５００ｍＬ）に溶解し、濃塩酸（３００ｍＬ）を加えた後、室温で１６時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた粗生成物（１２２ｇ）を１，４−ジオキサン／水（１０００ｍＬ／１０００ｍＬ）に溶解し、炭酸カリウム（２３９ｇ、１．７３ｍｏｌ）およびＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（２３４ｇ、６９４．３６ｍｍｏｌ）を加えて室温で１６時間撹拌した。その後、反応液をヘキサンで３回洗浄した。洗浄後、塩酸水溶液（６Ｍ）を加えて水層のｐＨを２から３に調節し、酢酸エチルで２回抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後に減圧濃縮して溶媒を除去した。得られた粗生成物をエーテル、ヘキサン、酢酸エチルで洗浄し、さらに逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル＝１００／０→３０／７０）で精製してＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−イソペンチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ５４、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）−ＯＨ）（９５ｇ、４１％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３９８ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：２．２９分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ１８）
化合物ａａ５５（Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ｉＰｅｎ）−ＯＨ）の合成は、以下のスキームに従って行った。
Figure 2018225864
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−イソペンチル−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ｉＰｅｎ）−ＯＨ、化合物ａａ５５）の合成
Figure 2018225864
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−イソペンチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ５４、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）−ＯＨ）（７５ｇ、１８８．７０ｍｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルホン酸（ＴｓＯＨ）（１．９５ｇ、１１．３２ｍｍｏｌ）およびパラホルムアルデヒド（１１．４ｇ）をトルエン（７５０ｍＬ）に懸濁させ、窒素雰囲気下、１１０度で１６時間撹拌した。その後、反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、減圧濃縮することで溶媒を除去し、（Ｓ）−４−（（イソペンチルオキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチルを粗生成物として得た。
得られた（Ｓ）−４−（（イソペンチルオキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（４０ｇ、９７．６９ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（６７０ｍＬ）に溶解し、トリエチルシラン（Ｅｔ３ＳｉＨ）（３４ｇ、２９２．４１ｍｍｏｌ）およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（６７０ｍＬ）を室温で加えた。この反応液を室温で２日間撹拌した後、反応液を減圧濃縮した。得られた残渣を炭酸カリウム水溶液に溶解し、これを石油エーテルで３回洗浄した。その後、水層に濃塩酸を加えてｐＨを２から３に調節し、酢酸エチルで３回抽出した。有機層を飽和食塩水で３回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過した。溶媒を減圧濃縮により除去して得られた残渣をメタノールに溶解し、ヘキサンで３回洗浄した後、メタノールを減圧濃縮により除去することでＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−イソペンチル−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ｉＰｅｎ）−ＯＨ、化合物ａａ５５）（３５ｇ、８７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４１２ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
１，１−ジフルオロ−４−ヨードブタン（化合物ａａ５６）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、５−ブロモ−１，１−ジフルオロペンタン（５ｇ，２６．７３ｍｍｏｌ）をアセトン（２０ｍｌ）に溶解し室温にてヨウ化ナトリウム（６ｇ）を加えた。反応溶液を４５度に昇温し１時間撹拌した。反応溶液をろ過し、得られたろ液を減圧濃縮し、ヘキサンを加え、チオ硫酸ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、ろ過、減圧濃縮し、得られた粗生成物を順相シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン）にて精製し、１，１−ジフルオロ−４−ヨードブタン（化合物ａａ５６）（４．２ｇ、６７％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３−ｄ）：δ５．８７（ｔ，Ｊ＝２７．０Ｈｚ，１Ｈ），３．２６（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．０６−１．９９（ｍ，４Ｈ）
（Ｓ）−２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−７，７−ジフルオロヘプタン酸（化合物ａａ５８、Ｆｍｏｃ−Ｈｎｌ（７−Ｆ２）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｒ）−２−（２，６−ジクロロフェニル）−５−オキソ−３−（（Ｒ）−１−フェニルエチル）イミダゾリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（５０ｇ，１１４．８５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（３００ｍｌ）に溶解し、−２０度に冷却した。ナトリウムビス（トリメチルシリル）アミド（１．９Ｍテトラヒドロフラン溶液、６４ｍｌ、１２１．６ｍｍｏｌ）を滴下し１０分間撹拌した後、４０ｍｌのテトラヒドロフランに希釈された１，１−ジフルオロ−４−ヨードブタン（ａａ５６、３５ｇ、１４９．５６ｍｍｏｌ）を滴下し−２０度にて３０分間撹拌した。反応液に２０％の塩化アンモニウム水溶液を加えた後、酢酸エチルで２度抽出を行った。有機層を２０％酢酸アンモニウム水溶液（２回）、１５％食塩水で洗浄した後、得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、減圧濃縮する事で粗生成物（２Ｒ，４Ｓ）−２−（２，６−ジクロロフェニル）−４−（５，５−ジフルオロペンチル）−５−オキソ−３−（（Ｒ）−１−フェニルエチル）イミダゾリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ａａ５７、７４ｇ）を得た。
得られた（２Ｒ，４Ｓ）−２−（２，６−ジクロロフェニル）−４−（５，５−ジフルオロペンチル）−５−オキソ−３−（（Ｒ）−１−フェニルエチル）イミダゾリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ａａ５７、７４ｇ）をクロロベンゼン（２００ｍｌ）に溶解した。反応の内温を１０度以下に保ちながらトリフルオロメタンスルホン酸（４５ｍｌ）を３０分かけて滴下した。反応液を室温にて２時間撹拌した後１００ｍｌの水を加え、１１０度に昇温し４時間撹拌した。反応液を室温にし、水層を１：１のシクロペンチルメチルエーテルとヘキサンで３回洗浄した。その後、水層を４０％のリン酸カリウム水溶液で中和（ｐＨ＝７）した。そこへ窒素雰囲気下、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２５．７ｍｌ）、アセトニトリル（５０ｍｌ）、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（４４．８ｇ）を加え室温にて１６時間撹拌した。反応溶液のｐＨを８〜９に保つのにＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１９ｍｌ）を加えた。更に反応を進行させる為にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（９ｍｌ）を加えた。その後、反応溶液をろ過し、得られたろ液にヘキサン：酢酸エチル（２：１）（１５０ｍｌ）を加え激しく４０分撹拌した。３層になった反応液の中間層を回収し、２：１のヘキサンと酢酸エチル溶液（１５０ｍｌ）で９回洗浄した。洗浄した水層をｐＨが１になるまで濃塩酸を加えた後、酢酸エチルで２回抽出した。得られた有機層を水で２回、１０％食塩水で洗浄した後、得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、減圧濃縮する事で（Ｓ）−２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−７，７−ジフルオロヘプタン酸（化合物ａａ５８、Ｆｍｏｃ−Ｈｎｌ（７−Ｆ２）−ＯＨ）（３３ｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ４０４ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：３．２９分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ２７）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−７，７−ジフルオロヘプタン酸（化合物ａａ５９、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｎｌ（７−Ｆ２）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−７，７−ジフルオロヘプタン酸（化合物ａａ５８、Ｆｍｏｃ−Ｈｎｌ（７−Ｆ２）−ＯＨ）（３５ｇ、８６．７６ｍｍｏｌ）とパラホルムアルデヒド（８．０５ｇ、２６８．３３ｍｍｏｌ）と１０−カンファースルホン酸（ＣＳＡ）（１．０１ｇ、４．３５ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（５２５ｍＬ）を９５度に昇温し、２時間撹拌した。反応液を室温にした後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で３回洗浄し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、ろ過、減圧濃縮することで、（４Ｓ）−４−（５，５−ジフルオロペンチル）−５−オキソ−１，３−オキサゾリジン−３−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルを粗生成物として得た（３３ｇ、７９．４４ｍｍｏｌ）。
上述の粗生成物である（４Ｓ）−４−（５，５−ジフルオロペンチル）−５−オキソ−１，３−オキサゾリジン−３−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル（３３ｇ、７９．４４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液（３３０ｍＬ）にトリエチルシラン（２５．４ｍＬ、１２．４２ｍｍｏｌ）と水（１．４３ｍｌ）と三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（ＢＦ３・ＯＥｔ２）（２０．１ｍＬ）を０度にて加え、室温で１６時間撹拌した。反応液に５％塩化アンモニウム水溶液を加え、有機層を飽和食塩水で洗浄し、得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、ろ過、減圧濃縮した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−７，７−ジフルオロヘプタン酸（化合物ａａ５９、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｎｌ（７−Ｆ２）−ＯＨ）（２７ｇ、２工程８０％）を得た
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ４４０ （Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：２．２０分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ１８）
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−クロロフェニル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ６０、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ＯＨ）の合成は、以下のスキームに従って行った。
Figure 2018225864
メチルＯ−（２−クロロフェニル）−Ｎ−トリチル−Ｌ−セリナート（化合物ａａ６１、Ｔｒｔ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ＯＭｅ）の合成
Figure 2018225864
メチルトリチル−Ｌ−セリナート（Ｔｒｔ−Ｓｅｒ−ＯＭｅ）（２５．０ｇ、６９．２ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（ＰＰｈ３）（２０．０ｇ、７６．１ｍｍｏｌ）および２−クロロフェノール（１０．５ｍＬ、１０３．７ｍｍｏｌ）とトルエン（５７．２ｍＬ）を混合し、氷冷下でアゾジカルボン酸ジイソプロピル（ＤＩＡＤ）（４０％トルエン溶液、１．９ｍｏｌ／ｌ、４０．３ｍＬ、７６．１ｍｍｏｌ）を４０分かけて滴下した。滴下終了後、反応液を室温に昇温し、さらに９０分撹拌した。その後、反応液を減圧濃縮し、得られた残渣にエタノール／水（８／２、１８０ｍＬ）を加えて室温で５分撹拌した。生じた白色固体をろ過し、エタノール／水（８／２、１００ｍＬ）で３回洗浄、減圧乾燥させることでメチルＯ−（２−クロロフェニル）−Ｎ−トリチル−Ｌ−セリナート（化合物ａａ６１、Ｔｒｔ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ＯＭｅ）（２４．３ｇ、７５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４９４ （Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：１．１６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
メチルＯ−（２−クロロフェニル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ６２）の合成
Figure 2018225864
メチルＯ−（２−クロロフェニル）−Ｎ−トリチル−Ｌ−セリナート（化合物ａａ６１、Ｔｒｔ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ＯＭｅ）（２４．３ｇ、５１．５ｍｍｏｌ）を４Ｎ塩酸／１，４−ジオキサン溶液（３８．７ｍＬ、１５４．５ｍｍｏｌ）に溶解させ、室温で１５分撹拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた固体にヘキサン（１００ｍＬ）を加え、室温で１０分撹拌した後、ろ過し、固体をさらにヘキサン（１００ｍＬ）で３回洗浄、および減圧乾燥させることでメチルＯ−（２−クロロフェニル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ６２、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ＯＭｅ）（１３．５ｇ、９８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ２３０ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｏ−（２−クロロフェニル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ６３、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
メチルＯ−（２−クロロフェニル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ６２、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ＯＭｅ）（１３．５ｇ、５０．７ｍｍｏｌ）を水（７５ｍＬ）に溶解させ、氷冷下、水酸化リチウム一水和物（４．６８ｇ，１１１．５ｍｍｏｌ）の水／メタノール（３０ｍＬ／３０ｍＬ）溶液を２０分かけて滴下した。滴下終了後、氷冷下で６０分撹拌した。その後、冷蔵庫で冷やしたアセトニトリル（４００ｍＬ）を反応液に加えると固体が析出した。さらに氷冷下で２０分撹拌後、冷蔵庫内で５時間静置した。ろ過により固体を回収した後、母液に析出した固体も回収した。回収した固体をまとめてアセトニトリル（１５０ｍＬ）で３回洗浄し、減圧乾燥させることでＯ−（２−クロロフェニル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ６３、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ＯＨ）（化合物ａａ６３、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ＯＨ）（１０．３ｇ、９１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ２１６ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−クロロフェニル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ６０、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
Ｏ−（２−クロロフェニル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ６３、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ＯＨ）（１．０ｇ、４．４９ｍｍｏｌ）に炭酸ナトリウム（０．９５２ｇ、８．９９ｍｍｏｌ）水溶液（３．８ｍＬ）および１，４−ジオキサン（２．０ｍＬ）を加え、氷冷下でＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（１．５９ｇ、４．７２ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。添加後、室温で１０分撹拌した後、水（１２ｍＬ）を加えて固体を溶解させた。ｔ−ブチルメチルエーテル（１５ｍＬ）で３回洗浄した後、５Ｍ塩酸水溶液（４．４９ｍＬ、２２．４６ｍｍｏｌ）をゆっくり加えて水層のｐＨを１に調節し、水層をｔ−ブチルメチルエーテル（１５ｍＬ）で３回抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、ろ過した。減圧濃縮により溶媒を除去して、白色固体を得た。
同様の操作をＯ−（２−クロロフェニル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ６３、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ＯＨ）（９．２８ｇ、４１．７ｍｍｏｌ）を用いても実施し、得られた固体をまとめて減圧乾燥してＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−クロロフェニル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ６０、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ＯＨ）（１９．６ｇ、９７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４３８（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−４−（（２−クロロフェノキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ６４）の合成
Figure 2018225864
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−クロロフェニル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ６０、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ＯＨ）（３．００ｇ、６．８５ｍｍｏｌ）、パラホルムアルデヒド（０．８２３ｇ、２７．４ｍｍｏｌ）および（＋）−１０−カンファースルホン酸（８０．０ｍｇ、０．３４３ｍｍｏｌ）のトルエン（２３ｍＬ）懸濁液を８０度で３時間撹拌した。反応液を放冷後、酢酸エチル（１５ｍＬ）で希釈しセライトろ過した。ろ液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液／水（１／１、１５ｍＬ）を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液／水（１／１、１５ｍＬ）で２回洗浄し、飽和食塩水／水（１／１、１５ｍＬ）で１回洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒留去し、（Ｓ）−４−（（２−クロロフェノキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ６４）（３．２３ｇ）を粗生成物として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４５０ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−クロロフェニル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ６５、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−４−（（２−クロロフェノキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ６４、１．５０ｇ、３．３３ｍｍｏｌ）のジクロロエタン（ＤＣＥ）（１１ｍＬ）溶液に、トリエチルシラン（４．７９ｍＬ、３０．０ｍｍｏｌ）およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（６．９４ｍＬ、９０．０ｍｍｏｌ）を加え、７０度にて２．５時間撹拌した。減圧下溶媒留去し、残渣をアセトニトリル（２５ｍＬ）に溶解し、ヘキサン（２５ｍＬ）で４回洗浄した。アセトニトリル層を減圧下溶媒留去し、逆相カラムクロマトグラフィーで精製し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−クロロフェニル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ６５、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ＯＨ）（１．１ｇ、８３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４５２ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−４−（（（５−フルオロピリジン−３−イル）メトキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ６６）の合成
Figure 2018225864
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−Ｌ−セリン（Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ）（化合物ａａ１０、３．００ｇ、６．８７ｍｍｏｌ）のトルエン（１３．７ｍＬ）溶液に、パラホルムアルデヒド（０．６１９ｇ、２０．６ｍｍｏｌ）およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（４．７７ｍＬ、６１．９ｍｍｏｌ）を加え、７０度で３時間攪拌した。反応液を減圧下溶媒留去し、残渣をジクロロメタン（３０ｍｌ）に溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液／水（１：１、１５ｍＬ）で３回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒留去して（Ｓ）−４−（（（５−フルオロピリジン−３−イル）メトキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ６６）（３．０８ｇ）を粗生成物として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４４９ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ６７、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−４−（（（５−フルオロピリジン−３−イル）メトキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ６６）（１．７５ｇ、３．９０ｍｍｏｌ）のジクロロエタン（ＤＣＥ）（１３ｍＬ）溶液に、トリエチルシラン（５．６１ｍＬ、３５．１ｍｍｏｌ）、トリフルオロ酢酸（８．１２ｍＬ、１０５ｍｍｏｌ）を加え、７０度にて２時間３０分撹拌した。減圧下溶媒留去し、残渣をアセトニトリル（２５ｍＬ）に溶解し、ヘキサン（２５ｍＬ）で洗浄した。アセトニトリル層を減圧下溶媒留去し、得られた粗生成物を逆相カラムクロマトグラフィーで精製し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ６７、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ）（１．６３ｇ、９３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４５１ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
メチル（（２−ニトロフェニル）スルホニル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ６８、Ｎｓ−Ｓｅｒ−ＯＭｅ）の合成
Figure 2018225864
室温にて、炭酸ナトリウム（７．７６ｇ、７３．２ｍｍｏｌ）を水（７５ｍＬ）に溶解することで得られた溶液を市販のメチルＬ−セリナート塩酸塩（Ｈ−Ｓｅｒ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）（５．０ｇ、３２．１ｍｍｏｌ）に加えた後、塩化２−ニトロベンゼンスルホニル（ＮｓＣｌ）（７．０５ｇ、３１．８ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液（７５ｍＬ）を加え、室温で１時間３０分撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、１Ｎ塩酸水溶液、飽和食塩水で洗浄した後、得られた有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、ろ過、減圧濃縮することで、メチル（（２−ニトロフェニル）スルホニル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ６８、Ｎｓ−Ｓｅｒ−ＯＭｅ）（７．９ｇ、８２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ３０５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）アジリジン−２−カルボン酸メチル（化合物ａａ６９、Ｎｓ−Ａｚｙ−ＯＭｅ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、メチル（（２−ニトロフェニル）スルホニル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ６８、Ｎｓ−Ｓｅｒ−ＯＭｅ）（２．４９ｇ、８．１８ｍｍｏｌ）にジクロロメタン（ＤＣＭ）（６９ｍＬ）を加え、溶液が透明になるまで室温にて撹拌した後、トリフェニルホスフィン（ＰＰｈ３）（２．５４５ｇ、９．８２ｍｍｏｌ）を食塩と氷にて作成した氷浴を用いることで、ー１０度にて加え、溶液が透明になるまでー１０度で撹拌した。４０％アゾジカルボン酸ジエチル（ＤＥＡＤ）トルエン溶液（４．４６ｍＬ、東京化成工業より購入）をー１０度にて加え、反応液を３０分撹拌した後、トルエン（４０ｍＬ）を加え、ロータリーエバポレーターを用い、水浴の温度を１５度以下に保ち、減圧濃縮することでジクロロメタン（ＤＣＭ）を除去した。固体を除去するためにろ過を行い、得られたろ液を順相シリカゲルクロマトグラフィー（トルエン／アセトン）にて精製し、（Ｓ）−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）アジリジン−２−カルボン酸メチル（化合物ａａ６９、Ｎｓ−Ａｚｙ−ＯＭｅ）（１．９ｇ、８１％）を得た
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ２８７ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
メチルＮ−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）−Ｏ−（２，２，３，３−テトラフルオロプロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ７０、Ｎｓ−Ｓｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ＯＭｅ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）アジリジン−２−カルボン酸メチル（化合物ａａ６９、Ｎｓ−Ａｚｙ−ＯＭｅ）（１．９ｇ、６．６４ｍｍｏｌ）と２，２，３，３−テトラフルオロプロパン−１−オール（８．８２ｍＬ、１００ｍｍｏｌ）の混合物に三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（ＢＦ３・ＯＥｔ２）（２．５２ｍＬ、１９．９１ｍｍｏｌ）を室温にて加え、７０度にて４０分間撹拌した。反応液を室温にまで冷却した後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈し、逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、メチルＮ−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）−Ｏ−（２，２，３，３−テトラフルオロプロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ７０、Ｎｓ−Ｓｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ＯＭｅ）（１．３ｇ、４７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ４１９ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｎ−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）−Ｏ−（２，２，３，３−テトラフルオロプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ７１、Ｎｓ−Ｓｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
メチルＮ−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）−Ｏ−（２，２，３，３−テトラフルオロプロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ７０、Ｎｓ−Ｓｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ＯＭｅ）（１４２ｍｇ、０．３３９ｍｍｏｌ）にメタノール（ＭｅＯＨ）（０．７５ｍＬ）、水（０．７５ｍＬ）、水酸化リチウム１水和物（２４．３９ｍｇ、１．０１８ｍｍｏｌ）を加え、室温にて８時間３０分撹拌した。反応液にギ酸（０．１３ｍＬ）を加え、水で希釈した後、得られた溶液を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、Ｎ−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）−Ｏ−（２，２，３，３−テトラフルオロプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ７１、Ｎｓ−Ｓｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ＯＨ）（９６ｍｇ、７０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ４０３ （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．６８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２，２，３，３−テトラフルオロプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ７２、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）−Ｏ−（２，２，３，３−テトラフルオロプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ７１、Ｎｓ−Ｓｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ＯＨ）（４０．０ｍｇ、０．０９９ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（１．０ｍＬ）に炭酸カリウム（６８．４ｍｇ、０．４９５ｍｍｏｌ）、チオフェノール（ＰｈＳＨ）（０．０３１ｍＬ、０．２９７ｍｍｏｌ）を加え、室温にて４時間撹拌した。反応液にギ酸（０．０３８ｍＬ）を加え、水で希釈した後、ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）／ヘキサン＝１／４で洗浄し、得られた水層を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、Ｏ−（２，２，３，３−テトラフルオロプロピル）−Ｌ−セリン（Ｈ−Ｓｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ＯＨ）（１６ｍｇ、７４％）を得た。
上述のＯ−（２，２，３，３−テトラフルオロプロピル）−Ｌ−セリン（Ｈ−Ｓｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ＯＨ）（１４ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ）を水（１６０μＬ）に溶解させた後、Ｎ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（３９．１μＬ、０．２２４ｍｍｏｌ）と１，４−ジオキサン（４８０μＬ）、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（２２．６３ｍｇ、０．０６７ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応液を水で希釈し、ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）／ヘキサン＝４／１で洗浄し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で抽出した。得られた水層に１Ｎ塩酸水溶液をｐＨ＝１．５になるまで加え、酢酸エチルで抽出した後、得られた有機層を飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、ろ過、減圧濃縮し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２，２，３，３−テトラフルオロプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ７２、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ＯＨ）（２４ｍｇ、８５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４４０ （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．８５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（２−クロロフェニル）ブタン酸（化合物ａａ７３、Ｆｍｏｃ−Ｈｐｈ（２−Ｃｌ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
市販の（Ｓ）−２−アミノ−４−（２−クロロフェニル）ブタン酸（Ｈ−Ｈｐｈ（２−Ｃｌ）−ＯＨ）（１．０ｇ、４．６８ｍｍｏｌ）を水（１０ｍＬ）に溶解させた後、室温にて炭酸ナトリウム（１．４８８ｇ、１４．０４ｍｍｏｌ）と１，４−ジオキサン（４ｍＬ）、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（１．５７９ｇ、４．６８ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液（１１ｍＬ）を加え、室温で終夜撹拌した。原料の消失をＬＣ−ＭＳで確認した後、反応液を水で室温にて希釈し、ジエチルエーテルで洗浄した。得られた水層を１Ｎ塩酸水溶液を用いて酸性にした後、酢酸エチルで３回抽出した。得られた有機層をまとめて、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、ろ過、減圧濃縮し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（２−クロロフェニル）ブタン酸（化合物ａａ７３、Ｆｍｏｃ−Ｈｐｈ（２−Ｃｌ）−ＯＨ）（２．０ｇ、９８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４３６ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（２−クロロフェニル）ブタン酸（化合物ａａ７５、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｐｈ（２−Ｃｌ）−ＯＨ）の合成は、以下のスキームに従って行った。
Figure 2018225864
（Ｓ）−４−（２−クロロフェネチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ７４）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（２−クロロフェニル）ブタン酸（化合物ａａ７３、Ｆｍｏｃ−Ｈｐｈ（２−Ｃｌ）−ＯＨ）（４００ｍｇ、０．９１８ｍｍｏｌ）およびパラホルムアルデヒド（１１０ｍｇ、３．６７ｍｍｏｌ）をジクロロエタン（ＤＣＥ）（３．０６ｍＬ）およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（６３６μＬ、８．２６ｍｍｏｌ）に溶解し、５０度で２時間撹拌した。反応液をジクロロエタン（ＤＣＥ）で希釈後、減圧濃縮により溶媒を除去した。得られた残渣をジクロロメタンに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、ジクロロメタンを減圧濃縮により除去することで（Ｓ）−４−（２−クロロフェネチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ７４）（３７８．４ｍｇ、９２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４４８ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．０５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（２−クロロフェニル）ブタン酸（化合物ａａ７５、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｐｈ（２−Ｃｌ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−４−（２−クロロフェネチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ７４）（４１１ｍｇ、０．９１８ｍｍｏｌ）およびトリエチルシラン（Ｅｔ３ＳｉＨ）（１．４６ｍＬ、９．１８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（４．５９ｍＬ）およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（２．１２ｍＬ）に溶解し、室温で５時間撹拌した。反応液をジクロロメタンで希釈後、減圧濃縮により溶媒を除去した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）で精製し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（２−クロロフェニル）ブタン酸（化合物ａａ７５、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｐｈ（２−Ｃｌ）−ＯＨ）（１６４．６ｍｇ、４０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４５０ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（３−クロロフェニル）ブタン酸（化合物ａａ７６、Ｆｍｏｃ−Ｈｐｈ（３−Ｃｌ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
市販の（Ｓ）−２−アミノ−４−（３−クロロフェニル）ブタン酸（Ｈ−Ｈｐｈ（３−Ｃｌ）−ＯＨ）（１．０ｇ、４．６８ｍｍｏｌ）を水（１０ｍＬ）に溶解させた後、室温にて炭酸ナトリウム（１．４８８ｇ、１４．０４ｍｍｏｌ）と１，４−ジオキサン（４ｍＬ）、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（１．５７９ｇ、４．６８ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液（１１ｍＬ）を加え、室温で終夜撹拌した。原料の消失をＬＣ−ＭＳで確認した後、反応液を水で室温にて希釈し、ジエチルエーテルで洗浄した。得られた水層を１Ｎ塩酸水溶液を用いて酸性にした後、酢酸エチルで３回抽出した。得られた有機層をまとめて、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、ろ過、減圧濃縮し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（３−クロロフェニル）ブタン酸（化合物ａａ７６、Ｆｍｏｃ−Ｈｐｈ（３−Ｃｌ）−ＯＨ）（２．０ｇ、９８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４３６ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（３−クロロフェニル）ブタン酸（化合物ａａ７８、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｐｈ（３−Ｃｌ）−ＯＨ）の合成は、以下のスキームに従って行った。
Figure 2018225864
（Ｓ）−４−（３−クロロフェネチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ７７）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（３−クロロフェニル）ブタン酸（化合物ａａ７６、Ｆｍｏｃ−Ｈｐｈ（３−Ｃｌ）−ＯＨ）（４００ｍｇ、０．９１８ｍｍｏｌ）およびパラホルムアルデヒド（１１０ｍｇ、３．６７ｍｍｏｌ）をジクロロエタン（ＤＣＥ）（３．０６ｍＬ）およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（６３６μＬ、８．２６ｍｍｏｌ）に溶解し、５０度で２時間撹拌した。反応液をジクロロエタン（ＤＣＥ）で希釈後、減圧濃縮により溶媒を除去した。得られた残渣をジクロロメタンに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、ジクロロメタンを減圧下除去することで（Ｓ）−４−（３−クロロフェネチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ７７、４２６．３ｍｇ）を定量的に得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４４８ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．０６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（３−クロロフェニル）ブタン酸（化合物ａａ７８、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｐｈ（３−Ｃｌ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−４−（３−クロロフェネチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ７７）（４１１ｍｇ、０．９１８ｍｍｏｌ）およびトリエチルシラン（Ｅｔ３ＳｉＨ）（１．４６ｍＬ、９．１８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（４．５９ｍＬ）およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（２．１２ｍＬ）に溶解し、室温で６時間撹拌した。反応液をジクロロメタンで希釈後、減圧濃縮により溶媒を除去した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）で精製し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（３−クロロフェニル）ブタン酸（化合物ａａ７８、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｐｈ（３−Ｃｌ）−ＯＨ）（１４４．３ｍｇ、３５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４５０ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（４−クロロフェニル）ブタン酸（化合物ａａ７９、Ｆｍｏｃ−Ｈｐｈ（４−Ｃｌ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
市販の（Ｓ）−２−アミノ−４−（４−クロロフェニル）ブタン酸（Ｈ−Ｈｐｈ（４−Ｃｌ）−ＯＨ）（１．０ｇ、４．６８ｍｍｏｌ）を水（１０ｍＬ）に溶解させた後、室温にて炭酸ナトリウム（１．４８８ｇ、１４．０４ｍｍｏｌ）と１，４−ジオキサン（４ｍＬ）、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（１．５７９ｇ、４．６８ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液（１１ｍＬ）を加え、室温で終夜撹拌した。原料の消失をＬＣ−ＭＳで確認した後、反応液を水で室温にて希釈し、ジエチルエーテルで洗浄した。得られた水層を１Ｎ塩酸水溶液を用いて酸性にした後、酢酸エチルで３回抽出した。得られた有機層をまとめて、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥、ろ過、減圧濃縮した後、得られた混合物を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製することで、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（４−クロロフェニル）ブタン酸（化合物ａａ７９、Ｆｍｏｃ−Ｈｐｈ（４−Ｃｌ）−ＯＨ）（１．２ｇ、５９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４３４ （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．９５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（４−クロロフェニル）ブタン酸（化合物ａａ８１、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｐｈ（４−Ｃｌ）−ＯＨ）の合成は、以下のスキームに従って行った。
Figure 2018225864
（Ｓ）−４−（４−クロロフェネチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ８０）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（３−クロロフェニル）ブタン酸（化合物ａａ７９、Ｆｍｏｃ−Ｈｐｈ（４−Ｃｌ）−ＯＨ）（２５０ｍｇ、０．５７４ｍｍｏｌ）およびパラホルムアルデヒド（６８．９ｍｇ、２．２９ｍｍｏｌ）をジクロロエタン（ＤＣＥ）（１．９１ｍＬ）およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（３９８μＬ、５．１６ｍｍｏｌ）に溶解し、５０度で２時間撹拌した。反応液をジクロロエタン（ＤＣＥ）で希釈後、減圧濃縮により溶媒を除去した。得られた残渣をジクロロメタンに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、ジクロロメタンを除去することで（Ｓ）−４−（４−クロロフェネチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ８０）（２９７．５ｍｇ）を定量的に得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４４８ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．０６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（４−クロロフェニル）ブタン酸（化合物ａａ８１、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｐｈ（４−Ｃｌ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−４−（４−クロロフェネチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ８０）（２５７ｍｇ、０．５７４ｍｍｏｌ）およびトリエチルシラン（Ｅｔ３ＳｉＨ）（９１４μＬ、５．７４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２．８７ｍＬ）およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１．３３ｍＬ）に溶解し、室温で８時間撹拌した。反応液をジクロロメタンで希釈後、減圧濃縮により溶媒を除去した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）で精製し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（４−クロロフェニル）ブタン酸（化合物ａａ８１、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｐｈ（４−Ｃｌ）−ＯＨ）（１８０．５ｍｇ、７０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４５０ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−５−フェニルペンタン酸（化合物ａａ８２、Ｆｍｏｃ−ＭｅＰｈｅ｛＃（ＣＨ２）２｝−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、市販の（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−フェニルペンタン酸（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ｛＃（ＣＨ２）２｝−ＯＨ、渡辺化学工業より購入）（５００ｍｇ、１．２０３ｍｍｏｌ）とパラホルムアルデヒド（１０８ｍｇ、３．６１ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（３．０ｍＬ）にトリフルオロ酢酸（０．８３４ｍＬ、１０．８３ｍｍｏｌ）を室温にて加え、４時間撹拌した。反応液を濃縮し、ジクロロメタンで希釈した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、ろ過、減圧濃縮することで、（Ｓ）−５−オキソ−４−（３−フェニルプロピル）オキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（５９０ｍｇ）を粗生成物として得た。
上述の粗生成物である（Ｓ）−５−オキソ−４−（３−フェニルプロピル）オキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（５９０ｍｇ）のジクロロエタン（ＤＣＥ）溶液（７．０ｍＬ）にトリエチルシラン（１．９８４ｍＬ、１２．４２ｍｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（２．８７ｍＬ、３７．３ｍｍｏｌ）を室温にて加え、反応液を６０度で１時間撹拌した。反応液を室温にて冷却した後、減圧濃縮することで得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−５−フェニルペンタン酸（化合物ａａ８２、Ｆｍｏｃ−ＭｅＰｈｅ｛＃（ＣＨ２）２｝−ＯＨ）（４８８ｍｇ、２工程８２％）を得た
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ４３０ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−ベンジル−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ８３、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｂｎ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、市販のＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−ベンジル−Ｌ−セリン（Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｎ）−ＯＨ、渡辺化学工業より購入）（５００ｍｇ、１．１９８ｍｍｏｌ）とパラホルムアルデヒド（１０８ｍｇ、３．５９ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（３．０ｍＬ）にトリフルオロ酢酸（０．８３４ｍＬ、１０．７８ｍｍｏｌ）を室温にて加え、３時間撹拌した。反応液を濃縮し、ジクロロメタン（ＤＣＭ）で希釈した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、ろ過、減圧濃縮することで、（Ｓ）−４−（（ベンジルオキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（５４４ｍｇ）を粗生成物として得た。
上述の粗生成物である（Ｓ）−４−（（ベンジルオキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（５４４ｍｇ）のジクロロエタン（ＤＣＥ）溶液（７．０ｍＬ）にトリエチルシラン（１．８２１ｍＬ、１１．４０ｍｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（２．６３ｍＬ、３４．２ｍｍｏｌ）を室温にて加え、反応液を６０度で６時間撹拌した。反応液を室温にて冷却した後、減圧濃縮することで得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−ベンジル−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ８３、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｂｎ）−ＯＨ）（４２５ｍｇ、２工程７８％）を得た
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ４３２ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ，４Ｒ）−１−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−４−エトキシピロリジン−２−カルボン酸（化合物ａａ８４、Ｆｍｏｃ−Ｈｙｐ（Ｅｔ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
室温にて、市販の（２Ｓ，４Ｒ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−エトキシピロリジン−２−カルボン酸（Ｂｏｃ−Ｈｙｐ（Ｅｔ）−ＯＨ）（ＣＡＳ番号１４６０６０−１８−６、６５ｇ、２５１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（ＤＣＭ）（４００ｍＬ）溶液に塩化水素ガスを吹き込みながら撹拌した。６時間後、反応液を減圧下溶媒留去し、残渣をジエチルエーテルで洗浄し、（２Ｓ，４Ｒ）−４−エトキシピロリジン−２−カルボン酸塩酸塩（Ｈ−Ｈｙｐ（Ｅｔ）−ＯＨ・ＨＣｌ）（４５ｇ）を粗生成物として得た。
上述の粗生成物である（２Ｓ，４Ｒ）−４−エトキシピロリジン−２−カルボン酸塩酸塩（Ｈ−Ｈｙｐ（Ｅｔ）−ＯＨ・ＨＣｌ）を水（５００ｍＬ）と１、４−ジオキサン（５００ｍＬ）の混合液に溶解し、炭酸カリウム（７９．４ｇ、５７４ｍｍｏｌ）とＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（６９．８ｇ、２０７ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。
反応液をジエチルエーテルで洗浄し、水層を５％硫酸水素カリウム水溶液を用いｐＨを３に調整した後、酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒留去し、（２Ｓ，４Ｒ）−１−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−４−エトキシピロリジン−２−カルボン酸（化合物ａａ８４、Ｆｍｏｃ−Ｈｙｐ（Ｅｔ）−ＯＨ）（９０．７ｇ、９５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３８２ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．９７分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ２６）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（６−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル）プロパン酸（化合物ａａ８８、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ−４−ＮＭｅ２）−ＯＨ））の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、撹拌しているトリフェニルホスフィン（ＰＰｈ３）（２４．０９ｇ、９１．８４ｍｍｏｌ）とイミダゾール（６．２５ｇ、９１．９１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２００ｍＬ）に遮光条件下０度にてヨウ素（２３．３６ｇ、９１．９７ｍｍｏｌ）を加えた。撹拌している０度の反応液にｔｅｒｔ−ブチル（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−セリナート（Ｂｏｃ−Ｓｅｒ−ＯｔＢｕ）（２０．０ｇ、７６．５４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１００ｍＬ）を滴下し１時間撹拌した。その後、反応液を２０度にて更に１時間撹拌した後、反応液を飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液で洗浄した。得られた水層をジクロロメタンで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧濃縮した。得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、（Ｒ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−ヨードプロパン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ａａ８５）（２０．０ｇ、７０％）を得た。
亜鉛（２．５８８ｇ、４０．４４ｍｍｏｌ）を真空にて熱し、乾燥させた。その後、窒素雰囲気下、脱水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１５ｍＬ）を加えた後にヨウ素（０．５１４ｇ、２．０２ｍｍｏｌ）を加えた。そこへ（Ｒ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−ヨードプロパン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ａａ８５）（５．０ｇ、１３．４７ｍｍｏｌ）とヨウ素（０．５１４ｇ、２．０２ｍｍｏｌ）を加え、２０度にて２時間撹拌した。反応液に２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’，４’，６’−トリイソプロピルビフェニル（Ｘｐｈｏｓ）（０．３２１ｇ、０．６７ｍｍｏｌ），トリス（ジベンジリデンアセトン）二パラジウム（０）（Ｐｄ２（ｄｂａ）３）（０．３４９ｇ、０．３４ｍｍｏｌ），５−ブロモ−Ｎ，Ｎ−ジメチルピリジン−２−アミン（３．６０８ｇ、１７．９４ｍｍｏｌ）を加え５０度にて１６時間撹拌した。室温にて反応液に酢酸エチルを加え、水、飽和食塩水でそれぞれ３回洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（６−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル）プロパン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ａａ８６、Ｂｏｃ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ−４−ＮＭｅ２）−ＯｔＢｕ）（３．５ｇ、７１％）を得た。
得られた（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（６−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル）プロパン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ａａ８６、Ｂｏｃ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ−４−ＮＭｅ２）−ＯｔＢｕ）（１０．０ｇ、２７．３６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１２０ｍＬ）に塩化水素ガスを注入し、室温にて２時間撹拌した。沈殿した粗生成物をろ過で回収し、ジクロロメタンで洗浄、乾燥させる事で（Ｓ）−２−アミノ−３−（６−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル）プロパン酸の塩酸塩（化合物ａａ８７、Ｈ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ−４−ＮＭｅ２）−ＯＨ・ＨＣｌ）（６．７ｇ）を定量的に得た。
（Ｓ）−２−アミノ−３−（６−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル）プロパン酸の塩酸塩（化合物ａａ８７、Ｈ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ−４−ＮＭｅ２）−ＯＨ・ＨＣｌ）（６．７ｇ、２７．２７ｍｍｏｌ）を１０％炭酸カリウム水溶液（１５０ｍＬ）に溶解し、そこへＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（９．２ｇ、２７．２７ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液（７０ｍＬ）を滴下し室温にて９０分撹拌した。反応溶液に水（１００ｍＬ）を加え、ジエチルエーテルで３回洗浄した。得られた水層のｐＨを硫酸水素カリウム水溶液を用いて３から５に調節した後、酢酸エチルで３回抽出を行った。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧濃縮して得た残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール）にて精製し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（６−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル）プロパン酸（化合物ａａ８８、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ−４−ＮＭｅ２）−ＯＨ））（３．９ｇ、３３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ４３２ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．５５分（分析条件ＥＬＳＤ２）
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−ペンチルグリシン（化合物ａａ８９、Ｆｍｏｃ−ｎＰｅｎＧｌｙ−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
ペンタン−１−アミン（１８．９ｇ、２１６．９５ｍｍｏｌ）の水溶液（４５０ｍＬ）に２−ブロモ酢酸（１０．０ｇ、７１．９７ｍｍｏｌ）の水溶液（５０ｍＬ）を０度にて加えた後、８Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（３６ｍＬ）を０度にて滴下しながら加えた。反応液を室温で１６時間攪拌させた後、溶媒を１００ｍＬ程度になるまで減圧下留去した。得られた溶液を濃塩酸を用いてｐＨ＝７になるまで中和することで、２−（ペンチルアミノ）酢酸の溶液を得た。得られた溶液に炭酸カリウム（３８ｇ、２７４．９４ｍｍｏｌ）とＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（５１ｇ、１５１．３４ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液（１５０ｍＬ）を室温にて加え、１６時間撹拌した。反応液をｔ−ブチルメチルエーテル／ヘキサン（１／３）で希釈した後、ろ過を行い、得られたろ液をｔ−ブチルメチルエーテル／ヘキサン（１／３）で３回洗浄した。その後、ｐＨ＝１．０になるまで水層に塩酸を加え、酢酸エチルで３回抽出後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらに真空ポンプで乾燥させた。得られた残渣を逆相クロマトグラフィー（水／アセトニトリル）により精製することでＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−ペンチルグリシン（化合物ａａ８９、Ｆｍｏｃ−ｎＰｅｎＧｌｙ−ＯＨ）（５．４４７ｇ、２工程１１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ３６８ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−ヘキシルグリシン（化合物ａａ９０、Ｆｍｏｃ−ｎＨｅｘＧｌｙ−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
ヘキサン−１−アミン（２１．９６ｇ、２１７．０２ｍｍｏｌ）の水溶液（５００ｍＬ）に２−ブロモ酢酸（１０．０ｇ、７１．９７ｍｍｏｌ）の水溶液（５０ｍＬ）を０度にて加えた後、８Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（３６ｍＬ）を０度にて滴下しながら加えた。反応液を室温で１６時間攪拌させた後、溶媒を１００ｍＬ程度になるまで減圧下留去した。得られた溶液を濃塩酸を用いてｐＨ＝７になるまで中和し、得られた溶液に炭酸カリウム（３２．１ｇ、２３０．５８ｍｍｏｌ）とＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（４３．１ｇ、１２７．８９ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液（１２５ｍＬ）を室温にて加え、１６時間撹拌した。反応液をｔ−ブチルメチルエーテル／ヘキサン（１／３）で希釈した後、ろ過を行い、得られたろ液をｔ−ブチルメチルエーテル／ヘキサン（１／３）で３回洗浄した。その後、ｐＨ＝１．０になるまで水層に塩酸を加え、酢酸エチルで３回抽出後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらに真空ポンプで乾燥させた。得られた残渣を逆相クロマトグラフィー（水／アセトニトリル）により精製することでＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−ヘキシルグリシン（化合物ａａ９０、Ｆｍｏｃ−ｎＨｅｘＧｌｙ−ＯＨ）（５．０８ｇ、２工程１９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ３８２ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−（２−エトキシエチル）グリシン（化合物ａａ９１、Ｆｍｏｃ−（ＥｔＯＥｔ）ＮＧｌｙ−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
２−エトキシエタン−１−アミン（２０．０ｇ、２２４．３８ｍｍｏｌ）の水溶液（４５０ｍＬ）に２−ブロモ酢酸（１０．０ｇ、７１．９７ｍｍｏｌ）の水溶液（５０ｍＬ）を０度にて加えた後、８Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（３６ｍＬ）を０度にて滴下しながら加えた。反応液を室温で１６時間攪拌させた後、溶媒を１００ｍＬ程度になるまで減圧下留去した。得られた溶液を濃塩酸を用いてｐＨ＝７になるまで中和し、得られた溶液に炭酸カリウム（２０．０ｇ、１４４．７１ｍｍｏｌ）とＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（２６．０ｇ、７７．１５ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液（１００ｍＬ）を室温にて加え、１６時間撹拌した。反応液をｔ−ブチルメチルエーテル／ヘキサン（１／３）で希釈した後、ろ過を行い、得られたろ液をｔ−ブチルメチルエーテル／ヘキサン（１／３）で３回洗浄した。その後、ｐＨ＝１．０になるまで水層に塩酸を加え、酢酸エチルで３回抽出後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させた。得られた残渣を逆相クロマトグラフィー（水／アセトニトリル）により精製することでＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−（２−エトキシエチル）グリシン（化合物ａａ９１、Ｆｍｏｃ−（ＥｔＯＥｔ）ＮＧｌｙ−ＯＨ）（１３．０ｇ、２工程４９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ３７０ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−（２−フェノキシエチル）グリシン（化合物ａａ９２、Ｆｍｏｃ−（ＰｈＯＥｔ）ＮＧｌｙ−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
２−フェノキシエタン−１−アミン（２９．８ｇ、２１７．２３ｍｍｏｌ）の水溶液（４５０ｍＬ）に２−ブロモ酢酸（１０．０ｇ、７１．９７ｍｍｏｌ）の水溶液（５０ｍＬ）を０度にて加えた後、８Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（３６ｍＬ）を０度にて滴下しながら加えた。反応液を室温で１６時間攪拌させた後、溶媒を１００ｍＬ程度になるまで減圧下留去した。得られた溶液を濃塩酸を用いてｐＨ＝７になるまで中和し、得られた溶液に炭酸カリウム（２０．０ｇ、１４４．７１ｍｍｏｌ）とＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（２６．０ｇ、７７．１５ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液（１００ｍＬ）を室温にて加え、１６時間撹拌した。反応液をｔ−ブチルメチルエーテル／ヘキサン（１／３）で希釈した後、ろ過を行い、得られたろ液をｔ−ブチルメチルエーテル／ヘキサン（１／３）で３回洗浄した。その後、ｐＨ＝１．０になるまで水層に塩酸を加え、酢酸エチルで３回抽出後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させた。得られた残渣を逆相クロマトグラフィー（水／アセトニトリル）により精製することでＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−（２−フェノキシエチル）グリシン（化合物ａａ９２、Ｆｍｏｃ−（ＰｈＯＥｔ）ＮＧｌｙ−ＯＨ）（５．３６ｇ、２工程１４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ４１８ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
ｔｅｒｔ−ブチルＮ２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ５，Ｎ５−ジメチル−Ｌ−グルタミナート（化合物ａａ９３、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｍｅ２）−ＯｔＢｕ）の合成
Figure 2018225864
氷冷下、（Ｓ）−４−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−５−オキソペンタン酸（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）（４．００ｇ、９．４０ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（１．４０ｇ、１０．３ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（３１ｍＬ）溶液に、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ・ＨＣｌ）（２．１６ｇ、１１．３ｍｍｏｌ）、ジメチルアミン塩酸塩（０．７６７ｇ、９．４０ｍｍｏｌ）およびＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１．６４ｍＬ、９．４０ｍｍｏｌ）を加え、室温で９０分攪拌した。反応液をヘキサン／酢酸エチル（１／１、１００ｍＬ）で希釈し、有機層を飽和食塩水／水（１：１、７５ｍＬ）で洗浄した。水層をヘキサン／酢酸エチル（１／１）で抽出し、すべての有機層を混ぜて減圧下溶媒留去し、ｔｅｒｔ−ブチルＮ２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ５，Ｎ５−ジメチル−Ｌ−グルタミナート（化合物ａａ９３、５．７９ｇ）を粗生成物として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４５３ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６３分（分析条件ＳＱＤＡＡ５０）
Ｎ２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ５，Ｎ５−ジメチル−Ｌ−グルタミン（化合物ａａ９４、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｍｅ２）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、ｔｅｒｔ−ブチルＮ２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ５，Ｎ５−ジメチル−Ｌ−グルタミナート（化合物ａａ９３、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｍｅ２）−ＯｔＢｕ）（４．２５ｇ、９．３９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（ＤＣＭ）（４．７０ｍＬ）溶液を氷冷し、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１４．５ｍＬ、１８８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。減圧下溶媒留去し、得られた粗生成物を逆相カラムクロマトグラフィ−（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、Ｎ２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ５，Ｎ５−ジメチル−Ｌ−グルタミン（化合物ａａ９４、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｍｅ２）−ＯＨ）（３．４５ｇ、９３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３９７ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４０分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）
（Ｓ）−４−（３−（ジメチルアミノ）−３−オキソプロピル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ９５）の合成
Figure 2018225864
Ｎ２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ５，Ｎ５−ジメチル−Ｌ−グルタミン（化合物ａａ９４、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｍｅ２）−ＯＨ）（１３ｇ、３２．８ｍｍｏｌ）のトルエン（３２５ｍＬ）溶液に、パラホルムアルデヒド（１．９８ｇ、６５．６ｍｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルホン酸（３３８ｍｇ、１．９６ｍｍｏｌ）を加え、１１０度で１６時間攪拌した。反応液を炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下溶媒留去して（Ｓ）−４−（３−（ジメチルアミノ）−３−オキソプロピル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ９５）（１１．８ｇ）を粗生成物として得た
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４０９ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９２分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ２２）
Ｎ２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ２，Ｎ５，Ｎ５−トリメチル−Ｌ−グルタミン（化合物ａａ９６、Ｆｍｏｃ−ＭｅＧｌｎ（Ｍｅ２）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−４−（３−（ジメチルアミノ）−３−オキソプロピル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ９５）（１３ｇ、３１．８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（ＤＣＭ）（２２０ｍＬ）溶液に、トリエチルシラン（１１．１ｇ，９５．５ｍｍｏｌ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（２２０ｍＬ）を加え、室温にて３日間撹拌した。減圧下溶媒留去し、残渣に炭酸カリウム水溶液を加え、ヘキサンで洗浄した。水層を５％塩酸水でｐＨを２から３の範囲内に調整し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒留去した。得られた残渣をメタノールに溶解し、ヘキサンで洗浄した。メタノール層を減圧下溶媒留去し、Ｎ２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ２，Ｎ５，Ｎ５−トリメチル−Ｌ−グルタミン（化合物ａａ９６、Ｆｍｏｃ−ＭｅＧｌｎ（Ｍｅ２）−ＯＨ）（１２．０ｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４１１ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．３８分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ３３）
ｔｅｒｔ−ブチルＮ２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ５−メチル−Ｌ−グルタミナート（化合物ａａ９７、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｍｅ）−ＯｔＢｕ）の合成
Figure 2018225864
氷冷下、（Ｓ）−４−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−５−オキソペンタン酸（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）（２０．０ｇ、４７．０ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）（８．８ｇ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（３００ｍＬ）溶液に、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ・ＨＣｌ）（１３．５ｇ）を加え、１０分間撹拌した。反応液の温度を５度以下に保ちつつ、２ｍｏｌ／Ｌのメチルアミンのテトラヒドロフラン溶液（２９．５ｍＬ）を加え、室温で１６時間攪拌した。反応液をヘキサン／酢酸エチル（１／１、１４００ｍＬ）と塩化アンモニウム水溶液（５００ｍＬ）で希釈し、有機層を分離した。有機層を炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒留去し、ｔｅｒｔ−ブチルＮ２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ５−メチル−Ｌ−グルタミナート（化合物ａａ９７、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｍｅ）−ＯｔＢｕ）（３６．２ｇ）を粗生成物として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４３９ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．０５分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ２３）
Ｎ２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ５−メチル−Ｌ−グルタミン（化合物ａａ９８、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｍｅ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
ｔｅｒｔ−ブチルＮ２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ５−メチル−Ｌ−グルタミナート（化合物ａａ９７、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｍｅ）−ＯｔＢｕ）（４３．６ｇ）のジクロロメタン（ＤＣＭ）（３００ｍＬ）溶液に、氷冷下、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（３００ｍＬ）を滴下し、室温で１６時間攪拌した。減圧下溶媒留去し、得られた残渣にジエチルエーテルと炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、有機相を分離した。得られた水層を５ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液でｐＨを１から２の間に調整し、沈殿した固体をろ取し、Ｎ２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ５−メチル−Ｌ−グルタミン（化合物ａａ９８、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｍｅ）−ＯＨ）（２６．７ｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３８３ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．７５分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ５）
（Ｓ）−３−（３−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−５−オキソオキサゾリジン−４−イル）プロパン酸（化合物ａａ９９）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−グルタミン酸（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯＨ、ＣＡＳ番号１２１３４３−８２−６）（２ｇ、５．４１ｍｍｏｌ）、パラホルムアルデヒド（０．６５ｇ、２１．７ｍｍｏｌ）、（＋）−１０−カンファースルホン酸（０．６９ｍｇ、０．２９８ｍｍｏｌ）のトルエン（１６ｍｌ）懸濁液を、７５度で６時間１５分撹拌した。室温に冷却し、炭酸水素ナトリウム（２５ｍｇ、０．２９８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０時間撹拌した。酢酸エチル（１５ｍｌ）を加え、セライトろ過し、ろ液に飽和食塩水／水（１／１、５ｍｌ）を加え、酢酸エチルで２回抽出した。有機層を飽和食塩水／水（１／１、５ｍｌ）で２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒留去して（Ｓ）−３−（３−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−５−オキソオキサゾリジン−４−イル）プロパン酸（化合物ａａ９９）（２．３１ｇ）を粗生成物として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３８２ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−４−（３−（メチルアミノ）−３−オキソプロピル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ１００）の合成
Figure 2018225864
氷冷下で（Ｓ）−３−（３−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−５−オキソオキサゾリジン−４−イル）プロパン酸（化合物ａａ９９）（２．３０ｇ、６．０３ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（７．０ｍＬ）溶液に、Ｏ−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ）（２．５２ｇ、６．６３ｍｍｏｌ）、メチルアミン（２ｍｏｌ／Ｌテトラヒドロフラン溶液、３．０２ｍＬ、６．０３ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．５２７ｍＬ、３．０２ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下３時間攪拌した。反応液を酢酸エチルとヘキサンで希釈し、５ｍｏｌ／Ｌ塩酸水溶液でｐＨを１に調整した。飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで２回抽出し、得られた有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液／水（１／１）で２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒留去した。得られた粗生成物を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製し、（Ｓ）−４−（３−（メチルアミノ）−３−オキソプロピル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ１００）（２．４０ｇ）を定量的に得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３９５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｎ２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ２，Ｎ５−ジメチル−Ｌ−グルタミン（Ｆｍｏｃ−ＭｅＧｌｎ（Ｍｅ）−ＯＨ）（化合物ａａ１０１）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気、氷冷下、４−（３−（メチルアミノ）−３−オキソプロピル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（Ｓ）−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ１００）（２．４０ｇ、６．０８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（ＤＣＭ）（１５ｍＬ）溶液に、トリエチルシラン（Ｅｔ３ＳｉＨ）（２．９２ｍＬ、１８．３ｍｍｏｌ）および三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（ＢＦ３・ＯＥｔ２）（１．５４ｍＬ、１２．２ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２４時間撹拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液／水（１／１、５ｍＬ）を加え、ジクロロメタンで抽出した。有機層を飽和食塩水／水（１／１、５ｍＬ）で２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒留去した。得られた粗生成物を逆相カラムクロマトグラフィーで精製し、Ｎ２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ２，Ｎ５−ジメチル−Ｌ−グルタミン（化合物ａａ１０１、Ｆｍｏｃ−ＭｅＧｌｎ（Ｍｅ）−ＯＨ）（４９１ｍｇ、２０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３９７ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
２−ブロモーＮ−ｔｅｒｔ−ブチルアセトアミド（化合物ａａ１０２）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、２−ブロモ酢酸（５０．０ｇ、３６０ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（８０．０ｍＬ）溶液に、２−メチルプロパンー２−アミン（２６．７ｇ、３６５ｍｍｏｌ）、Ｎ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（１３９ｇ、１．０８ｍｏｌ）およびプロピルホスホン酸無水物（Ｔ３Ｐ）（２２９ｇ、７２０ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２時間攪拌した。反応液に水を加え酢酸エチルで２回抽出し、得られた有機層を混合し、飽和食塩水で有機層を洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、得られた残渣をヘキサンで洗浄し、２−ブロモーＮ−ｔｅｒｔ−ブチルアセトアミド（化合物ａａ１０２、３６．５ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
Ｏ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−トリチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０３、Ｔｒｔ−Ｓｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、トリチル−Ｌ−セリン（Ｔｒｔ−Ｓｅｒ−ＯＨ）のトリエチルアミン塩（１．５０ｇ、４．３２ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２．００ｍＬ）溶液に、水素化ナトリウム（０．５２ｇ、１３．０ｍｍｏｌ、６０％オイルディスパージョン）を加え、室温で２時間撹拌した。そこへ２−ブロモーＮ−ｔｅｒｔ−ブチルアセトアミド（化合物ａａ１０２）（０．９６ｇ）のＤＭＦ（１．００ｍＬ）溶液を加え、室温で１時間撹拌した。反応液に水を加え酢酸エチルで２回抽出し、得られた有機層を混合し、飽和食塩水で有機層を洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させ、Ｏ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−トリチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０３、Ｔｒｔ−Ｓｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ）（１．６０ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０４、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｏ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−トリチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０３、Ｔｒｔ−Ｓｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ）（１５．３ｇ、３３．２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１５０ｍＬ）／水（１５０ｍＬ）溶液に、４度にてトリフルオロ酢酸（１１．２ｇ、９９．１ｍｍｏｌ）を加え同温度において２時間攪拌した。水層を分離し、Ｎ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）をｐＨ７になるまで加えた。そこへ１，４−ジオキサン（１５０ｍＬ）を加えたのち、Ｎ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（１４．９ｇ、１１５ｍｍｏｌ）およびＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（２２．３ｇ、２３１ｍｍｏｌ）を加え、２５度で１６時間撹拌した。反応液に水を加え、ヘキサンで２回洗浄したのち、水層に濃塩酸をｐＨ２になるまで加え、酢酸エチルで２回抽出した。得られた有機層を混合し、飽和食塩水で有機層を洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し得られた残渣を、逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製しＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０４、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ）（１４．２ｇ、９８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４４１ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．０８分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ９）
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０５、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０４、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ）（１．０ｇ、２．２７０ｍｍｏｌ）、パラホルムアルデヒド（２０３ｍｇ、６．８１ｍｍｏｌ）、（（１Ｓ，４Ｒ）−７，７−ジメチル−２−オキソビシクロ［２．２．１］ヘプタン−１−イル）メタンスルホン酸（２６ｍｇ、０．１１４ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（１．２ｍＬ）を８０度にて１時間撹拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで３回抽出し、飽和食塩水で洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、ろ過、減圧濃縮することで、（Ｓ）−４−（（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエトキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（１．０３５ｇ）を粗生成物として得た。
窒素雰囲気下、上述の粗生成物である（Ｓ）−４−（（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエトキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（１．０３５ｇ）のジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液（２．８６ｍＬ）にトリエチルシラン（Ｅｔ３ＳｉＨ）（１．０９６ｍＬ、６．８６ｍｍｏｌ）と水（４０μＬ）を加え室温にて２分間撹拌した後、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（ＢＦ３・ＯＥｔ２）（０．５８０ｍＬ、４．５７ｍｍｏｌ）を加え、２４時間室温にて撹拌した。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、室温で４０分撹拌した後、ジクロロメタン（ＤＣＭ）で２回抽出した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮することで得られた残渣にアセトニトリルを加え、ヘキサンで洗浄した。アセトニトリルを減圧下留去することで、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０５、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ）（０．９４４９ｇ、２工程９２％）を得た
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ４５５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−エチル−Ｎ−メチル−Ｌ−ホモセリン（化合物ａａ１０６、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｓｅ（Ｅｔ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、市販のＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−エチル−Ｌ−ホモセリン（Ｆｍｏｃ−Ｈｓｅ（Ｅｔ）−ＯＨ、渡辺化学工業より購入）（３００ｍｇ、０．８１２ｍｍｏｌ）とパラホルムアルデヒド（７３．２ｍｇ、２．４３６ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（２．５ｍＬ）にトリフルオロ酢酸（０．５６３ｍＬ、７．３１ｍｍｏｌ）を室温にて加え、６時間撹拌した。反応液を濃縮し、ジクロロメタンで希釈した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、ろ過、減圧濃縮することで、（Ｓ）−４−（２−エトキシエチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（３２３ｍｇ）を粗生成物として得た。
上述の粗生成物である（Ｓ）−４−（２−エトキシエチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）（３１０ｍｇ）のジクロロエタン（ＤＣＥ）溶液（４．０ｍＬ）にトリエチルシラン（Ｅｔ３ＳｉＨ）（１．１６８ｍＬ、７．３１ｍｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（１．６９１ｍＬ、２１．９４ｍｍｏｌ）を室温にて加え、反応液を６０度で８時間３０分撹拌した。反応液を室温にて冷却した後、減圧濃縮することで得られた残渣をヘキサン／酢酸エチル＝４／１で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回抽出した。得られた水層の液性を１Ｎ塩酸水溶液を用いて酸性にした後、酢酸エチルで３回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧濃縮することで、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−エチル−Ｎ−メチル−Ｌ−ホモセリン（化合物ａａ１０６、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｓｅ（Ｅｔ）−ＯＨ）（１０１ｍｇ、２工程３３％）を得た
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ３８４ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−６−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ヘキサン酸（化合物ａａ１０７、Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ（６−ＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
市販で購入した（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−６−ヒドロキシヘキサン酸（Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ（６−ＯＨ）−ＯＨ）（３ｇ、８．１２ｍｍｏｌ）とｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ）（４０８ｍｇ、１．６２ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（１０ｍＬ）を減圧濃縮し共沸脱水をおこなった。得られた残渣をテトラヒドロフラン（１５ｍＬ）に溶解しジヒドロピラン（５．４１ｍＬ、５６．８ｍｍｏｌ）を加え５０度にて１時間撹拌した。室温下、反応液に酢酸エチルを加え飽和食塩水で２回有機層を洗浄した後、得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、減圧濃縮した。得られた残渣をテトラヒドロフラン（３０ｍＬ）に溶解し、ｐＨを８に調整したリン酸緩衝液（３０ｍＬ）を加え５０度にて３時間撹拌した。室温下、反応液を酢酸エチルで２度抽出を行い、得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、減圧濃縮した。得られた残渣をジエチルエーテル（５０ｍＬ）に溶解し、そこへヘプタン（５０ｍＬ）を加える事で粗生成物を沈殿させ、減圧濃縮を行う事でジエチルエーテルを除去し、残った上澄み溶液をデカンテーションにて取り除いた。この作業を２度繰り返す事で粗生成物を得た。得られた粗生成物をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（１５０ｍＬ）に溶解し、０．０５Ｍリン酸溶液（１５０ｍＬ）を加え室温にて１時間撹拌した。有機層を回収し、酢酸エチルで水層を抽出した。得られた有機層を合わせその後、飽和食塩水で２回洗浄し、得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、減圧濃縮し、（２Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−６−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ヘキサン酸（化合物ａａ１０７、Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ（６−ＯＴＨＰ）−ＯＨ）（２．９２５ｇ、７９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ４５４ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）−４−オキソブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ａａ１０８、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯｔＢｕ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ・ＨＣｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（１２ｍＬ）に０度で１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（７２３ｍｇ、５．３５ｍｍｏｌ）と市販で購入した（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−４−オキソブタン酸（Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−ＯｔＢｕ）（２ｇ、４．８６ｍｍｏｌ）を加え１時間撹拌した。反応液に４，４−ジフルオロピペリジン塩酸塩（８４３ｍｇ、５．３５ｍｍｏｌ）とＮ−エチル−Ｎ−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（９３１μＬ、５．３５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（２ｍＬ）を加え０度で３時間撹拌した。反応液に水を加え酢酸エチルで２回抽出した。有機層を合わせたものを０．５Ｍ塩酸水溶液、水、５０％炭酸水素ナトリウム水溶液、５０％食塩水で洗浄後、得られた有機層を減圧濃縮する事で（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）−４−オキソブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ａａ１０８、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯｔＢｕ）（２．６３５ｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ５１５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）ブタン酸（化合物ａａ１０９、Ｆｍｏｃ−Ａｂｕ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、三ルテニウムドデカカルボニル（６２ｍｇ、０．０９７ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（５ｍＬ）に１，１，３，３−テトラメチルジシロキサン（２．７６ｍＬ，１５．５５ｍｍｏｌ）を加え室温にて１０分間撹拌した。反応液にテトラヒドロフラン（７ｍＬ）に溶解した（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）−４−オキソブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ａａ１０８、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯｔＢｕ）（１．０ｇ、１．９４３ｍｍｏｌ）を加え、５０度にて３時間撹拌した後、反応液を減圧濃縮した。得られた残渣を２，２，２−トリフルオロエタノール（１０ｍＬ）に溶解し、トリメチルクロロシラン（７４５μＬ、５．８３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応液を減圧濃縮した後、得られた残渣を１，４−ジオキサン（５ｍＬ）と２Ｎ塩酸水溶液（１０ｍＬ）に溶解し、室温で１時間撹拌した。反応液をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルで２回抽出し、有機層を減圧濃縮した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）ブタン酸（化合物ａａ１０９、Ｆｍｏｃ−Ａｂｕ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ））（５４０ｍｇ、６３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ４４５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）ブタン酸（化合物ａａ１１０、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）ブタン酸（化合物ａａ１０９、Ｆｍｏｃ−Ａｂｕ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ））（１３ｇ、９．２５ｍｍｏｌ）、パラホルムアルデヒド（２．６ｇ、２８．８６ｍｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（３０．５９ｇ、２６３．７１ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（６０ｍＬ）を室温で１６時間撹拌した。反応液を減圧濃縮した後、ジクロロメタンに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で洗浄した後、得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、減圧濃縮した。得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、中間体である（Ｓ）−４−（２−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）エチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（１０．９ｇ、８２％）を得た。得られた中間体（６ｇ、１３．１４ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（６５ｍＬ）とジクロロエタン（６５ｍＬ）に溶解し室温にてトリエチルシラン（１３．５ｇ、１１６．１ｍｍｏｌ）を加え、７０度にて４時間撹拌した。反応液を室温に戻した後、減圧濃縮し得られた残渣をジクロロメタンに溶解した。有機層を水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、減圧濃縮した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．５％塩酸水溶液／０．５％塩酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）ブタン酸（化合物ａａ１１０、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）（４．０ｇ、６６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ４５９ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：２．７１分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ２８）
１−ベンジル−３，３−ジフルオロピペリジン（化合物ａａ１１１）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、１−ベンジルピペリジン−３−オン（６０ｇ、３１７．０３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液に０度にてジメチルアミノ三フッ化硫黄（ＤＡＳＴ）（１５０ｇ、４．０４ｍｏｌ）を加え２時間撹拌した。その後、反応液に３００ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルにて３回抽出を行い、有機層を合わせた物を飽和食塩水で洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過を行い、得られた有機層を減圧濃縮することで粗生成物である１−ベンジル−３，３−ジフルオロピペリジン（化合物ａａ１１１）（３１ｇ、４６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ２１２ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９４分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ３１）
