JPWO2016088274A1 - 高効率エタノール発酵菌 - Google Patents

高効率エタノール発酵菌 Download PDF

Info

Publication number
JPWO2016088274A1
JPWO2016088274A1 JP2016562190A JP2016562190A JPWO2016088274A1 JP WO2016088274 A1 JPWO2016088274 A1 JP WO2016088274A1 JP 2016562190 A JP2016562190 A JP 2016562190A JP 2016562190 A JP2016562190 A JP 2016562190A JP WO2016088274 A1 JPWO2016088274 A1 JP WO2016088274A1
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
ethanol
strain
xylose
medium
concentration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2016562190A
Other languages
English (en)
Other versions
JP6145582B2 (ja
Inventor
芳樹 土田
芳樹 土田
範彦 塚越
範彦 塚越
育美 栗原
育美 栗原
幸亮 村田
幸亮 村田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Honda Motor Co Ltd
Original Assignee
Honda Motor Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Honda Motor Co Ltd filed Critical Honda Motor Co Ltd
Publication of JPWO2016088274A1 publication Critical patent/JPWO2016088274A1/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6145582B2 publication Critical patent/JP6145582B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/165—Yeast isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/065—Ethanol, i.e. non-beverage with microorganisms other than yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/84—Pichia
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

外来遺伝子を導入することなく、エタノール産生効率の高い高効率エタノール発酵菌を提供する。高効率エタノール発酵菌は、五炭糖及び六炭糖から効率的にエタノールを産生する発酵菌であって、特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９６２として寄託されている。

