JPWO2016110980A1

JPWO2016110980A1 - 画像取得装置および画像取得方法

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Publication number: JPWO2016110980A1
Application number: JP2016568226A
Authority: JP
Inventors: 克典小江; 浩文鈴木
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2015-01-08
Filing date: 2015-01-08
Publication date: 2017-10-12
Also published as: WO2016110980A1

Abstract

画像取得装置は、培養液３４に浸かった生体試料１７の発光画像を暗視野で取得する画像取得部と、前記画像取得部が前記発光画像を取得する時間帯から外れた時間帯で培養液３４中の酸素量を調整する酸素量調整部と、を備える。

Description

本発明は、生体試料の発光画像を取得するための画像取得装置および画像取得方法に関する。

生物発光、特に甲虫ルシフェラーゼ活性由来の光生成方法が開示される。例えば、特許文献１では、ルシフェラーゼの発光活性を検出する際にCoA などのチオール類を用いることで、発光の半減期を５分間に延長し、かつ発光量を増大させ得る。

一方、非特許文献１では、セレンテラジンを発光基質とする生物発光が酸欠状態になると発光しなくなるという特徴を利用して酸素の周期的変動（Oscillation）をイメージングしている。

特許第３１７１５９５号公報 Kwon H.J., Ohmiya Y., Yasuda K. (2013) Simultaneous monitoring of intracellular ATP and oxygen levels in chondrogenic differentiation using a dual-color bioluminescence reporter. Luminescence. doi: 10.1002/bio.2598.

特許文献１では、細胞等を溶かす処理を行う。このため、細胞を生きたまま観察できない問題がある。一方、生体試料を生かした状態で、生体試料の発光画像を安定的に取得したいという要望がある。

本発明の目的は、安定的に画像を取得できる画像取得装置および画像取得方法を提供することにある。

前記目的を達成するため、本発明の一つの形態に係る画像取得装置は、培養液に浸かった生体試料の発光画像を暗視野で取得する画像取得部と、前記画像取得部が前記発光画像を取得する時間帯から外れた時間帯で前記培養液中の酸素量を調整する酸素量調整部と、を備える。

前記目的を達成するため、本発明の一つの形態に係る画像取得方法は、培養液に浸かった生体試料の発光画像を暗視野で取得する画像取得工程と、前記画像取得工程以外の時間帯で、前記培養液の液面に気体を送って前記培養液中の酸素量を調整する酸素量調整工程と、を備える。

上記の構成によれば、安定的に画像を取得できる画像取得装置および画像取得方法を提供できる。

図１は、第１実施形態にかかる顕微鏡システムの全体構成を示したブロック図である。図２は、図１に示す顕微鏡システムの周辺機器の空気供給部および顕微鏡装置の生体試料を概略的に示す模式図である。図３は、第１実施形態のフリマジンを発光基質とする生物発光（ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応）を示す模式図である。図４は、第１実施形態の顕微鏡システムを用いて生物発光を観察した際に、培養液量を変化させた各条件において、発光強度と時間経過の関係を示すグラフである。図５は、第２実施形態にかかる顕微鏡システムの周辺機器の調整空気供給部、顕微鏡装置のインキュベータ（チャンバー）および生体試料を概略的に示す模式図である。図６は、第３実施形態にかかる顕微鏡システムの生体試料を保持する容器の第１の形状を示す断面図である。図７は、第３実施形態にかかる顕微鏡システムの生体試料を保持する容器の第２の形状を示す断面図である。図８は、図７に示す容器のＡの領域を拡大して示した断面図である。図９は、図６に示す容器に対して注ぐ培養液の量を変化させた各条件において、培養液の深さ（水深）を測定した結果と発光安定性を評価した結果を示す表である。図１０は、図７に示す容器に対して注ぐ培養液の量を変化させた各条件において、培養液の深さ（水深）を測定した結果と発光安定性を評価した結果を示す表である。

