JPWO2018194120A1 - がんの罹患の可能性の試験方法およびそれに用いる試験試薬 - Google Patents
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Abstract
Description
テロメア反復配列含有RNA(TERRA)の発現測定試薬を含むことを特徴とする。
本発明のがんの罹患の可能性の試験方法は、前述のように、被検者の血液試料について、テロメア反復配列含有RNA(TERRA)の発現量を測定する測定工程を含むことを特徴とする。本発明は、がんマーカーとして、血液試料におけるTERRAの発現量を測定することが特徴であって、その他の工程および条件は、特に制限されない。
5’-tgggacacagccacatacatgtgttatatgacgtctctggctactttcatggtataatggaagagctgagtcattgagagagagaccatatggcttggaaaatttaaaatatttaacatttagccctttgcagaaaatatttgctgactcttgttttaaaagatctctgtggccaggcgtggtggctcacgtctgtaatcccagcactttgggacgccgaggctagcggatcacgaggccaggagatcaagaccatcctggctaacccagtgaaacctcgtctctactaaaaatacaaaaaaattagccgggtgtggtggcgggcgactgtagtcccagctactccagaggctgaggcaggagaatggtgtgaacctgggaggaggagcttgcagtgacccgggatcgtgtcactgcattccagcccgggcaacagagcaagactccatctcaaaaaaaaaaaggatctctgtttagaatgctacctattgccttctggatagaatcacaactctttaccacaaacaacacagcttcagccctgcttctatatccagcctcatctatttctgctcctcctccttattttcctcctggacatgctgatggattgtcagacttcccagatgtgtgagagtctctcctgccttcctaacattctcatgctctccctctg-3’
5’-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’
本発明の試験試薬は、前記本発明の試験方法に使用する試験試薬であって、テロメア反復配列含有RNA(TERRA)の発現測定試薬を含むことを特徴とする。本発明の試験試薬によれば、前記本発明のがんの罹患の可能性の試験方法を簡便に行える。本発明は、がんの罹患の可能性の試験にTERRAの発現の測定を使用することが特徴であり、TERRAの発現が測定できればよく、前記発現測定試薬の構成は、特に制限されない。前記TERRAの発現測定試薬は、例えば、RNAの発現測定試薬があげられ、具体例として、TERRAを逆転写する試薬、および前記逆転写により生じたcDNAを増幅する試薬、すなわち、逆転写酵素、プライマーセット、DNAポリメラーゼ、dNTP等があげられる。前記プライマーセットは、例えば、TERRAの塩基配列に基づいて適宜設計できる。TERRAは、前記サブテロメア領域に対応する塩基配列を有するため、前記プライマーセットは、例えば、前記サブテロメア領域の塩基配列に対応するポリヌクレオチドまたはその一部を増幅可能なように設計されることが好ましい。本発明の試験試薬は、例えば、前記本発明の試験方法の説明を援用できる。
本発明のがんの診断方法は、被検者の血液試料におけるテロメア反復配列含有RNA(TERRA)の発現量を測定する工程を含むことを特徴とする。また、本発明のがんの診断試薬は、テロメア反復配列含有RNA(TERRA)の発現測定試薬を含むことを特徴とする。なお、本発明のがんの診断方法および診断試薬は、前記本発明の試験方法および試験試薬の説明を援用できる。
本発明の試験試薬の使用は、テロメア反復配列含有RNA(TERRA)の発現測定試薬の前記本発明の試験方法のための使用である。なお、本発明の試験試薬の使用は、前記本発明の試験方法および試験試薬の説明を援用できる。
本発明のがんの治療方法(以下、「治療方法」ともいう)は、被検者についてがんの診断を行なう診断工程と、前記診断工程において、がんの罹患可能性があると評価された被検者(以下、「がん患者」または「投与対象」ともいう)に、がん治療薬を投与する投与工程とを含み、前記診断工程が、前記本発明の試験方法により実施されることを特徴とする。本発明の治療方法は、前記診断工程が、前記本発明の試験方法により実施されることが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の治療方法は、例えば、前記本発明の試験方法および試験試薬の説明を援用できる。
様々ながん細胞由来の細胞株について、細胞外小胞におけるTERRAの発現量が上昇していることを確認した。
がん細胞由来の細胞株としては、以下の細胞株を使用した。
(白血病由来)
U937(ATCC(American Type Culture Collection)から入手)
HL−60(ATCCから入手)
(多発性骨髄腫由来)
RPMI8226(ATCCから入手)
KMS−11(JCRB細胞バンクから入手)
(肺がん由来)
SCT−1(ATCCから入手)
(卵巣がん由来)
Kuramochi(JCRB細胞バンクから入手)
(ヒト皮膚線維芽細胞)
NHDF(normal dermal fibroblast、JCRB細胞バンクから入手)
(EBウイルス形質転換B細胞)
HEV0034(理研バイオリソースセンター(RIKEN BRC)から入手)
HEV0046(RIKEN BRCから入手)
各細胞について、培養液中で、37℃、5%CO2の条件で24時間培養した。U937、HL−60、RPMI8226、KMS−11、HEV0034、およびHEV0046の培養液の組成は、10%牛胎児血清(Fetal bovine serum (FBS))および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むRPMI1640培地とした。また、SCT−1、Kuramochi、およびNHDFの培養液の組成は、10%FBS、1×非必須アミノ酸(Non-Essential Amino Acids Solution(NEAA))および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むRPMI1640培地とした。