Description

リグノセルロース系バイオマスを用いたバイオエタノール生産において、糖化溶液を発酵するための微生物に関する。
特に、リグノセルロース系バイオマスを用いたバイオエタノール生産において、五炭糖（以下、Ｃ５糖ということがある。）、及び六炭糖（以下、Ｃ６糖ということがある。）から効率的にエタノール生産することができる微生物に関する。
バイオエタノールは、バイオマスから産生される枯渇することのない再生可能資源として期待されている。また、バイオエタノールを燃焼させて発生する二酸化炭素はカーボンニュートラルであることから、バイオエタノールの利用が進むことによって、地球温暖化の主な原因である二酸化炭素の上昇を抑制すると考えられている。
バイオエタノールは、バイオマスを発酵させ、蒸留してエタノールを精製する。バイオエタノールの収率を高めるために糖化溶液から多くのアルコールを生成する必要がある。バイオエタノール生産の過程で一般的に用いられている酵母は、キシロース、アラビノースなどの五炭糖をアルコールに変換できないため、発酵原料としては六炭糖のみが用いられてきた。
原料によって異なるものの典型的なバイオマスには、３５〜４５％のセルロース、２５〜４０％のヘミセルロース、１５〜３０％のリグニンが含まれていると言われている。したがって、六炭糖が重合しているセルロースだけではなく、五炭糖であるキシロース等を主として含有するヘミセルロースを基質として利用することは効率的なエタノール産生につながることになる。
キシロースはグルコースの次にバイオマス中に多く含まれている糖であると言われており、五炭糖を効率的に利用することはバイオエタノール生産において大きな課題となっている。
これまでに、遺伝子組換えによるキシロース利用能の付与や、キシロースを利用してエタノールを産生する微生物の利用等により、キシロースを少しでも利用する技術が開示されている。
特許文献１には、キシローストランスポーター活性を有する遺伝子を宿主細胞に導入することによって、キシロース（Ｃ５糖）をキシルロースに変換し、解糖系のペントースリン酸経路に組み入れ、発酵に利用する発明が開示されている。
特許文献２には、アラビノーストランスポーターを付与した酵母によって、アルコールを生成する技術が開示されている。特許文献１と同様にアラビノース（Ｃ５糖）をアラビトール、キシルロースを経て解糖系のペントースリン酸経路に組み入れ、発酵に利用するものである。
非特許文献１には、大腸菌由来のキシロース資化遺伝子をザイモモナスに組み込むことにより、キシロース資化能を付与することが開示されている。
非特許文献２には、ピキア属酵母が、キシロースを利用してエタノールを生産することが記載されている。
特開2012-170422号公報 米国特許出願公開第2013/189788号明細書
Zhang, M., et al., Science, 1995. Vol. 267, pp. 240-243. Bicho, P.A., et al., Appl. Environ. Microbiol., 1988, Vol. 54, pp. 50-54.
しかしながら、特許文献１の発明は、Candida guilliermondii由来のキシローストランスポーター活性のあるタンパク質を宿主としてSaccharomyces cerevisiaeに導入している。すなわち外来遺伝子を導入することになる。また、特許文献２の発明もトランスポーター遺伝子は異なるものの、宿主に対して異なる種の遺伝子を導入する発明である。
また、非特許文献１に記載の技術は、キシロース資化遺伝子を導入するものであり、上記特許文献１及び２とは技術思想は異なるが、外来遺伝子を導入することに変わりない。
そのため、上記特許文献１及び２、非特許文献１に記載の発明は、いずれも国連で採択された「生物の多様性に関する条約のバイオセーフティに関するカルタヘナ議定書」を実施するために我が国において施行されているいわゆるカルタヘナ法に則した封じ込め策を講じる必要がある。従って、バイオセーフティを保証するための施設を必要とすることから、当該菌体を利用してエタノールを生産することはコストの面で不利である。
また、非特許文献２に記載の技術によって、ピキア属酵母を利用することは、野生型のピキア属酵母はキシロース利用性が低く、エタノール産生効率はさほど高くならない。
本発明は、外来遺伝子を導入することなく、エタノール産生効率の高い高効率エタノール発酵菌を得ることを課題とする。
前記課題を解決するために、本発明の高効率エタノール発酵菌は、五炭糖及び六炭糖から効率的にエタノールを産生する発酵菌であって、特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９６２として寄託されていることを特徴とする。
野生型Meyerozyma guilliermondiは、グルコース資化能に加えてキシロース資化能を備えているとはいうものの、バイオエタノール生産に十分なキシロース利用能を備えているわけではない。これに対して、本発明の高効率エタノール発酵菌（以下、ＢＰ−０１９６２株ということがある。）は、Meyerozyma guilliermondi Ｎ株を親株として菌株育種することによりキシロースの利用効率の高い菌を選抜して得たものである。