［第１実施形態］
以下、図１から図４を参照して、第１実施形態の顕微鏡システム１１について説明する。この顕微鏡システム１１は、例えば、生体試料（培養細胞、細胞）をシャーレ状の容器１６を用いて培養したり、経時的に該生体試料の暗視野における発光画像および明視野画像（位相差画像を含む）等を取得したり、該生体試料の現在の状態を示す画像（ライブ画像）を取得したり、この発光画像、明視野画像およびライブ画像等に基づいて１つの細胞、細胞のコロニー、或いは細胞の凝集塊である胚様体をピックアップしたり、多目的に使用される。この顕微鏡システム１１では、制御装置１２の表示部１３（表示画面）上において、明視野画像と発光画像とを重ね合わせて表示することができる。顕微鏡システム１１は、画像取得装置の一例である。

以下の実施形態でいう生体試料１７には、ルシフェラーゼやその他の発光性または蛍光性のあるタンパク質等を発現させた各種の細胞（胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、組織性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの培養細胞）、およびルシフェラーゼやその他の発光性または蛍光性のあるタンパク質等を発現させた各種の生物が含まれる。生体試料１７は、１つの細胞であってもよいし、細胞のコロニーであってもよいし、或いは細胞の凝集塊である胚様体であってもよい。

顕微鏡システム１１は、顕微鏡装置１４と、顕微鏡装置１４に付属する周辺機器１５と、を有している。顕微鏡装置１４は、例えば発光を十分な時間（１分以上）露光した像を取得できる撮像素子（ＣＣＤ、ＣＭＯＳ等）と、高ＮＡの結像光学系（対物レンズ、結像レンズ等）と、を備え、これらによって細胞等から発せられる微弱光に基づいて発光画像を取得する。

図１に示すように、顕微鏡装置１４は、容器１６内に保持された生体試料１７を保持可能な本体１８と、本体１８の頂部に設けられ暗箱（暗室）を兼ねたインキュベータ２１と、インキュベータ２１の上部を覆う蓋体２２と、インキュベータ２１内に設けられ皿状をなしたステージ２３と、ステージ２３上に置かれるシャーレ状の容器１６（ディッシュ）と、容器１６内で培養液に浸かった状態で保持された生体試料１７（細胞、培養細胞）と、を有している。蓋体２２には、後述する空気供給用のチューブ２４を通すための第１孔部と、インキュベータ２１内から空気を排出する排気用の第２孔部と、が設けられている。

インキュベータ２１およびステージ２３には、観察用の孔が設けられている。顕微鏡装置１４は、暗箱の下側に、例えば、ステージ２３をＸ軸方向（ユーザから見て前後方向）およびＹ軸方向（ユーザから見て左右方向）に手動で移動させるためのハンドルを有している。

顕微鏡装置１４は、本体１８の暗箱の下部に、ステージ２３の下方に設けられた対物光学系２５と、対物光学系２５を通る不要な光を遮断する第１のフィルタ２６と、対物光学系２５および第１のフィルタ２６の下方に設けられて対物光学系を通った光を検出できるＣＣＤカメラ２７（カラーＣＣＤカメラ）と、を有している。また、対物光学系には図示しないズーム機構を備えていてもよい。ＣＣＤカメラ２７は、明視野のみならず暗視野で画像（発光画像）を取得することができる画像取得部の一例である。

顕微鏡装置１４は、後述する光源２８からの光を調整するための第２のフィルタ３１を有している。本実施形態で用いることができる顕微鏡装置１４には、例えばオリンパス株式会社製の発光イメージングシステムＬＵＭＩＮＯＶＩＥＷＬＶ２００（ＬＵＭＩＮＯＶＩＥＷ（登録商標）があるが、これに限定されるものではなく、他の顕微鏡装置を用いてもよい。

容器１６（ディッシュ）は、透光性のある材質で形成されている。容器１６は、例えば樹脂材料で形成されているが、ガラス製であってもよい。容器１６には、第３実施形態で説明する容器１６を使用することもできる。

周辺機器１５は、明視野画像や蛍光画像を取得する際に利用される光源２８と、光源２８およびＣＣＤカメラ２７と接続された制御装置１２（コンピュータ）と、生体試料１７に対して空気を送ることができる空気供給部３３と、を有している。光源２８は、明視野画像を取得する際に利用される白色光を照射可能なランプやＬＥＤ等で構成されている。周辺機器１５は、第２の光源として、蛍光観察時に利用する励起光を照射可能な蛍光ユニットをさらに有していても良い。

