JPWO2017170328A1 - 分化促進型多能性幹細胞及びその使用 - Google Patents

分化促進型多能性幹細胞及びその使用 Download PDF

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Abstract

Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３β（ＧＳＫ３β）阻害剤、Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＢＭＰ）シグナル阻害剤及びＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）−β阻害剤を有効成分として含有する、多能性幹細胞の分化促進型多能性幹細胞への誘導用培地。

Description

本発明は、分化促進型多能性幹細胞（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ−ｓｔａｔｅ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、以下「ＤｉＳＣ」という場合がある。）及びその使用に関する。より詳細には、多能性幹細胞の分化促進型多能性幹細胞への誘導用培地、分化促進型多能性幹細胞の製造方法、分化促進型多能性幹細胞、神経幹細胞塊の製造方法及び神経幹細胞に関する。本願は、２０１６年３月３１日に、日本に出願された特願２０１６−０７３７３９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、以下、「ｉＰＳＣ」という場合がある。）は、従来、主に皮膚繊維芽細胞から作製されてきた。しかしながら、皮膚繊維芽細胞株を得るためには皮膚の採取が必要であり、出血、感染、傷跡が残る等の問題を伴う。
そこで、低侵襲な手法により採取することができる末梢血細胞からｉＰＳＣを作製する技術が検討されている。例えば、ＣＤ３陽性Ｔ細胞は、センダイウイルスベクターを用いて効果的にｉＰＳＣにリプログラムすることができることが報告されている（例えば非特許文献１を参照。）。
しかし、ｉＰＳＣの樹立に用いた細胞の種類、樹立方法、ドナーの違い等により、ｉＰＳＣの分化傾向等の特性は、通常大きく異なっている。このため、従来、ｉＰＳＣの中から目的とする細胞に分化しやすいｉＰＳＣを選別する必要があり、多大な労力を要している。また、分化抵抗性を示すＥＳ細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、以下、「ＥＳＣ」という場合がある。）株が存在することも知られており、このようなＥＳＣを、目的とする細胞に分化させることは困難であった。
Seki T., et al., Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells., Cell Stem Cell, 7 (1), 11-14, 2010.
そこで、本発明は、分化抵抗性を示すＥＳ細胞株や、株選別を実施していない樹立直後のｉＰＳ細胞株であっても、目的とする細胞に高効率に分化させることができる技術を提供することを目的とする。
本発明は以下の態様を含む。
（１）Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３β（ＧＳＫ３β）阻害剤、Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＢＭＰ）シグナル阻害剤及びＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）−β阻害剤を有効成分として含有する、多能性幹細胞の分化促進型多能性幹細胞への誘導用培地。
（２）多能性幹細胞を（１）に記載の培地中で培養する工程を備える、分化促進型多能性幹細胞の製造方法。
（３）前記多能性幹細胞は、由来又は内胚葉、中胚葉若しくは外胚葉への分化能の高さにより予め選択されたものでない、（２）に記載の分化促進型多能性幹細胞の製造方法。
（４）対照細胞と比較して内胚葉、中胚葉及び外胚葉マーカーの発現が上昇している、分化促進型多能性幹細胞。
（５）（２）又は（３）に記載の製造方法により製造された、（４）に記載の分化促進型多能性幹細胞。
（６）対照細胞と比較して内胚葉、中胚葉及び外胚葉への分化能が向上している、分化促進型多能性幹細胞。
（７）（２）又は（３）に記載の製造方法により製造された、（６）に記載の分化促進型多能性幹細胞。
（８）（４）〜（７）のいずれかに記載の分化促進型多能性幹細胞を、ＧＳＫ３β阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ（ＲＯＣＫ）阻害剤、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ２（ＦＧＦ２）及びＬｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）を有効成分として含有する培地中で培養する工程を備える、神経幹細胞塊の製造方法。
（９）神経幹細胞塊を構成する神経幹細胞のほぼすべてが内胚葉マーカー及び中胚葉マーカーを実質的に発現していない神経幹細胞塊。
（１０）（８）に記載の製造方法により製造された、（９）に記載の神経幹細胞塊。
（１１）（４）〜（７）のいずれかに記載の分化促進型多能性幹細胞を分化させる工程を備える、内胚葉又は内胚葉由来組織の製造方法。
（１２）（４）〜（７）のいずれかに記載の分化促進型多能性幹細胞を分化させる工程を備える、中胚葉又は中胚葉由来組織の製造方法。
（１３）（４）〜（７）のいずれかに記載の分化促進型多能性幹細胞を分化させる工程を備える、外胚葉又は外胚葉由来組織の製造方法。
［１］ＧＳＫ３β阻害剤、ＢＭＰシグナル阻害剤及びＴＧＦ−β阻害剤を有効成分として含有する、多能性幹細胞の分化促進型多能性幹細胞への誘導用培地。
［２］多能性幹細胞を［１］に記載の培地中で培養する工程を備える、分化促進型多能性幹細胞の製造方法。
［３］対照細胞と比較して内胚葉、中胚葉及び外胚葉マーカーの発現が上昇している、分化促進型多能性幹細胞。
［４］［３］に記載の分化促進型多能性幹細胞を、ＧＳＫ３β阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦ２及びＬＩＦを有効成分として含有する培地中で培養する工程を備える、神経幹細胞塊の製造方法。
［５］神経幹細胞塊を構成する神経幹細胞のほぼすべてが内胚葉マーカー及び中胚葉マーカーを実質的に発現していない神経幹細胞塊。
本発明により、分化抵抗性を示すＥＳ細胞株や、株選別を実施していない樹立直後のｉＰＳ細胞株であっても、目的とする細胞に高効率に分化させることができる技術を提供することができる。
（ａ）〜（ｇ）は、実験例１における各マーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。（ａ）はＯＣＴ４の結果を表し、（ｂ）はＮＡＮＯＧの結果を表し、（ｃ）はＳＯＸ１の結果を表し、（ｄ）はＰＡＸ６の結果を表し、（ｅ）はＮＥＳＴＩＮの結果を表し、（ｆ）はＢＲＡＣＨＹＵＲＹの結果を表し、（ｇ）はＳＯＸ１７の結果を表す。 （ａ）〜（ｇ）は、実験例２における各マーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。（ａ）はＯＣＴ４の結果を表し、（ｂ）はＮＡＮＯＧの結果を表し、（ｃ）はＳＯＸ１の結果を表し、（ｄ）はＰＡＸ６の結果を表し、（ｅ）はＮＥＳＴＩＮの結果を表し、（ｆ）はＢＲＡＣＨＹＵＲＹの結果を表し、（ｇ）はＳＯＸ１７の結果を表す。 （ａ）は未分化状態を維持しているヒト多能性幹細胞コロニー（ｈＰＳＣコロニー）の代表的な光学顕微鏡写真である。（ｂ）は、過剰に分化したｈＰＳＣコロニーの代表的な光学顕微鏡写真である。（ａ）及び（ｂ）の倍率はいずれも同じであり、スケールバーは２００μｍを示す。 実験例２において、ヒトｉＰＳＣを、ＳＢ、ＤＭ及びＣＨＩＲを添加した培地で３〜６日間培養して分化促進型多能性幹細胞を誘導した場合に出現したｈＰＳＣコロニーのうち、過剰に分化したｈＰＳＣコロニーの割合を示すグラフである。 （ａ）は、実験例３における通常のｉＰＳＣのコロニーの代表的な光学顕微鏡写真である。（ｂ）は、実験例３における分化促進型多能性幹細胞のコロニーの代表的な光学顕微鏡写真である。（ａ）及び（ｂ）の倍率はいずれも同じであり、スケールバーは２００μｍを示す。 実験例３において、分化促進型多能性幹細胞のコロニーと、通常のヒト多能性幹細胞のコロニーの直径の変化を測定した結果を示すグラフである。 