この結果、本発明の高効率エタノール発酵菌は、外来遺伝子を導入することなく、親株より高いエタノール産生効率を得ることができる。
本発明の高効率エタノール発酵菌は、Meyerozyma guilliermondii Ｎ株をアンモニア処理稲わら由来酵素糖化液に変異剤を加えた培地で馴化培養して、該培地で生育する菌を選抜することによりエタノール発酵性能が向上している。
キシロース資化性とエタノール収率とを示すグラフであり、ＡはＮ株、ＢはＢＰ−０１９６２株を示す。 アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液におけるＢＰ−０１９６２株によるグルコース及びキシロースの消化量と、エタノールの生成量との経時変化を示すグラフである。 ＢＰ−０１９６２株とＮ株との希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液における糖濃度と発酵収率との関係を示すグラフである。 ＢＰ−０１９６２株とＮ株との希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液におけるエタノール生成量の経時変化を示すグラフである。
次に、添付の図面を参照しながら本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。
子嚢菌系酵母であるMeyerozyma guilliermondiの野生株は、グルコース資化能に加えてキシロース利用能を備えているが、そのキシロース利用能はバイオエタノール生産に十分とは言えない。そこで、本実施形態の高効率エタノール発酵菌は、子嚢菌系酵母であるMeyerozyma guilliermondi Ｎ株を親株として、アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液に変異剤を加えた培地で馴化培養して、該培地で生育する菌を選抜することにより得られた変異株である。
本実施形態の高効率エタノール発酵菌は、本出願人により独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（日本国 〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室）に寄託されている。受託日は２０１４年１１月１９日、受託番号は、ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９６２である。以下、本実施形態の高効率エタノール発酵菌を、ＢＰ−０１９６２株ということがある。
前記アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液は、例えば、次のようにして得たものを用いることができる。まず、埼玉県熊谷市産の稲わらを等量の２５質量％アンモニア水に３０℃の温度で３時間浸漬した後、アンモニアを放散させることにより前処理する。次に、前記前処理が施された稲わらに、ｐＨ調整後、糖化酵素（MeijiSeikaファルマ株式会社製、商品名：アクレモニウムセルラーゼ）を添加し５０℃の温度に７２時間保持して酵素糖化を行い、酵素糖化液を含むスラリーを得る。次に、前記スラリーをフィルタープレスにより固液分離し、回収された液体分を前記アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液とする。前記アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液は、例えば、３〜１５質量％のグルコースと、１〜１０質量％のキシロースとを含んでいる。
前記変異剤としては、例えば、N−エチル−N−ニトロソウレア（ＥＮＵ）、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）等のエチル化剤、５−ブロモ−２´−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）等の塩基類似化合物、ニトロアミン、ニトロソグアニジン等のニトロソ化合物等を用いることができる。
本実施形態の高効率エタノール発酵菌であるＢＰ−０１９６２株は、前記親株を前記アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液に変異剤を加えた培地で馴化培養して、該培地で生育する菌の選抜を繰り返すことにより得られた変異株である。従って、ＢＰ−０１９６２株は、Meyerozyma guilliermondiの野生株又はＮ株に比較して、外来遺伝子を導入することなく、キシロース資化性及びエタノール発酵性能が向上している。
次に、Meyerozyma guilliermondi Ｎ株とＢＰ−０１９６２株とのキシロース資化性とエタノール収率を比較した。