（Ｓ）−２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（３，３−ジフルオロピペリジン−１−イル）ブタン酸ベンジル（化合物ａａ１１３、Ｃｂｚ−ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ−３−Ｆ２）−ＯＢｎ）の合成
Figure 2018225864
得られた粗生成物１−ベンジル−３，３−ジフルオロピペリジン（化合物ａａ１１１）を２００ｍＬのメタノールに溶解し、１０％パラジウム／炭素（１ｇ）を加え、水素雰囲気下室温にて４８時間撹拌した。反応液をろ過し、得られたろ液を減圧濃縮する事で３，３−ジフルオロピペリジン（化合物ａａ１１２）（１９ｇ）を粗生成物として得た。
別途合成した、（Ｓ）−２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（エチルチオ）−４−オキソブタン酸ベンジル（化合物ａａ１１４、Ｃｂｚ−ＭｅＡｓｐ（ＳＥｔ）−ＯＢｎ）（２０ｇ、４８．１３ｍｍｏｌ）、３，３−ジフルオロピペリジン（化合物ａａ１１２）（８．２６ｇ、６８．１９ｍｍｏｌ）、トリエチルシラン（４０ｍＬ）、１０％パラジウム／炭素（２．６ｇ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（２０ｍＬ）に０度にてナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３）（２０．４ｇ、２０４ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３０分間撹拌した。反応液をろ過、減圧濃縮することで得た粗生成物を順相シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）にて精製し、（Ｓ）−２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（３，３−ジフルオロピペリジン−１−イル）ブタン酸ベンジル（化合物ａａ１１３、Ｃｂｚ−ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ−３−Ｆ２）−ＯＢｎ）（１１ｇ、５０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ４６１ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．４２分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ３２）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（３，３−ジフルオロピペリジン−１−イル）ブタン酸（化合物ａａ１１６、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ−３−Ｆ２）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（３，３−ジフルオロピペリジン−１−イル）ブタン酸ベンジル（化合物ａａ１１３、Ｃｂｚ−ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ−３−Ｆ２）−ＯＢｎ）（２０ｇ、４３．４３ｍｍｏｌ）を３３％臭化水素酢酸溶液に溶解し、室温にて２時間撹拌した後、５０度にてさらに１時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮することで得た残渣をジエチルエーテルにて沈殿させ、（２Ｓ）−４−（３，３−ジフルオロピペリジン−１−イル）−２−（メチルアミノ）ブタン酸の臭化物（化合物ａａ１１５）（２９ｇ）を粗生成物として得た。
上述の粗生成物である（２Ｓ）−４−（３，３−ジフルオロピペリジン−１−イル）−２−（メチルアミノ）ブタン酸の臭化物（化合物ａａ１１５）（７．０８ｇ、２９．９７ｍｍｏｌ）とＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（１６ｇ、４７．４８ｍｍｏｌ）を炭酸カリウムの水／１，４−ジオキサン溶液＝１／１（３００ｍＬ）に溶解し室温にて４時間撹拌した。その後反応液をジエチルエーテルにて３回洗浄し、塩酸で水層のｐＨを３に調節し、酢酸エチルにて２度抽出した。得られた有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧濃縮し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（１０ｍｍｏｌ炭酸水素アンモニウム水溶液／アセトニトリル）にて精製し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（３，３−ジフルオロピペリジン−１−イル）ブタン酸（化合物ａａ１１６、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ−３−Ｆ２）−ＯＨ））（７．２ｇ、７１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ４５９ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．６１分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ５）
（Ｓ）−２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（エチルチオ）−４−オキソブタン酸（化合物ａａ１１９、Ｃｂｚ−ＭｅＡｓｐ（ＳＥｔ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−アスパラギン酸（Ｃｂｚ−Ａｓｐ−ＯＨ）（２００ｇ、７４８．４１ｍｍｏｌ）とパラホルムアルデヒド（６７．５ｇ、７４９．３５ｍｍｏｌ）とｐ−トルエンスルホン酸（７．７４ｇ、４４．９５ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（２０００ｍＬ）を１１０度に昇温し、３日間撹拌した。反応液を室温にした後、水を加え酢酸エチルにて３回抽出した。合わせた有機層を飽和食塩水で洗浄し、得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、ろ過、減圧濃縮することで、（Ｓ）−２−（３−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−オキソオキサゾリジン−４−イル）酢酸（化合物ａａ１１７）を粗生成物として得た（２００ｇ）。
上述と同様の方法で合成した（Ｓ）−２−（３−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−オキソオキサゾリジン−４−イル）酢酸（化合物ａａ１１７）（２６５ｇ、９４８．９９ｍｍｏｌ）の粗生成物とエタンチオール（８８．３ｇ、１．４２ｍｏｌ）と４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（１１．５９ｇ、９５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液に０度にてＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（２１４ｇ、１．０４ｍｏｌ）を加え、室温にて５時間撹拌した。反応溶液をろ過し、得られたろ液を飽和食塩水で洗浄し、得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、ろ過、減圧濃縮した。得られた粗生成物を順相シリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、（Ｓ）−４−（２−（エチルチオ）−２−オキソエチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸ベンジル（化合物ａａ１１８）（１６７ｇ）の混合物を得た。
得られた（Ｓ）−４−（２−（エチルチオ）−２−オキソエチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸ベンジル（化合物ａａ１１８）（１３９ｇ、１．２０ｍｏｌ）のジクロロメタン（ＤＣＭ）とトリフルオロ酢酸溶液（１５００ｍＬ／１５００ｍＬ）にトリエチルシラン（１３９ｇ、１．２ｍｏｌ）を加え、室温にて３日間撹拌した。反応液を減圧濃縮し得られた残渣に炭酸カリウム水溶液を加え、ジエチルエーテルで３度洗浄した。得られた水層を２Ｎ塩酸水溶液でｐＨを３に調節したものに対して酢酸エチルで２度抽出した。合わせた有機層を飽和食塩水で洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、ろ過、減圧濃縮し、（Ｓ）−２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（エチルチオ）−４−オキソブタン酸（化合物ａａ１１９、Ｃｂｚ−ＭｅＡｓｐ（ＳＥｔ）−ＯＨ）（７５ｇ）の粗生成物を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ３２６ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．００分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ１６）
（Ｓ）−２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（エチルチオ）−４−オキソブタン酸ベンジル（化合物ａａ１１４、Ｃｂｚ−ＭｅＡｓｐ（ＳＥｔ）−ＯＢｎ）の合成
Figure 2018225864
室温下、（Ｓ）−２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（エチルチオ）−４−オキソブタン酸（化合物ａａ１１９、Ｃｂｚ−ＭｅＡｓｐ（ＳＥｔ）−ＯＨ）（３ｇ、９．２２ｍｍｏｌ）の粗生成物と炭酸カリウム（１．９ｇ、１３．６５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（４６ｍＬ）にベンジルブロミド（１．７３ｇ、１０．１１ｍｍｏｌ）を加え１６時間撹拌した後ろ過をした。得られたろ液を減圧濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、（Ｓ）−２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（エチルチオ）−４−オキソブタン酸ベンジル（化合物ａａ１１４、Ｃｂｚ−ＭｅＡｓｐ（ＳＥｔ）−ＯＢｎ）（１．５ｇ）を得た。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．３６−７．３１（ｍ，１０Ｈ），５．１９−４．８９（ｍ，５Ｈ），３．３４−２．８５（ｍ，７Ｈ），１．３０−１．２１（ｍ，３Ｈ）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−モルホリノブタン酸（化合物ａａ１２３、Ｆｍｏｃ−Ａｂｕ（Ｍｏｒ）−ＯＨ）の合成は、以下のスキームに従って行った。
Figure 2018225864
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（エチルチオ）−４−オキソブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ａａ１２０、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＳＥｔ）−ＯｔＢｕ）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−４−オキソブタン酸（Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−ＯｔＢｕ）（５ｇ、１２．１５ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（１４８ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ）およびエタンチオール（ＥｔＳＨ）（１．１３ｇ、１８．１９ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（ＤＣＭ）（５０ｍＬ）に溶解し、氷冷下でＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（２．７５６ｇ、１．３３７ｍｍｏｌ）を加えた。室温で５時間撹拌した後、固体をろ過により除去した。ろ液をジクロロメタン（ＤＣＭ）で希釈した後、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過、減圧濃縮した。得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（０〜４０％酢酸エチル／石油エーテル）で精製し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（エチルチオ）−４−オキソブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ａａ１２０、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＳＥｔ）−ＯｔＢｕ）（３．９ｇ、７０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４７８ （Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：３．１３分（分析条件 ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ１４）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−オキソブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ａａ１２１）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（エチルチオ）−４−オキソブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ａａ１２０、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＳＥｔ）−ＯｔＢｕ）（１ｇ、２．２０ｍｍｏｌ）をアセトン（４．４ｍＬ）に溶解し、Ｐｄ／Ｃ（ｗｅｔ、１０％、４４ｍｇ）を加えた。氷冷下、トリエチルシラン（１．２７６ｇ、１０．９７ｍｍｏｌ）を加えて１時間撹拌した。その後、ろ過によりＰｄ／Ｃを除去し、ろ液を減圧濃縮して得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（０〜６０％酢酸エチル／石油エーテル）で精製し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−オキソブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ａａ１２１）（６８０ｍｇ、７８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４１８ （Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：２．０７分（分析条件 ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ４０）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−モルホリノブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ａａ１２２、Ｆｍｏｃ−Ａｂｕ（Ｍｏｒ）−ＯｔＢｕ）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−オキソブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ａａ１２１）（１．６ｇ、４．０５ｍｍｏｌ）およびモルホリン（３８７ｍｇ、４．４４ｍｍｏｌ）をジクロロエタン（ＤＣＥ）（８ｍＬ）に溶解し、室温で１時間撹拌した。その後、氷冷下でナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３）（１．７１７ｇ、８．１０ｍｍｏｌ）のジクロロエタン（ＤＣＥ）（８ｍＬ）溶液を加え、４時間撹拌した。その後、反応液をジクロロメタンで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、減圧濃縮した。得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）で精製し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−モルホリノブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ａａ１２２、Ｆｍｏｃ−Ａｂｕ（Ｍｏｒ）−ＯｔＢｕ）（１．７ｇ、９８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４６７ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：２．０２分（分析条件 ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ４１）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−モルホリノブタン酸（化合物ａａ１２３、Ｆｍｏｃ−Ａｂｕ（Ｍｏｒ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−モルホリノブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ａａ１２２、Ｆｍｏｃ−Ａｂｕ（Ｍｏｒ）−ＯｔＢｕ）（９ｇ、１９．２９ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／ジクロロエタン（ＤＣＥ）（２５ｍＬ／２５ｍＬ）に溶解させ、４０度で２時間撹拌した。室温まで冷却後、反応液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過、減圧濃縮することで（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−モルホリノブタン酸（化合物ａａ１２３、Ｆｍｏｃ−Ａｂｕ（Ｍｏｒ）−ＯＨ）（７ｇ、９０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４１１ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．２０分（分析条件 ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ４２）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−モルホリノブタン酸（化合物ａａ１２５、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｂｕ（Ｍｏｒ）−ＯＨ）の合成は、以下のスキームに従って行った。
Figure 2018225864
（Ｓ）−４−（２−モルホリノエチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ１２４）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−モルホリノブタン酸（化合物ａａ１２３、Ｆｍｏｃ−Ａｂｕ（Ｍｏｒ）−ＯＨ）（６００ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）およびパラホルムアルデヒド（１３１．４ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）をトルエン（３ｍＬ）およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１．５２７ｇ、１３．１６ｍｍｏｌ）に懸濁させ、室温で１６時間撹拌した。その後、反応液を減圧濃縮し、得られた残渣をジクロロメタンで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で洗浄後した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、ろ液を減圧濃縮して得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）で精製し、（Ｓ）−４−（２−モルホリノエチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ１２４）（４８６ｍｇ、７９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４２３ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．１４分（分析条件 ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ４０）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−モルホリノブタン酸（化合物ａａ１２５、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｂｕ（Ｍｏｒ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−４−（２−モルホリノエチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ１２４）（４８６ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ）およびトリエチルシラン（１．５ｍＬ、１０．３５ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸／ジクロロエタン（１／１、１２ｍＬ）に溶解し、７０度で４時間撹拌した。室温まで冷却した後、反応液を減圧濃縮して得られた残渣をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、ろ液を減圧濃縮した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（５〜７０％ ０．５％塩酸水溶液／０．５％塩酸アセトニトリル溶液）で精製し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−モルホリノブタン酸（化合物ａａ１２５、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｂｕ（Ｍｏｒ）−ＯＨ）（４００ｍｇ、８２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４２５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．４０分（分析条件 ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ３４）
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−（２−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）エチル）グリシン（化合物ａａ１２６、Ｆｍｏｃ−（２−（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−Ｅｔ）Ｇｌｙ−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
２−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）エタン−１−アミン（０．８４２ｇ、５．１３ｍｍｏｌ）の水溶液（８．５ｍＬ）に２−ブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチル（０．３７８ｍＬ、２．５６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（１．７ｍＬ）を０度にて加えた後、室温にて終夜撹拌した。反応液に水（８．５ｍＬ）を加え、Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（１．３６５ｍＬ、７．６９ｍｍｏｌ）とＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（１．９０２ｇ、５．６４ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１時間撹拌した。反応液にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と０．１％ギ酸を含む２０％アセトニトリル水溶液を加え、減圧下テトラヒドロフランを除去した後、逆相クロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）により精製することでｔｅｒｔ−ブチルＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−（２−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）エチル）グリシナート（Ｆｍｏｃ−（２−（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−Ｅｔ）Ｇｌｙ−ＯｔＢｕ）（８７５ｍｇ）を得た。
上述のｔｅｒｔ−ブチルＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−（２−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）エチル）グリシナート（Ｆｍｏｃ−（２−（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−Ｅｔ）Ｇｌｙ−ＯｔＢｕ）（８７０ｍｇ）の２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）溶液（７．０ｍＬ）にクロロトリメチルシラン（ＴＭＳＣｌ）（０．６６６ｍＬ、５．２１ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１時間撹拌した。反応液を減圧濃縮した後、得られた残渣を逆相クロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）により精製することで、表題化合物とギ酸の混合物を得た。ギ酸を除くため、得られた混合物に４Ｎ塩酸／１，４−ジオキサンを加えロータリーエバポレーターを用いて濃縮する操作を６回繰り返し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−（２−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）エチル）グリシン（化合物ａａ１２６、Ｆｍｏｃ−（２−（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−Ｅｔ）Ｇｌｙ−ＯＨ）（７９８．７ｍｇ、３工程７０％）を塩酸塩として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ４４５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４，４−ジフルオロ−１−ピペリジル）−１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）ピロリジン−２−カルボン酸（化合物ａａ１３０、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）の合成は、以下のスキームに従って行った。
Figure 2018225864
（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−メチル１−（ｔｅｒｔ−ブチル）（化合物ａａ１２７、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＭｅ）の合成
Figure 2018225864
（２Ｓ，４Ｓ）−４−ヒドロキシピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−メチル１−ｔｅｒｔ−ブチル（Ｂｏｃ−ｃｉｓＨｙｐ−ＯＭｅ）（３０ｇ、１２２．３ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２７．２ｍＬ、１９５．７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３００ｍＬ）に溶解し、−４０度に冷却下でトリフルオロメタンスルホン酸無水物（Ｔｆ２Ｏ）（２４．８ｍＬ、１４６．８ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。１時間撹拌後、トリエチルアミン（７０ｍＬ、４８９．２ｍｍｏｌ）および４，４−ジフルオロピペリジンの塩酸塩（３８．４ｇ、３１７．０１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１００ｍＬ）溶液を加え、さらに３時間撹拌した。その後、反応液を飽炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ、ｔ−ブチルメチルエーテルで３回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過後、減圧濃縮することで（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−メチル１−（ｔｅｒｔ−ブチル）（化合物ａａ１２７、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＭｅ）（５２ｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３４９ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６２分（分析条件 ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ３５）
（２Ｓ，４Ｒ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−４−（４，４−ジフルオロ−１−ピペリジル）ピロリジン−２−カルボン酸（化合物ａａ１２８、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
水酸化リチウム（８．２５ｇ、３４４．４７ｍｍｏｌ）および塩化カルシウム（１４３ｇ、１．３０ｍｏｌ）を２−プロパノール（ｉＰｒＯＨ）（９００ｍＬ）および水（３００ｍＬ）に加え撹拌した後、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−メチル１−（ｔｅｒｔ−ブチル）（化合物ａａ１２７、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＭｅ）（５２ｇ、１４９．２６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（３００ｍＬ）溶液を添加し、室温で１６時間撹拌した。有機溶媒を減圧濃縮により除去し、得られた水層をｔ−ブチルメチルエーテルで洗浄した。その後、１Ｎ塩酸水溶液を加えて水層のｐＨを５〜６に調整し、酢酸エチルで３回抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、減圧濃縮して（２Ｓ，４Ｒ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−４−（４，４−ジフルオロ−１−ピペリジル）ピロリジン−２−カルボン酸（化合物ａａ１２８、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）（４８ｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３３５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８８ 分（分析条件 ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ１３）
（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４，４−ジフルオロ−１−ピペリジル）ピロリジン−２−カルボン酸（化合物ａａ１２９、Ｈ−Ｐｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（２Ｓ，４Ｒ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−４−（４，４−ジフルオロ−１−ピペリジル）ピロリジン−２−カルボン酸（化合物ａａ１２８、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）（４８ｇ、１４３．２８ｍｍｏｌ）を２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）（９００ｍＬ）に溶解し、クロロトリメチルシラン（ＴＭＳＣｌ）（６０ｇ、５７３．１２ｍｍｏｌ）を加えて室温で１時間撹拌した。その後、反応液を減圧濃縮することで（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４，４−ジフルオロ−１−ピペリジル）ピロリジン−２−カルボン酸（化合物ａａ１２９、Ｈ−Ｐｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）（３７．３ｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ２３５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．１３ 分（分析条件 ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ３６）
（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４，４−ジフルオロ−１−ピペリジル）−１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）ピロリジン−２−カルボン酸（化合物ａａ１３０、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４，４−ジフルオロ−１−ピペリジル）ピロリジン−２−カルボン酸（化合物ａａ１２９、Ｈ−Ｐｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）（３７．３ｇ，１５９．２３ｍｍｏｌ）、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（５６．４ｇ、１６７．１９ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（４４ｇ、３１８．４６ｍｍｏｌ）を水（３５０ｍＬ）および１，４−ジオキサン（２６０ｍＬ）に加えて室温で１６時間撹拌した。その後、２５％ｔ−ブチルメチルエーテルのヘキサン溶液で洗浄し、１Ｎ塩酸水溶液で水層のｐＨを１〜２に調整し、ｔ−ブチルメチルエーテルで３回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、ろ液を減圧濃縮した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（５〜６５％ 水／アセトニトリル）で精製し、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４，４−ジフルオロ−１−ピペリジル）−１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）ピロリジン−２−カルボン酸（化合物ａａ１３０、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）（４．５ｇ、４工程８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４５７ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：２．８３分（分析条件 ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ３７）
化合物ａａ１３３（Ｆｍｏｃ−ｃｉｓＰｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）の合成は、以下のスキームに従って行った。
Figure 2018225864
（２Ｓ，４Ｓ）−４−（４，４−ジフルオロ−１−ピペリジル）ピロリジン−１，２−ジカルボン酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ａａ１３１、Ｂｏｃ−ｃｉｓＰｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯｔＢｕ）の合成
Figure 2018225864
（２Ｓ）−４−オキソピロリジン−１，２−ジカルボン酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（２０ｇ、７０．０９ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（４００ｍＬ）およびジメチルスルホキシド（１２０ｍＬ）に溶解し、４，４−ジフルオロピペリジンの塩酸塩（１１ｇ、９０．８１ｍｍｏｌ）と酢酸（８ｍＬ）を加えた。室温で１時間撹拌した後、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３）（２９．８ｇ、１４０．６ｍｍｏｌ）を加え、６時間撹拌した。反応液を氷冷下の飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注いだ後、酢酸エチルで３回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、減圧濃縮することで（２Ｓ，４Ｓ）−４−（４，４−ジフルオロ−１−ピペリジル）ピロリジン−１，２−ジカルボン酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ａａ１３１、Ｂｏｃ−ｃｉｓＰｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯｔＢｕ）（５０ｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３９１ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７５分（分析条件 ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ３８）
（２Ｓ，４Ｓ）−４−（４，４−ジフルオロ−１−ピペリジル）ピロリジン−２−カルボン酸（化合物ａａ１３２、Ｈ−ｃｉｓＰｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（２Ｓ，４Ｓ）−４−（４，４−ジフルオロ−１−ピペリジル）ピロリジン−１，２−ジカルボン酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ａａ１３１、Ｂｏｃ−ｃｉｓＰｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯｔＢｕ）（５０ｇ、１２８．７０ｍｍｏｌ）を２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）（１０００ｍＬ）に溶解し、クロロトリメチルシラン（ＴＭＳＣｌ）（８０ｍＬ、６４３．５ｍｍｏｌ）を加えて１時間撹拌した。その後、反応液を減圧濃縮することで（２Ｓ，４Ｓ）−４−（４，４−ジフルオロ−１−ピペリジル）ピロリジン−２−カルボン酸（化合物ａａ１３２、Ｈ−ｃｉｓＰｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）（４５ｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ２３５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３３分（分析条件 ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ３９）
（２Ｓ，４Ｓ）−４−（４，４−ジフルオロ−１−ピペリジル）−１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）ピロリジン−２−カルボン酸（化合物ａａ１３３、Ｆｍｏｃ−ｃｉｓＰｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（２Ｓ，４Ｓ）−４−（４，４−ジフルオロ−１−ピペリジル）ピロリジン−２−カルボン酸（化合物ａａ１３２、Ｈ−ｃｉｓＰｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）（４５ｇ、１９２．１０ｍｍｏｌ）、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（６７．４ｇ、１９９．８０ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（５２．４ｇ、３７９．１３ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（３００ｍＬ）および水（４００ｍＬ）に加えて室温で１６時間撹拌した。その後、２５％ｔ−ブチルメチルエーテルのヘキサン溶液で洗浄し、１Ｎ塩酸水溶液を加えて水層のｐＨを１から２に調整した。ｔ−ブチルメチルエーテルで３回抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過、減圧濃縮した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（５〜６５％ 水／アセトニトリル）で精製し、（２Ｓ，４Ｓ）−４−（４，４−ジフルオロ−１−ピペリジル）−１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）ピロリジン−２−カルボン酸（化合物ａａ１３３、Ｆｍｏｃ−ｃｉｓＰｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）（５．５ｇ、４工程１７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４５７ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．４５分（分析条件 ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ３４）
（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−Ｎ−（（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシ−１，２−ジフェニルエチル）−Ｎ−メチルヘプタンアミド（化合物ａａ１３４）の合成
Figure 2018225864
減圧下、塩化リチウム（１６５ｍｇ、３．９ｍｍｏｌ）をヒートガンにて１分間加熱した後、室温に戻し窒素雰囲気化、既知論文（Angew. Chem. Int. Ed., 2014, 53, 4642）に基づいて合成した２−アミノ−Ｎ−（（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシ−１，２−ジフェニルエチル）−Ｎ−メチルアセトアミド（１８５ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）を加え、３．２５ｍＬのテトラヒドロフランを加え撹拌した。反応溶液を−７８度に冷却し、１Ｍリチウムビス（トリメチルシリル）アミドのテトラヒドロフラン溶液（１．２５ｍＬ、１．２５ｍｍｏｌ）を滴下し５分間撹拌した後、反応溶液を４度にて更に２５分間撹拌した。反応溶液を−７８度へ再度冷却し、１Ｍペンタナールのテトラヒドロフラン溶液（０．５ｍＬ、０．５ｍｍｏｌ）を滴下し２時間半撹拌した。５０μＬの５０％飽和塩化アンモニウム水溶液を加え室温にした。得られた反応液に１０ｍＬの５０％飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、１５ｍＬの酢酸エチルで２度抽出を行い得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、ろ過、減圧濃縮した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）にて精製し（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−Ｎ−（（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシ−１，２−ジフェニルエチル）−Ｎ−メチルヘプタンアミド（化合物ａａ１３４）（１０７．６ｍｇ、５８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ３７１ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシヘプタン酸ナトリウム（化合物ａａ１３５）の合成
Figure 2018225864
上述の合成法で得られた（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−Ｎ−（（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシ−１，２−ジフェニルエチル）−Ｎ−メチルヘプタンアミド（化合物ａａ１３４）（３．１ｇ、８．３７ｍｍｏｌ）のメタノールとテトラヒドロフラン溶液（１／１、３４ｍＬ）に８．４ｍＬの１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加え７時間室温にて撹拌した。反応溶液を減圧濃縮し、得られた残渣に水（４０ｍＬ）を加え、４０ｍＬのジクロロメタンにて３回洗浄した。得られた有機層を水で一度抽出した後、水層を合わせた物を凍結乾燥し、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシヘプタン酸のナトリウム塩（化合物ａａ１３５）（１．４３７ｇ、９４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ １６０ （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．２８分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）
（２Ｓ，３Ｒ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−ヒドロキシヘプタン酸（化合物ａａ１３６、Ｆｍｏｃ−Ａｈｐ（２）（３−Ｒ−ＯＨ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（２．０８１ｇ、６．１７ｍｍｏｌ）の水、１，４−ジオキサン溶液（１／１、３１ｍＬ）に炭酸セシウム（４．０２ｇ、１２．３４ｍｍｏｌ）を加え撹拌し、上述の合成法で得られた（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシヘプタン酸のナトリウム塩（化合物ａａ１３５）（１．１３ｇ、６．１７ｍｍｏｌ）を加え４５分間撹拌した。反応液をジエチルエーテル（１０ｍＬ）で２度洗浄し、得られた水層のｐＨを５Ｎ塩酸水溶液で２になるまで調節した。得られた水層をジクロロメタン（１０ｍＬ）で３度抽出し、合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧濃縮し、（２Ｓ，３Ｒ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−ヒドロキシヘプタン酸（化合物ａａ１３６、Ｆｍｏｃ−Ａｈｐ（２）（３−Ｒ−ＯＨ）−ＯＨ）（２．４６ｇ）の粗生成物を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ３８４ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８２分（分析条件 ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ，３Ｒ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ヘプタン酸（化合物ａａ１３７、Ｆｍｏｃ−Ａｈｐ（２）（３−Ｒ−ＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（２Ｓ，３Ｒ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−ヒドロキシヘプタン酸（化合物ａａ１３６、Ｆｍｏｃ−Ａｈｐ（２）（３−Ｒ−ＯＨ）−ＯＨ）（２．４ｇ、６．２６ｍｍｏｌ）とｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（７９ｍｇ、０．３１３ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（１２．５ｍＬ）を減圧濃縮し共沸脱水をおこなった。得られた残渣をテトラヒドロフラン（１２．５ｍＬ）に溶解しジヒドロピラン（４．０１ｍＬ、４３．８ｍｍｏｌ）を加え５０度にて２時間撹拌した。反応液を室温にし、反応液に酢酸エチル（１２ｍＬ）を加え飽和食塩水（１２ｍＬ）で有機層を洗浄した。得られた水層を酢酸エチル（１２ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を飽和食塩水で２度洗浄し、得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、減圧濃縮した。得られた残渣をテトラヒドロフラン（２５ｍＬ）に溶解し、ｐＨを８に調整したリン酸緩衝液（２５ｍＬ）を加え５０度にて４時間撹拌した。室温下、反応液を酢酸エチルで２度抽出を行い、合わせた有機層を飽和食塩水で２度洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、減圧濃縮した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（２Ｓ，３Ｒ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ヘプタン酸（化合物ａａ１３７、Ｆｍｏｃ−Ａｈｐ（２）（３−Ｒ−ＯＴＨＰ）−ＯＨ）（２．１５ｇ、７４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ４６６ （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：１．００分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
メチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ベンジルオキシ）エチル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ１３８、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＢｎ）−ＯＭｅ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−アジリジン−１，２−ジカルボン酸２−メチル１−ベンジル（Ｃｂｚ−Ａｚｙ−ＯＭｅ）（２５．０ｇ、１０６ｍｍｏｌ）および２−（ベンジルオキシ）エタンー１−オール（２３．８ｇ、１５６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解し０度に冷却したのち、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（２．００ｍＬ、１５．９ｍｍｏｌ）を加えて０度で１時間攪拌した。反応液に水を加えジクロロメタンで２回抽出後、炭酸ナトリウム水溶液、飽和食塩水で有機層を洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させた。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製し、メチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ベンジルオキシ）エチル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ１３８、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＢｎ）−ＯＭｅ）（３０．０ｇ、７３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３８８ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．１３分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ９）
Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ベンジルオキシ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１３９、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＢｎ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、水酸化リチウム１水和物（１３．９ｇ、３３１ｍｍｏｌ）、塩化カルシウム（１２９ｇ、１．２４ｍｏｌ）を水（３２１ｍＬ）に溶解させた。そこへメチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ベンジルオキシ）エチル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ１３８、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＢｎ）−ＯＭｅ）（３０．０ｇ、７７．４ｍｍｏｌ）の２−プロパノール／テトラヒドロフラン溶液（１．２８Ｌ／３２１ｍＬ）を室温で加え３時間攪拌した。２Ｍ塩酸水溶液をｐＨ２になるまで加え、有機層を除去したのち、水層を酢酸エチルで３回抽出した。得られた有機層を混合し無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させ、Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ベンジルオキシ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１３９、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＢｎ）−ＯＨ）（３０．０ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１４０、Ｈ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＨ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
水素雰囲気下、Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ベンジルオキシ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１３９、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＢｎ）−ＯＨ）（３４．０ｇ、９１．１ｍｍｏｌ）とパラジウム炭素（６．８０ｇ、２０％ｗ／ｗ）をメタノール（５００ｍＬ）に溶解させ、室温で１６時間撹拌した。反応液をろ過したのち、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させ、Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１４０、Ｈ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＨ）−ＯＨ）（１０．７ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１４１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＨ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１４０、Ｈ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＨ）−ＯＨ）（５．００ｇ、３３．５ｍｍｏｌ）、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（１２．４ｇ、３６．９ｍｍｏｌ）および炭酸ナトリウム（１０．６ｇ、１００ｍｍｏｌ）を水／１，４−ジオキサン（１３６ｍＬ／５６．０ｍＬ）に溶解させ室温で３時間攪拌した。反応液をｔ−ブチルメチルエーテルで３回洗浄後、水層に２Ｍ塩酸水溶液をｐＨ２になるまで加え、酢酸エチルで３回抽出した、得られた有機層を混合し、飽和食塩水で有機層を洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させた。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１４１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＨ）−ＯＨ）（１２．０ｇ、９６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３７２ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．３１分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ３３）
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１４２、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１４１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＨ）−ＯＨ）（１．６ｇ、４．３１ｍｍｏｌ）と３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（２．７２８ｍＬ、３０．３ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（８．６１６ｍＬ）溶液に、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ）（５４．１ｍｇ、０．２１５ｍｍｏｌ）を加え、５０度にて２時間攪拌した。混合物を冷却した後、酢酸エチルを加えた。続いて飽和食塩水にて有機層を３回洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に溶解させ、次いで０．０５Ｍのリン酸緩衝液（１００ｍＬ）（１Ｍのリン酸２水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）水溶液（９４．３ｍＬ）と１Ｍのリン酸水素２ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）水溶液（５．７ｍＬ）を混ぜて調製）を加えた。この混合物を室温で１０分間攪拌した後、ｔ−ブチルメチルエーテルで抽出し、飽和食塩水で有機層を洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）で精製し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１４２、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）（１．７５ｇ、９６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ４５６ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８１分（分析条件 ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−４−（（２−（ベンジルオキシ）エトキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸ベンジル（化合物ａａ１４３）の合成
Figure 2018225864
Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ベンジルオキシ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１３９、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＢｎ）−ＯＨ）（３０．０ｇ、８０．３ｍｍｏｌ）、パラホルムアルデヒド（７．２０ｇ）およびパラトルエンスルホン酸（０．８３ｇ、４．８２ｍｍｏｌ）をトルエン中（３００ｍＬ）に溶解させ１１０度で１６時間攪拌した。室温に冷却後、炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、有機層を混合し無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させ、（Ｓ）−４−（（２−（ベンジルオキシ）エトキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸ベンジル（化合物ａａ１４３）（２７．０ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ベンジルオキシ）エチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１４４、Ｃｂｚ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＢｎ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−４−（（２−（ベンジルオキシ）エトキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸ベンジル（化合物ａａ１４３）（２７．０ｇ、７０．１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（４５０ｍＬ）にトリエチルシラン（２４．４ｇ、２１０ｍｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（４５０ｍＬ）を加え、室温で４８時間撹拌した。反応液を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥したのち、炭酸カリウム水溶液で再溶解し、ジエチルエーテルで洗浄し、濃塩酸をｐＨ２になるまで加えたのち、酢酸エチルで２回抽出した。得られた有機層を混合し無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させ、Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ベンジルオキシ）エチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１４４、Ｃｂｚ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＢｎ）−ＯＨ）（２４．０ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１４５、Ｈ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＨ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
水素雰囲気下、Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ベンジルオキシ）エチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１４４、Ｃｂｚ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＢｎ）−ＯＨ）（２４．０ｇ、６２．０ｍｍｏｌ）とパラジウム炭素（２．４０ｇ、１０％ｗ／ｗ）をメタノール（４００ｍＬ）に溶解させ、室温で１６時間撹拌した。反応液をろ過したのち、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させ、Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１４５、Ｈ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＨ）−ＯＨ）（１２．０ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１４６、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＨ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１４５、Ｈ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＨ）−ＯＨ）（１２ｇ、７３．５４ｍｍｏｌ）、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（２７．３ｇ、８１．０ｍｍｏｌ）および炭酸ナトリウム（２７．３ｇ、２５８ｍｍｏｌ）を水／１，４−ジオキサン（３２０ｍＬ／１６０ｍＬ）に溶解させ室温で３時間攪拌した。反応液をｔ−ブチルメチルエーテルで３回洗浄後、水層に２Ｍ塩酸水溶液をｐＨ２になるまで加え、酢酸エチルで３回抽出した。得られた有機層を混合し、飽和食塩水で有機層を洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させ、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１４６、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＨ）−ＯＨ）（２０．０ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｏ−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１４７、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１４６、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＨ）−ＯＨ）（１８．０ｇ、４６．７ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）溶液に、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（０．５９ｇ、２．３４ｍｍｏｌ）と３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（２７．５ｇ、３２７ｍｍｏｌ）を加え、５０度にて３時間攪拌した。混合物を２５度まで冷却し、酢酸エチルを加えた。続いて飽和食塩水にて有機層を洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣（３１ｇ）のうち、２５．０ｇをテトラヒドロフラン（２００ｍＬ）に溶解させ、次いでｐＨ６．８に調製した１．０Ｍリン酸緩衝液（２００ｍＬ）を加えた。この混合物を５０度で３時間攪拌した。２５度まで冷却した後、酢酸エチルを加え、有機層と水層を分離した。水層に酢酸エチルを加えて抽出を行った後、得られた全ての有機層を混合し、飽和食塩水で有機層を洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させ、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｏ−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１４７、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）（２０．０ｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ４８７ （Ｍ＋ＮＨ４）＋
保持時間：０．６８分（分析条件 ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ１１）
（４Ｓ）−４−メチルー２−フェニルー１，３−ジオキソラン（化合物ａａ１４８）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−プロパンー１，２−ジオール（２０．０ｇ、２６３ｍｍｏｌ）のトルエン（２００ｍＬ）溶液に、ベンズアルデヒド（２９．３ｇ、２７６ｍｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルホン酸（０．４５ｇ、２．６１ｍｍｏｌ）を加え、１３０度にて１６時間攪拌した。反応液を濃縮し、残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製し、（４Ｓ）−４−メチルー２−フェニルー１，３−ジオキソラン（化合物ａａ１４８）（３１．５ｇ、７３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ １６５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８９分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ１２）
（２Ｓ）−２−（ベンジルオキシ）プロパンー１−オール（化合物ａａ１４９）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（４Ｓ）−４−メチルー２−フェニルー１，３−ジオキソラン（化合物ａａ１４８）（３２ｇ、１９４．８８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１．００Ｌ）溶液に、水素化ジイソブチルアルミニウムの１Ｍヘキサン溶液（３９０ｍＬ、３９０ｍｍｏｌ）を−５０度において加え、当該温度で１５分撹拌後、室温にて２時間攪拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液を加え反応を停止したのち、ジクロロメタンで２回抽出した。混合した有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させ、（２Ｓ）−２−（ベンジルオキシ）プロパンー１−オール（化合物ａａ１４９）（３５．５ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
メチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ１５０、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＭｅ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−アジリジン−１，２−ジカルボン酸２−メチル１−ベンジル（Ｃｂｚ−Ａｚｙ−ＯＭｅ）（２５．０ｇ、１０６ｍｍｏｌ）および（２Ｓ）−２−（ベンジルオキシ）プロパンー１−オール（化合物ａａ１４９）（２６．５ｇ、１５９ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１８８ｍＬ）に溶解し０度に冷却したのち、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（２．７５ｍＬ）を加えて０度で１時間３０分攪拌した。反応液に水を加えジクロロメタンで抽出後、飽和炭酸ナトリウム水溶液、飽和食塩水で有機層を洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させ、メチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ１５０、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＭｅ）（化合物ａａ１５０、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＭｅ）（３０．０ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１５１、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、水酸化リチウム１水和物（１０．５ｇ）塩化カルシウム（１０３ｇ）を水（３００ｍＬ）に溶解させた。そこへメチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ１５０、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＭｅ）（２５ｇ、６２．３ｍｍｏｌ）の２−プロパノール／テトラヒドロフラン溶液（１．２０Ｌ／３００ｍＬ）を室温で加え５時間攪拌した。２Ｍ塩酸水溶液をｐＨ２になるまで加え、有機層を除去したのち、水層を酢酸エチルで３回抽出した。得られた有機層を混合し無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させ、Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１５１、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＨ）（２５．０ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
Ｏ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１５２、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
水素雰囲気下、Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１５１、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＨ）（３．００ｇ、７．７４ｍｍｏｌ）とパラジウム炭素（０．３０ｇ、１０％ ｗ／ｗ）をメタノール（５０．０ｍＬ）に溶解させ、室温で１６時間撹拌した。反応液をろ過したのち、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させ、Ｏ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１５２、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（０．７８ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレンー９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１５３、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｏ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１５２、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（０．７８ｇ、４．７８ｍｍｏｌ）、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（１．６１ｇ、４．７８ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．９３ｍｇ、７．１７ｍｍｏｌ）を水／１，４−ジオキサン（８．００ｍＬ／２２．０ｍＬ）に溶解させ室温で３０分攪拌した。反応液をヘキサン（１８．０ｍＬ）／ｔ−ブチルメチルエーテル（６．００ｍＬ）で２回洗浄後、水層に２Ｍ塩酸水溶液をｐＨ２になるまで加え、酢酸エチル（２０．０ｍＬ）で２回抽出した、得られた有機層を混合し、飽和食塩水で有機層を洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させた。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレンー９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１５３、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（１．６２ｇ、８８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３８６ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレンー９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（２Ｓ）−２−（（テトラヒドロー２Ｈ−ピランー２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１５４、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレンー９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１５３、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（８３ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１．００ｍＬ）溶液に、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（２．７１ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）と３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（０．１３ｇ、１．５１ｍｍｏｌ）を加え、５０度にて２時間攪拌した。混合物を２５度まで冷却し、酢酸エチルを加えた。続いて飽和食塩水にて有機層を洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をテトラヒドロフラン（１．００ｍＬ）に溶解させ、次いでｐＨ６．８に調製した１．０Ｍリン酸緩衝液（１．００ｍＬ）を加えた。この混合物を５０度で３時間攪拌した。２５度まで冷却した後、酢酸エチル（１７５ｍＬ）を加え、有機層と水層を分離した。水層に酢酸エチル（１７５ｍＬ）を加えて抽出を行った後、得られた全ての有機層を混合し、飽和食塩水で有機層を洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させ、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレンー９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（２Ｓ）−２−（（テトラヒドロー２Ｈ−ピランー２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１５４、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）（８８．０ｍｇ、８７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４６８ （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．８６分、０．８７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−４−（（（Ｓ）−２−（ベンジルオキシ）プロポキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸ベンジル（化合物ａａ１５５）の合成
Figure 2018225864
Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１５１、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＨ）（２５．０ｇ、６４．５３ｍｍｏｌ）、パラホルムアルデヒド（５．８０ｇ）およびパラトルエンスルホン酸（０．６７ｇ、３．８９ｍｍｏｌ）をトルエン中（２５０ｍＬ）に溶解させ１１０度で１６時間攪拌した。室温に冷却後、炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、有機層を混合し無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させ、（Ｓ）−４−（（（Ｓ）−２−（ベンジルオキシ）プロポキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸ベンジル（化合物ａａ１５５）（１８．６ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１５６、Ｃｂｚ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−４−（（（Ｓ）−２−（ベンジルオキシ）プロポキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸ベンジル（化合物ａａ１５５）（１８．６ｇ、４６．６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２９６ｍＬ）にトリエチルシシラン（１６．２ｇ、１３９ｍｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（２９６ｍＬ）を加え、室温で４８時間撹拌した。反応液を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥したのち、炭酸カリウム水溶液で再溶解し、ジエチルエーテルで洗浄し、濃塩酸をｐＨ２になるまで加えたのち、酢酸エチルで３回抽出した。得られた有機層を混合し無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させ、Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１５６、Ｃｂｚ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＨ）（９．４ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
Ｏ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１５７、Ｈ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
水素雰囲気下、Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１５６、Ｃｂｚ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＨ）（９．４０ｇ、２３．４ｍｍｏｌ）とパラジウム炭素（１．８０ｇ、１０％ ｗ／ｗ）をメタノール（１８５ｍＬ）に溶解させ、室温で１６時間撹拌した。反応液をろ過したのち、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させ、Ｏ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１５７、Ｈ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（３．４０ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１５８、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｏ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１５７、Ｈ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（３．４０ｇ、１９．２ｍｍｏｌ）、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（７．１２ｇ、２２．１ｍｍｏｌ）および炭酸ナトリウム（７．１３ｇ、６７．３ｍｍｏｌ）を水／１，４−ジオキサン（８０．０ｍＬ／４０．０ｍＬ）に溶解させ室温で３時間攪拌した。反応液をｔ−ブチルメチルエーテルで３回洗浄後、水層に２Ｍ塩酸水溶液をｐＨ２になるまで加え、酢酸エチルで３回抽出した、得られた有機層を混合し、飽和食塩水で有機層を洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させ、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１５８、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（８．００ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｏ−（（２Ｓ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１５９、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１５８、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（８０．０ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（４０．０ｍＬ）溶液に、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（０．２６ｇ、１．０２ｍｍｏｌ）と３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（１１．８ｇ、１４０ｍｍｏｌ）を加え、５０度にて２時間攪拌した。混合物を２５度まで冷却し、酢酸エチルを加えた。続いて飽和食塩水にて有機層を洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣（９．３０ｇ）をテトラヒドロフラン（５０．０ｍＬ）に溶解させ、次いでｐＨ６．８に調製した１．０Ｍリン酸緩衝液（５０．０ｍＬ）を加えた。この混合物を５０度で３時間攪拌した。２５度まで冷却した後、酢酸エチルを加え、有機層と水層を分離した。水層に酢酸エチルを加えて抽出を行った後、得られた全ての有機層を混合し、飽和食塩水で有機層を洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させ、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．５％炭酸水素アンモニウム水溶液／アセトニトリル）にて精製し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｏ−（（２Ｓ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１５９、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）（７．００ｇ、７２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ５０１ （Ｍ＋ＮＨ４）＋
保持時間：０．８２分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ１０）
（４Ｒ）−４−メチルー２−フェニルー１，３−ジオキソラン（化合物ａａ１６０）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｒ）−プロパンー１，２−ジオール（２０ｇ、２６２．８３ｍｍｏｌ）のトルエン（２００ｍＬ）溶液に、ベンズアルデヒド（２９．３ｇ、２７６ｍｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルホン酸（０．４５ｇ、２．６１ｍｍｏｌ）を加え、１３０度にて１６時間攪拌した。反応液を濃縮し、残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製し、（４Ｒ）−４−メチルー２−フェニルー１，３−ジオキソラン（化合物ａａ１６０）（３１．５ｇ、７３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ １６３ （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：７．２１分（分析条件ＧＣ０１）
（２Ｒ）−２−（ベンジルオキシ）プロパンー１−オール（化合物ａａ１６１）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（４Ｒ）−４−メチルー２−フェニルー１，３−ジオキソラン（化合物ａａ１６０）（３２．０ｇ、１９５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１．００Ｌ）溶液に、水素化ジイソブチルアルミニウムの１Ｍヘキサン溶液（３９０ｍＬ、３９０ｍｍｏｌ）を−５０度において加え、当該温度で１５分撹拌後、室温にて２時間攪拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液を加え反応を停止したのち、ジクロロメタンで２回抽出した。混合した有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させ、（２Ｒ）−２−（ベンジルオキシ）プロパンー１−オール（化合物ａａ１６１）（３５．５ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
メチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ１６２、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＭｅ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−アジリジン−１，２−ジカルボン酸２−メチル１−ベンジル（Ｃｂｚ−Ａｚｙ−ＯＭｅ）（２５ｇ、１０６．２８ｍｍｏｌ）および（２Ｒ）−２−（ベンジルオキシ）プロパンー１−オール（化合物ａａ１６１）（２６．５ｇ、１５９ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１８８ｍＬ）に溶解し０度に冷却したのち、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（２．７５ｍＬ）を加えて０度で１時間３０分攪拌した。反応液に水を加えジクロロメタンで抽出後、飽和炭酸ナトリウム水溶液、飽和食塩水で有機層を洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させ、メチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ１６２、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＭｅ）（５０．０ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１６３、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、水酸化リチウム１水和物（１０．５ｇ）塩化カルシウム（１０３ｇ）を水（３００ｍＬ）に溶解させた。そこへメチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ１６２、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＭｅ）（２５．０ｇ、６２．３ｍｍｏｌ）の２−プロパノール／テトラヒドロフラン溶液（１．５０Ｌ／１５０ｍＬ）を室温で加え５時間攪拌した。２Ｍ塩酸水溶液をｐＨ２になるまで加え、有機層を除去したのち、水層を酢酸エチルで３回抽出した。得られた有機層を混合し無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させ、Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１６３、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＨ）（２５．０ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
Ｏ−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１６４、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
水素雰囲気下、Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１６３、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＨ）（２．８７ｇ、７．４１ｍｍｏｌ）とパラジウム炭素（５７０ｍｇ、２０％ ｗ／ｗ）をメタノール（５０ｍＬ）に溶解させ、室温で１６時間撹拌した。反応液をろ過したのち、溶媒を減圧下留去し、得られた残渣を酢酸エチルにて６０度で再結晶することで、Ｏ−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１６４、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（９００ｍｇ、７４％）を得た。
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１６５、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、上述に記載の方法で合成したＯ−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１６４、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（５．０ｇ、３０．６４ｍｍｏｌ）、炭酸水素ナトリウム（７．７１ｇ、９１．８ｍｍｏｌ）を水／１，４−ジオキサン（１２７ｍＬ／５２．９ｍＬ）に溶解させ、室温にてＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（１０．８５ｇ、３２．２ｍｍｏｌ）を加え４時間撹拌した。反応液に水を加え、ｔ−ブチルメチルエーテルで洗浄した後、水層に濃塩酸をｐＨ３になるまで加え、ｔ−ブチルメチルエーテルで２回抽出した、得られた有機層を飽和食塩水で洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製することで、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１６５、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（８ｇ、６８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３８６ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：２．０８分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ４９）
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（２Ｒ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１６６、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１６５、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（４．４ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（５０ｍＬ）溶液に、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（１４３ｍｇ、５．７ｍｍｏｌ）と３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（６．７ｇ、７９．８ｍｍｏｌ）を加え、５０度にて３時間攪拌した。混合物を室温にて冷却し、ｔ−ブチルメチルエーテルを加えた後、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過を行い、得られた溶媒を減圧下留去し、粗生成物（８ｇ）を得た。得られた粗生成物（８００ｍｇ）にテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）とｐＨ６．８に調製した１．０Ｍリン酸緩衝液（１０ｍＬ）の混合液を加え、５０度で３時間攪拌した。反応液を室塩で冷却した後、ｔ−ブチルメチルエーテルを加え、飽和食塩水で洗浄し、ろ過を行った。得られた溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．５％炭酸水素アンモニウム水溶液／アセトニトリル）で精製し、得られたフラクションをまとめてアセトニトリルを減圧下留去した。得られた水層にｐＨ６．８に調製した１．０Ｍリン酸緩衝液を加え、ｔ−ブチルメチルエーテルで３回抽出し、減圧下溶媒を留去することでＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（２Ｒ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１６６、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）（４００ｍｇ、２工程６５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４６８ （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．８５分、０．８７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−４−（（（Ｒ）−２−（ベンジルオキシ）プロポキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸ベンジル（化合物ａａ１６７）の合成
Figure 2018225864
Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１６３、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＨ）（２５．０ｇ、６４．５ｍｍｏｌ）、パラホルムアルデヒド（５．８０ｇ）およびパラトルエンスルホン酸（０．６７ｇ、３．８９ｍｍｏｌ）をトルエン中（２５０ｍＬ）に溶解させ１１０度で１６時間攪拌した。室温に冷却後、炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、有機層を混合し無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させ、（Ｓ）−４−（（（Ｒ）−２−（ベンジルオキシ）プロポキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸ベンジル（化合物ａａ１６７）（１８．６ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１６８、Ｃｂｚ−ＭｅＳｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−４−（（（Ｒ）−２−（ベンジルオキシ）プロポキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸ベンジル（化合物ａａ１６７）（１８．６ｇ、４６．６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２９６ｍＬ）にトリエチルシラン（１６．２ｇ、１３９ｍｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（２９６ｍＬ）を加え、室温で４８時間撹拌した。反応液を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥したのち、炭酸カリウム水溶液で再溶解し、ジエチルエーテルで洗浄し、濃塩酸をｐＨ２になるまで加えたのち、酢酸エチルで３回抽出した。得られた有機層を混合し無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させ、Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１６８、Ｃｂｚ−ＭｅＳｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＨ）（９．４０ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
Ｏ−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１６９、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
水素雰囲気下、Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１６８、Ｃｂｚ−ＭｅＳｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＨ）（９．４０ｇ、２３．４ｍｍｏｌ）とパラジウム炭素（１．８０ｇ、１０％ ｗ／ｗ）をメタノール（１８５ｍＬ）に溶解させ、室温で１６時間撹拌した。反応液をろ過したのち、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させ、Ｏ−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１６９、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（３．４０ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１７０、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｏ−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１６９、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（３．４０ｇ、１９．２ｍｍｏｌ）、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（７．１２ｇ、２２．１ｍｍｏｌ）および炭酸ナトリウム（７．１３ｇ、６７．３ｍｍｏｌ）を水／１，４−ジオキサン（８０．０ｍＬ／４０．０ｍＬ）に溶解させ室温で３時間攪拌した。反応液をｔ−ブチルメチルエーテルで３回洗浄後、水層に２Ｍ塩酸水溶液をｐＨ２になるまで加え、酢酸エチルで３回抽出した、得られた有機層を混合し、飽和食塩水で有機層を洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させ、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１７０、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（８．００ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｏ−（（２Ｒ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１７１、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１７０、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（８．００ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（４０．０ｍＬ）溶液に、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（０．２６ｇ、１．０２ｍｍｏｌ）と３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（１１．８ｇ、１３９ｍｍｏｌ）を加え、５０度にて２時間攪拌した。混合物を２５度まで冷却し、酢酸エチルを加えた。続いて飽和食塩水にて有機層を洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣（９．３ｇ）をテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）に溶解させ、次いでｐＨ６．８に調製した１．０Ｍリン酸緩衝液（１００ｍＬ）を加えた。この混合物を５０度で３時間攪拌した。２５度まで冷却した後、酢酸エチルを加え、有機層と水層を分離した。水層に酢酸エチルを加えて抽出を行った後、得られた全ての有機層を混合し、飽和食塩水で有機層を洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させ、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｏ−（（２Ｒ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１７１、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）（８．５０ｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ５０１ （Ｍ＋ＮＨ４）＋
保持時間：０．８２分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ１０）
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−メチル−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１７４、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成は、以下のスキームに従って行った。
Figure 2018225864
メチルＯ−（２−（ベンジルオキシ）−２−メチルプロピル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ１７２、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＢｎ）−ＯＭｅ）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−アジリジン−１，２−ジカルボン酸２−メチル１−ベンジル（Ｃｂｚ−Ａｚｙ−ＯＭｅ）（２．０ｇ、８．５０ｍｍｏｌ）および２−ベンジルオキシ−２−メチル−プロパン−１−オール（２．３０ｇ、１２．７５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（７．５ｍＬ）に溶解し、氷冷下で三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（ＢＦ３・ＯＥｔ２）（０．１６０ｍＬ、１．２８ｍｍｏｌ）を５分かけて滴下した。氷冷下で３０分撹拌後、水（２．０ｍＬ）を加えて１０分撹拌して反応を停止し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた。ジクロロメタンで水層を抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。ろ過後、有機溶媒を減圧濃縮により除去し、得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１００／０→７５／２５）で精製し、メチルＯ−（２−（ベンジルオキシ）−２−メチルプロピル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ１７２、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＢｎ）−ＯＭｅ）（２．３６ｇ、６７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４１６ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９３ 分（分析条件 ＳＱＤＦＡ０５）
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１７３、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
メチルＯ−（２−（ベンジルオキシ）−２−メチルプロピル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ１７２、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＢｎ）−ＯＭｅ）（２．３６ｇ、５．６８ｍｍｏｌ）をメタノール（８．０ｍＬ）に溶解させた。これに、水酸化リチウム一水和物（０．４７７ｇ、１１．３６ｍｍｏｌ）を水（８．０ｍＬ）に溶解させた水溶液を添加し、室温で１時間撹拌した。その後、２Ｍの塩酸水溶液（８．５２ｍＬ、１７．０４ｍｍｏｌ）を加えた。水層を酢酸エチルで３回抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。ろ過後、酢酸エチルを減圧濃縮により除去し、Ｏ−（２−（ベンジルオキシ）−２−メチルプロピル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリン（Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＢｎ）−ＯＨ）を得た。
上で得られた、Ｏ−（２−（ベンジルオキシ）−２−メチルプロピル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリン（Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＢｎ）−ＯＨ）をメタノール（４５ｍＬ）に溶解し、Ｐｄ／Ｃ（４５６ｍｇ）を加えて水素雰囲気化、室温で終夜撹拌した。セライトろ過によりＰｄ／Ｃを除いた後、減圧濃縮によりメタノールを除去することでＯ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｌ−セリン（Ｈ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＨ）（１．０５ｇ）を定量的に得た。
得られたＯ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｌ−セリン（Ｈ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＨ）（１．５９ｇ、８．９７ｍＬ）および炭酸ナトリウム（２．８５ｇ、２６．９ｍｍｏｌ）を水（３６ｍＬ）および１，４−ジオキサン（１５ｍＬ）に溶解し、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（３．１８ｇ、９．４２ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。室温で３０分撹拌後、反応液に水（４０ｍＬ）を加え、ｔ−ブチルメチルエーテル（６０ｍＬ）で３回洗浄した。その後、水層に２Ｍの塩酸水溶液（２６．９ｍＬ、５３．８ｍｍｏｌ）を加えて水層のｐＨを１とした後、ｔ−ブチルメチルエーテル（６０ｍＬ）で３回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過後、ｔ−ブチルメチルエーテルを減圧濃縮して得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１ギ酸アセトニトリル溶液）で精製し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１７３、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＨ）（２．６２ｇ、７３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４００ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７１分（分析条件 ＳＱＤＦＡ０５）
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−メチル−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１７４、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１７３、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＨ）（１．２ｇ、３．００ｍｍｏｌ）および３．４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（１．９０ｍＬ、２１．０３ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（６．０ｍＬ）に溶解し、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ）（０．０３８ｇ、０．１５０ｍｍｏｌ）を加えて５０度で２時間撹拌した。その後、反応液を酢酸エチル（１５ｍＬ）で希釈し、飽和食塩水（１５ｍＬ）で３回洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、減圧濃縮により溶媒を除去した。得られた残渣をテトラヒドロフラン（２４．０ｍＬ）に溶解し、ｐＨ６．８に調製した１．０Ｍリン酸緩衝液（２４．０ｍＬ）を加えて５０度で３時間撹拌した。反応液を酢酸エチル（４５ｍＬ）で希釈後、飽和食塩水（４５ｍＬ）で３回洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。ろ過後、減圧濃縮して得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）で精製し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−メチル−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１７４、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）（１．０５ｇ、７２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４８４（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｏ−（２−メチル−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１７５、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ｔＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成は、以下のスキームに従って行った。
Figure 2018225864
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｏ−（２−メチル−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１７５、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ｔＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１７３、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＨ）（１２ｇ、３０．０４ｍｍｏｌ）およびパラホルムアルデヒド（２．７５ｇ、９１．６７ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（３１．４ｇ、２７７．７８ｍｍｏｌ）およびトルエン（６０ｍＬ）に溶解させ、室温で４時間撹拌した。反応液を減圧濃縮後、得られた残渣をジクロロメタンに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。ろ過後、ジクロロメタンを減圧濃縮により除去することで（Ｓ）−４−（（２−ヒドロキシ−２−メチルプロポキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（１２ｇ、９７％）を得た。
