JPWO2018016451A1 - Ｐｃｒ法を用いた大腸菌の広域鞭毛抗原型判定方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】H型の判定を迅速かつ簡易に行うことが可能な実用的判定手法の開発。
【解決手段】大腸菌の鞭毛を構成するフラジェリンをコードする遺伝子の多様性領域の核酸増幅を行うことにより，H型別の判定を行うことを特徴とする大腸菌H型別判定方法。すなわち，本発明により，大腸菌のH型を遺伝学的に迅速かつ正確に判定することが可能となったため，医療や公衆衛生・食品衛生の場において，腸管出血性大腸菌を含む病原大腸菌感染症の予防や感染拡大を，より適切かつ迅速に防ぐことが期待できる。
【選択図】図４
【解決手段】大腸菌の鞭毛を構成するフラジェリンをコードする遺伝子の多様性領域の核酸増幅を行うことにより，H型別の判定を行うことを特徴とする大腸菌H型別判定方法。すなわち，本発明により，大腸菌のH型を遺伝学的に迅速かつ正確に判定することが可能となったため，医療や公衆衛生・食品衛生の場において，腸管出血性大腸菌を含む病原大腸菌感染症の予防や感染拡大を，より適切かつ迅速に防ぐことが期待できる。
【選択図】図４
Description
本発明は，PCR法を用いた大腸菌の広域鞭毛抗原型判定方法に関する。さらに詳しくいうと本発明は，PCR法により大腸菌鞭毛抗原型（H型）に準ずる遺伝学的分類を可能とするプライマー，ならびにかかるプライマーを用いた大腸菌の広域鞭毛抗原型判定方法に関する。
大腸菌をはじめとして病原細菌による感染事例が発生した場合，汚染源や汚染経路，汚染範囲をできるだけ早急に特定し，感染の拡大を阻止する必要がある。そのためには，分離株の特徴を正しく判定し，株間の関係性を明確にする必要がある。
大腸菌の細分類においては，O型別とH型別に基づく血清型別（O:H血清型）が，国際的なゴールドスタンダード法として古くから用いられている。
O型別とは，大腸菌の菌体表層に存在する糖鎖構造を抗原として分類する手法である。また，H型別とは，大腸菌の運動器官である鞭毛を抗原として分類する手法である。
現在，「大腸菌のリファレンスと研究に関する世界保健機関協力センター」であるデンマーク国立血清学研究所（SSI：Statens Serum Institut）により，大腸菌の細分類として，185種類のO血清群（O1〜O188，亜型3種類：O18ab/O18ac，O28ab/O28ac，O112ab，O112acを含み，6種類：O31，O47，O67，O72，O94，O122は欠番）と53種類のH型（H1〜H56，3種類：H13，H22，H50は欠番）が定められている（非特許文献１）。
O型別とは，大腸菌の菌体表層に存在する糖鎖構造を抗原として分類する手法である。また，H型別とは，大腸菌の運動器官である鞭毛を抗原として分類する手法である。
現在，「大腸菌のリファレンスと研究に関する世界保健機関協力センター」であるデンマーク国立血清学研究所（SSI：Statens Serum Institut）により，大腸菌の細分類として，185種類のO血清群（O1〜O188，亜型3種類：O18ab/O18ac，O28ab/O28ac，O112ab，O112acを含み，6種類：O31，O47，O67，O72，O94，O122は欠番）と53種類のH型（H1〜H56，3種類：H13，H22，H50は欠番）が定められている（非特許文献１）。
大腸菌感染における国内の現状として，重症化を引き起こす腸管出血性大腸菌（年間約4,000株）は，地方衛生研究所や国立感染症研究所により，ほぼすべての分離株に対して血清型判定が行われている。しかしながら，国内メーカーが販売する抗血清試薬は，一部の血清型にしか対応しておらず（O血清群：50種類，H型：22種類），一部の分離株で判定不能となることが問題となっていた。
発明者のグループは，この問題を解決するために，ほぼすべてのO血清群を遺伝学的に判定できるPCR法（E. coli O-genotyping PCR：ECOG-PCR）を開発し，特許申請および検査現場での実用化に至っている（特許文献１，非特許文献２）。
発明者のグループは，この問題を解決するために，ほぼすべてのO血清群を遺伝学的に判定できるPCR法（E. coli O-genotyping PCR：ECOG-PCR）を開発し，特許申請および検査現場での実用化に至っている（特許文献１，非特許文献２）。
しかしながら，O血清群のみによる判別では，必ずしも十分とはいえない。
例えば，腸管出血性大腸菌として日本においても広く知られているO157は，その名のとおり，O157抗原を有する大腸菌であるが，O157の中には腸管出血性大腸菌でみられるH7に加え，腸管病原性大腸菌でのH39やH45，非病原性大腸菌でのH16など，複数種のH型が含まれることが知られている。また，国内の腸管出血性大腸菌分離報告数で常に上位にくるO103は，H2，H11，H25など複数種のH型が含まれている。
これらのことから，O血清群のみならず，H型についても，正確な型別判定が行われることが求められている。
例えば，腸管出血性大腸菌として日本においても広く知られているO157は，その名のとおり，O157抗原を有する大腸菌であるが，O157の中には腸管出血性大腸菌でみられるH7に加え，腸管病原性大腸菌でのH39やH45，非病原性大腸菌でのH16など，複数種のH型が含まれることが知られている。また，国内の腸管出血性大腸菌分離報告数で常に上位にくるO103は，H2，H11，H25など複数種のH型が含まれている。
これらのことから，O血清群のみならず，H型についても，正確な型別判定が行われることが求められている。
STATENS SERUM INSTUT, E.coli strains, インターネット＜URL：http://www.ssi.dk/English/SSI%20Diagnostica/Products%20from%20SSI%20Diagnostica/Bacterial%20strains/E%20coli.aspx＞
Iguchi A, Iyoda S, Seto K, Morita-Ishihara T, Scheutz F, Ohnishi M, and Pathogenic E. coli Working Group in Japan. Escherichia coli O-genotyping PCR; a comprehensive and practical platform for molecular O-serogrouping. Journal of Clinical Microbiology 53(8):2427-32 (2015)
