JPWO2018038165A1 - ポリマー、ポリマーの製造方法、及び薬物複合体 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2016年8月23日に日本に出願された、特願2016−163134号に基づき優先権主張し、その内容をここに援用する。
また、アルデヒド基含有ポリマーは、カチオン性ポリペプチドのコア架橋にも用いることが出来る。このため、アルデヒド/ケトン含有ポリマーは、薬物送達のキャリアとして、特に医薬分野において注目されている。
アルデヒドをポリマーに導入する方法として、4−ビニルベンズアルデヒドのRAFT重合によりアルデヒド導入ポリマーを得る方法が知られている(例えば、非特許文献1〜4参照)。
非特許文献4では、アセタール基導入メタクリレートが用いられている。しかし、エステル結合を介してベースポリマーに結合しているため、生理的pH(pH7.4)では解離してしまい、薬物送達には不適切であった。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、新規なポリマー、その製造方法、ならびに該ポリマーを含有する薬物複合体を提供することを課題とする。
(1)下記一般式(I)で表される繰り返し単位(I)、及び
下記一般式(II)で表される繰り返し単位(II)
を有することを特徴とするポリマー。
下記一般式(II’)で表される繰り返し単位(II’)を有するポリマー(P1)と下記一般式(1a)で表される化合物(1a)とを反応させて、下記一般式(I’)で表される繰り返し単位及び前記繰り返し単位(II’)を有するポリマー(P2)を得る工程(1)と、
前記ポリマー(P2)を中性条件下又は弱酸性条件下で加水分解して、下記一般式(I)で表される繰り返し単位(I)及び下記一般式(II−1)で表される繰り返し単位(II−1)を有するポリマーを得る工程(2)と、
を含むことを特徴とするポリマーの製造方法。
前記ポリマー(P2)をアルカリ条件下の加水分解、エステル交換反応、アミノリシス、並びにアルカリ条件下の加水分解及びアミドカップリングからなる群より選ばれる少なくとも1種の処理に付し、下記一般式(I’)で表される繰り返し単位(I’)及び下記一般式(II’)で表される繰り返し単位(II’)を有するポリマー(P3)を得る工程(2a)と、
前記ポリマー(P3)を中性条件下又は弱酸性条件下で加水分解して、下記一般式(I)で表される繰り返し単位(I)及び下記一般式(II)で表される繰り返し単位(II)を有するポリマーを得る工程(2b)と、
を含むポリマーの製造方法。
前記ポリマーに結合した少なくとも1種の薬物
を含有する薬物複合体。
下記一般式(II)で表される繰り返し単位(II)
を有するポリマーを含有する前記(4)に記載の薬物複合体。
<ポリマー>
本実施形態のポリマーは、下記一般式(I)で表される繰り返し単位(I)、及び
下記一般式(II)で表される繰り返し単位(II)
を有する。
前記一般式(I)中、Lは2価の芳香族炭化水素基又は2価の脂肪族炭化水素基を表す。
Lの2価の芳香族炭化水素基としては、フェニレン基、ベンジレン基等が挙げられる。
Lの2価の芳香族炭化水素基は、置換基を有していてもよい。該置換基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、tert−ブチル基、ニトロ基、ハロゲン化物等が挙げられる。
Lの2価の脂肪族炭化水素基としては、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基等が挙げられる。Lの2価の脂肪族炭化水素基は、置換基を有していてもよい。
該置換基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、tert−ブチル基、ハロゲン化物等が挙げられる。
中でも、Lとしては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ベンジレン基が好ましく、メチレン基、エチレン基又はベンジレン基がより好ましい。
R1の脂肪族炭化水素基としては、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基等が挙げられる。R1の脂肪族炭化水素基は、置換基を有していてもよい。該置換基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、tert−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、tert−ペンチル基、シクロヘキシル基、トリハロメチル基等が挙げられる。
R1の芳香族炭化水素基としては、フェニル基、ベンジル基、ピリジル基、ナフチル基、ヒドロキシフェニル基、メトキシフェニル基、エトキシフェニル基、キシリル基、メチルフェニル基、ニトロフェニル基、クロロフェニル基、フロオロフェニル基、ヨードフェニル基、ブロモフェニル基等が挙げられる。
なかでも、R1としては、水素原子又は脂肪族炭化水素基が好ましく、水素原子又はメチル基がより好ましい。
前記一般式(I)中、Rxは水素原子、脂肪族炭化水素基又は芳香族炭化水素基を表す。Rxの脂肪族炭化水素基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、tert−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、tert−ペンチル基、シクロヘキシル基、トリフルオロメチル基等が挙げられる。
Rxの芳香族炭化水素基としては、フェニル基、ベンジル基、ピリジル基、ナフチル基、ヒドロキシフェニル基、メトキシフェニル基、エトキシフェニル基、キシリル基、メチルフェニル基、ニトロフェニル基、クロロフェニル基、フロオロフェニル基、ヨードフェニル基、ブロモフェニル基等が挙げられる。
Rx1及びRx2はそれぞれ独立に水素原子、脂肪族炭化水素基又は芳香族炭化水素基を表す。
Rx1及びRx2の脂肪族炭化水素基としては、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、tert−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、tert−ペンチル基、シクロヘキシル基、トリハロメチル基挙げられる。
Rx1及びRx2の芳香族炭化水素基としては、フェニル基、ベンジル基、ピリジル基、ナフチル基、ヒドロキシフェニル基、メトキシフェニル基、エトキシフェニル基、キシリル基、メチルフェニル基、ヒトロフェニル基、クロロフェニル基、フロオロフェニル基、ヨードフェニル基、ブロモフェニル基等が挙げられる。
中でも、XとしてはORxが好ましく、OH(ヒドロキシ基)がより好ましい。
繰り返し単位(III)としては、親水性の繰り返し単位が好ましく、例えば、ポリエチレングリコールから誘導される繰り返し単位、ポリ(エチルエチレンホスフェート)から誘導される繰り返し単位、ポリビニルアルコールから誘導される繰り返し単位、ポリビニルピロリドンから誘導される繰り返し単位、ポリ(オキサゾリン)から誘導される繰り返し単位、ポリ(N−(2−ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド)(PHPMA)から誘導される繰り返し単位等が挙げられる。中でも、繰り返し単位(III)としては、ポリエチレングリコールから誘導される繰り返し単位が好ましい。