図１に示される制御装置１２（制御部）は、一般的なパーソナルコンピュータ等のコンピュータであり、液晶ディスプレイ等で構成される表示部１３と、キーボードおよびマウスを含む入力部３２と、を含んでいる。制御装置１２は、ＣＣＤカメラ２７の撮影条件の制御、および取得像の画像化と表示部１３への表示等をすることができる。制御装置１２は、取得した発光画像および明視野画像の記憶のほか、これら発光画像および明視野画像の画像処理や画像解析をすることができる。制御装置１２は、これら画像解析の結果のデータを観察条件とともに記憶することができる。制御装置１２は、第１のフィルタ２６および第２のフィルタ３１を種類の異なる適切なフィルタに切り替える制御を行うことができる。制御装置１２は、光源２８の光量の制御を行うことができる。さらに制御装置１２は、対物光学系のズーム制御を行うことができる。

顕微鏡装置１４で明視野画像を取得する場合には、光源２８から可視光が照射されるようにして生体試料１７を照明し、透過した光が、対物光学系２５を進み、第１のフィルタ２６を透過した光がＣＣＤカメラ２７で検出される。ＣＣＤカメラ２７で検出された光は、制御装置１２に送られて画像化される。顕微鏡装置１４で暗視野の発光画像を取得する場合には、生体試料１７から発せられた光は、対物光学系２５に進み、第１のフィルタ２６で不要な光が遮断されてＣＣＤカメラ２７で検出される。ＣＣＤカメラ２７で検出された光は、制御装置１２に送られて画像化される。

空気供給部３３は、培養液３４中の酸素量を調整できる酸素量調整部の一例である。図２に示すように、空気供給部３３は、送気用のチューブ２４を介して生体試料１７に向けて空気を送ることができるエアーポンプ３５と、チューブ２４の途中に設けられてエアーポンプ３５から送られた空気を加湿する加湿装置３６（加湿部）と、チューブ２４の途中で上記エアーポンプ３５よりも下流側に設けられるメンブレンフィルター３７と、を有している。エアーポンプ３５は、商業的に入手可能な空気ポンプで構成される。チューブ２４の生体試料１７側の端部は、インキュベータ２１内で生体試料１７の上側に配置されている。メンブレンフィルター３７は、例えば、孔径０．２２μｍのメンブレンフィルター３７で、商業的に入手可能なものを使用することができる。メンブレンフィルター３７は、培養液３４に送られる空気から、細菌やカビの胞子等を除去することができる。

ここで、図３を参照して、生体試料１７の発光メカニズムについて簡単に説明する。一例として、フリマジンを発光基質とする生物発光について説明する。イミダゾピラジン骨格を有するフリマジン等の化合物、いわゆるセレンテラジン系の発光物質を基質とするルシフェラーゼ−ルシフェリン反応（一例として、プロメガ社製発光試薬：nanoluc（登録商標））では、発光が起こる際にＯ_２が消費されてＣＯ_２が発生する。このため、イミダゾピラジン骨格を有するセレンテラジン系の発光物質を用いる発光反応では、Ｏ_２が必要となり、Ｏ_２が不足して生体試料１７が酸欠状態にある場合には、発光反応が起こりにくくなるか或いは阻害される。

続いて、本実施形態の顕微鏡システム１１を用いた発光画像の画像取得方法について説明する。

本実施形態の画像取得方法では、暗視野での発光画像を取得する前に、必要に応じて明視野において生体試料の明視野画像を取得する。この画像取得方法は、暗視野において画像を取得する画像取得工程と、画像取得工程とは異なる時間帯で実行される酸素量調整工程と、を備えている。

画像取得工程では、暗箱内で静置された生体試料１７に対して、例えば１分から６０分の露光を行って生体試料１７の発光画像を暗視野で取得する。この間、生体試料１７があるインキュベータ２１に対しては、空気の供給を行っていないので、培養液３４中のＯ_２濃度が低下し、ＣＯ_２濃度が増加する。