実験例４において、分化促進型多能性幹細胞と通常のヒト多能性幹細胞の、内胚葉マーカー、中胚葉マーカー及び外胚葉マーカータンパク質の発現量を示すグラフである。 実験例４において、分化促進型多能性幹細胞と通常のヒト多能性幹細胞の、細胞ポピュレーション解析の結果を示すグラフである。 実験例５において、形成された神経幹細胞塊の数を示すグラフである。 （ａ）〜（ｈ）は、実験例５における各マーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。（ａ）はＯＣＴ４の結果を表し、（ｂ）はＮＡＮＯＧの結果を表し、（ｃ）はＰＡＸ６の結果を表し、（ｄ）はＳＯＸ１の結果を表し、（ｅ）はＮＥＳＴＩＮの結果を表し、（ｆ）はＴＵＢＢ３の結果を表し、（ｇ）はＢＲＡＣＨＹＵＲＹの結果を表し、（ｈ）はＳＯＸ１７の結果を表す。 （ａ）は、実験例５において、分化促進型多能性幹細胞を経ずに形成した神経幹細胞塊における、ＰＡＸ６＋ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ＋細胞、ＰＡＸ６＋ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ−細胞、ＰＡＸ６−ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ＋細胞、ＰＡＸ６−ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ−細胞の割合を示すグラフである。（ｂ）は、実験例５において、分化促進型多能性幹細胞を経て形成した神経幹細胞塊における、ＰＡＸ６＋ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ＋細胞、ＰＡＸ６＋ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ−細胞、ＰＡＸ６−ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ＋細胞、ＰＡＸ６−ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ−細胞の割合を示すグラフである。 （ａ）は、実験例５において、分化促進型多能性幹細胞を経ずに形成した神経幹細胞塊における、ＮＥＳＴＩＮ＋ＳＯＸ１７＋細胞、ＮＥＳＴＩＮ＋ＳＯＸ１７−細胞、ＮＥＳＴＩＮ−ＳＯＸ１７＋細胞、ＮＥＳＴＩＮ−ＳＯＸ１７−細胞の割合を示すグラフである。（ｂ）は、実験例５において、分化促進型多能性幹細胞を経て形成した神経幹細胞塊における、ＮＥＳＴＩＮ＋ＳＯＸ１７＋細胞、ＮＥＳＴＩＮ＋ＳＯＸ１７−細胞、ＮＥＳＴＩＮ−ＳＯＸ１７＋細胞、ＮＥＳＴＩＮ−ＳＯＸ１７−細胞の割合を示すグラフである。 実験例６において、分化促進型多能性幹細胞を経て、又は分化促進型多能性幹細胞を経ずに形成した神経幹細胞塊を、更にニューロンに分化誘導し、各マーカー遺伝子の発現量を測定した結果を示すグラフである。 実験例７において、成熟したニューロンの数を測定した結果を示すグラフである。 実験例８において、ニューロンの発火の数を測定した結果を示すグラフである。 実験例９において、各条件で培養したＥＳ細胞の光学顕微鏡写真である。 実験例９において、各条件で培養したＥＳ細胞から形成された神経幹細胞塊の数を測定した結果を示すグラフである。 実験例１０において、ニューロン全体に占める、βＩＩＩ−チューブリン＋ＭＡＰ２＋ニューロンの数を測定した結果を示すグラフである。 実験例１０において、成熟したニューロンの数を測定した結果を示すグラフである。 実験例１１において、ニューロン全体に占める、βＩＩＩ−チューブリン＋ＭＡＰ２＋ニューロンの数を測定した結果を示すグラフである。 実験例１１において、成熟したニューロンの数を測定した結果を示すグラフである。 実験例１２において、βＩＩＩ−チューブリン＋細胞又はＴＨ＋βＩＩＩ−チューブリン＋細胞の割合を測定した結果を示すグラフである。 実験例１３において、各細胞の分化マーカーの発現量を定量した結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例１４において、各細胞のＳＯＸ１タンパク質の発現量を測定した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例１４において、各細胞のＢＲＡＣＨＹＵＲＹタンパク質の発現量を測定した結果を示すグラフである。（ｃ）は、実験例１４において、各細胞のＳＯＸ１７タンパク質の発現量を測定した結果を示すグラフである。 実験例１４において、各細胞の分化マーカーの発現量を定量した結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例１５において、各細胞のＳＯＸ１タンパク質の発現量を測定した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例１５において、各細胞のＢＲＡＣＨＹＵＲＹタンパク質の発現量を測定した結果を示すグラフである。（ｃ）は、実験例１５において、各細胞のＳＯＸ１７タンパク質の発現量を測定した結果を示すグラフである。
［分化促進型多能性幹細胞誘導用培地］
１実施形態において、本発明は、ＧＳＫ３β阻害剤、ＢＭＰシグナル阻害剤及びＴＧＦ−β阻害剤を有効成分として含有する、多能性幹細胞の分化促進型多能性幹細胞への誘導用培地を提供する。ここで、分化促進型多能性幹細胞とは、発明者らが新たに見出した細胞であり、未分化状態を維持したまま、内胚葉、中胚葉及び外胚葉マーカーの発現が上昇した細胞である。
実施例において後述するように、発明者らは、本実施形態の培地により、多能性幹細胞から分化促進型多能性幹細胞を誘導することができることを明らかにした。また、実施例において後述するように、発明者らは、多能性幹細胞から分化促進型多能性幹細胞を誘導し、分化促進型多能性幹細胞から目的とする細胞に分化させることにより、従来法と比較して分化効率を向上させることができ、短い培養期間で機能的な細胞に分化させることができることを明らかにした。更に、発明者らは、本実施形態の培地によれば、多能性幹細胞として、分化抵抗性を示すＥＳ細胞株や、株選別を実施していない樹立直後のｉＰＳ細胞株であっても、分化促進型多能性幹細胞を誘導することができることを明らかにした。
本実施形態の培地において、ＧＳＫ３β阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ番号：２５２９１７−０６−９）が挙げられる。また、ＢＭＰシグナル阻害剤としてはＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（ＣＡＳ番号：８６６４０５−６４−３）、ＬＤＮ−１９３１８９（ＣＡＳ番号：１０６２３６８−２４−４）、Ｎｏｇｇｉｎ等が挙げられる。また、ＴＧＦ−β阻害剤としてはＳＢ４３１５４２（ＣＡＳ番号：３０１８３６−４１−９）、Ａ−８３−０１（ＣＡＳ番号：９０９９１０−４３−６）等が挙げられる。
本明細書において、「分化促進型多能性幹細胞」とは、幹細胞性を維持したまま分化が促進された多能性幹細胞を意味する。実施例において後述するように、分化促進型多能性幹細胞は、本実施形態の製造方法を経ていない多能性幹細胞と比較して、内胚葉、中胚葉及び外胚葉（以下、「三胚葉」という場合がある。）の全ての胚葉への分化能が向上している。
本実施形態の培地において、ＧＳＫ３β阻害剤の濃度は３μＭ程度が好ましい。また、ＢＭＰシグナル阻害剤の濃度は３〜６μＭが好ましい。また、ＴＧＦ−β阻害剤の濃度は３〜６μＭが好ましい。
本実施形態の培地において、分化させる対象の多能性幹細胞は、例えばＥＳ細胞であってもよく、例えば人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であってもよい。分化させる対象の多能性幹細胞は、更に、分化抵抗性を示すＥＳ細胞株や、株選別を実施していない樹立直後のｉＰＳ細胞株であってもよい。従来、これらの細胞株を目的の細胞に分化させることは困難であったが、本実施形態の培地を用いることにより、これらの細胞株であっても目的の細胞に分化させることが可能になる。
すなわち、本実施形態の培地を用いることにより、多能性幹細胞の由来、樹立方法、内胚葉、中胚葉若しくは外胚葉への分化能の高さ等に基づいて、予め多能性幹細胞を選択しなくても、内胚葉、中胚葉及び外胚葉への分化能が高い分化促進型多能性幹細胞を得ることができる。