得られた（Ｓ）−４−（（２−ヒドロキシ−２−メチルプロポキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（１ｇ、２．４３ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸／ジクロロメタン（１３ｍＬ／１３ｍＬ）に溶解し、トリエチルシラン（Ｅｔ３ＳｉＨ）（８３２ｍｇ、７．１６ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。室温で１６時間撹拌後、反応液を減圧濃縮して得られた残渣を炭酸カリウム水溶液に溶解し、ｔ−ブチルメチルエーテルで洗浄後、水層に塩酸水溶液（１Ｍ）を加えてｐＨを２に調節した。水層をｔ−ブチルメチルエーテルで２回抽出した後、有機層を水、飽和食塩水で各２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。ろ過後、減圧濃縮して得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル＝１００／０→５０／５０）で精製し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＨ）（７００ｍｇ、７０％）を得た。
得られたＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＨ）（６ｇ、１４．５１ｍｍｏｌ）とｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ）（１８２ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（４８ｍＬ）に溶解し、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（８．５ｇ、１０１．０５ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気化、室温で滴下して加えた。反応液を５０度で５時間撹拌後、反応液に酢酸エチルを添加し、抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、減圧濃縮してＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｏ−（２−メチル−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリンおよびテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｏ−（２−メチル−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリナートを混合物として得た。
得られた混合物（５０ｇ）をリン酸緩衝液（１Ｍ、ｐＨ＝６．８、１０００ｍＬ）およびテトラヒドロフラン（１０００ｍＬ）に溶解させ、５０度で４時間撹拌した。その後、反応液を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後に減圧濃縮した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィ（０〜４０％ ０．５％炭酸水素アンモニウム水溶液／アセトニトリル）で精製し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｏ−（２−メチル−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１７５、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ｔＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）（２０ｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４９８ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９４分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ２０）
４，４−ジメチルー２−フェニルー１，３−ジオキサン（化合物ａａ１７６）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、３−メチルブタンー１，３−ジオール（４０．０ｇ、３８４ｍｍｏｌ）のクロロホルム（４００ｍＬ）溶液に、ジメトキシメチルベンゼン（８７．６ｇ、５７６ｍｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルホン酸（３．５９ｇ、１８．９ｍｍｏｌ）を加え、０度にて１．５時間攪拌した。反応液を濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィ−（ヘキサン／酢酸エチル）で精製し、４，４−ジメチルー２−フェニルー１，３−ジオキサン（化合物ａａ１７６）（７０．０ｇ、９５％）を得た。
３−（ベンジルオキシ）−３−メチルブタンー１−オール（化合物ａａ１７７）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、上述の方法で得た４，４−ジメチルー２−フェニルー１，３−ジオキサン（化合物ａａ１７６）（５．００ｇ、２６．０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１３０ｍＬ）溶液に、水素化ジイソブチルアルミニウムの１Ｍヘキサン溶液（１５６ｍＬ、１５６ｍｍｏｌ）を−５０度において加え、当該温度で１５分撹拌後、室温にて１時間攪拌した。メタノール加え反応を停止したのち、ジクロロメタンで２回抽出した。混合した有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製し、３−（ベンジルオキシ）−３−メチルブタンー１−オール（化合物ａａ１７７）（２．００ｇ、４０％）を得た。
メチルＯ−（３−（ベンジルオキシ）−３−メチルブチル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ１７８、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＢｎ）−ＯＭｅ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−アジリジン−１，２−ジカルボン酸２−メチル１−ベンジル（２５ｇ、１０６ｍｍｏｌ）および３−（ベンジルオキシ）−３−メチルブタンー１−オール（化合物ａａ１７７）（３１．０ｇ、１５９ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１１３ｍＬ）に溶解し０度に冷却したのち、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（２．２６ｇ、１５．９ｍｍｏｌ）を加えて０度で３時間攪拌した。反応液に水を加えジクロロメタンで抽出後、飽和炭酸ナトリウム水溶液、飽和食塩水で有機層を洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製し、メチルＯ−（３−（ベンジルオキシ）−３−メチルブチル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ１７８、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＢｎ）−ＯＭｅ）（２８．０ｇ、５５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４５２ （Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：１．４６分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ１３）
Ｏ−（３−（ベンジルオキシ）−３−メチルブチル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１７９、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＢｎ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、水酸化リチウム１水和物（１１．２ｇ）塩化カルシウム（１１０ｇ）を水（２７８ｍＬ）に溶解させた。そこへメチルＯ−（３−（ベンジルオキシ）−３−メチルブチル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ１７８、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＢｎ）−ＯＭｅ）（２８．７ｇ、６８．４ｍｍｏｌ）の２−プロパノール／テトラヒドロフラン溶液（２７８ｍＬ／１１１５ｍＬ）を室温で加え５時間攪拌した。２Ｍ塩酸水溶液をｐＨ２になるまで加え、有機層を除去したのち、水層を酢酸エチルで３回抽出した。得られた有機層を混合し無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させ、Ｏ−（３−（ベンジルオキシ）−３−メチルブチル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１７９、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＢｎ）−ＯＨ）（２８．０ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
Ｏ−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１８０、Ｈ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
水素雰囲気下、Ｏ−（３−（ベンジルオキシ）−３−メチルブチル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１７９、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＢｎ）−ＯＨ）（化合物ａａ１７９）（２８．０ｇ、６７．４ｍｍｏｌ）とパラジウム炭素（６．００ｇ、２０％ｗ／ｗ）をメタノール（５００ｍＬ）に溶解させ、室温で１６時間撹拌した。反応液をろ過したのち、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させたのち、メタノール／ジクロロメタン（１／５）から再結晶を行い、Ｏ−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１８０、Ｈ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）（７．００ｇ、５４％）を得た。
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１８１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｏ−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１８０、Ｈ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）（２．８０ｇ、１４．６ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（４．６６ｇ、４４．０ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（２４．５ｍＬ）／水（５８．８ｍＬ）に溶解させた後に、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（５．１８ｇ、１５．４ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応液をｔ−ブチルメチルエーテルで３回洗浄後、水層に２Ｍ塩酸水溶液をｐＨ２になるまで加え、酢酸エチルで３回抽出した、得られた有機層を混合し、飽和食塩水で有機層を洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させ、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１８１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）（５．８０ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−メチル−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１８２、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１８１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）（６．８０ｇ、１６．５ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（３５．０ｍＬ）溶液に、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（０．２０ｇ、０．８２ｍｍｏｌ）と３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（１０．３ｍＬ）を加え、５０度にて５時間攪拌した。混合物を２５度まで冷却し、酢酸エチルを加えた。続いて飽和食塩水にて有機層を洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣（１１．０ｇ）のうち、０．７５ｇをテトラヒドロフラン（２０．０ｍＬ）に溶解させ、次いでｐＨ６．８に調製した１．０Ｍリン酸緩衝液（２０．０ｍＬ）を加えた。この混合物を５０度で４時間攪拌した。２５度まで冷却した後、酢酸エチルを加え、有機層と水層を分離した。水層に酢酸エチルを加えて抽出を行った後、得られた全ての有機層を混合し、飽和食塩水で有機層を洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し得られた残渣を、逆相カラムクロマトグラフィー（０．５％炭酸水素アンモニウム水溶液／アセトニトリル）にて精製し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−メチル−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１８２、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）（０．６０ｇ、８０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４９８ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７２分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ１１）
（Ｓ）−４−（（３−ヒドロキシ−３−メチルブトキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ１８３）の合成
Figure 2018225864
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１８１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）（０．２０ｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、パラホルムアルデヒド（０．０６ｇ）およびトリフルオロ酢酸（０．６４ｇ、５．６２ｍｍｏｌ）をトルエン中（１０．０ｍＬ）に溶解させ室温で１６時間攪拌した。反応液を減圧下留去し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製し、（Ｓ）−４−（（３−ヒドロキシ−３−メチルブトキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ１８３）（０．１６ｇ、８０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４４８ （Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：２．４７分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ１４）
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１８４、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−４−（（３−ヒドロキシ−３−メチルブトキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ１８３）（１．００ｇ、２．３５ｍｍｏｌ）、塩化アルミニウム（０．６３ｇ、４．７０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（５０．０ｍＬ）に、０度においてトリエチルシラン（０．７５ｍＬ）をゆっくり滴下し、室温で２時間撹拌した。反応液をジクロロメタンで希釈し、２Ｍ塩酸水溶液および飽和食塩水で洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１８４、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）（０．３０ｇ、３０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４５０ （Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：２．１２分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ１５）
（Ｓ）−４−（（６−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ１８５）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（６−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル）プロパン酸（化合物ａａ８８、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ−４−ＮＭｅ２）−ＯＨ）（５００ｍｇ、０．１．１５９ｍｍｏｌ）とパラホルムアルデヒド（１０４ｍｇ、３．４８ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（３．５ｍＬ）にトリフルオロ酢酸（０．８０３ｍＬ、１０．４３ｍｍｏｌ）を室温にて加え、終夜撹拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−４−（（６−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ１８５）（５１７ｍｇ）を定量的に得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ４４４ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（６−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル）プロパン酸（化合物ａａ１８６、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｌａ（３−Ｐｙｒ−４−ＮＭｅ２）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−４−（（６−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ１８５）（４９６ｍｇ）のジクロロエタン（ＤＣＥ）溶液（４．０ｍＬ）にトリエチルシラン（１．６０８ｍＬ、１０．０７ｍｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（２．３２６ｍＬ、３０．２ｍｍｏｌ）を室温にて加え、反応液を６０度で終夜撹拌した。反応液を室温にて冷却した後、減圧濃縮することで得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（６−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル）プロパン酸（化合物ａａ１８６、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｌａ（３−Ｐｙｒ−４−ＮＭｅ２）−ＯＨ）（１８１ｍｇ、３６％）を得た
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ４４６ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）プロパン酸（化合物ａａ１８７、Ｆｍｏｃ−ＭｅＰｈｅ（４−ＣＦ３）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、市販の（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）プロパン酸（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＣＦ３）−ＯＨ）（１０ｇ、２１．９６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液（１１０ｍＬ）にパラホルムアルデヒド（１．９７８ｇ、６５．９ｍｍｏｌ）、無水硫酸マグネシウム（６．６１ｇ、５２．９ｍｍｏｌ）、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（ＢＦ３・ＯＥｔ）（３．３４ｍＬ、２６．３ｍｍｏｌ）を室温にて加え、２時間撹拌した。反応液に５０％飽和食塩水を加え、ジクロロメタン（ＤＣＭ）で抽出し、得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した後、フェーズセパレーター（Ｂｉｏｔａｇｅ社より購入）を用い有機層を分離した。得られた有機溶媒を減圧下留去し、粗生成物である（Ｓ）−５−オキソ−４−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）オキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチルを得た。
窒素雰囲気下、上記の粗生成物である（Ｓ）−５−オキソ−４−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）オキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチルのジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液（１１０ｍＬ）にトリエチルシラン（１０．４９ｍＬ、６５．９ｍｍｏｌ）、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（ＢＦ３・ＯＥｔ）（８．３５ｍＬ、６５．９ｍｍｏｌ）、水（０．３９６ｍＬ）を室温にて加え、終夜撹拌した。反応液に５０％飽和食塩水を加え、室温にて１５分撹拌した後、フェーズセパレーター（Ｂｉｏｔａｇｅ社より購入）を用い有機層を分離した。得られた有機溶媒を減圧下留去し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）プロパン酸（化合物ａａ１８７、Ｆｍｏｃ−ＭｅＰｈｅ（４−ＣＦ３）−ＯＨ）（７．７ｇ、２工程７５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ４７０ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（４−（ジフルオロメチル）フェニル）プロパン酸（化合物ａａ１８８、Ｆｍｏｃ−ＭｅＰｈｅ（４−ＣＨＦ２）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、市販の（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−（ジフルオロメチル）フェニル）プロパン酸（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＣＨＦ２）−ＯＨ）（２．０ｇ、４．５７ｍｍｏｌ）とパラホルムアルデヒド（４１２ｍｇ、１３．７２ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（１５ｍＬ）にトリフルオロ酢酸（３．１７ｍＬ、４１．１ｍｍｏｌ）を室温にて加え、終夜撹拌した。反応液に水を加え、ジクロロメタン（ＤＣＭ）で抽出し、得られた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。ろ過後、有機溶媒を減圧下留去し、粗生成物である（Ｓ）−４−（４−（ジフルオロメチル）ベンジル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（２．８ｇ）を得た。
窒素雰囲気下、上記の粗生成物である（Ｓ）−４−（４−（ジフルオロメチル）ベンジル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（２．８ｇ）のジクロロエタン（ＤＣＥ）溶液（２５ｍＬ）にトリエチルシラン（６．５７ｍＬ、４１．１ｍｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（９．５１ｍＬ、１２３ｍｍｏｌ）を室温にて加え、反応液を６０度で終夜撹拌した。反応液を室温にて冷却した後、水を加え、減圧濃縮した。得られた残渣をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈し、逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（４−（ジフルオロメチル）フェニル）プロパン酸（化合物ａａ１８８、Ｆｍｏｃ−ＭｅＰｈｅ（４−ＣＨＦ２）−ＯＨ）（１．３８ｇ、２工程６７％）を得た
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ４５２ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（４−（ジフルオロメトキシ）フェニル）プロパン酸（化合物ａａ１８９、Ｆｍｏｃ−ＭｅＰｈｅ（４−ＯＣＨＦ２）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、市販の（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−（ジフルオロメトキシ）フェニル）プロパン酸（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＯＣＨＦ２）−ＯＨ）（１．０ｇ、２．２０５ｍｍｏｌ）とパラホルムアルデヒド（１９９ｍｇ、６．６２ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（１１ｍＬ）にトリフルオロ酢酸（１．５２９ｍＬ、１９．８５ｍｍｏｌ）を室温にて加え、終夜撹拌した。反応液に水を加え、ジクロロメタン（ＤＣＭ）で抽出し、得られた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。ろ過後、有機溶媒を減圧下留去し、粗生成物である（Ｓ）−４−（４−（ジフルオロメトキシ）ベンジル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチルを得た。
窒素雰囲気下、上記の粗生成物である（Ｓ）−４−（４−（ジフルオロメチル）ベンジル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチルのジクロロエタン（ＤＣＥ）溶液（１５ｍＬ）にトリエチルシラン（１．０５７ｍＬ、６．６２ｍｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（１．５２９ｍＬ、１９．８５ｍｍｏｌ）を室温にて加え、反応液を６０度で終夜撹拌した。反応液を室温にて冷却した後、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈し、逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（４−（ジフルオロメトキシ）フェニル）プロパン酸（化合物ａａ１８９、Ｆｍｏｃ−ＭｅＰｈｅ（４−ＯＣＨＦ２）−ＯＨ）（６９６ｍｇ、２工程６８％）を得た
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ４６８ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（４−クロロフェニル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１９０、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−４−Ｃｌ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
市販のメチルトリチル−Ｌ−セリナート（Ｔｒｔ−Ｓｅｒ−ＯＭｅ）（１０．０ｇ、２７．７ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（ＰＰｈ３）（７．９８ｇ、３０．４ｍｍｏｌ）および４−クロロフェノール（４．０９ｍＬ、４１．５ｍｍｏｌ）とトルエン（２３ｍＬ）を混合し、氷冷下でアゾジカルボン酸ジイソプロピル（ＤＩＡＤ）（４０％トルエン溶液、１．９ｍｏｌ／Ｌ、１６．０２ｍＬ、３０．４ｍｍｏｌ）を滴下しながら加えた。滴下終了後、０度にて５分間撹拌し、反応液を室温に昇温し、さらに１時間撹拌した。その後、反応液を減圧濃縮し、得られた残渣にエタノール／水（８／２、１６．６ｍＬ）を加えて冷凍庫で２日放置した。得られた固体をろ過し、エタノール／水（８／２、２０ｍＬ）で洗浄し、減圧乾燥させることでメチルＯ−（４−クロロフェニル）−Ｎ−トリチル−Ｌ−セリナート（Ｔｒｔ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−４−Ｃｌ）−ＯＭｅ）（７．２９ｇ、５６％）を得た。
上述のメチルＯ−（４−クロロフェニル）−Ｎ−トリチル−Ｌ−セリナート（Ｔｒｔ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−４−Ｃｌ）−ＯＭｅ）に４Ｎ塩酸／１，４−ジオキサン溶液（５３．２ｍＬ、２１３ｍｍｏｌ）を加え、室温で５分撹拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた固体にヘキサンを加え、ろ過し、固体をさらにヘキサンで洗浄した。得られた固体を減圧下乾燥させることでメチルＯ−（４−クロロフェニル）−Ｌ−セリナート（Ｈ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−４−Ｃｌ）−ＯＭｅ）を塩酸塩として得た（４．１５ｇ）。
上述のメチルＯ−（４−クロロフェニル）−Ｌ−セリナート（Ｈ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−４−Ｃｌ）−ＯＭｅ）の塩酸塩（３００ｍｇ、１．１２７ｍｍｏｌ）を水（１．６７ｍＬ）に溶解させ、氷冷下、水酸化リチウム一水和物（９５ｍｇ、２．２５５ｍｍｏｌ）の水／メタノール（６６８μＬ／６６８μＬ）溶液を５分かけて滴下し、０度で１時間撹拌した。反応液にさらに水酸化リチウム一水和物（９．５ｍｇ、０．２２５５ｍｍｏｌ）の水／メタノール（６６．８μＬ／６６．８μＬ）溶液を０度にて加え、２０分撹拌した。反応液に１，４−ジオキサン（２．３３７ｍＬ）、炭酸ナトリウム（２３９ｍｇ、２．２５５ｍｍｏｌ）、水（２．４ｍＬ）、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（３８０ｍｇ、１．１２７ｍｍｏｌ）を加え、０度で５分間撹拌した後、室温で１時間撹拌した。反応液に０度にて２Ｎ塩酸水溶液をｐＨ＝２になるまで加えた後、冷凍庫で放置した。得られた固体をヘキサン、水、ヘキサンで洗浄することで、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（４−クロロフェニル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１９０、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−４−Ｃｌ）−ＯＨ）（５２６．２ｍｇ）を定量的に得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４３８ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−モルホリノエチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１９１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｅｔ−２−Ｍｏｒ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、市販の（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−セリン（Ｂｏｃ−Ｓｅｒ−ＯＨ）（２０ｇ、９７．４６ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（１００ｍＬ）に水素化ナトリウム（７．７１８ｇ、３２１．６２ｍｍｏｌ、６０％オイルディスパージョン）を室温にて加え、１時間撹拌した。反応液を０度に冷却し、４−（２−クロロエチル）モルホリン（１６．０４０ｇ、１０７．２１ｍｍｏｌ）を滴下しながら加え、室温にて１６時間撹拌した。反応液に０度にて５０％ギ酸水溶液を加え、ろ過を行った後、得られたろ液を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）で精製し、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｏ−（２−モルホリノエチル）−Ｌ−セリン（Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｅｔ−２−Ｍｏｒ）−ＯＨ）（５．６ｇ、１８％）を得た。
Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｏ−（２−モルホリノエチル）−Ｌ−セリン（Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｅｔ−２−Ｍｏｒ）−ＯＨ）（５．６ｇ、１７．５９ｍｍｏｌ）に４Ｎ塩酸／１，４−ジオキサン溶液（２８．０ｍＬ、９２１．５３ｍｍｏｌ）を室温にて加え、１時間撹拌した。減圧下溶媒を留去し、得られた残渣をジクロロメタンで洗浄した後、水（１０ｍＬ）を加え溶液とした。得られた溶液に炭酸カリウムを加えｐＨ７に調節し、水（１００ｍＬ）と１．４−ジオキサン（１５０ｍＬ）を加えた後、室温にて炭酸カリウム（４．４６５ｇ、３２．０７ｍｍｏｌ）、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（５．６８ｇ、１６．８４ｍｍｏｌ）を加え、１６時間撹拌した。反応液をジエチルエーテルで洗浄し、濃塩酸を用いて水層のｐＨを１に調節し、ジクロロメタンで３回抽出した。得られた有機層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。ろ液を減圧下濃縮し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％塩酸水溶液／０．１％塩酸アセトニトリル溶液）で精製することでＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−モルホリノエチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１９１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｅｔ−２−Ｍｏｒ）−ＯＨ）の塩酸塩（３．２ｇ、２工程４８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４４１ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−ブチルグリシン（化合物ａａ１９２、Ｆｍｏｃ−ｎＢｕＧｌｙ−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
水素化ナトリウム（２６ｇ、１．０８ｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（５００ｍＬ）にｔｅｒｔ−ブチル（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）グリシナート（Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯｔＢｕ）（１００ｇ、４３２．３６ｍｍｏｌ）を少しずつ室温で加え、３０分撹拌した後、１−ヨードブタン（２３９ｇ、１．３０ｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（５０ｍＬ）を滴下しながら加えた。反応液を１６時間室温にて撹拌したのち、水を加えた。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を減圧下除去した後、酢酸エチルを用いて３回抽出し、得られた有機溶媒を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）で精製し、ｔｅｒｔ−ブチルＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−ブチルグリシナート（Ｂｏｃ−ｎＢｕＧｌｙ−ＯｔＢｕ）（１３０ｇ）を定量的に得た。
上述の方法で得たｔｅｒｔ−ブチルＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−ブチルグリシナート（Ｂｏｃ−ｎＢｕＧｌｙ−ＯｔＢｕ）（２６０ｇ、９０４．６８ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液（１０００ｍＬ）に濃塩酸（１０００ｍＬ）を０度にて滴下しながら加えた。反応液を室温に昇温した後、１６時間室温にて撹拌した。反応液を濃縮することでブチルグリシン（Ｈ−ｎＢｕＧｌｙ−ＯＨ）（２００ｇ）の塩酸塩を粗生成物として得た。
粗生成物であるブチルグリシン（Ｈ−ｎＢｕＧｌｙ−ＯＨ）（６０ｇ）、炭酸カリウム（１８８．９ｇ、１．３７ｍｏｌ）、水／１，４−ジオキサン（１：１）（３０００ｍＬ）の混合物を室温にて３０分間撹拌した後、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（１８３．２ｇ、５４３．０９ｍｍｏｌ）を少しずつ室温にて加えた。反応液を室温にて１６時間撹拌した後、エーテルで３回洗浄した。得られた水層がｐＨ＝３になるまで５Ｍ塩酸水溶液を加えた後、酢酸エチルで３回抽出した。有機溶媒を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去した。得られた粗生成物をエーテルで洗浄することで、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−ブチルグリシン（化合物ａａ１９２、Ｆｍｏｃ−ｎＢｕＧｌｙ−ＯＨ）（１２１ｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ３５４ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−イソペンチルグリシン（化合物ａａ１９３、Ｆｍｏｃ−ｉＰｅｎＧｌｙ−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
３−メチルブタン−１−アミン（１１．９２ｍＬ、１０３ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１００ｍＬ）に２−ブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチル（１０ｇ、５１．３ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１００ｍＬ）を０度にて滴下しながら加え、反応液を０度で１０分撹拌した後、室温で１時間攪拌した。反応液に０度にて水（１６５ｍＬ）を加えた後、炭酸ナトリウム（１１．９５ｇ、１１３ｍｍｏｌ）、カルボノクロリド酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（Ｆｍｏｃ−Ｃｌ）（２９．２ｇ、１１３ｍｍｏｌ）を少量づつ１５回に分けて加えた後、室温で１時間撹拌した。反応液に０度にて飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した後、水、飽和食塩水で洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去することで得られた残渣にヘキサンを加え、ろ過をした。ろ液を濃縮し、得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）により精製することでｔｅｒｔ−ブチルＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−イソペンチルグリシナート（Ｆｍｏｃ−ｉＰｅｎＧｌｙ−ＯｔＢｕ）（１５．３４ｇ、７１％）を得た。
上述のｔｅｒｔ−ブチルＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−イソペンチルグリシナート（Ｆｍｏｃ−ｉＰｅｎＧｌｙ−ＯｔＢｕ）（１２．３４ｇ、２９．１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１３３．４ｍＬ）に室温にてトリフルオロ酢酸（６６．７ｍＬ）を滴下しながら加えた後、１時間撹拌した。反応液にトルエン（１００ｍＬ）を加え、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去する操作を３回繰り返した後、得られた残渣にヘキサン（３００ｍＬ）を加え冷凍庫で保管した。得られた固体をヘキサンで洗浄しながらろ過することで、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−イソペンチルグリシン（化合物ａａ１９３、Ｆｍｏｃ−ｉＰｅｎＧｌｙ−ＯＨ）（１１．８３ｇ、８９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ３６８ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）ブタン酸（化合物ａａ１９４、Ｆｍｏｃ−Ａｂｕ（５−Ｏｘｏ−Ｏｄｚ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、市販の（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−グルタミン（Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨ）（５０ｇ、２０３．０３ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（３５０ｍＬ）にＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（４６．１ｇ、２２３．４３ｍｍｏｌ）を室温にて加え、２時間撹拌した。反応液をろ過し、ろ液を濃縮することで得られた残渣にジクロロメタン、濃塩酸をｐＨ＝３になるように調整しながら加え、ジクロロメタンで２回抽出した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った後、減圧下溶媒留去した。得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製することで、（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−シアノブタン酸（４５．５ｇ、９８％）を得た。
上述のように得られた（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−シアノブタン酸（５０ｇ、２１９．０６ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（５００ｍＬ）に室温にてヒドロキシルアミンの塩酸塩（３２ｇ、４６０．５０ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（８３ｍＬ）を加え、８０度で２時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮することで、（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−５−（ヒドロキシアミノ）−５−イミノペンタン酸（１０７ｇ）を粗生成物として得た。
窒素雰囲気下、上述の粗生成物である（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−５−（ヒドロキシアミノ）−５−イミノペンタン酸（４４ｇ、１６８．４０ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液（５００ｍＬ）に室温にて１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（３９ｇ、２４０．５２ｍｍｏｌ）と１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ）（５５ｇ、３６１．２７ｍｍｏｌ）を加え、１１０度で４時間撹拌した。反応液を室温にて冷却した後、濃塩酸を加えｐＨ＝２になるように調整し、ジクロロメタンで２回抽出した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った後、減圧下溶媒留去することで、（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−（５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）ブタン酸（Ｂｏｃ−Ａｂｕ（５−Ｏｘｏ−Ｏｄｚ）−ＯＨ）（１１ｇ）を粗生成物として得た。
窒素雰囲気下、上述のように得られた（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−（５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）ブタン酸（Ｂｏｃ−Ａｂｕ（５−Ｏｘｏ−Ｏｄｚ）−ＯＨ）（１３．５ｇ、４６．９９ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液（１０ｍＬ）に室温にて４Ｎ塩酸／１，４−ジオキサン溶液（１４０ｍＬ）を加え、１６時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮することで、（Ｓ）−２−アミノ−４−（５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）ブタン酸（Ｈ−Ａｂｕ（５−Ｏｘｏ−Ｏｄｚ）−ＯＨ）（８．８ｇ）を粗生成物として得た。
窒素雰囲気下、得られた粗生成物である（Ｓ）−２−アミノ−４−（５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）ブタン酸（Ｈ−Ａｂｕ（５−Ｏｘｏ−Ｏｄｚ）−ＯＨ）（８．８ｇ、４７．０２ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム（１３ｇ、９４．０６ｍｍｏｌ）の水／１，４−ジオキサン溶液（１００ｍＬ／１００ｍＬ）に室温にて、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（１４．３ｇ、４２．４ｍｍｏｌ）を加え、３時間撹拌した。反応液をｔ−ブチルメチルエーテル／ヘキサン（１／３）で洗浄し、濃塩酸を用いて水層のｐＨを２に調節し、ジクロロメタンで２回抽出した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。ろ液を減圧下濃縮し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）で精製することで、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）ブタン酸（化合物ａａ１９４、Ｆｍｏｃ−Ａｂｕ（５−Ｏｘｏ−Ｏｄｚ）−ＯＨ）（２．６７ｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４１０ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
化合物ａａ１９６（Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｂｕ（５−Ｏｘｏ−Ｏｄｚ）−ＯＨ）の合成は、以下のスキームに従って行った。
Figure 2018225864
（４Ｓ）−５−オキソ−４−［２−（５−オキソ−４Ｈ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）エチル］オキサゾリジン−３−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル（化合物ａａ１９５）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）ブタン酸（化合物ａａ１９４、Ｆｍｏｃ−Ａｂｕ（５−Ｏｘｏ−Ｏｄｚ）−ＯＨ）（９３ｍｇ、０．２２７ｍｍｏｌ）、パラホルムアルデヒド（３４．１ｍｇ、１．１３６ｍｍｏｌ）および無水硫酸マグネシウム（６８．４ｍｇ、０．５６８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２．２７ｍＬ）に懸濁させ、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（ＢＦ３・ＯＥｔ２）（２８．８μＬ、０．２２７ｍｍｏｌ）を室温で添加し、２３時間撹拌した。その後、固体をろ過により除去し、ろ液を減圧濃縮した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）で精製し、（４Ｓ）−５−オキソ−４−［２−（５−オキソ−４Ｈ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）エチル］オキサゾリジン−３−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル（化合物ａａ１９５）（２６．０ｍｇ、２７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４２２ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７３分（分析条件 ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ）−２−［９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル（メチル）アミノ］−４−（５−オキソ−４Ｈ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）ブタン酸（化合物ａａ１９６、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｂｕ（５−Ｏｘｏ−Ｏｄｚ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（４Ｓ）−５−オキソ−４−［２−（５−オキソ−４Ｈ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）エチル］オキサゾリジン−３−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル（化合物ａａ１９５）（２３ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）およびトリエチルシラン（７８μＬ、０．４９１ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（６３．１μＬ）およびジクロロエタン（１８２μＬ）に溶解し、室温で３時間撹拌した。反応液を減圧濃縮して得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）で精製し、（２Ｓ）−２−［９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル（メチル）アミノ］−４−（５−オキソ−４Ｈ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）ブタン酸（化合物ａａ１９６、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｂｕ（５−Ｏｘｏ−Ｏｄｚ）−ＯＨ）（２２．１ｍｇ、９６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４２４ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６７分（分析条件 ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸（化合物ａａ１９７、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
スクリューキャップ型の反応容器を用いて、市販の（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸（Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＨ）（４．０ｇ、１０．３０ｍｍｏｌ）とパラホルムアルデヒド（１．８５５ｇ、６１．８ｍｍｏｌ）の酢酸溶液（１６ｍＬ）を９０度にて５時間撹拌した。反応液を室温で冷却した後、減圧下溶媒留去し、得られた残渣に酢酸エチルを加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過を行った後、有機溶媒を減圧下留去し、粗生成物である５−オキソ−４−（ピリジン−３−イルメチル）オキサゾリジン−３−カルボン酸（Ｓ）−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（３．１７ｇ）を得た。
窒素雰囲気下、スクリューキャップ型の反応容器を用いて、上記の粗生成物である５−オキソ−４−（ピリジン−３−イルメチル）オキサゾリジン−３−カルボン酸（Ｓ）−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（２．８１ｇ）のジクロロエタン（ＤＣＥ）溶液（２８．５ｍＬ）にトリエチルシラン（１３．４５ｍＬ、８４ｍｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（１９．４６ｍＬ、２５３ｍｍｏｌ）を室温にて加え、反応液を８５度で２時間撹拌した。反応液を室温にて冷却した後、減圧下溶媒留去し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸（化合物ａａ１９７、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＨ）（２．６８ｇ、９５％）を得た
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ４０３ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１９８、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｅｔ−２−ＮＭｅ２）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、市販のトリチル−Ｌ−セリン（Ｔｒｔ−Ｓｅｒ−ＯＨ）のトリエチルアミン塩（５ｇ、１１．１５ｍｍｏｌ）にジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（４０ｍＬ）を加えた後、ナトリウムｔｅｒｔ−ペントキシド（７．３６ｇ、６６．９ｍｍｏｌ）を室温にて加え、３０分撹拌した。反応液に室温にて、２−クロロ−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタン−１−アミン塩酸塩（４．０１ｇ、２７．９ｍｍｏｌ）を加え、終夜撹拌した。反応液にギ酸（６．４１ｍＬ、１６７ｍｍｏｌ）を加え、逆相カラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）で精製し、Ｏ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）−Ｎ−トリチル−Ｌ−セリン（Ｔｒｔ−Ｓｅｒ（Ｅｔ−２−ＮＭｅ２）−ＯＨ）（４．１ｇ）を得た。
得られた、Ｏ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）−Ｎ−トリチル−Ｌ−セリン（Ｔｒｔ−Ｓｅｒ（Ｅｔ−２−ＮＭｅ２）−ＯＨ）（４．１ｇ、９．８０ｍｍｏｌ）にジクロロメタン（１０ｍＬ）を加えた後、４Ｎ塩酸／１，４−ジオキサン溶液（４０ｍＬ、１６０ｍｍｏｌ）、水（４ｍＬ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応液に水（８０ｍＬ）を加え、ヘキサンで２回洗浄し、得られた水層に０度にて炭酸ナトリウム（２６．０ｇ、２４５ｍｍｏｌ）、１、４−ジオキサン（１２０ｍＬ）、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（３．９７ｇ、１１．７６ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２時間撹拌した。反応液にギ酸（１１．２８ｍＬ、２９４ｍｍｏｌ）を加えた後、減圧下１，４−ジオキサンを留去し、得られた水層を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）で精製することでＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１９８、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｅｔ−２−ＮＭｅ２）−ＯＨ）のギ酸塩（３．０７ｇ、３工程６９％）を得た。得られたＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１９８、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｅｔ−２−ＮＭｅ２）−ＯＨ）のギ酸塩（３．０ｇ、７．５３ｍｍｏｌ）にジクロロメタン（４ｍＬ）、４Ｎ塩酸／１、４−ジオキサン溶液（９．４１１ｍＬ、３７．６ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２０分撹拌した。反応液を減圧濃縮することで、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１９８、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｅｔ−２−ＮＭｅ２）−ＯＨ）の塩酸塩（２．７ｇ、８２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３９９ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｎ２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ５−（メチルスルホニル）−Ｌ−グルタミン（化合物ａａ１９９、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｍｓ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、市販の（Ｓ）−４−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−５−オキソペンタン酸（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）（２０ｇ、４７ｍｍｏｌ）、メタンスルホンアミド（２０ｇ、２１０ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（１．３ｇ、１０．６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３６０ｍＬ）に１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ・ＨＣｌ）（９．６４ｇ、５０．３ｍｍｏｌ）を室温にて加え、１６時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮し、酢酸エチルを加え、０．１％塩酸水溶液で３回、水で１回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。得られた溶液を減圧下濃縮し、残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）で精製することで、ｔｅｒｔ−ブチルＮ２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ５−（メチルスルホニル）−Ｌ−グルタミナート（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｍｓ）−ＯｔＢｕ）（９．３ｇ、３９％）を得た。
窒素雰囲気下、上述のようにして得られた、ｔｅｒｔ−ブチルＮ２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ５−（メチルスルホニル）−Ｌ−グルタミナート（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｍｓ）−ＯｔＢｕ）（５．５ｇ、１０．９）の２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）溶液（１００ｍＬ）に０度にてクロロトリメチルシラン（ＴＭＳＣｌ）（３．５７ｇ、３２．８６１ｍｍｏｌ））を加え、１時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮し、得られた残渣にｔ−ブチルメチルエーテルを加え再び濃縮した。この操作をさらに２回繰り返し、アセトニトリル／ジクロロメタンで再結晶を行うことで、Ｎ２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ５−（メチルスルホニル）−Ｌ−グルタミン（化合物ａａ１９９、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｍｓ）−ＯＨ）（３．８１７８ｇ、７７％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４４７ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
メチルＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ２００、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＭｅ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、別途合成した（Ｓ）−アジリジン−１，２−ジカルボン酸２−メチル１−（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル）（化合物ａａ２０４、Ｆｍｏｃ−Ａｚｙ−ＯＭｅ）（０．２０ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）と３，３，３−トリフルオロプロパン−１，２−ジオール（０．２４ｇ、１．９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３．０ｍＬ）に三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（ＢＦ３・ＯＥｔ２）（７．８μＬ、０．０６２ｍｍｏｌ）を０度にて加え、３０分間撹拌した。また、窒素雰囲気下、（Ｓ）−アジリジン−１，２−ジカルボン酸２−メチル１−（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル）（化合物ａａ２０４、Ｆｍｏｃ−Ａｚｙ−ＯＭｅ）（５．０ｇ、１５．４６ｍｍｏｌ）と３，３，３−トリフルオロプロパン−１，２−ジオール（６．０３ｇ、４６．４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（７７．０ｍＬ）に三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（ＢＦ３・ＯＥｔ２）（０．１９ｍＬ、１．５５ｍｍｏｌ）を０度にて加え、３０分間撹拌した。さらに、窒素雰囲気下、（Ｓ）−アジリジン−１，２−ジカルボン酸２−メチル１−（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル）（化合物ａａ２０４、Ｆｍｏｃ−Ａｚｙ−ＯＭｅ）（３．６ｇ、１１．１３ｍｍｏｌ）と３，３，３−トリフルオロプロパン−１，２−ジオール（４．３４ｇ、３３．４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（５５．７ｍＬ）に三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（ＢＦ３・ＯＥｔ２）（０．１４ｍＬ、１．１１ｍｍｏｌ）を０度にて加え、３０分間撹拌した。
上記３つの反応液にそれぞれ飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた後、全ての反応液を合わせ減圧下、大部分の有機溶媒を留去し、残った溶液に酢酸エチル（３００ｍＬ）を加え抽出した。有機層を飽和食塩水溶液で洗浄した後、有機溶媒を減圧下留去した。得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）にて精製し、メチルＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ２００、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＭｅ）（６．５７ｇ、５３％、純度９５％）および同化合物（３．１ｇ、２５％、純度８７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ４５４ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．１８分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ４５）
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ２０１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
塩化カルシウム（２．０６ｇ、１８．５ｍｍｏｌ）を水（５．２ｍＬ）に溶解し、水酸化リチウムの１水和物（２０７ｍｇ、４．９４ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１０分撹拌した。その溶液にメチルＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ２００、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＭｅ）（５６０ｍｇ、１．２４ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（５．１５ｍＬ）、イソプロパノール（２０．６ｍＬ）溶液を加え、室温にて２時間撹拌した。１Ｎ塩酸水溶液を加え反応を終結させた。さらに、０．１５ｇ、１．１１ｇ、０．４８ｇ、０．９６ｇのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＭｅをそれぞれ用いて、同様に反応を実施した。全ての反応液を集め、減圧下大部分の溶媒を留去した。得られた溶液に酢酸エチルと水を加え、抽出した。有機層を減圧下留去した後、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ２０１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＨ）（３．１０ｇ、９８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ４６２ （Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：２．２４分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ４６）
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｏ−（３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ２０２、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ２０１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＨ）（１．８４ｇ、４．１９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２０．９ｍＬ）にパラホルムアルデヒド（１５１ｍｇ、５．０３ｍｍｏｌ）、無水硫酸マグネシウム（１．２６ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（ＢＦ３・ＯＥｔ２）（５２６μＬ、４．１９ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３時間撹拌した。不溶物を除去するため反応液をろ過した後、ジクロロメタン（１０ｍＬ）で洗浄した。
ろ過した反応液にトリエチルシラン（２．０ｍＬ、１２．６ｍｍｏｌ）、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（ＢＦ３・ＯＥｔ２）（１．５８ｍＬ、１２．６ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間撹拌した。反応液を飽和食塩水で希釈し、ジクロロメタンで抽出した。得られた有機層を減圧濃縮した後、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｏ−（３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ２０２、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＨ）（６４０ｍｇ、３４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４５２ （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：２．３３分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ４７）
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３，３，３−トリフルオロ−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ２０３、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ２０１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＨ）（２．５２ｇ、５．７４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１９．１２ｍＬ）に３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（３．９２ｍＬ、４３．０ｍｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（０．１４４ｇ、０．５７４ｍｍｏｌ）を加え、４０度にて終夜撹拌した。その後、反応液に水を加え、ジクロロメタンにて抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、減圧濃縮により溶媒を除去した。得られた残渣をテトラヒドロフラン（２９ｍＬ）に溶解し、１Ｍのリン酸水溶液（ｐＨ＝８，２９ｍＬ）を加え５０度で３時間撹拌した。反応液を水で希釈し、酢酸エチルで２回抽出した。有機層を合わせ飽和食塩水にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、減圧濃縮により溶媒を除去した。得られた残渣をジクロロメタン（６０ｍＬ）とヘプタン（６０ｍＬ）に溶解後、ジクロロメタンを減圧濃縮することで油状粗生成物を沈殿させた。ヘプタン溶液をデカンテーションにて除去した。この操作を２度繰り返した。得られた粗生成物を酢酸エチルに溶解し、０．０５Ｍリン酸水溶液で２回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過後、減圧濃縮しＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３，３，３−トリフルオロ−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ２０３、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）（２．８９ｇ、９６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝５２２（Ｍ−Ｈ）−
保持時間：１．００分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５−２）
（Ｓ）−アジリジン−１，２−ジカルボン酸２−メチル１−（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル）（化合物ａａ２０４、Ｆｍｏｃ−Ａｚｙ−ＯＭｅ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、市販の（Ｓ）−１−トリチルアジリジン−２−カルボン酸メチル（Ｔｒｔ−Ａｚｙ−ＯＭｅ）（５０ｇ、１４５．６０ｍｍｏｌ）のクロロホルム／メタノール溶液（１４５ｍＬ／１４５ｍＬ）に０度にてトリフルオロ酢酸（３３ｍＬ）を滴下しながら加え、反応液を７時間撹拌した。反応液に０度にてＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１２７ｍＬ）、カルボノクロリド酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（Ｆｍｏｃ−Ｃｌ）（３６ｇ、１３９．１６ｍｍｏｌ）の１、４−ジオキサン溶液（１４５ｍＬ）を滴下しながら加え、反応液を０度にて１時間３０分撹拌した。反応液の溶媒を減圧下留去し、酢酸エチルで希釈した後、水、飽和塩化アンモニウム水溶液で２回、飽和食塩水で２回洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った後、減圧下溶媒留去することで得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）で精製することで、（Ｓ）−アジリジン−１，２−ジカルボン酸２−メチル１−（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル）（化合物ａａ２０４、Ｆｍｏｃ−Ａｚｙ−ＯＭｅ）（４０ｇ、２工程８５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝３２４（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）−６−オキソヘキサン酸メチル（化合物ａａ２０５）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、市販の（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−６−ヒドロキシヘキサン酸（Ｂｏｃ−Ｎｌｅ（６−ＯＨ）−ＯＨ）（１０ｇ、４０．４ｍｍｏｌ）のトルエン／メタノール（９０ｍＬ／６０ｍＬ）溶液に２Ｍの（トリメチルシリル）ジアゾメタン／ヘキサン溶液（２４．２６ｍＬ、４８．５ｍｍｏｌ）を滴下しながら室温にて加え、終夜撹拌した。反応液をロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮することで得られた残渣にトルエン／メタノール（９０ｍＬ／６０ｍＬ）溶液を加え、溶解させた後、２Ｍの（トリメチルシリル）ジアゾメタン／ヘキサン溶液（２４．２６ｍＬ、４８．５ｍｍｏｌ）を滴下しながら室温にて加え、６時間撹拌した。反応液をロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮することで、粗生成物として（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−６−ヒドロキシヘキサン酸メチル（Ｂｏｃ−Ｎｌｅ（６−ＯＨ）−ＯＭｅ）（１３ｇ）を得た。
得られた粗生成物である（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−６−ヒドロキシヘキサン酸メチル（Ｂｏｃ−Ｎｌｅ（６−ＯＨ）−ＯＭｅ）（１３ｇ）に４Ｎ塩酸／１．４−ジオキサン溶液（５０ｍＬ、２００ｍｍｏｌ）を室温にて加え、６時間撹拌した。反応液をロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮することで、粗生成物として（Ｓ）−２−アミノ−６−ヒドロキシヘキサン酸メチルの塩酸塩（Ｈ−Ｎｌｅ（６−ＯＨ）−ＯＭｅ）（９．２ｇ）を得た
得られた粗生成物である（Ｓ）−２−アミノ−６−ヒドロキシヘキサン酸メチルの塩酸塩（Ｈ−Ｎｌｅ（６−ＯＨ）−ＯＭｅ）（９．２ｇ）のアセトニトリル溶液（１００ｍＬ）に１，３−ジオキソイソインドリン−２−カルボン酸エチル（９．７４ｇ、４４．４ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１５．５２ｍＬ、８９ｍｍｏｌ）を室温にて加え、終夜撹拌した。反応液をロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮することで、得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール）で精製することで（Ｓ）−２−（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）−６−ヒドロキシヘキサン酸メチル（１４．６ｇ）を得た。
上述の（Ｓ）−２−（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）−６−ヒドロキシヘキサン酸メチル（７．０８ｇ、２４．３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１００ｍＬ）にデス−マーチンペルヨージナン（ＣＡＳ＃８７４１３−０９−０、１１．３４ｇ、２６．７ｍｍｏｌ）を０度にて加え、室温にて３時間撹拌した。反応液をジクロロメタンで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液／水（１／１）の溶液、飽和チオ硫酸ナトリウム、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過を行った後、減圧濃縮することで得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製することで、（Ｓ）−２−（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）−６−オキソヘキサン酸メチル（化合物ａａ２０５）（３．６ｇ、４工程５１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ２９０ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７０分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）
（２Ｓ）−２−（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）−７，７，７−トリフルオロ−６−ヒドロキシヘプタン酸メチル（化合物ａａ２０６）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−２−（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）−６−オキソヘキサン酸メチル（化合物ａａ２０５）（３．６２ｇ、１２．５１ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（５０ｍＬ）に０度にて（トリフルオロメチル）トリメチルシラン（１．３９０ｍＬ、９．３９ｍｍｏｌ）、１Ｍのテトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）／テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（０．６２６ｍＬ、０．６２６ｍｍｏｌ）を加え、０度にて１０分間撹拌した。反応液に（トリフルオロメチル）トリメチルシラン（１．３９０ｍＬ、９．３９ｍｍｏｌ）、１Ｍのテトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）／テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（０．６２６ｍＬ、０．６２６ｍｍｏｌ）を０度にて加え、３０分撹拌した。さらに反応液に（トリフルオロメチル）トリメチルシラン（１．３９０ｍＬ、９．３９ｍｍｏｌ）、１Ｍのテトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）／テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（０．６２６ｍＬ、０．６２６ｍｍｏｌ）を０度にて加え、２時間３０分撹拌した。反応液に１Ｎ塩酸水溶液（３７．５ｍＬ）を０度にて加え、室温で２０分間撹拌した後、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過を行い、減圧濃縮することで得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）で精製することで、（２Ｓ）−２−（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）−７，７，７−トリフルオロ−６−ヒドロキシヘプタン酸メチル（化合物ａａ２０６）（１．８ｇ、４０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ３５８ （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．８１分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）
（２Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−７，７，７−トリフルオロ−６−ヒドロキシヘプタン酸メチル（化合物ａａ２０７、Ｆｍｏｃ−Ｈｎｌ（７−Ｆ３−６−ＯＨ）−ＯＭｅ）の合成
Figure 2018225864
上述の方法で得た、（２Ｓ）−２−（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）−７，７，７−トリフルオロ−６−ヒドロキシヘプタン酸メチル（化合物ａａ２０６）（３．１ｇ、８．６３ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（３０ｍＬ）にヒドラジンの１水和物（１．２５８ｍＬ、２５．９ｍｍｏｌ）、酢酸（１．４８２ｍＬ、２５．９ｍｍｏｌ）を室温にて加え、終夜撹拌した。メタノールを除去するために、反応液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、得られた溶液をジメチルスルホキシドで希釈した後、逆相カラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）で精製することで、（２Ｓ）−２−アミノ−７，７，７−トリフルオロ−６−ヒドロキシヘプタン酸メチル（Ｈ−Ｈｎｌ（７−Ｆ３−６−ＯＨ）−ＯＭｅ）（２ｇ）を得た。
上記の（２Ｓ）−２−アミノ−７，７，７−トリフルオロ−６−ヒドロキシヘプタン酸メチル（Ｈ−Ｈｎｌ（７−Ｆ３−６−ＯＨ）−ＯＭｅ）（２ｇ、８．７３ｍｍｏｌ）に水（２５ｍＬ）、炭酸ナトリウム（２．９３ｇ、３４．９ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）、炭酸Ｎ−スクシンイミジル９−フルオレニルメチル（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（３．５３ｇ、１０．４７ｍｍｏｌ）を室温にて加え、反応液を２時間撹拌した。テトラヒドロフランを除去するために反応液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、酢酸エチル、１Ｎ塩酸水溶液を加え、酢酸エチルで２回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムにて乾燥後、ろ過、減圧濃縮した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）、順相カラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール）で精製した後、さらに、逆相カラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）で精製することで得られたフラクションを集め、メタノールを減圧下留去し、酢酸エチルで２回抽出し、飽和硫酸水素カリウム溶液、飽和食塩水で洗浄した。得られた有機溶媒を減圧下留去しすることで、（２Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−７，７，７−トリフルオロ−６−ヒドロキシヘプタン酸メチル（化合物ａａ２０７、Ｆｍｏｃ−Ｈｎｌ（７−Ｆ３−６−ＯＨ）−ＯＭｅ）（１．４ｇ、２工程３６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４５２ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−７，７，７−トリフルオロ−６−ヒドロキシヘプタン酸（化合物ａａ２０８、Ｆｍｏｃ−Ｈｎｌ（７−Ｆ３−６−ＯＨ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
塩化カルシウム（５．１６ｇ、４６．５ｍｍｏｌ）の水溶液（７．００ｍＬ）に水酸化リチウムの１水和物（０．５２１ｇ、１２．４０ｍｍｏｌ）を室温にて加え、５分間撹拌した。（２Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−７，７，７−トリフルオロ−６−ヒドロキシヘプタン酸メチル（化合物ａａ２０７、Ｆｍｏｃ−Ｈｎｌ（７−Ｆ３−６−ＯＨ）−ＯＭｅ）（１．４ｇ、３．１０ｍｍｏｌ）のイソプロパノール／テトラヒドロフラン溶液（２８ｍＬ／７ｍＬ）を室温にて滴下しながら加え、反応液を終夜撹拌した。反応液に１Ｎ塩酸水溶液を加え、ｔ−ブチルメチルエーテルで２回抽出し、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、ろ過、減圧濃縮を行うことで得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（２Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−７，７，７−トリフルオロ−６−ヒドロキシヘプタン酸（化合物ａａ２０８、Ｆｍｏｃ−Ｈｎｌ（７−Ｆ３−６−ＯＨ）−ＯＨ）（９５０ｍｇ、７０％）で得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４３８．６ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
１−３．ペプチド合成機によるペプチド合成に用いるレジン合成
ペプチド合成機によるペプチド合成に用いるレジンは、以下のとおり合成した。２−クロロトリチルクロライドレジン（１００−２００ｍｅｓｈ、１％ＤＶＢ）は渡辺化学工業及びＣｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ社から購入した。
（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−オキソ−４−（ピペリジン−１−イル）ブタン酸−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ０１、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−ｒｅｓｉｎ）−ｐｉｐ）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−オキソ−４−（ピペリジン−１−イル）ブタン酸−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ０１、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−ｒｅｓｉｎ）−ｐｉｐ）は、ＷＯ２０１３／１００１３２に記載の方法にて合成した。
なお、本明細書では、ポリマーやレジンと化合物が結合した場合、ポリマーやレジン部位を○にて表記する場合がある。また、レジン部位の反応点を明確にさせる目的で、○に接続させて反応部位の化学構造を表記させる場合がある。上の構造では、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−ｒｅｓｉｎ）−ｐｉｐ（化合物ｐｄ０１）において、レジン上の２−クロロトリチル基がＡｓｐの側鎖カルボン酸とエステル結合を介して結合している様子を示している。
（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−オキソ−４−（ピペリジン−１−イル）ブタン酸−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ０７、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｓｐ（Ｏ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−Ｒｅｓｉｎ）−ｐｉｐ）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−オキソ−４−（ピペリジン−１−イル）ブタン酸−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ０７、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｓｐ（Ｏ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−Ｒｅｓｉｎ）−ｐｉｐ）は下記のルートにて合成した。
Figure 2018225864
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（アリルオキシ）−４−オキソブタン酸（化合物ｐｄ０４、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｓｐ（ＯＡｌ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（アリルオキシ）−４−オキソブタン酸（化合物ｐｄ０２、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＡｌ）−ＯＨ）（１０．０ｇ、２５．３ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（１００ｍＬ）に室温にてパラホルムアルデヒド（１．５２ｇ）、トシル酸（ＴｓＯＨ、２６０ｍｇ、１．５１ｍｍｏｌ）を加え、１１０℃にて１６時間撹拌した。その後、室温まで反応液を冷却し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液による洗浄を２回行った。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過、減圧濃縮し、粗生成物として（Ｓ）−４−（２−（アリルオキシ）−２−オキソエチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ｐｄ０３、８．０ｇ）を得た。
窒素雰囲気下、前工程にて得られた（Ｓ）−４−（２−（アリルオキシ）−２−オキソエチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ｐｄ０３、５．０ｇ、１２．３ｍｍｏｌ）とトリエチルシラン（Ｅｔ３ＳｉＨ、４．３ｇ、３７．０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン／トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）＝１／１（８０ｍＬ／８０ｍＬ）の溶液を室温にて２日間撹拌した後、反応液を減圧濃縮した。得られた残渣に炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）水溶液を加え、石油エーテルで３回洗浄した後、塩酸を用いてｐＨ３まで調整し、酢酸エチルを用いて３回抽出した。有機層をまとめて、無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過、減圧濃縮し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル）にて精製し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（アリルオキシ）−４−オキソブタン酸（化合物ｐｄ０４、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｓｐ（ＯＡｌ）−ＯＨ）（３．０ｇ、４６％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４１０（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−オキソ−４−（ピペリジン−１−イル）ブタン酸アリル（化合物ｐｄ０５、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｓｐ（ＯＡｌ）−ｐｉｐ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣＩ・ＨＣｌ）（１．６．５ｇ、８６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１４３ｍＬ）に１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（１０．６ｇ、７９ｍｍｏ）を０℃にて加え、続いて（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（アリルオキシ）−４−オキソブタン酸（化合物ｐｄ０４、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｓｐ（ＯＡｌ）−ＯＨ）（２９．３ｇ、７１．６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ／ＤＣＭ＝１／１の混合溶液（１１７ｍＬ）を０℃にて滴下しながら加え、３０分撹拌した。その後、ピペリジン（８．４９ｍＬ、８６ｍｍｏｌ）を０℃で滴下しながら加え、３０分撹拌した。反応の進行をＬＣ−ＭＳにて確認した後、反応液に酢酸エチルを加え、室温まで昇温した。得られた有機層を２Ｍの塩酸水溶液で２回、５％炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、飽和食塩水で２回洗浄した後、硫酸マグネシウムにて乾燥した。得られた混合物をろ過、減圧濃縮し、（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−オキソ−４−（ピペリジン−１−イル）ブタン酸アリル（化合物ｐｄ０５、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｓｐ（ＯＡｌ）−ｐｉｐ）（３３．７ｇ、９９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４７７（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．３２分（分析条件ＳＭＤｍｅｔｈｏｄ６）
（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−オキソ−４−（ピペリジン−１−イル）ブタン酸（化合物ｐｄ０６、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｓｐ−ｐｉｐ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−オキソ−４−（ピペリジン−１−イル）ブタン酸アリル（化合物ｐｄ０５、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｓｐ（ＯＡｌ）−ｐｉｐ）（３１．４ｇ、６５．９ｍｍｏｌ）、４−メチルベンゼンスルフィン酸ナトリウム（１１．２ｇ、６２．６ｍｍｏｌ）、テトラキストリフェニルフォスフィンパラジウム（Ｐｄ（ＰＰｈ３）４）（７６１ｍｇ、０．６５９ｍｍｏｌ）にジクロロメタン（１３２ｍＬ）を加え、室温で１．５時間撹拌した。その後、反応液に５％炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）で２回洗浄した。得られた水層のｐＨを６Ｍ塩酸水溶液を用い酸性にした後、酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を５０％食塩水で２回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、得られた混合物をろ過、減圧下濃縮した。得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル）にて精製し、さらに順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＯ２Ｈシリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル）で精製することで（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−オキソ−４−（ピペリジン−１−イル）ブタン酸（化合物ｐｄ０６、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｓｐ−ｐｉｐ）（１７．１ｇ、６０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４３７（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．１０分（分析条件ＳＭＤｍｅｔｈｏｄ６）
（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−オキソ−４−（ピペリジン−１−イル）ブタン酸−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ０７、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｓｐ（Ｏ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−ｒｅｓｉｎ）−ｐｉｐ）の合成
Figure 2018225864
フィルター付きの反応容器に２−クロロトリチルクロライドレジン（１．６０ｍｍｏｌ／ｇ、１００−２００ｍｅｓｈ、１％ＤＶＢ、渡辺化学から購入、２５ｇ、４０．０ｍｍｏｌ）と脱水ジクロロメタン（４００ｍＬ）を入れ、室温にて１０分間振とうした。窒素圧をかけてジクロロメタンを除いた後、（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−オキソ−４−（ピペリジン−１−イル）ブタン酸（化合物ｐｄ０６、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｓｐ−ｐｉｐ）（８．３７ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）と脱水ジクロロメタン（４００ｍＬ）に脱水メタノール（６．４８ｍＬ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１６．７ｍＬ）を加えた混合液を反応容器に添加し、３０分間振とうした。窒素圧をかけて反応液を除いた後、脱水ジクロロメタン（４００ｍＬ）に脱水メタノール（５０．０ｍＬ）とジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１６．７ｍＬ）を加えた混合液を反応容器に添加し、１時間３０分振とうした。窒素圧をかけて反応液を除いた後、ジクロロメタンを入れ、５分間振とうした。窒素圧をかけて反応液を除いた。このジクロロメタンでのレジンの洗浄を２回繰り返し、得られたレジンを減圧下で一晩乾燥させ、（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−オキソ−４−（ピペリジン−１−イル）ブタン酸−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ０７、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｓｐ（Ｏ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−ｒｅｓｉｎ）−ｐｉｐ）（２９．９ｇ）を得た。
得られた（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−オキソ−４−（ピペリジン−１−イル）ブタン酸−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ０７、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｓｐ（Ｏ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−ｒｅｓｉｎ）−ｐｉｐ）（１０．７ｍｇ）を反応容器に入れ、ＤＭＦ（２００μＬ）、ピペリジン（２００μＬ）を加えて室温にて１時間振とうした。その後、反応混合液にＤＭＦ（１．６ｍＬ）を加え、４００μＬを取りだし、その吸光度（３０１．２ｎｍ）を測定し（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、ＵＶ−１６００ＰＣ（セル長１．０ｃｍ）を用いて測定）、（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−オキソ−４−（ピペリジン−１−イル）ブタン酸−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ０７、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｓｐ（Ｏ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−ｒｅｓｉｎ）−ｐｉｐ）のローディング量を０．４１６ｍｍｏｌ／ｇと算出した。
なお、同様に合成したローディング量が異なる別ロットについてもペプチド合成に使用した。
（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（メチル（（Ｓ）−１−オキソ−１−（（（Ｓ）−１−オキソ−１−（ピペリジン−１−イル）プロパン−２−イル）アミノ）−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−４−オキソブタン酸−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ０８、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−ｒｅｓｉｎ）−ＭｅＰｈｅ−Ａｌａ−ｐｉｐ）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（メチル（（Ｓ）−１−オキソ−１−（（（Ｓ）−１−オキソ−１−（ピペリジン−１−イル）プロパン−２−イル）アミノ）−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−４−オキソブタン酸−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ０８、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−ｒｅｓｉｎ）−ＭｅＰｈｅ−Ａｌａ−ｐｉｐ）は、文献記載の方法にて合成した（文献：国際公開番号：ＷＯ２０１３／１００１３２Ａ１）。
（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（メチル（（Ｓ）−１−オキソ−１−（（（Ｓ）−１−オキソ−３−フェニル−１−（ピペリジン−１−イル）プロパン−２−イル）アミノ）−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−４−オキソブタン酸−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ０９、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−ｒｅｓｉｎ）−ＭｅＰｈｅ−Ｐｈｅ−ｐｉｐ）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（メチル（（Ｓ）−１−オキソ−１−（（（Ｓ）−１−オキソ−３−フェニル−１−（ピペリジン−１−イル）プロパン−２−イル）アミノ）−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−４−オキソブタン酸−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ０９、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−ｒｅｓｉｎ）−ＭｅＰｈｅ−Ｐｈｅ−ｐｉｐ）は、文献記載の方法を用い、化合物ｐｄ０８と同様の手法にて合成した（文献：国際公開番号：ＷＯ２０１３／１００１３２Ａ１）。
（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（メチル（（Ｓ）−１−オキソ−１−（（（Ｓ）−１−オキソ−１−（（（Ｓ）−１−オキソ−１−（ピペリジン−１−イル）プロパン−２−イル）アミノ）−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−４−オキソブタン酸−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ１０、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−ｒｅｓｉｎ）−ＭｅＰｈｅ−ＭｅＰｈｅ−Ａｌａ−ｐｉｐ）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（メチル（（Ｓ）−１−オキソ−１−（（（Ｓ）−１−オキソ−１−（（（Ｓ）−１−オキソ−１−（ピペリジン−１−イル）プロパン−２−イル）アミノ）−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−４−オキソブタン酸−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ１０、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−ｒｅｓｉｎ）−ＭｅＰｈｅ−ＭｅＰｈｅ−Ａｌａ−ｐｉｐ）は、ＷＯ２０１３／１００１３２に記載の方法にて合成した。
１−４．ペプチドの化学合成
特別な記載がない限り、ｐｄ５０〜ｐｄ７０、ｐｄ１００〜ｐｄ２４７、およびｐｄ３００〜ｐｄ５０４のペプチド化合物の合成は実施例１の冒頭に記載した基本ルートで、以下の方法にて行った。
１）自動合成機によるペプチド固相合成
ＷＯ２０１３／１００１３２に記載の方法にてペプチド合成機（Ｍｕｌｔｉｐｅｐ ＲＳ；Ｉｎｔａｖｉｓ社製）を用いて、Ｆｍｏｃ法によりペプチド合成を行った。なお、操作の詳細な手順については合成機に付属のマニュアルに従った。
合成機にＮ末端がＦｍｏｃで保護されたアスパラギン酸の側鎖カルボン酸部位が結合した２−クロロトリチルレジン（１カラムあたり１００ｍｇ）と、各種Ｆｍｏｃ−アミノ酸（０．６ｍｏｌ／Ｌ、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（化合物ａａ０５）の場合は下記の方法で塩酸塩とした後、０．５ｍｏｌ／Ｌの溶液として用いた）と１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）もしくはｏｘｙｍａ（０．３７５ｍｏｌ／Ｌ）のＮＭＰ溶液と、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（１０％ｖ／ｖ）をセットした。Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ０１）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ０６）はＮＭＰ溶液においてｏｘｙｍａと共存させ、さらにモレキュラシーブス４Ａ１／８（和光純薬工業）もしくはモレキュラシーブス４Ａ１／１６（和光純薬工業）を添加してセットした。また、使用するアミノ酸が塩酸塩などの塩（例えばＦｍｏｃ−ＭｅＨｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（化合物ａａ０５）の塩酸塩）を用いる場合、ＤＩＰＥＡ／ＤＭＦ＝３／１の溶液をセットし、ペプチド伸長の際に使用するアミノ酸に対して、０．９６等量分のＤＩＰＥＡを上記のＤＭＦ溶液として別途添加した。
Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（化合物ａａ０５）の塩酸塩は下記の方法で調製した。
Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（化合物ａａ０５）（１．１６６ｇ）にＤＣＭ（１０．５ｍＬ）を加え、０℃にて４ＮのＨＣｌ／１，４−ｄｉｏｘａｎｅ（０．８８ｍＬ）をＤＣＭ（５．３ｍＬ）で希釈した溶液を滴下しながら加えた。その後、反応液を０℃にて５分間撹拌し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下濃縮した。得られた残渣をオイルポンプを用いて減圧下乾燥させることでＦｍｏｃ−ＭｅＨｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（化合物ａａ０５）を塩酸塩として得た。その後、ＮＭＰ（２．２１ｍＬ）を加え、０．５ｍｏｌ／Ｌの溶液として調整した。
Ｆｍｏｃ脱保護溶液としてジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）のＤＭＦ溶液（２％ｖ／ｖ）を用いて合成を行った。レジンはＤＭＦにて洗浄した後、Ｆｍｏｃ脱保護に次いでＦｍｏｃアミノ酸の縮合反応を１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことでレジン表面上にペプチドを伸長させた。ペプチド伸長完了後、レジンのＮ末端のＦｍｏｃ基の除去をペプチド合成機上にて行った後、レジンをＤＭＦにて洗浄した。
２）伸長したペプチドのレジンからの切り出し
ＷＯ２０１３／１００１３２に記載の方法にて、上記の方法によって得られた固相上に担持された鎖状ペプチドに対し、ＤＣＭを加えレジンを再膨潤させた後、レジンに２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）／ＤＣＭ（１／１，ｖ／ｖ，２ｍＬ）を加えて室温にて２時間振とうした。続いてチューブ内の溶液を合成用カラムでろ過することによりレジンを除き、残ったレジンをさらに２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）／ＤＣＭ（１／１，ｖ／ｖ，１ｍＬ）にて２回洗浄した。得られた全ての切り出し溶液を混合し、減圧下濃縮した。
３）切り出したペプチドの環化法
切り出し後に減圧下濃縮した残渣をＤＭＦ／ＤＣＭ（１／１，ｖ／ｖ，８ｍＬ）に溶解した。０．５ＭのＯ−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）／ＤＭＦ溶液（用いたレジン上のモル数（ローディング量（ｍｍｏｌ／ｇ）に使用したレジン量（通常は０．１０ｇ）をかけたもの）に対して１．５等量となる容量）と、ＤＩＰＥＡ（用いたレジン上のモル数に対して１．８等量）を加え、室温にて２時間振とうした。その後、減圧下溶媒を留去した。目的の環状ペプチドの生成はＬＣＭＳ測定によって確認した。
４）５）環状ペプチドが有する側鎖官能基の保護基の脱保護
配列中にＴｙｒ（３−Ｆ，ｔＢｕ）を含む場合には、調製した０．１Ｍの硫酸水素テトラメチルアンモニウム／１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロイソプロピルアルコール（ＨＦＩＰ）溶液（２％トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ））を２ｍＬ加え、残渣を溶解させた後、室温もしくは３０度にて２４時間静置した。配列中にＴｙｒ（３−Ｆ）を含まない場合には、調製した０．０５Ｍの硫酸水素テトラメチルアンモニウム／１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロイソプロピルアルコール（ＨＦＩＰ）溶液（２％トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ））を４ｍＬ加え、残渣を溶解させた後、室温にて４時間静置した。いずれの場合においても、一定時間静置した後、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（７０μＬ）を加え、減圧下溶媒を留去した。
減圧下、溶媒を留去した後、ＤＭＦもしくはＤＭＳＯを加え、不溶物をフィルターろ過にて取り除いた後、ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ−ＨＰＬＣで精製した。
なお、０．１Ｍの硫酸水素テトラメチルアンモニウム／ＨＦＩＰ溶液（２％ＴＩＰＳ）、は、ＨＦＩＰ（１１．６６ｍＬ）、ＴＩＰＳ（０．２４ｍＬ）、ＤＣＥ（０．１０ｍＬ）を混合した溶液から４ｍＬを抜き取り、これに６８．５ｍｇの硫酸水素テトラブチルアンモニウムを溶解させて調製した。また、０．０５Ｍの硫酸水素テトラメチルアンモニウム／ＨＦＩＰ溶液（２％ＴＩＰＳ）は、ＨＦＩＰ（１１．６６ｍＬ）、ＴＩＰＳ（０．２４ｍＬ）、ＤＣＥ（０．１０ｍＬ）を混合した溶液から４ｍＬを抜き取り、これに３４．３ｍｇの硫酸水素テトラブチルアンモニウムを溶解させて調製した。これらの溶液（０．１Ｍの硫酸水素テトラメチルアンモニウム／ＨＦＩＰ溶液（２％ＴＩＰＳ）及び０．０５Ｍの硫酸水素テトラメチルアンモニウム／ＨＦＩＰ溶液（２％ＴＩＰＳ））はＨＦＩＰの代わりに別のフルオロアルコール、例えば２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）なども用いることができる。
ｐＫａ実測に用いた３残基ｐｅｐｔｉｄｅの合成
実施例１に記載のペプチド化合物の化学合成と同様の手法を用いペプチドの伸長、レジン上からの切り出しを行った後、Ｃ末端のカルボン酸とピペリジンを縮合することでｐｄ３０−ｐｄ３６を合成した。また、ペプチド合成に用いたＦｍｏｃ−ＭｅＧｌｙ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−ｒｅｓｉｎ（化合物ｐｄ１１）は下記の通り合成した。ＺＭｅＧｌｙ（Ｃｂｚ−ＭｅＧｌｙ−ＯＨ、ＣＡＳ＃３９６０８−３１−６）は東京化成工業より購入した。
