WO2016088274A1 - 高効率エタノール発酵菌 - Google Patents

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範彦 塚越
育美 栗原
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    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • This invention relates to a microorganism for fermenting a saccharified solution in bioethanol production using lignocellulosic biomass.
  • ethanol is efficiently produced from pentose sugar (hereinafter sometimes referred to as C5 sugar) and hexose sugar (hereinafter sometimes referred to as C6 sugar). Relates to microorganisms that can.
  • C5 sugar pentose sugar
  • C6 sugar hexose sugar
  • Bioethanol is expected as a non-depleting renewable resource produced from biomass.
  • carbon dioxide generated by burning bioethanol is carbon neutral, it is considered that the increase in carbon dioxide, which is a major cause of global warming, is suppressed by the use of bioethanol.
  • xylose is a sugar that is contained in the biomass next to glucose, and the efficient use of pentose sugar is a major issue in bioethanol production.
  • Patent Document 1 discloses an invention in which xylose (C5 sugar) is converted to xylulose by introducing a gene having xylose transporter activity into a host cell, incorporated into a glycolytic pentose phosphate pathway, and used for fermentation. Has been.
  • Patent Document 2 discloses a technique for producing an alcohol using a yeast provided with an arabinose transporter. Similarly to Patent Document 1, arabinose (C5 sugar) is incorporated into a glycolytic pentose phosphate pathway via arabitol and xylulose and used for fermentation.
  • arabinose C5 sugar
  • Non-Patent Document 1 discloses that xylose utilization ability is imparted by incorporating a xylose utilization gene derived from Escherichia coli into Zymomonas.
  • Non-Patent Document 2 describes that Pichia yeasts produce ethanol using xylose.
  • Patent Document 1 introduces a protein having a xylose transporter activity derived from Candida guilliermondii into Saccharomyces cerevisiae as a host. That is, a foreign gene is introduced.
  • Patent Document 2 is also an invention in which different types of genes are introduced into the host, although the transporter genes are different.
  • Non-Patent Document 1 introduces a xylose-utilizing gene. Although the technical idea is different from that of Patent Documents 1 and 2, it is not different from introducing a foreign gene.
  • Patent Documents 1 and 2 and Non-Patent Document 1 are both implemented in Japan to implement the “Cartagena Protocol on Biosafety of the Convention on Biological Diversity” adopted by the United Nations. It is necessary to take containment measures in accordance with the so-called Cartagena Act. Therefore, since a facility for assuring biosafety is required, it is disadvantageous in terms of cost to produce ethanol using the cells.
  • Pichia yeast by the technique described in Non-Patent Document 2 is that wild-type Pichia yeast has low xylose utilization, and ethanol production efficiency is not so high.
  • An object of the present invention is to obtain a high-efficiency ethanol-fermenting bacterium having high ethanol production efficiency without introducing a foreign gene.
  • the high-efficiency ethanol-fermenting bacterium of the present invention is a fermenting bacterium that efficiently produces ethanol from pentose and hexose, and has the accession number NITE BP-01962 at the Patent Microorganism Depositary Center. It is characterized by being deposited as.
  • BP-01962 strain the high-efficiency ethanol-fermenting bacterium of the present invention
  • the highly efficient ethanol-fermenting bacterium of the present invention can obtain higher ethanol production efficiency than the parent strain without introducing a foreign gene.
  • the high-efficiency ethanol-fermenting bacterium of the present invention is conditioned by culturing Meyerozyma guilliermondii N strain in a medium obtained by adding a mutant to an enzyme-treated rice straw-derived enzyme saccharified solution, and selecting a bacterium that grows on the medium. Has improved.
  • 2 is a graph showing xylose assimilation ability and ethanol yield, with A representing the N strain and B representing the BP-01962 strain.
  • 2 is a graph showing changes over time in the digestion amount of glucose and xylose by the BP-01962 strain and the production amount of ethanol in an ammonia-treated rice straw-derived enzyme saccharified solution.
  • 2 is a graph showing the relationship between the sugar concentration and fermentation yield in dilute sulfuric acid-treated corn stover-derived enzyme saccharified solutions of BP-01962 and N strains.