繰り返し単位(I)の含有量は、ポリマーを構成する全繰り返し単位の合計(100モル%)に対し、5〜100モル%が好ましく、10〜80モル%がより好ましく、20〜50モル%が更に好ましい。
繰り返し単位(II)の含有量は、ポリマーを構成する全繰り返し単位の合計(100モル%)に対し、0〜80モル%が好ましく、10〜60モル%がより好ましく、20〜40モル%が更に好ましい。
繰り返し単位(III)の含有量は、ポリマーを構成する全繰り返し単位の合計(100モル%)に対し、0〜95モル%が好ましく、20〜90モル%がより好ましく、50〜80モル%が更に好ましい。
本実施形態のポリマーの製造方法(以下、「製造方法(1)」という場合がある)は、下記一般式(II’)で表される繰り返し単位(II’)を有するポリマー(P1)と下記一般式(1a)で表される化合物(1a)とを反応させて、下記一般式(I’)で表される繰り返し単位及び前記繰り返し単位(II’)を有するポリマー(P2)を得る工程(1)と、前記ポリマー(P2)を弱酸性条件下で加水分解して、下記一般式(I)で表される繰り返し単位(I)及び下記一般式(II−1)で表される繰り返し単位(II−1)を有するポリマーを得る工程(2)と、を含む。
前記一般式(1a)及び(I’)中、Ra11及びRa12はそれぞれ独立にメチル基若しくはエチル基を表す、又はRa11及びRa12は相互に結合してエチレン基若しくはプロピレン基を表す。Ra11及びRa12が相互に結合してエチレン基若しくはプロピレン基を表す場合、化合物(1a)は環状アセタール又は環状ケタールとなる。
前記一般式(1a)中、n1及びn2はそれぞれ独立に0又は1であり、1が好ましい。
製造方法(1)の工程(1)は、ポリマー(P1)と化合物(1a)とのアミノリシス反応である。工程(1)により、ポリマー(P1)の側鎖に化合物(1a)のアセタール構造又はケタール構造が導入される。
工程(1)の反応温度は、ポリマー(P1)の側鎖に化合物(1a)のアセタール構造又はケタール構造が導入される条件であれば特に限定されないが、通常4℃〜100℃であり、室温〜40℃が好ましい。
工程(1)の反応時間は、ポリマー(P1)の側鎖に化合物(1a)のアセタール構造又はケタール構造が導入される条件であれば特に限定されず、反応時間、化合物(1a)の種類や量によって選択できるが、通常4時間〜5日間である。
製造方法(1)の工程(2)において、ポリマー(P2)を中性条件下又は弱酸性条件下で加水分解し、ポリマー(P2)の繰り返し単位(I’)のアセタール構造をアルデヒド、又はケタール構造をケトンに変換する。
加水分解は、ポリマー(P2)の繰り返し単位(I’)のアセタール構造をアルデヒド、又はケタール構造をケトンに変換できる条件であれば特に限定されない。例えば、(i)0.1N塩酸で30分程度処理する方法、(ii)アセトン及びインジウム(III)トリフルオロメタンスルホネート(触媒)の存在下で処理する方法、(iii)30℃の水中で触媒量のテトラキス(3,5−トリフルオロメチルフェニル)ホウ酸ナトリウムを用いる方法、(iv)室温でウェットニトロメタン中、1〜5モル%のEr(OTf)3を用いる方法、(v)ほぼ中性のpH条件下、室温でウェットニトロメタン中、触媒量のセリウム(III)トリフレートを用いる方法等、公知の方法が挙げられる。
本実施形態のポリマーの製造方法(以下、「製造方法(2)」という場合がある)は、下記一般式(II’)で表される繰り返し単位(II’)を有するポリマー(P1)と下記一般式(1a)で表される化合物(1a)とを反応させて、下記一般式(I’)で表される繰り返し単位及び前記繰り返し単位(II’)を有するポリマー(P2)を得る工程(1)と、
前記ポリマー(P2)をアルカリ条件下の加水分解、エステル交換反応、アミノリシス、並びにアルカリ条件下の加水分解及びアミドカップリングからなる群より選ばれる少なくとも1種の処理に付し、下記一般式(I’)で表される繰り返し単位(I’)及び下記一般式(II’)で表される繰り返し単位(II’)を有するポリマー(P3)を得る工程(2a)と、
前記ポリマー(P3)を中性条件下又は弱酸性条件下で加水分解して、下記一般式(I)で表される繰り返し単位(I)及び下記一般式(II)で表される繰り返し単位(II)を有するポリマーを得る工程(2b)と、
を含む。
前記一般式(1a)及び(I’)中、R1、Ra11、Ra12は前記と同様である。
製造方法(2)の工程(1)は、製造方法(1)の工程(1)と同様である。
製造方法(2)の工程(2a)では、ポリマー(P2)を所定の処理に付すことにより、繰り返し単位(I’)がアセタール構造で保護された状態で、繰り返し単位(II’)の側鎖に所望の官能基を導入することができる。
アルカリ条件下の加水分解は、例えば、0.5NのNaOH溶液とDMSOとの混合物(体積比:50/50)中、室温で30分処理する方法、DMSO中トリエチルアミンで室温にて1時間処理する方法、DMSO中ジイソプロピルエチルアミンで室温にて1時間処理する方法等が挙げられる。アルカリ条件下の加水分解により得られるカルボン酸残基は、後述するミセルのコア中のプロトンを引き寄せ、ヒドラゾン結合の加水分解を容易にし、低pH条件下において生体材料の放出を可能とする。
アミノリシスは、例えば、エチレンジアミン又はジアミノプロパンによりエステルを開裂してアミノ官能基を導入することができる。アミノ基導入により、蛍光色素と結合させることができる。また、他のカルボン酸基を有する画像診断剤と、公知のアミノカップリングに付すこともできる。アセタール構造及びケタール構造は、このようなアミノ基導入条件下では安定なので、ポリマーの多官能ナノキャリアデザインに供することができる。
アルカリ条件下の加水分解及びアミドカップリングは、例えば、アルカリ条件下の加水分解によりエステル残基を処理後、生成したカルボン酸をエステル交換反応もしくは公知のカップリング剤を用いたアミドカップリングに付すことができる。ヒドロキシ/アミン官能基による適切な構造モチーフにより、ポリマーの親水性/疎水性のバランスを所望のものとすることができ、極性又は非極性溶媒中での自己組織化に寄与する。
製造方法(2)の工程(2b)において、ポリマー(P3)を弱酸性条件下で加水分解し、ポリマー(P3)の繰り返し単位(I’)のアセタール構造をアルデヒドに変換する。加水分解の条件は、製造方法(1)の工程(2)と同様である。
本実施形態の薬物複合体は、前記ポリマー、及び前記ポリマーに結合した少なくとも1種の薬物を含有する。