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチルグリシン−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ１１、Ｆｍｏｃ−ＭｅＧｌｙ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−ｒｅｓｉｎ）の合成
Figure 2018225864
フィルター付きの反応容器に２−クロロトリチルクロライドレジン（１．５８ｍｍｏｌ／ｇ、１００−２００ｍｅｓｈ、１％ＤＶＢ、渡辺化学から購入、１０ｇ、１５．８ｍｍｏｌ）と脱水ジクロロメタンを入れ、室温にて１時間振とうした。窒素圧をかけてジクロロメタンを除いた後、市販のＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチルグリシン（Ｆｍｏｃ−ＭｅＧｌｙ−ＯＨ）（３．５４ｇ、１１．３９ｍｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（５．２９ｍＬ、３０．４ｍｍｏｌ）の脱水ジクロロメタン（１３０ｍＬ）溶液を反応容器に添加し、３０分間振とうした。窒素圧をかけて反応液を除いた後、脱水ジクロロメタン（１３０ｍＬ）に脱水メタノール（５．７６ｍＬ）とジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（５．２９ｍＬ、３０．４ｍｍｏｌ）を加えた混合液を反応容器に添加し、１時間振とうした。窒素圧をかけて反応液を除いた後、ジクロロメタンを入れ、５分間振とうした。窒素圧をかけて反応液を除いた。得られたレジンを減圧下で一晩乾燥させ、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチルグリシン−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ１１、Ｆｍｏｃ−ＭｅＧｌｙ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−ｒｅｓｉｎ）（１３．２ｇ）を得た。
得られたレジンのローディング量は文献記載（Letters in Peptie Science, 2002, 9, 203）の方法を用い算出した。Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチルグリシン−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ１１、Ｆｍｏｃ−ＭｅＧｌｙ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−ｒｅｓｉｎ）（１４．４ｍｇ）を反応容器に入れ、ＤＭＦ（２ｍＬ）を加え１時間振とうした。反応液にＤＢＵ（０．０４ｍＬ）を加え、３０分振とうした後、ＤＭＦ（１０ｍＬ）を加え、１ｍＬを取りだし、さらに溶液量が１２．５ｍＬになるまでＤＭＦで希釈した。得られた溶液の吸光度（２９４ｎｍ）を測定し（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、ＵＶ−１６００ＰＣ（セル長１．０ｃｍ）を用いて測定）、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチルグリシン−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ１１、Ｆｍｏｃ−ＭｅＧｌｙ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−ｒｅｓｉｎ）のローディング量を０．７８９ｍｍｏｌ／ｇと算出した。
ｐＫａを実測したペプチド化合物の分析情報
Figure 2018225864
ｐＫａを実測したペプチド化合物の構造情報
Figure 2018225864
実施例２ ペプチド化合物の翻訳合成
２−１．アミノアシル化ｐＣｐＡの合成
翻訳合成に用いるためのアミノアシル化ｐＣｐＡ（化合物ｐｃ０５、ｐｃ０９、ｐｃ１４、ｐｃ１９、ｐｃ２３、ｐｃ２５、ｐｃ２８、ｐｃ３１、ｐｃ３５、ｐｃ３８、ｐｃ４３、ｐｃ４４、ｐｃ５０、ｐｃ５１、ｐｃ５２、ｐｃ５３、ｐｃ５６、ｐｃ５９、ｐｃ６２、ｐｃ６６、ｐｃ７０、ｐｃ７３、ｐｃ７７、ｐｃ８２、ｐｃ８６、ｐｃ９０、ｐｃ９３、ｐｃ９７、ｐｃ１００、ｐｃ１０４、ｐｃ１０６、ｐｃ１０９、ｐｃ１１３、ｐｃ１１７、ｐｃ１２０、ｐｃ１２１、ｐｃ１２５、ｐｃ１２９、ｐｃ１３２、ｐｃ１３５、ｐｃ１３８、ｐｃ１４０、ｐｃ１４３、ｐｃ１４６、ｐｃ１５０、ｐｃ１５３、ｐｃ１５７、ｐｃ１６０、ｐｃ１６４、ｐｃ１６８、ｐｃ１７１、ｐｃ１７５、ｐｃ１７９、ｐｃ１８３、ｐｃ１８７、ｐｃ１９０、ｐｃ１９４、ｐｃ１９９、ｐｃ２０３、ｐｃ２０５、ｐｃ２０７、ｐｃ２１０、ｐｃ２１２、ｐｃ２１５、ｐｃ２１７、ｐｃ２２０、ｐｃ２２２、ｐｃ２２４、ｐｃ２２８、ｐｃ２３０、ｐｃ２３２、ｐｃ２３３、ｐｃ２３４、ｐｃ２３７、ｐｃ２３８、ｐｃ２３９、ｐｃ２４０、ｐｃ２４３、ｐｃ２４５、ｐｃ２４８）を以下のスキームに従い合成した。
Figure 2018225864
翻訳合成に用いるためのｐＣｐＡ−アミノ酸はエステル部位が下記のような平衡状態で存在している。本明細書ではいずれか片方の構造のみを記載しているが、分析条件によっては２つの平衡状態を区別して観測することが可能である。
Figure 2018225864
（Ｒ）−２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（化合物ｐｃ０１、Ａｃｂｚ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｓ−ｔｅｒｔ−ブチルメルカプト−Ｌ−システイン（Ｈ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ））（１２６ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）と文献記載（Bioconjugate Chem.2008,19,714.）の方法で合成した炭酸（４−ニトロフェニル）４−アジドベンジル（２０７ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＦ（０．６ｍＬ）を添加した。混合物を氷浴で冷却後、トリエチルアミン（２５１μＬ、１．８０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２５℃で１２時間撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｒ）−２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（化合物ｐｃ０１、Ａｃｂｚ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（２２０．１ｍｇ、９５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝３８３（Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．８４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（Ｒ）−シアノメチル（化合物ｐｃ０２、Ａｃｂｚ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｒ）−２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（化合物ｐｃ０１、Ａｃｂｚ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（１．１５ｇ、３．００ｍｍｏｌ）及びＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．５７６ｍＬ、３．３０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（６．０ｍｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（０．６２７ｍＬ、９．００ｍｍｏｌ）を加えて室温で５時間攪拌した。反応液を濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィ（酢酸エチル：ヘキサン＝１：９→１：１）で精製し、２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（Ｒ）−シアノメチル（化合物ｐｃ０２、Ａｃｂｚ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１．２１ｇ、９５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４２２（Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．９０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（２Ｒ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（（ホスホノオキシ）メチル）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ０４）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（６０ｍｌ）に、文献記載（Helv.Chim.Acta,90,297-310）の方法で合成したリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（１２０．４ｍｇ、０．１６７ｍｍｏｌ）を溶解させ、２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（Ｒ）−シアノメチル（化合物ｐｃ０２、Ａｃｂｚ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（２１２ｍｇ、０．５００ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（２．５ｍｌ）溶液を３回に分割投与し（反応開始時、反応開始から５分後、３０分後にそれぞれ０．８３ｍＬ、合計３回投与），、室温で７０分撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ０４）とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム塩化物の混合物（５６６ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝１０８７（Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．６２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
緩衝液Ａは以下のように調製した。すなわち、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム塩化物（６，４０ｇ、２０ｍｍｏｌ）とイミダゾール（６．８１ｇ、１００ｍｍｏｌ）の水溶液に酢酸を添加し、ｐＨ＝８、２０ｍＭのＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム、１００ｍＭのイミダゾールの緩衝液Ａ（１Ｌ）を得た。
２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（２Ｒ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ０５、Ａｃｂｚ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
前工程にて得られた２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（２Ｒ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（（ホスホノオキシ）メチル）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ０４）とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム塩化物の混合物（２７０ｍｇ）に８０％酢酸水溶液（５ｍＬ）を加えて室温で２時間撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ０５、Ａｃｂｚ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ｐＣｐＡ）（１７．８ｍｇ、２１％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝１０１９（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（化合物ｐｃ０６、Ａｃｂｚ−Ｄ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｓ−ｔｅｒｔ−ブチルメルカプト−Ｄ−システイン（Ｈ−Ｄ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（４００ｍｇ、１．９１ｍｍｏｌ）と炭酸（４−ニトロフェニル）４−アジドベンジル（６６１ｍｇ、２．１０ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＦ（１．９１ｍＬ）を添加した。混合物を氷浴で冷却後、トリエチルアミン（７９９μＬ、５．７３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２５℃で２時間撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（化合物ｐｃ０６、Ａｃｂｚ−Ｄ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（６５８．２ｍｇ、９０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝３８３（Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．８１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（Ｓ）−シアノメチル（化合物ｐｃ０７、Ａｃｂｚ−Ｄ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（化合物ｐｃ０６、Ａｃｂｚ−Ｄ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（０．６５８ｇ、１．７１ｍｍｏｌ）及びＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．３２９ｍＬ、１．８８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（３．４２ｍｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（０．３５８ｍＬ、５．１３ｍｍｏｌ）を加えて室温で５時間攪拌した。反応液を濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィ（酢酸エチル：ヘキサン＝１：９→１：１）で精製し、２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（Ｓ）−シアノメチル（化合物ｐｃ０７、Ａｃｂｚ−Ｄ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（０．７１５ｇ、９９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４２２（Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．９０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（（ホスホノオキシ）メチル）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ０８）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（４０ｍｌ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（６０．２ｍｇ、０．０８３ｍｍｏｌ）を溶解させ、２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（Ｓ）−シアノメチル（化合物ｐｃ０７、Ａｃｂｚ−Ｄ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１０６ｍｇ、０．２５０ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１．２６ｍｌ）溶液を３回に分割投与し（反応開始時、反応開始から５分後、３０分後にそれぞれ０．４２ｍＬ、合計３回投与）、室温で７０分撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ０８）とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム塩化物の混合物（２４２．５ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝１０８７（Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．５９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ０９、Ａｃｂｚ−Ｄ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
前工程にて得られた２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（（ホスホノオキシ）メチル）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ０８）とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム塩化物の混合物（２４２．５ｍｇ）に８０％酢酸水溶液（５ｍＬ）を加えて室温で２時間撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ０９、Ａｃｂｚ−Ｄ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ｐＣｐＡ）（２４．７ｍｇ、２９％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝１０１９（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｒ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）−２−（メチルアミノ）プロパン酸（化合物ｐｃ１０、Ｈ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（Ｒ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（Ｆｍｏｃ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（３．００ｇ、６．７３ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１３．４ｍｌ）溶液に１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ）（１．１２ｍｌ、７．４１ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分攪拌した。反応溶液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル）にて精製し、（Ｒ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）−２−（メチルアミノ）プロパン酸（化合物ｐｃ１０、Ｈ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（１．４６ｇ、９７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝２２４（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｒ）−２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（化合物ｐｃ１１、Ａｃｂｚ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｒ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）−２−（メチルアミノ）プロパン酸（化合物ｐｃ１０、Ｈ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（７００ｍｇ、３．１３ｍｍｏｌ）と炭酸（４−ニトロフェニル）４−アジドベンジル（１．０３４ｇ、３．２９ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（３．１３ｍＬ）を添加した。混合物を氷浴で冷却後、トリエチルアミン（１．３１ｍＬ、９．４０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２５℃で４日間撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｒ）−２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（化合物ｐｃ１１、Ａｃｂｚ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（１．１５ｇ、９２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝３９７（Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．８７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（Ｒ）−シアノメチル（化合物ｐｃ１２、Ａｃｂｚ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｒ）−２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（化合物ｐｃ１１、Ａｃｂｚ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（１．１４ｇ、２．８６ｍｍｏｌ）及びＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．４９ｍＬ、２．８０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５．７２ｍｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（０．５９８ｍＬ、８．５８ｍｍｏｌ）を加えて室温で７時間攪拌した。反応液を濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィ（酢酸エチル：ヘキサン＝１：９→１：１）で精製し、２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（Ｒ）−シアノメチル（化合物ｐｃ１２、Ａｃｂｚ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１．１７ｇ、９３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４３６（Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．９６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（２Ｒ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（（ホスホノオキシ）メチル）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ１３）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（４０ｍｌ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（６０．２ｍｇ、０．０８３ｍｍｏｌ）を溶解させ、２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（Ｒ）−シアノメチル（化合物ｐｃ１２、Ａｃｂｚ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１０９ｍｇ、０．２５０ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１．２６ｍｌ）溶液を３回に分割投与し（反応開始時、反応開始から５分後、３０分後にそれぞれ０．４２ｍＬ、合計３回投与）、室温で１２０分撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ１３）とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム塩化物の混合物（９０ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝１１０１（Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．６９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（２Ｒ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ１４、Ａｃｂｚ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
前工程にて得られた２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（２Ｒ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（（ホスホノオキシ）メチル）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ１３）とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム塩化物の混合物（９０ｍｇ）に８０％酢酸水溶液（５ｍＬ）を加えて室温で１５０分撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ１４、Ａｃｂｚ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ｐＣｐＡ）（２６．７ｍｇ、３１％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝１０３３（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）−２−（メチルアミノ）プロパン酸（化合物ｐｃ１５、Ｈ−Ｄ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（Ｆｍｏｃ−Ｄ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（０．５ｇ、１．１２ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２．２４ｍｌ）溶液に１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ）（０．１８６ｍｌ、１．２３４ｍｍｏｌ）を加え、室温で９０分攪拌した。反応溶液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル）にて精製し、（Ｓ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）−２−（メチルアミノ）プロパン酸（化合物ｐｃ１５、Ｈ−Ｄ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（０．２２ｇ、８８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝２２４（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（化合物ｐｃ１６、Ａｃｂｚ−Ｄ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）−２−（メチルアミノ）プロパン酸（化合物ｐｃ１５、Ｈ−Ｄ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（２００ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ）と炭酸（４−ニトロフェニル）４−アジドベンジル（２９５ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（０．９０ｍＬ）を添加した。混合物を氷浴で冷却後、トリエチルアミン（３７４μＬ、２．６９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を４０℃で２時間撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（化合物ｐｃ１６、Ａｃｂｚ−Ｄ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（３５０ｍｇ、９８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝３９７（Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．９０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（Ｓ）−シアノメチル（化合物ｐｃ１７、Ａｃｂｚ−Ｄ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（化合物ｐｃ１６、Ａｃｂｚ−Ｄ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（３５０ｍｇ、０．８８ｍｍｏｌ）及びＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．１５ｍＬ、０．８６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１．７５ｍｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（０．１８ｍＬ、２．６３ｍｍｏｌ）を加えて室温で２時間攪拌した。反応液を濃縮し、粗生成物２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（Ｒ）−シアノメチル（化合物ｐｃ１７、Ａｃｂｚ−Ｄ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１．１７ｇ）を得た。得られた粗生成物２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（Ｒ）−シアノメチル（化合物ｐｃ１７、Ａｃｂｚ−Ｄ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＣＨ２ＣＮ）をアセトニトリル（４．４ｍｌ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４３６（Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．９６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（（ホスホノオキシ）メチル）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ１８）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（５６．４ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（８５．０ｍｇ、０．１１８ｍｍｏｌ）を溶解させ、２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（Ｒ）−シアノメチル（化合物ｐｃ１７、Ａｃｂｚ−Ｄ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＣＨ２ＣＮ）の０．２Ｍアセトニトリル溶液（１．７７ｍｌ、０．３５３ｍｍｏｌ）を３回に分割投与し（反応開始時、反応開始から１０分後、３０分後にそれぞれ０．５９ｍＬ、合計３回投与）、室温で１２０分撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ１８）とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム塩化物の混合物（１０５．２ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝１１０１（Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．６９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ１９、Ａｃｂｚ−Ｄ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
前工程にて得られた２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（（ホスホノオキシ）メチル）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ１８）とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム塩化物の混合物（１００ｍｇ）に８０％酢酸水溶液（５ｍＬ）を加えて室温で８０分撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ１９、Ａｃｂｚ−Ｄ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ｐＣｐＡ）（３９．８ｍｇ、４３％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝１０３３（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）−３−（１，３−チアゾール−４−イル）プロパン酸（化合物ｐｃ２０、Ｐｅｎ−ＭｅＡｌａ（４−Ｔｈｚ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
ＷＯ２０１３／１００１３２に記載の方法にて合成した（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（チアゾール−４−イル）プロパン酸（Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｌａ（４−Ｔｈｚ）−ＯＨ）（４．２０ｇ、１０．２８ｍｍｏｌ）に２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液（１００ｍＬ）を加え室温で２時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮し、濃縮残渣にジエチルエーテルを加え、混合物をろ過し、ジエチルエーテルでろ紙上の固体を洗浄し、粗生成物（２Ｓ）−２−（メチルアミノ）−３−（１，３−チアゾール−４−イル）プロパン酸を得た。
得られた（２Ｓ）−２−（メチルアミノ）−３−（１，３−チアゾール−４−イル）プロパン酸を１，４−ジオキサン（４０ｍｌ）／水（４０ｍｌ）に溶解させた後に、文献記載（Organic Letters, 2011, 13, 4906）の方法で合成したペンタ−４−エン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（３．２００ｇ、１６．２３ｍｍｏｌ）と、炭酸水素ナトリウム（１．８０ｇ、２１．４３ｍｍｏｌ）を加え、反応液を３０度で１２時間撹拌した。反応が完結した後、反応液に水を加えて酢酸エチルで洗浄し、水層の液性がｐＨ＝２になるまで１．０Ｍ硫酸水素ナトリウム水溶液を加えた。得られた混合物を酢酸エチルで抽出操作を行い有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、減圧濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール）にて精製し、（２Ｓ）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）−３−（１，３−チアゾール−４−イル）プロパン酸（化合物ｐｃ２０、Ｐｅｎ−ＭｅＡｌａ（４−Ｔｈｚ）−ＯＨ）（０．６０ｇ、２２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝２６９（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．３２分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ１）
２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）−３−（チアゾール−４−イル）プロパン酸（Ｓ）−シアノメチル（化合物ｐｃ２１、Ｐｅｎ−ＭｅＡｌａ（４−Ｔｈｚ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（２Ｓ）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）−３−（１，３−チアゾール−４−イル）プロパン酸（化合物ｐｃ２０、Ｐｅｎ−ＭｅＡｌａ（４−Ｔｈｚ）−ＯＨ）（１．５０ｇ、２．８０ｍｍｏｌ）及びＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（６８０ｍｇ、５．２６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（８０ｍｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（１．２５ｇ、１０．４２ｍｍｏｌ）を加えて室温で終夜攪拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）−３−（チアゾール−４−イル）プロパン酸（Ｓ）−シアノメチル（化合物ｐｃ２１、Ｐｅｎ−ＭｅＡｌａ（４−Ｔｈｚ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（０．２３ｇ、２７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝３０８（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．６１分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ１）
２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）−３−（チアゾール−４−イル）プロパン酸（２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（（ホスホノオキシ）メチル）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ２２）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（１２０ｍｌ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（３００ｍｇ、０．４１５ｍｍｏｌ）を溶解させ、２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）−３−（チアゾール−４−イル）プロパン酸（Ｓ）−シアノメチル（化合物ｐｃ２１、Ｐｅｎ−ＭｅＡｌａ（４−Ｔｈｚ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（３１１ｍｇ、１．０１３ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（３．６ｍｌ）溶液を加え、室温で４時間撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ２２）とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム塩化物の混合物（３００ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝９７１（Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．５９分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）
２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）−３−（チアゾール−４−イル）プロパン酸（２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ２３、Ｐｅｎ−ＭｅＡｌａ（４−Ｔｈｚ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
前工程にて得られた２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）−３−（チアゾール−４−イル）プロパン酸（２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（（ホスホノオキシ）メチル）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ２２）とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム塩化物の混合物（３００ｍｇ）に８０％酢酸水溶液（６ｍＬ）を加えて室温で７時間撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ２３、Ｐｅｎ−ＭｅＡｌａ（４−Ｔｈｚ）−ｐＣｐＡ）（４６ｍｇ、１７％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝９０３（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）酢酸シアノメチル（化合物ｐｃ２４、Ｐｅｎ−ＭｅＧｌｙ−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
Ｎ−メチルグリシン（１．５ｇ、１６．８ｍｍｏｌ）とＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（７．３５ｍｌ、４２．１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３３．７ｍｌ）に加えた。その後混合物を０℃に冷却した後に、ペンタ−４−エン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（１．９５ｍｌ、１７．７ｍｍｏｌ）を加え、反応液を２５度で３日間撹拌した。反応が完結した後、反応混合物にＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（２．９４ｍｌ、１６．８ｍｍｏｌ）と２−ブロモアセトニトリル（２．３５ｍｌ、３３．７ｍｍｏｌ）を加えて２５度で４時間攪拌した。反応液をジクロロメタンで希釈したのちに、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、有機層を飽和食塩水で洗浄した。その後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、減圧濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）にて精製し、２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）酢酸シアノメチル（化合物ｐｃ２４、Ｐｅｎ−ＭｅＧｌｙ−ＯＣＨ２ＣＮ）（１．１ｇ、３１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝２１１（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７２分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ３）
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イルＮ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）グリシナート（化合物ｐｃ２５、Ｐｅｎ−ＭｅＧｌｙ−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（１００ｍｌ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（２５０ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を溶解させ、２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）酢酸シアノメチル（化合物ｐｃ２４、Ｐｅｎ−ＭｅＧｌｙ−ＯＣＨ２ＣＮ）（２９０ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（１．５ｍｌ）を加え、室温で４時間撹拌した。さらに８０％酢酸水溶液（１５ｍｌ）を反応液に加えて、室温で４時間撹拌した。
反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ２５、Ｐｅｎ−ＭｅＧｌｙ−ｐＣｐＡ）（３７．６ｍｇ、１３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝８０６（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６０分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ２）
（Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−２−フェニル酢酸シアノメチル（化合物ｐｃ２６、Ｐｅｎ−Ｐｈｇ−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−フェニル酢酸（Ｂｏｃ−Ｐｈｇ−ＯＨ、５．０ｇ、１９．９ｍｍｏｌ）にジクロロメタン（５０．０ｍｌ）を加えた後、塩酸ガスを反応液に吹き込み２５℃で３時間撹拌した。析出した固体をろ過し、混合物として（Ｓ）−２−アミノ−２−フェニル酢酸（Ｈ−Ｐｈｇ−ＯＨ）（３．７ｇ）を得た。
得られた混合物である（Ｓ）−２−アミノ−２−フェニル酢酸（Ｈ−Ｐｈｇ−ＯＨ）（３．７ｇ）に水（２０ｍＬ）と炭酸水素ナトリウム（５．０ｇ、５９．５ｍｍｏｌ）を加えて撹拌した後、ペンタ−４−エン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（４．０ｇ、２０．３ｍｍｏｌ）の１、４−ジオキサン溶液（２０．０ｍＬ）を加えた。反応液を２５℃で３時間撹拌した後、酢酸エチルを加え３回洗浄した。その後、水層を１Ｍの塩酸水溶液でｐＨ２になるまで調整し、酢酸エチルで３回抽出した。得られた有機層をまとめて、飽和食塩水で２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、減圧濃縮を行った。得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール）にて精製し、（Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−２−フェニル酢酸（Ｐｅｎ−Ｐｈｇ−ＯＨ）（３．１ｇ、６６％、２工程）を得た。
窒素雰囲気下、上記の（Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−２−フェニル酢酸（Ｐｅｎ−Ｐｈｇ−ＯＨ）（１．５ｇ、６．４３ｍｍｏｌ）及びＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（２．０ｇ、１５．５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２０ｍｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（４．００ｇ、３３．４ｍｍｏｌ）を加えて２５℃で２時間３０分撹拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、（Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−２−フェニル酢酸シアノメチル（化合物ｐｃ２６、Ｐｅｎ−Ｐｈｇ−ＯＣＨ２ＣＮ）（０．６９２ｇ、４０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝２７３（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
２−（ペンタ−４−エンアミド）−２−フェニル酢酸（２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ２８、Ｐｅｎ−Ｐｈｇ−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（１２０ｍｌ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（３００ｍｇ、０．４１５ｍｍｏｌ）を溶解させ、（Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−２−フェニル酢酸シアノメチル（化合物ｐｃ２６、Ｐｅｎ−Ｐｈｇ−ＯＣＨ２ＣＮ）（２７６ｍｇ、１．０１ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（３．６ｍｌ）溶液を加え、２５℃で４時間撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）にて精製した後、再び逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル）にて精製し、２−（ペンタ−４−エンアミド）−２−フェニル酢酸（２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（（ホスホノオキシ）メチル）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ２７）とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム塩化物の混合物を得た。
前工程にて得られた化合物ｐｃ２７とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム塩化物の混合物（７０ｍｇ）に８０％酢酸水溶液（１．４ｍＬ）を加えて２５℃で７時間撹拌した。反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）で精製し、表題化合物（化合物ｐｃ２８、Ｐｅｎ−Ｐｈｇ−ｐＣｐＡ）（３４ｍｇ、９％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝８６８（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）プロパン酸（化合物ｐｃ２９、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ＤＭＴ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
ＷＯ２０１３／１００１３２に記載の方法にて合成した（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）プロパン酸（Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ＤＭＴ）−ＯＨ）（３．０ｇ、４．６６ｍｍｏｌ）にＤＭＦ（９．３２ｍＬ）、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ）（０．８４３ｍＬ、５．５９ｍｍｏｌ）を０℃で加えた後、反応液を２５℃で１時間撹拌した。次いで、反応液にＤＢＵ（１．７６ｍＬ、１１．７ｍｍｏｌ）、塩化ペンタ−４−エノイル（１．０３ｍＬ、９．３２ｍｍｏｌ）を０℃にて加え、反応液を０℃で３０分撹拌した。反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）にて精製し、（Ｓ）−３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）プロパン酸（化合物ｐｃ２９、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ＤＭＴ）−ＯＨ）（１．５０ｇ、６４％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝５０２（Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．９１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）プロパン酸（Ｓ）−シアノメチル（化合物ｐｃ３０、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ＤＭＴ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）プロパン酸（化合物ｐｃ２９、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ＤＭＴ）−ＯＨ）（１．５０ｇ、２．９８ｍｍｏｌ）及びＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（２．６０ｍＬ、１４．９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（６．０ｍｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（０．６２３ｍＬ、８．９４ｍｍｏｌ）を加えて２５℃で３０分攪拌した。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、得られた有機層を水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過した。有機溶媒を減圧濃縮後、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）にて精製し、３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）プロパン酸（Ｓ）−シアノメチル（化合物ｐｃ３０、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ＤＭＴ）−ＯＣＨ２ＣＮ（１．３０ｇ、８０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝５４３（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５７分（分析条件ＦＡ５０）
３−ヒドロキシ−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）プロパン酸（２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ３１、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（１２０ｍｌ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（３００ｍｇ、０．４１５ｍｍｏｌ）を溶解させ、３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）プロパン酸（Ｓ）−シアノメチル（化合物ｐｃ３０、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ＤＭＴ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（５４９ｍｇ、１．０１３ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（３．６ｍｌ）溶液を加え、２５℃で３時間撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた粗生成物に溶媒量の８０％酢酸水溶液を加えて２５℃で７時間撹拌した。反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）で精製し、表題化合物（化合物ｐｃ３１、Ｐｅｎ−−ＭｅＳｅｒ−ｐＣｐＡ）（７．０ｍｇ、２％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝８３６（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．２８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−４−（メチルスルホニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（化合物ｐｃ３２、Ｐｅｎ−Ｍｅｔ（Ｏ２）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（メチルスルホニル）ブタン酸（Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ（Ｏ２）−ＯＨ）（５．００ｇ、１２．４ｍｍｏｌ）に２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液（８０．０ｍＬ）を加えた後、反応液を２５℃で３時間撹拌した。次いで、反応液にジエチルエーテル（５０ｍＬ）を加え、混合物をろ過し、得られた固体をジエチルエーテル及びヘキサンで洗浄することで、粗生成物である（Ｓ）−２−アミノ−４−（メチルスルホニル）ブタン酸（Ｈ−−Ｍｅｔ（Ｏ２）−ＯＨ）（２．８８ｇ）を得た。
水（４０ｍＬ）と１，４−ジオキサン（４０ｍＬ）の混合溶媒に、得られた粗生成物である（Ｓ）−２−アミノ−４−（メチルスルホニル）ブタン酸（Ｈ−−Ｍｅｔ（Ｏ２）−ＯＨ）（２．８８ｇ）とペンタ−４−エン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（３．７６ｇ、１９．１ｍｍｏｌ）、炭酸水素ナトリウム（２．６８ｇ、３１．９ｍｍｏｌ）を加えた後、反応液を２５℃で４時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで２回洗浄した後、水層を１Ｍの塩酸水溶液でｐＨ２になるまで調整し、ジクロロメタンで４回抽出した。得られた有機層をまとめて、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、減圧濃縮を行った。得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール）にて精製し、（Ｓ）−４−（メチルスルホニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（Ｐｅｎ−Ｍｅｔ（Ｏ２）−ＯＨ）（２．４ｇ、７４％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝２６４（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．００分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ４）
４−（メチルスルホニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（Ｓ）−シアノメチル（化合物ｐｃ３３、Ｐｅｎ−Ｍｅｔ（Ｏ２）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−４−（メチルスルホニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（Ｐｅｎ−Ｍｅｔ（Ｏ２）−ＯＨ）（１．８０ｇ、６．８４ｍｍｏｌ）及びＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（３．００ｇ、２３．２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３０ｍｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（３．２８ｇ、２７．４ｍｍｏｌ）を加えて２５℃で１６時間攪拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、４−（メチルスルホニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（Ｓ）−シアノメチル（化合物ｐｃ３３、Ｐｅｎ−Ｍｅｔ（Ｏ２）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１．５ｇ、７３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝３０３（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５０分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）
４−（メチルスルホニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（（ホスホノオキシ）メチル）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ３４）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（１２０ｍｌ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（３００ｍｇ、０．４１５ｍｍｏｌ）の水溶液（３．６ｍＬ）、４−（メチルスルホニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（Ｓ）−シアノメチル（化合物ｐｃ３３、Ｐｅｎ−Ｍｅｔ（Ｏ２）−ＯＣＨ２ＣＮ）（５０２ｍｇ、１．６６ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（３．６ｍｌ）溶液を加え、室温で２時間撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ３４）とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム塩化物の混合物（１３６ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝９６８．５（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４４分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）
４−（メチルスルホニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ３５、Ｐｅｎ−Ｍｅｔ（Ｏ２）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
前工程にて得られた４−（メチルスルホニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（（ホスホノオキシ）メチル）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ３４）とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム塩化物の混合物（７０ｍｇ）に８０％酢酸水溶液（１．０ｍＬ）を加えて室温で２時間撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ３５、Ｐｅｎ−Ｍｅｔ（Ｏ２）−ｐＣｐＡ）（１２．７ｍｇ、７％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝８９８（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．２９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−３−（３−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）プロパン酸シアノメチル（化合物ｐｃ３６、Ｐｅｎ−Ｐｈｅ（３−Ｃｌ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−クロロフェニル）プロパン酸（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（３−Ｃｌ）−ＯＨ）（５．００ｇ、１１．９ｍｍｏｌ）に２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液（７６ｍＬ）を加えた後、反応液を２５℃で１６時間撹拌した。反応液を濃縮後、得られた残渣にジエチルエーテルを加え、混合物をろ過することで、粗生成物である（Ｓ）−２−アミノ−３−（３−クロロフェニル）プロパン酸（Ｈ−−Ｐｈｅ（３−Ｃｌ）−ＯＨ）（２．２２ｇ）を得た。
水（２８ｍＬ）と１，４−ジオキサン（２８ｍＬ）の混合溶媒に、得られた粗生成物である（Ｓ）−２−アミノ−３−（３−クロロフェニル）プロパン酸（Ｈ−−Ｐｈｅ（３−Ｃｌ）−ＯＨ）（２．２２ｇ）とペンタ−４−エン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（２．６２ｇ、１３．３ｍｍｏｌ）、炭酸水素ナトリウム（１．８６ｇ、２２．１ｍｍｏｌ）を加えた後、反応液を２５℃で１６時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで２回洗浄した後、水層を１Ｍの塩酸水溶液でｐＨ２になるまで調整し、ジクロロメタンで３回抽出した。得られた有機層をまとめて、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、減圧濃縮を行った。得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール）にて精製し、（Ｓ）−３−（３−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）プロパン酸（Ｐｅｎ−Ｐｈｅ（３−Ｃｌ）−ＯＨ）（１．５ｇ、４５％、２工程）を得た。
窒素雰囲気下、（Ｓ）−３−（３−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）プロパン酸（Ｐｅｎ−Ｐｈｅ（３−Ｃｌ）−ＯＨ）（１．５０ｇ、５．３２ｍｍｏｌ）及びＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（１．３７ｇ、１０．６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２４ｍｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（２．５５ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）を加えて２５℃で１６時間攪拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、（Ｓ）−３−（３−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）プロパン酸シアノメチル（化合物ｐｃ３６、Ｐｅｎ−Ｐｈｅ（３−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（０．７６７ｇ、４５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝３２１（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８７分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）
３−（３−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）プロパン酸（２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（（ホスホノオキシ）メチル）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ３７）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（１２０ｍｌ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（２００ｍｇ、０．２７７ｍｍｏｌ）の水溶液（３．０ｍＬ）、（Ｓ）−３−（３−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）プロパン酸シアノメチル（化合物ｐｃ３６、Ｐｅｎ−Ｐｈｅ（３−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（３５５ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（３．０ｍｌ）溶液を加え、室温で２時間撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ３7）とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム塩化物の混合物（７５ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝９８６（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７７分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）
３−（３−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）プロパン酸（２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ３８、Ｐｅｎ−Ｐｈｅ（３−Ｃｌ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
前工程にて得られた３−（３−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）プロパン酸（２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（（ホスホノオキシ）メチル）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ３７）とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム塩化物の混合物を（４０ｍｇ）に８０％酢酸水溶液（０．８０ｍＬ）を加えて室温で６時間撹拌した。反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）で精製した後、再び逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）で精製することで、表題化合物（化合物ｐｃ３８、Ｐｅｎ−Ｐｈｅ（３−Ｃｌ）−ｐＣｐＡ）（７．５ｍｇ、６％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝９１４（Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．４７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
３−（４−クロロフェニル）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）プロパン酸（Ｓ）−シアノメチル（化合物ｐｃ４１、Ｐｅｎ−ＭｅＰｈｅ（４−Ｃｌ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
下記のスキームにしたがって合成を行った。
Figure 2018225864
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−クロロフェニル）プロパン酸（Ｂｏｃ−Ｐｈｅ（４−Ｃｌ）−ＯＨ）（４．００ｇ、１３．３ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１２０ｍＬ）に溶解した後、０℃にて水素化ナトリウム（１．６０ｇ、４０．０ｍｍｏｌ、６０％オイルディスパージョン）、ヨウ化メチル（９．４８ｇ、６６．８ｍｍｏｌ）を加えた。反応液をオイルバスを用い、３０℃にて２日間撹拌した後、反応を氷水（５０ｍＬ）で停止させた。混合溶液を酢酸エチルで３回洗浄した後、水層を硫酸水素ナトリウムを用いてｐＨ３−４に調整し、酢酸エチルで３回抽出した。有機層をまとめて無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール）にて精製し、（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）−３−（４−クロロフェニル）プロパン酸（化合物ｐｃ３９、Ｂｏｃ−ＭｅＰｈｅ（４−Ｃｌ）−ＯＨ）（２．２０ｇ、５３％）を得た。
窒素雰囲気下、前工程にて得られた（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）−３−（４−クロロフェニル）プロパン酸（化合物ｐｃ３９、Ｂｏｃ−ＭｅＰｈｅ（４−Ｃｌ）−ＯＨ）（１．５０ｇ、４．７８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（８０ｍＬ）溶液にＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（１．２４ｇ、９．５９ｍｍｏｌ）及び２−ブロモアセトニトリル（２．２８ｇ、１９．０ｍｍｏｌ）を加えて２５℃で１６時間攪拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）−３−（４−クロロフェニル）プロパン酸シアノメチル（化合物ｐｃ４０、Ｂｏｃ−ＭｅＰｈｅ（４−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１．４５ｇ、８６％）を得た。
前工程にて得られた（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）−３−（４−クロロフェニル）プロパン酸シアノメチル（化合物ｐｃ４０、Ｂｏｃ−ＭｅＰｈｅ（４−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１．３０ｇ、３．６８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、塩酸ガスを吹き付け２０℃にて１時間撹拌した。反応液を濃縮し、混合物として（Ｓ）−３−（４−クロロフェニル）−２−（メチルアミノ）プロパン酸シアノメチルを（１．０６ｇ）得た。
前工程にて得られた（Ｓ）−３−（４−クロロフェニル）−２−（メチルアミノ）プロパン酸シアノメチルの混合物（０．９６ｇ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、０℃にてトリエチルアミン（８４０ｍｇ、８．３０ｍｍｏｌ）を加えた後、塩化ペンタ−４−エノイル（４７２ｍｇ、３．９８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１０ｍＬ）を滴下しながら加えた。反応液を２０℃で２時間撹拌した後、濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、３−（４−クロロフェニル）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）プロパン酸（Ｓ）−シアノメチル（化合物ｐｃ４１、Ｐｅｎ−ＭｅＰｈｅ（４−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（０．９１８ｇ、８３％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝３３５（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：２．２１分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ５）
３−（４−クロロフェニル）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）プロパン酸（２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（（ホスホノオキシ）メチル）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ４２）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（１１５ｍｌ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（２００ｍｇ、０．２７７ｍｍｏｌ）の水溶液（６．２５ｍＬ）、（Ｓ）−３−（３−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）プロパン酸シアノメチル（化合物ｐｃ３６、Ｐｅｎ−Ｐｈｅ（３−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（３７１ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（３．１ｍｌ）溶液を加え、室温で２時間撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製、表題化合物（化合物ｐｃ４２）とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム塩化物の混合物（２７７ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝１０００（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５８分（分析条件ＳＱＤFＡ０５）
３−（４−クロロフェニル）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）プロパン酸（２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ４３）の合成
Figure 2018225864
前工程にて得られた３−（４−クロロフェニル）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）プロパン酸（２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（（ホスホノオキシ）メチル）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ４２）とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム塩化物の混合物を（２７７ｍｇ）に８０％酢酸水溶液（４．０ｍＬ）を加えて室温で４時間撹拌した。反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ４３、Ｐｅｎ−ＭｅＰｈｅ（４−Ｃｌ）−ｐＣｐＡ）（１１９ｍｇ、４６％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝９２８（Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．５２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
４−（メチルチオ）−４−オキソ−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ４４、Ｐｅｎ−Ａｓｐ（ＳＭｅ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（２００ｍｌ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（４００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を溶解させ、文献記載（ＷＯ２０１３／１００１３２）の方法で合成した４−（メチルチオ）−４−オキソ−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（Ｓ）−シアノメチル（６３０ｍｇ、２．２２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（４．０ｍｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。さらにトリフルオロ酢酸（４．６ｍｌ、６０ｍｍｏｌ）を反応液に加えて、反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ４４、Ｐｅｎ−Ａｓｐ（ＳＭｅ）−ｐＣｐＡ）（２０ｍｇ、４．２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝８８０．４（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
化合物ｐｃ５０（Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ｎＰｒ）−ｐＣｐＡ）の合成は、以下のスキームに従って行った。
Figure 2018225864
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イルＮ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−プロピル−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ５０、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ｎＰｒ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−プロピル−Ｌ−セリン（Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｎＰｒ）−ＯＨ、化合物ａａ５１）の合成過程で得られた中間体であるＯ−プロピル−Ｌ−セリン（Ｈ−Ｓｅｒ（ｎＰｒ）−ＯＨ）（２．５ｇ、１３．６１ｍｍｏｌ）とペンタ−４−エン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（６．７ｇ、３３．９８ｍｍｏｌ）および炭酸水素ナトリウム（２．９ｇ、３４．５２ｍｍｏｌ）に１、４−ジオキサン／水（５０ｍＬ／５０ｍＬ）を加えて室温で１６時間撹拌した。その後、ジエチルエーテルで洗浄し、水層のｐＨを５に調節した後、水層をジクロロメタンで抽出した。抽出した有機層を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）で精製し、Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−プロピル−Ｌ−セリン（Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ｎＰｒ）−ＯＨ）（２．３ｇ、７４％）を得た。
得られたＮ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−プロピル−Ｌ−セリン（Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ｎＰｒ）−ＯＨ）（２．３ｇ、１０．０３ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（２．６ｇ、２０．１６ｍｍｏｌ）および２−ブロモアセトニトリル（４．８ｇ、４０．０２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、室温で１６時間撹拌した。その後、順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）で精製し、シアノメチルＮ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−プロピル−Ｌ−セリナート（Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ｎＰｒ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１．８ｇ、６７％）を得た。
続いてリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（３００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）およびシアノメチルＮ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−プロピル−Ｌ−セリナート（Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ｎＰｒ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（３３４ｍｇ、１．２４ｍｍｏｌ）を緩衝液Ａ（１８ｍＬ）に加え、室温で１時間撹拌した。その後、反応液にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１．７ｍＬ）を添加し、この反応液を凍結乾燥した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）で精製し、表題化合物（化合物ｐｃ５０、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ｎＰｒ）−ＯＨ）（６１．４ｍｇ、８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ８６５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
化合物ｐｃ５１（Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ｎＰｒ）−ｐＣｐＡ）の合成は、以下のスキームに従って行った。
Figure 2018225864
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イルＮ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−プロピル−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ５１、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ｎＰｒ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｏ−プロピル−Ｌ−セリン（Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ｎＰｒ）−ＯＨ、化合物ａａ５２）（１０ｇ、２２．７０ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１２８ｍＬ）に溶解し、ピペリジン（３２ｍＬ）を加えて室温で３時間撹拌した。その後、反応液をジエチルエーテル（５００ｍＬ）で希釈し、析出した固体を回収することでＮ−メチル−Ｏ−プロピル−Ｌ−セリン（Ｈ−ＭｅＳｅｒ（ｎＰｒ）−ＯＨ）を得た。
得られたＮ−メチル−Ｏ−プロピル−Ｌ−セリン（Ｈ−ＭｅＳｅｒ（ｎＰｒ）−ＯＨ）とペンタ−４−エン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（７．８８ｇ、４０．０ｍｍｏｌ）および炭酸水素ナトリウム（３．３６ｇ、４０．０ｍｍｏｌ）に１、４−ジオキサン／水（１０ｍＬ／１０ｍＬ）を加えて室温で１６時間撹拌した。その後、ジエチルエーテルで２回洗浄し、水層に塩酸水溶液（１Ｍ）を加えてｐＨ１とした。水層をジクロロメタンで２回抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過後に減圧濃縮した。得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル＝１００／０→３０／７０）で精製し、Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−プロピル−Ｌ−セリン（Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ｎＰｒ）−ＯＨ）（２．７ｇ、４３％）を得た。
得られたＮ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−プロピル−Ｌ−セリン（Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ｎＰｒ）−ＯＨ）（２．７ｇ、１１．１ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（２．８５ｇ、２２．１ｍｍｏｌ）および２−ブロモアセトニトリル（５．３０ｇ、４４．２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（６０ｍＬ）に溶解し、室温で１６時間撹拌した。その後、減圧濃縮で溶媒を除去し、得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル＝１００／０→４０／６０）で精製し、シアノメチルＮ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−プロピル−Ｌ−セリナート（Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ｎＰｒ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（２．２２ｇ、７１％）を得た。
続いてリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（４００ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）を水（３．０ｍＬ）に溶解し、緩衝液Ａ（１００ｍＬ）に加えた。この水溶液に先で得られたシアノメチルＮ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−プロピル−Ｌ−セリナート（Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ｎＰｒ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（６２５ｍｇ、２．２１ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（３．０ｍＬ）を添加し、室温で１時間撹拌した。その後、反応液にトリフルオロ酢酸（２．３ｍＬ）を添加し、この反応液を凍結乾燥した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）で精製し、表題化合物（ｐｃ５１、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ｎＰｒ）−ｐＣｐＡ）（６９ｍｇ、１４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ８７８．４ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１０．３９３分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ２１）
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ８７８．５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１０．９１０分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ２１）
化合物ｐｃ５２（Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）−ｐＣｐＡ）の合成は、以下のスキームに従って行った。
Figure 2018225864
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イルＯ−イソペンチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ５２、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−イソペンチル−Ｌ−セリン（Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）−ＯＨ、化合物ａａ５４）の合成過程で得られた中間体であるＯ−イソペンチル−Ｌ−セリン（Ｈ−Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）−ＯＨ）（２．０ｇ、１１．４３ｍｍｏｌ）とペンタ−４−エン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（４．５ｇ、２２．８６ｍｍｏｌ）および炭酸水素ナトリウム（１．９２ｇ、２２．８６ｍｍｏｌ）に１、４−ジオキサン／水（１０ｍＬ／１０ｍＬ）を加えて室温で１６時間撹拌した。その後、反応液をジエチルエーテルで２回洗浄し、水層に１Ｍ塩酸水溶液を加えてｐＨを２とした。この水層をジクロロメタンで２回抽出し、得られた有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル＝１００／０→３０／７０）で精製し、Ｏ−イソペンチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）−ＯＨ）（２．６９ｇ、８９％）を得た。
得られたＯ−イソペンチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）−ＯＨ）（２．６２ｇ、１０．１９ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（２．６３ｇ、２０．３８ｍｍｏｌ）および２−ブロモアセトニトリル（４．８９ｇ、４０．７８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（６０ｍＬ）に溶解し、室温で１６時間撹拌した。その後、順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル＝１００／０−＞４０／６０）で精製し、シアノメチルＯ−イソペンチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（２．２２ｇ、７１％）を得た。
続いてリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（３００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）およびシアノメチルＯ−イソペンチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（３６９ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）を緩衝液Ａ（７５ｍＬ）に加え、室温で１時間撹拌した。その後、反応液にトリフルオロ酢酸（１．７ｍＬ）を添加し、この反応液を凍結乾燥した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）で精製し、表題化合物（化合物ｐｃ５２、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）−ｐＣｐＡ）（４４．１ｍｇ、６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ８９３ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
化合物ｐｃ５３（Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ｉＰｅｎ）−ｐＣｐＡ）の合成は、以下のスキームに従って行った。
Figure 2018225864
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イルＯ−イソペンチル−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ５３、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ｉＰｅｎ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−イソペンチル−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ｉＰｅｎ）−ＯＨ、化合物ａａ５５）（１８ｇ、４３．７４ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（１２６ｍＬ）に溶解し、ピペリジン（５４ｍＬ）を加えて室温で３時間撹拌した。その後、析出した固体を回収することでＯ−イソペンチル−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（Ｈ−ＭｅＳｅｒ（ｉＰｅｎ）−ＯＨ）を得た。
得られたＯ−イソペンチル−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（Ｈ−ＭｅＳｅｒ（ｉＰｅｎ）−ＯＨ）とペンタ−４−エン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（１５．６ｇ、７９．１１ｍｍｏｌ）および炭酸水素ナトリウム（４．４ｇ、５２．３７ｍｍｏｌ）に１，４−ジオキサン／水（１００ｍＬ／１００ｍＬ）を加えて室温で１６時間撹拌した。その後、ジエチルエーテルで２回洗浄し、水層に塩酸水溶液を加えてｐＨ１とした。水層をジクロロメタンで２回抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過後に減圧濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル＝２／１）で精製し、Ｏ−イソペンチル−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ｉＰｅｎ）−ＯＨ）（５．６ｇ、７８％）を得た。
得られたＯ−イソペンチル−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ｉＰｅｎ）−ＯＨ）（４．０ｇ、１４．７４ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（３．８ｇ、２９．４ｍｍｏｌ）および２−ブロモアセトニトリル（７．０８ｇ、５９．０３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（８０ｍＬ）に溶解し、室温で１６時間撹拌した。その後、減圧濃縮で溶媒を除去し、得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル＝２／１）で精製し、シアノメチルＯ−イソペンチル−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ｉＰｅｎ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（２ｇ、４４％）を得た。
続いてリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（４００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を緩衝液Ａ（１００ｍＬ）に溶解し、先で得られたシアノメチルＯ−イソペンチル−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ｉＰｅｎ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（６８６ｍｇ、２．２１ｍｍｏｌ）を添加し、室温で２時間撹拌した。その後、反応液にトリフルオロ酢酸（２．３ｍＬ）を添加し、この反応液を凍結乾燥した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）で精製し、表題化合物（化合物ｐｃ５３、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ｉＰｅｎ）−ｐＣｐＡ）（５９ｍｇ、６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ９０７ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｏ−エチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−ホモセリン（化合物ｐｃ５４、Ｐｅｎ−Ｈｓｅ（Ｅｔ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、市販のＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−エチル−Ｌ−ホモセリン（Ｆｍｏｃ−Ｈｓｅ（Ｅｔ）−ＯＨ、渡辺化学工業より購入）（２００ｍｇ、０．５４１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液（２．０ｍＬ）に４−（３−フェニルプロピル）ピペリジン（０．２２９ｍＬ、１．０８３ｍｍｏｌ）を室温にて加えた。反応液を室温にて７時間撹拌した後、４−（３−フェニルプロピル）ピペリジン（０．２２９ｍＬ、１．０８３ｍｍｏｌ）をさらに加え、２時間室温にて撹拌した。反応液に水を加え、ヘキサンで洗浄し、得られた水層を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、Ｏ−エチル−Ｌ−ホモセリン（Ｈ−Ｈｓｅ（Ｅｔ）−ＯＨ）（７８ｍｇ、９８％）を得た。
窒素雰囲気下、Ｏ−エチル−Ｌ−ホモセリン（Ｈ−Ｈｓｅ（Ｅｔ）−ＯＨ）（７８ｍｇ、０．５３０ｍｍｏｌ）の水溶液（２．０ｍＬ）に炭酸ナトリウム（１２９ｍｇ、１．２１９ｍｍｏｌ）を室温にて加え、反応液が透明になるまで撹拌した。反応液に塩化ペンタ−４−エノイル（０．９３ｍＬ、８．３９ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（２．０ｍＬ）を滴下しながら室温にて加え、２時間撹拌した。塩化ペンタ−４−エノイル（０．９３ｍＬ、８．３９ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（１２９ｍｇ、１．２１９ｍｍｏｌ）を室温にて反応液にさらに加え、１３時間撹拌した。反応液にギ酸（０．２０３ｍＬ）を加え、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を減圧濃縮により除去し、水で希釈した。得られた溶液を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、Ｏ−エチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−ホモセリン（化合物ｐｃ５４、Ｐｅｎ−Ｈｓｅ（Ｅｔ）−ＯＨ）（９３ｍｇ、７７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ２３０ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
シアノメチルＯ−エチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−ホモセリナート（化合物ｐｃ５５、Ｐｅｎ−Ｈｓｅ（Ｅｔ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｏ−エチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−ホモセリン（化合物ｐｃ５４、Ｐｅｎ−Ｈｓｅ（Ｅｔ）−ＯＨ）（９３ｍｇ、０．４０６ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（１．０ｍＬ）にＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．２１３ｍＬ、１．２１７ｍｍｏｌ）、２−ブロモアセトニトリル（０．１７０ｍＬ、２．４３４ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２時間３０分撹拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）にて精製し、シアノメチルＯ−エチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−ホモセリナート（化合物ｐｃ５５、Ｐｅｎ−Ｈｓｅ（Ｅｔ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１１０ｍｇ）を定量的に得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ２６９ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イルＯ−エチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−ホモセリナート（化合物ｐｃ５６、Ｐｅｎ−Ｈｓｅ（Ｅｔ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（２５ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（５０ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）の水溶液（２．５ｍＬ）、シアノメチルＯ−エチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−ホモセリナート（化合物ｐｃ５５、Ｐｅｎ−Ｈｓｅ（Ｅｔ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（３７．１ｍｇ、０．１３８ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（１．２５ｍＬ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応液に０度にてトリフルオロ酢酸（０．５ｍＬ）を加え、０度にて１時間３０分撹拌した。反応液を水で希釈し、逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（ｐｃ５６、Ｐｅｎ−Ｈｓｅ（Ｅｔ）−ｐＣｐＡ）（１４．０ｍｇ、２工程２３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ８６５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｏ−エチル−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−ホモセリン（化合物ｐｃ５７、Ｐｅｎ−ＭｅＨｓｅ（Ｅｔ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−エチル−Ｎ−メチル−Ｌ−ホモセリン（化合物ａａ１０６、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｓｅ（Ｅｔ）−ＯＨ）（１０１ｍｇ、０．２６３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液（１．０ｍＬ）に４−（３−フェニルプロピル）ピペリジン（０．１１２ｍＬ、０．５２７ｍｍｏｌ）を室温にて加えた。反応液を室温にて７時間撹拌した後、４−（３−フェニルプロピル）ピペリジン（０．１１２ｍＬ、０．５２７ｍｍｏｌ）をさらに加え、２時間室温にて撹拌した。反応液に水を加え、ヘキサンで洗浄し、得られた水層を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、Ｏ−エチル−Ｎ−メチル−Ｌ−ホモセリン（Ｈ−ＭｅＨｓｅ（Ｅｔ）−ＯＨ）（３１ｍｇ、７３％）を得た。
窒素雰囲気下、Ｏ−エチル−Ｎ−メチル−Ｌ−ホモセリン（Ｈ−ＭｅＨｓｅ（Ｅｔ）−ＯＨ）（３０ｍｇ、０．１８６ｍｍｏｌ）の水溶液（７００μＬ）に炭酸ナトリウム（４５．４ｍｇ、０．４２８ｍｍｏｌ）を室温にて加え、反応液が透明になるまで撹拌した。反応液に塩化ペンタ−４−エノイル（４１．２μＬ、０．３７２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（０．７ｍＬ）を滴下しながら室温にて加え、２時間撹拌した。塩化ペンタ−４−エノイル（４１．２μＬ、０．３７２ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（４５．４ｍｇ、０．４２８ｍｍｏｌ）を室温にて反応液にさらに加え、１３時間撹拌し、再び塩化ペンタ−４−エノイル（４１．２μＬ、０．３７２ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（４５．４ｍｇ、０．４２８ｍｍｏｌ）を室温にて反応液に加え、５時間３０分撹拌した。反応液にギ酸（０．１０７ｍＬ）を加え、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を減圧濃縮により除去し、水で希釈した。得られた溶液を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、Ｏ−エチル−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−ホモセリン（化合物ｐｃ５７、Ｐｅｎ−ＭｅＨｓｅ（Ｅｔ）−ＯＨ）（２４ｍｇ、２工程５３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ２４４ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
シアノメチルＯ−エチル−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−ホモセリナート（化合物ｐｃ５８、Ｐｅｎ−ＭｅＨｓｅ（Ｅｔ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｏ−エチル−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−ホモセリン（化合物ｐｃ５７、Ｐｅｎ−ＭｅＨｓｅ（Ｅｔ）−ＯＨ）（２２ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．５ｍＬ）にＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．０４７ｍＬ、０．２７１ｍｍｏｌ）、２−ブロモアセトニトリル（０．０３８ｍＬ、０．５４３ｍｍｏｌ）を加え、室温にて５時間３０分撹拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）にて精製し、シアノメチルＯ−エチル−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−ホモセリナート（化合物ｐｃ５８、Ｐｅｎ−ＭｅＨｓｅ（Ｅｔ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（２６ｍｇ）を定量的に得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ２８３ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イルＯ−エチル−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−ホモセリナート（化合物ｐｃ５９、Ｐｅｎ−ＭｅＨｓｅ（Ｅｔ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（２０ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（３３．３ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）の水溶液（２．０ｍＬ）、シアノメチルＯ−エチル−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−ホモセリナート（化合物ｐｃ３８、Ｐｅｎ−ＭｅＨｓｅ（Ｅｔ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（２６．０ｍｇ、０．０９２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（１．０ｍＬ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応液に０度にてトリフルオロ酢酸（０．４ｍＬ）を加え、０度にて３時間撹拌した。反応液を水で希釈し、逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ５９、Ｐｅｎ−ＭｅＨｓｅ（Ｅｔ）−ｐＣｐＡ）（１０．０ｍｇ、２工程２５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ８７９（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｏ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ６０、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｍｅ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
市販のＯ−メチル−Ｌ−セリン（Ｈ−Ｓｅｒ（Ｍｅ）−ＯＨ、渡辺化学工業より購入）（５００ｍｇ、４．２０ｍｍｏｌ）の水溶液（４．０ｍＬ）に炭酸ナトリウム（１．０２ｇ、９．６５ｍｍｏｌ）を室温にて加え、溶液が透明になるまで撹拌した後、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（４．０ｍＬ）、塩化ペンタ−４−エノイル（０．９３ｍＬ、８．３９ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で２時間２０分撹拌した後、塩化ペンタ−４−エノイル（０．９３ｍＬ、８．３９ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（１．０２ｇ、９．６５ｍｍｏｌ）を加え、室温でさらに２時間撹拌した。反応液を水で希釈し、ギ酸（１．６１ｍＬ）を加え、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を減圧濃縮により除去した。得られた溶液を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、Ｏ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ６０、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｍｅ）−ＯＨ）（５８３ｍｇ、６９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ２０２ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