本実施形態の培地は液体で供給されてもよいし、粉末で供給されてもよい。また、ＧＳＫ３β阻害剤、ＢＭＰシグナル阻害剤又はＴＧＦ−β阻害剤は、別の容器で供給され、使用時に培地に添加する形態であってもよい。
［分化促進型多能性幹細胞の製造方法］
１実施形態において、本発明は、多能性幹細胞を上述した培地中で培養する工程を備える、分化促進型多能性幹細胞の製造方法を提供する。
本実施形態の製造方法は、内胚葉又は内胚葉に由来する組織への分化用の分化促進型多能性幹細胞の製造方法であるということもできる。あるいは、本実施形態の製造方法は、中胚葉又は中胚葉に由来する組織への分化用の分化促進型多能性幹細胞の製造方法であるということもできる。あるいは、本実施形態の製造方法は、外胚葉又は外胚葉に由来する組織への分化用の分化促進型多能性幹細胞の製造方法であるということもできる。
あるいは、本実施形態の製造方法は、内胚葉若しくは内胚葉に由来する組織への分化用、又は中胚葉若しくは中胚葉に由来する組織への分化用の、分化促進型多能性幹細胞の製造方法であるということもできる。
内胚葉由来の組織としては、例えば、食道上皮、胃上皮、消化管上皮、肝臓、膵臓、膀胱上皮、尿道後方部上皮、扁桃、咽頭上皮、喉頭上皮、気管上皮、肺、甲状腺、上皮小体、胸腺、耳管、鼓室等が挙げられる。また、中胚葉由来の組織としては、例えば、神経小膠細胞、骨、軟骨、心臓、血管内皮、血液細胞、脾臓、骨髄、歯象牙質、腹膜上皮、腎臓、尿管、胸膜上皮、副腎皮質、筋肉、卵巣、子宮、精巣、結合組織等が挙げられる。また、外胚葉由来の組織としては、例えば、中枢神経、末梢神経、神経細胞、軸索、髄鞘、口腔上皮、舌、歯エナメル質、直腸外方部上皮、尿道外方部上皮、鼻腔上皮、下垂体、松果体、副腎髄質、瞳孔括約筋、瞳孔散大筋、皮膚、角膜、網膜、内耳、外耳、膣上皮等が挙げられる。
本実施形態の製造方法において、分化させる対象の多能性幹細胞は、例えばＥＳ細胞であってもよく、例えば人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であってもよい。更に、分化抵抗性を示すＥＳ細胞株や、株選別を実施していない樹立直後のｉＰＳ細胞株であってもよい。
すなわち、本実施形態の製造方法によれば、多能性幹細胞の由来、樹立方法、内胚葉、中胚葉若しくは外胚葉への分化能の高さ等に基づいて、予め多能性幹細胞を選択しなくても、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の全ての胚葉への分化能が高い分化促進型多能性幹細胞を得ることができる。本実施形態の製造方法は、多能性幹細胞の由来に関わらず、多能性幹細胞の内胚葉、中胚葉及び外胚葉への分化能を向上させる方法であるということもできる。ここで、「由来に関わらず」とは、多能性幹細胞が由来する組織、人工多能性幹細胞の樹立方法、人工多能性幹細胞の樹立に用いるベクター、（人工）多能性幹細胞の培養方法等に関わらないことを意味する。
実施例において後述するように、多能性幹細胞を上述した培地中で培養することにより、分化促進型多能性幹細胞を製造することができる。実施例において後述するように、分化促進型多能性幹細胞を目的とする細胞に分化させることにより、通常の多能性幹細胞から目的とする細胞に分化させる場合と比較して、分化効率を向上させることができ、また、短い培養期間で機能的な細胞に分化させることができる。
本実施形態の製造方法において、多能性幹細胞を上述した培地中で培養する期間は、４〜６日間が好ましく、５日間がより好ましい。実施例において後述するように、上記の培養期間であれば、未分化状態を維持したまま、内胚葉、中胚葉及び外胚葉マーカーの発現が上昇した分化促進型多能性幹細胞を得やすい傾向にある。
［分化促進型多能性幹細胞］
１実施形態において、本発明は、対照細胞と比較して内胚葉、中胚葉及び外胚葉マーカーの発現が上昇している、分化促進型多能性幹細胞を提供する。ここで、対照細胞としては、例えば、上述した培地中での培養工程を経ていない多能性幹細胞が挙げられる。実施例において後述するように、本実施形態の分化促進型多能性幹細胞は、対照細胞と比較して内胚葉、中胚葉及び外胚葉の全ての胚葉への分化能が向上している。
本実施形態の分化促進型多能性幹細胞は、内胚葉又は内胚葉に由来する組織への分化用であるということもできる。あるいは、本実施形態の分化促進型多能性幹細胞は、中胚葉又は中胚葉に由来する組織への分化用であるということもできる。あるいは、本実施形態の分化促進型多能性幹細胞は、外胚葉又は外胚葉に由来する組織への分化用であるということもできる。
あるいは、本実施形態の分化促進型多能性幹細胞は、内胚葉若しくは内胚葉に由来する組織への分化用、又は中胚葉若しくは中胚葉に由来する組織への分化用であるということもできる。
本実施形態の分化促進型多能性幹細胞は、未分化マーカーの発現を維持している。未分化マーカーとしては、例えば、ｏｃｔａｍｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４（ＯＣＴ４）、ＮＡＮＯＧ等が挙げられる。また、内胚葉マーカーとしては、例えば、ＳＯＸ１７等が挙げられる。また、中胚葉マーカーとしては、例えば、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ等が挙げられる。また、外胚葉マーカーとしては、例えば、ＳＯＸ１、ＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮ等が挙げられる。各マーカーの発現量は、ｍＲＮＡレベルで測定してもよいし、タンパク質レベルで測定してもよい。
［神経幹細胞塊の製造方法］
１実施形態において、本発明は、上記の分化促進型多能性幹細胞を、ＧＳＫ３β阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ（ＲＯＣＫ）阻害剤、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ２（ＦＧＦ２）及びＬｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）を有効成分として含有する培地中で培養する工程を備える、神経幹細胞塊の製造方法を提供する。本実施形態の製造方法は、神経幹細胞の製造方法であるということもできる。
多能性幹細胞から神経幹細胞塊を作製する場合、胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ、ＥＢ）形成を介した従来の分化誘導法では約１．５ヶ月を要する。これに対し、本実施形態の製造方法によれば、多能性幹細胞から神経幹細胞への分化を約１０日で行うことができる。
また、実施例において後述するように、本実施形態の製造方法によれば、従来法では神経系に分化させることが困難であった、分化抵抗性を示すＥＳ細胞株や、株選別を実施していない樹立直後のｉＰＳ細胞株であっても、高効率に神経幹細胞塊に分化させることができる。
本実施形態の製造方法において、ＧＳＫ３β阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤については、上述したものと同様である。また、本実施形態の製造方法において、分化させる対象の多能性幹細胞がヒト由来の細胞である場合には、ＦＧＦ２及びＬＩＦはヒト由来であることが好ましく、ＧＳＫ３β阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤もヒトＲＯＣＫを対象とするものが好ましい。また、例えば分化させる対象の多能性幹細胞がマウス由来の細胞である場合には、ＦＧＦ２及びＬＩＦはマウス由来であることが好ましく、ＧＳＫ３β阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤もマウスＲＯＣＫを対象とするものが好ましい。
なお、ヒトＦＧＦ２タンパク質のＲｅｆＳｅｑＩＤはＮＰ＿００１９９７であり、マウスＦＧＦ２タンパク質のＲｅｆＳｅｑＩＤはＮＰ＿０３２０３２である。また、ヒトＬＩＦタンパク質のＲｅｆＳｅｑＩＤはＮＰ＿００１２４４０６４であり、マウスＬＩＦタンパク質のＲｅｆＳｅｑＩＤはＮＰ＿００１０３４６２６である。上記の培地中のＦＧＦ２の濃度は２０ｎｇ／ｍＬ程度が好ましい。また、上記の培地中のＬＩＦの濃度は１０ｎｇ／ｍＬ程度が好ましい。
ＲＯＣＫ阻害剤としては、例えば、Ｙ２７６３２等が挙げられる。上記の培地中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は１０μＭ程度が好ましい。