前記薬物は、特に限定されず、所望の活性を有する薬物を結合させることができる。なお、本明細書において、前記薬物は、「活性分子」と表記されることもある。ここで、活性分子とは、何らかの生理学的又は化学的活性を有する分子をいう。活性分子が有する生理学的活性又は化学的活性の種類は特に限定されず、医薬品の有効成分として公知の化合物が有する生理活性や、体内に投与されて使用される診断薬が有する化学的又は生理学的活性を含み得る。前記薬物(活性分子)の例としては、例えば、抗癌剤、シグナル伝達阻害剤、代謝拮抗剤、鎮痛剤、抗炎症剤、造影剤等が挙げられるが、これらに限定されない。抗癌剤としては、例えば、ビンブラスチンなどのビンカアルカロイド、OSU−03012などのCOX−2選択的非ステロイド性抗炎症剤、(+)−JQ1などのBETブロモドメイン阻害剤、K252Aなどのスタウロスポリン類縁体、ヒドララジンなどの脱メチル化剤、ベンダムスチン及びクロラムブシルなどのアルキル化剤、AZD39などのファシネルトランスフェラーゼ阻害剤、フルルビプロフェンなどの非ステロイド系抗炎症剤等を挙げることができる。前記ポリマーとの薬物複合体とすることにより、副作用により用量が制限される抗癌剤のような薬物であっても、副作用の緩和が期待できる。そのため、そのような薬物は、前記ポリマーと結合させる薬物の好適な例である。そのような薬物の例としては、例えば、ビンブラスチンなどのビンカアルカロイド系化合物を挙げることができる。
なかでも、前記薬物としては、ビンブラスチンなどのビンカアルカロイド、K252Aなどのスタウロスポリン類縁体、(+)−JQ1などのBETブロモドメイン阻害剤が好ましい。
前記一般式(Ia)中、BMは活性分子を表す。活性分子としては、前記薬物において例示した化合物等が挙げられる。
また、前記ポリマーにおいては、導入するアルデヒド基又はケトン基を、芳香族アルデヒド基、脂肪族アルデヒド基、芳香族ケトン基、脂肪族ケトン基から選択することができる。
芳香族アルデヒド基又は芳香族ケトン基のシッフ塩基は、脂肪族アルデヒド基又は脂肪族ケトン基のシッフ塩基よりも安定であるため、芳香族アルデヒド基を導入した場合には、薬物がより安定に保持される。そのため、疾患の状態や薬物の種類により、導入するアルデヒド基又はケトン基の種類を選択することにより、薬物の徐放性を制御することができる。さらに、本実施形態の薬物複合体では、薬物が前記ポリマーに保持されている間、薬物は安定に維持され、毒性も緩和されるため、副作用を軽減して治療効果を高めることができる。
前記薬物複合体を含む医薬組成物は、任意に前記薬物複合体の他の成分を含んでもよい。他の成分は、医薬品分野において一般的に使用される成分を特に制限なく使用することができる。例えば、前記医薬組成物は、前記薬物複合体を薬学的に許容される担体に溶解又は懸濁したものであってもよい。薬学的に許容される担体としては、医薬分野において常用されるものを特に制限なく使用することができ、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝液、DMSO、ジメチルアセトアミド、エタノール、グリセロール、ミネラルオイル等を挙げることができる。また、他の成分としては、その他に、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、pH調整剤、賦形剤、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、防腐剤、着色剤、香料等が挙げられる。
前記医薬組成物は、単回投与又は複数回投与を行うことが可能であり、その投与期間及び間隔は、薬物の種類、疾患の種類及び状態等、投与経路、投与対象の年齢、体重及び性別等によって、適宜選択することができる。
前記医薬組成物の投与量は、その投与期間及び間隔は、薬物の種類、疾患の種類及び状態等、投与経路、投与対象の年齢、体重及び性別等によって、適宜選択することができる。前記医薬組成物の投与量は、治療的有効量とすることができ、例えば、1回につき体重1kgあたり0.01〜1000mg程度とすることができる。
したがって、ビンブラスチン等の毒性の高い薬剤を用いる場合、pH5〜6.6での薬剤リリースが緩やかな芳香族アルデヒド基又は芳香族ケトン基を導入した薬物複合体が好ましい。一方、K252aやJQ−1等の比較的毒性の低い薬剤を用いる場合、pH5〜6.6での薬剤リリースが速い脂肪族アルデヒド基又は脂肪族ケトン基を導入した薬物複合体が好ましい。
<化合物>
本発明の第2の態様にかかる化合物(以下、「化合物(K)」という場合がある。)は、下記一般式(k1)で表される化合物である。
(a)水素、ハロゲン、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、アシル、ニトロ、カルバモイル、低級アルキルアミノカルボニル、−NR5R6[ここで、R5およびR6は、水素、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換の低級アルキルアミノカルボニル、置換もしくは非置換の低級アリールアミノカルボニル、アルコキシカルボニル、カルバモイル、アシルからそれぞれ独立に選択されるか、またはR5およびR6は、ヘテロ環式基由来の窒素原子と結合している]、
(b)−CO(CH2)jR4[ここで、jは1から6であり、R4は、
(i)水素、ハロゲン、−N3、
(ii)−NR5R6(ここで、R5およびR6は上記に定義されたとおりである)、
(iii)−SR7(ここで、R7は、水素、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のアラルキル、−(CH2)aCO2R10(ここで、aは、1または2であり、R10は、水素および置換もしくは非置換の低級アルキルからなる群から選択される)および−(CH2)aCO2NR5R6、
(iv)−OR8、−OCOR8(ここで、R8は、水素、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリールから選択される)
からなる群から選択される]、
(c)−CH(OH)(CH2)jR4(ここで、jおよびR4は、上記に定義したとおりである);
(d)−(CH2)dCHR11CO2R12または−(CH2)dCHR11CONR5R6(ここで、dは、0から5であり、R11は、水素、−CONR5R6、または−CO2R13であり、R13は、水素または置換もしくは非置換の低級アルキルであり、R12は、水素または置換もしくは非置換の低級アルキルである);
(e)−(CH2)kR14[ここで、kは2から6であり、R14は、ハロゲン、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、−COOR15、−OR15(ここで、R15は、水素、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリールまたはアシルである)、−SR7(ここで、R7は、上記に定義したとおりである)、−CONR5R6、−NR5R6(ここで、R5およびR6は、上記に定義したとおりである)または−N3である];
(f)−CH=CH(CH2)m1R16[ここで、m1は、0から4であり、R16は、水素、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、−COOR15、−OR15(ここで、R15は上記に定義したとおりである)、−CONR5R6または−NR5R6(ここで、R5およびR6は上記に定義したとおりである)];
(g)−CH=C(CO2R12)2(ここで、R12は、上記に定義したとおりである);
(h)−C≡C(CH2)nR16(ここで、nは0から4であり、R16は、上記に定義したとおりである);