シアノメチルＯ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ６１、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｍｅ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｏ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ６０、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｍｅ）−ＯＨ）（３００ｍｇ、１．４９１ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（３．０ｍＬ）にＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．７８１ｍＬ、４．４７ｍｍｏｌ）、２−ブロモアセトニトリル（０．６２３ｍＬ、８．９５ｍｍｏｌ）を加え、室温にて４時間撹拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）にて精製し、シアノメチルＯ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ６１、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｍｅ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（２８３ｍｇ、７９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ２４１ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イルＯ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ６２、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｍｅ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（５０ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（１００ｍｇ、０．１３８ｍｍｏｌ）の水溶液（５．０ｍＬ）、シアノメチルＯ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ６１、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｍｅ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（６６．５ｍｇ、０．２７７ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（２．５ｍＬ）を加え、室温で４時間撹拌した。反応液に０度にてトリフルオロ酢酸（１．０ｍＬ）を加え、０度にて１時間３０分撹拌した。反応液を水で希釈し、逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ６２、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｍｅ）−ｐＣｐＡ）（１４．０ｍｇ、２工程１２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ８３７ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−アミノ−７，７−ジフルオロヘプタン酸（化合物ｐｃ６３、Ｈ−Ｈｎｌ（７−Ｆ２）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−７，７−ジフルオロヘプタン酸（化合物ａａ５８、Ｆｍｏｃ−Ｈｎｌ（７−Ｆ２）−ＯＨ）（１４３ｍｇ、０．３４８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（６９６μＬ）に溶解し、４−（３−フェニルプロピル）ピペリジン（２２１μＬ、１．０４３ｍｍｏｌ）と水（１ｍＬ）を加え４時間室温にて撹拌した。得られた反応液を直接逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−２−アミノ−７，７−ジフルオロヘプタン酸（化合物ｐｃ６３、Ｈ−Ｈｎｌ（７−Ｆ２）−ＯＨ）（２９．４ｍｇ、４７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ １８２ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．２４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−７，７−ジフルオロ−２−（ペンタ−４−エンアミド）ヘプタン酸（化合物ｐｃ６４、Ｐｅｎ−Ｈｎｌ（７−Ｆ２）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、既に実施例に記載済みの（Ｓ）−２−アミノ−７，７−ジフルオロヘプタン酸（化合物ｐｃ６３、Ｈ−Ｈｎｌ（７−Ｆ２）−ＯＨ）（１４．７ｍｇ、０．０８１ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（１７．２ｍｇ、０．１６２ｍｍｏｌ）に水（２４３μＬ）、１，４−ジオキサン（１６２μＬ）を室温にて加え、撹拌した後、反応液に塩化ペンタ−４−エノイル（１８μＬ、０．０８１ｍｍｏｌ）を室温にて滴下し、３０分間撹拌した。反応液に２Ｎ塩酸水溶液をｐＨ＝２になるまで加え、酢酸エチルで抽出し、得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した後、減圧濃縮した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−７，７−ジフルオロ−２−（ペンタ−４−エンアミド）ヘプタン酸（化合物ｐｃ６４、Ｐｅｎ−Ｈｎｌ（７−Ｆ２）−ＯＨ）（１０ｍｇ、４７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ２６４ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−７，７−ジフルオロ−２−（ペンタ−４−エンアミド）ヘプタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ６５、Ｐｅｎ−Ｈｎｌ（７−Ｆ２）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−７，７−ジフルオロ−２−（ペンタ−４−エンアミド）ヘプタン酸（化合物ｐｃ６４、Ｐｅｎ−Ｈｎｌ（７−Ｆ２）−ＯＨ）（２５．２ｍｇ、０．０９６ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（４７９μＬ）に２−ブロモアセトニトリル（６．６７μＬ、０．０９６ｍｍｏｌ）、Ｎ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（２５μＬ、０．１４４ｍｍｏｌ）を０度にて加え、１時間撹拌した。反応液に２−ブロモアセトニトリル（０．６６７μＬ、０．００９６ｍｍｏｌ）を０度にてさらに加え、１０分撹拌した。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）で抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧濃縮し、得られた粗生成物を順相シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）にて精製し、（Ｓ）−７，７−ジフルオロ−２−（ペンタ−４−エンアミド）ヘプタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ６５、Ｐｅｎ−Ｈｎｌ（７−Ｆ２）−ＯＣＨ２ＣＮ）（２１．２ｍｇ、７３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ３０３ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ）−７，７−ジフルオロ−２−（ペンタ−４−エンアミド）ヘプタン酸（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ６６、Ｐｅｎ−Ｈｎｌ（７−Ｆ２）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（３．６ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（１２．６７ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）の水溶液（０．２ｍＬ）に上述の粗生成物である（Ｓ）−７，７−ジフルオロ−２−（ペンタ−４−エンアミド）ヘプタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ６５、Ｐｅｎ−Ｈｎｌ（７−Ｆ２）−ＯＣＨ２ＣＮ）（２１．２ｍｇ、０．０７０ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．１ｍＬ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応液に酢酸（３．６ｍＬ）を室温にて加え、２時間撹拌した。反応液を水で希釈し、逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（２Ｓ）−７，７−ジフルオロ−２−（ペンタ−４−エンアミド）ヘプタン酸（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ６６、Ｐｅｎ−Ｈｎｌ（７−Ｆ２）−ｐＣｐＡ）（６．０ｍｇ、２工程３８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ８９８ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ）−７，７−ジフルオロ−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）ヘプタン酸（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ７０、Ｐｅｎ−ＭｅＨｎｌ（７−Ｆ２）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−７，７−ジフルオロヘプタン酸（化合物ａａ５９、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｎｌ（７−Ｆ２）−ＯＨ）（１．１７ｇ、２．８０ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（１６ｍＬ）にピペリジン（４ｍＬ、２．２７２ｍｍｏｌ）を室温にて加え、１６時間撹拌した。反応液にジエチルエーテル（１００ｍＬ）を加え３０分撹拌した。反応液をろ過し（２Ｓ）−７，７−ジフルオロ−２−（メチルアミノ）ヘプタン酸（化合物ｐｃ６７、Ｈ−ＭｅＨｎｌ（７−Ｆ２）−ＯＨ）（４４１ｍｇ、８１％）を白色固体として得た。
窒素雰囲気下、（２Ｓ）−７，７−ジフルオロ−２−（メチルアミノ）ヘプタン酸（化合物ｐｃ６７、Ｈ−ＭｅＨｎｌ（７−Ｆ２）−ＯＨ）（４１２ｍｇ、２．１１ｍｍｏｌ）とペンタ−４−エン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（１．２４ｇ、６．２９ｍｍｏｌ）と炭酸ナトリウム（７０６ｍｇ、８．４０ｍｍｏｌ）の水／１，４−ジオキサン溶液（１／１、２０ｍＬ）を室温にて１６時間撹拌した。反応溶液をジエチルエーテルで２回洗浄し、水層のｐＨを１Ｎ塩酸水溶液でｐＨを２に調節した。水層をジクロロメンタンで２度抽出し、得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、ろ過、減圧濃縮した。得られた残渣を順相シリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、（２Ｓ）−７，７−ジフルオロ−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）ヘプタン酸（化合物ｐｃ６８、Ｐｅｎ−ＭｅＨｎｌ（７−Ｆ２）−ＯＨ）（３００ｍｇ、５１％）を得た。
窒素雰囲気下、上述の様にして得た（２Ｓ）−７，７−ジフルオロ−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）ヘプタン酸（化合物ｐｃ６８、Ｐｅｎ−ＭｅＨｎｌ（７−Ｆ２）−ＯＨ）（１．０７ｇ、３．８６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３０ｍＬ）にＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（９９６ｍｇ、７．７２ｍｍｏｌ）、２−ブロモアセトニトリル（１．８４ｇ、１５．３４ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１６時間撹拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、（２Ｓ）−７，７−ジフルオロ−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）ヘプタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ６９、Ｐｅｎ−ＭｅＨｎｌ（７−Ｆ２）−ＯＣＨ２ＣＮ）（６１３ｍｇ、５０％）の混合物を得た。
緩衝液Ａ（２５ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（３００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）の水溶液（７５ｍＬ）、上述の方法で得た（２Ｓ）−７，７−ジフルオロ−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）ヘプタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ６９、Ｐｅｎ−ＭｅＨｎｌ（７−Ｆ２）−ＯＣＨ２ＣＮ）（５２８ｍｇ、１．７５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（３ｍＬ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応溶液にトリフルオロ酢酸（１．６ｍＬ）を加え反応液を凍結乾燥した。残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ７０、Ｐｅｎ−ＭｅＨｎｌ（７−Ｆ２）−ｐＣｐＡ）（３２ｍｇ、２工程８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ９１２ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（２，２，３，３−テトラフルオロプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ７１、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、既に実施例に記載済みのＯ−（２，２，３，３−テトラフルオロプロピル）−Ｌ−セリン（Ｈ−Ｓｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ＯＨ）（２００ｍｇ、０．９１３ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（１９３ｍｇ、１．８２５ｍｍｏｌ）に水（２．７ｍＬ）、１，４−ジオキサン（１．８ｍＬ）を室温にて加え、撹拌した後、反応液に塩化ペンタ−４−エノイル（０．２０２ｍＬ、１．８２５ｍｍｏｌ）を滴下しながら室温にて加え、３０分撹拌した。反応液に２Ｎ塩酸水溶液をｐＨ＝２になるまで加え、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄した後、得られた有機層を減圧濃縮した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（２，２，３，３−テトラフルオロプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ７１、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ＯＨ）（１８０．９ｍｇ、６６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ３０２ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
シアノメチルＮ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（２，２，３，３−テトラフルオロプロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ７２、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（２，２，３，３−テトラフルオロプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ７１、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ＯＨ）（１８０．９ｍｇ、０．６０１ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（１．５ｍＬ）に２−ブロモアセトニトリル（４１．９μＬ、０．６０１ｍｍｏｌ）、Ｎ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．１５７ｍＬ、０．９０１ｍｍｏｌ）を０度にて加え、１時間撹拌した。反応液に２−ブロモアセトニトリル（８．３８μＬ、０．１２０ｍｍｏｌ）、Ｎ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．１５７ｍＬ、０．９０１ｍｍｏｌ）を０度にてさらに加え、１時間３０分撹拌した。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）で抽出し、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧濃縮することで粗生成物であるシアノメチルＮ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（２，２，３，３−テトラフルオロプロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ７２、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１５０ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ３４１ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イルＮ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（２，２，３，３−テトラフルオロプロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ７３、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（２３ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（８０．０ｍｇ、０．１１０ｍｍｏｌ）の水溶液（１．２ｍＬ）、上述の粗生成物であるシアノメチルＮ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（２，２，３，３−テトラフルオロプロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ７２、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１５０ｍｇ）のアセトニトリル溶液（０．６１６ｍＬ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応液に酢酸（２３．０ｍＬ）を室温にて加え、４時間３０分撹拌した。反応液を水で希釈し、逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ７３、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ｐＣｐＡ）（１６．３ｍｇ、２工程１６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ９３６ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
メチルＮ−メチル−Ｎ−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）−Ｏ−（２，２，３，３−テトラフルオロプロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ７４、Ｎｓ−ＭｅＳｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ＯＭｅ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、既に実施例に記載済みのメチルＮ−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）−Ｏ−（２，２，３，３−テトラフルオロプロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ７０、Ｎｓ−Ｓｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ＯＭｅ）（１．０ｇ、２．３９１ｍｍｏｌ）とトリフェニルホスフィン（ＰＰｈ３）（１．２５ｇ、４．７８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液（４０ｍＬ）に脱水メタノール（ＭｅＯＨ）（０．１４５ｍＬ、３．９５ｍｍｏｌ）、４０％アゾジカルボン酸ジエチル（ＤＥＡＤ）トルエン溶液（２．１７ｍＬ、東京化成工業より購入）を滴下しながら０度にて加えた後、室温で１時間撹拌した。反応液にギ酸（０．９１７ｍＬ）を加え、減圧濃縮することで得られた残渣をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈し、逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製することで、メチルＮ−メチル−Ｎ−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）−Ｏ−（２，２，３，３−テトラフルオロプロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ７４、Ｎｓ−ＭｅＳｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ＯＭｅ）（６２５ｍｇ、６１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ４３３ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（２，２，３，３−テトラフルオロプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ７５、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、メチルＮ−メチル−Ｎ−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）−Ｏ−（２，２，３，３−テトラフルオロプロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ７４、Ｎｓ−ＭｅＳｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ＯＭｅ）（１００ｍｇ、０．２３１ｍｍｏｌ）のジクロロエタン（ＤＣＥ）溶液（０．７７１ｍＬ）に水酸化トリメチルすず（８４ｍｇ、０．４６３ｍｍｏｌ）を室温にて加え、６０度で２０時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、１Ｎ塩酸水溶液、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過、減圧濃縮することで得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、Ｎ−メチル−Ｎ−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）−Ｏ−（２，２，３，３−テトラフルオロプロピル）−Ｌ−セリン（Ｎｓ−ＭｅＳｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ＯＨ）（８８ｍｇ）を混合物として得た。
上述の混合物であるＮ−メチル−Ｎ−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）−Ｏ−（２，２，３，３−テトラフルオロプロピル）−Ｌ−セリン（Ｎｓ−ＭｅＳｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ＯＨ）（４４ｍｇ）のアセトニトリル溶液（０．５ｍＬ）に炭酸カリウム（７２．７ｍｇ、０．５２６ｍｍｏｌ）、チオフェノール（ＰｈＳＨ）（３２．３μＬ、０．３１６ｍｍｏｌ）を室温にて加え、２時間３０分撹拌した。反応液にギ酸（４０．３μＬ）、ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）／ヘキサン＝１／４を加え、水で抽出した。得られた水層を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、Ｎ−メチル−Ｏ−（２，２，３，３−テトラフルオロプロピル）−Ｌ−セリン（Ｈ−ＭｅＳｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ＯＨ）（１５ｍｇ、２工程５５％）を得た。
上述のＮ−メチル−Ｏ−（２，２，３，３−テトラフルオロプロピル）−Ｌ−セリン（Ｈ−ＭｅＳｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ＯＨ）（１２ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）の水溶液（６５０μＬ）に炭酸ナトリウム（１２．６ｍｇ、０．１１８ｍｍｏｌ）を室温にて加え、反応液が透明になるまで撹拌した後、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（６５０μＬ）、塩化ペンタ−４−エノイル（１１．４μＬ、０．１０３ｍｍｏｌ）を滴下しながら室温にて加え、５時間３０分撹拌した。反応液にさらに塩化ペンタ−４−エノイル（１１．４μＬ、０．１０３ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（１２．６ｍｇ、０．１１８ｍｍｏｌ）を室温にて加え、１３時間３０分撹拌した。反応液にギ酸（１９．７μＬ）を加え、ロータリーエバポレーターを用い、減圧下、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を除去した。得られた水層をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）にて希釈した後、逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（２，２，３，３−テトラフルオロプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ７５、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ＯＨ）（１５ｍｇ、９２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ３１６ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
シアノメチルＮ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（２，２，３，３−テトラフルオロプロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ７６、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（２，２，３，３−テトラフルオロプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ７５、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ＯＨ）（５３ｍｇ、０．１６８ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．５ｍＬ）にＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（８８μＬ、０．５０４ｍｍｏｌ）、２−ブロモアセトニトリル（７０．３μＬ、１．００９ｍｍｏｌ）を室温にて加え、１時間３０分撹拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）にて精製し、シアノメチルＮ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（２，２，３，３−テトラフルオロプロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ７６、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（５７ｍｇ、９６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ３５５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イルＮ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（２，２，３，３−テトラフルオロプロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ７７、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（１６ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（３０．０ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）の水溶液（１．２ｍＬ）、シアノメチルＮ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（２，２，３，３−テトラフルオロプロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ７６、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（２９．４ｍｇ、０．０８３ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．６ｍＬ）を加え、室温で２時間３０分撹拌した。反応液にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（３２０μＬ）を０度にて加え、３０分撹拌した。反応液を水で希釈し、逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ７７、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）−ｐＣｐＡ）（１０ｍｇ、２工程２５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ９４８ （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．４７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ）−２−アミノ−６−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ヘキサン酸（化合物ｐｃ７８、Ｈ−Ｎｌｅ（６−ＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（２Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−６−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ヘキサン酸（化合物ａａ１０７、Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ（６−ＯＴＨＰ）−ＯＨ）（１５０ｍｇ，０．３３１ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．６５ｍＬ）に溶解した後にピペリジン（８４ｍｇ、０．９９２ｍｍｏｌ）を加え３時間室温にて撹拌した。得られた反応液を直接逆相カラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）にて精製し、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ヘキサン酸（化合物ｐｃ７８、Ｈ−Ｎｌｅ（６−ＯＨ）−ＯＨ）（５１ｍｇ、６７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ２３０ （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．４５分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）
（２Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−６−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ヘキサン酸（化合物ｐｃ７９、Ｐｅｎ−Ｎｌｅ（６−ＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ヘキサン酸（化合物ｐｃ７８、Ｈ−Ｎｌｅ（６−ＯＨ）−ＯＨ）（５１ｍｇ、０．２２１ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（２５．７ｍｇ、０．２４３ｍｍｏｌ）に水（１．１ｍＬ）、テトラヒドロフラン（１．１ｍＬ）を室温にて加え、撹拌した後、反応液に塩化ペンタ−４−エノイル（３６．５μＬ，０．３３１ｍｍｏｌ）を滴下し室温にて４８時間撹拌した。反応液に２０％硫酸水素カリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、得られた有機層を減圧濃縮し、（２Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−６−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ヘキサン酸（化合物ｐｃ７９、Ｐｅｎ−Ｎｌｅ（６−ＯＴＨＰ）−ＯＨ）（７０ｍｇ）を粗生成物として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ３１２ （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．７１分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）
（２Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−６−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ヘキサン酸シアノメチル（化合物ｐｃ８０、Ｐｅｎ−Ｎｌｅ（６−ＯＴＨＰ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（２Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−６−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ヘキサン酸（化合物ｐｃ７９、Ｐｅｎ−Ｎｌｅ（６−ＯＴＨＰ）−ＯＨ）（７０ｍｇ、０．２２３ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（１．１２ｍＬ）に２−ブロモアセトニトリル（３１．２μＬ、０．４４７ｍｍｏｌ）、Ｎ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（６２．３μＬ、０．４４７ｍｍｏｌ）を０度にて加え、２時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧濃縮し、得られた粗生成物を順相シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）にて精製し、（２Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−６−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ヘキサン酸シアノメチル（化合物ｐｃ８０、Ｐｅｎ−Ｎｌｅ（６−ＯＴＨＰ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（４３ｍｇ、５５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ３７５ （Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：０．８３分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）
２−（ペンタ−４−エンアミド）−６−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ヘキサン酸（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（（ホスホノオキシ）メチル）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ８１、Ｐｅｎ−Ｎｌｅ（６−ＯＴＨＰ）−ｐＣｐＡ（ＴＨＦ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（１３．８８ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（２２．０４ｍｇ、０．１２２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（４５８μＬ）と水（９１５μＬ）の溶液を加え、２−（ペンタ−４−エンアミド）−６−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ヘキサン酸（２Ｓ）−シアノメチル（化合物ｐｃ８０、Ｐｅｎ−Ｎｌｅ（６−ＯＴＨＰ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（４３ｍｇ、０．１２２ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。凍結乾燥にて溶媒を留去し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて簡易精製し、表題化合物（化合物ｐｃ８１、Ｐｅｎ−Ｎｌｅ（６−ＯＴＨＰ）−ｐＣｐＡ（ＴＨＦ））（４０ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ １０１６ （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．６１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
６−ヒドロキシ−２−（ペンタ−４−エンアミド）ヘキサン酸（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ８２、Ｐｅｎ−Ｎｌｅ（６−ＯＨ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
２−（ペンタ−４−エンアミド）−６−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ヘキサン酸（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（（ホスホノオキシ）メチル）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ８１、Ｐｅｎ−Ｎｌｅ（６−ＯＴＨＰ）−ｐＣｐＡ（ＴＨＦ）（３２ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）を８０％酢酸水溶液（１．０５ｍＬ）に溶解し１時間撹拌した。その後、トリフルオロ酢酸（４．８１μＬ、０．０６３ｍｍｏｌ）を加え１時間撹拌した。反応液を水で希釈し、逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ８２、Ｐｅｎ−Ｎｌｅ（６−ＯＨ）−ｐＣｐＡ）（１０．０ｍｇ、３７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ８６４ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｏ−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ８３、Ｈ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１４２、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）（０．５０ｇ、１．１０ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（６．４０ｍＬ）溶液に、ピペリジン（１．６０ｍＬ）を加え、室温にて３時間攪拌した。反応液にジエチルエーテル／ヘキサン（２０．０ｍＬ／２０．０ｍＬ）を加え、析出した固体を回収し、Ｏ−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ８３、Ｈ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）（０．１０ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ８４、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｏ−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ８３、Ｈ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）（０．２０ｇ、０．８６ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（４．００ｍＬ）／水（４．００ｍＬ）に溶解させた後に、文献記載（Organic Letters, 2011, 13, 4906）の方法で合成したペンタ−４−エン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（０．３４ｇ、１．８６ｍｍｏｌ）と、炭酸水素ナトリウム（０．１５ｇ、１．７９ｍｍｏｌ）を加え、室温で１６時間撹拌した。反応が完結した後、酢酸エチルで３回洗浄し、水層を凍結乾燥することで、Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ８４、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）（０．７６ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
シアノメチルＮ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エチル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ８５、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ８４、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）（０．１６ｇ、０．４９ｍｍｏｌ）、ブロモアセトニトリル（０．２４ｇ、１．９７ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．１３ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０．０ｍＬ）／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．００ｍＬ）に溶解し、２５度で１６時間攪拌した。反応液を濃縮し、残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製し、シアノメチルＮ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エチル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ８５、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（０．０８ｇ、１６％）を得た。
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノー２−オキソピリミジンー１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシー２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフランー３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノー９Ｈ−プリンー９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフランー３−イルＯ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ−（ペンター４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ８６、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＨ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（１００ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（４００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）および、シアノメチルＮ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エチル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ８５、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（７７９ｍｇ、２．２０ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応液にトリフルオロ酢酸（２．３ｍＬ）を加えたのち、反応液を逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ８６、２０．０ｍｇ、２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ８６６ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３０分（分析条件ＦＡ０５）
Ｎ−メチル−Ｏ−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ８７、Ｈ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｏ−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１４７、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）（１０．０ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（８０．０ｍＬ）溶液に、ピペリジン（３０．０ｍＬ）を加え、室温にて３時間攪拌した。反応液にジエチルエーテル（５００ｍＬ）を加え、析出した固体を回収し、Ｎ−メチル−Ｏ−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ８７、Ｈ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）（３．２０ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ８８、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−メチル−Ｏ−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ８７、Ｈ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）（３．００ｇ、１２．１ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（６０．０ｍＬ）／水（６０．０ｍＬ）に溶解させた後に、文献記載（Organic Letters, 2011, 13, 4906）の方法で合成したペンタ−４−エン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（５．９８ｇ、３０．３ｍｍｏｌ）と、炭酸水素ナトリウム（２．０４ｇ、２４．３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１６時間撹拌した。反応が完結した後、酢酸エチルで３回洗浄し、水層を凍結乾燥することで、Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ８８、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）（５．００ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
シアノメチルＮ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エチル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ８９、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成

Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ８８、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）（４．００ｇ、１２．１ｍｍｏｌ）、ブロモアセトニトリル（５．８０ｇ、４８．４ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（３．１０ｇ、２４．０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１００ｍＬ）／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０．０ｍＬ）に溶解し、２５度で４８時間攪拌した。反応液を濃縮し、残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製し、シアノメチルＮ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エチル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ８９、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１．２０ｇ、２７％）を得た。
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノー２−オキソピリミジンー１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシー２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフランー３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノー９Ｈ−プリンー９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフランー３−イルＯ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ−メチルーＮ−（ペンター４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ９０、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＨ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（１００ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（４００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）および、シアノメチルＮ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エチル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ８９、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（８１５ｍｇ、２．２１ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応液にトリフルオロ酢酸（２．３０ｍＬ）加えたのち、反応液を逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ９０、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＨ）−ｐＣｐＡ）（３３．７ｍｇ、３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ８８１ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３５分（分析条件ＦＡ０５）
Ｏ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−（ペンター４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ９１、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｏ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１５２、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（０．１２ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（０．７４ｍＬ）／水（０．７４ｍＬ）に溶解させた後に、塩化ペンター４−エノイル（０．１３ｇ、１．１０ｍｍｏｌ）と、Ｎ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．１９ｇ、１．４７ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間撹拌した。反応液を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、Ｏ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−（ペンター４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ９１、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（０．１２ｇ、６７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ２４６ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４１分（分析条件ＦＡ０５）
シアノメチルＯ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−（ペンター４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ９２、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｏ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−（ペンター４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ９１、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（０．１１ｇ、０．９０ｍｍｏｌ）、ブロモアセトニトリル（０．１１ｇ、０．９０ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．１７ｇ、１．３５ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．００ｍＬ）に溶解し、室温で１時間攪拌した。反応液を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、シアノメチルＯ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−（ペンター４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ９２、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（０．１２ｇ、９６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ２８５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４６分（分析条件ＦＡ０５）
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノー２−オキソピリミジンー１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシー２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフランー３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノー９Ｈ−プリンー９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフランー３−イルＯ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−（ペンター４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ９３、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（３０．０ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（７６．０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）および、シアノメチルＯ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−（ペンター４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ９２、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１２０ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間３０分撹拌した。０度に冷却したのち、反応液に酢酸（６．００ｍＬ）加え、室温で２時間撹拌した。反応液に水（３０．０ｍＬ）を加え、逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ９３、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ｐＣｐＡ）（１１．０ｍｇ、１２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ８８０ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３２分（分析条件ＦＡ０５）
Ｎ−メチル−Ｏ−（（２Ｓ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ９４、Ｈ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｏ−（（２Ｓ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１５９、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）（７．００ｇ、１４．５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５０．０ｍＬ）溶液に、ピペリジン（２０．０ｍＬ）を加え、室温にて３時間攪拌した。反応液にヘキサン（１．５０Ｌ）を加え、析出した固体を回収し、Ｎ−メチル−Ｏ−（（２Ｓ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ９４、Ｈ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）（２．４０ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（（２Ｓ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ９５、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−メチル−Ｏ−（（２Ｓ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ９４、Ｈ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）（２．５０ｇ、９．５７ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（５０．０ｍＬ）／水（５０．０ｍＬ）に溶解させた後に、文献記載（Organic Letters, 2011, 13, 4906）の方法で合成したペンタ−４−エン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（４．７０ｇ、２３．８ｍｍｏｌ）と、炭酸水素ナトリウム（１．６０ｇ、１９．１ｍｍｏｌ）を加え、室温で１６時間撹拌した。反応が完結した後、酢酸エチルで３回洗浄し、水層を凍結乾燥することで、Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（（２Ｓ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ９５、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）（５．１０ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
シアノメチルＮ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（（２Ｓ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ９６、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（（２Ｓ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ９５、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）（３．１０ｇ、９．０３ｍｍｏｌ）、ブロモアセトニトリル（４．３０ｇ、３５．９ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（２．３０ｇ、１７．８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１００ｍＬ）／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０．０ｍＬ）に溶解し、２５度で１６時間攪拌した。反応液を濃縮し、残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製し、シアノメチルＮ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（（２Ｓ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ９６、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１．０１ｇ、２９％）を得た。
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノー２−オキソピリミジンー１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシー２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフランー３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノー９Ｈ−プリンー９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフランー３−イルＯ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチルーＮ−（ペンター４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ９７、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（１００ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（４００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）および、シアノメチルＮ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（（２Ｓ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ９６、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（９００ｍｇ、２．２１ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応液にトリフルオロ酢酸（２．３ｍＬ）加えたのち、反応液を逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ９７、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ｐＣｐＡ）（７９．８ｍｇ、１６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ８９４ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３５分（分析条件ＦＡ０５）
Ｏ−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−（ペンター４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ９８、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｏ−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１６４、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（０．１８ｇ、１．１０ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（０．５５ｍＬ）／水（１．６６ｍＬ）に溶解させた後に、塩化ペンター４−エノイル（０．２０ｇ、１．６６ｍｍｏｌ）と炭酸ナトリウム（０．２３ｇ、２．２１ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間撹拌した。反応液を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、Ｏ−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−（ペンター４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ９８、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（０．１１ｇ、４１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ２４６ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４１分（分析条件ＦＡ０５）
シアノメチルＯ−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−（ペンター４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ９９、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｏ−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−（ペンター４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ９８、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（０．１１ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）、ブロモアセトニトリル（０．１１ｇ、０．９０ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．１７ｇ、１．３５ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．００ｍＬ）に溶解し、室温で１時間攪拌した。反応液を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、シアノメチルＯ−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−（ペンター４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ９９、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（０．１１ｇ、８８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ２８５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４６分（分析条件ＦＡ０５）
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノー２−オキソピリミジンー１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシー２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフランー３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノー９Ｈ−プリンー９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフランー３−イルＯ−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−（ペンター４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１００、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（３０．０ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（２３．０ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）および、シアノメチルＯ−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−（ペンター４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ９９、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（３６．０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間３０分撹拌した。０度に冷却したのち、反応液に酢酸（６．００ｍＬ）加え、室温で２時間撹拌した。反応液に水（３０．０ｍＬ）を加え、逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ１００、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ｐＣｐＡ）（９．８０ｍｇ、３５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ８８０ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３３分（分析条件ＦＡ０５）
Ｎ−メチル−Ｏ−（（２Ｒ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１０１、Ｈ−ＭｅＳｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｏ−（（２Ｒ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１７１、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）（７．００ｇ、１４．５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５０．０ｍＬ）溶液に、ピペリジン（２０．０ｍＬ）を加え、室温にて３時間攪拌した。反応液にヘキサン（１．５００Ｌ）を加え、析出した固体を回収し、Ｎ−メチル−Ｏ−（（２Ｒ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１０１、Ｈ−ＭｅＳｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）（２．４０ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（（２Ｒ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１０２、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−メチル−Ｏ−（（２Ｒ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１０１、Ｈ−ＭｅＳｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）（２．５０ｇ、９．５７ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（５０．０ｍＬ）／水（５０．０ｍＬ）に溶解させた後に、文献記載（Organic Letters, 2011, 13, 4906）の方法で合成したペンタ−４−エン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（４．７０ｇ、２３．８ｍｍｏｌ）と、炭酸水素ナトリウム（１．６０ｇ、１９．１ｍｍｏｌ）を加え、室温で１６時間撹拌した。反応が完結した後、酢酸エチルで３回洗浄し、水層を凍結乾燥することで、Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（（２Ｒ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１０２、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）（５．１０ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
シアノメチルＮ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（（２Ｒ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１０３、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（（２Ｒ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１０２、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）（３．１０ｇ、９．０３ｍｍｏｌ）、ブロモアセトニトリル（４．３０ｇ、３５．９ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（２．３０ｇ、１７．８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１００ｍＬ）／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０．０ｍＬ）に溶解し、２５度で１６時間攪拌した。反応液を濃縮し、残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製し、シアノメチルＮ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（（２Ｒ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１０３、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１．０１ｇ、２９％）を得た。
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノー２−オキソピリミジンー１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシー２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフランー３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノー９Ｈ−プリンー９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフランー３−イルＯ−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチルーＮ−（ペンター４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１０４、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（１００ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（４００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）および、シアノメチルＮ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｏ−（（２Ｒ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１０３、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（８４６ｍｇ、２．２１ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応液にトリフルオロ酢酸（２．３０ｍＬ）加えたのち、反応液を逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ１０４、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ｐＣｐＡ）（６９．５ｍｇ、１６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ８９４ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３５分（分析条件ＦＡ０５）
化合物ｐｃ１０６の合成は、以下のスキームに従って行った。
Figure 2018225864
シアノメチルＯ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１０５、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１７３、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＨ）（２００ｍｇ、０．５０１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１．０ｍＬ）に溶解し、４−（３−フェニルプロピル）ピペリジン（３１８μＬ、１．５０２ｍｍｏｌ）を加えて室温で１分撹拌した。その後、反応液に水（１ｍＬ）を加えて室温で１時間撹拌した。その後、水層を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル＝９５／５）で精製し、Ｏ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｌ−セリン（Ｈ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＨ）（７２ｍｇ、８１％）を得た。
得られたＯ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｌ−セリン（Ｈ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＨ）（６９ｍｇ、０．３８９ｍｍｏｌ）と炭酸水素ナトリウム（１２４ｍｇ、１．１６８ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン／水（２６０μＬ／５１９μＬ）に溶解し、塩化ペンタ−４−エノイル（８６μＬ、０．７７９ｍｍｏｌ）を加えて室温で３０分撹拌した。その後、水層に塩酸水溶液（２Ｍ）を加えてｐＨ２とし、水層を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過後に減圧濃縮し、Ｏ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＨ）を粗生成物として得た。
得られたＯ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＨ）の粗生成物とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１５１ｍｇ、１．１６７ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（９７３μＬ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（５２．４μＬ，０．７７８ｍｍｏｌ）を加えて、室温で１時間撹拌した。その後、反応液に酢酸エチルを加えた後、これを水で３回洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、減圧濃縮で溶媒を除去し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）で精製し、シアノメチルＯ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１０５、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（３６ｍｇ、３１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ２９９ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イルＯ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１０６、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（２１．８ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）を水（０．４ｍＬ）に溶解し、緩衝液Ａ（６ｍＬ）に加えた。この水溶液にシアノメチルＯ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１０５、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（３６ｍｇ、０．１２１ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．２ｍＬ）を滴下し、室温で３時間撹拌した。その後、反応液に酢酸（６ｍＬ）を添加し、この反応液を室温で３時間撹拌した。その後、水（３０ｍＬ）を添加し、逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）で精製し、表題化合物（化合物ｐｃ１０６、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ｐＣｐＡ）（１０．１ｍｇ、３８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ８９４ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
化合物ｐｃ１０９（Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ｐＣｐＡ）の合成は、以下のスキームに従って行った。
Figure 2018225864
Ｏ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１０７、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｏ−（２−メチル−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１７５、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ｔＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成過程で得られた中間体であるＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＨ）（４１６ｍｇ、１．００６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５．０ｍＬ）に溶解し、４−（３−フェニルプロピル）ピペリジン（４２６μＬ、２．０１２ｍｍｏｌ）を加えて室温で９時間撹拌した。その後、反応液をジクロロメタンで希釈し、水で抽出した。水層をジクロロメタンで洗浄後、逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）で精製し、Ｏ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（Ｈ−ＭｅＳｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＨ）（１３７ｍｇ、７１％）を得た。
得られたＯ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（Ｈ−ＭｅＳｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＨ）（１１０ｍｇ、０．５７５ｍｍｏｌ）を水（２．０ｍＬ）に溶解し、炭酸ナトリウム（１４０ｍｇ、１．３２３ｍｍｏｌ）を加えて溶解するまで撹拌した。その後、塩化ペンタ−４−エノイル（１２７μＬ，１．１５０ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（２．０ｍＬ）を加えて室温で２６０分撹拌した。その後、さらに塩化ペンタ−４−エノイル（６３．５μＬ、０．５７５ｍｍｏｌ）および炭酸ナトリウム（７３ｍｇ、０．６９０ｍｍｏｌ）を加えて、室温で２時間撹拌した。さらに塩化ペンタ−４−エノイル（６３．５μＬ、０．５７５ｍｍｏｌ）および炭酸ナトリウム（７３ｍｇ、０．６９０ｍｍｏｌ）を加えて、室温で終夜撹拌した。その後、反応液にギ酸（０．２２１ｍＬ、５．７５ｍｍｏｌ）を加え、テトラヒドロフランを減圧濃縮により除去し、得られた残渣をジメチルスルホキシドで希釈して逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）で精製し、Ｏ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１０７、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＨ）（１４４ｍｇ、７８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ２７４ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
シアノメチルＯ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１０８、Ｐｅｎ−Ｓｅｔ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
Ｏ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１０７、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＨ）（１２０ｍｇ、０．４３９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（２３０μＬ、１．３１７ｍｍｏｌ）および２−ブロモアセトニトリル（１８３μＬ、２．６３ｍｍｏｌ）を加えて室温で１１０分撹拌した。その後、２−ブロモアセトニトリル（９１．５μＬ、１．３２ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１１５μＬ、０．６５９ｍｍｏｌ）を追加し、室温で３０分撹拌した後、反応液を減圧濃縮した。これにより得られた残渣と、Ｏ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１０７、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＨ）（２０ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）を用いて同様の操作を行うことで得られた残渣を合わせて順相カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製することで、シアノメチルＯ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１０８、Ｐｅｎ−Ｓｅｔ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１３７ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３１３ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イルＯ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１０９、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（４６．３ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ）の水溶液（１．４ｍＬ）およびシアノメチルＯ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１０８、Ｐｅｎ−Ｓｅｔ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（８０ｍｇ、０．２５６ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．７ｍＬ）を緩衝液Ａ（２１ｍＬ）に加え、室温で２時間撹拌した。その後、反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を８０％酢酸水溶液（４．０ｍＬ）に溶解し、室温で８時間撹拌した。その後、反応液を水で希釈し、逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）で精製し、表題化合物（化合物ｐｃ１０９、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ｐＣｐＡ）（２０ｍｇ、３４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ９０８ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｏ−（３−メチル−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブチル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１１０、Ｈ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−メチル−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１８２、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）（９．５０ｇ、１．１０ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（７７．０ｍＬ）溶液に、ピペリジン（２２．０ｍＬ）を加え、室温にて３時間攪拌した。反応液にジエチルエーテル（５００ｍＬ）を加え、析出した固体を回収し、Ｏ−（３−メチル−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブチル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１１０、Ｈ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）（２．９０ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
Ｏ−（３−メチル−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブチル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１１１、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｏ−（３−メチル−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブチル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１１０、Ｈ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）（０．２４ｇ、０．８６ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（４．００ｍＬ）／水（４．００ｍＬ）に溶解させた後に、文献記載（Organic Letters, 2011, 13, 4906）の方法で合成したペンタ−４−エン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（０．３４ｇ、１．７２ｍｍｏｌ）と、炭酸水素ナトリウム（０．１４ｇ、１．７１ｍｍｏｌ）を加え、室温で５時間撹拌した。反応が完結した後、ジエチルエーテルで２回洗浄し、水層に１Ｍ塩酸水溶液をｐＨ２になるまで加え、ジクロロメタンで２回抽出した、得られた有機層を混合し、飽和食塩水で有機層を洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製し、Ｏ−（３−メチル−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブチル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１１１、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）（０．３０ｇ、９８％）を得た。
シアノメチルＯ−（３−メチル−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブチル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１１２、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｏ−（３−メチル−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブチル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１１１、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）（３．７６ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）、ブロモアセトニトリル（５．０６ｇ、４２．２ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（２．７１ｇ、２１．０ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０．０ｍＬ）／ジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解し、室温で２日間攪拌した。反応液を減圧下濃縮し得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製し、シアノメチルＯ−（３−メチル−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブチル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１１２、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（３．００ｇ、７２％）を得た。
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノー２−オキソピリミジンー１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシー２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフランー３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノー９Ｈ−プリンー９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフランー３−イルＯ−（３−ヒドロキシー３−メチルブチル）−Ｎ−（ペンター４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１１３、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（１２５ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（４００ｍｇ、１．０１ｍｍｏｌ）および、シアノメチルＯ−（３−メチル−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブチル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１１２、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（８７７ｍｇ、１．２１ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応液にトリフルオロ酢酸（２．８０ｍＬ）加えたのち、凍結乾燥を行い得られた残渣を、逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ１１３、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ｐＣｐＡ）（５４．０ｍｇ、５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ９０９ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３６分（分析条件ＦＡ０５）
Ｏ−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１１４、Ｈ−ＭｅＳｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１８４、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）（０．１５ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．５０ｍＬ）溶液に、ピペリジン（０．３７ｍＬ）を加え、室温にて２時間攪拌した。反応液にヘキサンを加え、析出した固体を回収し、Ｏ−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１１４、Ｈ−ＭｅＳｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）（０．０５ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
Ｏ−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチル）−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１１５、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｏ−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１１４、Ｈ−ＭｅＳｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）（０．０７ｇ、０．３４ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（１．００ｍＬ）／水（１．００ｍＬ）に溶解させた後に、文献記載（Organic Letters, 2011, 13, 4906）の方法で合成したペンタ−４−エン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（０．１３ｇ、０．６７ｍｍｏｌ）と、炭酸水素ナトリウム（０．０６ｇ、０．６８ｍｍｏｌ）を加え、室温で７時間撹拌した。反応が完結した後、ジエチルエーテルで３回洗浄したのち、２Ｍ塩酸水溶液をｐＨ２になるまで加え、ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）で３回抽出した、得られた有機層を混合し、飽和食塩水で有機層を洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させ、Ｏ−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチル）−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１１５、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）（０．１０ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
シアノメチルＯ−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチル）−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１１６、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｏ−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチル）−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１１５、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）（０．５０ｇ、１．７４ｍｍｏｌ）、ブロモアセトニトリル（０．８３ｇ、６．９１ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．４５ｇ、３．４８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１５．０ｍＬ）に溶解し、２５度で１６時間攪拌した。反応液を濃縮し、残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製し、シアノメチルＯ−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチル）−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１１６、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（０．３６ｇ、６６％）を得た。
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノー２−オキソピリミジンー１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシー２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフランー３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノー９Ｈ−プリンー９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフランー３−イルＯ−（３−ヒドロキシー３−メチルブチル）−Ｎ−メチルーＮ−（ペンター４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１１７、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（１００ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（４００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）および、シアノメチルＯ−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチル）−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１１６、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（３６０ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応液にトリフルオロ酢酸（２．８０ｍＬ）を加えたのち、反応液を凍結乾燥した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ１１７、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ｐＣｐＡ）（８６．０ｍｇ、８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ９２３ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３９分（分析条件ＦＡ０５）
Ｎ５，Ｎ５−ジメチル−Ｌ−グルタミン（化合物ｐｃ１１８、Ｈ−Ｇｌｎ（Ｍｅ２）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
Ｎ２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ５，Ｎ５−ジメチル−Ｌ−グルタミン（化合物ａａ９４、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｍｅ２）−ＯＨ）（２２．５ｇ、５６．７６ｍｍｏｌ）およびピペリジン（４５ｍＬ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１８０ｍＬ）に溶解し、室温で１６時間攪拌した。反応液にジエチルエ−テルを加えて３０分撹拌後、析出物をろ取し、Ｎ５，Ｎ５−ジメチル−Ｌ−グルタミン（化合物ｐｃ１１８、Ｈ−Ｇｌｎ（Ｍｅ２）−ＯＨ）（５．９２ｇ、６０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ １７５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３５分（分析条件ＳＭＤｍｅｔｈｏｄ３３）
Ｎ５，Ｎ５−ジメチル−Ｎ２−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−グルタミン（化合物ｐｃ１１９、Ｐｅｎ−Ｇｌｎ（Ｍｅ２）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
Ｎ５，Ｎ５−ジメチル−Ｌ−グルタミン（化合物ｐｃ１１８、Ｈ−Ｇｌｎ（Ｍｅ２）−ＯＨ）（５．９２ｇ、３４．０ｍｍｏｌ）を水（８０ｍＬ）と１、４−ジオキサン（８０ｍＬ）の混合液に溶解し、炭酸水素ナトリウム（０．８９ｇ、１０．６ｍｍｏｌ）とペンタ−４−エン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（１．２５ｇ、６．３４ｍｍｏｌ）を加え、室温で１６時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで３回洗浄し、水層を塩酸水溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）でｐＨを２に調整した。ジクロロメタンで３回抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒留去した。得られた粗生成物を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル/酢酸エチル）で精製し、Ｎ５，Ｎ５−ジメチル−Ｎ２−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−グルタミン（化合物ｐｃ１１９、Ｐｅｎ−Ｇｌｎ（Ｍｅ２）−ＯＨ）（３．１４ｇ、３６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ２５７ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．０３分（分析条件ＳＭＤｍｅｔｈｏｄ３３）
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イルＮ５，Ｎ５−ジメチル−Ｎ２−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−グルタミナート（化合物ｐｃ１２０、Ｐｅｎ−Ｇｌｎ（Ｍｅ２）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下Ｎ５、Ｎ５−ジメチル−Ｎ２−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−グルタミン（化合物ｐｃ１１８、Ｐｅｎ−Ｇｌｎ（Ｍｅ２）−ＯＨ）（３．１４ｇ）および２−ブロモアセトニトリル（６．２３ｇ、５８．８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（ＤＣＭ）（８５ｍＬ）に溶解し、Ｎ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（３．３５ｇ、２５．９ｍｍｏｌ）を加えて室温で攪拌した。１６時間後、反応液を減圧下溶媒留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（石油エーテル/酢酸エチル）で精製し、シアノメチルＮ５，Ｎ５−ジメチル−Ｎ２−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−グルタミナート（Ｐｅｎｔ−Ｇｌｎ（Ｍｅ２）−ＯＣＨ２ＣＮ）（２．６３ｇ、７３％）を得た。
緩衝液Ａ（７５ｍＬ）に、上記シアノメチルＮ５，Ｎ５−ジメチル−Ｎ２−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−グルタミナート（Ｐｅｎｔ−Ｇｌｎ（Ｍｅ２）−ＯＣＨ２ＣＮ）（４９０ｍｇ、１．６６ｍｍｏｌ）およびリン酸二水素（（２Ｒ、３Ｒ、４Ｒ、５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ、３Ｓ、４Ｒ、５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３、４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（３００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）を加え、室温にて５時間撹拌した。反応液にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１．７ｍＬ）を加え、反応液を凍結乾燥し、得られた粗生成物を逆相カラムクロマトグラフィ−（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ１２０、Ｐｅｎ−Ｇｌｎ（Ｍｅ２）−ｐＣｐＡ）（３１ｍｇ、４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ８９１ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イルＮ２，Ｎ５，Ｎ５−トリメチル−Ｎ２−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−グルタミナート（化合物ｐｃ１２１、Ｐｅｎ−ＭｅＧｌｎ（Ｍｅ２）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
Ｎ２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ２，Ｎ５，Ｎ５−トリメチル−Ｌ−グルタミン（化合物ａａ９６、Ｆｍｏｃ−ＭｅＧｌｎ（Ｍｅ２）−ＯＨ）（１２．０ｇ、３１．３ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４８．０ｍＬ）溶液に、室温にてピペリジン（１８．０ｍＬ）を加え、撹拌した。１６時間後、反応液にジエチルエーテル（１００ｍＬ）とヘキサン（１００ｍＬ）を加え、３０分撹拌した。沈殿物をろ取し、Ｎ２，Ｎ５，Ｎ５−トリメチル−Ｌ−グルタミン（Ｈ−ＭｅＧｌｎ（Ｍｅ２）−ＯＨ）（１．６３ｇ、３２％）を得た。