200μLの細胞外小胞画分に、700μLのQIAzol Lysis Reagent(QIAGEN社製)を添加し、よく混合した。得られた混合液に、2.85μLの合成ath−miR−159(0.1nmol/L、シロイヌナズナ由来miR-159の合成miRNA mimic、北海道システムサイエンス社製)を添加し、よく混合し、室温(約25℃)で5分静置した。前記静置後、200μLのクロロホルムを添加し、40秒間激しく混合し、さらに、室温で5分静置した。つぎに、クロロホルム添加後の混合液について、4000rpmの条件で、15分間遠心し、2層に分離した状態の上段側の溶液を回収した。そして、回収した溶液と等量のエタノールを添加および混合後、得られた混合液をmiRNeasy mini Kit(QIAGEN社製)付属のスピンカラムに添加し、8000×gで1分間遠心した。つぎに、miRNeasy mini Kitの添付のプロトコルに従い、前記スピンカラムを洗浄し、さらに総RNAを溶出することにより35μLの総RNA溶液を取得した。
ath−miR−159(配列番号3)
5’-uuuggauugaagggagcucua-3’
つぎに、下記組成となるように各試薬を混合し、逆転写準備液を調製した。
総RNA溶液 2.5μL
TERRA逆転写プライマー(2μmol/L) 1μL
dNTP 1μL
DNase/RNase free water 5.5μL
合計 10μL
5’-CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAA-3’
逆転写準備液 10μL
10×RT buffer 2μL
MgCl(25mmoL/L) 4μL
DTT 2μL
RNase Inhibitor 1μL
SuperScript酵素 1μL
合計 20μL
cDNA溶液 1μL
TERRA用フォワードプライマー(25nmol/L) 1μL
TERRA用リバースプライマー(25nmol/L) 1μL
2×SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems) 12.5μL
DNase/RNase free water 9.5μL
合計 25μL
5’-GAATCCTGCGCACCGAGAT-3’
TERRA用リバースプライマー(配列番号6)
5’-CTGCACTTGAACCCTGCAATAC-3’
下記組成となるように各試薬を混合し、コントロールの逆転写準備液を調製した。なお、各試薬は、TaqMan MicroRNA Assay Kit(Thermo Fisher Scientific社製)に添付のものを使用した。
10×RT buffer 2μL
dNTP(100mmol/L) 0.2μL
RT Enzyme 1μL
ath-miR-159用5×RT primer 1μL
hsa-miR-16用5×RT primer 1μL
DNase/RNase free water 4.8μL
合計 10μL
cDNA溶液 1μL
20×assay reagent
(ath-miR-159用またはhas-miR-16用) 1μL
2×Universal PCR Master Mix 10μL
DNase/RNase free water 8μL
合計 20μL
別途、コントロールRNA(Stratagene QPCR Human Reference Total RNA)からcDANを合成することにより調製したコントロールサンプルを1/10、1/100、および1/1000に段階希釈し、前記RT−PCR反応液と同時にRT−PCRを行い、得られた結果から検量線を作成した。そして、TERRAの発現量は、RT−PCRによって得られた各サンプルのCt値と、前記検量線とを用いて相対的な発現量として算出した。なお、NHDF細胞株由来のサンプルにおけるTERRAの発現量を1とした。
多発性骨髄腫の患者由来の血液試料の細胞外小胞において、TERRAの発現量が上昇していることを確認した。
急性骨髄性白血病の患者由来の血液試料の細胞外小胞において、TERRAの発現量が上昇していることを確認した。
多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、および骨髄異形成症候群から転化した急性骨髄性白血病について、TERRAにより精度よく罹患の可能性を試験できることを確認した。
Claims (8)
- 被検者の血液試料について、テロメア反復配列含有RNA(TERRA)の発現量を測定する測定工程を含むことを特徴とする、がんの罹患の可能性の試験方法。
- 前記がんは、血液がんである、請求項1記載の試験方法。
- 前記血液がんは、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、および急性骨髄性白血病からなる群から選択された少なくとも1つである、請求項2記載の試験方法。
- さらに、前記被検者の血液試料におけるTERRAの発現量を、基準値と比較することにより、前記被検者のがんの罹患の可能性を試験する試験工程を含み、前記基準値が、健常者の血液試料におけるTERRAの発現量またはがん患者の血液試料におけるTERRAの発現量である、請求項1から3のいずれか一項に記載の試験方法。
- 前記試験工程において、前記被検者の血液試料におけるTERRAの発現量が、前記健常者の血液試料におけるTERRAの発現量よりも高い場合、前記がん患者の血液試料におけるTERRAの発現量と同じ場合または、前記がん患者の血液試料におけるTERRAの発現量よりも高い場合に、前記被検者は、がんに罹患する可能性があるとする、請求項4記載の試験方法。
- 前記血液試料は、前記血液試料由来の細胞外小胞を含む試料である、請求項1から5のいずれか一項に記載の試験方法。
- さらに、前記被検者の血液試料から、細胞外小胞を分離する分離工程を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の試験方法。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載の試験方法に使用する試験試薬であって、
テロメア反復配列含有RNA(TERRA)の発現測定試薬を含むことを特徴とする、試験試薬。
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