本実施形態の製造方法で分化促進型多能性幹細胞から神経幹細胞を誘導した場合、神経幹細胞は神経幹細胞塊（ニューロスフェア、以下、「ＮＳ」という場合がある。）を形成する。形成された神経幹細胞塊は、細胞１個ずつに解離させて再びＧＳＫ３β阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦ２及びＬＩＦを有効成分として含有する培地中で培養することにより、神経幹細胞の状態で継代することができる。
本実施形態の製造方法において、分化促進型多能性幹細胞を上述した培地中で培養する工程は、低酸素環境下で行うことが好ましい。低酸素環境下としては、酸素濃度が例えば１〜１０％（ｖ／ｖ）、例えば１〜５％（ｖ／ｖ）である環境が挙げられる。これにより、製造される神経幹細胞の数を増加させることができる。
また、本実施形態の製造方法は、多能性幹細胞を上述した培地中で培養する工程の前に、分化促進型多能性幹細胞を細胞１個ずつに解離させる工程を更に備えることが好ましい。これにより、製造される神経幹細胞の数を増加させることができる。
［神経幹細胞塊］
１実施形態において、本発明は、神経幹細胞塊を構成する神経幹細胞のほぼすべてが内胚葉マーカー及び中胚葉マーカーを実質的に発現していない神経幹細胞塊を提供する。本実施形態の神経幹細胞塊は、内胚葉・中胚葉マーカーを発現する細胞を実質的に含まない（内胚葉マーカーを発現する細胞及び中胚葉マーカーを発現する細胞を実質的に含まない）神経幹細胞塊、又は、内胚葉マーカーを発現する細胞及び中胚葉マーカーを発現する細胞を実質的に含まない、多能性幹細胞由来の神経幹細胞塊といいかえることもできる。本実施形態の神経幹細胞塊は、上述した神経幹細胞塊の製造方法により製造することができる。
内胚葉マーカー、中胚葉マーカーとしては、上述したものと同様である。実施例において後述するように、上述した神経幹細胞塊の製造方法により製造された神経幹細胞塊は、内胚葉マーカー及び中胚葉マーカーをほとんど発現していないことが明らかとなった。
神経幹細胞塊は外胚葉系の細胞である神経幹細胞が自己増殖して形成した細胞塊であるため、生体内の神経幹細胞塊は、内胚葉マーカー及び中胚葉マーカーを発現していないのが通常である。しかしながら、多能性幹細胞から従来法により分化誘導した神経幹細胞塊は、内胚葉マーカー又は中胚葉マーカーを発現する細胞が混在している場合がある。
これは、多能性幹細胞から従来法により分化誘導した神経幹細胞塊が、（１）外胚葉系細胞、（２）外胚葉系にコミットしつつある多能性細胞、（３）単に増殖した中胚葉系細胞又は内胚葉系細胞、等のヘテロな細胞集団により構成されていることによる。このような神経幹細胞塊は、機能的なニューロンへと分化させることが困難な場合がある。
これに対し、本実施形態の神経細胞隗は、ほぼ（１）外胚葉系細胞、（２）外胚葉系にコミットしつつある多能性細胞、の細胞集団だけで構成されている。このため、
本実施形態の神経細胞隗は、高純度な神経分化誘導基盤であるといえる。
すなわち、上述した神経幹細胞塊の製造方法により、内胚葉マーカー又は中胚葉マーカーを発現する細胞をほとんど含まない神経幹細胞塊を製造することができる。この神経幹細胞塊を構成するほぼ全ての細胞は、内胚葉マーカー及び中胚葉マーカーを実質的に発現していない。ここで、実質的に発現していないとは、例えば、神経幹細胞塊を細胞１個ずつに解離させて細胞ポピュレーション解析を実施した場合に、内胚葉マーカー及び中胚葉マーカーを発現する細胞をほとんど検出できないことを意味する。より具体的には、内胚葉マーカー及び中胚葉マーカーを発現する細胞の割合が、例えば１％以下であることを意味する。なお、本明細書において、細胞ポピュレーション解析とは、免疫染色した細胞１個ずつについて、そのマーカータンパク質の発現を解析する解析手法をいう。
上記の神経幹細胞塊を構成する神経幹細胞は、Ｔ細胞受容体遺伝子を再編成していてもよい。Ｔ細胞受容体遺伝子を再編成しているということは、当該神経幹細胞が成熟したＴ細胞由来であることを示す。
すなわち、成熟したＴ細胞から作製されたｉＰＳＣ（以下、「ＴｉＰＳＣ」という場合がある。）を材料に用い、上述した神経幹細胞塊の製造方法により製造した神経幹細胞塊は、Ｔ細胞受容体遺伝子が再編成している。
［胚葉又は組織の製造方法］
１実施形態において、本発明は、上述した分化促進型多能性幹細胞を分化させる工程を備える、胚葉又は組織の製造方法を提供する。胚葉又は組織としては、内胚葉若しくは内胚葉由来組織、中胚葉若しくは中胚葉由来組織、外胚葉若しくは外胚葉由来組織が挙げられる。各胚葉由来組織としては上述したものが挙げられる。
本実施形態の製造方法によれば、多能性幹細胞の由来、樹立方法、内胚葉、中胚葉若しくは外胚葉への分化能の高さ等に基づいて、予め多能性幹細胞を選択しなくても、多能性幹細胞から、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の全ての胚葉又はそれに由来する組織を効率よく製造することができる。
分化促進型多能性幹細胞を分化させる工程は、特に限定されず、例えば胚様体を形成して培養する方法であってもよいし、分化促進型多能性幹細胞に所定の遺伝子を発現させる方法等であってもよい。
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実験例１］
（分化促進型多能性幹細胞の誘導培地の検討）
ヒト多能性幹細胞の未分化状態を維持したまま、内胚葉、中胚葉及び外胚葉マーカーの発現を上昇させることができる因子の組み合わせを検討した。
具体的には、ヒトｉＰＳＣである２０１Ｂ７細胞株を、通常の培地（対照）、又は様々な組み合わせでＧＳＫ３β阻害剤、ＢＭＰシグナル阻害剤及びＴＧＦ−β阻害剤を含有する培地で５日間培養した。続いて、リアルタイムＰＣＲにより、未分化マーカー、内胚葉マーカー、中胚葉マーカー及び外胚葉マーカーの発現量を測定した。また、比較のために、胚様体（ＥＢ）形成用培地中で３６日間培養して形成させたＥＢにおける各マーカーの発現量も同様に測定した。
ＧＳＫ３β阻害剤としてはＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ番号：２５２９１７−０６−９）を使用した。また、ＢＭＰシグナル阻害剤としてはＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（ＣＡＳ番号：８６６４０５−６４−３）を使用した。また、ＴＧＦ−β阻害剤としてはＳＢ４３１５４２（ＣＡＳ番号：３０１８３６−４１−９）を使用した。
また、未分化マーカーとしてはｏｃｔａｍｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４（ＯＣＴ４）及びＮＡＮＯＧ遺伝子を検討した。また、外胚葉マーカーとしてはＳＯＸ１、ＰＡＸ６及びＮＥＳＴＩＮ遺伝子を検討した。また、中胚葉マーカーとしてはＢＲＡＣＨＹＵＲＹ遺伝子を検討した。また、内胚葉マーカーとしてはＳＯＸ１７遺伝子を検討した。
図１（ａ）〜（ｇ）は、各マーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。図１（ａ）はＯＣＴ４の結果を表し、図１（ｂ）はＮＡＮＯＧの結果を表し、図１（ｃ）はＳＯＸ１の結果を表し、図１（ｄ）はＰＡＸ６の結果を表し、図１（ｅ）はＮＥＳＴＩＮの結果を表し、図１（ｆ）はＢＲＡＣＨＹＵＲＹの結果を表し、図１（ｇ）はＳＯＸ１７の結果を表す。
図１中、ＳＢはＳＢ４３１５４２を表し、ＤＭはＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎを表し、ＣＨＩＲはＣＨＩＲ９９０２１を表す。また、ＳＢ＋ＤＭはＳＢ及びＤＭを培地に添加したことを表し、ＳＢ＋ＣＨＩＲはＳＢ及びＣＨＩＲを培地に添加したことを表し、ＤＭ＋ＣＨＩＲはＤＭ及びＣＨＩＲを培地に添加したことを表し、ＳＢ＋ＤＭ＋ＣＨＩＲはＳＢ、ＤＭ及びＣＨＩＲを培地に添加したことを表す。ＳＢの培地中濃度は３μＭであり、ＤＭの培地中濃度は３μＭであり、ＣＨＩＲの培地中濃度は３μＭであった。
その結果、ＳＢ、ＤＭ及びＣＨＩＲを培地に添加した場合に、未分化状態を維持したまま、内胚葉、中胚葉及び外胚葉マーカーの発現を上昇させることができることが明らかとなった。
［実験例２］
（分化促進型多能性幹細胞の誘導条件の検討）
ヒト多能性幹細胞を分化促進型多能性幹細胞に誘導する条件を検討した。より具体的には、ＳＢ、ＤＭ及びＣＨＩＲを添加した培地での培養日数を３、４、５又は６日間培養し、ヒトｉＰＳＣである２０１Ｂ７細胞株から分化促進型多能性幹細胞を誘導した。対照としては、通常の培地で６日間培養した２０１Ｂ７細胞株を使用した。
続いて、リアルタイムＰＣＲにより、未分化マーカー、内胚葉マーカー、中胚葉マーカー及び外胚葉マーカーの発現量を測定した。マーカーとしては、実験例１と同様の遺伝子を検討した。また、細胞の形態を観察した。