上記Ｎ２，Ｎ５，Ｎ５−トリメチル−Ｌ−グルタミン（Ｈ−ＭｅＧｌｎ（Ｍｅ２）−ＯＨ）（１．６３ｇ、８．６６ｍｍｏｌ）を水（６８ｍＬ）と１、４−ジオキサン（６８ｍＬ）の混合溶液に溶解し、炭酸水素ナトリウム（１．５１ｇ、１８．０ｍｍｏｌ）とペンタ−４−エン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（２．０５ｇ、１０．４ｍｍｏｌ）を加え、２５度で１６時間攪拌した。反応液をジエチルエーテルで３回洗浄し、水層を塩酸水溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）でｐＨ＝４に調整した。ジクロロメタン（１００ｍＬ）で２回抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下溶媒留去した。得られた粗生成物を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）で精製し、Ｎ２，Ｎ５，Ｎ５−トリメチル−Ｎ２−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−グルタミン（Ｐｅｎｔ−ＭｅＧｌｎ（Ｍｅ２）−ＯＨ）（４００ｍｇ、１７％）を得た。
上記に従って追加合成を行った後、次の反応を行った。
得られたＮ２，Ｎ５，Ｎ５−トリメチル−Ｎ２−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−グルタミン（Ｐｅｎｔ−ＭｅＧｌｎ（Ｍｅ２）−ＯＨ）（０．７６ｇ、２．８１ｍｍｏｌ）、２−ブロモアセトニトリル（１．３４ｇ、１１．２ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（７２７ｍｇ、５．６３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（ＤＣＭ）（２０ｍＬ）に溶解し、２５度で攪拌した。１６時間後、反応液を減圧下溶媒留去した。残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）で精製し、シアノメチルＮ２，Ｎ５，Ｎ５−トリメチル−Ｎ２−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−グルタミナート（Ｐｅｎ−ＭｅＧｌｎ（Ｍｅ２）−ＯＣＨ２ＣＮ）（５２０ｍｇ、６０％）を得た。
緩衝液Ａ（７５ｍＬ）に、上記シアノメチルＮ２，Ｎ５，Ｎ５−トリメチル−Ｎ２−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−グルタミナート（Ｐｅｎ−ＭｅＧｌｎ（Ｍｅ２）−ＯＣＨ２ＣＮ）（４３３ｍｇ、１．４０ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（２ｍＬ）およびリン酸二水素（（２Ｒ、３Ｒ、４Ｒ、５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ、３Ｓ、４Ｒ、５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３、４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（２５０ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１時間撹拌した。反応液にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１．７０ｍＬ）を加え、反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィ−（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ１２１、Ｐｅｎ−ＭｅＧｌｎ（Ｍｅ２）−ｐＣｐＡ）（５５ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ９０５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｏ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１２２、Ｈ−Ｓｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０４、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ）（１０．０ｇ、２２．７ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１２８ｍＬ）溶液に、ピペリジン（３２．０ｍＬ）を加え、室温にて３時間攪拌した。反応液にジエチルエーテル（５００ｍｌ）を加え、析出した固体を回収し、Ｏ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１２２、Ｈ−Ｓｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ）（３．１０ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
Ｏ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１２３、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｏ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１２２、Ｈ−Ｓｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ）（０．１２ｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（２．５０ｍＬ）／水（２．５０ｍＬ）に溶解させた後に、文献記載（Organic Letters, 2011, 13, 4906）の方法で合成したペンタ−４−エン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（０．２２ｇ、１．１０ｍｍｏｌ）と、炭酸水素ナトリウム（０．０９ｇ、１．１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で１６時間撹拌した。反応が完結した後、ジエチルエーテルで２回洗浄し、水層に１Ｍ塩酸水溶液をｐＨ２になるまで加え、ジクロロメタンで２回抽出した、得られた有機層を混合し、飽和食塩水で有機層を洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製し、Ｏ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１２３、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ）（０．１０ｇ、６１％）を得た。
シアノメチルＯ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１２４、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｏ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１２３、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ）（３．１０ｇ、１０．３ｍｍｏｌ）、ブロモアセトニトリル（４．９７ｇ、４１．８ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（２．６７ｇ、２０．６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（６０．０ｍＬ）に溶解し、２５度で１６時間攪拌した。反応液を減圧下濃縮し得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製し、シアノメチルＯ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１２４、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１．８０ｇ、５１％）を得た。
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノー２−オキソピリミジンー１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシー２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフランー３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノー９Ｈ−プリンー９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフランー３−イル Ｏ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（ペンター４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１２５、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（１２５ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（５００ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）およびシアノメチルＯ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１２４、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（９３９ｍｇ、２．７７ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応液にトリフルオロ酢酸（２．８０ｍＬ）加えたのち、凍結乾燥を行い得られた残渣を、逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ１２５、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ｐＣｐＡ）（４８．０ｍｇ、７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ９３５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４０分（分析条件ＦＡ０５）
Ｏ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１２６、Ｈ−ＭｅＳｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０５、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ）（１３．６ｇ、２９．９ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１５０ｍＬ）溶液に、ピペリジン（４４．０ｍＬ）を加え、室温にて３時間攪拌した。反応液にヘキサン（５００ｍＬ）／ジエチルエーテル（５００ｍＬ）を加え室温で３０分間撹拌し、析出した固体を回収し、Ｏ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１２６、Ｈ−ＭｅＳｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ）（４．１０ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
Ｏ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１２７、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｏ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１２６、Ｈ−ＭｅＳｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ）（４．５０ｇ、１９．４ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（９０．０ｍＬ）／水（９０．０ｍＬ）に溶解させた後に、文献記載（Organic Letters, 2011, 13, 4906）の方法で合成したペンタ−４−エン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（９．５０ｇ、４８．２ｍｍｏｌ）と、炭酸水素ナトリウム（３．３０ｇ、３９．３ｍｍｏｌ）を加え、２５度で１６時間撹拌した。反応が完結した後、ジエチルエーテルで３回洗浄したのち、１Ｍ塩酸水溶液をｐＨ２になるまで加え、ジクロロメタンで２回抽出した、得られた有機層を混合し、飽和食塩水で有機層を洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去し、得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ジエチルエーテル／酢酸エチル）で精製し、Ｏ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１２７、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ）（２．５０ｇ、４１％）を得た。
シアノメチルＯ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１２８、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｏ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１２７、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ）（２．３０ｇ、７．３２ｍｍｏｌ）、ブロモアセトニトリル（３．５２ｇ、２９．４ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（１．８９ｇ、１４．６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０．０ｍＬ）に溶解し、２５度で１６時間攪拌した。反応液を濃縮し、残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ジエチルエーテル／酢酸エチル）で精製し、シアノメチルＯ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１２８、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１．１０ｇ、４３％）を得た。
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノー２−オキソピリミジンー１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシー２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフランー３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（４−アミノー７Ｈ−ピロロ「２，３−ｄ」ピリミジンー７−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフランー３−イルＯ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−メチルーＮ−（ペンター４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１２９、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（７５．０ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（３００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）および、シアノメチルＯ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１２８、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（５８６ｍｇ、１．６６ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応液にトリフルオロ酢酸（１．７ｍＬ）を加えたのち、反応液を凍結乾燥した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ１２９、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ｐＣｐＡ）（５１．０ｍｇ、６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ９４９ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４３分（分析条件ＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−４−フェニルブタン酸（化合物ｐｃ１３０、Ｐｅｎ−Ｈｐｈ−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
市販の（Ｓ）−２−アミノ−４−フェニルブタン酸（Ｈ−Ｈｐｈ−ＯＨ、ＣＡＳ番号９４３−７３−７）（１．００ｇ、５．５８ｍｍｏｌ）、炭酸水素ナトリウム（０．９４ｇ、１１．２ｍｍｏｌ）、ペンタ−４−エン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（１．３２ｇ、６．６９ｍｍｏｌ）を、水（２０ｍＬ）と１、４−ジオキサン（２０ｍＬ）の混合溶液に溶解し、室温で１６時間攪拌した。反応液を酢酸エチル（２０ｍＬ）で２回洗浄し、水層を塩酸水溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）でｐＨを２に調整した。ジクロロメタン（６０ｍＬ）で３回抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下溶媒留去した。残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン/メタノール）で精製し（Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−４−フェニルブタン酸（化合物ｐｃ１３０、Ｐｅｎ−Ｈｐｈ−ＯＨ）（１．１ｇ、７５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ２６２ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．５６分（分析条件ＥＬＳＤ１）
（Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−４−フェニルブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１３１、Ｐｅｎ−Ｈｐｈ−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下（Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−４−フェニルブタン酸（化合物ｐｃ１３０、Ｐｅｎ−Ｈｐｈ−ＯＨ）（１．１ｇ、４．２１ｍｍｏｌ）、２−ブロモアセトニトリル（２．００ｇ、１６．７ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（１．１ｇ）をジクロロメタン（ＤＣＭ）（２０ｍＬ）に溶解し、２５度で撹拌した。１６時間後、反応液を減圧下溶媒留去し、（Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−４−フェニルブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１３１、Ｐｅｎ−Ｈｐｈ−ＯＣＨ２ＣＮ）（０．９５ｇ、７５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３０１ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．８６分（分析条件ＥＬＳＤ２）
（２Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−４−フェニルブタン酸（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ１３２、Ｐｅｎ−Ｈｐｈ−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（７５ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ、３Ｒ、４Ｒ、５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ、３Ｓ、４Ｒ、５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３、４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（３００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）の水溶液（３ｍＬ）および（Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−４−フェニルブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１３１、Ｐｅｎ−Ｈｐｈ−ＯＣＨ２ＣＮ）（５０４ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（２．２５ｍＬ）を加え、室温にて１時間撹拌した。反応液を凍結乾燥し、８０％酢酸水溶液（１０ｍＬ）を加えて３時間撹拌した。混合物を逆相カラムクロマトグラフィ−（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ１３２、Ｐｅｎ−Ｈｐｈ−ｐＣｐＡ）（３７ｍｇ、１０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ８９４ （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．４７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
化合物ｐｃ１３５（Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ−ｐＣｐＡ）の合成は、以下のスキームに従って行った。
Figure 2018225864
（Ｓ）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）−４−フェニルブタン酸（化合物ｐｃ１３３、Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
フィルター付きの反応容器に、２−クロロトリチルクロライドレジン（１．６０ｍｍｏｌ／ｇ、１００−２００ｍｅｓｈ、１％ＤＶＢ、渡辺化学から購入、１．６８ｇ、２．６９ｍｍｏｌ）と脱水ジクロロメタン（ＤＣＭ）（１５ｍＬ）を入れ、室温にて１０分間振とうした。ジクロロメタン（ＤＣＭ）を除いた後、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−フェニルブタン酸（化合物ａａ１１、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｐｈ−ＯＨ）（１．１２ｇ、２．６８ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１．４０ｍＬ、８．０５ｍｍｏｌ）の脱水ジクロロメタン（ＤＣＭ）（２５ｍＬ）溶液を反応容器に添加し、３０分振とうした。反応液に脱水メタノール（２．１７ｍＬ、５３．７ｍｍｏｌ）を加え、１時間振とうした。反応液を除いた後、レジンをジクロロメタン（ＤＣＭ）に懸濁し、溶液を除く操作を４回繰り返した。更にレジンをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に懸濁し、溶液を除く操作を４回繰り返した。得られたレジンはそのまま次の反応に用いた。
上記のレジンに、２％（ｖ／ｖ）の１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ）を含むＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１５．０ｍＬ）を加え、室温にて１５分間振とうした。反応液を除いた後、レジンをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２０．０ｍＬ）に懸濁し、溶液を除く操作を５回繰り返した。得られたレジンはそのまま次の反応に用いた。
上記のレジンに、ペンタ−４−エン酸（１．０９ｍＬ、１０．７ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）（１．０９ｇ、８．０４ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ´−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（２．０９ｍＬ、１３．４ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１５ｍＬ）溶液を加え、室温にて２０時間振とうした。
反応液を除いた後、レジンをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に懸濁し、反応液を除く操作を４回繰り返した。更にレジンをジクロロメタン（ＤＣＭ）に懸濁し、反応液を除く操作を４回繰り返した。得られたレジンはそのまま次の反応に用いた。
上記のレジンを２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）／ジクロロメタン（ＤＣＭ）（１／１、５０ｍＬ）に懸濁し、室温にて３時間振とうした。ろ液を減圧下溶媒留去し、得られた粗生成物を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）−４−フェニルブタン酸（化合物ｐｃ１３３、Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ−ＯＨ）（２９５ｍｇ、４０％、４工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ２７６ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）−４−フェニルブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１３４、Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）−４−フェニルブタン酸（化合物ｐｃ１３３、Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ−ＯＨ）（２９５ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ）および２−ブロモアセトニトリル（２５７ｍｇ、２．１５ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２．６８ｍＬ）に溶解し、Ｎ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（４１６ｍｇ、３．２２ｍｍｏｌ）を加えて室温で攪拌した。１０分後、２−ブロモアセトニトリル（３８．６ｍｇ、０．３２２ｍｍｏｌ）を加えて１０分間攪拌した。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、ｔ−ブチルメチルエーテル（ＭＴＢＥ）で抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ液を減圧下溶媒留去し、（Ｓ）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）−４−フェニルブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１３４、Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ−ＯＣＨ２ＣＮ）（４４０ｍｇ）を粗生成物として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３１５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）−４−フェニルブタン酸（２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ１３５、Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（２７．６ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（１００ｍｇ、０．１３８ｍｍｏｌ）の水溶液（１．５０ｍＬ）および（Ｓ）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）−４−フェニルブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１３４、Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ−ＯＣＨ２ＣＮ）（１７４ｍｇ、０．５５４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（０．７７０ｍＬ）溶液を加え、３７度から４０度の間で１時間撹拌した。反応液に酢酸（３０．０ｍＬ）を加え、室温で１１０分撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた粗生成物を逆相カラムクロマトグラフィー（０．０１％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０１％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ１３５、Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ−ｐＣｐＡ）（４８．６ｍｇ、３９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ９１１ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
化合物ｐｃ１３８（Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ｐＣｐＡ）の合成は、以下のスキームに従って行った。
Figure 2018225864
Ｏ−（２−クロロフェニル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１３６、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
Ｏ−（２−クロロフェニル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ６３、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ＯＨ）（１２４ｍｇ、０．５７５ｍｍｏｌ）と炭酸ナトリウム（７６ｍｇ、０．７１９ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン／水（１．５ｍＬ／１．５ｍＬ）に溶解し、塩化ペンタ−４−エノイル（７６ｍｇ、０．７１９ｍｍｏｌ）を加えて室温で１０分撹拌した。その後、さらに塩化ペンタ−４−エノイル（７．５ｍｇ、０．０６３３ｍｍｏｌ）および炭酸ナトリウム（７．６ｍｇ、０．０７１９ｍｍｏｌ）を加えて、室温で撹拌した。その後、反応液に５Ｎ塩酸水溶液（０．３２２ｍＬ、１．６ｍｍｏｌ）を加え、酢酸エチルで抽出した。減圧濃縮により酢酸エチルを除去することで、Ｏ−（２−クロロフェニル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１３６、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ＯＨ）（１４８ｍｇ、８６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ２９８ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
シアノメチルＯ−（２−クロロフェニル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１３７、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
Ｏ−（２−クロロフェニル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１３６、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ＯＨ）（１４８ｍｇ、０．４９７ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（５ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１７４μＬ、０．９９４ｍｍｏｌ）および２−ブロモアセトニトリル（１３２μＬ、１．９８８ｍｍｏｌ）を加えて室温で撹拌した。その後、反応液に水を添加し、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、減圧濃縮した。得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製することで、シアノメチルＯ−（２−クロロフェニル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１３７、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１００．１ｍｇ、６０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３３７ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イルＯ−（２−クロロフェニル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１３８、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（４０．５ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）の水溶液（１．０ｍＬ）を緩衝液Ａ（６．２３ｍＬ）に添加し、シアノメチルＯ−（２−クロロフェニル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１３７、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（７５．６ｍｇ、０．２２４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．３ｍＬ）を加えて室温で３５分撹拌した。その後、反応液に酢酸（０．２５７ｍＬ、４．４９ｍｍｏｌ）を加え、逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）で精製した。フラクションを凍結乾燥後に得られた固体を水／酢酸（２．４ｍＬ／０．６ｍＬ）に溶解し、室温で２時間撹拌した。その後、反応液を水で希釈し、逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）で精製し、表題化合物（化合物ｐｃ１３８、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ｐＣｐＡ）（１８．７ｍｇ、３６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ９３２ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
シアノメチルＯ−（２−クロロフェニル）−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１３９、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−クロロフェニル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ６５、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ＯＨ）（１５ｇ、３３．２ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（８０ｍＬ）溶液に、室温にてピペリジン（３４ｍＬ）を加え、撹拌した。１６時間後、ジエチルエーテル（５００ｍＬ）、ヘキサン（１０００ｍＬ）を加え、沈殿物をろ取し、Ｏ−（２−クロロフェニル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（Ｈ−ＭｅＳｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ＯＨ）（６．５ｇ、８５％）を粗生成物として得た。
上述のＯ−（２−クロロフェニル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（Ｈ−ＭｅＳｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ＯＨ）を水（９０ｍＬ）と１、４−ジオキサン（９０ｍＬ）の混合液に溶解し、炭酸水素ナトリウム（４．９７ｇ、５９．２ｍｍｏｌ）とペンタ−４−エン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（１１．６ｇ、５８．８ｍｍｏｌ）を加え、室温で１６時間攪拌した。反応液をジエチルエーテルで２回洗浄し、水層を塩酸水溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）でｐＨ＝２に調整した。ジクロロメタンで２回抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒留去した。残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）で精製し、Ｏ−（２−クロロフェニル）−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ＯＨ）（７．４ｇ、７７％）を得た。
上記化合物Ｏ−（２−クロロフェニル）−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ＯＨ）（１．００ｇ）のジクロロメタン（ＤＣＭ）（３０ｍＬ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．８３０ｇ、６．４２ｍｍｏｌ）および２−ブロモアセトニトリル（１．５４ｇ、１２．８ｍｍｏｌ）を加え、２５度で攪拌した。３６時間後、反応液を減圧下溶媒留去した。残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）で精製し、シアノメチルＯ−（２−クロロフェニル）−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１３９、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（５００ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３５１ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．１１分（分析条件ＳＭＤｍｅｔｈｏｄ９）
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イルＯ−（２−クロロフェニル）−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１４０、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（２０ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ、３Ｒ、４Ｒ、５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ、３Ｓ、４Ｒ、５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３、４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（４０．０ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）の水溶液（２．０ｍＬ）およびシアノメチルＯ−（２−クロロフェニル）−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１３９、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（３８．８ｍｇ、０．１１１ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（１．００ｍＬ）を加え、室温にて１時間撹拌した。反応液を氷冷し、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１ｍＬ）を加えて９０分撹拌した。反応液を水で希釈し、逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）で精製し、表題化合物（化合物ｐｃ１４０、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）−ｐＣｐＡ）（４．２０ｍｇ、８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ９４４ （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．５２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｏ−（３−クロロフェニル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１４１、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
室温にて、（Ｓ）−２−アミノ−３−（３−クロロフェノキシ）プロパン酸（化合物ａａ２１、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）−ＯＨ）（２００ｍｇ、０．９２７ｍｍｏｌ）および炭酸ナトリウム（１２３ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（２．５ｍＬ）と水（２．５ｍＬ）の混合溶液に、塩化４−ペンテノイル（ＣＡＳ番号３９７１６−５８−０）（１２１ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）、を加え、１時間撹拌した。その後、炭酸ナトリウム（５９ｍｇ）、塩化４−ペンテノイル（０．０５１４ｍＬ）を加え、１時間撹拌した。５ｍｏｌ／Ｌ塩酸水溶液（１ｍＬ）を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を減圧下溶媒留去し、Ｏ−（３−クロロフェニル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１４１、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）−ＯＨ）（２５０ｍｇ）を粗生成物として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ２９８ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
シアノメチルＯ−（３−クロロフェニル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１４２、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
室温にてＯ−（３−クロロフェニル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１４１、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）−ＯＨ）（２２１ｍｇ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（７．４ｍＬ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．２５９ｍＬ、１．４９ｍｍｏｌ）、ブロモアセトニトリル（０．１９８ｍＬ、２．９７ｍｍｏｌ）を加え、３０分攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒留去した。得られた粗生成物を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製し、シアノメチルＯ−（３−クロロフェニル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１４２、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（２５７ｍｇ）を定量的に得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３３７ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イルＯ−（３−クロロフェニル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１４３、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（３０ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ、３Ｒ、４Ｒ、５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ、３Ｓ、４Ｒ、５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３、４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（５３．６ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）の水溶液（１．５ｍＬ）およびシアノメチルＯ−（３−クロロフェニル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１４２、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１００ｍｇ、０．２９７ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．７５ｍＬ）を加え、室温にて４０分撹拌した。反応液に酢酸（０．３４ｍＬ、５．９４ｍｍｏｌ）を加え、逆相カラムクロマトグラフィーで精製し、（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（（ホスホノオキシ）メチル）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イルＯ−（３−クロロフェニル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）−ｐＣｐＡ（ＴＨＦ））を得た。
得られた（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（（ホスホノオキシ）メチル）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イルＯ−（３−クロロフェニル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）−ｐＣｐＡ（ＴＨＦ））に、酢酸（４ｍＬ）と水（１ｍＬ）の混合溶液を加え、室温にて１４０分撹拌した。逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）で精製し、表題化合物（化合物ｐｃ１４３、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）−ｐＣｐＡ）（１５．６ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ９３２ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８８分（分析条件ＳＭＤｍｅｔｈｏｄ２５）
（Ｓ）−４−（２−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（化合物ｐｃ１４４、Ｐｅｎ−Ｈｐｈ（２−Ｃｌ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
市販の（Ｓ）−２−アミノ−４−（２−クロロフェニル）ブタン酸（Ｈ−Ｈｐｈ（２−Ｃｌ）−ＯＨ）（２００ｍｇ、０．９３６ｍｍｏｌ）を水（６５０μＬ）に溶解させた後、室温にて炭酸ナトリウム（２２８ｍｇ、２．１５３ｍｍｏｌ）を加え、透明な溶液になるまで撹拌した。反応液に室温にてテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（６５０μＬ）、塩化ペンタ−４−エノイル（２０７μＬ、１．８７２ｍｍｏｌ）を加え、７．５時間撹拌した後、塩化ペンタ−４−エノイル（２０７μＬ、１．８７２ｍｍｏｌ）と炭酸ナトリウム（２２８ｍｇ、２．１５３ｍｍｏｌ）を加え、終夜撹拌した。原料の消失をＬＣ−ＭＳで確認した後、反応液を水で希釈し、ギ酸（３５９μＬ）を加え、ロータリーエバポレーターにより減圧下、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を除去した。得られた混合物にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加え、逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−４−（２−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（化合物ｐｃ１４４、Ｐｅｎ−Ｈｐｈ（２−Ｃｌ）−ＯＨ）（２２３ｍｇ、８１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ２９６ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−４−（２−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１４５、Ｐｅｎ−Ｈｐｈ（２−Ｃｌ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−４−（２−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（化合物ｐｃ１４４、Ｐｅｎ−Ｈｐｈ（２−Ｃｌ）−ＯＨ）（２２３ｍｇ、０．７５４ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１．５ｍＬ）に溶解し、Ｎ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（３９５μＬ、２．２６２ｍｍｏｌ）、２−ブロモアセトニトリル（５４５ｍｇ、４．５２ｍｍｏｌ）を加えて室温で４時間撹拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）にて精製し、（Ｓ）−４−（２−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１４５、Ｐｅｎ−Ｈｐｈ（２−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（２４５ｍｇ、９７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３３５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ）−４−（２−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ１４６、Ｐｅｎ−Ｈｐｈ（２−Ｃｌ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（１８ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（４０ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）の水溶液（１．８ｍＬ）、（Ｓ）−４−（２−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１４５、Ｐｅｎ−Ｈｐｈ（２−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（３７．１ｍｇ、０．１１１ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．９ｍＬ）を加え、室温で３０分間撹拌した。反応液に０度にてトリフルオロ酢酸（９００μＬ）を加え、３０分間撹拌した後、反応液を水で希釈し、逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ１４６、Ｐｅｎ−Ｈｐｈ（２−Ｃｌ）−ｐＣｐＡ）（１７ｍｇ、２工程３３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ９３１ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
化合物ｐｃ１５０（Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ（２−Ｃｌ）−ｐＣｐＡ）の合成は、以下のスキームに従って行った。
Figure 2018225864
（２Ｓ）−４−（２−クロロフェニル）−２−（メチルアミノ）ブタン酸（化合物ｐｃ１４７、Ｈ−ＭｅＨｐｈ（２−Ｃｌ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（２−クロロフェニル）ブタン酸（化合物ａａ７５、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｐｈ（２−Ｃｌ）−ＯＨ）（２７４．３ｍｇ、０．６１０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１．７４ｍＬ）に溶解し、４−（３−フェニルプロピル）ピペリジン（２５８μＬ、１．２１９ｍｍｏｌ）を加えて室温で５時間撹拌した。その後、反応液に水を加え、ジクロロメタンを減圧濃縮により除去した。得られた水層を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）で精製し、（２Ｓ）−４−（２−クロロフェニル）−２−（メチルアミノ）ブタン酸（化合物ｐｃ１４７、Ｈ−ＭｅＨｐｈ（２−Ｃｌ）−ＯＨ）（１５２．６ｍｇ）を定量的に得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ２２８ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ）−４−（２−クロロフェニル）−２−［メチル（ペンタ−４−エノイル）アミノ］ブタン酸（化合物ｐｃ１４８、Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ（２−Ｃｌ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（２Ｓ）−４−（２−クロロフェニル）−２−（メチルアミノ）ブタン酸（化合物ｐｃ１４７、Ｈ−ＭｅＨｐｈ（２−Ｃｌ）−ＯＨ）（１５２．６ｍｇ、０．６７０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン／水（０．９６ｍＬ／０．９６ｍＬ）に溶解し、炭酸ナトリウム（２３４ｍｇ、２．２１２ｍｍｏｌ）を添加した。その後、塩化ペンタ−４−エノイル（１４９μＬ、１．３４０ｍｍｏｌ）を加えて室温で３０分撹拌した。その後、さらに塩化ペンタ−４−エノイル（１４９μＬ、１．３４０ｍｍｏｌ）と炭酸ナトリウム（２３４ｍｇ、２．２１２ｍｍｏｌ）を加えて、室温で９０分撹拌した。ギ酸（２５７μＬ、６．７０ｍｍｏｌ）を加えて反応を停止し、テトラヒドロフランを減圧濃縮により除去して得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）で精製し、（２Ｓ）−４−（２−クロロフェニル）−２−［メチル（ペンタ−４−エノイル）アミノ］ブタン酸（化合物ｐｃ１４８、Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ（２−Ｃｌ）−ＯＨ）（６４．３ｍｇ、３１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３１０ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ）−４−（２−クロロフェニル）−２−［メチル（ペンタ−４−エノイル）アミノ］ブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１４９、Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ（２−Ｃｌ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
（２Ｓ）−４−（２−クロロフェニル）−２−［メチル（ペンタ−４−エノイル）アミノ］ブタン酸（化合物ｐｃ１４８、Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ（２−Ｃｌ）−ＯＨ）（６１．８ｍｇ、０．１９９ｍｍｏｌ）と２−ブロモアセトニトリル（２７．８μＬ、０．３３９ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（６６５μＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１０５μＬ、０．５９８ｍｍｏｌ）を加えて、室温で撹拌した。その後、反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、ｔ−ブチルメチルエーテル（ＭＴＢＥ）で抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、減圧濃縮することで（２Ｓ）−４−（２−クロロフェニル）−２−［メチル（ペンタ−４−エノイル）アミノ］ブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１４９、Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ（２−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（６６．３ｍｇ、９５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３４９ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ）−４−（２−クロロフェニル）−２−［メチル（ペンタ−４−エノイル）アミノ］ブタン酸［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−［［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソ−ピリミジン−１−イル）−４−ヒドロキシ−２−（ホスホノオキシメチル）テトラヒドロフラン−３−イル］オキシ−ヒドロキシ−ホスホリル］オキシメチル］−５−（６−アミノプリン−９−イル）−４−ヒドロキシ−テトラヒドロフラン−３−イル］（化合物ｐｃ１５０、Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ（２−Ｃｌ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（６８．３ｍｇ、０．０９５ｍｍｏｌ）を水（２．９ｍＬ）に溶解し、緩衝液Ａ（２９ｍＬ）に加えた。この水溶液に（２Ｓ）−４−（２−クロロフェニル）−２−［メチル（ペンタ−４−エノイル）アミノ］ブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１４９、Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ（２−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（６６．３ｍｇ、０．１９０ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（１．４５ｍＬ）を加えて室温で９０分撹拌した。その後、反応液にトリフルオロ酢酸（１．４５ｍＬ、１８．８２ｍｍｏｌ）を０度で添加し、３０分撹拌した。その後、反応液を水で希釈し、逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）で精製することで表題化合物（化合物ｐｃ１５０、Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ（２−Ｃｌ）−ｐＣｐＡ）（４３．２ｍｇ、４８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ９４５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−４−（３−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（化合物ｐｃ１５１、Ｐｅｎ−Ｈｐｈ（３−Ｃｌ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
市販の（Ｓ）−２−アミノ−４−（３−クロロフェニル）ブタン酸（Ｈ−Ｈｐｈ（３−Ｃｌ）−ＯＨ）（２００ｍｇ、０．９３６ｍｍｏｌ）を水（６５０μＬ）に溶解させた後、室温にて炭酸ナトリウム（２２８ｍｇ、２．１５３ｍｍｏｌ）を加え、透明な溶液になるまで撹拌した。反応液に室温にてテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（６５０μＬ）、塩化ペンタ−４−エノイル（２０７μＬ、１．８７２ｍｍｏｌ）を加え、６時間撹拌した。原料の消失をＬＣ−ＭＳで確認した後、反応液にギ酸（３５９μＬ）を加え、ロータリーエバポレーターにより減圧下、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を除去した。得られた混合物にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加え、逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−４−（３−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（化合物ｐｃ１５１、Ｐｅｎ−Ｈｐｈ（３−Ｃｌ）−ＯＨ）（２１５ｍｇ、７８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ２９６ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−４−（３−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１５２、Ｐｅｎ−Ｈｐｈ（３−Ｃｌ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−４−（３−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（化合物ｐｃ１５１、Ｐｅｎ−Ｈｐｈ（３−Ｃｌ）−ＯＨ）（２１５ｍｇ、０．７２７ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１．５ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（３８１μＬ、２．１８１ｍｍｏｌ）、２−ブロモアセトニトリル（５４３ｍｇ、４．５２ｍｍｏｌ）を加えて室温で４時間撹拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）にて精製し、（Ｓ）−４−（３−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１５２、Ｐｅｎ−Ｈｐｈ（３−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（２３７ｍｇ、９７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３３５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ）−４−（３−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ１５３、Ｐｅｎ−Ｈｐｈ（３−Ｃｌ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（１８ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（４０ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）の水溶液（１．８ｍＬ）、（Ｓ）−４−（３−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１５２、Ｐｅｎ−Ｈｐｈ（３−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（３７．１ｍｇ、０．１１１ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．９ｍＬ）を加え、室温で３０分間撹拌した。反応液に０度にてトリフルオロ酢酸（９００μＬ）を加え、３０分間撹拌した後、反応液を水で希釈し、逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ１５３、Ｐｅｎ−Ｈｐｈ（３−Ｃｌ）−ｐＣｐＡ）（１１ｍｇ、２工程２１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ９３１ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
化合物ｐｃ１５７（Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ（３−Ｃｌ）−ｐＣｐＡ）の合成は、以下のスキームに従って行った。
Figure 2018225864
（２Ｓ）−４−（３−クロロフェニル）−２−（メチルアミノ）ブタン酸（化合物ｐｃ１５４、Ｈ−ＭｅＨｐｈ（３−Ｃｌ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（３−クロロフェニル）ブタン酸（化合物ａａ７８、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｐｈ（３−Ｃｌ）−ＯＨ）（２６１．７ｍｇ、０．５８２ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（１．６６ｍＬ）に溶解し、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ）（５２．６μＬ、０．３４９ｍｍｏｌ）を加えて室温で２時間撹拌した。その後、反応液に０．１％ギ酸水溶液を加え、逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）で精製し、（２Ｓ）−４−（３−クロロフェニル）−２−（メチルアミノ）ブタン酸（化合物ｐｃ１５４、Ｈ−ＭｅＨｐｈ（３−Ｃｌ）−ＯＨ）（５０．５ｍｇ、３８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ２２８ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ）−４−（３−クロロフェニル）−２−［メチル（ペンタ−４−エノイル）アミノ］ブタン酸（化合物ｐｃ１５５、Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ（３−Ｃｌ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（２Ｓ）−４−（３−クロロフェニル）−２−（メチルアミノ）ブタン酸（化合物ｐｃ１５４、Ｈ−ＭｅＨｐｈ（３−Ｃｌ）−ＯＨ）（５０．５ｍｇ、０．２２２ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン／水（０．３２ｍＬ／０．３２ｍＬ）に溶解し、炭酸ナトリウム（７８ｍｇ、０．７３２ｍｍｏｌ）を添加した。その後、塩化ペンタ−４−エノイル（４９．２μＬ、０．４４４ｍｍｏｌ）を加えて室温で撹拌した。その後、さらに塩化ペンタ−４−エノイル（４９．２μＬ、０．４４４ｍｍｏｌ）と炭酸ナトリウム（７８ｍｇ、０．７３２ｍｍｏｌ）を加えて、室温で９０分撹拌した。ギ酸（８５μＬ、２．２１８ｍｍｏｌ）を加えて反応を停止し、テトラヒドロフランを減圧濃縮により除去して得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）で精製し、（２Ｓ）−４−（３−クロロフェニル）−２−［メチル（ペンタ−４−エノイル）アミノ］ブタン酸（化合物ｐｃ１５５、Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ（３−Ｃｌ）−ＯＨ）（３９．０ｍｇ、５７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３１０ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ）−４−（３−クロロフェニル）−２−［メチル（ペンタ−４−エノイル）アミノ］ブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１５６、Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ（３−Ｃｌ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
（２Ｓ）−４−（３−クロロフェニル）−２−［メチル（ペンタ−４−エノイル）アミノ］ブタン酸（化合物ｐｃ１５５、Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ（３−Ｃｌ）−ＯＨ）（３７．５ｍｇ、０．１２１ｍｍｏｌ）と２−ブロモアセトニトリル（１６．９μＬ、０．２４２ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（４０３μＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（６３．４μＬ、０．３６３ｍｍｏｌ）を加えて、室温で撹拌した。その後、反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、ｔ−ブチルメチルエーテルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、減圧濃縮することで（２Ｓ）−４−（３−クロロフェニル）−２−［メチル（ペンタ−４−エノイル）アミノ］ブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１５６、Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ（３−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（３１．５ｍｇ、７５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３４９ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ）−４−（３−クロロフェニル）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ１５７、Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ（３−Ｃｌ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（３２．６ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）を水（１．４ｍＬ）に溶解し、緩衝液Ａ（１４ｍＬ）に加えた。この水溶液に（２Ｓ）−４−（３−クロロフェニル）−２−［メチル（ペンタ−４−エノイル）アミノ］ブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１５６、Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ（３−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（３１．５ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．７ｍＬ）を加えて室温で３０分撹拌した。その後、反応液にトリフルオロ酢酸（０．７ｍＬ、９．０９ｍｍｏｌ）を０度で添加し、３０分撹拌した。その後、反応液を水（１６ｍＬ）で希釈し、逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）で精製し、表題化合物（化合物ｐｃ１５７、Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ（３−Ｃｌ）−ｐＣｐＡ）（１８．５ｍｇ、４３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ９４５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−４−（４−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（化合物ｐｃ１５８、Ｐｅｎ−Ｈｐｈ（４−Ｃｌ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
市販の（Ｓ）−２−アミノ−４−（４−クロロフェニル）ブタン酸（Ｈ−Ｈｐｈ（４−Ｃｌ）−ＯＨ）（２００ｍｇ、０．９３６ｍｍｏｌ）を水（６５０μＬ）に溶解させた後、室温にて炭酸ナトリウム（２２８ｍｇ、２．１５３ｍｍｏｌ）を加え、室温にて透明な溶液になるまで撹拌した。反応液に室温にてテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（６５０μＬ）、塩化ペンタ−４−エノイル（２０７μＬ、１．８７２ｍｍｏｌ）を加え、室温にて６時間撹拌した。原料の消失をＬＣ−ＭＳで確認した後、反応液にギ酸（３５９μＬ）を加え、ロータリーエバポレーターにより減圧下、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を除去した。得られた混合物にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加え、逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−４−（４−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（化合物ｐｃ１５８、Ｐｅｎ−Ｈｐｈ（４−Ｃｌ）−ＯＨ）（１３０ｍｇ、４７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ２９６ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−４−（４−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１５９、Ｐｅｎ−Ｈｐｈ（４−Ｃｌ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−４−（４−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（化合物ｐｃ１５８、Ｐｅｎ−Ｈｐｈ（４−Ｃｌ）−ＯＨ）（１３０ｍｇ、０．４４０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１．０ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（２３０μＬ、１．３１９ｍｍｏｌ）、２−ブロモアセトニトリル（３１６ｍｇ、２．６４ｍｍｏｌ）を加えて室温で４時間撹拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）にて精製し、（Ｓ）−４−（４−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１５９、Ｐｅｎ−Ｈｐｈ（４−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１３９ｍｇ、９４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３３５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ）−４−（４−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ１６０、Ｐｅｎ−Ｈｐｈ（４−Ｃｌ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（１８ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（４０ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）の水溶液（１．８ｍＬ）、（Ｓ）−４−（４−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１５９、Ｐｅｎ−Ｈｐｈ（４−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（３７．１ｍｇ、０．１１１ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．９ｍＬ）を加え、室温で６時間撹拌した。反応液に０度にてトリフルオロ酢酸（９００μＬ）を加え、４０分撹拌した後、反応液を水で希釈し、逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ１６０、Ｐｅｎ−Ｈｐｈ（４−Ｃｌ）−ｐＣｐＡ）（１２ｍｇ、２工程２３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ９３１ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
化合物ｐｃ１６４（Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ（４−Ｃｌ）−ｐＣｐＡ）の合成は、以下のスキームに従って行った。
Figure 2018225864
（２Ｓ）−４−（４−クロロフェニル）−２−（メチルアミノ）ブタン酸（化合物ｐｃ１６１、Ｈ−ＭｅＨｐｈ（４−Ｃｌ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（４−クロロフェニル）ブタン酸（化合物ａａ８１、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｐｈ（４−Ｃｌ）−ＯＨ）（１８０．５ｍｇ、０．４０１ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（１．１５ｍＬ）に溶解し、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ）（３６．３μＬ、０．２４１ｍｍｏｌ）を加えて室温で２時間撹拌した。その後、反応液に０．１％ギ酸水溶液を加え、逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）で精製し、（２Ｓ）−４−（４−クロロフェニル）−２−（メチルアミノ）ブタン酸（化合物ｐｃ１６１、Ｈ−ＭｅＨｐｈ（４−Ｃｌ）−ＯＨ）（５６．５ｍｇ、６２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ２２８ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ）−４−（４−クロロフェニル）−２−［メチル（ペンタ−４−エノイル）アミノ］ブタン酸（化合物ｐｃ１６２、Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ（４−Ｃｌ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（２Ｓ）−４−（４−クロロフェニル）−２−（メチルアミノ）ブタン酸（化合物ｐｃ１６１、Ｈ−ＭｅＨｐｈ（４−Ｃｌ）−ＯＨ）（５６．５ｍｇ、０．２４８ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン／水（０．３５ｍＬ／０．３５ｍＬ）に溶解し、炭酸ナトリウム（８７ｍｇ、０．８１９ｍｍｏｌ）を添加した。その後、塩化ペンタ−４−エノイル（５５．０μＬ、０．４９６ｍｍｏｌ）を加えて室温で撹拌した。その後、さらに塩化ペンタ−４−エノイル（５５．０μＬ、０．４９６ｍｍｏｌ）と炭酸ナトリウム（８７ｍｇ、０．８１９ｍｍｏｌ）を加えて、室温で９０分撹拌した。ギ酸（９５μＬ、２．４８１ｍｍｏｌ）を加えて反応を停止し、テトラヒドロフランを減圧濃縮により除去して得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）で精製し、（２Ｓ）−４−（４−クロロフェニル）−２−［メチル（ペンタ−４−エノイル）アミノ］ブタン酸（化合物ｐｃ１６２、Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ（４−Ｃｌ）−ＯＨ）（５５．１ｍｇ、７２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３１０ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ）−４−（４−クロロフェニル）−２−［メチル（ペンタ−４−エノイル）アミノ］ブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１６３、Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ（４−Ｃｌ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
（２Ｓ）−４−（４−クロロフェニル）−２−［メチル（ペンタ−４−エノイル）アミノ］ブタン酸（化合物ｐｃ１６２、Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ（４−Ｃｌ）−ＯＨ）（５３．９ｍｇ、０．１７４ｍｍｏｌ）と２−ブロモアセトニトリル（２４．２７μＬ、０．３４８ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（５８０μＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（９１μＬ、０．５２２ｍｍｏｌ）を加えて、室温で撹拌した。その後、反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、ｔ−ブチルメチルエーテルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、減圧濃縮することで（２Ｓ）−４−（４−クロロフェニル）−２−［メチル（ペンタ−４−エノイル）アミノ］ブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１６３、Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ（４−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（５０．７ｍｇ，８４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３４９ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ）−４−（４−クロロフェニル）−２−［メチル（ペンタ−４−エノイル）アミノ］ブタン酸［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−［［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソ−ピリミジン−１−イル）−４−ヒドロキシ−２−（ホスホノオキシメチル）テトラヒドロフラン−３−イル］オキシ−ヒドロキシ−ホスホリル］オキシメチル］−５−（６−アミノプリン−９−イル）−４−ヒドロキシ−テトラヒドロフラン−３−イル］（化合物ｐｃ１６４、Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ（４−Ｃｌ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（５２．５ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）を水（２．２ｍＬ）に溶解し、緩衝液Ａ（２２ｍＬ）に加えた。この水溶液に（２Ｓ）−４−（４−クロロフェニル）−２−［メチル（ペンタ−４−エノイル）アミノ］ブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１６３、Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ（４−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（５０．７ｍｇ、０．１４５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（１．１ｍＬ）を加えて室温で３０分撹拌した。その後、反応液にトリフルオロ酢酸（１．１ｍＬ、１４．２８ｍｍｏｌ）を０度で添加し、３０分撹拌した。その後、反応液を水（２５ｍＬ）で希釈し、逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）で精製し、表題化合物（化合物ｐｃ１６４、Ｐｅｎ−ＭｅＨｐｈ（４−Ｃｌ）−ｐＣｐＡ）（３１．３ｍｇ、４６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ９４５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メトキシ）プロパン酸（化合物ｐｃ１６５、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、水素化ナトリウム（７３１ｍｇ、１８．２７ｍｍｏｌ、６０％オイルディスパージョン）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（１０ｍＬ）へ市販で購入した（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−ヒドロキシプロパン酸（Ｂｏｃ−Ｓｅｒ−ＯＨ）（１．１３６ｇ、５．５４ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）溶液を０度にて滴下し、１時間撹拌した。反応溶液に３−（ブロモメチル）−５−フルオロピリジン臭化水素酸塩（化合物ａａ１５）（１．５ｇ、５．５４ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）溶液を滴下し室温にて１６時間撹拌した。反応溶液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで２度抽出を行った。有機層を水、飽和食塩水で２度洗浄した後、得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、減圧濃縮した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メトキシ）プロパン酸（化合物ｐｃ１６５、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（３−Ｆ，５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ）（５００ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ３１３ （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．６３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−３−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メトキシ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）プロパン酸（化合物ｐｃ１６６、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
室温下、（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メトキシ）プロパン酸（化合物ｐｃ１６５、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ）（１９５ｍｇ、０．６２０ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液（２．２ｍＬ）に４Ｎ塩酸／１，４−ジオキサン溶液（４ｍＬ）を加え室温にて２時間撹拌した。反応液へ更に４Ｎ塩酸／１，４−ジオキサン溶液（２ｍＬ）を加え３０分間撹拌し、減圧濃縮を行った。得られた残渣と炭酸ナトリウム（２５５ｍｇ、２．４０ｍｏｌ）を水（５．０１ｍＬ）と１，４−ジオキサン（３．０ｍＬ）に溶解し、塩化ペンタ−４−エノイル（１４６μＬ、１．３２ｍｍｏｌ）を室温で加え４５分間撹拌した。更に塩化ペンタ−４−エノイル（４５μＬ、０．４１ｍｍｏｌ）を室温で加え４５分間撹拌した。反応液に１Ｎ塩酸水溶液（１．６０ｍＬ）を加え減圧濃縮を行い得られた残渣を水で希釈した後、逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−３−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メトキシ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）プロパン酸（化合物ｐｃ１６６、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（３−Ｆ，５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ）（９５．４ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ２９７ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５９分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）
３−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メトキシ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）プロパン酸（Ｓ）−シアノメチル（化合物ｐｃ１６７、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−３−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メトキシ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）プロパン酸（化合物ｐｃ１６６、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ）（８５ｍｇ、０．２８７ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（２．８７ｍＬ）に２−ブロモアセトニトリル（２０．０μＬ、０．０２８７ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（７５μＬ、０．４３ｍｍｏｌ）を室温にて加え、４時間撹拌した。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、水３回と飽和食塩水で洗浄した後、得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧濃縮し、粗生成物３−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メトキシ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）プロパン酸（Ｓ）−シアノメチル（化合物ｐｃ１６７、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（３−Ｆ，５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（６８．４ｍｇ、７１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ３３６ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７２分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）
３−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メトキシ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）プロパン酸（２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ１６８、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（１４ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（４８．８ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）の水溶液（０．９ｍＬ）に上述の粗生成物である３−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メトキシ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）プロパン酸（Ｓ）−シアノメチル（化合物ｐｃ１６７、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（３−Ｆ，５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（６８．０ｍｇ、０．２０３ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．５５ｍＬ）を加え、室温で９０分間撹拌した。反応液に酢酸（１４ｍＬ）を室温にて加え、９０分間撹拌した。反応液を水（８０ｍＬ）で希釈し、逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ１６８、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ｐＣｐＡ）（２０．９ｍｇ、２工程３３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ９３１ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ）−３−［（５−フルオロピリジン−３−イル）メトキシ］−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）プロパン酸（化合物ｐｃ１６９、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ６７、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ）（７．００ｇ、１５．５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（９５ｍＬ）溶液に、室温にてピペリジン（２４ｍＬ）を加え、撹拌した。１６時間後、ジエチルエーテル（１００ｍＬ）を加え、３０分撹拌した。沈殿物をろ取し、（２Ｓ）−３−［（５−フルオロピリジン−３−イル）メトキシ］−２−（メチルアミノ）プロパン酸（Ｈ−ＭｅＳｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ）（２．７５ｇ）を粗生成物として得た。
上記（２Ｓ）−３−［（５−フルオロピリジン−３−イル）メトキシ］−２−（メチルアミノ）プロパン酸（Ｈ−ＭｅＳｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ）を水（５０ｍＬ）と１、４−ジオキサン（５０ｍＬ）の混合液に溶解し、炭酸水素ナトリウム（２．０３ｇ、２４．２ｍｍｏｌ）およびペンタ−４−エン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（４．７５ｇ、２４．１ｍｍｏｌ）を加え、室温で１６時間攪拌した。反応液をジエチルエーテルで２回洗浄し、水層を塩酸水溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）でｐＨ＝２に調整した。ジクロロメタンで２回抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒留去した。得られた粗生成物を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）で精製し、（２Ｓ）−３−［（５−フルオロピリジン−３−イル）メトキシ］−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）プロパン酸（化合物ｐｃ１６９、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ）（１．６６ｇ、４４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３１１ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．１４分（分析条件ＳＭＤｍｅｔｈｏｄ３３）
（２Ｓ）−３−［（５−フルオロピリジン−３−イル）メトキシ］−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）プロパン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１７０、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
（２Ｓ）−３−［（５−フルオロピリジン−３−イル）メトキシ］−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）プロパン酸（化合物ｐｃ１６９、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ）（１．６５ｇ、５．３２ｍｍｏｌ）、２−ブロモアセトニトリル（２．５５ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１．３７ｇ、１０．６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（ＤＣＭ）（１００ｍＬ）に溶解し、２５度で攪拌した。１６時間後、反応液を減圧下溶媒留去した。残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）で精製し、（２Ｓ）−３−［（５−フルオロピリジン−３−イル）メトキシ］−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）プロパン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１７０、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１．００ｇ、５４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ３５０ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９０分（分析条件ＳＭＤｍｅｔｈｏｄ９）
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イルＯ−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１７１、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（７５ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ、３Ｒ、４Ｒ、５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ、３Ｓ、４Ｒ、５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３、４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（３００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）および（２Ｓ）−３−［（５−フルオロピリジン−３−イル）メトキシ］−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）プロパン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１７０、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（５８０ｍｇ、１．６６ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２時間撹拌した。
反応液にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１．６ｍＬ）を加え、反応液を凍結乾燥し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィ−（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ１７１、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ｐＣｐＡ）（６０ｍｇ、８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ９４５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−アミノ−５−フェニルペンタン酸（化合物ｐｃ１７２、Ｈ−Ｐｈｅ｛＃（ＣＨ２）２｝−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、市販の（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−フェニルペンタン酸（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ｛＃（ＣＨ２）２｝−ＯＨ、渡辺化学工業より購入）（５００ｍｇ、１．２０３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液（１．２ｍＬ）に４−（３−フェニルプロピル）ピペリジン（０．５１０ｍＬ、２．４０７ｍｍｏｌ）を室温にて加えた。反応液を室温にて２３時間撹拌した後、ジクロロメタン（ＤＣＭ）で希釈し、水で抽出した。得られた水層を濃縮、凍結乾燥し、得られた残渣にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）とギ酸を加えた後、逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて２回精製し、（Ｓ）−２−アミノ−５−フェニルペンタン酸（化合物ｐｃ１７２、Ｈ−Ｐｈｅ｛＃（ＣＨ２）２｝−ＯＨ）（８０ｍｇ、３４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ １９４ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−５−フェニルペンタン酸（化合物ｐｃ１７３、Ｐｅｎ−Ｐｈｅ｛＃（ＣＨ２）２｝−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−２−アミノ−５−フェニルペンタン酸（化合物ｐｃ１７２、Ｈ−Ｐｈｅ｛＃（ＣＨ２）２｝−ＯＨ）（８０ｍｇ、０．４１４ｍｍｏｌ）の水溶液（２．０ｍＬ）に炭酸ナトリウム（１０１ｍｇ、０．９５２ｍｍｏｌ）を室温にて加え、反応液が透明になるまで撹拌した。反応液に塩化ペンタ−４−エノイル（０．０９２ｍＬ、０．８２８ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（２．０ｍＬ）を滴下しながら室温にて加え、８時間撹拌した。塩化ペンタ−４−エノイル（０．０９２ｍＬ、０．８２８ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（１０１ｍｇ、０．９５２ｍｍｏｌ）を室温にて反応液にさらに加え、１５時間撹拌した。反応液にギ酸（０．１５９ｍＬ）を加え、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を減圧濃縮により除去した後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈した。得られた溶液を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−５−フェニルペンタン酸（化合物ｐｃ１７３、Ｐｅｎ−Ｐｈｅ｛＃（ＣＨ２）２｝−ＯＨ）（６７ｍｇ、５９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ２７６ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−５−フェニルペンタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１７４、Ｐｅｎ−Ｐｈｅ｛＃（ＣＨ２）２｝−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−５−フェニルペンタン酸（化合物ｐｃ１７３、Ｐｅｎ−Ｐｈｅ｛＃（ＣＨ２）２｝−ＯＨ）（６７ｍｇ、０．２４３ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．５ｍＬ）にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．１２７ｍＬ、０．７３０ｍｍｏｌ）、２−ブロモアセトニトリル（０．１０２ｍＬ、１．４６０ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３時間撹拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）にて精製し、（Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−５−フェニルペンタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１７４、Ｐｅｎ−Ｐｈｅ｛＃（ＣＨ２）２｝−ＯＣＨ２ＣＮ）（６７ｍｇ、８８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ３１５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−５−フェニルペンタン酸（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（（ホスホノオキシ）メチル）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（ｐｃ１７５、Ｐｅｎ−Ｐｈｅ｛＃（ＣＨ２）２｝−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（１２ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（１９．０ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）の水溶液（１．２ｍＬ）、（Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−５−フェニルペンタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１７４、Ｐｅｎ−Ｐｈｅ｛＃（ＣＨ２）２｝−ＯＣＨ２ＣＮ）（３３ｍｇ、０．１０５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．６ｍＬ）を加え、室温で４時間３０分撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣に８０％酢酸水溶液（３．０ｍＬ）を室温にて加え、５時間撹拌した。反応液を水で希釈し、逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ１７５、Ｐｅｎ−Ｐｈｅ｛＃（ＣＨ２）２｝−ｐＣｐＡ）（８．５ｍｇ、２工程３６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ９１０（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（メチルアミノ）−５−フェニルペンタン酸（化合物ｐｃ１７６、Ｈ−ＭｅＰｈｅ｛＃（ＣＨ２）２｝−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−５−フェニルペンタン酸（化合物ａａ８２、Ｆｍｏｃ−ＭｅＰｈｅ｛＃（ＣＨ２）２｝−ＯＨ）（４８８ｍｇ、１．１３６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液（２．２ｍＬ）に４−（３−フェニルプロピル）ピペリジン（０．４８１ｍＬ、２．２７２ｍｍｏｌ）を室温にて加え、２０時間撹拌した。反応液にジクロロメタン（ＤＣＭ）を加え、ろ過した後、得られた固体をジクロロメタン（ＤＣＭ）とヘキサンで洗浄し、（Ｓ）−２−（メチルアミノ）−５−フェニルペンタン酸（化合物ｐｃ１７６、Ｈ−ＭｅＰｈｅ｛＃（ＣＨ２）２｝−ＯＨ）（２１３ｍｇ、９０％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ２０８ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）−５−フェニルペンタン酸（化合物ｐｃ１７７、Ｐｅｎ−ＭｅＰｈｅ｛＃（ＣＨ２）２｝−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−２−（メチルアミノ）−５−フェニルペンタン酸（化合物ｐｃ１７６、Ｈ−ＭｅＰｈｅ｛＃（ＣＨ２）２｝−ＯＨ）（２１３ｍｇ、１．０２８ｍｍｏｌ）の水溶液（５．０ｍＬ）に炭酸ナトリウム（２５１ｍｇ、２．３６４ｍｍｏｌ）を室温にて加え、反応液が透明になるまで撹拌した。反応液に塩化ペンタ−４−エノイル（０．２２８ｍＬ、２．０５５ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（５．０ｍＬ）を滴下しながら室温にて加え、４時間２０分撹拌した。塩化ペンタ−４−エノイル（０．２２８ｍＬ、２．０５５ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（２５１ｍｇ、２．３６４ｍｍｏｌ）を室温にて反応液にさらに加え、４０分間撹拌した。反応液にギ酸（０．３９４ｍＬ）を加え、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を減圧濃縮により除去した後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈した。得られた溶液を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）−５−フェニルペンタン酸（化合物ｐｃ１７７、Ｐｅｎ−ＭｅＰｈｅ｛＃（ＣＨ２）２｝−ＯＨ）（２５０ｍｇ、８４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ２９０ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）−５−フェニルペンタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１７８、Ｐｅｎ−ＭｅＰｈｅ｛＃（ＣＨ２）２｝−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）−５−フェニルペンタン酸（化合物ｐｃ１７７、Ｐｅｎ−ＭｅＰｈｅ｛＃（ＣＨ２）２｝−ＯＨ）（２５０ｍｇ、０．８６４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（２．０ｍＬ）にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．４５３ｍＬ、２．５９ｍｍｏｌ）、２−ブロモアセトニトリル（０．３６１ｍＬ、５．１８ｍｍｏｌ）を加え、室温にて５時間撹拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）にて精製し、（Ｓ）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）−５−フェニルペンタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１７８、Ｐｅｎ−ＭｅＰｈｅ｛＃（ＣＨ２）２｝−ＯＣＨ２ＣＮ）（２５２ｍｇ、８９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ３２９ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）−５−フェニルペンタン酸（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ１７９、Ｐｅｎ−ＭｅＰｈｅ｛＃（ＣＨ２）２｝−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（２５ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（５０．０ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）の水溶液（２．５ｍＬ）、（Ｓ）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）−５−フェニルペンタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１７８、Ｐｅｎ−ＭｅＰｈｅ｛＃（ＣＨ２）２｝−ＯＣＨ２ＣＮ）（９１ｍｇ、０．２７７ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（１．５ｍＬ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣に８０％酢酸水溶液（８．０ｍＬ）を室温にて加え、７時間３０分撹拌した。反応液を水で希釈し、逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ１７９、Ｐｅｎ−ＭｅＰｈｅ｛＃（ＣＨ２）２｝−ｐＣｐＡ）（３０ｍｇ、２工程４７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ９２４ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｏ−ベンジル−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１８０、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｂｎ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、市販のＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−ベンジル−Ｌ−セリン（Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｎ）−ＯＨ、渡辺化学工業より購入）（４９０ｍｇ、１．１７４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液（２．４ｍＬ）に４−（３−フェニルプロピル）ピペリジン（０．４９７ｍＬ、２．３４８ｍｍｏｌ）を室温にて加え、１８時間撹拌した。反応液をジクロロメタン（ＤＣＭ）で希釈し、ろ過した後、得られた固体をジクロロメタン（ＤＣＭ）とヘキサンで洗浄し、Ｏ−ベンジル−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１８０、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｂｎ）−ＯＨ）（２１１ｍｇ、９２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ １９６ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｏ−ベンジル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１８１、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｂｎ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｏ−ベンジル−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１８０、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｂｎ）−ＯＨ）（２１１ｍｇ、１．０８１ｍｍｏｌ）の水溶液（５．０ｍＬ）に炭酸ナトリウム（２６３ｍｇ、２．４８６ｍｍｏｌ）を室温にて加え、反応液が透明になるまで撹拌した。反応液に塩化ペンタ−４−エノイル（０．２４０ｍＬ、２．１６２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（５．０ｍＬ）を滴下しながら室温にて加え、８時間撹拌した。塩化ペンタ−４−エノイル（０．２４０ｍＬ、２．１６２ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（２６３ｍｇ、２．４８６ｍｍｏｌ）を室温にて反応液にさらに加え、１５時間撹拌した。反応液にギ酸（０．４１５ｍＬ）を加え、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を減圧濃縮により除去した後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈した。得られた溶液を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、Ｏ−ベンジル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１８１、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｂｎ）−ＯＨ）（２３７ｍｇ、７９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ２７８ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