  • 2 is a graph showing changes in ethanol production with time in dilute sulfuric acid-treated corn stover-derived enzyme saccharified solutions of BP-01962 and N strains.
  • the wild strain of Meyerozyma guilliermondi an ascomycete yeast
  • the high-efficiency ethanol-fermenting bacterium of this embodiment has been submitted to the Patent Microorganism Deposit Center by the Applicant's National Institute for Product Evaluation and Technology (Japan ⁇ 292-0818, 2-5-8, Kazusa Kamashichi, Kisarazu City, Chiba Prefecture No. 122) It has been deposited.
  • the acceptance date is November 19, 2014, and the acceptance number is NITE BP-01962.
  • the high-efficiency ethanol-fermenting bacterium of this embodiment may be referred to as BP-01962 strain.
  • ammonia-treated rice straw-derived enzyme saccharified solution for example, one obtained as follows can be used. First, rice straw produced in Kumagaya City, Saitama Prefecture is immersed in an equal amount of 25% by mass ammonia water at a temperature of 30 ° C. for 3 hours, and then pretreated by releasing ammonia. Next, after adjusting the pH of the pretreated rice straw, saccharification enzyme (Meiji Seika Pharma Co., Ltd., trade name: Acremonium Cellulase) is added and maintained at a temperature of 50 ° C. for 72 hours for enzymatic saccharification. And a slurry containing the enzyme saccharified solution is obtained.
  • saccharification enzyme Meiji Seika Pharma Co., Ltd., trade name: Acremonium Cellulase
  • the ammonia-treated rice straw-derived enzyme saccharified solution contains, for example, 3 to 15% by mass of glucose and 1 to 10% by mass of xylose.
  • mutagen examples include ethylating agents such as N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) and ethyl methanesulfonate (EMS), and base analogs such as 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU). Nitroso compounds such as nitroamine and nitrosoguanidine can be used.
  • ethylating agents such as N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) and ethyl methanesulfonate (EMS)
  • base analogs such as 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU).
  • Nitroso compounds such as nitroamine and nitrosoguanidine can be used.
  • the BP-0196 strain which is a high-efficiency ethanol-fermenting bacterium of the present embodiment, is cultivated in a medium in which the parent strain is mutated with the ammonia-treated rice straw-derived enzyme saccharified solution, and the bacteria that grow on the medium are selected. It is a mutant strain obtained by repeating. Therefore, the BP-01962 strain has improved xylose utilization and ethanol fermentation performance without introducing foreign genes compared to the wild strain or N strain of Meyerozyma guilliermondi.
  • a culture solution of Meyerozyma guilliermondiN strain was added to a synthetic medium having a pH of 4.7 containing 97.6 g / L of glucose, 41.5 g / L of xylose, 10.0 g / L of yeast extract and 20.0 g / L of peptone, and the OD of the medium. 600 was added to 2.0, and culture was performed at a temperature of 30 ° C. for 168 hours.
  • the medium is collected every predetermined time, the concentration of glucose and xylose is determined by HPLC (trade name: LC-8020, manufactured by Tosoh Corporation), and the concentration of ethanol is determined by GC-FID (manufactured by GL Science Co., Ltd., product). Name: GC390B), respectively.
  • HPLC trade name: LC-8020, manufactured by Tosoh Corporation
  • GC-FID manufactured by GL Science Co., Ltd., product
  • GC390B concentration of xylose concentration and the ethanol concentration are shown in FIG. 1A.
  • the ammonia-treated rice straw-derived enzyme saccharified solution contained 112 g / L glucose and 40.6 g / L xylose, and had a pH of 4.5.
  • the medium is collected every predetermined time, the concentration of glucose and xylose is determined by HPLC (trade name: LC-8020, manufactured by Tosoh Corporation), and the concentration of ethanol is determined by GC-FID (manufactured by GL Science Co., Ltd., product). Name: GC390B), respectively.
  • HPLC trade name: LC-8020, manufactured by Tosoh Corporation
  • GC-FID manufactured by GL Science Co., Ltd., product
  • GC390B concentration of xylose concentration and the ethanol concentration are shown in FIG. 1B.