続いて、酸素量調整工程を行う。酸素量調整工程は、ＣＣＤカメラ２７（画像取得部）が発光画像を取得する時間帯から外れた時間帯で行われる。酸素量調整工程では、生体試料１７を培養液３４とともに保持した容器１６の上方（好ましくは、斜め上方）にあるチューブ２４の端部から、培養液３４の液面３４Ａに対して空気を連続的に吹き付ける。培養液３４の液面３４Ａに吹き付ける空気の流速は、培養液３４内に乱流を生じない範囲で適宜に設定することができる。この空気の吹き付けによって、表層付近にある培養液３４に酸素を供給する。これと同時に、チューブ２４から出た空気の風圧によって培養液３４の液面３４Ａを揺らす（波立たせる）ことで、培養液３４全体を混和して、空気（酸素）を供給した表層付近の培養液と、生体試料１７（細胞）が存在する容器の底面付近の培養液と、を徐々に入れ替えることができる。この培養液３４の混和によって容器１６の底面付近で培養液中のＯ_２濃度が低下し、ＣＯ_２濃度が増加してしまうことを防止する。

この酸素量調整工程では、培養液３４を棒等によって直接攪拌する場合に比して、培養液３４内に早い液流や乱流を生じないので、容器１６内の細胞（生体試料）の向きが変わったり、生体試料１７同士の位置が変わったりする不具合を生じない。また、生体試料１７に送る空気に対して予め加湿装置３６によって加湿を行っているため、培養液３４の蒸発を防止して培養液が濃縮することも防止される。なお、酸素量調整工程での空気の吹き付けは、一定時間継続して行う連続的なものに限られず、吹き付けを一定時間継続した後に所定時間停止する間欠的なものでもよい。また、容器１６に対して吹き付ける空気の流速を変化させてもよい。酸素量調整工程は、画像取得工程同士の間の時間帯で、画像取得を行っていない時間帯に行われる。

図４に本実施形態の画像取得工程と酸素量調整工程を行った場合の実験結果を示す。シャーレ状の容器に対して培地ＤＭＥＭ（培養液３４）を０．５ｍＬ（破線）、１．０ｍＬ（２点鎖線）入れて生体試料１７を培養した状態では、時間経過とともに生物発光の発光強度が低下していくことが観察された。このように上記した生物発光では、ルシフェラーゼが徐々に失活することに伴い、時間経過とともに徐々に発光強度が低下する挙動（単調減少）を示すことが通常である。

一方、シャーレ状の容器１６に対して培地ＤＭＥＭ（培養液３４）を２．０ｍＬ入れて生体試料１７を培養した状態では、図４に１点鎖線で示すように、時間経過に対して上記生物発光の強度が不安定に変化する結果となった。

これに対して、図４に実線で示すように、本実施形態の酸素量調整工程を含む画像取得方法を用いて、培地ＤＭＥＭ（培養液３４）を２．０ｍＬ入れて培養した生体試料１７を観察した場合には、０．５ｍＬまたは１．０ｍＬの培地を入れた場合と同様に、生物発光が時間経過とともに徐々に低下する挙動（単調減少）を示すことが確認された。

第１実施形態によれば、画像取得装置は、培養液３４に浸かった生体試料１７の発光画像を暗視野で取得する画像取得部と、前記画像取得部が前記発光画像を取得する時間帯から外れた時間帯で前記培養液中の酸素量を調整する酸素量調整部と、を備える。

画像取得方法は、培養液３４中に浸かった生体試料１７の発光画像を暗視野で取得する画像取得工程と、前記画像取得工程以外の時間帯で、培養液３４の液面３４Ａに気体を送って培養液３４中の酸素量を調整する酸素量調整工程と、を備える。

これらの構成によれば、酸素量調整部（酸素量調整工程）によって培養液３４中の酸素濃度を調整することができるため、培養液３４中の酸素濃度が低下することがなく、生物発光が不安定化することを防止できる。また、画像取得部が発光画像を取得する時間帯（画像取得工程）から外れた時間帯で酸素量調整部が培養液３４中の酸素量を調整できるため、画像取得時に培養液が攪拌されて発光画像が乱れてしまう不具合を防止できる。これらによって、生物発光を利用して遺伝子発現の変動を細胞ごとに正確に観察することができる。