シアノメチルＯ−ベンジル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１８２、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｂｎ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｏ−ベンジル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１８１、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｂｎ）−ＯＨ）（２３７ｍｇ、０．８５５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（２．０ｍＬ）にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．４４８ｍＬ、２．５６ｍｍｏｌ）、２−ブロモアセトニトリル（０．３５７ｍＬ、５．１３ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３時間撹拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）にて精製し、シアノメチルＯ−ベンジル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１８２、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｂｎ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（２５２ｍｇ、９３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ３１７ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イルＯ−ベンジル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１８３、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｂｎ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（２２ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（４５．７ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ）の水溶液（２．２ｍＬ）、シアノメチルＯ−ベンジル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１８２、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｂｎ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（８０ｍｇ、０．２５３ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（１．１ｍＬ）を加え、室温で４時間３０分撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣に８０％酢酸水溶液（５．０ｍＬ）を室温にて加え、５時間撹拌した。反応液を水で希釈し、逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ１８３、Ｐｅｎ−Ｓｅｒ（Ｂｎ）−ｐＣｐＡ）（１９．５ｍｇ、２工程３４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ９１２ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６３分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ２４）
Ｏ−ベンジル−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１８４、Ｈ−ＭｅＳｅｒ（Ｂｎ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−ベンジル−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ８３、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｂｎ）−ＯＨ）（４２５ｍｇ、０．９８５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液（２．０ｍＬ）に４−（３−フェニルプロピル）ピペリジン（０．４１７ｍＬ、１．９７０ｍｍｏｌ）を室温にて加え、２０時間撹拌した。反応液にジクロロメタン（ＤＣＭ）を加え、ろ過した後、得られた固体をジクロロメタン（ＤＣＭ）とヘキサンで洗浄し、Ｏ−ベンジル−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１８４、Ｈ−ＭｅＳｅｒ（Ｂｎ）−ＯＨ）（１８３ｍｇ、８９％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ２１０ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｏ−ベンジル−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１８５、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｂｎ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｏ−ベンジル−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１８４、Ｈ−ＭｅＳｅｒ（Ｂｎ）−ＯＨ）（１８３ｍｇ、０．８７５ｍｍｏｌ）の水溶液（５．０ｍＬ）に炭酸ナトリウム（２１３ｍｇ、２．０１２ｍｍｏｌ）を室温にて加え、反応液が透明になるまで撹拌した。反応液に塩化ペンタ−４−エノイル（０．１９４ｍＬ、１．７４９ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（５．０ｍＬ）を滴下しながら室温にて加え、８時間３０分撹拌した。塩化ペンタ−４−エノイル（０．１９４ｍＬ、１．７４９ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（２１３ｍｇ、２．０１２ｍｍｏｌ）を室温にて反応液にさらに加え、１時間４０分間撹拌した。反応液にギ酸（０．３３５ｍＬ）を加え、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を減圧濃縮により除去した後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈した。得られた溶液を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、Ｏ−ベンジル−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１８５、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｂｎ）−ＯＨ）（２２９ｍｇ、９０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ２９２ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
シアノメチル Ｏ−ベンジル−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１８６、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｂｎ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｏ−ベンジル−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ１８５、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｂｎ）−ＯＨ）（２２９ｍｇ、０．７８６ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（２．０ｍＬ）にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．４１２ｍＬ、２．３５８ｍｍｏｌ）、２−ブロモアセトニトリル（０．３２９ｍＬ、４．７２ｍｍｏｌ）を加え、室温にて５時間撹拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）にて精製し、シアノメチル Ｏ−ベンジル−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１８６、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｂｎ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（２５２ｍｇ、９７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ３３１ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イルＯ−ベンジル−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１８７、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｂｎ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（２５ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（５０．０ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）の水溶液（２．５ｍＬ）、シアノメチルＯ−ベンジル−Ｎ−メチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ１８６、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｂｎ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（９１ｍｇ、０．２７７ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（１．５ｍＬ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣に８０％酢酸水溶液（８．０ｍＬ）を室温にて加え、７時間３０分撹拌した。反応液を水で希釈し、逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ１８７、Ｐｅｎ−ＭｅＳｅｒ（Ｂｎ）−ｐＣｐＡ）（２６．３ｍｇ、２工程４１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ９２６ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ，４Ｒ）−４−エトキシ−１−（ペンタ−４−エノイル）ピロリジン−２−カルボン酸（化合物ｐｃ１８８、Ｐｅｎ−Ｈｙｐ（Ｅｔ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
温度２０度にて、（２Ｓ，４Ｒ）−１−［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］−４−エトキシピロリジン−２−カルボン酸（Ｂｏｃ−Ｈｙｐ（Ｅｔ）−ＯＨ、ＣＡＳ番号１４６０６０−１８−６）（５ｇ、１９．２８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（ＤＣＭ）（５０ｍＬ）溶液に塩化水素ガスを吹き込みながら撹拌した。４時間後、反応液を減圧下溶媒留去し、（２Ｓ，４Ｒ）−４−エトキシピロリジン−２−カルボン酸塩酸塩（Ｈ−Ｈｙｐ（Ｅｔ）−ＯＨ・ＨＣｌ）（３．８ｇ）を粗生成物として得た。
上記の粗生成物である（２Ｓ，４Ｒ）−４−エトキシピロリジン−２−カルボン酸塩酸塩（Ｈ−Ｈｙｐ（Ｅｔ）−ＯＨ・ＨＣｌ）（２．１ｇ、１０．７ｍｍｏｌ）の水溶液（２０ｍＬ）に、炭酸水素ナトリウム（２．５０ｇ、２９．８ｍｍｏｌ）を加え、ペンタ−４−エン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（２．３０ｇ、１１．７ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン（２０ｍＬ）溶液を加えて２０度で３時間撹拌した。塩酸水溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）でｐＨを２に調整し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下溶媒留去し、（２Ｓ，４Ｒ）−４−エトキシ−１−（ペンタ−４−エノイル）ピロリジン−２−カルボン酸（Ｐｅｎ−Ｈｙｐ（Ｅｔ）−ＯＨ）（化合物ｐｃ１８８、２．１ｇ）を粗生成物として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ２４２ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．４０分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ５）
（２Ｓ，４Ｒ）−４−エトキシ−１−（ペンタ−４−エノイル）ピロリジン−２−カルボン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１８９、Ｐｅｎ−Ｈｙｐ（Ｅｔ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
（２Ｓ，４Ｒ）−４−エトキシ−１−（ペンタ−４−エノイル）ピロリジン−２−カルボン酸（Ｐｅｎ−Ｈｙｐ（Ｅｔ）−ＯＨ）（化合物ｐｃ１８８、１．５０ｇ、６．２２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（ＤＣＭ）（２０ｍＬ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（２．００ｇ、１５．５ｍｍｏｌ）および２−ブロモアセトニトリル（４．００ｇ、３３．４ｍｍｏｌ）を加え、２０度で攪拌した。２時間後、反応液を減圧下溶媒留去した。残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）で精製し、（２Ｓ，４Ｒ）−４−エトキシ−１−（ペンタ−４−エノイル）ピロリジン−２−カルボン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１８９、Ｐｅｎ−Ｈｙｐ（Ｅｔ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（６６２ｍｇ、３８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ２８１ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．８２分（分析条件ＥＬＳＤ２）
（２Ｓ，４Ｒ）−４−エトキシ−１−（ペンタ−４−エノイル）ピロリジン−２−カルボン酸（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ１９０、Ｐｅｎ−Ｈｙｐ（Ｅｔ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（１００ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ、３Ｒ、４Ｒ、５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ、３Ｓ、４Ｒ、５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３、４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（２５０ｍｇ、０．３４６ｍｍｏｌ）の水溶液（３．００ｍＬ）と、（２Ｓ，４Ｒ）−４−エトキシ−１−（ペンタ−４−エノイル）ピロリジン−２−カルボン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１８９、Ｐｅｎ−Ｈｙｐ（Ｅｔ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（３８８ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（１．５ｍＬ）を加え、室温にて２時間撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣に８０％酢酸水溶液（０．６ｍＬ）を加え、６時間撹拌した。反応液を逆相カラムクロマトグラフィ−（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ１９０、Ｐｅｎ−Ｈｙｐ（Ｅｔ）−ｐＣｐＡ）（４０．８ｍｇ、１３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ８７４ （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．３９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−アミノ−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）ブタン酸（化合物ｐｃ１９１、Ｈ−Ａｂｕ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）ブタン酸（化合物ａａ１０９、Ｆｍｏｃ−Ａｂｕ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）（３００ｍｇ、０．６７５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１．５ｍＬ）に溶解した後に４−（３−フェニルプロピル）ピペリジン（２８６μＬ、１．３５ｍｍｏｌ）を加え３時間室温にて撹拌した。得られた反応液を直接逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−２−アミノ−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）ブタン酸（化合物ｐｃ１９１、Ｈ−Ａｂｕ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）（１５０ｍｇ）を定量的に得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ２２３ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．１６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）−２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）ブタン酸（化合物ｐｃ１９２、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｂｕ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
ジメチルスルホキシド（３ｍＬ）で溶解した（Ｓ）−２−アミノ−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）ブタン酸（化合物ｐｃ１９１、Ｈ−Ａｂｕ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）（８０ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）に別途調整した炭酸−（４−ニトロフェニル）−４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（化合物ｐｃ１９６）（１５３ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１８時間撹拌した。得られた反応液を直接逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）−２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）ブタン酸（化合物ｐｃ１９２、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｂｕ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）（９０ｍｇ、４９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ５０８ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）−２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）ブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１９３、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｂｕ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）−２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）ブタン酸（化合物ｐｃ１９２、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｂｕ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）（３０ｍｇ、０．０５９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５００μＬ）で溶解し、そこに２−ブロモアセトニトリル（７．９７μＬ、０．１１８ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（３１μＬ、０．１７７ｍｍｏｌ）を０度にて加え、３時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた粗生成物を順相シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）にて精製し、（Ｓ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）−２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）ブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１９３、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｂｕ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１８．３ｍｇ、５７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ５４７ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）−２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）ブタン酸（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ１９４、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｂｕ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（８．３４ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（９．９１ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）の水溶液（０．２ｍＬ）と（Ｓ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）−２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）ブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１９３、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｂｕ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１５ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（４１７μＬ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応液にトリフルオロ酢酸（４１６μＬ）を室温にて加え、３０分間撹拌した。反応液を水で希釈し、逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ１９４、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｂｕ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ｐＣｐＡ）（３．４１ｍｇ、２２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ １１４３ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
２−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アセトアミド（化合物ｐｃ１９５）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、２−（４−フルオロフェニル）酢酸（３００ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）、４−アミノフェニルメタノール（２６４ｍｇ、２．１４ｍｍｏｌ）、ＤＭＴ−ＭＭ（６４６ｍｇ、２．３４ｍｍｏｌ）の混合物に対してテトラヒドロフラン（９．７ｍＬ）を加えたのち、４０度において２時間撹拌した。反応液を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、２−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アセトアミド（化合物ｐｃ１９５）（４００．０ｍｇ、７９．０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ２６０ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
炭酸−（４−ニトロフェニル）−４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（化合物ｐｃ１９６）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、２−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アセトアミド（化合物ｐｃ１９５）（３００ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１．００ｍＬ）に溶解し、ピリジン（０．１８７ｍＬ、２．３１ｍｍｏｌ）を加えたのち、反応液を０度に冷却した。その反応液に対して４−ニトロフェニルクロロホルメート（２３３ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１．１３ｍＬ）を０度においてゆっくり滴下したのち、室温において２時間撹拌した。反応液を濃縮し得られた残渣をヘキサン−酢酸エチル３：１で洗浄し、炭酸−（４−ニトロフェニル）−４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（化合物ｐｃ１９６）（３３０．０ｍｇ、６７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４２５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（化合物ｐｃ１９７、Ｐｅｎ−ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）ブタン酸（化合物ａａ１１０、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）（１．４ｇ、３．０５ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（７ｍＬ）に溶解し、ピペリジン（２．８ｍＬ）を加え２時間室温にて撹拌した。得られた反応液にジエチルエーテル（１４ｍＬ）を加え、３０分間室温にて撹拌した後、ろ過を行い。得られた固体とペンタ−４−エン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（１．４ｇ、７．１０ｍｍｏｌ）と炭酸ナトリウム（５９０ｍｇ、７．０２ｍｍｏｌ）の水／１，４−ジオキサン溶液（１／１、２０ｍＬ）を室温にて１６時間撹拌した。反応溶液をジエチルエーテルで３回洗浄し、５Ｎ塩酸水溶液で水層のｐＨを４に調節した後、凍結乾燥にて濃縮した。得られた残渣を順相シリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール）にて精製し、（２Ｓ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（化合物ｐｃ１９７、Ｐｅｎ−ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）（６００ｍｇ、２工程で６２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ３１９ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．１３７分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ１６）
（２Ｓ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ１９９、Ｐｅｎ−ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（２Ｓ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（化合物ｐｃ１９７、Ｐｅｎ−ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）（６００ｍｇ、１．８８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２０ｍＬ）にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（７３０ｍｇ、５．６５ｍｍｏｌ）、２−ブロモアセトニトリル（８９８ｍｇ、７．４９ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１６時間撹拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、（２Ｓ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）ブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１９８、Ｐｅｎ−ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＣＨ２ＣＮ）（２８０ｍｇ、４２％）を得た。
緩衝液Ａ（７５ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（３００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）、（２Ｓ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）ブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ１９８、Ｐｅｎ−ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＣＨ２ＣＮ）（３００ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（２ｍＬ）を加え、室温で９０分間撹拌した。反応溶液にトリフルオロ酢酸（１．６ｍＬ）を加え反応液を凍結乾燥した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ１９９、Ｐｅｎ−ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ｐＣｐＡ）（２１ｍｇ、２工程３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４７７ （Ｍ＋２Ｈ）２＋
保持時間：０．７４９分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ２９）
（２Ｓ）−４−（３，３−ジフルオロピペリジン−１−イル）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（化合物ｐｃ２０１、Ｐｅｎ−Ａｂｕ（ｐｉｐ−３−Ｆ２）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（３，３−ジフルオロピペリジン−１−イル）ブタン酸（化合物ａａ１１６、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ−３−Ｆ２）−ＯＨ）（２ｇ、４．３６ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（１０ｍＬ）にピペリジン（４ｍＬ）を室温にて加え、２時間撹拌した。反応液にジエチルエーテル（１００ｍＬ）を加え３０分撹拌し，得られた沈殿物をろ過し（２Ｓ）−４−（３，３−ジフルオロピペリジン−１−イル）−２−（メチルアミノ）ブタン酸（化合物ｐｃ２００、Ｈ−ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ−３−Ｆ２）−ＯＨ）（９７９ｍｇ、９５％）を得た。
窒素雰囲気下、（２Ｓ）−４−（３，３−ジフルオロピペリジン−１−イル）−２−（メチルアミノ）ブタン酸（化合物ｐｃ２００、Ｈ−ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ−３−Ｆ２）−ＯＨ）（１ｇ、４．２３ｍｍｏｌ）とペンタ−４−エン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（２．１ｇ、１０．７０ｍｍｏｌ）と炭酸水素ナトリウム（１．４３ｇ、１７．０２ｍｍｏｌ）の水／１，４−ジオキサン溶液（１／１、４０ｍＬ）を室温にて１６時間撹拌した。反応溶液をジエチルエーテルで３回洗浄し、５Ｎ塩酸水溶液で水層のｐＨを４に調節し、凍結乾燥した。得られた残渣を順相シリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール）にて精製し、（２Ｓ）−４−（３，３−ジフルオロピペリジン−１−イル）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（化合物ｐｃ２０１、Ｐｅｎ−ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ−３−Ｆ２）−ＯＨ）（０．５ｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ３１９ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３３４分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ１６）
（２Ｓ）−４−（３，３−ジフルオロピペリジン−１−イル）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ２０３、Ｐｅｎ−ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ−３−Ｆ２）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（２Ｓ）−４−（３，３−ジフルオロピペリジン−１−イル）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（化合物ｐｃ２０１、Ｐｅｎ−ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ−３−Ｆ２）−ＯＨ）（５００ｍｇ、１．５７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１５ｍＬ）にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（６１０ｍｇ）、２−ブロモアセトニトリル（７５０ｍｇ、６．２５ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１６時間撹拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、（２Ｓ）−４−（３，３−ジフルオロピペリジン−１−イル）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）ブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ２０２、Ｐｅｎ−ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ−３−Ｆ２）−ＯＣＨ２ＣＮ）（３８０ｍｇ）を得た。
緩衝液Ａ（７５ｍＬ）にリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（３５０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、（２Ｓ）−４−（３，３−ジフルオロピペリジン−１−イル）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）ブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ２０２、Ｐｅｎ−ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ−３−Ｆ２）−ＯＣＨ２ＣＮ）（３５０ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（２ｍＬ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応液にトリフルオロ酢酸（１．６ｍＬ）を室温にて加え、３０分間撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ２０３、Ｐｅｎ−ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ−３−Ｆ２）−ｐＣｐＡ）（２５ｍｇ、３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４７７ （Ｍ＋２Ｈ）２＋、９５３ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８８７分，０．９９３分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ３４）
（Ｓ）−３−（６−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル）−２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸（化合物ｐｃ２０４、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ−４−ＮＭｅ２）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（６−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル）プロパン酸（化合物ａａ８８、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ−４−ＮＭｅ２）−ＯＨ）（５００ｍｇ、１．１５９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（５．０ｍＬ）に４−（３−フェニルプロピル）ピペリジン（０．４９１ｍＬ、２．３１８ｍｍｏｌ）を室温にて加え、終夜撹拌した。反応液にｔ−ブチルメチルエーテル／ヘキサン＝１／４と水を加え、ｔ−ブチルメチルエーテル／ヘキサン＝１／４で洗浄した。得られた水層を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−２−アミノ−３−（６−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル）プロパン酸（Ｈ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ−４−ＮＭｅ２）−ＯＨ）（２６０ｍｇ）を定量的に得た。
上述の（Ｓ）−２−アミノ−３−（６−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル）プロパン酸（Ｈ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ−４−ＮＭｅ２）−ＯＨ）（１００ｍｇ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（５００μＬ）に別途調整した炭酸（４−ニトロフェニル）４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（化合物ｐｃ１９６）（２４３ｍｇ、０．５７３ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）（１５３μＬ、１．０９９ｍｍｏｌ）を室温にて加え、３５度で５時間撹拌した。反応液に水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加え、逆相クロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）で精製した後、再び逆相クロマトグラフィー（１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）により精製することで、（Ｓ）−３−（６−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル）−２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸（化合物ｐｃ２０４、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ−４−ＮＭｅ２）−ＯＨ）（５５ｍｇ、２工程２４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ４９５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７４分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）
（２Ｓ）−３−（６−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル）−２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ２０５、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ−４−ＮＭｅ２）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−３−（６−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル）−２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸（化合物ｐｃ２０４、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ−４−ＮＭｅ２）−ＯＨ）（２０ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．４ｍＬ）にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（２１．１９μＬ、０．１２１ｍｍｏｌ）、２−ブロモアセトニトリル（１６．９μＬ、０．２４３ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３時間３０分撹拌した。反応液を濃縮し、（Ｓ）−３−（６−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル）−２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸シアノメチル（Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ−４−ＮＭｅ２）−ＯＣＨ２ＣＮ）を粗生成物として得た。
緩衝液Ａ（２０ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（１４．９ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）の水溶液（２．０ｍＬ）、上述の粗生成物である（Ｓ）−３−（６−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル）−２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸シアノメチル（Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ−４−ＮＭｅ２）−ＯＣＨ２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（１．０ｍＬ）を加え、室温で２時間３０分撹拌した。反応液に０度にてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（０．４ｍＬ）を加え、０度にて４０分撹拌した後、反応液を水で希釈し、逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ２０５、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ−４−ＮＭｅ２）−ｐＣｐＡ）（６．７ｍｇ、２９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ １１２９（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−３−（６−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル）−２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）プロパン酸（化合物ｐｃ２０６、Ｆ−Ｐｎａｚ−ＭｅＡｌａ（３−Ｐｙｒ−４−ＮＭｅ２）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（６−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル）プロパン酸（化合物ａａ１８６、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｌａ（３−Ｐｙｒ−４−ＮＭｅ２）−ＯＨ）（１８１ｍｇ、０．４０６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１．８ｍＬ）に４−（３−フェニルプロピル）ピペリジン（０．１７２ｍＬ、０．８１３ｍｍｏｌ）を室温にて加え、終夜撹拌した。反応液にｔ−ブチルメチルエーテル／ヘキサン＝１／４と水を加え、ｔ−ブチルメチルエーテル／ヘキサン＝１／４で洗浄した。得られた水層を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−３−（６−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル）−２−（メチルアミノ）プロパン酸（Ｈ−ＭｅＡｌａ（３−Ｐｙｒ−４−ＮＭｅ２）−ＯＨ）（４７ｍｇ、５２％）を得た。
上述の（Ｓ）−３−（６−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル）−２−（メチルアミノ）プロパン酸（Ｈ−ＭｅＡｌａ（３−Ｐｙｒ−４−ＮＭｅ２）−ＯＨ）（３３ｍｇ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（２００μＬ）に別途調整した炭酸（４−ニトロフェニル）４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（化合物ｐｃ１９６）（７５ｍｇ、０．１７７ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）（４７．４μＬ、０．３４０ｍｍｏｌ）を室温にて加え、３５度で７時間撹拌した後、５５度で終夜撹拌した。反応液にギ酸（２８．３μＬ）を加えた後、逆相クロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）で精製した後、再び逆相クロマトグラフィー（１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）により精製することで、（Ｓ）−３−（６−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル）−２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）プロパン酸（化合物ｐｃ２０６、Ｆ−Ｐｎａｚ−ＭｅＡｌａ（３−Ｐｙｒ−４−ＮＭｅ２）−ＯＨ）（１９ｍｇ、２５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ５０９ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７５分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）
（２Ｓ）−３−（６−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル）−２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）プロパン酸（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ２０７、Ｆ−Ｐｎａｚ−ＭｅＡｌａ（３−Ｐｙｒ−４−ＮＭｅ２）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−３−（６−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル）−２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）プロパン酸（化合物ｐｃ２０６、Ｆ−Ｐｎａｚ−ＭｅＡｌａ（３−Ｐｙｒ−４−ＮＭｅ２）−ＯＨ）（１９ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．４ｍＬ）にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１９．５８μＬ、０．１１２ｍｍｏｌ）、２−ブロモアセトニトリル（１５．６１μＬ、０．２２４ｍｍｏｌ）を加え、室温にて５時間３０分撹拌した。反応液を濃縮し、（Ｓ）−３−（６−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル）−２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）プロパン酸シアノメチル（Ｆ−Ｐｎａｚ−ＭｅＡｌａ（３−Ｐｙｒ−４−ＮＭｅ２）−ＯＣＨ２ＣＮ）を粗生成物として得た。
緩衝液Ａ（２０ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（１３．５２ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ）の水溶液（２．０ｍＬ）、上述の粗生成物である（Ｓ）−３−（６−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル）−２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）プロパン酸シアノメチル（Ｆ−Ｐｎａｚ−ＭｅＡｌａ（３−Ｐｙｒ−４−ＮＭｅ２）−ＯＣＨ２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（１．０ｍＬ）を加え、室温で１時間３０分撹拌した。反応液に０度にてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（０．４ｍＬ）を加え、０度にて３０分撹拌した後、反応液を水で希釈し、逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ２０７、Ｆ−Ｐｎａｚ−ＭｅＡｌａ（３−Ｐｙｒ−４−ＮＭｅ２）−ｐＣｐＡ）（３．０ｍｇ、１４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ １１４１．５（Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．４５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
ｔｅｒｔ−ブチルＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−ペンチルグリシナート（化合物ｐｃ２０８、Ｂｏｃ−ｎＰｅｎＧｌｙ−ＯｔＢｕ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、水素化ナトリウム（５．２ｇ、２１６．６７ｍｍｏｌ、６０％オイルディスパージョン）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（１００ｍＬ）に０度にてｔｅｒｔ−ブチル（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）グリシナート（Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯｔＢｕ）（２０ｇ、８６．４７ｍｍｏｌ）を加えた後、反応液を室温で３０分撹拌し、１−ヨードペンタン（５１．４ｇ、２５９．５４ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液（１０ｍＬ）を滴下しながら加えた。反応液を室温にて１６時間撹拌した後、水を加え、酢酸エチルで３回抽出した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させｔｅｒｔ−ブチルＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−ペンチルグリシナート（化合物ｐｃ２０８、Ｂｏｃ−ｎＰｅｎＧｌｙ−ＯｔＢｕ）（６．３ｇ）を粗生成物として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ３０２ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．３７分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ９）
シアノメチルＮ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｎ−ペンチルグリシナート（化合物ｐｃ２０９、Ｐｅｎ−ｎＰｅｎＧｌｙ−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
上述のようにして得た粗生成物であるｔｅｒｔ−ブチルＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−ペンチルグリシナート（化合物ｐｃ２０８、Ｂｏｃ−ｎＰｅｎＧｌｙ−ＯｔＢｕ）（１０．２ｇ、３３．８４ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（３７．５ｍＬ）に溶解し、０度にて濃塩酸（３７．５ｍＬ）を加え、室温にて１６時間撹拌した。反応液を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させ粗生成物としてペンチルグリシン（Ｈ−ｎＰｅｎＧｌｙ−ＯＨ）の塩酸塩を（４．９ｇ）得た。
上述のようにして得た、粗生成物であるペンチルグリシン（Ｈ−ｎＰｅｎＧｌｙ−ＯＨ）の塩酸塩（６．２ｇ、４２．７ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（７１ｍＬ）／水（７１ｍＬ）に溶解させた後、文献記載（Organic Letters, 2011, 13, 4906）の方法で合成したペンタ−４−エン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（２０ｇ、１０１．４３ｍｍｏｌ）と、炭酸水素ナトリウム（５．７ｇ、８５．４ｍｍｏｌ）を加え、反応液を３５度で１６時間撹拌した。反応が完結した後、反応液をジエチルエーテルで２回洗浄し、水層がｐＨ＝２になるまで１．０Ｍ塩酸水溶液を加えた。得られた混合物をジクロロメタンで２回抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、減圧濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｎ−ペンチルグリシン（Ｐｅｎ−ｎＰｅｎＧｌｙ−ＯＨ）（１．８ｇ、７．９２ｍｍｏｌ）を得た。
窒素雰囲気下、Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｎ−ペンチルグリシン（Ｐｅｎ−ｎＰｅｎＧｌｙ−ＯＨ）（１．８ｇ、７．９２ｍｍｏｌ）、２−ブロモアセトニトリル（３．８ｇ、３１．６８ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（２．０ｇ、１５．８４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３６ｍＬ）を室温にて１６時間撹拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、シアノメチルＮ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｎ−ペンチルグリシナート（化合物ｐｃ２０９、Ｐｅｎ−ｎＰｅｎＧｌｙ−ＯＣＨ２ＣＮ）（１．６ｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ２６７ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．０５分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ９）
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イルＮ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｎ−ペンチルグリシナート（化合物ｐｃ２１０、Ｐｅｎ−ｎＰｅｎＧｌｙ−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（７５ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（３００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）、シアノメチルＮ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｎ−ペンチルグリシナート（化合物ｐｃ２０９、Ｐｅｎ−ｎＰｅｎＧｌｙ−ＯＣＨ２ＣＮ）（４４８ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（３．０ｍＬ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応液にトリフルオロ酢酸（１．７ｍＬ）を加え、そのまま凍結乾燥し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ２１０、Ｐｅｎ−ｎＰｅｎＧｌｙ−ｐＣｐＡ）（４０ｍｇ、６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ８６２ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｎ−ヘキシル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）グリシン（化合物ｐｃ２１１、Ｐｅｎ−ｎＨｅｘＧｌｙ−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、水素化ナトリウム（６．０ｇ、２５０ｍｍｏｌ、６０％オイルディスパージョン）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（１５０ｍＬ）に０度にてｔｅｒｔ−ブチル（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）グリシナート（Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯｔＢｕ）（２５ｇ、１０８．０９ｍｍｏｌ）を加えた後、反応液を室温で３０分撹拌し、１−ヨードヘキサン（６８．８ｇ、３２４．４２ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液（１５ｍＬ）を滴下しながら加えた。反応液を室温にて１６時間撹拌した後、水を加え、酢酸エチルで３回抽出した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させｔｅｒｔ−ブチルＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−ヘキシルグリシナート（Ｂｏｃ−ｎＨｅｘＧｌｙ−ＯｔＢｕ）（８．３ｇ）を粗生成物として得た。
粗成性物であるｔｅｒｔ−ブチルＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−ヘキシルグリシナート（Ｂｏｃ−ｎＨｅｘＧｌｙ−ＯｔＢｕ）（１１．５ｇ）を１，４−ジオキサン（４０．４ｍＬ）に溶解し、０度にて濃塩酸（４０．４ｍＬ）を加え、室温にて１６時間撹拌した。反応液を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させ粗生成物としてヘキシルグリシン（Ｈ−ｎＨｅｘＧｌｙ−ＯＨ）の塩酸塩を（５．８ｇ）得た。
組成性物であるヘキシルグリシン（Ｈ−ｎＨｅｘＧｌｙ−ＯＨ）の塩酸塩（７．１ｇ）を１，４−ジオキサン（７６ｍＬ）／水（７６ｍＬ）に溶解させた後、文献記載（Organic Letters, 2011, 13, 4906）の方法で合成したペンタ−４−エン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（２１．６ｇ、１０９．５４ｍｍｏｌ）と、炭酸水素ナトリウム（６．１ｇ、７２．６１ｍｍｏｌ）を加え、反応液を３５度で１６時間撹拌した。反応が完結した後、反応液をジエチルエーテルで２回洗浄し、水層の液性がｐＨ＝２になるまで１．０Ｍ塩酸水溶液を加えた。得られた混合物をジクロロメタンで２回抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、減圧濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、Ｎ−ヘキシル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）グリシン（化合物ｐｃ２１１、Ｐｅｎ−ｎＨｅｘＧｌｙ−ＯＨ）（４．０ｇ、１６．６ｍｍｏｌ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ２４２ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９８分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ９）
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イルＮ−ヘキシル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）グリシナート（化合物ｐｃ２１２、Ｐｅｎ−ｎＨｅｘＧｌｙ−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−ヘキシル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）グリシン（化合物ｐｃ２１１、Ｐｅｎ−ｎＨｅｘＧｌｙ−ＯＨ）（４．０ｇ、１６．６ｍｍｏｌ）、２−ブロモアセトニトリル（８．０ｇ、６６．７ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（４．３ｇ、３３．３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（７０ｍＬ）を室温にて１６時間撹拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、シアノメチルＮ−ヘキシル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）グリシナート（Ｐｅｎ−ｎＨｅｘＧｌｙ−ＯＣＨ２ＣＮ）（１．２ｇ、２６％）を得た。
緩衝液Ａ（７５ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（３００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）、シアノメチルＮ−ヘキシル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）グリシナート（Ｐｅｎ−ｎＨｅｘＧｌｙ−ＯＣＨ２ＣＮ）（４６５ｍｇ、１．６６ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（３．０ｍＬ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応液にトリフルオロ酢酸（１．７ｍＬ）を加え、そのまま凍結乾燥し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ２１２、Ｐｅｎ−ｎＨｅｘＧｌｙ−ｐＣｐＡ）（５３ｍｇ、７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ８７６ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｎ−フェネチルグリシン（化合物ｐｃ２１３、Ｐｅｎ−（ＰｈＥｔ）ＮＧｌｙ−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
２−フェニルエタン−１−アミン（６．０ｇ、４９．５１ｍｍｏｌ）の水溶液（８０ｍＬ）に２−ブロモ酢酸（２．３ｇ、１６．５５ｍｍｏｌ）の水溶液（２０ｍＬ）を０度にて加えた後、８Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（８．２ｍＬ）を滴下しながら、０度にて加えた。反応液を室温にて１６時間撹拌した後、酢酸エチルで３回洗浄した。得られた水層を減圧下６０ｍＬ程度になるまで濃縮し、濃塩酸を用いてｐＨ＝７になるまで中和し、混合物としてフェネチルグリシン（Ｈ−（ＰｈＥｔ）ＮＧｌｙ−ＯＨ）の水溶液を得た。
混合物であるフェネチルグリシン（Ｈ−（ＰｈＥｔ）ＮＧｌｙ−ＯＨ）の水溶液に１，４−ジオキサン（６０ｍＬ）を加えた後、文献記載（Organic Letters, 2011, 13, 4906）の方法で合成したペンタ−４−エン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（６．６ｇ、３３．４７ｍｍｏｌ）と、炭酸水素ナトリウム（２．８ｇ、３３．３３ｍｍｏｌ）を加え、反応液を２５度で１６時間撹拌した。反応液をジエチルエーテルで３回洗浄し、水層の液性がｐＨ＝４になるまで１．０Ｍ塩酸水溶液を加えた。得られた混合物をジクロロメタンで２回抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、減圧濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｎ−フェネチルグリシン（化合物ｐｃ２１３、Ｐｅｎ−（ＰｈＥｔ）ＮＧｌｙ−ＯＨ）（１．４ｇ、２工程３２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ２６２ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９０分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ１６）
シアノメチルＮ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｎ−フェネチルグリシナート（化合物ｐｃ２１４、Ｐｅｎ−（ＰｈＥｔ）ＮＧｌｙ−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｎ−フェネチルグリシン（化合物ｐｃ２１３、Ｐｅｎ−（ＰｈＥｔ）ＮＧｌｙ−ＯＨ）（１．５ｇ、５．７４ｍｍｏｌ）、２−ブロモアセトニトリル（２．７４ｇ、２２．８４ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１．４８ｇ、１１．４５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（４５ｍＬ）を２５度にて１６時間撹拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、シアノメチルＮ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｎ−フェネチルグリシナート（化合物ｐｃ２１４、Ｐｅｎ−（ＰｈＥｔ）ＮＧｌｙ−ＯＣＨ２ＣＮ）（１．１ｇ、６４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ３０１ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．０３分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ１６）
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イルＮ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｎ−フェネチルグリシナート（化合物ｐｃ２１５、Ｐｅｎ−（ＰｈＥｔ）ＮＧｌｙ−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（７５ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（３００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）、シアノメチルＮ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｎ−フェネチルグリシナート（化合物ｐｃ２１４、Ｐｅｎ−（ＰｈＥｔ）ＮＧｌｙ−ＯＣＨ２ＣＮ）（３７３ｍｇ、１．２４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（２．０ｍＬ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応液にトリフルオロ酢酸（１．６ｍＬ）を加え、そのまま凍結乾燥し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ２１５、Ｐｅｎ−（ＰｈＥｔ）ＮＧｌｙ−ｐＣｐＡ）（５７．５ｍｇ、８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ８９７ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
シアノメチルＮ−（２−エトキシエチル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）グリシナート（化合物ｐｃ２１６、Ｐｅｎ−（ＥｔＯＥｔ）ＮＧｌｙ−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成

Figure 2018225864
２−エトキシエタン−１−アミン（９．６ｇ、１０７．８７ｍｍｏｌ）の水溶液（１６０ｍＬ）に２−ブロモ酢酸（５．０ｇ、３５．９７ｍｍｏｌ）の水溶液（４０ｍＬ）を０度にて加えた後、８Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（１７．８ｍＬ）を滴下しながら、０度にて加えた。反応液を室温にて１６時間撹拌した後、酢酸エチルで３回洗浄した。得られた水層を減圧下２００ｍＬ程度になるまで濃縮し、濃塩酸を用いてｐＨ＝７になるまで中和し、混合物として（２−エトキシエチル）グリシン（Ｈ−（ＥｔＯＥｔ）ＮＧｌｙ−ＯＨ）の水溶液を得た。
混合物である（２−エトキシエチル）グリシン（Ｈ−（ＥｔＯＥｔ）ＮＧｌｙ−ＯＨ）の水溶液に１，４−ジオキサン（２００ｍＬ）を加えた後、文献記載（Organic Letters, 2011, 13, 4906）の方法で合成したペンタ−４−エン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（１４．０ｇ、７１．３６ｍｍｏｌ）と、炭酸水素ナトリウム（６．０ｇ、７１．４２ｍｍｏｌ）を加え、反応液を２５度で１６時間撹拌した。反応液をジエチルエーテルで３回洗浄し、水層の液性がｐＨ＝４になるまで１．０Ｍ塩酸水溶液を加えた。得られた混合物をジクロロメタンで２回抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、減圧濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、Ｎ−（２−エトキシエチル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）グリシン（Ｐｅｎ−（ＥｔＯＥｔ）ＮＧｌｙ−ＯＨ）（３．１ｇ、２工程３８％）を得た。
窒素雰囲気下、Ｎ−（２−エトキシエチル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）グリシン（Ｐｅｎ−（ＥｔＯＥｔ）ＮＧｌｙ−ＯＨ）（３．１ｇ、１３．５２ｍｍｏｌ）、２−ブロモアセトニトリル（６．６５ｇ、５５．４４ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（３．６１ｇ、２７．９３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（６０ｍＬ）を２５度にて１６時間撹拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、シアノメチルＮ−（２−エトキシエチル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）グリシナート（化合物ｐｃ２１６、Ｐｅｎ−（ＥｔＯＥｔ）ＮＧｌｙ−ＯＣＨ２ＣＮ）（２．７ｇ、７４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ２６９ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８７分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ１６）
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イルＮ−（２−エトキシエチル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）グリシナート（化合物ｐｃ２１７、Ｐｅｎ−（ＥｔＯＥｔ）ＮＧｌｙ−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（７５ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（３００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）、シアノメチルＮ−（２−エトキシエチル）−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）グリシナート（化合物ｐｃ２１６、Ｐｅｎ−（ＥｔＯＥｔ）ＮＧｌｙ−ＯＣＨ２ＣＮ）（３４３ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（２．０ｍＬ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応液にトリフルオロ酢酸（１．６ｍＬ）を加え、そのまま凍結乾燥し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ２１７、Ｐｅｎ−（ＥｔＯＥｔ）ＮＧｌｙ−ｐＣｐＡ）（５０．０ｍｇ、７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ８６５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｎ−（２−フェノキシエチル）グリシン（化合物ｐｃ２１８、Ｐｅｎ−（ＰｈＯＥｔ）ＮＧｌｙ−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
２−フェノキシエタン−１−アミン（１４．８ｇ、１０８．０３ｍｍｏｌ）の水溶液（１６０ｍＬ）に２−ブロモ酢酸（５．０ｇ、３５．９７ｍｍｏｌ）の水溶液（４０ｍＬ）を０度にて加えた後、８Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（１７．８ｍＬ）を滴下しながら、０度にて加えた。反応液を室温にて１６時間撹拌した後、酢酸エチルで３回洗浄した。得られた水層を減圧下１００ｍＬ程度になるまで濃縮し、濃塩酸を用いてｐＨ＝７になるまで中和し、混合物として（２−フェノキシエチル）グリシン（Ｈ−（ＰｈＯＥｔ）ＮＧｌｙ−ＯＨ）の水溶液を得た。
混合物である（２−フェノキシエチル）グリシン（Ｈ−（ＰｈＯＥｔ）ＮＧｌｙ−ＯＨ）の水溶液に１，４−ジオキサン（１００ｍＬ）を加えた後、文献記載（Organic Letters, 2011, 13, 4906）の方法で合成したペンタ−４−エン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（１４．０ｇ、７１．３６ｍｍｏｌ）と、炭酸水素ナトリウム（６．０ｇ、７１．４２ｍｍｏｌ）を加え、反応液を２５度で１６時間撹拌した。反応液をジエチルエーテルで３回洗浄し、水層の液性がｐＨ＝４になるまで５Ｎ塩酸水溶液を加えた。得られた混合物をジクロロメタンで２回抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、減圧濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｎ−（２−フェノキシエチル）グリシン（化合物ｐｃ２１８、Ｐｅｎ−（ＰｈＯＥｔ）ＮＧｌｙ−ＯＨ）（２．２ｇ、２工程２２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ２７８ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９１分（分析条件ＳＭＤｍｅｔｈｏｄ１６）
シアノメチルＮ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｎ−（２−フェノキシエチル）グリシナート（化合物ｐｃ２１９、Ｐｅｎ−（ＰｈＯＥｔ）ＮＧｌｙ−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成

Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｎ−（２−フェノキシエチル）グリシン（化合物ｐｃ２１８、Ｐｅｎ−（ＰｈＯＥｔ）ＮＧｌｙ−ＯＨ）（２．２ｇ、７．９３ｍｍｏｌ）、２−ブロモアセトニトリル（３．７８ｇ、３１．５１ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（２．０４ｇ、１５．７８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（６０ｍＬ）を２５度にて１６時間撹拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、シアノメチルＮ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｎ−（２−フェノキシエチル）グリシナート（化合物ｐｃ２１９、Ｐｅｎ−（ＰｈＯＥｔ）ＮＧｌｙ−ＯＣＨ２ＣＮ）（２．０ｇ、８０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ３１７ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．０２分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ１６）
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イルＮ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｎ−（２−フェノキシエチル）グリシナート（化合物ｐｃ２２０、Ｐｅｎ−（ＰｈＯＥｔ）ＮＧｌｙ−ｐＣｐＡ）の合成

Figure 2018225864
緩衝液Ａ（７５ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（３００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）、シアノメチルＮ−（ペンタ−４−エノイル）−Ｎ−（２−フェノキシエチル）グリシナート（化合物ｐｃ２１９、Ｐｅｎ−（ＰｈＯＥｔ）ＮＧｌｙ−ＯＣＨ２ＣＮ）（３９３ｍｇ、１．２４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（２．０ｍＬ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応液にトリフルオロ酢酸（１．６ｍＬ）を加え、そのまま凍結乾燥し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ２２０、Ｐｅｎ−（ＰｈＯＥｔ）ＮＧｌｙ−ｐＣｐＡ）（５３．３ｍｇ、７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ９１３ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
化合物ｐｃ２２２（Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｐｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ｐＣｐＡ）の合成は、以下のスキームに従って行った。
Figure 2018225864
（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４，４−ジフルオロ−１−ピペリジル）−１−［［４−［［２−（４−フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル］ピロリジン−２−カルボン酸（化合物ｐｃ２２１、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｐｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４，４−ジフルオロ−１−ピペリジル）ピロリジン−２−カルボン酸（化合物ａａ１２９、Ｈ−Ｐｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）（１３５ｍｇ、０．５７６ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（２ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．１６１ｍＬ、１．１５３ｍｍｏｌ）および炭酸−（４−ニトロフェニル）−４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（化合物ｐｃ１９６）（２４５ｍｇ、０．５７６ｍｍｏｌ）を加えて室温で５時間撹拌した。反応液に０．１％酢酸アンモニウム水溶液（２ｍＬ）を加えた後、逆相カラムクロマトグラフィ（１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）で精製し、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４，４−ジフルオロ−１−ピペリジル）−１−［［４−［［２−（４−フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル］ピロリジン−２−カルボン酸（化合物ｐｃ２２１、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｐｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）（１４３ｍｇ、４８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ５２０ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７７分（分析条件 ＳＱＤＡＡ０５）
（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）２−（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル）（化合物ｐｃ２２２、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｐｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（４００ｍｇ、０．５５４ｍｍｏｌ）を水（２．０ｍＬ）に溶解し、水酸化テトラブチルアンモニウム（４０％水溶液、０．９ｇ、１．３８７ｍｍｏｌ）を加えて撹拌した。凍結乾燥により水を除去することでリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチルテトラブチルアンモニウム塩（０．７２３ｇ）を得た。
次いで（２Ｓ，４Ｒ）−４−（４，４−ジフルオロ−１−ピペリジル）−１−［［４−［［２−（４−フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル］ピロリジン−２−カルボン酸（化合物ｐｃ２２１、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｐｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）（８０ｍｇ、０．１５４ｍｍｏｌ）および２−ブロモアセトニトリル（１０．２μＬ、０．１４６ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（０．６ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．０５４ｍＬ、０．３０８ｍｍｏｌ）を加えて室温で１７時間撹拌した。この反応液に、先に調整したリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチルテトラブチルアンモニウム塩（１２５ｍｇ）を加えて５０度で４６時間撹拌した。室温まで冷却した後、反応液にギ酸（０．０３０ｍＬ、０．７７０ｍｍｏｌ）を加え、逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）で精製した。フラクションを凍結乾燥して得られた残渣を５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、室温で３０分撹拌した。その後、水を添加して希釈し、逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）で精製した。フラクションを凍結乾燥して、表題化合物（化合物ｐｃ２２２、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｐｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ｐＣｐＡ）（７．７ｍｇ、９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ １１５５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４４分（分析条件 ＳＱＤＦＡ０５）
化合物ｐｃ２２４（Ｆ−Ｐｎａｚ−ｃｉｓＰｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）の合成は、以下のスキームに従って行った。
Figure 2018225864
（２Ｓ，４Ｓ）−４−（４，４−ジフルオロ−１−ピペリジル）−１−［［４−［［２−（４−フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル］ピロリジン−２−カルボン酸（化合物ｐｃ２２３、Ｆ−Ｐｎａｚ−ｃｉｓＰｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（２Ｓ，４Ｓ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）ピロリジン−２−カルボン酸（化合物ａａ１３２、Ｈ−ｃｉｓＰｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）（９０ｍｇ、０．３８４ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（１．５ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．１０７ｍＬ、０．７６８ｍｍｏｌ）および炭酸−（４−ニトロフェニル）−４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（化合物ｐｃ１９６）（１６３ｍｇ、０．３８４ｍｍｏｌ）を加えて室温で５時間撹拌した。反応液に０．１％酢酸アンモニウム水溶液（２ｍＬ）を加えた後、逆相カラムクロマトグラフィ（１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）で精製し、（２Ｓ，４Ｓ）−４−（４，４−ジフルオロ−１−ピペリジル）−１−［［４−［［２−（４−フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル］ピロリジン−２−カルボン酸（化合物ｐｃ２２３、Ｆ−Ｐｎａｚ−ｃｉｓＰｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）（１６１ｍｇ、８１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ５２０ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８０ 分（分析条件 ＳＱＤＡＡ０５）
（２Ｓ，４Ｓ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）２−（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル）（化合物ｐｃ２２４、Ｆ−Ｐｎａｚ−ｃｉｓＰｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（４００ｍｇ、０．５５４ｍｍｏｌ）を水（２．０ｍＬ）に溶解し、水酸化テトラブチルアンモニウム（４０％水溶液、０．９ｇ、１．３８７ｍｍｏｌ）を加えて撹拌した。凍結乾燥により水を除去することでリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチルテトラブチルアンモニウム塩（０．７２３ｇ）を得た。
次いで（２Ｓ，４Ｓ）−４−（４，４−ジフルオロ−１−ピペリジル）−１−［［４−［［２−（４−フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニル］ピロリジン−２−カルボン酸（化合物ｐｃ２２３、Ｆ−Ｐｎａｚ−ｃｉｓＰｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯＨ）（１００ｍｇ、０．１９２ｍｍｏｌ）および２−ブロモアセトニトリル（０．０１３ｍＬ、０．１８３ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（０．６ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．０６７ｍＬ、０．３８５ｍｍｏｌ）を加えて室温で１７時間撹拌した。この反応液に、先に調整したリン酸二水素 （（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチルテトラブチルアンモニウム塩（１５５ｍｇ）を加えて５０度で４６時間撹拌した。室温まで冷却した後、反応液にギ酸（０．０３７ｍＬ、０．９６０ｍｍｏｌ）を加え、逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）で精製した。フラクションを凍結乾燥して得られた残渣を５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解させ、室温で３０分撹拌した。その後、水を添加して希釈し、逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）で精製した。フラクションを凍結乾燥して、表題化合物（化合物ｐｃ２２４、Ｆ−Ｐｎａｚ−ｃｉｓＰｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ｐＣｐＡ）（７．２ｍｇ、７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ １１５５ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４６ 分（分析条件 ＳＱＤＦＡ０５）
化合物ｐｃ２２８（Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｂｕ（Ｍｏｒ）−ｐＣｐＡ）の合成は、以下のスキームに従って行った。
Figure 2018225864
（２Ｓ）−２−アミノ−４−モルホリノ−ブタン酸（化合物ｐｃ２２５、Ｈ−Ａｂｕ（Ｍｏｒ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−モルホリノブタン酸（化合物ａａ１２３、Ｆｍｏｃ−Ａｂｕ（Ｍｏｒ）−ＯＨ）（１２．５ｇ、３０．４５ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（３０ｍＬ）に溶解し、ピペリジン（８ｍＬ）を加えて２時間撹拌した。その後、反応液をジエチルエーテルで希釈し、析出した固体を回収して、（２Ｓ）−２−アミノ−４−モルホリノ−ブタン酸（化合物ｐｃ２２５、Ｈ−Ａｂｕ（Ｍｏｒ）−ＯＨ）（４ｇ、７０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ １８９ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．２３８分（分析条件 ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ３９）
（２Ｓ）−２−［［４−［［２−（４−フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］−４−モルホリノ−ブタン酸（化合物ｐｃ２２６、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｂｕ（Ｍｏｒ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
（２Ｓ）−２−アミノ−４−モルホリノ−ブタン酸（化合物ｐｃ２２５、Ｈ−Ａｂｕ（Ｍｏｒ）−ＯＨ）（６４０ｍｇ、３．４０ｍｍｏｌ）、炭酸−（４−ニトロフェニル）−４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（化合物ｐｃ１９６）（１．３ｇ、３．０６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．８５ｍＬ、６．１２ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（１２ｍＬ）に溶解し、窒素雰囲気下、２５度で１６時間撹拌した。その後、反応液を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）で精製し、（２Ｓ）−２−［［４−［［２−（４−フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］−４−モルホリノ−ブタン酸（化合物ｐｃ２２６、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｂｕ（Ｍｏｒ）−ＯＨ）（１．０ｇ、６９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ４７４ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７４分（分析条件 ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ４３）
（２Ｓ）−２−［［４−［［２−（４−フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］−４−モルホリノ−ブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ２２７、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｂｕ（Ｍｏｒ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
（２Ｓ）−２−［［４−［［２−（４−フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］−４−モルホリノ−ブタン酸（化合物ｐｃ２２６、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｂｕ（Ｍｏｒ）−ＯＨ）（１ｇ、２．１１ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（５４０ｍｇ、４．１８ｍｍｏｌ）および２−ブロモアセトニトリル（１ｇ、８．３４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３０ｍＬ）に溶解し、窒素雰囲気下、２５度で４８時間撹拌した。その後、反応液を減圧濃縮し、得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／アセトン）で精製し、（２Ｓ）−２−［［４−［［２−（４−フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］−４−モルホリノ−ブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ２２７、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｂｕ（Ｍｏｒ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（５０５ｍｇ、４７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ５１３ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６６分（分析条件 ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ４４）
（２Ｓ）−２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−４−モルホリノブタン酸（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ２２８、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｂｕ（Ｍｏｒ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（４００ｍｇ、０．５５４ｍｍｏｌ）を緩衝液Ａ（１００ｍＬ）に溶解し、（２Ｓ）−２−［［４−［［２−（４−フルオロフェニル）アセチル］アミノ］フェニル］メトキシカルボニルアミノ］−４−モルホリノ−ブタン酸シアノメチル（化合物ｐｃ２２７、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｂｕ（Ｍｏｒ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１５０ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（５．０ｍＬ）を１５分かけて添加した。室温で１時間撹拌した後、トリフルオロ酢酸（２．３ｍＬ）を加え、反応液を凍結乾燥した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）で精製し、表題化合物（化合物ｐｃ２２８、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｂｕ（Ｍｏｒ）−ｐＣｐＡ）（３３．２ｍｇ、１０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ １１０９ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．１２分（分析条件 ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ３４）
Ｎ−（２−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）エチル）−Ｎ−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）グリシン（化合物ｐｃ２２９、Ｆ−Ｐｎａｚ−（２−（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−Ｅｔ）Ｇｌｙ−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−（２−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）エチル）グリシン（化合物ａａ１２６、Ｆｍｏｃ−（２−（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−Ｅｔ）Ｇｌｙ−ＯＨ）（１．０８１ｍｇ、２．４３３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液に４−（３−フェニルプロピル）ピペリジン（２．０６１ｍＬ、９．７３ｍｍｏｌ）を室温にて加え、３０分間撹拌した。反応液に水を加え、逆相クロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）により精製することで、（２−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）エチル）グリシン（Ｈ−（２−（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−Ｅｔ）Ｇｌｙ−ＯＨ）（５８５．６ｍｇ）を得た。
上述の（２−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）エチル）グリシン（Ｈ−（２−（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−Ｅｔ）Ｇｌｙ−ＯＨ）（１５０ｍｇ）にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（３．０ｍＬ）、トリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）（４００μＬ）を加えた後、別途調整した炭酸−（４−ニトロフェニル）−４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（化合物ｐｃ１９６）（３５６ｍｇ、０．８２９ｍｍｏｌ）を室温にて加え、１０分間撹拌した。反応液をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈し、逆相クロマトグラフィー（１０ ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）により精製することで、Ｎ−（２−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）エチル）−Ｎ−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）グリシン（化合物ｐｃ２２９、Ｆ−Ｐｎａｚ−（２−（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−Ｅｔ）Ｇｌｙ−ＯＨ）（２５３．５ｍｇ、２工程８０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ５０８ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７５分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イルＮ−（２−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）エチル）−Ｎ−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）グリシナート（化合物ｐｃ２３０、Ｆ−Ｐｎａｚ−（２−（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−Ｅｔ）Ｇｌｙ−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−（２−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）エチル）−Ｎ−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）グリシン（化合物ｐｃ２２９、Ｆ−Ｐｎａｚ−（２−（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−Ｅｔ）Ｇｌｙ−ＯＨ）（４８ｍｇ、０．０９４ｍｍｏｌ）、２−ブロモアセトニトリル（１３μＬ、０．１８８ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（４８μＬ、０．２８２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．７９７ｍＬ）を室温にて３０分撹拌した。反応液を濃縮し、得られたシアノメチルＮ−（２−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）エチル）−Ｎ−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）グリシナート（Ｆ−Ｐｎａｚ−（２−（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−Ｅｔ）Ｇｌｙ−ＯＣＨ２ＣＮ）の混合物をそのまま次の反応に用いた。
緩衝液Ａ（３０ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（４７．５ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）、上述のシアノメチルＮ−（２−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）エチル）−Ｎ−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）グリシナート（Ｆ−Ｐｎａｚ−（２−（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−Ｅｔ）Ｇｌｙ−ＯＣＨ２ＣＮ）の混合物（２５．７ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（３．０ｍＬ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応液にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１．７ｍＬ）を０度にて加え、１５分間撹拌した。反応液を逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ２３０、Ｆ−Ｐｎａｚ−（２−（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−Ｅｔ）Ｇｌｙ−ｐＣｐＡ）（１１．９ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ １１４３ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−３−（４−（ジフルオロメチル）フェニル）−２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸（化合物ｐｃ２３１、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｐｈｅ（４−ＣＨＦ２）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、市販の（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−（ジフルオロメチル）フェニル）プロパン酸（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＣＨＦ２）−ＯＨ）（３００ｍｇ、０．６８６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３．０ｍＬ）に４−（３−フェニルプロピル）ピペリジン（０．２９１ｍＬ、１．３７２ｍｍｏｌ）を室温にて加え、終夜撹拌した。反応液にｔ−ブチルメチルエーテル／ヘキサン＝１／４と水を加え、ｔ−ブチルメチルエーテル／ヘキサン＝１／４で洗浄した。得られた水層を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−（ジフルオロメチル）フェニル）プロパン酸（Ｈ−Ｐｈｅ（４−ＣＨＦ２）−ＯＨ）（１２８ｍｇ、８７％）を得た。
上述の（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−（ジフルオロメチル）フェニル）プロパン酸（Ｈ−Ｐｈｅ（４−ＣＨＦ２）−ＯＨ）（１２８ｍｇ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（２．０ｍＬ）に別途調整した炭酸−（４−ニトロフェニル）−４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（化合物ｐｃ１９６）（３０３ｍｇ、０．７１４ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）（１９１μＬ、１．３６８ｍｍｏｌ）を室温にて加え、４０度で２時間撹拌した。反応液に水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を室温にて加え、逆相クロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）で精製することで、（Ｓ）−３−（４−（ジフルオロメチル）フェニル）−２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸（化合物ｐｃ２３１、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｐｈｅ（４−ＣＨＦ２）−ＯＨ）（２６２ｍｇ、８８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ５０１ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ）−３−（４−（ジフルオロメチル）フェニル）−２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ２３２、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｐｈｅ（４−ＣＨＦ２）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−３−（４−（ジフルオロメチル）フェニル）−２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸（化合物ｐｃ２３１、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｐｈｅ（４−ＣＨＦ２）−ＯＨ）（３５ｍｇ、０．０７０ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．８ｍＬ）にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（３６．６μＬ、０．２１０ｍｍｏｌ）、２−ブロモアセトニトリル（２９．２μＬ、０．４２０ｍｍｏｌ）を加え、室温にて終夜撹拌した。反応液を濃縮し、（Ｓ）−３−（４−（ジフルオロメチル）フェニル）−２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸シアノメチル（Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｐｈｅ（４−ＣＨＦ２）−ＯＣＨ２ＣＮ）を粗生成物として得た。