(i)−CH2OR22(ここで、R22は、3個の低級アルキル基が同じかもしくは異なっているトリ−低級アルキルシリルであるか、またはR22は、R8と同じ意味を有する);
(j)−CH(SR23)2および−CH2−SR7(ここで、R23は、低級アルキル、低級アルケニルまたは低級アルキニルであり、R7は、上記に定義したとおりである)
からなる群から、それぞれ独立して、選択され;
Rk3は、水素、ハロゲン、アシル、カルバモイル、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニルまたはアミノであり;
Wk1およびWk2は、独立して、水素、ヒドロキシであるか、またはWk1およびWk2は一緒に酸素を表す。]
化合物(K)は、例えば、下記一般式(k0)で表される化合物を、無水ヒドラジン又はヒドラジン水和物の存在下、無溶媒で還流して製造することができる。また、例えば、下記一般式(k0)で表される化合物をメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、tert−ブタノール、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、テトラヒドロフラン(THF)、ジオキサン、アセトニトリル、トルエン等の溶媒に溶解し、無水ヒドラジンに添加して反応させることにより製造することができる。反応温度及び反応時間は特に限定されないが、例えば室温〜50℃で30分〜15時間反応させることができる。
本発明の第二の態様は、下記一般式(ka)で表される繰り返し単位(ka)、及び下記一般式(II)で表される繰り返し単位(II)を有するポリマーを含有する薬物複合体(以下、「薬物複合体(K)」という場合がある。)である。
前記一般式(ka)中、Lはメチレン基、エチレン基、プロピレン基、ベンジレン基が好ましく、メチレン基、エチレン基又はベンジレン基がより好ましい。
前記一般式(ka)中、R1は水素原子又は脂肪族炭化水素基が好ましく、水素原子又はメチル基がより好ましい。
前記一般式(ka)中、Rk1およびRk2はそれぞれ独立に、水素、ハロゲン、ニトロ、−CH2OH、−(CH2)kR14、−CH=CH(CH2)mR16、−C≡C(CH2)nR15、−CO(CH2)jR4(ここで、R4は−SR7である)、CH2O−(置換または非置換の)低級アルキル(ここで、置換低級アルキルは、好ましくは、メトキシメチル、メトキシエチルまたはエトキシメチルである)又は−NR5R6であることが好ましく、水素であることがより好ましい。
前記一般式(ka)中、Rk3は、水素またはアセチルであることが好ましく、水素であることがより好ましい。
前記一般式(ka)中、Wk1およびWk2は水素であることが好ましい。
前記一般式(II)中、mは1が好ましい。
前記一般式(II)中、XはORxが好ましく、OH(ヒドロキシ基)がより好ましい。
前記一般式(ka−1)中、Lはメチレン基、エチレン基、プロピレン基、ベンジレン基が好ましく、メチレン基、エチレン基又はベンジレン基がより好ましい。
前記一般式(ka−1)中、R1は水素原子又は脂肪族炭化水素基が好ましく、水素原子又はメチル基がより好ましい。
前記一般式(II)中、XはORxが好ましく、OH(ヒドロキシ基)がより好ましい。
また、薬物複合体(K)を含有するミセルを調製することにより、第1の態様のミセルと同様に、生体内のpH環境に依存して、薬物複合体(K)からの化合物(K)のリリースを制御することができる。薬物複合体(K)を含有するミセルの調製は、第1の態様の薬物複合体のミセルと同様に、公知の方法により調製することができる。例えば、薬物複合体(K)を親油性又は親水性の溶媒に溶解又は懸濁し、当該溶解液又は懸濁液を親水性又は親油性の溶媒に滴下して撹拌することにより、薬物複合体(K)を含有するミセルを調製することができる。
なお、薬物複合体(K)は、第1の態様の薬物複合体において、薬物が化合物(K)である態様であり、第1の態様の薬物複合体に包含される。また、薬物複合体(K)は、第1の態様における一般式(Ia)において、BMが化合物(K)である態様であるということもできる。
化合物(K)又は薬物複合体(K)は、そのまま生体に投与することもできるが、公知の手法により、適宜他の成分と混合して製剤化されてもよい。したがって、本発明はまた、化合物(K)又は薬物複合体(K)を含む医薬組成物も提供する。化合物(K)又は薬物複合体(K)が製剤化される場合、剤型は特に限定されず、乳剤、エマルション剤、液剤、ゲル状剤、カプセル剤、軟膏剤、貼付剤、バップ剤、顆粒剤、錠剤、造影剤等とすることができる。また、薬物複合体(K)は、ミセルの形態としてもよい。
化合物(K)又は薬物複合体(K)を含む医薬組成物は、任意に化合物(K)又は薬物複合体(K)の他の成分を含んでもよい。他の成分は、医薬品分野において一般的に使用される成分を特に制限なく使用することができる。例えば、前記医薬組成物は、化合物(K)又は薬物複合体(K)を薬学的に許容される担体に溶解又は懸濁したものであってもよい。薬学的に許容される担体としては、医薬分野において常用されるものを特に制限なく使用することができ、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝液、DMSO、ジメチルアセトアミド、エタノール、グリセロール、ミネラルオイル等を挙げることができる。また、他の成分としては、その他に、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、pH調整剤、賦形剤、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、防腐剤、着色剤、香料等が挙げられる。
前記医薬組成物は、単回投与又は複数回投与を行うことが可能であり、その投与期間及び間隔は、薬物の種類、疾患の種類及び状態等、投与経路、投与対象の年齢、体重及び性別等によって、適宜選択することができる。
前記医薬組成物の投与量は、その投与期間及び間隔は、薬物の種類、疾患の種類及び状態等、投与経路、投与対象の年齢、体重及び性別等によって、適宜選択することができる。前記医薬組成物の投与量は、治療的有効量とすることができ、例えば、1回につき体重1kgあたり0.01〜1000mg程度とすることができる。
また、化合物(K)、薬物複合体(K)、又は薬物複合体(K)のミセルは、EGFRのゲートキーパー変異(d746−750/T790M、d746−750/T790M/C797S、L858R,T790Mなど)有する腫瘍細胞、及びc−Kit、FLT3、若しくはRETに変異を有する腫瘍細胞に対して、高い細胞傷害活性を示す。そのため、前記医薬組成物は、これらの変異を有する腫瘍を治療又は予防するための医薬組成物として、特に好適に用いることができる。例えば、前記医薬組成物は、図42に示す変異を有する腫瘍を治療又は予防するための医薬組成物として好適に用いることができる。これらの変異を有する癌は、既存の腫瘍治療薬に対して耐性であることが多いため、前記医薬組成物は極めて有用性が高い。そのため、本発明は、既存の腫瘍治療薬に対して耐性である腫瘍治療又は予防するための前記医薬組成物もまた提供する。既存の腫瘍治療薬としては、特に限定されないが、ゲフェチニブ、アファチニブ、オシメチニブ、ミドスタウリン、エルロチニブ、AG1478、ゲムシタビン、シスラプチン、ペメトレキセド等が挙げられる。また、前記医薬組成物の好適な使用態様として、既存の腫瘍治療薬との併用が挙げられる。そのため、本発明は、化合物(K)又は薬物複合体(K)と、少なくとも1種の他の腫瘍治療薬と、を含む、腫瘍を治療又は予防するための医薬組成物もまた提供する。