この場合、前記酸素量調整部は、培養液３４の液面３４Ａに空気を送る空気供給部３３である。一般的には、生体試料（細胞）の生物発光（例えば、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応）をレポーターとして利用して、細胞内の各種の遺伝子の発現等を経時的に観察ないしイメージングすることは、各種の生命現象を明らかにするうえで極めて重要である。上記の構成によれば、培養液３４を直接攪拌する場合に比して生体試料１７（細胞）の向きや位置が変わってしまうことを防止できる。このため、細胞内の各種の遺伝子の発現等を経時的に観察する場合でも、細胞に与える影響を極めて軽微にすることができる。

この場合、空気供給部３３は、前記空気を加湿する加湿部を含んでいる。また、前記気体は、培養液３４の表面に送られる前に加湿部で加湿される。これらの構成によれば、培養液３４に送られる空気によって培養液３４の蒸発が促進されて、培養液３４に濃縮を生じてしまうことを防止できる。

［第２実施形態］
続いて、図５を参照して、顕微鏡システム１１の第２実施形態について説明する。第２実施形態の顕微鏡システム１１は、顕微鏡装置１４にチャンバーが設けられる点、および周辺機器１５として酸素分圧を調整した空気を供給できる調整空気供給部４０が設けられる点で、第１実施形態と異なっているが、他の部分は第１実施形態と共通している。このため、主として第１実施形態と異なる部分について説明し、第１実施形態と共通する部分については図示或いは説明を省略する。第２実施形態の顕微鏡システム１１の全体の構成は、図１に示すものと同様である。顕微鏡システム１１は、画像取得装置の一例である。
図１に示すものと同様に、顕微鏡システム１１は、顕微鏡装置１４と、顕微鏡装置１４に付属する周辺機器１５と、を有している。

顕微鏡装置１４は、容器１６内に保持された生体試料１７を保持可能な本体１８と、本体１８の頂部に設けられ暗箱（暗室）を兼ねたインキュベータ２１と、インキュベータ２１の上部を覆う蓋体２２と、インキュベータ２１内に設けられ皿状をなしたステージ２３と、ステージ２３上に置かれるシャーレ状の容器１６（ディッシュ）と、容器１６内に保持された生体試料１７（細胞、培養細胞）と、を有している。本実施形態では、蓋体２２のうち、本体１８と当接する縁部には、気密性を確保するためのパッキンが設けられている。このため、本実施形態では、インキュベータ２１は、気密性がある程度確保されたチャンバーを兼ねている。蓋体２２には、空気供給用のチューブ２４を通すための第１孔部と、インキュベータ２１内から空気を排出する排気用の第２孔部と、が設けられている。

周辺機器１５は、明視野画像や蛍光画像を取得する際に利用される光源２８と、光源２８およびＣＣＤカメラ２７と接続された制御装置１２（コンピュータ）と、生体試料１７に対して酸素分圧を調整した調整空気を送ることができる調整空気供給部４０と、を有している。

調整空気供給部４０およびチャンバーを兼ねるインキュベータ２１は、培養液３４中の酸素量を調整できる酸素量調整部の一例である。調整空気供給部４０は、空気よりも酸素分圧を高く調整した調整空気を培養液３４の液面に送ることができる。

図５に示すように、調整空気供給部４０は、送気用のチューブ２４を介して生体試料１７に向けて調整空気を送ることができるエアーボンベ３８と、チューブ２４の途中に設けられてエアーボンベ３８から送られた空気を加湿する加湿装置３６（加湿部）と、チューブ２４の途中で上記エアーボンベ３８よりも下流側に設けられるメンブレンフィルター３７と、を有している。エアーボンベ３８は、商業的に入手可能なエアーボンベで構成される。エアーボンベ３８は、酸素分圧が通常の空気（大気）よりも高く調整された調整空気を生成できるとともに、酸素分圧が高く調整された調整空気を内部に貯留することができる。この調整空気には、例えば３０％から４０％の割合で酸素が含まれている。