緩衝液Ａ（２０ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（２５ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）の水溶液（２．０ｍＬ）、上述の粗生成物である（Ｓ）−３−（４−（ジフルオロメチル）フェニル）−２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸シアノメチル（Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｐｈｅ（４−ＣＨＦ２）−ＯＣＨ２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（１．０ｍＬ）を加え、室温で１時間２０分撹拌した。反応液に０度にてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（０．４ｍＬ）を加え、０度にて５０分撹拌した後、反応液を室温で１時間１０分さらに撹拌した。反応液を水で希釈し、逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ２３２、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｐｈｅ（４−ＣＨＦ２）−ｐＣｐＡ）（１１ｍｇ、２８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ １１３５（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ）−３−（３−クロロフェニル）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）プロパン酸（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ２３３、Ｐｅｎ−ＭｅＰｈｅ（３−Ｃｌ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
フィルター付きの反応容器に２−クロロトリチルレジン（１５ｇ、１．６０ｍｍｏｌ／ｇ）、ジクロロメタンを加え１０分間振とうしレジンを膨潤させた。ジクロロメタンを除いたのち、ＷＯ２０１３／１００１３２に記載の方法にて合成した（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（３−クロロフェニル）プロパン酸（Ｆｍｏｃ−ＭｅＰｈｅ（３−Ｃｌ）−ＯＨ）（５．０ｇ、１１．４７ｍｍｏｌ）、Ｎ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（７．４ｇ、５７．３４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（５０ｍＬ）を加え室温で３時間振とうした後、ジクロロメタン溶液を除去し、ジクロロメタンでレジンを３回洗浄した。ピペリジン（２０ｍＬ）のジメチルホルムアミド溶液（８０ｍＬ）を加え、室温で３時間振とうした後に溶液を除去し、ジメチルホルムアミドで３回レジンを洗浄した。４−ペンテン酸（２．２９ｇ、２２．９４ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）（３．１２ｇ、２２．９４ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ´−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（３．１８ｇ、２５．２３ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液（８０ｍＬ）を加え室温で３時間振とうした。溶液を除去し、ジメチルホルムアミドで４回、ジクロロメタンで４回レジンを洗浄し、２％トリフルオロ酢酸／ジクロロメタン溶液（８０ｍＬ）を加え室温で３０分間振とうし、溶液をろ過することでレジン上から切り出した。この操作を３回繰り返し、得られたろ液を濃縮した後、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製し、（Ｓ）−３−（３−クロロフェニル）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）プロパン酸（Ｐｅｎ−ＭｅＰｈｅ（３−Ｃｌ）−ＯＨ）（１．６ｇ、４７％）を得た。
窒素雰囲気下、（Ｓ）−３−（３−クロロフェニル）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）プロパン酸（Ｐｅｎ−ＭｅＰｈｅ（３−Ｃｌ）−ＯＨ）（１．０ｇ、３．３８ｍｍｏｌ）、Ｎ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．８７ｇ、６．７６ｍｍｏｌ）、２−ブロモアセトニトリル（１．６２ｇ、１３．５１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１００ｍＬ）を室温で１６時間攪拌した後、エバポレーターで溶媒を留去することで得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）で精製することで、（Ｓ）−３−（３−クロロフェニル）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）プロパン酸シアノメチル（Ｐｅｎ−ＭｅＰｈｅ（３−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（０．７ｇ、７２％）を得た。
緩衝液Ａ（８６．４ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（１５０ｍｇ、０．２０８ｍｍｏｌ）の水溶液（４．６９ｍＬ）、（Ｓ）−３−（３−クロロフェニル）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）プロパン酸シアノメチル（Ｐｅｎ−ＭｅＰｈｅ（３−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（２．３ｍＬ）を加え、室温で２時間撹拌した後、反応液を凍結乾燥した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製した後、得られた混合物に８０％酢酸水溶液（３．０ｍＬ）を加え、室温で４時間撹拌した。反応液を水で希釈し、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ２３３、Ｐｅｎ−ＭｅＰｈｅ（３−Ｃｌ）−ｐＣｐＡ）（４５．１ｍｇ、２３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ９３０ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−３−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）プロパン酸（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ２３４、Ｐｅｎ−Ｐｈｅ（４−ＣＦ３）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
フィルター付きの反応容器に２−クロロトリチルレジン（１５ｇ、１．６０ｍｍｏｌ／ｇ）、ジクロロメタンを加え１０分間振とうしレジンを膨潤させた。ジクロロメタンを除いたのち、市販の（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）プロパン酸（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＣＦ３）−ＯＨ）（５．０ｇ、１０．９８ｍｍｏｌ）、Ｎ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（７．０９ｇ、５４．８４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１００ｍＬ）を加え室温で３時間振とうした後、ジクロロメタン溶液を除去し、ジクロロメタンでレジンを４回洗浄した。２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミド溶液（８０ｍＬ）を加え、室温で３時間振とうした後に溶液を除去し、ジメチルホルムアミドで４回レジンを洗浄した。４−ペンテン酸（２．５２ｇ、２５．１７ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）（３．４３ｇ、２５．２０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ´−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（３．４９ｇ、２７．６５ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液（８０ｍＬ）を加え室温で３時間振とうした後、溶液を除去し、ジメチルホルムアミドで４回、ジクロロメタンで４回レジンを洗浄した。２％トリフルオロ酢酸／ジクロロメタン溶液（８０ｍＬ）を加え室温で３０分間振とうし、溶液をろ過することでレジン上から切り出した。この操作を３回繰り返し、得られたろ液を濃縮することで、（Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−３−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）プロパン酸（Ｐｅｎ−Ｐｈｅ（４−ＣＦ３）−ＯＨ）（１．６ｇ）を粗生成物として得た。
窒素雰囲気下、（Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−３−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）プロパン酸（Ｐｅｎ−Ｐｈｅ（４−ＣＦ３）−ＯＨ）（２．６０ｇ、８．２５ｍｍｏｌ）、Ｎ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（３．６１ｇ、０．０３ｍｏｌ）、２−ブロモアセトニトリル（４．００ｇ、３３．３５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（４０ｍＬ）を室温で１６時間攪拌した後、エバポレーターで溶媒を留去することで得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）で精製することで、（Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−３−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）プロパン酸シアノメチル（Ｐｅｎ−Ｐｈｅ（４−ＣＦ３）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１．６ｇ、５５％）を得た。
緩衝液Ａ（８６．４ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（１５０ｍｇ、０．２０８ｍｍｏｌ）の水溶液（４．６９ｍＬ）、（Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−３−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）プロパン酸シアノメチル（Ｐｅｎ−Ｐｈｅ（４−ＣＦ３）−ＯＣＨ２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（２．３ｍＬ）を加え、室温で１時間３０分撹拌した後、反応液を凍結乾燥した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製した後、得られた混合物に８０％酢酸水溶液（３．０ｍＬ）を加え、室温で５時間撹拌した。反応液を水で希釈し、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ２３４、Ｐｅｎ−Ｐｈｅ（４−ＣＦ３）−ｐＣｐＡ）（５８．９ｍｇ、３０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ９５０ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
Ｎ−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−モルホリノエチル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ２３５、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｓｅｒ（Ｅｔ−２−Ｍｏｒ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−モルホリノエチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１９１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｅｔ−２−Ｍｏｒ）−ＯＨ）の合成中間体であるＯ−（２−モルホリノエチル）−Ｌ−セリンの塩酸塩（１．０ｇ、３．９４ｍｍｏｌ）と別途調整した炭酸（４−ニトロフェニル）４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（化合物ｐｃ１９６）（１．３９ｇ、３．２８ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド溶液（６．０ｍＬ）にトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）（１．６６ｇ、１６．４ｍｍｏｌ）を室温にて加え、１６時間撹拌した。反応液を逆相クロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）で精製することで、Ｎ−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−モルホリノエチル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ２３５、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｓｅｒ（Ｅｔ−２−Ｍｏｒ）−ＯＨ）（１．７ｇ、８５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ５０４ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９８分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ１３）
シアノメチルＮ−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−モルホリノエチル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ２３６、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｓｅｒ（Ｅｔ−２−Ｍｏｒ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−モルホリノエチル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ２３５、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｓｅｒ（Ｅｔ−２−Ｍｏｒ）−ＯＨ）（５００ｍｇ、０．９９３ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（２５６．６８ｍｇ、１．９８６ｍｍｏｌ）、２−ブロモアセトニトリル（４７６．４４ｍｇ、３．９７２ｍｍｏｌ）、触媒量のジメチルホルムアミドのジクロロメタン溶液（１０ｍＬ）を室温にて４時間撹拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）で精製することで、シアノメチルＮ−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−モルホリノエチル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ２３６、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｓｅｒ（Ｅｔ−２−Ｍｏｒ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１４０ｍｇ、２５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ５４３ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．０２分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ１３）
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イルＮ−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−モルホリノエチル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ２３７、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｓｅｒ（Ｅｔ−２−Ｍｏｒ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（１００ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（２５０ｍｇ、０．３４６３ｍｍｏｌ）の水溶液（２．０ｍＬ）を加えた後、シアノメチルＮ−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−モルホリノエチル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ２３６、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｓｅｒ（Ｅｔ−２−Ｍｏｒ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１２０ｍｇ、０．２０７８ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（４．０ｍＬ）をシリンジポンプを用いて１５分かけて加えた。反応液を室温にて２時間撹拌した後、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１．８４ｍＬ）を加え、逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ２３７、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｓｅｒ（Ｅｔ−２−Ｍｏｒ）−ｐＣｐＡ）（３５ｍｇ、９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ １１３６（Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．４０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ）−１−（ペンタ−４−エノイル）ピペリジン−２−カルボン酸（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ２３８、Ｐｅｎ−Ｐｉｃ（２）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
市販の（Ｓ）−ピペリジン−２−カルボン酸（Ｈ−Ｐｉｃ（２）−ＯＨ）（５．０ｇ、３８．７１ｍｍｏｌ）、文献記載（Organic Letters, 2011, 13, 4906）の方法で合成したペンタ−４−エン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（２３．０ｇ、１１６．２８ｍｍｏｌ）、炭酸水素ナトリウム（６．５ｇ、７７．５２ｍｍｏｌ）の１．４−ジオキサン／水溶液（６５ｍＬ／６５ｍＬ）を２５度で１６時間撹拌した。反応液を石油エーテル／酢酸エチル＝１／１で洗浄し、水層の液性がｐＨ＝３になるまで１Ｎ塩酸水溶液を加えた。得られた混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過を行った後、減圧濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール）にて精製し、（Ｓ）−１−（ペンタ−４−エノイル）ピペリジン−２−カルボン酸（Ｐｅｎ−Ｐｉｃ（２）−ＯＨ）（５．１８２ｇ）を得た。
上述の（Ｓ）−１−（ペンタ−４−エノイル）ピペリジン−２−カルボン酸（Ｐｅｎ−Ｐｉｃ（２）−ＯＨ）（５．１８２ｇ、４９．１５ｍｍｏｌ）、Ｎ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（６．３４ｇ、０．０３ｍｏｌ）、２−ブロモアセトニトリル（１１．７９ｇ、９８．２９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１１２ｍＬ）を２５度で１６時間攪拌した後、エバポレーターで溶媒を留去することで得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）で精製することで、（Ｓ）−１−（ペンタ−４−エノイル）ピペリジン−２−カルボン酸シアノメチル（Ｐｅｎ−Ｐｉｃ（２）−ＯＣＨ２ＣＮ）（４．０１８ｇ）を得た。
緩衝液Ａ（５０ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（１５０ｍｇ、０．２０８ｍｍｏｌ）の水溶液（１．０ｍＬ）、（Ｓ）−１−（ペンタ−４−エノイル）ピペリジン−２−カルボン酸シアノメチル（Ｐｅｎ−Ｐｉｃ（２）−ＯＣＨ２ＣＮ）（２０７ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（１．０ｍＬ）を加え、室温で７時間撹拌した後、トリフルオロ酢酸（１．１５ｍＬ）を加え、反応液を凍結乾燥した。得られた残渣に水を加え、酢酸エチルで２回洗浄し、水層を凍結乾燥した。得られた残渣をｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ＨＰＣＬにて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ２３８、Ｐｅｎ−Ｐｉｃ（２）−ｐＣｐＡ）（１７ｍｇ、１０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ８４４ （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．３９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｌ−フェニルアラニナート（化合物ｐｃ２３９、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｐｈｅ−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
市販のＬ−フェニルアラニン（Ｈ−Ｐｈｅ−ＯＨ）（４０ｍｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）、別途調整した炭酸（４−ニトロフェニル）４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（化合物ｐｃ１９６）（１２３ｍｇ、０．２９１ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド溶液（０．２５ｍＬ）にトリエチルアミン（３３．８μＬ、０．２４２ｍｍｏｌ）を加え、室温にて終夜撹拌した。反応液を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｐｈｅ−ＯＨ）（１０４．８ｍｇ、９６％）を得た。
上述の（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｐｈｅ−ＯＨ）（３０ｍｇ、０．０６７ｍｍｏｌ）、２−ブロモアセトニトリル（９．８２μＬ、０．１４７ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．３ｍＬ）にＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（１８．６１μＬ、０．１０７ｍｏｌ）を０度にて加え、５分撹拌した後、室温で終夜撹拌した。エバポレーターで溶媒を留去することでシアノメチル（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｌ−フェニルアラニナート（Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｐｈｅ−ＯＣＨ２ＣＮ）を粗生成物として得た。
緩衝液Ａ（４０ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（９７ｍｇ、０．１３４ｍｍｏｌ）、上述の粗生成物であるシアノメチル（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｌ−フェニルアラニナート（Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｐｈｅ−ＯＣＨ２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（２．０ｍＬ）を加え、室温で１時間３０分撹拌した後、０度にてトリフルオロ酢酸（２．０ｍＬ）を加え、室温で３０分撹拌した。反応液を逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ２３９、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｐｈｅ−ｐＣｐＡ）（２２．７ｍｇ、３１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ １０８３ （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．５２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イルＮ−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｌ−フェニルアラニナート（化合物ｐｃ２４０、Ｆ−Ｐｎａｚ−ＭｅＰｈｅ−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
市販のメチル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｈ−ＭｅＰｈｅ−ＯＨ）（４０ｍｇ、０．２２３ｍｍｏｌ）、別途調整した炭酸（４−ニトロフェニル）４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（化合物ｐｃ１９６）（１１４ｍｇ、０．２６８ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド溶液（０．２５ｍＬ）にトリエチルアミン（３１．１μＬ、０．２２３ｍｍｏｌ）を加え、室温にて終夜撹拌した。反応液を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、Ｎ−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆ−Ｐｎａｚ−ＭｅＰｈｅ−ＯＨ）（５７．１ｍｇ、５５％）を得た。
上述のＮ−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆ−Ｐｎａｚ−ＭｅＰｈｅ−ＯＨ）（３０ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）、２−ブロモアセトニトリル（６．０６μＬ、０．０９０ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．３ｍＬ）にＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（１８．０５μＬ、０．１０３ｍｏｌ）を０度にて加え、５分撹拌した後、室温で２時間撹拌した。反応液に２−ブロモアセトニトリル（６．０６μＬ、０．０９０ｍｍｏｌ）をさらに加え、室温にて終夜撹拌した。エバポレーターで溶媒を留去することでシアノメチルＮ−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｌ−フェニルアラニナート（Ｆ−Ｐｎａｚ−ＭｅＰｈｅ−ＯＣＨ２ＣＮ）を粗生成物として得た。
緩衝液Ａ（４０ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（９４ｍｇ、０．１３０ｍｍｏｌ）、上述の粗生成物であるシアノメチルＮ−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｌ−フェニルアラニナート（Ｆ−Ｐｎａｚ−ＭｅＰｈｅ−ＯＣＨ２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（２．０ｍＬ）を加え、室温で２時間３０分撹拌した後、０度にてトリフルオロ酢酸（２．０ｍＬ）を加え、室温で３０分撹拌した。反応液を逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ２４０、Ｆ−Ｐｎａｚ−ＭｅＰｈｅ−ｐＣｐＡ）（２１．５４ｍｇ、３０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ １０９７ （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．５４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸（化合物ｐｃ２４１、Ｐｅｎ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
ジクロロメタン（２０ｍＬ）に２−クロロトリチルレジン（１．６０ｍｍｏｌ／ｇ、３．２１ｇ）を加え１０分間振とうしレジンを膨潤させた。ジクロロメタンを除いたのち、市販の（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸（Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＨ）（２．００ｇ、５．１５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（１．３３ｇ、１０．３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３３ｍＬ）を加え室温で３０分間振とうした後、メタノール（２．７８ｍＬ）を加えさらに１時間振とうした。ジクロロメタン溶液を除去した後、ジクロロメタン（１５ｍＬ）でレジンを２回洗浄し、化合物ｐｃ２４１＋＋＋を得た。得られた化合物ｐｃ２４１＋＋に対して、２％１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ）／ジメチルホルムアミド溶液（２０ｍＬ）を加え室温で１５分振とうした後に溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）で５回レジンを洗浄し、化合物ｐｃ２４１＋＋（２．３５ｇ、５．１４ｍｍｏｌ）を得た。得られた化合物ｐｃ２４１＋＋に対して、４−ペンテン酸（２．０６ｇ、２０．６ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）（２．１０ｇ、１５．４ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ´−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（３．２４ｇ、２５．７ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液（２０ｍＬ）を加え室温で終夜振とうした。溶液を除去しジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）で４回、ジクロロメタン（２０ｍＬ）で４回レジンを洗浄し、化合物ｐｃ２４１＋（２．７６ｇ、５．１２ｍｍｏｌ）を得た。得られた化合物ｐｃ２４１＋に対してジクロロメタン（３０ｍＬ）を加え１５分間振とうしレジンを膨潤させた。ジクロロメタンを除いたのち２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）（５０ｍＬ）／ジクロロメタン（５０ｍＬ）を加え室温で２時間半振とうし、化合物ｐｃ２４１のレジン上から切り出した。切り出し液ＴＦＥ／ＤＣＭ（１００ｍＬ）を除去し、さらにＴＦＥ（３０ｍＬ）／ＤＣＭ（３０ｍＬ）でレジンを２回洗浄した。この洗浄液（計６０ｍＬ）と先ほどの切り出し液（１００ｍＬ）を合わせエバポレーターで留去し得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸（化合物ｐｃ２４１、Ｐｅｎ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＨ）（５６４ｍｇ、４４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ２４７（Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．３３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸シアノメチル（化合物ｐｃ２４２、Ｐｅｎ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸（化合物ｐｃ２４１、Ｐｅｎ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＨ）（１００ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（１０６μＬ、０．６０ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（１．００ｍＬ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（２８．１μＬ、０．４０ｍｍｏｌ）を室温で加え室温で３０分攪拌した後Ｎ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（３５μＬ、０．２０ｍｍｏｌ）及び２−ブロモアセトニトリル（８．４３μＬ、０．１２ｍｍｏｌ）を再び加えた。室温で１０分撹拌した後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、ｔ−ブチルメチルエーテルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥後エバポレーターで溶媒を留去し、粗生成物（Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸シアノメチル（化合物ｐｃ２４２、Ｐｅｎ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＣＨ２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル（０．５７ｍＬ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ２８８ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（２Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ２４３、Ｐｅｎ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
緩衝液Ａ（１７ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（５９．２ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ）を溶解させ、（Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸シアノメチル（化合物ｐｃ２４２、Ｐｅｎ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＣＨ２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（０．５７ｍＬ）を投与し、室温で６０分撹拌した。反応液に酢酸（１７ｍＬ）を加え１時間撹拌したのちに、反応液を逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ２４３、Ｐｅｎ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ｐＣｐＡ）（１４．８ｍｇ、２０．５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ８９６ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３９、０．４１分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ６）
（Ｓ）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸（化合物ｐｃ２４４、Ｐｅｎ−ＭｅＡｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
フィルター付きの反応容器に２−クロロトリチルレジン（１．３１ｇ、１．６０ｍｍｏｌ／ｇ）、ジクロロメタン（１５ｍＬ）を加え１０分間振とうしレジンを膨潤させた。ジクロロメタンを除いた後、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸（化合物ａａ１９７、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＨ）（８４６．６ｍｇ、２．１０４ｍｍｏｌ）、Ｎ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（８１６ｍｇ、６．３１１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２５ｍＬ）を加え室温で３０分間振とうした後、メタノール（１．７０４ｍＬ）を用いてレジンの未反応の部分をキャッピングした。ろ過を行い、ジクロロメタンでレジンを４回洗浄した。ジメチルホルムアミドでレジンを洗浄した後、２％１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ）／ジメチルホルムアミド溶液（１５ｍＬ）を加え、室温で１５分間振とうした後に溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）で５回レジンを洗浄した。４−ペンテン酸（０．８４１ｇ、８．４０ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）（０．８５８ｇ、６．３０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ´−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（１．３２５ｇ、１０．５０ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液（１５ｍＬ）を加え、室温で終夜振とうした後、溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（１５ｍＬ）で４回、ジクロロメタン（１５ｍＬ）で４回レジンを洗浄した。２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）／ジクロロメタン溶液（１／１、５０ｍＬ）を加え室温で２時間３０分間振とうし、溶液をろ過することでレジン上から切り出した後、レジンを２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）／ジクロロメタン溶液（１／１、３０ｍＬ）で２回洗浄した。得られたろ液を濃縮し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製することで、（Ｓ）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸（化合物ｐｃ２４４、Ｐｅｎ−ＭｅＡｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＨ）（１９６．２ｍｇ、３６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ＝ ２６３ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸（２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｐｃ２４５、Ｐｅｎ−ＭｅＡｌａ（３−Ｐｙｒ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、（Ｓ）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸（化合物ｐｃ２４４、Ｐｅｎ−ＭｅＡｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＨ）（１９６．２ｍｇ、０．７４８ｍｍｏｌ）、２−ブロモアセトニトリル（５２．２μＬ、０．７４８ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液（１．８７ｍＬ）にＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（１９６μＬ、１．１２２ｍｏｌ）を室温にて加え、３０分攪拌した。反応液にさらに２−ブロモアセトニトリル（１０．４３μＬ、０．１５０ｍｍｏｌ）、Ｎ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（４０μＬ、０．２２９ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１５分撹拌した。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した後、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。得られた有機溶媒を減圧下濃縮することで、（Ｓ）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸シアノメチル（Ｐｅｎ−ＭｅＡｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＣＨ２ＣＮ）を粗生成物として得た。
緩衝液Ａ（３７．１４ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（１３４ｍｇ、０．１８６ｍｍｏｌ）の水溶液（２．０ｍＬ）、上述の粗生成物である（Ｓ）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸シアノメチル（Ｐｅｎ−ＭｅＡｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＣＨ２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（１．０ｍＬ）を滴下しながら加え、室温で１時間撹拌した後、反応液に酢酸（３７．１ｍＬ）を加え、さらに室温で２時間３０分撹拌した。反応液を水で希釈し、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｐｃ２４５、Ｐｅｎ−ＭｅＡｌａ（３−Ｐｙｒ）−ｐＣｐＡ）（４２ｍｇ、２５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ ８９５ （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．４１分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ６）
メチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ２４６、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＭｅ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、３，３，３−トリフルオロプロパン−１，２−ジオール（５００ｍｇ、３．８５ｍｍｏｌ）と（Ｓ）−アジリジン−１，２−ジカルボン酸２−メチル１−ベンジル（Ｃｂｚ−Ａｚｙ−ＯＭｅ）（６０３ｍｇ、２．５６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（７ｍＬ）に０度にて三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（ＢＦ３・ＯＥｔ２）（５４．７ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を加えた後、反応液を０度にて３０分撹拌した。反応液をジクロロメタンで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過を行った後、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）で精製することで、メチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ２４６、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＭｅ）（２５０ｍｇ、２７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝３６６（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．１３分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ３９）
Ｎ−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｏ−（３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ２４７、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
塩化カルシウム（９１１ｍｇ、８．２１ｍｍｏｌ）と水酸化リチウム（５７ｍｇ、２．１９ｍｍｏｌ）の水溶液（２．３ｍＬ）にイソプロパノール（９ｍＬ）、メチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ２４６、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＭｅ）（２００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（２．３ｍＬ）を加え、反応液を室温にて２時間撹拌した。反応液に１Ｍ塩酸水溶液を加え、酢酸エチルで２回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、ろ過を行い、減圧下溶媒を留去することで、粗生成物としてＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＨ）（３４６ｍｇ）を得た。
水素雰囲気下、得られた粗生成物であるＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＨ）（３００ｍｇ、０，８５ｍｍｏｌ）と１０％Ｐｄ／Ｃ（１５０ｍｇ）のメタノール混合液（７ｍＬ）を室温にて１６時間撹拌した後、ろ過を行い、得られた溶液を減圧下溶媒留去することで粗生成物としてＯ−（３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（Ｈ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＨ）（４９ｍｇ）を得た。
窒素雰囲気下、上述の方法で得た、粗生成物であるＯ−（３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（Ｈ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＨ）（５００ｍｇ、２．３０ｍｍｏｌ）、炭酸−（４−ニトロフェニル）−４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（化合物ｐｃ１９６）（８１４ｍｇ、１．９２ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（３８８ｍｇ、３．８４ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド溶液（２．５ｍＬ）を室温にて１６時間撹拌した。反応液を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）で精製することで、Ｎ−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｏ−（３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ２４７、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＨ）（７２６ｍｇ、７５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝５０３（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：２．０５分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ４８）
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イルＮ−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｏ−（３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ｐｃ２４８、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2018225864
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｏ−（３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ｐｃ２４７、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＨ）（５００ｍｇ、０．９９５ｍｍｏｌ）、２−ブロモアセトニトリル（４７７．４９ｍｇ、３．９８１ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（３８５．８６ｍｇ、２．９８６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２０ｍＬ）室温にて１６時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた粗生成物を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製し、シアノメチルＮ−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｏ−（３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリナート（Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１５０ｍｇ、２８％）を得た。
緩衝液Ａ（１００ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０３）（４００ｍｇ、０．５５４ｍｍｏｌ）を加えた後、シアノメチルＮ−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｏ−（３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリナート（Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１４９．８８ｍｇ、０．２７７ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．５ｍＬ）をシリンジポンプを用いて１５分以上かけて加えた。反応液を室温で３０分撹拌した後、トリフルオロ酢酸（２．３ｍＬ）を加えた。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）で精製し、表題化合物（化合物ｐｃ２４８、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ｐＣｐＡ）（４６．１ｍｇ、７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ １１３７ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
２−１−２．ＡＲＳによる翻訳合成に用いるためのアミノ酸の調整
ＡＲＳによる翻訳合成に用いるためのアミノ酸、Ｈ−Ｐｈｅ（４−ＯＣＨＦ２）−ＯＨはＡＳＩＢＡ ＰＨＡＲＭＴＥＣＨ社より購入した。Ｈ−Ｇｌｎ（Ｍｅ）−ＯＨ（化合物ａａ３０）は以下の通り合成した。
Ｎ５−メチル−Ｌ−グルタミン（化合物ａａ３０、Ｈ−Ｇｌｎ（Ｍｅ）−ＯＨ）の合成
Figure 2018225864
Ｎ２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ５−メチル−Ｌ−グルタミン（化合物ａａ９８、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｍｅ）−ＯＨ）（２１０ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（ＤＣＭ）（１．５０ｍＬ）に溶解し、室温にて４−（３−フェニルプロピル）ピペリジン（０．２３３ｍＬ、１．１０ｍｍｏｌ）を加え、４時間３０分撹拌した。反応液に水を加え、逆相カラムクロマトグラフィーで精製し、Ｎ５−メチル−Ｌ−グルタミン（化合物ａａ３０、Ｈ−Ｇｌｎ（Ｍｅ）−ＯＨ）（７８ｍｇ、８９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ＝ １６１ （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．１５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
２−２．アシル化ｔＲＮＡの合成
特許文献（ＷＯ２０１３／１００１３２）に記載の手法でパニングに使用するアシル化ｔＲＮＡを調製した。使用したtRNA(CA欠損)の塩基配列を表７に示した。表８に示すＥｌｏｎｇａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡをそれぞれ調製した。以降、翻訳で使用する際には、最終濃度が２０μＭとなるよう翻訳液を調製した。
Figure 2018225864
Figure 2018225864
Figure 2018225864
*tRNA Glu UAG RNA塩基配列 CUAコドン用：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUuagACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGCCA（配列番号：２）
２−３．ペプチド化合物の翻訳合成
様々なアミノ酸によりアミノアシル化されたｔＲＮＡを、無細胞翻訳系に加えて翻訳を開始することにより、所望の非天然アミノ酸を含有するペプチド化合物の翻訳合成を行った。翻訳系は、原核生物由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、翻訳液（１ｍＭ ＧＴＰ，１ｍＭ ＡＴＰ，２０ｍＭ クレアチンリン酸，５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．６，１００ｍＭ 酢酸カリウム，１０ｍＭ 酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．１ｍＭ １０−ＨＣＯ−Ｈ４ｆｏｌａｔｅ，０．６μＭ メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ，０．２６μＭ ＥＦ−Ｇ，０．２４μＭ ＲＦ２，０．１７μＭ ＲＦ３，０．５μＭ ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ 無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ ＩＦ１，０．４μＭ ＩＦ２，１．５μＭ ＩＦ３，４０μＭ ＥＦ−Ｔｕ，２８μＭ ＥＦ−Ｔｓ，１．２μＭ リボソーム，０．７３μＭ ＡｌａＲＳ，０．０３μＭ ＡｒｇＲＳ，０．３８μＭ ＡｓｎＲＳ，０．１３μＭ ＡｓｐＲＳ，０．０２μＭ ＣｙｓＲＳ，０．０６μＭ ＧｌｎＲＳ，０．２３μＭ ＧｌｕＲＳ，０．０９μＭ ＧｌｙＲＳ，０．０２μＭ ＨｉｓＲＳ，０．４μＭ ＩｌｅＲＳ，０．０４μＭ ＬｅｕＲＳ，０．１１μＭ ＬｙｓＲＳ，０．０３μＭ ＭｅｔＲＳ，０．６８μＭ ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ ＰｒｏＲＳ，０．０４μＭ ＳｅｒＲＳ，０．０９μＭ ＴｈｒＲＳ，０．０３μＭ ＴｒｐＲＳ，０．０２μＭ ＴｙｒＲＳ，０．０２μＭ ＶａｌＲＳ）に、鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１２）、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ならびにアミノアシル化ｔＲＮＡを翻訳反応混合物に添加し、３７℃で３０分から１時間静置することで行った。翻訳産物はマトリックスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を用いてＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを測定して同定した。
２−４．非天然アミノ酸を含むペプチド化合物の翻訳合成
１μＭの鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１２）に、各０．２５ｍＭのＬｅｕを除く１９種類のタンパク質を構成するアミノ酸（Ａｌａ，Ａｒｇ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｃｙｓ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ、Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，ＴｙｒおよびＶａｌ）、２０μＭのアシル化ｔＲＮＡを含む前述の転写翻訳液、Ｆ−Ｐｎａｚ保護を持つ非天然アミノ酸を翻訳する場合は０．５μＭ大腸菌由来ペニシリンＧアミダーゼ（ＰＧＡ）を加え、３７℃で６０分間保温した。なお、Ｐｈｅ（４−ＯＣＨＦ２）を評価するときは、アミノアシルｔＲＮＡは加えず、Ｐｈｅのアミノ酸を除き、かわりにＰｈｅ（４−ＯＣＨＦ２）を１ｍＭとなるように添加した。得られた翻訳反応物を、ＳＥＰ Ｃ−ＴＩＰ（日京テクノス社）で精製し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析した。その結果、非天然アミノ酸を含むペプチド化合物の分子量を示すマススペクトル（ＭＳ）が主生成物として観測された（図３〜図６）。鋳型ｍＲＮＡと期待される翻訳ペプチド化合物（配列番号：１１）、その分子量（計算値）に関しては、以下の表９（個別翻訳）に記載した。
Figure 2018225864
Figure 2018225864
実施例３ Caco-2細胞を用いた膜透過性測定法の改良法の確立
（１）細胞培養
Caco-2細胞 (CACO-2 Lot No.028；Riken BRC Cell Bank) を24wellのトランスウエル (Corning HTS Transwell、pore size 0.4 μm、 polycarbonate membrane) の膜上に1.0 × 105 cells/wellの濃度で播種し、温度37℃、5% CO2に維持されたインキュベータ内で、10% FBS、ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン (100x) 、L-グルタミン塩化ナトリウム溶液及びNon-essenntial amino acid (Neaa) を含むDMEM培地で培養した。培地は2〜3日ごとに交換し、播種後21〜23日目にCaco-2細胞を膜透過性測定に供した。
（２）プレインキュベーション
膜透過性測定法の改良法として長時間のインキュベーションを実施するために、各種バッファーを用いてインキュベーション時間が細胞に与える影響について、transepithelial electric resistance (TEER) を評価する事で検討した。
膜透過性測定法の従来法（Artursson, P., 2001. Adv Drug Deliv Rev 46, 27-43., Mason, A.K., 2013. Drug Metab Dispos 41, 1347-1366., Polli, J.W., 2001. J Pharmacol Exp Ther 299, 620-628., Sun, H. 2008. Expert Opin Drug Metab Toxicol 4, 395-411.）に準じて、Apical側にfasted state simulated intestinal and stomach fluids (FaSSIF) (with 1%DMSO)、Basal側にHanks' Balanced Salt Solutions (HBSS) (with 4% BSA) を添加し、37℃でインキュベーションした結果、3時間のインキュベーションで、TEERは30%以上低下する事が分かった。このことから従来法では3時間を超えてインキュベーションすることは不可能で、ラグタイムの大きい化合物は従来法では評価できないことが明らかとなった（図７）。
次に、長時間のインキュベーションを実施するため、培地（DMEM）中でのインキュベーション時間（0, 2, 4, 6, 8, 24hr）が細胞に与える影響を各時間のTEERを測定する事で評価した。その結果、Apical側にDMEM+FaSSIF (1%DMSO, 2% ジメチルアセトアミド(DMA))、Basal側にDMEMを添加する事で24時間のあいだTEERがほとんど低下しない事が示された。この結果から、Apical側にDMEM+FaSSIF (1%DMSO, 2%DMA)、Basal側にDMEMの条件で、24時間のインキュベーションを実施する事が可能であると分かった（図８）。
（３）プレインキュベーション後の膜透過性評価
環状ペプチドであるシクロスポリン（化合物A）とその他の環状ペプチド（化合物B〜H）を被験物質として、前記（２）で確立したプレインキュベーションの後に、従来法に準じてApical側からBasal側への膜透過性試験 (AtoB試験) を行った。プレインキュベーションは、Caco-2細胞を前記（１）に従い3週間培養した後に行った。すなわち、前記（２）に従いApical側にDMEM+FaSSIF (1%DMSO, 2%DMA)＋被験物質、Basal側にDMEMの条件で、24時間プレインキュベーションした。プレインキュベーション後のAtoB試験は、Apical側及びBasal側のプレインキュベーション溶液を吸引除去し、Apical側に被験物質を含むFaSSIF/HBSS (with 1%DMSO, 2% DMA) (pH6.0)を、Basal側にHBSS (4%BSA) (pH 7.4) を添加し開始した。各wellは37℃を維持するように加温しながら、220 rpmで振盪した。開始30、60、90、120分後にBasal側のサンプルを採取し、LC/MSで透過量を測定した。その透過量から膜透過係数 (Papp) を算出した。
吸収率 (Fa) の算出は環状ペプチドであるシクロスポリンとその他の環状ペプチドについてマウスにおける静脈内ならびに経口投与後の血漿中濃度及び糞中排泄率を評価し、実施した。雄性マウス（C57BL/6J、6週齢、日本クレア社製）に化合物を静脈内ならびに経口投与し、投与後24時間までの血液を抗凝固剤としてヘパリン処理済みのヘマトクリット管を用い、背中足静脈より経時的に採取し、糞を72時間まで採取した。測定はLC/MS/MS装置（API3200、AB SCIEX社製）を用いて実施した。得られた血漿中及び糞中薬物濃度より、吸収率 (Fa) を算出した（Qingqing X., et al 2016, Xenobiotica. 46, 913-921.）。
ほとんどの被験物質において、改良法（長時間のプレインキュベーションを行う方法）により算出された膜透過係数は、従来法のそれと比較して大きかったことから、従来法では膜透過係数が過小評価されていることが明らかとなった。特に、従来法で膜透過係数が1.0×10-8cm/秒より小さく評価できなかった化合物Hは、改良法では3×10-7cm/秒となり、膜透過係数が小さい化合物において大きく変動した。また、化合物のFaと膜透過係数との相関は、従来法（Preincubation (-)）と比較して改良法（Preincubation (+)）の方がよくなる傾向が確認された（表１０、図９、図１０）。したがって、前記の改良法により膜透過性測定を行うことで、被験物質の吸収率を予測することができることが示された。改良法により測定した膜透過係数が1.0×10-6cm/秒以上の化合物において、Faが0.3以上であったことから、膜透過性の高いペプチド化合物（例えば経口薬として開発可能なレベルの膜透過性を有するペプチド化合物）を選択するための基準の一つとして「膜透過係数（Papp）≧1.0×10-6cm/秒」を使用することができると考えられた。
Figure 2018225864
以下の実施例における膜透過性の測定は、上記により確立した改良法に準じて行った。すなわち、Caco-2細胞を96 wellトランスウェル上に3週間培養した後に、Apical側にDMEM+FaSSIF (1%DMSO)＋化合物、Basal側にDMEMを添加し、5% CO2, 37℃, 80 rpmで、20〜24時間プレインキュベーションを実施した。プレインキュベーション後、Apical側及びBasal側のプレインキュベーション溶液を吸引除去・洗浄し、Apical側に化合物を含むFaSSIF/HBSS buffer (1% DMSO) (pH6.0)を、Basal側にHBSS buffer (4％BSA) (pH 7.4) を添加し、膜透過性の測定を開始した。各wellは5% CO2, 37℃, 80 rpmで振盪し、開始180分後にBasal側のサンプルを採取し、LC/MSで透過量を測定した。その透過量から膜透過係数（Papp）を算出した。なお、本明細書の表中のカラムにおける「Caco-2 (cm/sec)」との記載は、「Papp (cm/秒)」と同義で使用している。
実施例４ 標的結合ペプチド化合物のパニング（試験管内選択）
４−１．アシル化ｔＲＮＡの合成
特許文献（ＷＯ２０１３／１００１３２）に記載の手法でパニングに使用するアシル化ｔＲＮＡを調製した。使用したtRNA(CA欠損)の塩基配列を表１１に示した。表１２に示すＥｌｏｎｇａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ混合物を調製した。以降、翻訳で使用する際には、表１２に示す最終濃度となるよう翻訳液を調製した。Ａｃｂｚ保護のｐＣｐＡアミノ酸は、ヨウ素による脱保護の代わりに、最終濃度４２ｍＭとなるようにＴＣＥＰを添加し、室温で４５分間脱保護を行ったのち、フェノール抽出以降の作業を行った。Ｐｎａｚ保護のｐＣｐＡアミノ酸は、脱保護を実施せずにフェノール抽出以降の作業を行った。Ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡの調製は、ライゲーション反応後、脱保護を実施せずにフェノール抽出以降の作業を行った。表１３に示す三種類を個別に調製し、翻訳で使用する際にもいずれか一つを表に示す最終濃度で翻訳液に添加した。
Figure 2018225864
Figure 2018225864
Figure 2018225864
４−２．ペプチド化合物ライブラリをコードするランダム化された二本鎖ＤＮＡライブラリ
特許文献（ＷＯ２０１３／１００１３２）に記載の手法で、DNAライブラリを構築した。膜透過性の低い長い側鎖のアミノ酸を含むパニングのうち、ｉＳＰ用として、TTT, TTG, CTA, ATT, GTT, CCG, ACT, GCT, TAC, CAT, CAG, TGG, CGG, AGT, AGG, GGTのいずれかのコドンがランダムに9回繰り返しで出現するもの、ｉＲＴ用として、CTT, CTA , ATT, ATG, GTT, ACT, TAC, CAG, TGG, AGT, GGT, TTT, TTG , CCG , GCT, TAG, CAT, AAC, GAA, CGG, AGGのいずれかのコドンが9回繰り返しで出現するもの、および、膜透過性の高い長い側鎖のアミノ酸評価パニング用として、ランダム領域のトリプレットが8回ないし9回繰り返しで出現するものを用意した。
４−３．ビオチン化標的タンパク質の調製
パニングに使用する標的タンパク質として、ＧＴＰａｓｅ ＫＲａｓ（ＫＲＡＳ）、Ｄｕａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ １（ＭＥＫ１）、Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ３（ＥＲＫ１）、インターロイキン６受容体（ＩＬ−６Ｒ）を用いた。ＫＲＡＳ、ＥＲＫ１、ＩＬ−６Ｒのビオチン化は非特許文献BMC biotechnology, 2008,8,41、及び非特許文献Protein Science,1999,8,921-929の方法を用いた。ＩＬ−６Ｒの調製は非特許文献J Biochem. 1990;108(4):673-6.に従って行った。ＥＲＫ１の調製はBiochem Biophys Res Commun. 2008 Dec 26;377(4):1123-7.の方法に準じ行った。ＭＥＫ１はカルナバイオサイエンス社よりビオチン化されたａｃｔｉｖｅ体（Product Number: 07-441-20N）を購入した。ＫＲＡＳは、大腸菌で発現・精製したものを使用した。
４−４．パニングに使用する翻訳液
膜透過性の低い長い側鎖のアミノ酸を含むパニングに使用した翻訳液は以下の組成で構成される。１ｍＭのＧＴＰ，１ｍＭのＡＴＰ，２０ｍＭのクレアチンリン酸，５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．６，１００ｍＭの酢酸カリウム，１０ｍＭの酢酸マグネシウム，２ｍＭのスペルミジン，１ｍＭのジチオスレイトール，０．５ｍｇ／ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），４μｇ／ｍｌのクレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌのミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌの無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌのヌクレオシド二リン酸キナーゼ，０．２６μＭのＥＦ−Ｇ，２．７μＭのＩＦ１，０．４μＭのＩＦ２，１．５μＭのＩＦ３，４０μＭのＥＦ−Ｔｕ，４４μＭのＥＦ−Ｔｓ，１．２μＭのリボソーム，２．７３μＭのＡｌａＲＳ，０．０９μＭのＧｌｙＲＳ，０．４μＭのＩｌｅＲＳ，０．５μＭの変異体ＰｈｅＲＳ０５（WO2016/148044），０．１６μＭのＰｒｏＲＳ，１μＭの変異体ＳｅｒＲＳ３７（WO2016/148044），０．０９μＭのＴｈｒＲＳ，０．０１μＭのＴｒｐＲＳ，０．０２μＭのＴｙｒＲＳ，１μＭの変異体ＶａｌＲＳ１３（WO2016/148044），０．１１μＭのＬｙｓＲＳ，０．３３μＭのＨｉｓＲＳ，３μＭのin vitro転写大腸菌ｔＲＮＡ Ａｌａ１Ｂ，３μＭの精製大腸菌ｔＲＮＡ Ｈｉｓ ＱＵＧ（Nucleic Acids Res. 2010 Apr;38(6):e89.の手法に習い精製。），２５０μＭのグリシン、２５０μＭのイソロイシン、２５０μＭのプロリン、２５０μＭのスレオニン、２５０μＭのトリプトファン、２５０μＭのリジン、５ｍＭのＮ−メチルバリン、５ｍＭのＮ−メチルセリン、５ｍＭのＮ−メチルアラニン、５ｍＭのＮ−メチルフェニルアラニン、２５０μＭの３−フルオロチロシン、５ｍＭのＮ−メチルヒスチジン、表１２に示すＥｌｏｎｇａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ混合物（膜透過性の低い長い側鎖のアミノ酸を含むパニング）。さらに、Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法（iＳＰ）を用いる場合は、Ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（表１３）のなかのいずれか一つを、Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ法（ｉＲＴ）を用いる場合は、２５０μＭのシステインおよび０．０２μＭのＣｙｓＲＳを加えて調製した。膜透過性の高い長い側鎖のアミノ酸評価パニング用の翻訳液は以下の組成で構成される。１ｍＭのＧＴＰ，１ｍＭのＡＴＰ，２０ｍＭのクレアチンリン酸，５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．６，１００ｍＭの酢酸カリウム，１０ｍＭの酢酸マグネシウム，２ｍＭのスペルミジン，１ｍＭのジチオスレイトール，１．０ｍｇ／ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），４μｇ／ｍｌのクレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌのミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌの無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌのヌクレオシド二リン酸キナーゼ，０．２６μＭのＥＦ−Ｇ，２．
７μＭのＩＦ１，０．４μＭのＩＦ２，１．５μＭのＩＦ３，４０μＭのＥＦ−Ｔｕ，４６μＭのＥＦ−Ｔｓ，１．２μＭのリボソーム，５．４６μＭのＡｌａＲＳ，０．０９μＭのＧｌｙＲＳ，０．５μＭの変異体ＰｈｅＲＳ０５（WO2016/148044），０．１６μＭのＰｒｏＲＳ，０．０９μＭのＴｈｒＲＳ，１μＭの変異体ＶａｌＲＳ１３（WO2016/148044），３μＭのin vitro転写大腸菌ｔＲＮＡ Ａｌａ１Ｂ，２５０μＭのグリシン、２５０μＭのプロリン、２５０μＭのスレオニン、５ｍＭのＮ−メチルバリン、５ｍＭのＮ−メチルアラニン、５ｍＭのＮ−メチルフェニルアラニン、表１２に示すＥｌｏｎｇａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ混合物（膜透過性の高い長い側鎖のアミノ酸評価パニング）、Ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（表１３）のＡｃｂｚ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ｔＲＮＡｆＭｅｔＣＡＵ。
４−５．パニングの実施
前述の二本鎖ＤＮＡライブラリと翻訳液を使用し、ＷＯ２０１３／１００１３２に倣ってパニングを実施した。膜透過性の高い長い側鎖のアミノ酸評価パニングでは、標的タンパク質とビオチンとの間にＴＥＶプロテアーゼ認識配列を導入し、ＴＥＶプロテアーゼによる溶出を行った。ペプチドライブラリをビオチン化タンパク質と相互作用させた後に、ストレプトアビジン固定化磁気ビーズで回収後、洗浄作業を行った後、ビーズにＴＥＶ溶出液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１Ｕ／μＬ ＡｃＴＥＶプロテアーゼ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、製品番号１２５７５０１５））を添加し、３０℃１０分間反応した。反応後、上清を回収しＰＣＲを行った。各パニングに使用したＮ末端のアミノ酸と標的の一覧を以下の表１４に示す。
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４−６．濃縮配列の解析
パニングの各ラウンドのＤＮＡプールの塩基配列解析を行い、ＵＰＧＭＡによる系統樹構築を行った。類似度マトリックスには、アミノ酸が一致する場合に１を、一致しない場合には０をあたえるものを用いた。プルーニングラインをリーフから０．２として、クラスタを分割した。さらに、最低１ラウンド以上で出現頻度が０．０５％を上回り、直前のラウンドのプールを分割し標的を添加せずにパニングした場合に比べ、標的を添加した場合に出現頻度が１０倍以上増加する配列を抽出した。クラスタごとに、ランダム領域の各アミノ酸グループ(長側鎖を有するアミノ酸、長側鎖を有しない芳香族アミノ酸、長側鎖を有しない非芳香族アミノ酸)の出現頻度を計算した。得られた全クラスタのアミノ酸出現頻度を合計しクラスタ数で割った値を、そのパニングにおける各アミノ酸グループの出現頻度とした。アミノ酸を以下の表１５「アミノ酸分類」に従い３つに分類し、パニングごとの出現頻度をまとめたものを表１６に示す。解析の結果、標的によらず長側鎖のアミノ酸の出現頻度が高い傾向があることが明らかとなった。このことから、標的分子に特異的に結合できる環状ペプチド化合物をスクリーニングする際に、長側鎖を有する環状ペプチド化合物を含むライブラリを用いることで、標的分子に特異的に結合できる環状ペプチド化合物のヒット率が向上し得ること、すなわちスクリーニングの効率を高め得ることが考えられた。
Figure 2018225864
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実施例５ 長側鎖を有する環状ペプチド化合物の膜透過性試験
上述のとおり、Trp、Tyr(3-F)、Phe(3-Cl)、MePhe(4-Cl)の側鎖のような長側鎖を有する環状ペプチド化合物が、標的分子と特異的に結合できるヒット化合物としてパニングにより濃縮されることが分かった。次に、これら側鎖を有する環状ペプチド化合物の膜透過性を前記の改良法により評価した。
５−１．Trpの側鎖を有する環状ペプチド化合物の膜透過性試験
Trpの側鎖を有する環状ペプチド化合物、及び同側鎖を有しない環状ペプチド化合物を合成し、改良法により膜透過性試験を行った。なお、MeTrpはTrpの側鎖を含むことから、構成アミノ酸にMeTrpを含む環状ペプチド化合物も、Trpの側鎖を有する環状ペプチド化合物に含まれる。その結果、Ｔｒｐの側鎖を持たない環状ペプチド化合物はＣｌｏｇＰを上昇させることによりＰａｐｐ≧１．０×１０−６ｃｍ／秒を達成することが可能であった（図１１）。一方、Ｔｒｐの側鎖を１つ以上有しているとＣｌｏｇＰを上昇させてもＰａｐｐ≧１．０×１０−６ｃｍ／秒まで膜透過性を上げるのは難しかった（図１２）。例えばＴｒｐ側鎖の位置、Ｎアルキルのパターンを変えたもので、１．０６≦ＣｌｏｇＰ／ｔｏｔａｌ ａａ≦１．４３の範囲にある環状ペプチド化合物の配列を表１７に示すが、これらはＰａｐｐ≧１．０×１０−６ｃｍ／秒の膜透過性を達成することは難しかった。
CｌｏｇＰはコンピューターで計算した分配係数であって、ＤａｙＬｉｇｈｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．社のＤａｙＬｉｇｈｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．９５を用いて計算した。なお、膜透過性評価を行ったペプチド配列（ｐｄ５０−ｐｄ７０、ｐｄ１００−ｐｄ２４７、およびｐｄ３００−ｐｄ５０４）の構造情報及び分析情報は下記表２６、表２７にまとめて記載した。
ｐｄ１００を例にとり、表１７のカラムについて説明する。交差ユニットの部分を1番目のアミノ酸と定義する。ｐｄ１００の場合ではＡｓｐが該当する。交差ユニット（Ａｓｐ）の隣で環状部を構成するアミノ酸を２番目のアミノ酸と定義し（ｐｄ１００の場合Ｔｈｒが該当）、以下３番目、４番目とＮ末端（▲ユニット）まで繰り返す（ｐｄ１００の場合３番目ＭｅＡｌａ、４番目ＭｅＧｌｙとなり、環状部が１１残基からなるためＮ末端（▲ユニット）は１１番目のＤ−Ｖａｌ）。またＣ−ｔｅｒｍのカラムはＣ末端のアミノ酸のカルボン酸部位と縮合する官能基を意味しており、ｐｉｐはＰｉｐｅｒｉｄｉｎｅを表し、ｐｙｒｒｏはＰｙｒｒｏｒｉｄｉｎｅを意味している。Ｃ−ｔｅｒｍがｎｏｎｅの場合は、Ｃ末端がカルボン酸のまま存在していることを表している（ｐｄ１００の場合、Ｃ末端のアミノ酸は交差ユニットであるＡｓｐであり、そのカルボン酸部位がｐｉｐ（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）と縮合した構造になる）。そして、▲ユニットと交差ユニットをアミド結合により環化させたペプチドであるということを表１７で表している。本文中に記載の環状ペプチド化合物に関しては特に記述が無い限り、全て同様の手法で表現している。なお、表１７に記載のすべての化合物で１番目と１１番目のアミノ酸残基が環状部を形成している。
Figure 2018225864
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以上のとおり、Ｔｒｐの側鎖を有する環状ペプチド化合物は、修飾によりClogP/total aaを上昇させても、膜透過性をＰａｐｐ≧１．０×１０−６ｃｍ／秒のレベルまで向上させることは困難であることが示された。
５−２．Tyr(3-F)又はTyrの側鎖を有する環状ペプチド化合物の膜透過性試験
Tyr(3-F)又はTyrの側鎖を有する環状ペプチド化合物を合成し、改良法により膜透過性試験を行った。その結果、Ｔｙｒ（３−Ｆ）又はＴｙｒの側鎖を有する環状ペプチド化合物もＴｒｐの側鎖を有する環状ペプチド化合物と同様の傾向であった。１．０６≦CｌｏｇＰ／ｔｏｔａｌ ａａ≦１．２９の範囲にある環状ペプチド化合物の配列を表１８に示すが、Ｔｒｐの場合と同様、これらがＰａｐｐ≧１．０×１０−６ｃｍ／秒を達成することは困難であった。
Figure 2018225864
５−３．Phe(3-Cl)、MePhe(4-Cl)、又はPhe(4-CF 3 )の側鎖を有する環状ペプチド化合物の膜透過性試験
Phe(3-Cl)、MePhe(4-Cl)、又はPhe(4-CF3)の側鎖を有する環状ペプチド化合物を合成し、改良法により膜透過性試験を行った。その結果、これら側鎖を有する環状ペプチド化合物の中には、ＣｌｏｇＰ／ｔｏｔａｌ ａａ≧１．１０の領域でＰａｐｐ≧１．０×１０−６ｃｍ／秒を達成するものが多数存在した。図１３にＰｈｅ（４−ＣＦ３）の例を示す。Ｐｈｅ（４−ＣＦ３）の側鎖を有する環状ペプチド化合物はCｌｏｇＰ／ｔｏｔａｌ ａａ≧１．１０の範囲で、Ｐａｐｐ≧１．０×１０−６ｃｍ／秒を達成可能であった（図１３）。
Ｐｈｅ（４−ＣＦ３）の側鎖を有する環状ペプチド化合物で１．１０≦CｌｏｇＰ／ｔｏｔａｌ ａａ≦１．５０の範囲でＰａｐｐ≧１．０×１０−６ｃｍ／秒であった環状ペプチド化合物の一部の配列を表１９に示す。
Figure 2018225864
Ｐｈｅ（３−Ｃｌ）の側鎖を有する環状ペプチド化合物もＰｈｅ（４−ＣＦ３）の側鎖を有する環状ペプチド化合物と同様の傾向であった。１．１７≦CｌｏｇＰ／ｔｏｔａｌ ａａ≦１．３１の範囲でＰａｐｐ≧１．０×１０−６ｃｍ／秒であった環状ペプチド化合物の一部の配列を表２０に示す。
Figure 2018225864
ＭｅＰｈｅ（４−Ｃｌ）の側鎖を有する環状ペプチド化合物もＰｈｅ（３−Ｃｌ）、又はＰｈｅ（４−ＣＦ３）の側鎖を有する環状ペプチド化合物と同様の傾向であった。１．２２≦ＣｌｏｇＰ／ｔｏｔａｌ ａａ≦１．３１の範囲でＰａｐｐ≧１．０×１０−６ｃｍ／秒であった環状ペプチド化合物の一部の配列を表２１に示す。
Figure 2018225864
以上より、Trp、Tyr、及びTyr(3-F)の側鎖を有する環状ペプチド化合物は、修飾を加えClogP/total aaを上昇させても、Papp≧1.0×10-6 cm/秒の基準を満たす環状ペプチド化合物を得ることは難しかった。一方、その他の長側鎖を有する環状ペプチド化合物は、修飾を加えClogP/total aaを上昇させることで、Papp≧1.0×10-6 cm/秒の基準を満たす化合物を多数得ることができた。
例えば、長側鎖を有するアミノ酸（Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）、ＭｅＳｅｒ（ｉＰｅｎ）、Ｈｐｈ、ＭｅＨｐｈ、Ｓｅｒ（ｎＰｒ）、Ｈｎｌ（７−Ｆ２）、Ｓｅｒ（Ｐｈ−２−Ｃｌ）、Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）、Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）、Ｓｅｒ（Ｆ（４）ｎＰｒ）、Ｈｐｈ（２−Ｃｌ）、Ｈｐｈ（３−Ｃｌ）、Ｈｐｈ（４−Ｃｌ）、Ｐｈｅ｛＃（ＣＨ２）２｝、Ｓｅｒ（Ｂｎ）、Ｈｙｐ（Ｅｔ）、ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ−３−Ｆ２）、ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）、Ａｌａ（３−Ｐｙｒ−４−ＮＭｅ２）、ｎＰｅｎＧｌｙ、ｎＨｅｘＧｌｙ、（ＰｈＥｔ）ＮＧｌｙ、（ＥｔＯＥｔ）ＮＧｌｙ、（ＰｈＯＥｔ）Ｇｌｙ、Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）、Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＨ）、Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−２−ＢｕＯＨ）、Ｇｌｎ（Ｍｅ２）、Ｓｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）、ＭｅＳｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）、Ｈｓｅ（Ｅｔ）、Ｎｌｅ（６−ＯＨ）、ＭｅＡｂｕ（Ｍｏｒ）、２−（（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−Ｅｔ）Ｇｌｙ、Ｐｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）、ｃｉｓＰｒｏ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）、Ｇｌｎ（Ｍｅ）、Ａｈｐ（２）（３−Ｒ−ＯＨ）、Ｌｙｓ（Ａｃ）、Ｐｈｅ（４−ＣＨＦ２）、Ｐｈｅ（４−ＯＣＨＦ２）、Ｓｅｒ（Ｅｔ−２−Ｍｏｒ）、Ａｂｕ（５−Ｏｘｏ−Ｏｄｚ）、Ｓｅｒ（ＥｔＯＨ）、Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）、Ｈｎｌ（７−Ｆ３−６−ＯＨ）、Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）を含む環状ペプチドの膜透過性評価したところ、１．１３≦ＣｌｏｇＰ／ｔｏｔａｌ ＡＡ≦１．３５の領域でＣａｃｏ−２≧１．０ｘ１０−６ｃｍ／ｓｅｃを達成することが可能であった。下記に配列情報の一部を示す。
Figure 2018225864
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必ずしも特定の理論に拘束されることを意図しないが、本発明者らは以下のように考える。上記の結果から、Trp、Tyr、又はTyr(3-F)のような側鎖を有する環状ペプチド化合物をヒット化合物として得たとしても、hit to leadにより膜透過性を高めることは難しいと考えられる。一方、その他の長側鎖であれば、パニングの際に標的分子との結合に寄与し得るし、これらの側鎖を有する環状ペプチド化合物は高い膜透過性を有し得るため、標的分子に特定的に結合でき、かつ、膜透過性の高い環状ペプチド化合物を得るために有用であると考えられる。
実施例６ 環状ペプチド中の芳香環の数（ＡＲＣ）が膜透過性に与える影響の評価
Ｐａｐｐ≧１．０×１０−６を達成するためには、環状ペプチド化合物の環状部の側鎖に含まれる芳香環の数（ＡＲＣ）が３以下であることが好ましいことが以下のデータより示された（図１４）。ＡＲＣが増加するにともなって環状ペプチド化合物のＰａｐｐが低下、すなわち膜透過性が低下する傾向があり、ＡＲＣが４以上になるとＰａｐｐ≧１．０×１０−６を達成するのは困難であった。
なお、本解析では、環状部の側鎖に縮環構造を有するもの、並びに置換及び無置換のヒドロキシフェニル基を有する環状ペプチド化合物を解析対象から除外した。ＡＲＣ＝３の場合、ＣｌｏｇＰ／ｔｏｔａｌ ＡＡが０．８８以上の配列で、１．０×１０−６以上のＰａｐｐが認められた。一方、ＡＲＣ＝４の場合は前記ＡＲＣ＝３の化合物群と同程度のＣｌｏｇＰ／ｔｏｔａｌ ＡＡ（０．８８以上）の化合物であっても、Ｐａｐｐが１．０×１０−６以上となるものはほとんど存在しなかった。このことから、同程度の脂溶性の配列群であるにも関わらず、ＡＲＣ＝３とＡＲＣ＝４を比較すると、ＡＲＣ＝３の方が良好な膜透過性を示すことが示された（表２３−１、表２３−２、表２４）。また、直鎖部１を含むペプチドであるｐｄ１９８を例にとり、表２３−１、表２３−２及び表２４のカラムについて説明する。前述した通り、交差ユニットの部分を1番目のアミノ酸と定義する。ｐｄ１９８の場合ではＡｓｐが該当する。交差ユニット（Ａｓｐ）の隣で環状部を構成するアミノ酸を２番目のアミノ酸と定義し（ｐｄ１９８の場合Pheが該当）、以下３番目、４番目とＮ末端（▲ユニット）まで繰り返す（ｐｄ１９８の場合３番目ＭｅVal、４番目ＭｅLeuとなり、環状部が１０残基からなるためＮ末端（▲ユニット）は１０番目のｇ−MeAbu）。また直鎖部１のアミノ酸を交差ユニット（ｐｄ１９８の場合はAsp）から近い順に、H-1、H-2、H-3で示している。ｐｄ１９８の場合H-1はMePhe、H-2はAlaであるので、直鎖部１は交差ユニットであるAspのC末端にMePheが結合しており、ついでAlaが結合していることを意味している。またＣ−ｔｅｒｍのカラムはＣ末端のアミノ酸のカルボン酸部位と縮合する官能基を意味しており、ｐｉｐはＰｉｐｅｒｉｄｉｎｅを表し、ｐｙｒｒｏはＰｙｒｒｏｒｉｄｉｎｅを意味している。Ｃ−ｔｅｒｍがｎｏｎｅの場合はＣ末端はカルボン酸のまま存在していることを表している（ｐｄ１９８の場合、Ｃ末端のアミノ酸はH-2のAlaであり、そのカルボン酸部位がｐｉｐ（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）と縮合した構造になる）。そして、▲ユニットと交差ユニットをアミド結合により環化させたペプチドであるということを表２３−１、表２３−２及び表２４で表している。本文中に記載の環状ペプチドに関しては特に記述が無い限り、全て同様の手法で表現している。
Figure 2018225864
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塩基性および酸性側鎖を有するアミノ酸で膜透過性に関して、Ｐａｐｐ≧１．０ｘ１０−６ｃｍ／秒を達成することが困難であったアミノ酸の例
実測値のbasic pKaが９．１、計算値のbasic pKaが８．９のアミノ酸であるＳｅｒ（Ｅｔ−２−ＮＭｅ２）を含む配列は、１．２１≦ＣｌｏｇＰ／ｔｏｔａｌ ａａ≦１．３６の範囲で、膜透過性に関してＰａｐｐ≧１．０ｘ１０−６ｃｍ／秒を達成することが困難であった（ｐｄ５０〜ｐｄ５８）。一方、本明細書に記載の通り、ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）、ＭｅＡｂｕ（Ｍｏｒ）、Ｓｅｒ（Ｅｔ−２−Ｍｏｒ）、ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ−３−Ｆ２）を含む配列は膜透過性、Ｐａｐｐ≧１．０ｘ１０−６ｃｍ／秒を達成することが可能であった。
一方、実測値のｐＫａが３．８、計算値のｐＫａが５．３のアミノ酸であるＧｌｎ（Ｍｓ）を含む配列は１．２０≦ＣｌｏｇＰ／ｔｏｔａｌ ａａ≦１．３３の範囲で、膜透過性に関してＰａｐｐ≧１．０ｘ１０−６ｃｍ／秒を達成することが困難であった（ｐｄ５９〜ｐｄ７０）。一方、本明細書に記載の通り、Ａｂｕ（５−Ｏｘｏ−Ｏｄｚ）を含む配列は膜透過性、Ｐａｐｐ≧１．０ｘ１０−６ｃｍ／秒を達成することが可能であった。
Ｓｅｒ（Ｅｔ−２−ＮＭｅ２）またはＧｌｎ（Ｍｓ）を含む環状ペプチド化合物の膜透過性
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膜透過性を評価した環状ペプチドの一部の構造情報
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膜透過性を評価した環状ペプチドの一部の分析情報
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本明細書に記載の方法でｂａｓｉｃ ｐＫａを計算した塩基性側鎖を有するアミノ酸の一部を下記の表に示す。
Figure 2018225864
本明細書に記載の方法でｐＫａを計算した酸性側鎖を有するアミノ酸の一部を下記の表に示す。
Figure 2018225864
本明細書においてアミノ酸側鎖のｐＫａの実測は以下の手順に従って行った。
使用装置
Sirius T3(Sirius Analytical Instruments Ltd., Forest Row, East Sussex, RH18 5DW, UK)
Figure 2018225864
（実施手順）
被験物質約１ｍｇの粉体または１０ｍＭのＤＭＳＯ溶液約１００ｕＬに０．１５ＭのＫＣｌを添加し、塩基性化合物の場合はｐＨ２となるまで０．５ＭのＨＣｌを添加後、０．５ＭのＫＯＨにてｐＨ１２まで滴定を行った。
酸性化合物の場合は、ｐＨ１２となるまで０．５ＭのＫＯＨ添加後、０．５ＭのＨＣｌにてｐＨ２まで滴定を行った。
滴定操作はSirius社製Ｔ３にて自動で行い、得られた滴定曲線からsirius T3 Refinementソフトを用いてｐＫａを求めた。
また参照化合物としてイミプラミン・ＨＣｌ、プロプラノロール・ＨＣｌ、ワルファリンを用いて同様にｐＫａを求め、Sirius社で得られた試験結果範囲内であることを確認した。
アミノ酸側鎖のｐＫａは評価したいアミノ酸を下記に示す３残基からならるペプチドの２残基目（下記表のＸの位置）に導入した配列を合成することで求めた。
Figure 2018225864
以下にその結果を示す。
Figure 2018225864
本開示の一態様を用いることにより、標的分子に特異的に結合することができ、高い細胞膜透過性を有する環状ペプチド化合物を効率的にスクリーニングすることができる。本開示は、例えば医薬品としての有用性が期待できる環状ペプチド化合物の製造やスクリーニング等の分野において有用である。

Claims (15)

  1. 環状ペプチド化合物のライブラリであって、前記ライブラリが、環状部の側鎖に、（１）インドール骨格、及び（２）置換又は無置換のヒドロキシフェニル基、を有しない環状ペプチド化合物から実質的になる、ライブラリ。
  2. 前記ライブラリに、環状部に酸性の側鎖を有する環状ペプチド化合物が含まれる場合、同環状ペプチド化合物が、該酸性の側鎖のpKaが3.5〜10である環状ペプチド化合物から実質的になる、請求項１に記載のライブラリ。
  3. 前記ライブラリに、環状部に塩基性の側鎖を有する環状ペプチド化合物が含まれる場合、同環状ペプチド化合物が、該塩基性の側鎖のBasic pKaが4.0〜10である環状ペプチド化合物から実質的になる、請求項１又は２に記載のライブラリ。
  4. 前記ライブラリが、長さが5.4〜13オングストロームの長側鎖を環状部に有する環状ペプチド化合物を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のライブラリ。
  5. 前記長側鎖が、その側鎖上にアミド結合を含まないか、又は１個のアミド結合を含む側鎖である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のライブラリ。
  6. 前記ライブラリに含まれる環状ペプチド化合物の環状部を構成するアミノ酸の数の平均が５〜１５である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のライブラリ。
  7. 前記ライブラリに含まれる環状ペプチド化合物の核酸連結部以外のペプチド部位を構成するアミノ酸の数の平均が、５〜２０である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のライブラリ。
  8. 前記ライブラリに含まれる環状ペプチド化合物の核酸連結部以外のペプチド部位に含まれるアミノ酸の数に占めるＮ置換アミノ酸の数の割合の平均が３０％以上である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のライブラリ。
  9. 前記長側鎖がＲ１を含み、ここでＲ１は、
    （ａ）フェニル基、若しくは、（ｂ）酸素原子及び窒素原子からなる群より独立に選択されるヘテロ原子を環内に１〜３個有している４〜６員の複素環基、
    ここで（ａ）及び（ｂ）は下記Ａ群より独立に選択される置換基を少なくとも一つ有していてもよく、
    Ａ群：オキソ、ハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−Ｃ４アルキル基、及びＣ１−Ｃ４ジアルキルアミノ基（ここで、Ｃ１−Ｃ４アルキル基中の隣接しない１又は２個のメチレン基が酸素原子で置換されていてもよい）
    又は、
    （ｃ）以下の一般式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、若しくは（ＩＶ）：
    Figure 2018225864
    [式中、
    Ｘ１は単結合、又は下記Ｂ群より独立して選択される置換基を少なくとも一つ有していてもよいＣ１−Ｃ２アルキレン基を表し、
    Ｘ２は単結合、又は下記Ｂ群より独立して選択される置換基を少なくとも一つ有していてもよいＣ１−Ｃ２アルキレン基を表し、
    Ｙ１は単結合、酸素原子、カルボニル基（−ＣＯ−）、又はスルホニル基（−ＳＯ２−）を表し、
    Ｙ２は単結合、Ｃ１−Ｃ４アルキル基で置換されていてもよいＣ１−Ｃ２アルキレン基、カルボニル基（−ＣＯ−）、又はスルホニル基（−ＳＯ２−）を表し、
    Ｚ１は単結合、下記Ｂ群より独立して選択される置換基を少なくとも一つ有していてもよいメチレン基、又は酸素原子を表し、
    Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ２−Ｃ４アルケニル基、又はＣ２−Ｃ４アルキニル基を表し、ここで該Ｃ１−Ｃ６アルキル基は、ハロゲン原子で置換されていてもよく、また、該Ｃ１−Ｃ６アルキル基中の隣接しない１若しくは２個のメチレン基が酸素原子で置換されていてもよく
    Ｒ２及びＲ３、又はＲ２及びＸ１が結合して４〜６員環の環状構造を形成していてもよく、この場合に該環状構造は、Ｃ１−Ｃ４アルキル基又はハロゲン原子で置換されていてもよく、環内に酸素原子を有していてもよく、該環状構造は部分的に不飽和であってもよく、
    Ｒ４はＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ２−Ｃ６アルケニル基、Ｃ２−Ｃ６アルキニル基、又はＣ１−Ｃ６アルカノイル基を表し、
    Ｒ５は水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ２−Ｃ６アルケニル基、又はＣ２−Ｃ６アルキニル基を表し、Ｒ４及び／又はＲ５のＣ１−Ｃ６アルキル基中の隣接しない１若しくは２個のメチレン基が酸素原子で置換されていてもよく、
    あるいはＲ４及びＲ５、又はＲ５及びＸ２はそれらが結合している原子と一緒になって４〜６員環の環状構造を形成していてもよく、この場合に該環状構造は、Ｃ１−Ｃ４アルキル基又はハロゲン原子で置換されていてもよく、環内に酸素原子を有していてもよく、該環状構造は部分的に不飽和であってもよく、
    Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ４アルキル基、Ｃ２−Ｃ４アルケニル基、又はＣ２−Ｃ４アルキニル基を表し、該Ｃ１−Ｃ４アルキル基中の隣接しない１若しくは２個のメチレン基が酸素原子で置換されていてもよく、
    Figure 2018225864
    は結合点を表す。
    Ｂ群：ハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ４アルキル基、及びＣ１−Ｃ２アルコキシ基]
    で表される基である、
    請求項４〜８のいずれか一項に記載のライブラリ。
  10. 前記ライブラリに含まれる環状ペプチド化合物の環状部の側鎖に含まれる芳香環の数の平均が０〜３である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のライブラリ。
  11. 以下の工程を含む、標的分子に特異的に結合できる環状ペプチド化合物のスクリーニング方法：
    （ｉ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載のライブラリに含まれる環状ペプチド化合物と該標的分子を接触させる工程；及び
    （ｉｉ）該標的分子に特異的に結合できる環状ペプチド化合物を選択する工程。
  12. ペプチド化合物を製造するための無細胞翻訳系であって、以下（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を実質的に含まない無細胞翻訳系：
    （ａ）側鎖にインドール骨格を有するアミノ酸、又は該アミノ酸をコードする核酸；
    （ｂ）側鎖に２以上の芳香環による縮環構造を有するアミノ酸、又は該アミノ酸をコードする核酸；及び
    （ｃ）側鎖に置換又は無置換のヒドロキシフェニル基を有するアミノ酸、又は該アミノ酸をコードする核酸。
  13. ペプチド化合物のライブラリの製造方法であって、以下（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される少なくとも一つの工程を含む、方法：
    （ａ）側鎖にインドール骨格を有するアミノ酸を実質的に含まないアミノ酸プールを用意し、該プールに含まれるアミノ酸の一部又は全部を構成アミノ酸としてペプチド化合物を合成する工程；及び
    （ｂ）側鎖にインドール骨格を有するアミノ酸をコードする核酸を実質的に含まない鋳型プールを用意し、該鋳型プールからペプチド化合物を合成する工程。
  14. 以下の工程を含む、環状ペプチド化合物の製造方法：
    （ｉ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載のライブラリに含まれる環状ペプチド化合物と標的分子を接触させる工程；
    （ｉｉ）該標的分子に結合できる環状ペプチド化合物を選択する工程；及び
    （ｉｉｉ）（ｉｉ）で選択された環状ペプチド化合物のアミノ酸配列に基づき、環状ペプチド化合物を製造する工程。
  15. 環状ペプチド化合物であって、
    （１）その環状部の側鎖に、メチルチオ基、チオール基、インドール骨格、及び、置換又は無置換のヒドロキシフェニル基を有さず；
    （２）その環状部に酸性の側鎖を有する場合、該酸性の側鎖のpKaが3.5〜10であり；
    （３）その環状部に塩基性の側鎖を有する場合、該塩基性の側鎖のBasic pKaが4.0〜10であり；
    （４）その環状部に側鎖の長さが6.0〜13オングストロームの長側鎖を有し；及び
    （５）該長側鎖がＲ１を含み、ここでＲ１は、請求項９に定義したとおりである、
    前記環状ペプチド化合物。
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Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2813512T3 (da) 2011-12-28 2021-04-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fremgangsmåde til cyklisering af en peptidforbindelse
EP3269809B1 (en) 2015-03-13 2022-07-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha MODIFIED AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE AND USE THEREOF
EP3636656A4 (en) 2017-06-09 2021-04-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha PROCESS FOR SYNTHESIS OF A PEPTIDE CONTAINING AN N-SUBSTITUTED AMINO ACID
JP7411414B2 (ja) 2017-12-15 2024-01-11 中外製薬株式会社 ペプチドの製造方法、及び塩基の処理方法
JPWO2020111238A1 (ja) 2018-11-30 2021-10-21 中外製薬株式会社 ペプチド化合物、またはアミド化合物の脱保護法および固相反応における脱樹脂方法、並びにペプチド化合物の製造方法
JPWO2020122182A1 (ja) * 2018-12-12 2021-10-28 中外製薬株式会社 分子内水素結合可能な官能基を有するアミノ酸とそれらのアミノ酸を含むペプチド化合物、およびそれらの製造方法
SG11202106747WA (en) 2018-12-26 2021-07-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Mutated trna for codon expansion
EP4056580A4 (en) 2019-11-07 2023-12-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha METHOD FOR MANUFACTURING A PEPTIDE COMPOUND CONTAINING A HIGHLY STERICALLY HINDERED AMINO ACID
CA3159931A1 (en) 2019-11-07 2021-05-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cyclic peptide compound having kras inhibitory action
EP4074829A4 (en) 2019-12-12 2024-01-10 Chugai Pharmaceutical Co Ltd METHOD FOR PRODUCING PEPTIDE CONTAINING NON-NATURAL AMINO ACID
WO2021132546A1 (ja) 2019-12-26 2021-07-01 中外製薬株式会社 翻訳用組成物及びペプチドの製造方法
KR20230019120A (ko) 2020-06-03 2023-02-07 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 고난도 서열의 효율적 펩티드 축합법
KR20230028363A (ko) 2020-06-25 2023-02-28 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 개변된 유전 암호표를 갖는 번역계
WO2022097540A1 (ja) 2020-11-05 2022-05-12 中外製薬株式会社 ジケトピペラジン形成による欠損を抑制するペプチド合成方法
US20240069033A1 (en) 2020-12-25 2024-02-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for screening for candidate molecule capable of forming complex in conjunction with plurality of target molecules
KR20230124935A (ko) 2020-12-25 2023-08-28 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 N-치환-아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드 화합물의제조 방법
EP4249496A1 (en) 2020-12-28 2023-09-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for supporting amino acid on resin for solid-phase synthesis
CN112939841A (zh) * 2021-03-10 2021-06-11 康化（上海）新药研发有限公司 一种(2s)-2-n-芴甲氧羰基氨基-4-（3-氯苯基）丁酸的合成方法
EP4309741A1 (en) 2021-05-07 2024-01-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cyclic compound having inhibitory effect selective for kras but not for hras and nras
CA3219415A1 (en) * 2021-05-07 2022-11-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical use of cyclic peptide compound
TW202308679A (zh) 2021-05-07 2023-03-01 日商中外製藥股份有限公司 包含環狀胜肽化合物的製劑及其製造方法
WO2022234639A1 (ja) 2021-05-07 2022-11-10 中外製薬株式会社 変異型ｒａｓ（ｇ１２ｄ）に対する選択的結合性を示す結合分子
WO2023054636A1 (ja) 2021-09-30 2023-04-06 中外製薬株式会社 光開裂性部位を有する化合物、連結体及びこれを用いたスクリーニング方法
TW202330014A (zh) * 2021-10-13 2023-08-01 日商中外製藥股份有限公司 含有胜肽化合物及界面活性劑之組成物
TW202402319A (zh) * 2022-03-28 2024-01-16 日商中外製藥股份有限公司 含有包含聚氧乙烯構造的油性成分之化合物製劑
WO2023214509A1 (ja) 2022-05-02 2023-11-09 中外製薬株式会社 界面活性剤と併用するためのペプチド化合物を含む組成物
WO2024044679A2 (en) * 2022-08-24 2024-02-29 Ohio State Innovation Foundation Methods of synthesizing peptides with free n-terminal cysteine and products thereof
WO2024101402A1 (ja) * 2022-11-09 2024-05-16 中外製薬株式会社 Ｈｒａｓおよびｎｒａｓに対して選択的なｋｒａｓ阻害作用を有する環状化合物を含む医薬組成物

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013100132A1 (ja) * 2011-12-28 2013-07-04 中外製薬株式会社 ペプチド化合物の環化方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR94740E (fr) * 1967-10-25 1969-10-24 Rhone Poulenc Sa Nouveaux cyclopeptides et leur préparation.
US20020068301A1 (en) * 1997-05-28 2002-06-06 Hung-Sen Lai Cyclic peptide libraries and methods of use thereof to identify binding motifs
EP3012265B1 (en) 2007-03-26 2017-06-28 The University of Tokyo Process for synthesizing cyclic peptide compound
CN101899092B (zh) * 2009-06-01 2013-07-24 北京大学 一种新型肽-链接基-缀合物及其固相合成方法
JP5818237B2 (ja) 2010-09-09 2015-11-18 国立大学法人 東京大学 Ｎ−メチルアミノ酸およびその他の特殊アミノ酸を含む特殊ペプチド化合物ライブラリーの翻訳構築と活性種探索法
CN103328648B (zh) 2010-12-03 2015-11-25 国立大学法人东京大学 具有稳定的二级结构的肽和肽库以及它们的制造方法
JP6754997B2 (ja) * 2013-08-26 2020-09-16 国立大学法人 東京大学 大環状ペプチド、その製造方法、及び大環状ペプチドライブラリを用いるスクリーニング方法
EP3269809B1 (en) 2015-03-13 2022-07-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha MODIFIED AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE AND USE THEREOF
JP2017043615A (ja) * 2015-08-27 2017-03-02 塩野義製薬株式会社 環状ペプチドの膜透過性および／または代謝安定性を改善するシクロプロパンアミノ酸ユニット
CN108713028B (zh) * 2016-02-04 2021-12-28 约翰霍普金斯大学 rapafucin文库的合成和组合物
GB201702938D0 (en) * 2017-02-23 2017-04-12 Univ Southampton Methods of generating and screening compartmentalised peptides libraries

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013100132A1 (ja) * 2011-12-28 2013-07-04 中外製薬株式会社 ペプチド化合物の環化方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOURNAL OF COMBINATORIAL CHEMISTRY, vol. 5, JPN6018032491, 2003, pages 414 - 428, ISSN: 0004834083 *
JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY, vol. 59, JPN6018032487, 2016, pages 5403 - 5415, ISSN: 0004834081 *
MOLECULAR PHARMACEUTICS, vol. 8, JPN6018032489, 2011, pages 479 - 487, ISSN: 0004834082 *

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