α−メトキシ−ω−アミノ ポリ(エチレングリコール)の末端第一級アミノ基によって開始される、β−ベンジルアスパラギン酸 N−カルボキシアルデヒドの開環重合により、メトキシ−ポリ(エチレングリコール)−b−ポリ(β−ベンジル−アスパルタミド)(MeO−PEG−PBLA;PEG分子量=12kDa;PBLAの重合度=40)コポリマーを合成した。ω−アミン基は、アセチル化によりブロックした。
PEG−PBLAポリマー(220mg、0.011mmol)をDMF(2mL)で溶解し、{〔4−(ジメトキシメチル)フェニル〕メタンアミン}(100μL、0.58mmol)を添加して、徐々に温度を上げて40℃で4日間撹拌した。特性分析のために、反応混合物の一部をエーテル沈殿し、芳香族アセタール基導入ポリマーを回収した。
反応スキームを図1に示す。また、得られた芳香族アセタール基導入ポリマーの1H−NMR解析結果を図2に示す。
1H−NMR解析により25個のベンジルエステルユニットのアミドへの置換が、確認された。残りのベンジルエステル(40−25=15)は、おそらくエーテル沈殿操作中に、加水分解された。
アミノリシス反応後、反応混合物を酸性化し(0.1N HCl、100μL、30分)、その後、水で透析し、ポリマーを凍結乾燥することにより、透析袋からアルデヒド基導入ポリマーを回収した。反応スキームを図1に示す。また、得られた芳香族アルデヒド基含有ポリマーの1H−NMR解析結果を図3に示す。27個のアルデヒドユニットが1H−NMRスペクトラムで確認された。
脂肪族アルデヒド基含有ポリマーの合成は、{〔4−(ジメトキシメチル)フェニル〕メタンアミン}に替えて、1−アミノ−3,3−ジエトキシプロパンを使用した以外は、芳香族アルデヒド基含有ポリマーの合成と同様の方法で行った。反応スキームを図1に示す。また、中間体である脂肪族アセタール基含有ポリマーの1H−NMR解析結果を図4に示す。また、得られた芳香族アルデヒド基含有ポリマーの1H−NMR解析結果を図5に示す。23個のアルデヒドユニットが1H−NMRスペクトラムで確認された。
<DAVBNHの合成>
硫酸ビンブラスチンは、BOC Science(US)から購入した。硫酸ビンブラスチンはアルカリ処理によりビンブラスチンに変換した。硫酸ビンブラスチン(200mg)を水(3mL)に溶解し、水酸化ナトリウム溶液(5N)を滴下しながら添加した。
これにより、白い懸濁液を得た。ジクロロメタン(DCM)により、この懸濁液からフリーのビンブラスチンを抽出した。DCM相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、エバポレートして約150mgのフリーのビンブラスチンを得た。
ビンブラスチン(150mg)を無水メタノール(1mL)に溶解し、無水ヒドラジン(1mL)に添加した。反応混合物を55℃で22時間撹拌した。反応混合物をエバポレートして乾燥体を得た。エバポレーションでは、トルエンを共エバポレーション溶媒として用いた。得られた生成物を、さらなる精製を行うことなく、薬物複合体とミセルの調製に使用した。当該生成物をHPLCで分析した。分析結果を図6A及び図6Bに示す。HPLC解析の条件は以下の通りである。
GE’s IncrtSustain C18カラム 4.6×250mm
溶媒A:0.1%トリフルオロ酢酸 pH2.0
溶媒B:アセトニトリル
5%B〜80B%の勾配
流速:1mL/分、30分
UV検出:波長220nm
なお、ビンブラスチンからのDAVBNHの合成スキームを以下に示す。
上記のように得られた生成物(DAVLBH)と芳香族アルデヒド基含有ポリマーとの反応をDMSO溶液中で35〜40℃で72時間行い、その後、透析により溶媒をジメチルアセトアミド(DMAc)に交換した(4時間透析、透析溶媒は1度交換)。この溶媒交換により透明なDMAc溶液が生成された。なお、芳香族アルデヒド基導入ポリマーとDAVBNHとの結合反応スキームを図7に示す
上記のように得られたDMAc溶液をミセルの調製に使用した。薬物複合体のDMAc溶液を、容量比で水10に対して1の割合で、水に滴下してボルテックスし、ミセルを調製した。この溶液を、分画分子量(MWCO)3500Daの透析バッグで24時間、水で透析した。透析媒体は、透析中に5回交換した。透析バッグ中の溶液をフィルター(0.22μm)ろ過し、100kDa MWCOのフィルターメンブランを用いた限外濾過により濃縮した。
上記方法に従って、DAVBNHの負荷量(14%、25%、33%)が異なる3種類のミセルを調製した。なお、薬物結合反応において、ポリマーに添加されたDAVLBHのポリマーに対する質量比を、DAVBNHの負荷量とした。薬物結合反応の結果と薬物負荷量の違いを1H NMR解析により確認した。ミセル水溶液は、凍結乾燥し、NMR解析のためにd6DMSOに再溶解した。1H NMR解析の結果を図8A、図8B及び図8Cに示す。図8A、図8B及び図8Cは、DAVBNHの負荷量がそれぞれ14%、25%、33%であるミセルの解析結果である。
1H NMR解析により、薬物結合反応中のDAVBNHの負荷量を変えることにより、ポリマーに結合するDAVBNHの量を制御できることが確認された。
TOSOH’s TSKgel ODS−80Tmカラム 4.6×150mm
20mM リン酸バッファー(pH2.5)及びメタノール(1:1)均一濃度
流速:0.6mL/分
UV検出:波長220nm
ミセルのサイズと多分散指数(PDI)を、動的光散乱(DLS)手法により求めた。
測定は、入射ビームとして緑色レーザー(532nm)を用い、173°の検出角度で、Zetasizer nano ZS(Malvern instruments,UK)を使用して、25℃の温度条件で行った。結果を表1及び図10に示す。なお、図10中の各指標の説明を表2に記載した。また、表1中、%薬物コンジュゲーションの値は以下の式により算出した。
硫酸ビンブラスチンと薬物複合体(実施例1のDAVBNH結合ポリマーミセル)のin vitro細胞毒性を、cell−counting kit−8を用いて、神経膠芽腫細胞株であるU87MGに対して評価した。U87MG細胞(3000細胞/ウェル)を、96ウェルプレートを用いて、10% FBSを含むDMEM培地で培養した。その後、U87MG細胞を異なる用量の硫酸ビンブラスチン又は薬物複合体に曝露した。曝露後48時間と72時間における細胞生存率を、450nmでのホルマザン吸光度450nmを測定することにより求めた。
細胞毒性試験の結果を図11に示す。図11中、「VBN」は硫酸ビンブラスチンを示し、「V/m」はDAVBNH結合ポリマーミセルを示す。DAVBNH結合ポリマーミセルでは、IC50の値は、硫酸ビンブラスチンよりも高かったが、細胞傷害活性の用量依存性の特性は、硫酸ビンブラスチンと同様であった。この結果は、DAVBNHがミセル中で活性を維持していることを示す。
<Alexa−647標識DAVBNH結合ポリマーミセルの調製>