本実施形態の画像取得方法は、暗視野において画像を取得する画像取得工程と、画像取得工程とは異なる時間帯で実行される酸素量調整工程と、を備えている。

画像取得工程は、第１実施形態と同様である。続く酸素量調整工程では、生体試料１７を培養液３４とともに保持した容器１６の上方（好ましくは、斜め上方）から、培養液３４の液面３４Ａに対して調整空気を連続的に吹き付ける。培養液３４の液面３４Ａに吹き付ける調整空気の流速は、培養液３４内に乱流を生じない範囲で適宜に設定することができる。これによって、表層付近にある培養液３４に酸素を供給する。本実施形態では、調整空気中の酸素分圧が高く設定されているため、表層付近にある培養液３４への酸素の供給が効率的になされる。

この酸素供給と同時に、チューブ２４から出た調整空気の風圧によって培養液３４の液面３４Ａを揺らす（波立たせる）ことで、培養液３４全体を混和して、酸素を供給した表層付近の培養液３４と、生体試料１７（細胞）が存在する容器１６の底面付近の培養液３４と、を徐々に入れ替えることができる。この混和によって容器１６の底面付近で培養液３４中のＯ_２濃度が低下し、ＣＯ_２濃度が増加することを防止する。

第２実施形態によれば、前記酸素量調整部は、生体試料１７を取り囲むチャンバーと、空気よりも酸素分圧を高く調整した調整空気を培養液３４の液面３４Ａに送る調整空気供給部４０と、を備える。本実施形態の画像取得方法によれば、前記気体は、空気よりも酸素分圧を高く調整した調整空気である。これらの構成によれば、調整空気によって培養液３４中の酸素濃度を効率よく高くできるため、生物発光が不安定化することを防止できる。

［第３実施形態］
続いて、図６から図１０を参照して、顕微鏡システム１１の第３実施形態について説明する。第３実施形態の顕微鏡システム１１は、生体試料１７を保持する容器１６の形状が異なる点で第１実施形態と異なっているが、他の部分は第１の実施形態と共通している。このため、主として第１実施形態と異なる部分について説明し、第１実施形態と共通する部分については図示或いは説明を省略する。第３実施形態の顕微鏡システム１１の全体の構成は、図１に示すものと同様である。顕微鏡システム１１は、画像取得装置の一例である。

図１に示すものと同様に、顕微鏡システム１１は、顕微鏡装置１４と、顕微鏡装置１４に付属する周辺機器１５と、を有している。

顕微鏡装置１４は、容器１６内に保持された生体試料１７を保持可能な本体１８と、本体１８の頂部に設けられた暗箱（暗室）を兼ねたインキュベータ２１と、インキュベータ２１の上部を覆う蓋体２２と、インキュベータ２１内に設けられ皿状をなしたステージ２３と、ステージ２３上に置かれるシャーレ状の容器１６（ディッシュ）と、容器１６内に保持された生体試料１７（細胞、培養細胞）と、を有している。蓋体２２には、空気供給用のチューブ２４を通すための第１孔部と、インキュベータ２１内から空気を排出する排気用の第２孔部と、が設けられている。

本実施形態において、容器１６は２つの形状を取りうる。図６に示すように、第１の形状では、容器１６は、シャーレ状（ディッシュ状）の形態、すなわち円筒形に立ち上がった円筒部４４（外縁部）を有する皿状をなしている。容器１６は、透光性のある樹脂材料あるいはガラスによって形成されている。容器１６の直径は、例えば３５ｍｍである。容器１６は、底面部４１と、底面部４１の中央に設けられた開口部４２と、開口部４２を塞ぐように底面部４１に設けられたカバーガラス部４３と、底面部４１の外縁を取り囲む円筒部４４と、を有している。カバーガラス部４３は、底面部４１よりも一段低くなっている。なお、本実施形態では、カバーガラス部４３は、底面部４１に接着されているが、底面部４１と一体的に設けられていてもよい。

容器１６は、カバーガラス部４３と底面部４１との間の位置に設けられた第１段部４５と、底面部４１と円筒部４４との間の位置に設けられた第２段部４６と、を有している。第１段部４５は、容器１６内に入れる培養液３４の下限を示す第１の指標であり、第２段部４６は、容器１６内に入れる培養液３４の上限を示す第２の指標である。第１段部４５の高さｈは、例えば、０．５ｍｍである。カバーガラス部４３からの第２段部４６の高さｈ´は、例えば、１．２ｍｍである。