図２（ａ）〜（ｇ）は、各マーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。図２（ａ）はＯＣＴ４の結果を表し、図２（ｂ）はＮＡＮＯＧの結果を表し、図２（ｃ）はＳＯＸ１の結果を表し、図２（ｄ）はＰＡＸ６の結果を表し、図２（ｅ）はＮＥＳＴＩＮの結果を表し、図２（ｆ）はＢＲＡＣＨＹＵＲＹの結果を表し、図２（ｇ）はＳＯＸ１７の結果を表す。
その結果、ＳＢ、ＤＭ及びＣＨＩＲを添加した培地で５〜６日間培養することにより、未分化状態を維持したまま、内胚葉、中胚葉及び外胚葉マーカーの発現を上昇させることができることが明らかとなった。
図３（ａ）及び（ｂ）は、ヒト多能性幹細胞コロニー（ｈＰＳＣコロニー）の光学顕微鏡写真である。スケールバーは２００μｍを示す。図３（ａ）に示すｈＰＳＣコロニーの細胞は、その形態から未分化状態を維持していると判断できる。一方、図３（ｂ）に示すｈＰＳＣコロニーの細胞は、中央部が窪んだ形態を示しており、その形態から過剰に分化していると判断できる。
図４は、２０１Ｂ７細胞株を、ＳＢ、ＤＭ及びＣＨＩＲを添加した培地で３、４、５又は６日間培養して分化促進型多能性幹細胞を誘導した場合に出現したｈＰＳＣコロニーのうち、過剰に分化したｈＰＳＣコロニーの割合を示すグラフである。図４中、「＊＊」は、危険率０．１％未満で有意差が存在することを示す。
その結果、ヒト多能性幹細胞を、ＳＢ、ＤＭ及びＣＨＩＲを添加した培地で６日間培養すると、対照と比較して、過剰に分化したｈＰＳＣコロニーの割合が有意に増加することが明らかとなった。
以上の結果から、ヒト多能性幹細胞を分化促進型多能性幹細胞に誘導する条件としては、ＳＢ、ＤＭ及びＣＨＩＲを添加した培地で５日間培養する条件が好適であることが明らかとなった。
［実験例３］
（分化促進型多能性幹細胞の性状１）
発明者らは、分化促進型多能性幹細胞のコロニーが、通常のヒト多能性幹細胞を同期間培養した場合のコロニーと比較して小さいことを見出した。
具体的には、ヒトｉＰＳＣである２０１Ｂ７細胞株を、ＳＢ、ＤＭ及びＣＨＩＲを添加した培地で５日間培養して分化促進型多能性幹細胞を誘導し、コロニーの直径の変化を測定した。対照として、２０１Ｂ７細胞株を５日間通常の培地で培養し、コロニーの直径の変化を測定した。実験は独立して３回行った。
図５（ａ）は、通常の培地で５日間培養した２０１Ｂ７細胞のコロニーの代表的な写真である。図５（ｂ）は、２０１Ｂ７細胞株を、ＳＢ、ＤＭ及びＣＨＩＲを添加した培地で５日間培養して誘導した分化促進型多能性幹細胞のコロニーの写真である。図５（ａ）及び図５（ｂ）の倍率はいずれも同じであり、スケールバーは２００μｍを示す。
図５（ｂ）に示すように、分化促進型多能性幹細胞のコロニーの直径は対照と比較して小さいことが明らかとなった。また、図６は、分化促進型多能性幹細胞のコロニーと、通常のヒト多能性幹細胞のコロニーの直径の変化を測定した結果を示すグラフである。図５中、「＊＊」は危険率１％未満で有意差が存在することを示す。
図６の結果からも、分化促進型多能性幹細胞のコロニーは、通常のヒト多能性幹細胞のコロニーと比較して、３日目以降においてコロニーの直径が有意に小さいことが明らかとなった。
［実験例４］
（分化促進型多能性幹細胞の性状２）
ヒトｉＰＳＣである２０１Ｂ７細胞株を、ＳＢ、ＤＭ及びＣＨＩＲを添加した培地で５日間培養し、分化促進型多能性幹細胞を形成した。対照として、通常の培地で５日間培養した２０１Ｂ７細胞株を用いた。
続いて、免疫染色により、内胚葉マーカー、中胚葉マーカー及び外胚葉マーカーの発現量を測定した。外胚葉マーカーとしてはＰＡＸ６及びＮＥＳＴＩＮタンパク質を検出した。また、中胚葉マーカーとしてＢＲＡＣＨＹＵＲＹタンパク質を検出した。また、内胚葉マーカーとしてはＳＯＸ１７タンパク質を検討した。
図７は、各マーカータンパク質の発現量を示すグラフである。図７中、「＊＊」は、危険率０．１％未満で有意差が存在することを示す。その結果、タンパク質レベルにおいても、分化促進型多能性幹細胞では、対照と比較して、内胚葉マーカー、中胚葉マーカー及び外胚葉マーカーの発現レベルが上昇していることが確認された。
続いて、上記の分化促進型多能性幹細胞及び対照細胞を１細胞ずつに解離させ、上記の免疫染色と同じマーカーを免疫染色し、各マーカータンパク質を発現している細胞集団の比率を解析した。
図８は、解析結果を示すグラフである。その結果、分化促進型多能性幹細胞における、ＰＡＸ６＋ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ−細胞、ＰＡＸ６−ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ＋細胞、ＮＥＳＴＩＮ＋ＳＯＸ１７−細胞、ＮＥＳＴＩＮ−ＳＯＸ１７＋細胞の数は、いずれも対照と比較して増加していることが明らかとなった。
［実験例５］
（分化促進型多能性幹細胞からの神経幹細胞塊の誘導）
ヒトｉＰＳＣである２０１Ｂ７細胞株を、ＳＢ、ＤＭ及びＣＨＩＲを添加した培地で５日間培養し、分化促進型多能性幹細胞を誘導した。続いて、誘導した分化促進型多能性幹細胞を細胞１個ずつに解離させ、ＦＧＦ２、Ｙ２７６３２（ＣＡＳ番号：３３１７５２−４７−７）、ＬＩＦ、ＣＨＩＲ及びＳＢを含有する無血清培地（以下、「ＮＳ培地」という場合がある。）で５日間培養することにより神経幹細胞塊（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ、以下、「ＮＳ」という場合がある。）を形成させた（培養日数は合計１０日間）。以下、分化促進型多能性幹細胞（ＤｉＳＣ）を経て形成した神経幹細胞塊（ＮＳ）を、「ＤｉＳＣ−ＮＳ」という場合がある。ＮＳ培地の組成を下記表１に示す。
対照として、２０１Ｂ７細胞株を、通常の培地で５日間培養後、細胞１個ずつに解離させ、上記のＮＳ培地で５日間（培養日数は合計１０日間）又は１０日間（培養日数は合計１５日間）培養した細胞を用いた。続いて、顕微鏡観察により、形成された神経幹細胞塊の数を測定した。実験は独立して３回行った。
図９は、上記の培養により形成された神経幹細胞塊の数を示すグラフである。図９中、「＊＊」は、危険率１％未満で有意差が存在することを示す。その結果、分化促進型多能性幹細胞を経て神経幹細胞塊を形成させると、その形成効率が非常に高まることが明らかとなった。
続いて、リアルタイムＰＣＲにより、形成された上記の神経幹細胞塊における、未分化マーカー、内胚葉マーカー、中胚葉マーカー、外胚葉マーカー及び神経細胞マーカーの発現量を測定した。
未分化マーカーとしてはＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧ遺伝子を検討した。また、外胚葉マーカーとしてはＰＡＸ６、ＳＯＸ１及びＮＥＳＴＩＮ遺伝子を検討した。また、神経細胞マーカーとしてはβＩＩＩ−チューブリン（ＴＵＢＢ３）遺伝子を検討した。また、中胚葉マーカーとしてはＢＲＡＣＨＹＵＲＹ遺伝子を検討した。また、内胚葉マーカーとしてはＳＯＸ１７遺伝子を検討した。
図１０（ａ）〜（ｈ）は、各マーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。図１０（ａ）はＯＣＴ４の結果を表し、図１０（ｂ）はＮＡＮＯＧの結果を表し、図１０（ｃ）はＰＡＸ６の結果を表し、図１０（ｄ）はＳＯＸ１の結果を表し、図１０（ｅ）はＮＥＳＴＩＮの結果を表し、図１０（ｆ）はＴＵＢＢ３の結果を表し、図１０（ｇ）はＢＲＡＣＨＹＵＲＹの結果を表し、図１０（ｈ）はＳＯＸ１７の結果を表す。図１０中、「＊＊」は危険率１％未満で有意差が存在することを示す。
その結果、分化促進型多能性幹細胞を経て形成した神経幹細胞塊では、未分化マーカーの発現が有意に減少し、外胚葉マーカー、神経細胞マーカーの発現が有意に上昇したことが明らかとなった。
続いて、上記の神経幹細胞塊を１細胞ずつに解離させ、細胞ポピュレーション解析により、外胚葉マーカー、中胚葉マーカー及び内胚葉マーカータンパク質の発現を検討した。外胚葉マーカーとしては、ＰＡＸ６及びＮＥＳＴＩＮタンパク質を検出した。また、中胚葉マーカーとしてはＢＲＡＣＨＹＵＲＹタンパク質を検出した。また、内胚葉マーカーとしてはＳＯＸ１７タンパク質を検出した。