芳香族アルデヒド基含有ポリマー(20mg)、DAVBNH(10mg)及びAlexa−647ヒドラジド(0.5mg)をDMSO(1mL)に溶解し、35℃で72時間撹拌した。溶媒をDMAcに交換して、実施例1の<DAVBNH結合ポリマーミセルの調製>で記載したようにミセルを調製した。
血中動態試験は、in vivoレーザー走査顕微鏡を用いて行った。直立ECLIPASE FN1(株式会社ニコン、東京、日本)に設置した、Plan Apo VC 20x DIC N2 Nikonレンズ(開口数:0.75)を装着したNikon A1R共焦点レーザー走査顕微鏡システムを使用した。640nmのレーザーをAlexa−647の励起に使用した。Alexa−647標識DAVBNH結合ポリマーミセル(約30mg/kg:ビンブラスチンの投与量として)を、尾静脈カテーテルを用いて、マウス(BALB/c Nude、雌、6週齢)に投与した。Alexa647標識DAVBNH結合ポリマーミセルは、マウスの耳たぶ領域血管内の血流により観察し、投与後20時間血中動態をモニタリングした。得られたデータは、Nikon NIS Elements(ver.4.00.06)を用いて処理した。
血中動態試験の結果を図12に示す。Alexa−647標識DAVBNH結合ポリマーミセルは、少なくとも20時間、血液中を循環することが確認された。
DMEM培地中の5x106個のU87MG細胞を、マウス(BALB/c Nude、雌、6週齢)の皮下に接種した。接種5日後に、薬剤による処理を開始した。薬物の静脈内注射を、4日後毎に4回行った。投与群は以下の通りとし、各群の個体数は5とした。
投与群1:PBS投与(PBS)
投与群2:硫酸ビンブラスチン 2mg/kg(VBN)
投与群3:DAVBNH 2mg/kg(DAVBNH)
投与群4:DAVBNH結合ポリマーミセル(実施例1) 2mg/kg(V/m 2)
投与群5:DAVBNH結合ポリマーミセル(実施例1) 4mg/kg(V/m 4)
投与群6:DAVBNH結合ポリマーミセル(実施例1) 8mg/kg(V/m 8)
投与群7:DAVBNH結合ポリマーミセル(実施例1) 16mg/kg(V/m 16)
in vivo抗腫瘍試験の結果を図12に示す。なお、上記投与群の括弧内は、図13A及び図13Bに記載した各投与群の略語である。図13Aは腫瘍サイズの経時変化であり、図13Bはマウスの体重の経時変化である。DAVBNH結合ポリマーミセル投与群は、硫酸ビンブラスチン投与群及びDAVBNH投与群と同様の抗腫瘍効果を示した。また、DAVBN結合ポリマーミセル投与群は、いずれの投与量においても顕著な体重減少は観察されなかった。ビンブラスチンは、毒性が強く、マウスに対する最大耐性用量は2mg/kgである。一方、本試験において、DAVBNH結合ポリマーミセルは16mg/kgを投与しても顕著な毒性は確認されなかった。この結果は、DAVBNH結合ポリマーミセルの形態とすることにより、抗腫瘍活性を維持しつつ、ビンブラスチンの毒性を緩和できることを示している。
PEG−PBLAポリマー(318mg、0.016mmol)をDMF(3mL)で溶解し、得られた溶液に3,3−ジメトキシブタン(200μL)を添加した。反応液を40℃で72時間撹拌し、HCl溶液(100μL、0.1N)添加して1時間撹拌した。水で透析し、ポリマーを凍結乾燥することにより、側鎖に脂肪族ケトンが導入されたポリマーを回収した。
反応スキームを図14に示す。また、得られた脂肪族ケトン基含有ポリマーの1H−NMR解析結果を図15に示す。35個の脂肪族ケトンユニットがポリマーに導入されていることが確認された。
実施例1で得られたDAVLBHと合成例5で得た脂肪族ケトン含有ポリマーとの反応をDMSO溶液中で35〜40℃で72時間行い、その後、透析により溶媒をジメチルアセトアミド(DMAc)に交換した(4時間透析、透析溶媒は1度交換)。この溶媒交換により透明なDMAc溶液が生成された。
上記のように得られたDMAc溶液をミセルの調製に使用した。薬物複合体のDMAc溶液を、容量比で水10に対して1の割合で、水に滴下してボルテックスし、ミセルを調製した。この溶液を、分画分子量(MWCO)3500Daの透析バッグで24時間、水で透析した。透析媒体は、透析中に5回交換した。透析バッグ中の溶液をフィルター(0.22μm)ろ過し、100kDa MWCOのフィルターメンブランを用いた限外濾過により濃縮した。DAVBNHの負荷量は33%であった。
実施例1と同様にして、ミセルのサイズと多分散指数(PDI)を、動的光散乱(DLS)手法により求めた。結果を図16に示す。
実施例1及び5のポリマーミセルDMAc溶液をそれぞれリン酸バッファー975μLで異なるpHで希釈し、37℃で48時間培養した。逆相クロマトグラフィ−(RPLC)により、所定の時間におけるポリマーミセルDMAc溶液からの薬剤リリースを測定した。HPLC解析の条件は以下の通りである。
HPLC (東ソー製TSKgel ODS−80Tm C18 カラム 4.6×150mm)
溶媒:20mMリン酸バッファー(pH2.5)とメタノールとの1:1混合均一溶媒
流速:0.6mL/分
UV検出:波長220nm
図17及び18に示される結果から、本願発明を適用した実施例1及び5のポリマーミセル溶液は、pH感受性薬剤リリースが確認された。特に、生体内の環境を考えると、酸性化しているがんの周辺環境(pH6.6)および細胞質内に取り込まれた後エンドソーム(pH5)での薬剤リリースは、実施例5の脂肪族ケトン含有ポリマーの方が優れていることが確認された。
実施例5のDAVBNH結合ポリマーミセルのin vitro細胞毒性を、実施例2と同様にcell−counting kit−8を用いて、神経膠芽腫細胞株であるU87MGに対して評価した。結果を表3に示す。なお、表3中、参考までに、図11の結果も併記する。
DAVBNHをマウス(BALB/c Nude、雌、6週齢)に4日後毎に4回(0日、3日、6日、9日)投与し、最大耐性用量(MTD)を評価した。投与群は以下の通りとし、各群の個体数は3とした。結果を図19に示す。
投与群1:DAVBNH 3mg/kg
投与群2:DAVBNH 4mg/kg
投与群3:DAVBNH 6mg/kg
薬剤をマウス(BALB/c Nude、雌、6週齢)に4日後毎に4回(0日、3日、6日、9日)投与し、最大耐性用量(MTD)を評価した。投与群は以下の通りとし、各群の個体数は5とした。結果を図20に示す。
投与群1:PBS(対照)
投与群2:DAVBNH(VinHyd) 2mg/kg
投与群3:DAVBNH結合ポリマーミセル(実施例1) 2mg/kg
投与群4:DAVBNH結合ポリマーミセル(実施例1) 4mg/kg
投与群5:DAVBNH結合ポリマーミセル(実施例1) 16mg/kg
U87MG−Luc2(2μL中1.0×10 5個の細胞)をブレグマの1.0mm前部および2.0mmに頭蓋内に移植し、Balb/cヌードマウスの脳表面に3.0mmの深さに移植した。
腫瘍を5〜6日間増殖させ、BALB/cヌードマウスの3群(n=6)において抗腫瘍活性アッセイを開始した。
投与群は以下の通りとした。
投与群1:対照としてのPBS
投与群2:DAVBNH 2mg/kg(MTD)