  • the xylose concentration hardly changes in the Meyerozyma guilliermondi ⁇ ⁇ N strain and the ethanol concentration does not exceed 40 g / L, whereas the BP-01962 strain decreases the xylose concentration as the culture time increases. Is found to exceed 40 g / L.
  • the BP-01962 strain has better xylose utilization and ethanol fermentation performance than the N strain.
  • FIG. 2 shows that the total amount of glucose and xylose is digested 120 hours after the start of the culture, and the ethanol concentration increases as the culture time increases.
  • the glucose concentration was almost zero 48 hours after the start of the culture, but since then the xylose concentration decreased and the ethanol concentration continued to increase, the BP-01962 strain digested all the glucose. After that, it is clear that ethanol fermentation is performed using xylose as a substrate.
  • fermentation yields of the BP-01962 strain and the N strain were compared using an enzyme saccharified solution derived from dilute sulfuric acid-treated corn stover.
  • the dilute sulfuric acid-treated corn stover-derived enzyme saccharified solution used was obtained as follows. First, a corn stover produced in Iowa, USA is immersed in a double amount of 3.7% by mass sulfuric acid at a temperature of 170 ° C. for 10 minutes, and then pretreated by returning to normal temperature. Next, an aqueous NaOH solution is added to the pretreated corn stover to adjust the pH to 4, and then a saccharification enzyme (manufactured by Meiji Seika Pharma Co., Ltd., trade name: Acremonium Cellulase) is added and maintained at a temperature of 50 ° C. for 72 hours. Then, enzymatic saccharification is performed to obtain a slurry containing the enzymatic saccharified solution.
  • a saccharification enzyme manufactured by Meiji Seika Pharma Co., Ltd., trade name: Acremonium Cellulase
  • the slurry was subjected to solid-liquid separation by centrifugation, and the collected liquid was adjusted to pH 6 with an aqueous NaOH solution to obtain the diluted saccharified corn stover-derived enzyme saccharified solution.
  • the dilute sulfuric acid-treated corn stover-derived enzyme saccharified solution contains, for example, 3 to 15% by mass of glucose and 1 to 10% by mass of xylose.
  • a dilute sulfuric acid-treated corn stover-derived enzyme saccharified solution was used as a medium, and a culture solution of BP-01962 strain was added to the medium so that the OD 600 of the medium was 0.5, and the temperature was 30 ° C. Culture was performed for 100 hours.
  • the dilute sulfuric acid-treated corn stover-derived enzyme saccharified solution contained glucose 45 g / L and xylose 38 g / L, and had a pH of 6.
  • the medium was collected, the ethanol concentration was measured by GC-FID (manufactured by GL Sciences, trade name: GC390B), and the fermentation yield was calculated by the following formula (1). The results are shown in FIG.
  • Fermentation yield product ethanol concentration / (glucose concentration + xylose concentration) /0.5114 (1) (Glucose concentration and xylose concentration are initial concentrations before the start of culture)
  • an enzyme saccharified solution derived from 26% by mass of dilute sulfuric acid-treated corn stover is used as a medium, and a culture solution of Meyerozyma guilliermondi N strain is added to the medium so that the OD 600 of the medium is 0.5, and the temperature is 30 ° C. Culture was performed for 100 hours.
  • the diluted sulfuric acid-treated corn stover-derived enzyme saccharified solution had a pH of 6 including glucose 64 g / L and xylose 48 g / L.
  • the BP-01962 strain has ethanol fermentation performance superior to that of the N strain with respect to the enzyme saccharification solution derived from the diluted sulfuric acid-treated corn stover at a lower concentration than the N strain.
  • the dilute sulfuric acid-treated corn stover-derived enzyme saccharified solution contained glucose 58.8 g / L and xylose 33.8 g / L, and had a pH of 6. Then, the medium was collected every predetermined time, and the ethanol concentration was measured by GC-FID (manufactured by GL Sciences, trade name: GC390B). The results are shown in FIG.
  • FIG. 4 clearly shows that the BP-01962 strain has ethanol fermentation performance superior to that of the N strain even in the enzyme saccharification solution derived from the diluted sulfuric acid-treated corn stover at the same concentration.