図１１（ａ）は、分化促進型多能性幹細胞を経ずに形成した神経幹細胞塊における、ＰＡＸ６＋ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ＋細胞、ＰＡＸ６＋ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ−細胞、ＰＡＸ６−ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ＋細胞、ＰＡＸ６−ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ−細胞の割合を示すグラフである。
図１１（ｂ）は、分化促進型多能性幹細胞を経て形成した神経幹細胞塊における、ＰＡＸ６＋ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ＋細胞、ＰＡＸ６＋ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ−細胞、ＰＡＸ６−ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ＋細胞、ＰＡＸ６−ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ−細胞の割合を示すグラフである。
その結果、分化促進型多能性幹細胞を経て形成した神経幹細胞塊では、外胚葉マーカーのみを発現する細胞（ＰＡＸ６＋ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ−細胞）の割合が高かったのに対し、分化促進型多能性幹細胞を経ずに形成した神経幹細胞塊では、外胚葉マーカーのみを発現する細胞（ＰＡＸ６＋ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ−細胞）の割合が低く、外胚葉マーカーも中胚葉マーカーも発現しない細胞（ＰＡＸ６−ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ−細胞）の割合が高かった。
図１２（ａ）は、分化促進型多能性幹細胞を経ずに形成した神経幹細胞塊における、ＮＥＳＴＩＮ＋ＳＯＸ１７＋細胞、ＮＥＳＴＩＮ＋ＳＯＸ１７−細胞、ＮＥＳＴＩＮ−ＳＯＸ１７＋細胞、ＮＥＳＴＩＮ−ＳＯＸ１７−細胞の割合を示すグラフである。図１２（ｂ）は、分化促進型多能性幹細胞を経て形成した神経幹細胞塊における、ＮＥＳＴＩＮ＋ＳＯＸ１７＋細胞、ＮＥＳＴＩＮ＋ＳＯＸ１７−細胞、ＮＥＳＴＩＮ−ＳＯＸ１７＋細胞、ＮＥＳＴＩＮ−ＳＯＸ１７−細胞の割合を示すグラフである。
その結果、分化促進型多能性幹細胞を経ずに形成した神経幹細胞塊では、分化促進型多能性幹細胞を経て形成した神経幹細胞塊と比較して、外胚葉マーカー及び内胚葉マーカーの双方を発現する細胞（ＮＥＳＴＩＮ＋ＳＯＸ１７＋細胞）の割合が高かった。
［実験例６］
（分化誘導したニューロンの検討１）
ヒトｉＰＳＣである２０１Ｂ７細胞株及びＷＤ３９細胞株、並びにＥＳ細胞株であるＫｈＥＳ１細胞株から、分化促進型多能性幹細胞を経て、又は分化促進型多能性幹細胞を経ずに、神経幹細胞塊を形成した。さらに、これらの神経幹細胞塊をニューロンに分化させた。以下、分化促進型多能性幹細胞を経て形成した神経幹細胞塊から分化させて得たニューロンを「ＤｉＳＣニューロン」という場合がある。また、分化促進型多能性幹細胞を経ずに形成した神経幹細胞塊から分化させて得たニューロンを対照に用いた。
ニューロンへの分化は、各神経幹細胞塊をラミニン及びポリＬ−オルニチンコートしたプレートに播種し、神経分化誘導培地で培養することにより行った。下記表２に、神経分化誘導培地の組成を示す。
培養２３日後に、リアルタイムＰＣＲにより、ＤｉＳＣニューロン及び対照のニューロンにおける、神経細胞マーカー、グルタミン酸作動性ニューロンマーカー、ＧＡＢＡ作動性ニューロンマーカー、外胚葉マーカー、未分化マーカー、中胚葉マーカー、内胚葉マーカー遺伝子の発現量を測定した。また、比較のために、ヒト神経幹細胞（ｈＮＳＣ）についても同様のマーカー遺伝子の発現量を測定した。
神経細胞マーカーとしては、ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ２（ＭＡＰ２）、シナプシン１（ＳＹＮ１）、βＩＩＩ−チューブリン（ＴＵＢＢ３）遺伝子を検討した。グルタミン酸作動性ニューロンマーカーとしては、ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ １（ＶＧＬＵＴ１）遺伝子を検討した。ＧＡＢＡ作動性ニューロンマーカーとしては、グルタミン酸デカルボキシラーゼ２（ＧＡＤ６５）及びグルタミン酸デカルボキシラーゼ１（ＧＡＤ６７）遺伝子を検討した。外胚葉マーカーとしては、ＮＥＳＴＩＮ及びＳＯＸ１遺伝子を検討した。未分化マーカーとしては、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧ遺伝子を検討した。中胚葉マーカーとしてはＢＲＡＣＨＹＵＲＹ遺伝子を検討した。また、内胚葉マーカーとしてはＳＯＸ１７遺伝子を検討した。
図１３は、各マーカー遺伝子の発現量を示すグラフである。その結果、対照のニューロンにおいては、これらのマーカー遺伝子の発現量に明確な傾向が認められなかった。一方、ＤｉＳＣニューロンにおいては、神経細胞マーカー、グルタミン酸作動性ニューロンマーカー及びＧＡＢＡ作動性ニューロンマーカー遺伝子の発現レベルが高く、外胚葉マーカー、未分化マーカー、中胚葉マーカー及び内胚葉マーカー遺伝子の発現レベルが低い傾向が認められた。
［実験例７］
（分化誘導したニューロンの検討２）
実験例６で作製した対照のニューロン及びＤｉＳＣニューロンを免疫染色し、ニューロンの成熟について検討した。成熟したニューロンの指標として、シナプシン１＋βＩＩＩ−チューブリン＋細胞の数を測定した。実験は独立して３回行った。
図１４は、測定結果を示すグラフである。図１４中、「＊＊」は危険率１％未満で有意差が存在することを示す。その結果、ＤｉＳＣニューロンでは、対照のニューロンと比較して、成熟したニューロンの数が多いことが明らかとなった。
［実験例８］
（分化誘導したニューロンの検討３）
マイクロ電極アレイを用いて、実験例６で作製した対照のニューロン及びＤｉＳＣニューロンを電気物理学的に解析した。より具体的には、１分間当たりのニューロンの発火の数を測定することにより、ニューロンの機能性を評価した。
図１５は、ニューロンへの分化を開始してから１１〜２３日後の各ニューロンにおける発火の数を測定した結果を示すグラフである。図１５中、「＊」は危険率５％未満で有意差が存在することを示し、「＊＊」は危険率１％未満で有意差が存在することを示す。
その結果、ＤｉＳＣニューロンでは、対照のニューロンと比較して、発火の数が有意に多いことが明らかとなった。この結果は、ＤｉＳＣニューロンは、対照のニューロンと比較して機能的なニューロンを多く含むことを示す。
［実験例９］
（分化抵抗性ＥＳ細胞株の神経幹細胞塊への分化誘導）
分化抵抗性ヒトＥＳ細胞株である、ＫｈＥＳ２、ＫｈＥＳ３、ＫｈＥＳ４及びＫｈＥＳ５を、分化促進型多能性幹細胞を経て神経幹細胞塊に分化誘導した。
具体的には、まず、各細胞株をＳＢ、ＤＭ及びＣＨＩＲを添加した培地で５日間培養し、分化促進型多能性幹細胞を誘導した。続いて、誘導した各分化促進型多能性幹細胞を細胞１個ずつに解離させ、上述のＮＳ培地で１０日間培養した。
対照には、分化促進型多能性幹細胞を経ずに神経幹細胞塊に分化誘導した細胞を用いた。以下、分化促進型多能性幹細胞を経て誘導した神経幹細胞塊をＤｄＮＳという場合がある。
図１６は、ＮＳ培地で１０日間培養した各細胞の光学顕微鏡写真である。写真の倍率は全て同じであり、スケールバーは２００μｍを示す。また、図１７は、各細胞中の神経幹細胞塊の数を測定した結果を示すグラフである。図１７中、「＊＊」は、危険率１％未満で有意差が存在することを示す。
その結果、分化促進型多能性幹細胞を経ることにより、分化抵抗性のＥＳ細胞からも効率よく神経幹細胞塊を誘導できることが明らかとなった。
［実験例１０］
（分化抵抗性ＥＳ細胞株のニューロンへの分化誘導）
実験例９で誘導した各神経幹細胞塊を、ラミニン及びポリＬ−オルニチンコートしたプレートに播種し、上述した神経分化誘導培地で培養することによりニューロンに分化させた。続いて、培養２３日目（神経分化誘導培地で培養してから１３日目）に各ニューロンを免疫染色し、ニューロン全体に占める、βＩＩＩ−チューブリン＋ＭＡＰ２＋ニューロンの数を測定した。実験は独立して３回行った。
図１８は、測定結果を示すグラフである。図１８中、「＊」は危険率５％未満で有意差が存在することを示し、「＊＊」は危険率１％未満で有意差が存在することを示す。その結果、ＤｄＮＳを介して分化誘導したニューロンでは、対照のニューロンと比較して、βＩＩＩ−チューブリン＋ＭＡＰ２＋ニューロンの数が多いことが明らかとなった。