投与群3:DAVBNH結合ポリマーミセル(実施例1) 16mg/kg(安全耐性用量)
治療スケジュールは、以下の通りとした。
第1フェーズ:2日間隔(0日、3日、6日及び9日)で4回の注射に設定。
第2フェーズ:毎週7回の注射。合計治療期間約1.5ヶ月。
IVISスペクトル(Xenogen Corporation)を用いてインビボイメージングを行い、D−ルシフェリンカリウム塩溶液をルシフェラーゼの基質として使用した。
図22は実施例8の各投与群における25日目の腫瘍増殖の対比グラフである。
図23は、実施例8の各投与群における腫瘍増殖曲線を示すグラフである。
図21A、図21B、図22及び図23に示される結果から、DAVBNH結合ポリマーミセルは脳腫瘍同所移植モデルにおいて尾静脈注射で有意に脳腫瘍を縮小させ、有意に生存を延長させることが確認された。
また、実施例8においては、最大耐性用量(MTD)のDAVBNH(2mg/kg)と安全耐性用量のDAVBNH結合ポリマーミセル(16mg/kg)を用いている。したがって、DAVBNHによる治療については改善の余地はないが、DAVBNH結合ポリマーミセルによる治療は更なる改善の余地があることも確認された。
<K252a−Hの合成>
K252aは、BOC Science(US)から購入した。K252a(20mg)を無水メタノール(200μL)に溶解し、無水ヒドラジン(300μL)に添加した。反応混合物を40℃で15時間撹拌した。反応混合物をエバポレートして乾燥体を得た。エバポレーションでは、トルエンを共エバポレーション溶媒として用いた。得られた生成物を、さらなる精製を行うことなく、薬物複合体とミセルの調製に使用した。得られた生成物の1H−NMR解析結果を図24に示す。得られた生成物では、K252aのメチル基が消失し、ヒドラジド基プロトンのピークが確認されたことから、K252a−Hが得られたことが確認できた。また、K252a−HをHPLCで分析した。分析結果を図25に示す。K252a−HとK252aとは、リテンションタイムが異なっていることから、両者は異なる構造であることが確認された。なお、HPLC解析の条件は以下の通りである。
TSK−GEL ODS−100Vカラム 4.6×150mm、粒子径5μm(東ソー株式会社)
カラム圧:10.7MPa
カラム温度:40℃付近の一定の温度
移動相:メタノール/ギ酸緩衝液(pH3.0)混液(3:2)
流速:1.2mL/分、20〜30分
UV検出:波長290nm
K252aからのK252a−Hの合成スキームを以下に示す。
上記のように得られた生成物(K252a−H)と芳香族アルデヒド基含有ポリマー又は脂肪族ケトン含有ポリマーとの反応をDMSO溶液中で35〜40℃で72時間行い、その後、透析により溶媒をジメチルアセトアミド(DMAc)に交換した(4時間透析、透析溶媒は1度交換)。この溶媒交換により透明なDMAc溶液が生成された。
上記のように得られたDMAc溶液をミセルの調製に使用した。薬物複合体のDMAc溶液を、容量比で水10に対して1の割合で、水に滴下してボルテックスし、ミセルを調製した。この溶液を、分画分子量(MWCO)3500Daの透析バッグで24時間、水で透析した。透析媒体は、透析中に5回交換した。透析バッグ中の溶液をフィルター(0.22μm)ろ過し、100kDa MWCOのフィルターメンブランを用いた限外濾過により濃縮した。
ミセルのサイズと多分散指数(PDI)を、動的光散乱(DLS)手法により求めた。測定は、入射ビームとして緑色レーザー(532nm)を用い、173°の検出角度で、Zetasizer nano ZS(Malvern instruments,UK)を使用して、25℃の温度条件で行った。結果を図26A及び図26Bに示す。図26Aは、芳香族アルデヒド基含有ポリマーとK252a−Hとの薬物複合体のミセル(以下、「K252a−H結合芳香族ポリマーミセル」という。)であり、図26Bは、脂肪族ケトン基含有ポリマーとK252a−Hとの薬物複合体のミセル(以下、「K252a−H結合脂肪族ポリマーミセル」という。)である。
K252a−H粉末を、蒸留水又はメタノールに1mg/mLで溶解し、よく混合した。その後、孔径22μmのフィルターでろ過した。前記のように調製したろ液について、分光光度計(ジャスコ V670)を用いて紫外吸収スペクトルを測定した。結果を図27に示す。図27の結果から、K252a−Hは、水には1μg/mL以下でしか溶解しないことが確認された。
一方、K252a−H結合芳香族ポリマーミセル及びK252a−H結合脂肪族ポリマーミセルを、水に溶解し、HPLCでK252a−Hの濃度測定を行ったところ、水に対して2mg/mL以上の溶解性を示すことが確認された(図示せず)。以上の結果より、K252a−Hのような水に難溶の化合物であっても、ミセル化することによって、水に対する溶解性を増大できることが示された。
K252a−H結合脂肪族ポリマーミセルを、pH1の水性緩衝液(メタノール:ギ酸緩衝液(pH3)=3:2)中で、37℃で1時間インキュベートした。その後、HPLC解析を行った。HPLC条件は、実施例9と同様である。結果を図28に示す。pH1水性緩衝液処理後のサンプルで、K252a−Hと同一のピークが確認されたことから、酸性条件下で、K252a−H結合脂肪族ポリマーミセルからK252a−Hが放出されることが示された。
表4に示す肺癌細胞株を用いて、K252a−H結合芳香族ポリマーミセル及びK252a−H結合脂肪族ポリマーミセルの細胞毒性試験を行った。
なお、以下の実施例において、使用した細胞株はアメリカン・タイプ・. カルチャー・コレクション(American Type Culture. Collection, ATCC)もしくはJCRB(医薬基盤研)の細胞バンクより購入した。PC14 PE6は、法正先生(鳥取大学)より分与してもらった。培地は、特に記載していない限り、DMEM、RPMI又はE−MEMを使用した。Gefetinib、Afatinib、Erlotinib、Cisplatin、Pemetrexed、Gemicitabineは、フナコシ株式会社より購入した。Osimertinib は Selleck Chemicals社より購入した。
24ウェルプレートの10個の各ウェルに、300μLの培地を加えた。ミセル溶液100μLを24ウェルプレートのウェル1Aに加え、ピペッティング(10回程度)で撹拌した後、そこから100μLをウェル2Bへ移し、同様に撹拌した。同様の操作を10回繰り返し、10種類の濃度のミセル溶液を調整した。
上記で調整したミセル溶液を、癌細胞を播種した96ウェルプレートの列3から列12までミセル濃度の高い順に50μLずつ加えた。列1と2には、培地のみを50μL加えた。その後、3時間インキュベートした。インキュベート後、細胞を残してウェル内の溶液を除去し、200μLの培地で各ウェル内の細胞を洗浄した。最後に、100μLの培地を各ウェルに加えて48時間インキュベートした。
48時間後に、cell−counting kit−8溶液(DOJINDO)を各ウェルに10μLずつ添加した。再びインキュベーターし、30分後、1時間後、及び2時間後に、450nmの吸光度を測定した。