Joensen K, Tetzschner A, Iguchi A, Aarestrup F, Scheutz F*. Rapid and easy in silico serotyping of Escherichia coli using Whole genome sequencing (WGS) data. Journal of Clinical Microbiology 53:2410-26 (2015)
H型については，その抗原をコードする遺伝子の全配列情報は既に公開されている（非特許文献３）。しかしながら，現在，用いられているH型の判定方法は，抗原を識別対象として用いる判定方法であり，下記の課題を有することから，実用的な判定方法として機能していないのが現状である。
(1) 抗原に適した鞭毛を発現させるためには2〜3日の前培養を要することから，時間がかかり，迅速性に乏しい。
(2) 抗原性が低い（凝集性が低い）ために，判定が不明瞭となる場合がある。
(3) 鞭毛を発現しない菌株に対しては型別できない。
(4) SSIが販売するH型免疫血清が，比較的，高価である（1種類約5万円）。
(1) 抗原に適した鞭毛を発現させるためには2〜3日の前培養を要することから，時間がかかり，迅速性に乏しい。
(2) 抗原性が低い（凝集性が低い）ために，判定が不明瞭となる場合がある。
(3) 鞭毛を発現しない菌株に対しては型別できない。
(4) SSIが販売するH型免疫血清が，比較的，高価である（1種類約5万円）。
なお，病原微生物検出情報によれば，2015年に地方衛生研究所から国立感染症研究所に報告のあった腸管出血性大腸菌O157（1,040株）のうち，H7と判定されたものは75.4%，運動性が無く鞭毛抗原を発現していないものが12.2%，判定不能が0.3%，型別未実施が11.9%であった。このような状況からも，H型については，その判定を行うに足る十分な判定方法ないしその環境が整っていないのが現状である。
上記事情を背景として本発明では，H型の判定を迅速かつ簡易に行うことが可能な実用的判定手法の開発を課題とする。
発明者らは，鋭意研究の結果，鞭毛を構成するフラジェリンと呼ばれるタンパク質の構造多様性が，H型による抗原性の違いを生じさせていることに着目した。加えて，発明者らは，このフラジェリンが，fliCを主として，flkAやflmAなどの遺伝子にコードされていること，ならびに，これら遺伝子が，H型を決定づける多様性領域を有しており，この多様性領域をターゲットとした核酸増幅を行うことにより，H型の識別が可能となることに着想し，プライマー等にかかる発明を完成させたものである。
加えて発明者らは，かかる多様性領域において，核酸増幅を行うに有用な配列領域を見出し，この配列領域を増幅可能なプライマーセットの有用性を確認することにより，プライマー等にかかる発明を完成させたものである。
加えて発明者らは，かかる多様性領域において，核酸増幅を行うに有用な配列領域を見出し，この配列領域を増幅可能なプライマーセットの有用性を確認することにより，プライマー等にかかる発明を完成させたものである。
また，発明者らは，プライマーセットの有用性の確認において新たな課題を発見した。すなわち，H抗原のうちいくつかの種類は，遺伝子の性質上，異なる複数種のH抗原として検出されるという課題である。
発明者らは，かかる課題において，プライマーセットを組み合わせ補完的な検出を行うことにより，それぞれのH抗原を特定しうるH型判定方法の発明を完成させたものである。
発明者らは，かかる課題において，プライマーセットを組み合わせ補完的な検出を行うことにより，それぞれのH抗原を特定しうるH型判定方法の発明を完成させたものである。
本発明は，以下の構成からなる。
本発明の第一の構成は，大腸菌の鞭毛を構成するフラジェリンをコードする遺伝子の多様性領域の核酸増幅を行うことにより，H型別の判定を行うことを特徴とする大腸菌H型別判定方法である。
本発明の第一の構成は，大腸菌の鞭毛を構成するフラジェリンをコードする遺伝子の多様性領域の核酸増幅を行うことにより，H型別の判定を行うことを特徴とする大腸菌H型別判定方法である。
本発明の第二の構成は，前記遺伝子が，fliC，flkA，fllA，flmAのいずれか又は複数から選択されることを特徴とする第一の構成に記載の大腸菌H型別判定方法である。
本発明の第三の構成は，前記多様性領域が，配列番号１から53で示される配列のそれぞれにおいて，5’から500塩基，3’から300塩基を差し引いた配列領域から選択されることを特徴とする第一の構成に記載の大腸菌H型別判定方法である。
本発明の第三の構成は，前記多様性領域が，配列番号１から53で示される配列のそれぞれにおいて，5’から500塩基，3’から300塩基を差し引いた配列領域から選択されることを特徴とする第一の構成に記載の大腸菌H型別判定方法である。
本発明の第四の構成は，前記多様性領域が，配列番号54から106で示される配列領域を含むことを特徴とする第三の構成に記載の大腸菌H型別判定方法である。
本発明の第五の構成は，多様性領域の核酸増幅が，PCR法によりなされることを特徴とする第一から第四の構成に記載の大腸菌H型別判定方法である。
本発明の第六の構成は，核酸増幅が，プライマーセット１から51のいずれか又は複数のプライマーセットを用いてなされることを特徴とする第五の構成に記載の大腸菌H型別判定方法である。
本発明の第五の構成は，多様性領域の核酸増幅が，PCR法によりなされることを特徴とする第一から第四の構成に記載の大腸菌H型別判定方法である。
本発明の第六の構成は，核酸増幅が，プライマーセット１から51のいずれか又は複数のプライマーセットを用いてなされることを特徴とする第五の構成に記載の大腸菌H型別判定方法である。
本発明の第七の構成は，第一から第六の構成に記載の大腸菌H型別判定方法に用いられることを特徴とするプライマーである。
本発明の第八の構成は，第一から第六の構成に記載の大腸菌H型別判定方法に用いられることを特徴とするプライマーセットである。
本発明の第九の構成は，第八の構成に記載のプライマーセットを含み，大腸菌H型別判定方法に用いられるキットである。
本発明の第八の構成は，第一から第六の構成に記載の大腸菌H型別判定方法に用いられることを特徴とするプライマーセットである。
本発明の第九の構成は，第八の構成に記載のプライマーセットを含み，大腸菌H型別判定方法に用いられるキットである。