図７に示すように、第２の形状では、容器１６は、円筒形に立ち上がった円筒部４４（外縁部）を２重に有する皿状（シャーレ状、ディッシュ状）をなしている。容器１６は、透光性のある樹脂材料あるいはガラスによって形成されている。容器１６のうち培養液３４を入れる部分を規定する内側の円筒部４４Ａの直径は、例えば１７．５ｍｍである。容器１６は、底面部４１と、底面部４１の中央に設けられた開口部４２と、開口部４２を塞ぐように底面部４１に接着されたカバーガラス部４３と、培養液３４を入れる部分を規定するように底面部４１から立ち上がった第１円筒部４４Ａと、底面部４１の外縁を取り囲むように立ち上がった第２円筒部４４Ｂと、を有している。カバーガラス部４３は、底面部４１よりも一段低くなっている。

図８に示すように、容器１６は、カバーガラス部４３と底面部４１との間の位置に設けられた第１段部４５と、底面部４１と第１円筒部４４Ａとの間の位置に設けられた第２段部４６と、を有している。第１段部４５は、容器１６内に入れる培養液３４の下限を示す第１の指標であり、第２段部４６は、容器１６内に入れる培養液３４の上限を示す第２の指標である。第１段部４５の高さｈは、例えば、０．５ｍｍである。カバーガラス部４３からの第２段部４６の高さｈ´は、例えば、１．２ｍｍである。

なお、本実施形態の第１段部４５および第２段部４６は、指標の一例であり、指標としては他の形態をとることもできる。容器１６内に入れる培養液３４の上限・下限を示す指標は、例えば、容器１６の円筒部４４の内周面に水平方向に形成された線状の隆起部で構成してもよいし、円筒部４４の内周面に水平方向に線を印刷したもので構成してもよい。さらに容器１６が透光性を有しているので、指標は、容器１６の円筒部４４の外周面に線状に形成されても良い。本実施形態のシャーレ状の容器１６（第１の形状、第２の形状）は、酸素量調整部の一例である。

ここで、図９を参照して、直径３５ｍｍのディッシュ（容器１６）を用いて培養液３４の液量を検討した実験結果について説明する。この実験では、ディッシュに対して入れる培養液３４の液量を変化させることで、生物発光が安定化する最も適した培養液３４の深さ（水深）を検討した。

図９に示すように、ディッシュに対して０．２５ｍＬの培養液３４を入れた場合には、培養液３４の量が少なすぎるために培養液３４の深さを測定できなかった。ディッシュに対して０．５ｍＬの培養液３４を入れると、培養液３４の深さが１．０ｍｍとなった。この条件で生体試料の生物発光（上記したルシフェラーゼ−ルシフェリン反応）を経時的に観察したところ、生物発光が安定的に減衰することが分かった。一方、ディッシュに対して１ｍＬの培養液３４を入れると、培養液３４の深さが１．５ｍｍとなり、生物発光を経時的に観察したところ、生物発光が不安定な状態で減衰した。同様に、ディッシュに対して２ｍＬの培養液３４を入れると、培養液３４の深さが２．６ｍｍとなり、生物発光を経時的に観察したところ、生物発光が不安定な状態で減衰した。

直径３５ｍｍのディッシュ（容器）において、培養液３４の深さが０．５ｍｍ以下となると、生体試料１７（細胞）の大きさによっては生体試料１７が空気中に露出する可能性があるために好ましくないことが分かっている。このため、直径３５ｍｍのディッシュで実験した結果から、培養液３４の深さは、０．５ｍｍから１．０ｍｍの範囲にあることが好ましいと考えられる。