  • the BP-01962 strain is almost the same in all of the cell growth, glucose utilization, xylose utilization, and ethanol production even when fermentation is carried out by changing the laboratory scale from 1 L to 5000 L. Equivalent results could be obtained. Therefore, the BP-01962 strain is a useful strain for industrial production.

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Abstract

　外来遺伝子を導入することなく、エタノール産生効率の高い高効率エタノール発酵菌を提供する。　高効率エタノール発酵菌は、五炭糖及び六炭糖から効率的にエタノールを産生する発酵菌であって、特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１９６２として寄託されている。

Description

高効率エタノール発酵菌
　リグノセルロース系バイオマスを用いたバイオエタノール生産において、糖化溶液を発酵するための微生物に関する。
　特に、リグノセルロース系バイオマスを用いたバイオエタノール生産において、五炭糖（以下、Ｃ５糖ということがある。）、及び六炭糖（以下、Ｃ６糖ということがある。）から効率的にエタノール生産することができる微生物に関する。
　バイオエタノールは、バイオマスから産生される枯渇することのない再生可能資源として期待されている。また、バイオエタノールを燃焼させて発生する二酸化炭素はカーボンニュートラルであることから、バイオエタノールの利用が進むことによって、地球温暖化の主な原因である二酸化炭素の上昇を抑制すると考えられている。
　バイオエタノールは、バイオマスを発酵させ、蒸留してエタノールを精製する。バイオエタノールの収率を高めるために糖化溶液から多くのアルコールを生成する必要がある。バイオエタノール生産の過程で一般的に用いられている酵母は、キシロース、アラビノースなどの五炭糖をアルコールに変換できないため、発酵原料としては六炭糖のみが用いられてきた。
　原料によって異なるものの典型的なバイオマスには、３５～４５％のセルロース、２５～４０％のヘミセルロース、１５～３０％のリグニンが含まれていると言われている。したがって、六炭糖が重合しているセルロースだけではなく、五炭糖であるキシロース等を主として含有するヘミセルロースを基質として利用することは効率的なエタノール産生につながることになる。
　キシロースはグルコースの次にバイオマス中に多く含まれている糖であると言われており、五炭糖を効率的に利用することはバイオエタノール生産において大きな課題となっている。
　これまでに、遺伝子組換えによるキシロース利用能の付与や、キシロースを利用してエタノールを産生する微生物の利用等により、キシロースを少しでも利用する技術が開示されている。
　特許文献１には、キシローストランスポーター活性を有する遺伝子を宿主細胞に導入することによって、キシロース（Ｃ５糖）をキシルロースに変換し、解糖系のペントースリン酸経路に組み入れ、発酵に利用する発明が開示されている。
　特許文献２には、アラビノーストランスポーターを付与した酵母によって、アルコールを生成する技術が開示されている。特許文献１と同様にアラビノース（Ｃ５糖）をアラビトール、キシルロースを経て解糖系のペントースリン酸経路に組み入れ、発酵に利用するものである。
　非特許文献１には、大腸菌由来のキシロース資化遺伝子をザイモモナスに組み込むことにより、キシロース資化能を付与することが開示されている。
　非特許文献２には、ピキア属酵母が、キシロースを利用してエタノールを生産することが記載されている。
特開2012-170422号公報 米国特許出願公開第2013/189788号明細書
Zhang, M., et al., Science, 1995. Vol. 267, pp. 240-243. Bicho, P.A., et al., Appl. Environ. Microbiol., 1988, Vol. 54, pp. 50-54.