本発明において，プライマーセットとは，核酸増幅を行う際に最低限必要なプライマーの組み合わせとして定義される。このようなプライマーセットとして，核酸増幅法がPCR法の場合は，フォワードプライマーとリバースプライマーが挙げられ，LAMP法の場合は，FIP，F3プライマー，BIP，B3プライマーが挙げられる。
本発明において，プライマーセット1から51は，配列番号107から配列番号208で示されるPCR法にて用いられるプライマーを，図１から図３に示される通り，フォワードプライマーとリバースプライマーをそれぞれ一組ずつ含むものとして定義されるものである。
本発明において，プライマーセット1から51は，配列番号107から配列番号208で示されるPCR法にて用いられるプライマーを，図１から図３に示される通り，フォワードプライマーとリバースプライマーをそれぞれ一組ずつ含むものとして定義されるものである。
本発明により，H型の判定を迅速かつ簡易に行うことが可能な実用的判定手法の提供が可能となった。
すなわち，本発明により，大腸菌のH型を遺伝学的に迅速かつ正確に判定することが可能となったため，医療や公衆衛生・食品衛生の場において，腸管出血性大腸菌を含む病原大腸菌感染症の予防や感染拡大を，より適切かつ迅速に防ぐことが期待できる。
すなわち，本発明により，大腸菌のH型を遺伝学的に迅速かつ正確に判定することが可能となったため，医療や公衆衛生・食品衛生の場において，腸管出血性大腸菌を含む病原大腸菌感染症の予防や感染拡大を，より適切かつ迅速に防ぐことが期待できる。
以下，本発明の大腸菌H型別判定方法ないしプライマーセット等について説明を行う。
本発明の大腸菌H型判別判定方法は，大腸菌の鞭毛を構成するフラジェリンをコードする遺伝子の多様性領域の核酸増幅を行うことにより，H型別の判定を行うことを特徴とする。
本発明においては，フラジェリンをコードする遺伝子として，fliC，flkA，fllA，flmAが好ましい対象遺伝子として例示され，これら遺伝子における多様性領域を対象として，効率的なプライマーの設計と核酸増幅を可能とするものである。
また，このような遺伝子における多様性領域の具体的な配列として，例えば，配列番号１から53に示される配列領域のうち，上流側である5’末端側から500塩基，下流側である3'末端側から300塩基を差し引いた配列領域とすればよい。
これら配列番号1から配列番号53に示される各配列は，それぞれ配列番号1がH1（fliC，GenBank accession No.AB028471），配列番号2がH2（fliC，GenBank accession No.AIHA01000023），配列番号3がH3（flkA，GenBank accession No.AB128916），配列番号4がH4（fliC，GenBank accession No.AJ536600），配列番号5がH5（fliC，GenBank accession No.AY249990），配列番号6がH6（fliC，GenBank accession No.AY249991），配列番号7がH7（fliC，GenBank accession No.AY337468），配列番号8がH8（fliC，GenBank accession No.AJ865465），配列番号9がH9（fliC，GenBank accession No.AY249994），配列番号10がH10（fliC，GenBank accession No.AY249995），配列番号11がH11（fliC，GenBank accession No.AY337465），配列番号12がH12（fliC，GenBank accession No.AY337471），配列番号13がH14（fliC，GenBank accession No.AY249998），配列番号14がH15（fliC，GenBank accession No.AY249999），配列番号15がH16（fliC，GenBank accession No.AY337475），配列番号16がH17（fliC，GenBank accession No.AJ515904），配列番号17がH18（fliC，GenBank accession No.AY250001），配列番号18がH19（fliC，GenBank accession No.AY250002），配列番号19がH20（fliC，GenBank accession No.AY250003），配列番号20がH21（fliC，GenBank accession No.AIHL01000060），配列番号21がH23（fliC，GenBank accession No.AB028476），配列番号22がH24（fliC，GenBank accession No.AY250006），配列番号23がH25（fliC，GenBank accession No.AGSG01000116），配列番号24がH26（fliC，GenBank accession No.AY250008），配列番号25がH27（fliC，GenBank accession No.AM231154），配列番号26がH28（fliC，GenBank accession No.AY250010），配列番号27がH29（fliC，GenBank accession No.AY250012），配列番号28がH30（fliC，GenBank accession No.AY250011），配列番号29がH31（fliC，GenBank accession No.AY250013），配列番号30がH32（fliC，GenBank accession No.AY250014），配列番号31がH33（fliC，GenBank accession No.AY250015），配列番号32がH34（fliC，GenBank accession No.AY250016），配列番号33がH35（flkA，GenBank accession No.EF392692），配列番号34がH36（flkA，GenBank accession No.EF392693），配列番号35がH37（fliC，GenBank accession No.AY250017），配列番号36がH38（fliC，GenBank accession No.AY250018），配列番号37がH39（fliC，GenBank accession No.AY250019），配列番号38がH40（fliC，GenBank accession No.AJ884568），配列番号39がH41（fliC，GenBank accession No.AY250020），配列番号40がH42（fliC，GenBank