また、培養２３日目（神経分化誘導培地で培養してから１３日目）に各ニューロンを免疫染色し、ニューロンの成熟について検討した。成熟したニューロンの指標として、シナプシン１＋βＩＩＩ−チューブリン＋細胞の数を測定した。実験は独立して３回行った。
図１９は、測定結果を示すグラフである。図１９中、「＊＊」は危険率１％未満で有意差が存在することを示す。その結果、ＤｄＮＳを介して分化誘導したニューロンでは、対照のニューロンと比較して、成熟したニューロンの数が多いことが明らかとなった。
［実験例１１］
（樹立直後のＴｉＰＳＣからのニューロンの分化誘導）
樹立直後のＴｉＰＳＣは、ニューロンへの分化が非常に困難であることが知られている。そこで、実験例１０と同様にして、新たに樹立した直後のＴｉＰＳＣ３０株を、ＤｉＳＣ及びＤｄＮＳを介した方法によりニューロンに分化させた。対照として、ＤｉＳＣ及びＤｄＮＳを経ずにニューロンに分化させた細胞を用いた。続いて、培養２３日目（神経分化誘導培地で培養してから１３日目）に各ニューロンを免疫染色し、ニューロン全体に占める、βＩＩＩ−チューブリン＋ＭＡＰ２＋ニューロンの数を測定した。
なお、ＴｉＰＳＣ株は、健常人由来のＣＤ３陽性リンパ球に、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びｃ−ＭＹＣを４つのベクターにそれぞれ含むセンダイウイルスベクター（型式「Ｃｙｔｏｔｕｎｅ（商標）」、ＤＮＡＶＥＣ社）を導入することにより樹立した。
図２０は、測定結果を示すグラフである。その結果、ＤｉＳＣ及びＤｄＮＳを介した方法により分化誘導したニューロンでは、対照のニューロンと比較して、βＩＩＩ−チューブリン＋ＭＡＰ２＋ニューロンの数が多いことが明らかとなった。
また、培養２３日目（神経分化誘導培地で培養してから１３日目）に各ニューロンを免疫染色し、ニューロンの成熟について検討した。成熟したニューロンの指標として、シナプシン１＋βＩＩＩ−チューブリン＋細胞の数を測定した。
図２１は、測定結果を示すグラフである。その結果、ＤｉＳＣ及びＤｄＮＳを介した方法により分化誘導したニューロンでは、対照のニューロンと比較して、成熟したニューロンの数が多いことが明らかとなった。
下記表３に、ＤｉＳＣ及びＤｄＮＳを介さない方法（対照）及びＤｉＳＣ及びＤｄＮＳを介した方法（表３中、「ＤｄＮＳ」と示す。）により神経幹細胞塊の形成及びニューロンへの分化を示したＴｉＰＳＣ株の数を示す。ＤｉＳＣ及びＤｄＮＳを介した方法により、ニューロンへの分化が非常に困難であることが知られている樹立直後のＴｉＰＳＣ株を高効率にニューロンへ分化させることができた。
［実験例１２］
（ドーパミン作動性ニューロンへの分化誘導の検討）
実験例１０と同様にして、ヒトｉＰＳＣである２０１Ｂ７細胞株及びＷＤ３９細胞株、並びにＥＳ細胞株であるＫｈＥＳ１細胞株から、ＤｉＳＣ及びＤｄＮＳを介した方法によりニューロンを分化誘導した。
また、ヒトｉＰＳＣである２０１Ｂ７細胞株及びＷＤ３９細胞株、並びにＥＳ細胞株であるＫｈＥＳ１細胞株からドーパミン作動性ニューロンを分化誘導した。具体的には、上記の各細胞を、ＳＢ、ＤＭ及びＣＨＩＲを添加した培地で５日間培養し、分化促進型多能性幹細胞を誘導した。続いて、誘導した各分化促進型多能性幹細胞を細胞１個ずつに解離させ、上述のＮＳ培地で３日間培養した。続いて、上述の培地に、ＣＨＩＲ（３μＭ）、Ｓｈｈ（１００ｎｇ／ｍＬ）、Ｐｕｒｍｏｒｐａｍｉｎｅ（ＣＡＳ番号：４８３３６７−１０−８）（２μＭ）を更に添加して７日間培養することにより、ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞に分化させた。続いて、上述した神経分化誘導培地にＴＧＦ−β３（１ｎｇ／ｍＬ）とＣＨＩＲ（３μＭ）を添加して３日間培養し、その後ＣＨＩＲを除去した条件で培養することによりドーパミン作動性ニューロンに分化させた。
続いて、免疫染色により、ドーパミン作動性ニューロンマーカーであるｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（ＴＨ）及び神経細胞マーカーであるβＩＩＩ−チューブリンの発現を検討した。対照には、ＤｉＳＣ及びＤｄＮＳを介さずにニューロンに分化誘導した細胞を用いた。
図２２は、βＩＩＩ−チューブリン＋細胞又はＴＨ＋βＩＩＩ−チューブリン＋細胞の割合を測定した結果を示すグラフである。図２２中、ＤｄＮＳは実験例１０と同様にして誘導したニューロンの結果を示す。また、ＤｄＮＳ（Ｄｏｐａ）は、上述した方法により誘導したドーパミン作動性ニューロンの結果を示す。また、「＊＊」は危険率１％未満で有意差が存在することを示す。
その結果、ＤｉＳＣ及びＤｄＮＳを介した方法により、ドーパミン作動性ニューロンを高効率に分化誘導できることが明らかとなった。
［実験例１３］
（ｉＰＳＣ由来の分化促進型多能性幹細胞の三胚葉分化能の検討）
ｉＰＳＣから誘導した分化促進型多能性幹細胞（ＤｉＳＣ）の三胚葉分化能を検討した。具体的には、ヒトｉＰＳＣである２０１Ｂ７細胞株を、ＳＢ、ＤＭ及びＣＨＩＲを添加した培地で５日間培養し、分化促進型多能性幹細胞を形成した。ＳＢ、ＤＭ及びＣＨＩＲの終濃度はいずれも３μＭとした。対照として、通常の培地で５日間培養した２０１Ｂ７細胞株を用いた。
続いて、分化促進型多能性幹細胞のコロニーを細胞１個ずつに解離させた。細胞の解離には０．２５％トリプシン、１００μｇ／ｍＬコラゲナーゼＩＶ、１ｍＭ塩化カルシウム、２０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ、インビトロジェン社）を含む解離溶液を用いた。
続いて、解離した分化促進型多能性幹細胞からＳＮＬフィーダー細胞（ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＡＢＳ社）を除去し、通常のヒトＥＳ細胞用の培地からＦＧＦ２を除去した培地を用いて、培養ディッシュ中で８日間浮遊培養し、胚様体（以下、「ＥＢ」という場合がある。）を形成した。培地は１日おきに半量ずつ交換した。
その後、８日目のＥＢを、崩さずにそのままマトリゲルコートされた９６ウェルプレートに接着させて１０日間接着培養した。培地には、通常のヒトＥＳ細胞用の培地からＦＧＦ２を除去した培地を用いた。培地は１日おきに交換した。
続いて、接着培養開始から１０日後（分化促進型多能性幹細胞の形成から１８日後）に、細胞を固定した。続いて、固定した細胞を免疫染色し、内胚葉の分化マーカーであるＡＦＰ、中胚葉の分化マーカーであるαＳＭＡ、外胚葉の分化マーカーであるβＩＩＩ−チューブリンを検出し、三胚葉分化能を検討した。細胞の顕微鏡写真の撮影及び蛍光強度の定量にはＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ６０００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いた。
図２３は、各細胞における分化マーカーの発現量を定量した結果を示すグラフである。図２３中、「ＤｉＳＣ」はＤｉＳＣを経てＥＢを形成し、分化させた細胞の結果であることを示す。また、「＊＊」は、危険率０．１％未満で有意差が存在することを示す。その結果、ｉＰＳＣからＤｉＳＣを経てＥＢを形成し、分化させた細胞は、対照細胞と比較して、三胚葉分化能が有意に向上したことが明らかとなった。
［実験例１４］
（分化抵抗性ＥＳ細胞株由来の分化促進型多能性幹細胞の三胚葉分化能の検討）
分化抵抗性ＥＳ細胞株から誘導した分化促進型多能性幹細胞の三胚葉分化能を検討した。分化抵抗性ＥＳ細胞株としては、ヒトＥＳ細胞株である、ＫｈＥＳ２、ＫｈＥＳ３、ＫｈＥＳ４及びＫｈＥＳ５を使用した。
まず、各ＥＳ細胞株を、ＳＢ、ＤＭ及びＣＨＩＲを添加した培地で５日間培養し、分化促進型多能性幹細胞を形成した。ＳＢ、ＤＭ及びＣＨＩＲの終濃度はいずれも３μＭとした。対照として、通常の培地で５日間培養した各ＥＳ細胞株を用いた。
続いて、免疫染色により、内胚葉マーカー、中胚葉マーカー及び外胚葉マーカーの発現量を測定した。外胚葉マーカーとしてはＳＯＸ１タンパク質を検出した。また、中胚葉マーカーとしてＢＲＡＣＨＹＵＲＹタンパク質を検出した。また、内胚葉マーカーとしてＳＯＸ１７タンパク質を検討した。
図２４（ａ）〜（ｃ）は、各マーカータンパク質の発現量を示すグラフである。図２４（ａ）はＳＯＸ１タンパク質の発現量を示すグラフであり、図２４（ｂ）はＢＲＡＣＨＹＵＲＹタンパク質の発現量を示すグラフであり、図２４（ｃ）はＳＯＸ１７タンパク質の発現量を示すグラフである。図２４（ａ）〜（ｃ）中、「ＤｉＳＣ」は分化促進型多能性幹細胞の結果であることを示す。また、「＊＊」は、危険率０．１％未満で有意差が存在することを示す。その結果、分化促進型多能性幹細胞では、対照と比較して、外胚葉マーカー、中胚葉マーカー及び内胚葉マーカーの発現レベルが有意に上昇していることが確認された。