　しかしながら、特許文献１の発明は、Candida guilliermondii由来のキシローストランスポーター活性のあるタンパク質を宿主としてSaccharomyces cerevisiaeに導入している。すなわち外来遺伝子を導入することになる。また、特許文献２の発明もトランスポーター遺伝子は異なるものの、宿主に対して異なる種の遺伝子を導入する発明である。 
　また、非特許文献１に記載の技術は、キシロース資化遺伝子を導入するものであり、上記特許文献１及び２とは技術思想は異なるが、外来遺伝子を導入することに変わりない。
　そのため、上記特許文献１及び２、非特許文献１に記載の発明は、いずれも国連で採択された「生物の多様性に関する条約のバイオセーフティに関するカルタヘナ議定書」を実施するために我が国において施行されているいわゆるカルタヘナ法に則した封じ込め策を講じる必要がある。従って、バイオセーフティを保証するための施設を必要とすることから、当該菌体を利用してエタノールを生産することはコストの面で不利である。
　また、非特許文献２に記載の技術によって、ピキア属酵母を利用することは、野生型のピキア属酵母はキシロース利用性が低く、エタノール産生効率はさほど高くならない。
　本発明は、外来遺伝子を導入することなく、エタノール産生効率の高い高効率エタノール発酵菌を得ることを課題とする。
　前記課題を解決するために、本発明の高効率エタノール発酵菌は、五炭糖及び六炭糖から効率的にエタノールを産生する発酵菌であって、特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１９６２として寄託されていることを特徴とする。
　野生型Meyerozyma guilliermondiは、グルコース資化能に加えてキシロース資化能を備えているとはいうものの、バイオエタノール生産に十分なキシロース利用能を備えているわけではない。これに対して、本発明の高効率エタノール発酵菌（以下、ＢＰ－０１９６２株ということがある。）は、Meyerozyma guilliermondi Ｎ株を親株として菌株育種することによりキシロースの利用効率の高い菌を選抜して得たものである。
　この結果、本発明の高効率エタノール発酵菌は、外来遺伝子を導入することなく、親株より高いエタノール産生効率を得ることができる。
　本発明の高効率エタノール発酵菌は、Meyerozyma guilliermondii Ｎ株をアンモニア処理稲わら由来酵素糖化液に変異剤を加えた培地で馴化培養して、該培地で生育する菌を選抜することによりエタノール発酵性能が向上している。
キシロース資化性とエタノール収率とを示すグラフであり、ＡはＮ株、ＢはＢＰ－０１９６２株を示す。 アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液におけるＢＰ－０１９６２株によるグルコース及びキシロースの消化量と、エタノールの生成量との経時変化を示すグラフである。 ＢＰ－０１９６２株とＮ株との希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液における糖濃度と発酵収率との関係を示すグラフである。 ＢＰ－０１９６２株とＮ株との希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液におけるエタノール生成量の経時変化を示すグラフである。
　次に、添付の図面を参照しながら本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。
　子嚢菌系酵母であるMeyerozyma guilliermondiの野生株は、グルコース資化能に加えてキシロース利用能を備えているが、そのキシロース利用能はバイオエタノール生産に十分とは言えない。そこで、本実施形態の高効率エタノール発酵菌は、子嚢菌系酵母であるMeyerozyma guilliermondi Ｎ株を親株として、アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液に変異剤を加えた培地で馴化培養して、該培地で生育する菌を選抜することにより得られた変異株である。
　本実施形態の高効率エタノール発酵菌は、本出願人により独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（日本国　〒２９２－０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に寄託されている。受託日は２０１４年１１月１９日、受託番号は、ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１９６２である。以下、本実施形態の高効率エタノール発酵菌を、ＢＰ－０１９６２株ということがある。