accession No.AY250021），配列番号41がH43（fliC，GenBank accession No.AIGA01000038），配列番号42がH44（fllA，GenBank accession No.AB269770），配列番号43がH45（fliC，GenBank accession No.AY250023），配列番号44がH46（fliC，GenBank accession No.AY250024），配列番号45がH47（flkA，GenBank accession No.EF392694），配列番号46がH48（fliC，GenBank accession No.AY250025），配列番号47がH49（fliC，GenBank accession No.AY250026），配列番号48がH51（fliC，GenBank accession No.AY250027），配列番号49がH52（fliC，GenBank accession No.AY250028），配列番号50がH53（flkA，GenBank accession No.AB128917），配列番号51がH54（flmA，GenBank accession No.AB128918），配列番号52がH55（fllA，GenBank accession No.AB269771），配列番号53がH56（fliC，GenBank accession No.AY250029）に示される，各H抗原に基づくものである。
また，このような遺伝子における多様性領域の具体的な配列として，例えば，配列番号１から53に示される配列領域のうち，上流側である5’末端側から500塩基，下流側である3'末端側から300塩基を差し引いた配列領域とすればよい。
これら配列番号1から配列番号53に示される各配列は，それぞれ配列番号1がH1（fliC，GenBank accession No.AB028471），配列番号2がH2（fliC，GenBank accession No.AIHA01000023），配列番号3がH3（flkA，GenBank accession No.AB128916），配列番号4がH4（fliC，GenBank accession No.AJ536600），配列番号5がH5（fliC，GenBank accession No.AY249990），配列番号6がH6（fliC，GenBank accession No.AY249991），配列番号7がH7（fliC，GenBank accession No.AY337468），配列番号8がH8（fliC，GenBank accession No.AJ865465），配列番号9がH9（fliC，GenBank accession No.AY249994），配列番号10がH10（fliC，GenBank accession No.AY249995），配列番号11がH11（fliC，GenBank accession No.AY337465），配列番号12がH12（fliC，GenBank accession No.AY337471），配列番号13がH14（fliC，GenBank accession No.AY249998），配列番号14がH15（fliC，GenBank accession No.AY249999），配列番号15がH16（fliC，GenBank accession No.AY337475），配列番号16がH17（fliC，GenBank accession No.AJ515904），配列番号17がH18（fliC，GenBank accession No.AY250001），配列番号18がH19（fliC，GenBank accession No.AY250002），配列番号19がH20（fliC，GenBank accession No.AY250003），配列番号20がH21（fliC，GenBank accession No.AIHL01000060），配列番号21がH23（fliC，GenBank accession No.AB028476），配列番号22がH24（fliC，GenBank accession No.AY250006），配列番号23がH25（fliC，GenBank accession No.AGSG01000116），配列番号24がH26（fliC，GenBank accession No.AY250008），配列番号25がH27（fliC，GenBank accession No.AM231154），配列番号26がH28（fliC，GenBank accession No.AY250010），配列番号27がH29（fliC，GenBank accession No.AY250012），配列番号28がH30（fliC，GenBank accession No.AY250011），配列番号29がH31（fliC，GenBank accession No.AY250013），配列番号30がH32（fliC，GenBank accession No.AY250014），配列番号31がH33（fliC，GenBank accession No.AY250015），配列番号32がH34（fliC，GenBank accession No.AY250016），配列番号33がH35（flkA，GenBank accession No.EF392692），配列番号34がH36（flkA，GenBank accession No.EF392693），配列番号35がH37（fliC，GenBank accession No.AY250017），配列番号36がH38（fliC，GenBank accession No.AY250018），配列番号37がH39（fliC，GenBank accession No.AY250019），配列番号38がH40（fliC，GenBank accession No.AJ884568），配列番号39がH41（fliC，GenBank accession No.AY250020），配列番号40がH42（fliC，GenBank accession No.AY250021），配列番号41がH43（fliC，GenBank accession No.AIGA01000038），配列番号42がH44（fllA，GenBank accession No.AB269770），配列番号43がH45（fliC，GenBank accession No.AY250023），配列番号44がH46（fliC，GenBank accession