まず、グルコース９７．６ｇ／Ｌ、キシロース４１．５ｇ／Ｌ、酵母エキス１０．０ｇ／Ｌ、ペプトン２０．０ｇ／Ｌを含みｐＨ４．７の合成培地に、Meyerozyma guilliermondiＮ株の培養液を培地のＯＤ６００が２．０となるように添加し、３０℃の温度で１６８時間培養を行った。そして、所定時間毎に前記培地を採取し、グルコースとキシロースとの濃度をＨＰＬＣ（東ソー株式会社製、商品名：ＬＣ−８０２０）により、エタノールの濃度をＧＣ−ＦＩＤ（ジーエルサイエンス株式会社製、商品名：ＧＣ３９０Ｂ）により、それぞれ測定した。キシロース濃度とエタノール濃度との測定結果を図１Ａに示す。
次に、２６質量％のアンモニア処理稲わら由来酵素糖化液を培地とし、該培地にＢＰ−０１９６２株のの培養液を培地のＯＤ６００が２．０となるように添加し、３０℃の温度で１６８時間培養を行った。前記アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液は、グルコース１１２ｇ／Ｌ、キシロース４０．６ｇ／Ｌを含みｐＨ４．５であった。そして、所定時間毎に前記培地を採取し、グルコースとキシロースとの濃度をＨＰＬＣ（東ソー株式会社製、商品名：ＬＣ−８０２０）により、エタノールの濃度をＧＣ−ＦＩＤ（ジーエルサイエンス株式会社製、商品名：ＧＣ３９０Ｂ）により、それぞれ測定した。キシロース濃度とエタノール濃度との測定結果を図１Ｂに示す。
図１Ａ，１Ｂから、Meyerozyma guilliermondi Ｎ株ではキシロース濃度が殆ど変化せず、エタノール濃度も４０ｇ／Ｌを超えないのに対し、ＢＰ−０１９６２株では培養時間が長くなるほどキシロース濃度が低下し、エタノール濃度が４０ｇ／Ｌを超えることがわかる。
従って、ＢＰ−０１９６２株によれば、Ｎ株よりも優れたキシロース資化性及びエタノール発酵性能を備えていることが明らかである。
次に、２６質量％のアンモニア処理稲わら由来酵素糖化液を培地とし、該培地にＢＰ−０１９６２株の培養液を培地のＯＤ６００が２．０となるように添加し、３０℃の温度で１２０時間培養を行った。前記アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液は、グルコース７３．８ｇ／Ｌ、キシロース２８．３ｇ／Ｌを含みｐＨ５．８であった。そして、所定時間毎に前記培地を採取し、グルコースとキシロースとの濃度をＨＰＬＣ（東ソー株式会社製、商品名：ＬＣ−８０２０）により、エタノールの濃度をＧＣ−ＦＩＤ（ジーエルサイエンス株式会社製、商品名：ＧＣ３９０Ｂ）により、それぞれ測定した。結果を図２に示す。
図２から、培養開始から１２０時間後にはグルコース及びキシロースの全量が消化されており、エタノール濃度は培養時間が長くなるほど高くなることがわかる。また、培養開始から４８時間後にはグルコース濃度が殆どゼロになっているが、その後もキシロース濃度は低下し、エタノール濃度は増加を続けていることから、ＢＰ−０１９６２株はグルコースの全量が消化された後は、キシロースを基質としてエタノール発酵を行っていることが明らかである。
次に、希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液を用いて、ＢＰ−０１９６２株とＮ株との発酵収率を比較した。
前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液は、次のようにして得たものを用いた。まず、米国アイオワ州産のコーンストーバを２倍量の３．７質量％硫酸に１７０℃の温度で１０分間浸漬した後、常温に戻すことにより前処理する。次に、前記前処理が施されたコーンストーバにＮａＯＨ水溶液を添加してｐＨ４に調整後、糖化酵素（MeijiSeikaファルマ株式会社製、商品名：アクレモニウムセルラーゼ）を添加し５０℃の温度に７２時間保持して酵素糖化を行い、酵素糖化液を含むスラリーを得る。次に、前記スラリーを遠心分離により固液分離し、回収された液体分をＮａＯＨ水溶液でｐＨ６に調整し、前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液とした。前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液は、例えば、３〜１５質量％のグルコースと、１〜１０質量％のキシロースとを含んでいる。
次に、１５質量％の希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液を培地とし、該培地にＢＰ−０１９６２株の培養液を培地のＯＤ６００が０．５となるように添加し、３０℃の温度で１００時間培養を行った。前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液は、グルコース４５ｇ／Ｌ、キシロース３８ｇ／Ｌを含みｐＨ６であった。そして、前記培養後に前記培地を採取してエタノールの濃度をＧＣ−ＦＩＤ（ジーエルサイエンス株式会社製、商品名：ＧＣ３９０Ｂ）により測定し、次式（１）により発酵収率を算出した。結果を図３に示す。
発酵収率＝生成エタノール濃度/（グルコース濃度＋キシロース濃度）/０．５１１４ ・・・（１）
（グルコース濃度及びキシロース濃度は培養開始前の初期濃度である）