　前記アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液は、例えば、次のようにして得たものを用いることができる。まず、埼玉県熊谷市産の稲わらを等量の２５質量％アンモニア水に３０℃の温度で３時間浸漬した後、アンモニアを放散させることにより前処理する。次に、前記前処理が施された稲わらに、ｐＨ調整後、糖化酵素（MeijiSeikaファルマ株式会社製、商品名：アクレモニウムセルラーゼ）を添加し５０℃の温度に７２時間保持して酵素糖化を行い、酵素糖化液を含むスラリーを得る。次に、前記スラリーをフィルタープレスにより固液分離し、回収された液体分を前記アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液とする。前記アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液は、例えば、３～１５質量％のグルコースと、１～１０質量％のキシロースとを含んでいる。
　前記変異剤としては、例えば、N－エチル－N－ニトロソウレア（ＥＮＵ）、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）等のエチル化剤、５－ブロモ－２´－デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）等の塩基類似化合物、ニトロアミン、ニトロソグアニジン等のニトロソ化合物等を用いることができる。
　本実施形態の高効率エタノール発酵菌であるＢＰ－０１９６２株は、前記親株を前記アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液に変異剤を加えた培地で馴化培養して、該培地で生育する菌の選抜を繰り返すことにより得られた変異株である。従って、ＢＰ－０１９６２株は、Meyerozyma guilliermondiの野生株又はＮ株に比較して、外来遺伝子を導入することなく、キシロース資化性及びエタノール発酵性能が向上している。
　次に、Meyerozyma guilliermondi Ｎ株とＢＰ－０１９６２株とのキシロース資化性とエタノール収率を比較した。
　まず、グルコース９７．６ｇ／Ｌ、キシロース４１．５ｇ／Ｌ、酵母エキス１０．０ｇ／Ｌ、ペプトン２０．０ｇ／Ｌを含みｐＨ４．７の合成培地に、Meyerozyma guilliermondiＮ株の培養液を培地のＯＤ６００が２．０となるように添加し、３０℃の温度で１６８時間培養を行った。そして、所定時間毎に前記培地を採取し、グルコースとキシロースとの濃度をＨＰＬＣ（東ソー株式会社製、商品名：ＬＣ－８０２０）により、エタノールの濃度をＧＣ－ＦＩＤ（ジーエルサイエンス株式会社製、商品名：ＧＣ３９０Ｂ）により、それぞれ測定した。キシロース濃度とエタノール濃度との測定結果を図１Ａに示す。
　次に、２６質量％のアンモニア処理稲わら由来酵素糖化液を培地とし、該培地にＢＰ－０１９６２株のの培養液を培地のＯＤ６００が２．０となるように添加し、３０℃の温度で１６８時間培養を行った。前記アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液は、グルコース１１２ｇ／Ｌ、キシロース４０．６ｇ／Ｌを含みｐＨ４．５であった。そして、所定時間毎に前記培地を採取し、グルコースとキシロースとの濃度をＨＰＬＣ（東ソー株式会社製、商品名：ＬＣ－８０２０）により、エタノールの濃度をＧＣ－ＦＩＤ（ジーエルサイエンス株式会社製、商品名：ＧＣ３９０Ｂ）により、それぞれ測定した。キシロース濃度とエタノール濃度との測定結果を図１Ｂに示す。
　図１Ａ，１Ｂから、Meyerozyma guilliermondi Ｎ株ではキシロース濃度が殆ど変化せず、エタノール濃度も４０ｇ／Ｌを超えないのに対し、ＢＰ－０１９６２株では培養時間が長くなるほどキシロース濃度が低下し、エタノール濃度が４０ｇ／Ｌを超えることがわかる。
　従って、ＢＰ－０１９６２株によれば、Ｎ株よりも優れたキシロース資化性及びエタノール発酵性能を備えていることが明らかである。
　次に、２６質量％のアンモニア処理稲わら由来酵素糖化液を培地とし、該培地にＢＰ－０１９６２株の培養液を培地のＯＤ６００が２．０となるように添加し、３０℃の温度で１２０時間培養を行った。前記アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液は、グルコース７３．８ｇ／Ｌ、キシロース２８．３ｇ／Ｌを含みｐＨ５．８であった。そして、所定時間毎に前記培地を採取し、グルコースとキシロースとの濃度をＨＰＬＣ（東ソー株式会社製、商品名：ＬＣ－８０２０）により、エタノールの濃度をＧＣ－ＦＩＤ（ジーエルサイエンス株式会社製、商品名：ＧＣ３９０Ｂ）により、それぞれ測定した。結果を図２に示す。
　図２から、培養開始から１２０時間後にはグルコース及びキシロースの全量が消化されており、エタノール濃度は培養時間が長くなるほど高くなることがわかる。また、培養開始から４８時間後にはグルコース濃度が殆どゼロになっているが、その後もキシロース濃度は低下し、エタノール濃度は増加を続けていることから、ＢＰ－０１９６２株はグルコースの全量が消化された後は、キシロースを基質としてエタノール発酵を行っていることが明らかである。
　次に、希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液を用いて、ＢＰ－０１９６２株とＮ株との発酵収率を比較した。