No.AY250024），配列番号45がH47（flkA，GenBank accession No.EF392694），配列番号46がH48（fliC，GenBank accession No.AY250025），配列番号47がH49（fliC，GenBank accession No.AY250026），配列番号48がH51（fliC，GenBank accession No.AY250027），配列番号49がH52（fliC，GenBank accession No.AY250028），配列番号50がH53（flkA，GenBank accession No.AB128917），配列番号51がH54（flmA，GenBank accession No.AB128918），配列番号52がH55（fllA，GenBank accession No.AB269771），配列番号53がH56（fliC，GenBank accession No.AY250029）に示される，各H抗原に基づくものである。
前記「配列番号１から53に示される配列領域のうち，上流側である5’末端側から500塩基，下流側である3'末端側から300塩基を差し引いた配列領域」においては，さらに，配列番号54から配列番号106で示される配列領域を含む配列を対象として，核酸増幅を行うことが好ましい。
配列番号54から配列番号106で示される配列領域は，プライマー設計領域ならびに増幅対象における好ましい配列領域として発明者らにより見出されたものであり，これにより，効率的なプライマー設計と精度の高い核酸増幅が可能となるという効果を有する。
なお，これら核酸増幅の対象である多様性領域については，上記に示したものだけではなく，例示される配列と相補的な核酸配列についても当然含まれるものである。
配列番号54から配列番号106で示される配列領域は，プライマー設計領域ならびに増幅対象における好ましい配列領域として発明者らにより見出されたものであり，これにより，効率的なプライマー設計と精度の高い核酸増幅が可能となるという効果を有する。
なお，これら核酸増幅の対象である多様性領域については，上記に示したものだけではなく，例示される配列と相補的な核酸配列についても当然含まれるものである。
多様性領域における核酸増幅を行うための手法については，核酸増幅が可能な限り特に限定する必要はなく，種々の核酸増幅法を用いることができる。このような核酸増幅法として例えば，PCR法やLAMP法が挙げられる。
PCR法の場合は，多様性領域に対するリバースプライマー，フォワードプライマー，これらプライマーの設計を行い，プライマーセットとして用いて核酸増幅を行えばよい。
LAMP法の場合は，多様性領域に対するFIP，F3プライマー，BIP，B3プライマー，これらプライマーの設計を行い，プライマーセットとして用いて核酸増幅を行えばよい。なお，LAMP法においては，ループプライマーなどのプライマーをプライマーセットとして用いてもよい。
以下では，本発明において好適に用いられる例として，PCR法を挙げて，説明を行う。
PCR法の場合は，多様性領域に対するリバースプライマー，フォワードプライマー，これらプライマーの設計を行い，プライマーセットとして用いて核酸増幅を行えばよい。
LAMP法の場合は，多様性領域に対するFIP，F3プライマー，BIP，B3プライマー，これらプライマーの設計を行い，プライマーセットとして用いて核酸増幅を行えばよい。なお，LAMP法においては，ループプライマーなどのプライマーをプライマーセットとして用いてもよい。
以下では，本発明において好適に用いられる例として，PCR法を挙げて，説明を行う。
PCR法による大腸菌検査のためには，検体試料が必要である。この検体試料としては，通常用いられるあらゆる検体試料を用いることが可能であり，例えば，大腸菌感染が疑われる食品，ヒトや動物由来の生体試料などが挙げられる。
大腸菌検査のための検体試料については，通常用いられる前処理を行い，PCR法に用いる際の試料とすればよい。例えば，タンパク質分解酵素等による組織細胞由来タンパク質を分解後，フェノール及びクロロホルムを用いて核酸抽出や精製を行ったり，市販されている抽出キットを用いて得られた核酸を抽出したりするなどである。
検体試料の準備ができたら，本発明のプライマーセットを用いて，核酸増幅のための操作を行う。この核酸増幅の際の操作として，例えば，少なくとも１セットのプライマーセット，耐熱性DNAポリメラーゼ，デオキシヌクレオチド3リン酸などの基質を反応溶液に加え，熱変性，アニーリング，伸長反応を行い，これらのサイクルを繰り返すことにより核酸増幅を行う。
検体試料の準備ができたら，本発明のプライマーセットを用いて，核酸増幅のための操作を行う。この核酸増幅の際の操作として，例えば，少なくとも１セットのプライマーセット，耐熱性DNAポリメラーゼ，デオキシヌクレオチド3リン酸などの基質を反応溶液に加え，熱変性，アニーリング，伸長反応を行い，これらのサイクルを繰り返すことにより核酸増幅を行う。
PCR法における本発明のプライマーセットは，フォワードプライマー（F）とリバースプライマー（R）の組み合わせからなる，合計2つのプライマーからなる組み合わせを含むものであり，図１から図３の配列番号107から配列番号208に示される核酸配列をプライマーとして用いればよい。また，各プライマーセットにより，図１から図３，ないし図５から７の「+」で示される大腸菌H抗原における核酸増幅を行うことが可能である。
本発明においては，これらプライマーセットを単独で用いることもできるが，複数のプライマーセットを組み合わせて複合的なH型検出を行うことが好ましい。すなわち，一部のH抗原については，遺伝子の性質上，複数のH抗原が検出される場合がある。かかる場合に，複数のプライマーセットを組み合わせて検出を行うことにより，より精度の高い大腸菌H型別の判定が可能となるという効果を有する。
本発明においては，これらプライマーセットを単独で用いることもできるが，複数のプライマーセットを組み合わせて複合的なH型検出を行うことが好ましい。すなわち，一部のH抗原については，遺伝子の性質上，複数のH抗原が検出される場合がある。かかる場合に，複数のプライマーセットを組み合わせて検出を行うことにより，より精度の高い大腸菌H型別の判定が可能となるという効果を有する。
このような複数のプライマーセットを組み合わせたプライマーセット（マルチプレックス，MP）については，例として，図８に示されるMPを用いることができる。
すなわち，図８に示されるMPは，全てのH抗原をカバーするものであり，これらを組み合わせて検出を行うことにより，対象試料のH抗原を特定することが可能となる。