次に、図１０を参照して、直径１７．５ｍｍのディッシュ（容器１６）を用いて培養液３４の液量を検討した実験結果について説明する。

図１０に示すように、ディッシュに対して０．２５ｍＬの培養液３４を入れると、培養液３４の深さが１．２ｍｍとなった。この条件で生体試料１７の生物発光（上記したルシフェラーゼ−ルシフェリン反応）を経時的に観察したところ、生物発光が安定的に減衰することが分かった。一方、ディッシュに対して０．５ｍＬの培養液３４を入れると、培養液３４の深さが２．３ｍｍとなった。この条件で生物発光を経時的に観察したところ、生物発光が不安定な状態で減衰した。同様に、ディッシュに対して１ｍＬの培養液３４を入れると、培養液３４の深さが４．４ｍｍとなり、生物発光を経時的に観察したところ、生物発光が不安定な状態で減衰した。また、ディッシュに対して２ｍＬの培養液３４を入れると、培養液３４が第１円筒部４４よりも外側に溢れてしまい、培養液３４の深さを測定することができなかった。

直径１７．５ｍｍのディッシュ（容器１６）において、培養液３４の深さが０．５ｍｍ以下となると、生体試料１７（細胞）の大きさによっては生体試料１７が空気中に露出する可能性があるために好ましくないことが分かっている。このため、直径１７．５ｍｍのディッシュで実験した結果から、培養液３４の深さは、０．５ｍｍから１．２ｍｍの範囲にあることが好ましいと考えられる。

続いて、本実施形態の顕微鏡システム１１の作用について説明する。本実施形態では、容器１６に予め第１段部４５（第１の指標）および第２段部４６（第２の指標）が設けられている。このため、ユーザは、第１段部４５および第２段部４６の間の位置に培養液３４の液面３４Ａがくるように培養液３４の液量を調整することで、簡単に発光画像の取得に適した条件にすることができる。そして、第１実施形態の画像取得工程と同様の工程によって画像を取得すると、最適な発光画像を得ることができる。また、本実施形態では、第１実施形態の酸素量調整工程を適宜に行ってもよい。

本実施形態によれば、前記酸素量調整部は、培養液３４中に浸かった生体試料１７を保持するシャーレ状の容器１６であって、培養液３４の水深が０．５ｍｍ以上で、１．２ｍｍ以下であることを示す指標を有する容器１６である。

この構成によれば、画像取得装置のユーザは、生物発光に適した培養液３４の液量を簡単に知ることができ、ユーザの利便性を向上できる。これによって、ユーザは、上記した生物発光（ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応）による発光画像を安定的に取得することができる。

本実施形態に記載した顕微鏡システム１１は、発明の要旨を逸脱しない範囲で種々変形して実施することができる。また、第１実施形態から第３実施形態の構成要素を組み合わせて１個の発明を構成することもできる。

１１…顕微鏡システム、１４…顕微鏡装置、１６…容器、１７…生体試料、２１…インキュベータ、３３…空気供給部、３４…培養液、３４Ａ…液面、３６…加湿装置、４０…調整空気供給部、４５…第１段部、４６…第２段部。

Claims

培養液に浸かった生体試料の発光画像を暗視野で取得する画像取得部と、
前記画像取得部が前記発光画像を取得する時間帯から外れた時間帯で前記培養液中の酸素量を調整する酸素量調整部と、
を備える画像取得装置。
前記酸素量調整部は、前記培養液の液面に空気を送る空気供給部である請求項１に記載の画像取得装置。
前記空気供給部は、前記空気を加湿する加湿部を含む請求項２に記載の画像取得装置。
前記酸素量調整部は、
前記生体試料を取り囲むチャンバーと、
空気よりも酸素分圧を高く調整した調整空気を前記培養液の液面に送る調整空気供給部と、
を備える請求項１に記載の画像取得装置。
前記酸素量調整部は、前記培養液に浸かった前記生体試料を保持するシャーレ状の容器であって、前記培養液の水深が０．５ｍｍ以上で、１．２ｍｍ以下であることを示す指標を有する容器である請求項１に記載の画像取得装置。
培養液に浸かった生体試料の発光画像を暗視野で取得する画像取得工程と、
前記画像取得工程以外の時間帯で、前記培養液の液面に気体を送って前記培養液中の酸素量を調整する酸素量調整工程と、
を備える画像取得方法。
前記気体は、空気である請求項６に記載の画像取得方法。
前記気体は、前記培養液の表面に送られる前に加湿部で加湿される請求項７に記載の画像取得方法。
前記気体は、空気よりも酸素分圧を高く調整した調整空気である請求項６に記載の画像取得方法。