　前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液は、次のようにして得たものを用いた。まず、米国アイオワ州産のコーンストーバを２倍量の３．７質量％硫酸に１７０℃の温度で１０分間浸漬した後、常温に戻すことにより前処理する。次に、前記前処理が施されたコーンストーバにＮａＯＨ水溶液を添加してｐＨ４に調整後、糖化酵素（MeijiSeikaファルマ株式会社製、商品名：アクレモニウムセルラーゼ）を添加し５０℃の温度に７２時間保持して酵素糖化を行い、酵素糖化液を含むスラリーを得る。次に、前記スラリーを遠心分離により固液分離し、回収された液体分をＮａＯＨ水溶液でｐＨ６に調整し、前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液とした。前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液は、例えば、３～１５質量％のグルコースと、１～１０質量％のキシロースとを含んでいる。
　次に、１５質量％の希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液を培地とし、該培地にＢＰ－０１９６２株の培養液を培地のＯＤ６００が０．５となるように添加し、３０℃の温度で１００時間培養を行った。前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液は、グルコース４５ｇ／Ｌ、キシロース３８ｇ／Ｌを含みｐＨ６であった。そして、前記培養後に前記培地を採取してエタノールの濃度をＧＣ－ＦＩＤ（ジーエルサイエンス株式会社製、商品名：ＧＣ３９０Ｂ）により測定し、次式（１）により発酵収率を算出した。結果を図３に示す。
　発酵収率＝生成エタノール濃度/（グルコース濃度＋キシロース濃度）/０．５１１４　・・・（１）
　（グルコース濃度及びキシロース濃度は培養開始前の初期濃度である）
　次に、２６質量％の希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液を培地とし、該培地にMeyerozyma guilliermondi Ｎ株の培養液を培地のＯＤ６００が０．５となるように添加し、３０℃の温度で１００時間培養を行った。前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液は、グルコース６４ｇ／Ｌ、キシロース４８ｇ／Ｌを含みｐＨ６であった。そして、前記培養後に前記培地を採取してエタノールの濃度をＧＣ－ＦＩＤ（ジーエルサイエンス株式会社製、商品名：ＧＣ３９０Ｂ）により測定し、式（１）により発酵収率を算出した。結果を図３に示す。
　図３から、ＢＰ－０１９６２株は、Ｎ株よりも低濃度の前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液に対して、Ｎ株よりも優れたエタノール発酵性能を備えていることが明らかである。
　次に、２０質量％の希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液を培地とし、該培地にＢＰ－０１９６２株とＮ株との培養液を培地のＯＤ６００が２．０となるようにそれぞれ添加し、３０℃の温度で１２０時間培養を行った。前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液は、グルコース５８．８ｇ／Ｌ、キシロース３３．８ｇ／Ｌを含みｐＨ６であった。そして、所定時間毎に前記培地を採取してエタノールの濃度をＧＣ－ＦＩＤ（ジーエルサイエンス株式会社製、商品名：ＧＣ３９０Ｂ）により測定した。結果を図４に示す。
　図４から、ＢＰ－０１９６２株は、同濃度の前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液においても、Ｎ株より優れたエタノール発酵性能を備えていることが明らかである。
　また、ＢＰ－０１９６２株は、実験室レベルの規模である１Ｌから、５０００Ｌに変更して発酵を行った場合でも、菌体増殖、グルコース資化、キシロース資化、エタノール産生量のいずれにおいてもほぼ同等の結果を得ることができた。従って、ＢＰ－０１９６２株は、工業生産的にも有用な菌株である。
　符号なし。

Claims (2)

  1. 　五炭糖及び六炭糖から効率的にエタノールを産生する発酵菌であって、
    　特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１９６２として寄託されていることを特徴とする高効率エタノール発酵菌。
  2. 　請求項１に記載の高効率エタノール発酵菌において、Meyerozyma guilliermondii Ｎ株を、アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液に変異剤を加えた培地で馴化培養して、該培地で生育する菌を選抜することによりエタノール発酵性能が向上していることを特徴とする高効率エタノール発酵菌。
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