特に，MP1ならびにMP2については，重症化事例の原因となっている腸管出血性大腸菌に関連する11種類のH型を組み合わせているものであり，有用性が極めて高いものである。
すなわち，図８に示されるMPは，全てのH抗原をカバーするものであり，これらを組み合わせて検出を行うことにより，対象試料のH抗原を特定することが可能となる。
特に，MP1ならびにMP2については，重症化事例の原因となっている腸管出血性大腸菌に関連する11種類のH型を組み合わせているものであり，有用性が極めて高いものである。
本発明においては，本発明のプライマーセットと合わせて，大腸菌O抗原など，他の抗原を合わせて検出を行ってもよい。
また，本発明のプライマーセットは，対象とする大腸菌H型別のみの判定に限定する意図ではなく，その他の大腸菌H型別の判定に用いてもかまわない。例えば，プライマーセット1を用いて，H1抗原以外の大腸菌H型別を検出するなどである。大腸菌H型別の検出・判定を行う場合，対象となる大腸菌H型別が分からないことが通常である。その場合などには種々のプライマーセットを複合的に用いることにより，より正確な大腸菌H型別の検出や判定が可能となる。
また，本発明のプライマーセットは，対象とする大腸菌H型別のみの判定に限定する意図ではなく，その他の大腸菌H型別の判定に用いてもかまわない。例えば，プライマーセット1を用いて，H1抗原以外の大腸菌H型別を検出するなどである。大腸菌H型別の検出・判定を行う場合，対象となる大腸菌H型別が分からないことが通常である。その場合などには種々のプライマーセットを複合的に用いることにより，より正確な大腸菌H型別の検出や判定が可能となる。
耐熱性DNAポリメラーゼは，通常用いられるあらゆる耐熱性DNAポリメラーゼを用いることができる。このような酵素として，例えば，pol Ｉ 型DNAポリメラーゼ，α型DNAポリメラーゼ，混合型DNAポリメラーゼ，Hot start用DNAポリメラーゼ等が挙げられる。
核酸増幅反応操作が終了したら，核酸増幅産物の検出を行う。核酸増幅産物の検出には，通常用いられるあらゆる検出方法を用いることができる。例えば，増幅された塩基配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドを用いた検出や蛍光性インターカレーター法，アガロースゲル電気泳動法による検出などである。
また，核酸増幅反応操作を行いながら，核酸増幅物の検出を行ってもよい（RT-PCR）。この場合，インターカレーター法やハイブリダイゼーション法など，蛍光色素を用いた検出法を用いればよい。
また，核酸増幅反応操作を行いながら，核酸増幅物の検出を行ってもよい（RT-PCR）。この場合，インターカレーター法やハイブリダイゼーション法など，蛍光色素を用いた検出法を用いればよい。
本発明のプライマーセットを用いて核酸増幅の検出を行う際に必要な各種の試薬類は，あらかじめパッケージングしてキット化することにより，検査キットとすることができる。この場合，検査キットは，少なくとも１セットの本発明のプライマーセットと，核酸増幅用試薬を含む。核酸増幅用試薬として，例えば，耐熱性DNAポリメラーゼ，核酸合成の基質となる４種類のdNTP，酵素反応に好適な条件を与える緩衝液や塩類，酵素や鋳型を安定化する保護剤などが挙げられる。
以下，実施例を示して本発明の大腸菌H型別判定方法について詳述する。
＜＜実験例１，プライマーの設計＞＞
１．大腸菌Ｈ抗原関連遺伝子の遺伝子増幅が可能なプライマーの設計を行った。
２．各H抗原について多様性領域を調べ，核酸増幅に適切な領域を決定するとともに，これを増幅するためのプライマーを設定した。
３．各プライマーセットないしプライマー配列等について，図１から図３に示す。
１．大腸菌Ｈ抗原関連遺伝子の遺伝子増幅が可能なプライマーの設計を行った。
２．各H抗原について多様性領域を調べ，核酸増幅に適切な領域を決定するとともに，これを増幅するためのプライマーを設定した。
３．各プライマーセットないしプライマー配列等について，図１から図３に示す。
＜＜実験例２，プライマーセットの核酸増幅の確認＞＞
実験例１において設計を行った各プライマーセットを用いて各H抗原に対する増幅反応をPCR法にて行い，対象とするH抗原に対する増幅が可能かどうか，ならびに増幅特異性を調べることを目的に実験を行った。
実験例１において設計を行った各プライマーセットを用いて各H抗原に対する増幅反応をPCR法にて行い，対象とするH抗原に対する増幅が可能かどうか，ならびに増幅特異性を調べることを目的に実験を行った。
１．特異性の評価には，SSIから分与された大腸菌全H型参考株を用いた。
２．H型参考株について，Wizard Genomic DNA Purification Kit（プロメガ）により菌株DNAを精製した。この精製DNAを用いて，核酸増幅反応を行った。
２．H型参考株について，Wizard Genomic DNA Purification Kit（プロメガ）により菌株DNAを精製した。この精製DNAを用いて，核酸増幅反応を行った。
３．PCR法の反応条件および検出
(1) 表１に従い，反応液を混和し，サーマルサイクラーで〔94℃-30秒，58℃-30秒，72℃-1分〕×25サイクル，反応させた。
(2) 反応液の一部を1.5%アガロースゲルで電気泳動し，エチジウムブロマイドで染色後にUVトランスイルミネーター上で予測されるサイズの増幅産物（バンド）を確認した。
(1) 表１に従い，反応液を混和し，サーマルサイクラーで〔94℃-30秒，58℃-30秒，72℃-1分〕×25サイクル，反応させた。
(2) 反応液の一部を1.5%アガロースゲルで電気泳動し，エチジウムブロマイドで染色後にUVトランスイルミネーター上で予測されるサイズの増幅産物（バンド）を確認した。
４．実験結果例について，図４を用いて示す。
(1) 図４は電気泳動の結果を示した図である。
(2) すなわち，プライマーセット７（配列番号119および配列番号120）を用いて，各H抗原を対象として核酸増幅を行った結果である。図中，aがH1からH19，bがH20からH38，cがH39からH56の各H抗原に対して増幅反応を行ったサンプルについて，電気泳動を行った結果である。
(3) 図のとおり，プライマーセット7を用いた結果，H7抗原に対してバンドが現れており，核酸の増幅が行われていることが明らかとなったものである。加えて，その他のH抗原では，バンドが現れておらず，核酸増幅が起こっていないことが明らかとなったものである。