各種膵癌細胞株を用いて、上記と同様に、K252a−H結合芳香族ポリマーミセル及びK252a−H結合脂肪族ポリマーミセルの細胞毒性試験を行った。結果を図31に示す。BXPC3−F3株は、マウスへの同所移植後、肝転移した癌細胞株を樹立することを3回繰り返して悪性化させた転移株である。また、KP−3Lは、ヒト肝転移膵臓癌をヌードマウスの脾臓に移植後、肝転移した癌細胞株を樹立した転移株である(国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄養研究所 JCRB細胞バンクより入手)。また、Gemcitabine及びErlotinibは、現在認可されている膵癌治療薬である。
図31に示すように、K252a−H及びK252a−H結合ポリマーミセルは、Gemcitabine及びErlotinibの効果が低いK−ras変異株及び悪性化転移株に対して、有効であることが確認された。なお、K252a−H結合芳香族ポリマーミセルとK252a−H結合脂肪族ポリマーミセルとでは、K252a−H結合脂肪族ポリマーミセルの方が癌細胞に対する細胞傷害活性が高い傾向にあった。
各種頭頚部癌細胞株を用いて、上記と同様に、K252a−H結合芳香族ポリマーミセル及びK252a−H結合脂肪族ポリマーミセルの細胞毒性試験を行った。結果を図32に示す。なお、CDDPは、頭頸部癌の標準治療薬であるシスラプチンを示す。
図32に示すように、K252a−H及びK252a−H結合脂肪族ポリマーミセルは、いずれの頭頸部癌細胞株に対しても、シスラプチンよりも高い細胞傷害活性を示した。特に、Fradu株では、K252a−H結合脂肪族ポリマーミセルの細胞傷害活性が高かった。
中皮腫細胞株MSTO−211Hを用いて、上記と同様に、K252a−H結合芳香族ポリマーミセル及びK252a−H結合脂肪族ポリマーミセルの細胞毒性試験を行った。結果を図33に示す。なお、CDDPはシスラプチンを示し、中皮腫の標準治療薬である。Pemetrexedも中皮腫の標準治療薬である。
図33に示すように、K252a−H及びK252a−H結合脂肪族ポリマーミセルは、シスラプチン及びPemetrexedよりも高い細胞傷害活性を示した。K252a−H結合芳香族ポリマーミセルは、シスラプチンと同程度の細胞傷害活性を示した。
<JQ−1−Hの合成>
JQ−1は、BOC Science(US)から購入した。JQ−1(20mg)を無水メタノール(500μL)に溶解し、無水ヒドラジン(500μL)に添加した。反応混合物を40℃で一晩撹拌した。反応混合物をエバポレートして乾燥体を得た。エバポレーションでは、トルエンを共エバポレーション溶媒として用いた。得られた生成物を、さらなる精製を行うことなく、薬物複合体とミセルの調製に使用した。得られたJQ−1−Hの1H−NMR解析結果を図34に示す。
なお、JQ−1からのJQ−1−Hの合成スキームを以下に示す。
上記のように得られた生成物(JQ−1−H)と芳香族アルデヒド基含有ポリマーとの反応をDMSO溶液中で35〜40℃で72時間行い、その後、透析により溶媒をジメチルアセトアミド(DMAc)に交換した(4時間透析、透析溶媒は1度交換)。この溶媒交換により透明なDMAc溶液が生成された。
上記のように得られたDMAc溶液をミセルの調製に使用した。薬物複合体のDMAc溶液を、容量比で水10に対して1の割合で、水に滴下してボルテックスし、ミセルを調製した。この溶液を、分画分子量(MWCO)3500Daの透析バッグで24時間、水で透析した。透析媒体は、透析中に5回交換した。透析バッグ中の溶液をフィルター(0.22μm)ろ過し、100kDa MWCOのフィルターメンブランを用いた限外濾過により濃縮した。得られたJQ−1−H結合ポリマーミセルの1H−NMR解析結果を図35に示す。
ミセルのサイズと多分散指数(PDI)を、動的光散乱(DLS)手法により求めた。測定は、入射ビームとして緑色レーザー(532nm)を用い、173°の検出角度で、Zetasizer nano ZS(Malvern instruments,UK)を使用して、25℃の温度条件で行った。結果を図36及び図37に示す。図36は、芳香族アルデヒド基含有ポリマーとJQ−1−Hとの薬物複合体のミセル(以下、「JQ−1−H結合芳香族ポリマーミセル」という。)であり、図37は、脂肪族アルデヒド基含有ポリマーとJQ−1−Hとの薬物複合体のミセル(以下、「JQ−1−H結合脂肪族ポリマーミセル」という。)である。
実施例12と同様の方法で、肺癌細胞株H1975及び肺癌細胞A549に対するJQ−1−H結合芳香族ポリマーミセルの細胞毒性試験を行った。なお、添加濃度は、H1975が5μg/ml、A549が30μg/mlとし、72時間インキュベート後の生存%を確認した。
Rection Biology社に委託して、Monthly 202 mutant kinase panelを用いて、K252a−Hのキナーゼプロファイリングを行った。キナーゼアッセイの条件は、以下の通りである。K252aは、DMSOに溶解し、100nMでアッセイを行った。
バッファー条件:20mM HEPES、pH7.5、10mM MgCl2、1mM EGTA、(適用可能であれば、2mM MnCl2)
ATP濃度:10μM
反応時間:2時間
図41A〜Cに、キナーゼプロファイリングの結果を示す。図42に、K252a−Hに対するキナーゼプロファイリングの結果、キナーゼ活性が30%以下に抑制された突然変異キナーゼの一覧を示す。K252a−Hは、癌遺伝子であるc−kit/Flt3/RETの強力な阻害剤であることが確認された。
Claims (6)
- ポリマーの製造方法であって、
下記一般式(II’)で表される繰り返し単位(II’)を有するポリマー(P1)と下記一般式(1a)で表される化合物(1a)とを反応させて、下記一般式(I’)で表される繰り返し単位及び前記繰り返し単位(II’)を有するポリマー(P2)を得る工程(1)と、
前記ポリマー(P2)を中性条件下又は弱酸性条件下で加水分解して、下記一般式(I)で表される繰り返し単位(I)及び下記一般式(II−1)で表される繰り返し単位(II−1)を有するポリマーを得る工程(2)と、
を含むことを特徴とするポリマーの製造方法。
- 下記一般式(II’)で表される繰り返し単位(II’)を有するポリマー(P1)と下記一般式(1a)で表される化合物(1a)とを反応させて、下記一般式(I’)で表される繰り返し単位及び前記繰り返し単位(II’)を有するポリマー(P2)を得る工程(1)と、
前記ポリマー(P2)をアルカリ条件下の加水分解、エステル交換反応、アミノリシス、並びにアルカリ条件下の加水分解及びアミドカップリングからなる群より選ばれる少なくとも1種の処理に付し、下記一般式(I’)で表される繰り返し単位(I’)及び下記一般式(II’)で表される繰り返し単位(II’)を有するポリマー(P3)を得る工程(2a)と、
前記ポリマー(P3)を中性条件下又は弱酸性条件下で加水分解して、下記一般式(I)で表される繰り返し単位(I)及び下記一般式(II)で表される繰り返し単位(II)を有するポリマーを得る工程(2b)と、
を含むポリマーの製造方法。
- 請求項1に記載のポリマー、及び
前記ポリマーに結合した少なくとも1種の薬物
を含有する薬物複合体。 - 請求項5に記載の薬物複合体を含有するミセル。
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