続いて、実験例１３と同様にして、各分化促進型多能性幹細胞のコロニーを細胞１個ずつに解離させて８日間培養し、ＥＢを形成した。さらに、実験例１３と同様にして、ＥＢをマトリゲルコートされた９６ウェルプレートに接着させて１０日間接着培養した。
続いて、接着培養開始から１０日後（分化促進型多能性幹細胞の形成から１８日後）に、細胞を固定した。続いて、固定した細胞を免疫染色し、内胚葉の分化マーカーであるＡＦＰ、中胚葉の分化マーカーであるαＳＭＡ、外胚葉の分化マーカーであるβＩＩＩ−チューブリンを検出し、三胚葉分化能を検討した。細胞の顕微鏡写真の撮影及び蛍光強度の定量にはＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ６０００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いた。
図２５は、各細胞における分化マーカーの発現量を定量した結果を示すグラフである。図２５中、「ＤｉＳＣ」はＤｉＳＣを経てＥＢを形成し、分化させた細胞の結果であることを示す。その結果、分化促進型多能性幹細胞を経た細胞は、対照細胞と比較して、三胚葉分化能が有意に向上したことが明らかとなった。
［実験例１５］
（樹立直後のＴｉＰＳＣ由来の分化促進型多能性幹細胞の三胚葉分化能の検討）
樹立直後のＴｉＰＳＣから誘導した分化促進型多能性幹細胞の三胚葉分化能を検討した。ＴｉＰＳＣとしては、実験例１１と同様にして樹立した直後のヒトＴｉＰＳＣ３０株を、コロニー選別を行わずに使用した。
まず、各ＴｉＰＳＣ株を、ＳＢ、ＤＭ及びＣＨＩＲを添加した培地で５日間培養し、分化促進型多能性幹細胞を形成した。ＳＢ、ＤＭ及びＣＨＩＲの終濃度はいずれも３μＭとした。対照として、通常の培地で５日間培養した各ＴｉＰＳＣ株を用いた。
続いて、免疫染色により、内胚葉マーカー、中胚葉マーカー及び外胚葉マーカーの発現量を測定した。外胚葉マーカーとしてはＳＯＸ１タンパク質を検出した。また、中胚葉マーカーとしてＢＲＡＣＨＹＵＲＹタンパク質を検出した。また、内胚葉マーカーとしてＳＯＸ１７タンパク質を検討した。
図２６（ａ）〜（ｃ）は、各マーカータンパク質の発現量を示すグラフである。図２６（ａ）はＳＯＸ１タンパク質の発現量を示すグラフであり、図２６（ｂ）はＢＲＡＣＨＹＵＲＹタンパク質の発現量を示すグラフであり、図２６（ｃ）はＳＯＸ１７タンパク質の発現量を示すグラフである。図２６（ａ）〜（ｃ）中、横軸はＴｉＰＳＣの株番号を示す。また、グラフの値は、対照細胞における発現量を１とした相対値で表す。
その結果、樹立直後のＴｉＰＳＣから誘導した分化促進型多能性幹細胞では、対照と比較して、外胚葉マーカー、中胚葉マーカー及び内胚葉マーカーの発現レベルが有意に上昇していることが確認された。
本発明により、分化抵抗性を示すＥＳ細胞株や、株選別を実施していない樹立直後のｉＰＳ細胞株であっても、目的とする細胞に高効率に分化させることができる技術を提供することができる。

Claims (13)

  1. Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３β（ＧＳＫ３β）阻害剤、Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＢＭＰ）シグナル阻害剤及びＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）−β阻害剤を有効成分として含有する、多能性幹細胞の分化促進型多能性幹細胞への誘導用培地。
  2. 多能性幹細胞を請求項１に記載の培地中で培養する工程を備える、分化促進型多能性幹細胞の製造方法。
  3. 前記多能性幹細胞は、由来又は内胚葉、中胚葉若しくは外胚葉への分化能の高さにより予め選択されたものでない、請求項２に記載の分化促進型多能性幹細胞の製造方法。
  4. 対照細胞と比較して内胚葉、中胚葉及び外胚葉マーカーの発現が上昇している、分化促進型多能性幹細胞。
  5. 請求項２又は３に記載の製造方法により製造された、請求項４に記載の分化促進型多能性幹細胞。
  6. 対照細胞と比較して内胚葉、中胚葉及び外胚葉への分化能が向上している、分化促進型多能性幹細胞。
  7. 請求項２又は３に記載の製造方法により製造された、請求項６に記載の分化促進型多能性幹細胞。
  8. 請求項４〜７のいずれか一項に記載の分化促進型多能性幹細胞を、ＧＳＫ３β阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ（ＲＯＣＫ）阻害剤、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ２（ＦＧＦ２）及びＬｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）を有効成分として含有する培地中で培養する工程を備える、神経幹細胞塊の製造方法。
  9. 神経幹細胞塊を構成する神経幹細胞のほぼすべてが内胚葉マーカー及び中胚葉マーカーを実質的に発現していない神経幹細胞塊。
  10. 請求項８に記載の製造方法により製造された、請求項９に記載の神経幹細胞塊。
  11. 請求項４〜７のいずれか一項に記載の分化促進型多能性幹細胞を分化させる工程を備える、内胚葉又は内胚葉由来組織の製造方法。
  12. 請求項４〜７のいずれか一項に記載の分化促進型多能性幹細胞を分化させる工程を備える、中胚葉又は中胚葉由来組織の製造方法。
  13. 請求項４〜７のいずれか一項に記載の分化促進型多能性幹細胞を分化させる工程を備える、外胚葉又は外胚葉由来組織の製造方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN113416709A (zh) * 2021-06-21 2021-09-21 香港再生医学有限公司 促使iPSC分化为外周神经元细胞的方法及培养基和系统
CN114441413B (zh) * 2022-01-24 2024-05-14 南京医科大学 一种iPSC技术诱导分化的多巴胺能神经元中单囊泡储存的分析方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013187416A1 (ja) * 2012-06-12 2013-12-19 学校法人 慶應義塾 神経系分化に適したiPS細胞の増幅方法、及び神経幹細胞の誘導方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102604894B (zh) * 2012-02-29 2014-07-30 中国科学院广州生物医药与健康研究院 用于制备神经干细胞的培养基及其用途
US20150329821A1 (en) * 2012-10-19 2015-11-19 Agency For Science, Technology And Research Methods of differentiating stem cells into one or more cell lineages
WO2014069479A1 (ja) * 2012-10-29 2014-05-08 学校法人埼玉医科大学 分化多能性幹細胞の製造方法
WO2014161075A1 (en) * 2013-04-05 2014-10-09 University Health Network Methods and compositions for generating chondrocyte lineage cells and/or cartilage like tissue
CA2923592A1 (en) * 2013-09-05 2015-03-12 Kyoto University Method for inducing dopamine-producing neural precursor cells from pluripotent stem cells

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013187416A1 (ja) * 2012-06-12 2013-12-19 学校法人 慶應義塾 神経系分化に適したiPS細胞の増幅方法、及び神経幹細胞の誘導方法

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