(4) この場合，後述する図５ないし図７において，プライマーセット7の増幅反応については，H7に対して「+」（核酸増幅あり），その他の各H抗原については「−」（核酸増幅なし）として表している。
(1) 図４は電気泳動の結果を示した図である。
(2) すなわち，プライマーセット７（配列番号119および配列番号120）を用いて，各H抗原を対象として核酸増幅を行った結果である。図中，aがH1からH19，bがH20からH38，cがH39からH56の各H抗原に対して増幅反応を行ったサンプルについて，電気泳動を行った結果である。
(3) 図のとおり，プライマーセット7を用いた結果，H7抗原に対してバンドが現れており，核酸の増幅が行われていることが明らかとなったものである。加えて，その他のH抗原では，バンドが現れておらず，核酸増幅が起こっていないことが明らかとなったものである。
(4) この場合，後述する図５ないし図７において，プライマーセット7の増幅反応については，H7に対して「+」（核酸増幅あり），その他の各H抗原については「−」（核酸増幅なし）として表している。
５．図４と同様の実験を他のプライマーセットについても行い，その結果をまとめたものを図５から図７に示す。
(1) 設計を行った51のうち44のプライマーセットにおいて，目的とするH抗原のみの核酸増幅がなされていることが確認された。
(2) プライマーセット4（H4/H17）については，目的とするH4およびH17以外に，H44についても核酸増幅が確認された。
(3) プライマーセット11（H11）については，目的とするH11以外に，H35ならびにH36についても核酸増幅が確認された。
(4) プライマーセット14（H16）については，目的とするH16以外に，H3についても核酸増幅が確認された。
(5) プライマーセット18（H21）については，目的とするH21以外に，H47ならびにH54についても核酸増幅が確認された。
(6) プライマーセット34（H38）については，目的とするH38以外に，H55についても核酸増幅が確認された。
(7) プライマーセット36（H40）については，目的とするH40以外に，H53についても核酸増幅が確認された。
(8) これら目的とする抗原以外で検出された抗原については，non-fliC抗原であった。すなわち，H44がfllA，H35およびH36がflkA，H3がflkA，H47がflkA，H54がflmA，H53がflkA，H55がfllAであった。
(1) 設計を行った51のうち44のプライマーセットにおいて，目的とするH抗原のみの核酸増幅がなされていることが確認された。
(2) プライマーセット4（H4/H17）については，目的とするH4およびH17以外に，H44についても核酸増幅が確認された。
(3) プライマーセット11（H11）については，目的とするH11以外に，H35ならびにH36についても核酸増幅が確認された。
(4) プライマーセット14（H16）については，目的とするH16以外に，H3についても核酸増幅が確認された。
(5) プライマーセット18（H21）については，目的とするH21以外に，H47ならびにH54についても核酸増幅が確認された。
(6) プライマーセット34（H38）については，目的とするH38以外に，H55についても核酸増幅が確認された。
(7) プライマーセット36（H40）については，目的とするH40以外に，H53についても核酸増幅が確認された。
(8) これら目的とする抗原以外で検出された抗原については，non-fliC抗原であった。すなわち，H44がfllA，H35およびH36がflkA，H3がflkA，H47がflkA，H54がflmA，H53がflkA，H55がfllAであった。
６．上記のとおり，目的とするプライマーセットにおいて，目的外の複数の抗原が検出された結果については，下記のとおりと考えられる。
(1) 多くのH型の場合，鞭毛を構成するタンパク質（フラジェリン）はfliC遺伝子にコードされているが，H3（flkA），H35（flkA），H36（flkA），H44（fllA），H47（flkA），H53（flkA），H54（flmA），H55（fllA）においてはfliC以外の遺伝子（non-fliC）によってフラジェリンがコードされている。
(2) non-fliC保有株は染色体上にfliCを併せ持つが，non-fliCから発現されるタンパク質によりfliCの転写は抑制される。そのため，内在するfliC（潜在的fliC）ではなく，non-fliCより発現されるタンパク質がフラジェリンの構成タンパク（つまりH抗原）となる。
(3) 本実験で使用したH型参考株の潜在的fliCは，H3（fliC_H16），H35（fliC_H11），H36（fliC_H11），H44（fliC_H4/H17），H47（fliC_H21），H53（fliC_H40），H54（fliC_H21），H55（fliC_H38）である。そのため，non-fliCタイプのH参考株ではnon-fliCに加え，潜在的fliCの核酸増幅も確認された結果，複数の抗原が検出されたものと考えられる。
(4) 本発明のプライマーセットを用いて複数の抗原が検出された場合，non-fliCの結果を優先させることで，H型を特異的に判定することができる。
(5) また，他のプライマーセットと合わせて，同時検出を行うことにより，より正確な判定を行うことが可能となる。
(1) 多くのH型の場合，鞭毛を構成するタンパク質（フラジェリン）はfliC遺伝子にコードされているが，H3（flkA），H35（flkA），H36（flkA），H44（fllA），H47（flkA），H53（flkA），H54（flmA），H55（fllA）においてはfliC以外の遺伝子（non-fliC）によってフラジェリンがコードされている。
(2) non-fliC保有株は染色体上にfliCを併せ持つが，non-fliCから発現されるタンパク質によりfliCの転写は抑制される。そのため，内在するfliC（潜在的fliC）ではなく，non-fliCより発現されるタンパク質がフラジェリンの構成タンパク（つまりH抗原）となる。
(3) 本実験で使用したH型参考株の潜在的fliCは，H3（fliC_H16），H35（fliC_H11），H36（fliC_H11），H44（fliC_H4/H17），H47（fliC_H21），H53（fliC_H40），H54（fliC_H21），H55（fliC_H38）である。そのため，non-fliCタイプのH参考株ではnon-fliCに加え，潜在的fliCの核酸増幅も確認された結果，複数の抗原が検出されたものと考えられる。