次に、２６質量％の希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液を培地とし、該培地にMeyerozyma guilliermondi Ｎ株の培養液を培地のＯＤ６００が０．５となるように添加し、３０℃の温度で１００時間培養を行った。前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液は、グルコース６４ｇ／Ｌ、キシロース４８ｇ／Ｌを含みｐＨ６であった。そして、前記培養後に前記培地を採取してエタノールの濃度をＧＣ−ＦＩＤ（ジーエルサイエンス株式会社製、商品名：ＧＣ３９０Ｂ）により測定し、式（１）により発酵収率を算出した。結果を図３に示す。
図３から、ＢＰ−０１９６２株は、Ｎ株よりも低濃度の前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液に対して、Ｎ株よりも優れたエタノール発酵性能を備えていることが明らかである。
次に、２０質量％の希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液を培地とし、該培地にＢＰ−０１９６２株とＮ株との培養液を培地のＯＤ６００が２．０となるようにそれぞれ添加し、３０℃の温度で１２０時間培養を行った。前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液は、グルコース５８．８ｇ／Ｌ、キシロース３３．８ｇ／Ｌを含みｐＨ６であった。そして、所定時間毎に前記培地を採取してエタノールの濃度をＧＣ−ＦＩＤ（ジーエルサイエンス株式会社製、商品名：ＧＣ３９０Ｂ）により測定した。結果を図４に示す。
図４から、ＢＰ−０１９６２株は、同濃度の前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液においても、Ｎ株より優れたエタノール発酵性能を備えていることが明らかである。
また、ＢＰ−０１９６２株は、実験室レベルの規模である１Ｌから、５０００Ｌに変更して発酵を行った場合でも、菌体増殖、グルコース資化、キシロース資化、エタノール産生量のいずれにおいてもほぼ同等の結果を得ることができた。従って、ＢＰ−０１９６２株は、工業生産的にも有用な菌株である。
符号なし。
【０００３】
ローストランスポーター活性のあるタンパク質を宿主としてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに導入している。すなわち外来遺伝子を導入することになる。また、特許文献２の発明もトランスポーター遺伝子は異なるものの、宿主に対して異なる種の遺伝子を導入する発明である。
［００１５］
また、非特許文献１に記載の技術は、キシロース資化遺伝子を導入するものであり、上記特許文献１及び２とは技術思想は異なるが、外来遺伝子を導入することに変わりない。
［００１６］
そのため、上記特許文献１及び２、非特許文献１に記載の発明は、いずれも国連で採択された「生物の多様性に関する条約のバイオセーフティに関するカルタヘナ議定書」を実施するために我が国において施行されているいわゆるカルタヘナ法に則した封じ込め策を講じる必要がある。従って、バイオセーフティを保証するための施設を必要とすることから、当該菌体を利用してエタノールを生産することはコストの面で不利である。
［００１７］
また、非特許文献２に記載の技術によって、ピキア属酵母を利用することは、野生型のピキア属酵母はキシロース利用性が低く、エタノール産生効率はさほど高くならない。
［００１８］
本発明は、外来遺伝子を導入することなく、エタノール産生効率の高い高効率エタノール発酵菌を得ることを課題とする。
課題を解決するための手段
［００１９］
前記課題を解決するために、本発明の高効率エタノール発酵菌は、五炭糖及び六炭糖から効率的にエタノールを産生する発酵菌であって、Ｍｅｙｅｒｏｚｙｍａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ Ｎ株を、アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液に変異剤を加えた培地で馴化培養して、該培地で生育する菌を選抜することにより、Ｍｅｙｅｒｏｚｙｍａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ Ｎ株に比較してキシロース資化性及びエタノール発酵性能が向上している菌であり、特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９６２として寄託されていることを特徴とする。
［００２０］
野生型Ｍｅｙｅｒｏｚｙｍａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉは、グルコース資化能に加えてキシロース資化能を備えているとはいうものの、バイオエタノール生産に十分なキシロース利用能を備えているわけではない。これに対して、本発明の高効率エタノール発酵菌（以下、ＢＰ−０１９６２株ということがある。）は、Ｍｅｙｅｒｏｚｙｍａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉ Ｎ株を親株として菌株育種することによりキシロース