(4) 本発明のプライマーセットを用いて複数の抗原が検出された場合，non-fliCの結果を優先させることで，H型を特異的に判定することができる。
(5) また，他のプライマーセットと合わせて，同時検出を行うことにより，より正確な判定を行うことが可能となる。
＜＜実験例３，野生株を用いた検証実験＞＞
設計を行ったプライマーセットを用いて，対象となるH抗原を有することが分かっている大腸菌野生株に対し，核酸増幅による検出が可能かどうかを調べることを目的として行った。
設計を行ったプライマーセットを用いて，対象となるH抗原を有することが分かっている大腸菌野生株に対し，核酸増幅による検出が可能かどうかを調べることを目的として行った。
１．野生株については，共同研究機関から入手を行った。
２．入手を行った野生株について，Wizard Genomic DNA Purification Kit（プロメガ）により菌株DNAを精製した。この精製DNAを用いて，実験例２と同様の方法により，核酸増幅反応を行った。
２．入手を行った野生株について，Wizard Genomic DNA Purification Kit（プロメガ）により菌株DNAを精製した。この精製DNAを用いて，実験例２と同様の方法により，核酸増幅反応を行った。
３．結果を表２に示す。
(1) 表２は，各プライマーセットを用い，対象となるH抗原を有する大腸菌野生株の検出を行った結果である。
(2) 検討を行ったすべての大腸菌野生株で，核酸増幅が可能であった。
(3) また，表において下線で示す大腸菌株は，腸管出血性を示す大腸菌株（EHEC）であり，EHECの中でも主要なものである。これらのEHECについても，検出が可能であった。
４．これらの結果より，本発明のプライマーセットが，大腸菌野生株の検出に有用であることが確認された。
(1) 表２は，各プライマーセットを用い，対象となるH抗原を有する大腸菌野生株の検出を行った結果である。
(2) 検討を行ったすべての大腸菌野生株で，核酸増幅が可能であった。
(3) また，表において下線で示す大腸菌株は，腸管出血性を示す大腸菌株（EHEC）であり，EHECの中でも主要なものである。これらのEHECについても，検出が可能であった。
４．これらの結果より，本発明のプライマーセットが，大腸菌野生株の検出に有用であることが確認された。
＜＜実験例４，複数のプライマーセットを組み合わせた検出実験＞＞
各H抗原に対するプライマーセットについて，これを複数組み合わせたプライマーセット（マルチプレックス，MP）を作成し，MPによる複数のH抗原の検出が可能かどうかを調べた。
各H抗原に対するプライマーセットについて，これを複数組み合わせたプライマーセット（マルチプレックス，MP）を作成し，MPによる複数のH抗原の検出が可能かどうかを調べた。
１．実験例２に準じて実験を行った。
２．反応液については，表３に示す組成のものを用いた。
３．また，各MPについては，図８に示す10種類のMPとした。すなわち，この10種類のMPには，それぞれ複数種のプライマーセットが含まれており，10種類のすべてを合わせると，全てのH抗原をカバーする組み合わせとなっているものである。加えて，各MPは，H抗原としての重要性と増幅する配列の塩基数を考慮し，明瞭な判定が可能となるようデザインされている。
２．反応液については，表３に示す組成のものを用いた。
３．また，各MPについては，図８に示す10種類のMPとした。すなわち，この10種類のMPには，それぞれ複数種のプライマーセットが含まれており，10種類のすべてを合わせると，全てのH抗原をカバーする組み合わせとなっているものである。加えて，各MPは，H抗原としての重要性と増幅する配列の塩基数を考慮し，明瞭な判定が可能となるようデザインされている。
３．図９に，MP1を用いて，標準抗原の検出を行った際の電気泳動結果を示す。
(1) MP1により，MP1に対応する全てのH抗原を検出することが可能であった。
(2) 加えて，検出されたH抗原は，それぞれ増幅する配列の塩基数が異なるため，電気泳動により，明瞭に区別できることが確認された。
４．これにより，MPを用いること，ならびにこれらを組み合わせることにより，適切にH抗原の検出が可能となることが分かった。
５．特に，MP1ならびにMP2については，重症化事例の原因となっている腸管出血性大腸菌に関連する11種類のH型を組み合わせているものであり，有用性が極めて高いものと考えられる。
(1) MP1により，MP1に対応する全てのH抗原を検出することが可能であった。
(2) 加えて，検出されたH抗原は，それぞれ増幅する配列の塩基数が異なるため，電気泳動により，明瞭に区別できることが確認された。
４．これにより，MPを用いること，ならびにこれらを組み合わせることにより，適切にH抗原の検出が可能となることが分かった。
５．特に，MP1ならびにMP2については，重症化事例の原因となっている腸管出血性大腸菌に関連する11種類のH型を組み合わせているものであり，有用性が極めて高いものと考えられる。
Claims (9)
- 大腸菌の鞭毛を構成するフラジェリンをコードする遺伝子の多様性領域の核酸増幅を行うことにより，H型別の判定を行うことを特徴とする大腸菌H型別判定方法
- 前記遺伝子が，fliC，flkA，fllA，flmAのいずれか又は複数から選択されることを特徴とする請求項１に記載の大腸菌H型別判定方法
- 前記多様性領域が，配列番号１から53で示される配列のそれぞれにおいて，5’から500塩基，3’から300塩基を差し引いた配列領域から選択されることを特徴とする請求項１又は２に記載の大腸菌H型別判定方法
- 前記多様性領域が，配列番号54から106で示される配列領域を含むことを特徴とする請求項３に記載の大腸菌H型別判定方法
- 多様性領域の核酸増幅が，PCR法によりなされることを特徴とする請求項１から４に記載の大腸菌H型別判定方法
- 核酸増幅が，プライマーセット1から51のいずれか又は複数のプライマーセットを用いてなされることを特徴とする請求項５に記載の大腸菌H型別判定方法
- 請求項１から６に記載の大腸菌H型別判定方法に用いられることを特徴とするプライマー
- 請求項１から６に記載の大腸菌H型別判定方法に用いられることを特徴とするプライマーセット
- 請求項８に記載のプライマーセットを含み，大腸菌H型別判定方法に用いられるキット
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