Claims (2)

  1. 五炭糖及び六炭糖から効率的にエタノールを産生する発酵菌であって、
    特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９６２として寄託されていることを特徴とする高効率エタノール発酵菌。
  2. 請求項１に記載の高効率エタノール発酵菌において、Meyerozyma guilliermondii Ｎ株を、アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液に変異剤を加えた培地で馴化培養して、該培地で生育する菌を選抜することによりエタノール発酵性能が向上していることを特徴とする高効率エタノール発酵菌。
JP2016562190A 2014-12-05 2014-12-05 高効率エタノール発酵菌 Active JP6145582B2 (ja)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2014/082331 WO2016088274A1 (ja) 2014-12-05 2014-12-05 高効率エタノール発酵菌

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2016088274A1 true JPWO2016088274A1 (ja) 2017-05-25
JP6145582B2 JP6145582B2 (ja) 2017-06-14

Family

ID=56091245

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016562190A Active JP6145582B2 (ja) 2014-12-05 2014-12-05 高効率エタノール発酵菌

Country Status (6)

Country Link
US (1) US10119146B2 (ja)
EP (1) EP3228700B1 (ja)
JP (1) JP6145582B2 (ja)
CN (1) CN107429221B (ja)
BR (1) BR112017011495A2 (ja)
WO (1) WO2016088274A1 (ja)

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5828289A (ja) * 1981-08-12 1983-02-19 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 発酵法によるアルコ−ルの製造法
US7846712B2 (en) 2006-06-01 2010-12-07 Alliance For Sustainable Energy, Llc L-arabinose fermenting yeast
JP2011050359A (ja) 2009-09-04 2011-03-17 Musashino Chemical Laboratory Ltd 新規微生物および該微生物由来の酵素、ならびにこれらを用いた糖化液の製造方法
HUE036686T2 (hu) * 2010-04-14 2018-07-30 Lesaffre & Cie Legalább egy pentózból etanol képzésére alkalmas ipari élesztõ
JP2012170422A (ja) 2011-02-23 2012-09-10 Kyoto Institute Of Technology キシローストランスポーター活性を有する新規タンパク質および当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、並びにそれらの利用
JP2014158437A (ja) * 2013-02-19 2014-09-04 Nippon Shokubai Co Ltd リグノセルロース系バイオマスの糖化液、及びその製造方法と使用方法
WO2016088275A1 (ja) * 2014-12-05 2016-06-09 本田技研工業株式会社 高効率エタノール発酵菌

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FAN, CHAO ET AL.: "Efficient ethanol production from corncob residues by repeated fermentation of an adapted yeast", BIORESOURCE TECHNOLOGY, vol. Vol.136, JPN6015009221, 2013, pages 309 - 315, XP028591017, DOI: doi:10.1016/j.biortech.2013.03.028 *
HAN, LI-LI ET AL.: "Breeding of Higher Ethanol Fermentation of Xylose Strain with Protoplast Fusion and Mutagenisis", LIQUOR MAKING, vol. 35, no. 2, JPN6015009241, 2008, pages 38 - 41, XP008185458 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3228700B1 (en) 2019-07-31
JP6145582B2 (ja) 2017-06-14
BR112017011495A2 (pt) 2018-04-10
WO2016088274A1 (ja) 2016-06-09
US10119146B2 (en) 2018-11-06
CN107429221A (zh) 2017-12-01
US20170342425A1 (en) 2017-11-30
EP3228700A4 (en) 2018-05-23
CN107429221B (zh) 2020-08-18
EP3228700A1 (en) 2017-10-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5813369B2 (ja) アルコール発酵性酵母及びこれを用いたエタノール製造方法
TWI450963B (zh) 具高木醣消耗率之分離酵母菌株及使用該菌株製造酒精之方法
JP6228323B2 (ja) 高効率エタノール発酵菌
JP6145583B2 (ja) 高効率エタノール発酵菌
JP6145582B2 (ja) 高効率エタノール発酵菌
Zheng et al. Enhanced inulin saccharification by self-produced inulinase from a newly isolated Penicillium sp. and its application in D-lactic acid production
US9127323B2 (en) Isolated yeast strain having high xylose consumption rate and process for production of ethanol using the strain
JP6180660B2 (ja) 高効率エタノール発酵菌
JP6240344B2 (ja) 高効率エタノール発酵菌
JP2015107088A (ja) 酵母変異株を用いたエタノール製造方法
JP6443944B2 (ja) キシロース資化能及びエタノール生産能を有する酵母
JP6327822B2 (ja) 糸状菌を用いる木質系バイオマスからのエタノールの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
A529 Written submission of copy of amendment under article 34 pct

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A5211

Effective date: 20170216

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20170216

A871 Explanation of circumstances concerning accelerated examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871

Effective date: 20170220

A975 Report on accelerated examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005

Effective date: 20170315

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20170404

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20170316

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20170509

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20170515

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6145582

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150