JPWO2016052612A1 - 活性エステル化ポリ−γ−グルタミン酸を用いたヘモグロビンの測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ヘモグロビンの定量性に優れた活性エステル化ポリ−γ−グルタミン酸を提供する。【解決手段】ポリ−γ−グルタミン酸とＮ−ヒドロキシアミン系化合物とからなる活性エステル化ポリ−γ−グルタミン酸を含有するヘモグロビン測定用組成物。【選択図】なし

Description

本発明は、活性エステル化ポリ−γ−グルタミン酸を含むヘモグロビン測定用組成物に関する。詳しくは、ポリ−γ−グルタミン酸とＮ−ヒドロキシアミン系物質を反応させることによって得られる活性エステル化ポリ−γ−グルタミン酸であって、これを利用したヘモグロビン測定用試験片、当該試験片の製造方法、当該試験片を使用したヘモグロビンの測定方法に関する。

ヘモグロビンは血液中の赤血球中に存在して、肺で取り込まれた酸素を全身に運搬する役割を担っている。酸素運搬能はヘモグロビン量で規定されることから、血液中のヘモグロビンを測定することは貧血等の病態を診断する上で重要である。血液中のヘモグロビンの正常範囲は、男性で１４．０〜１８．０ｇ／ｄＬ、女性で１２．０〜１６．０ｇ／ｄＬであることが知られている。

通常、ヘモグロビンは国際基準法であるシアンメトヘモグロビン法により測定される。シアンメトヘモグロビン法は、フェリシアン化カリウムでヘモグロビンをシアンメトヘモグロビンに転化し、５４０ｎｍ付近の吸光度を測定することによって算出する方法である。この方法では測定試薬に有害なシアン化カリウムが含まれるため、試薬の取り扱いだけではなく、測定後の試料の廃棄にも細心の注意が必要であった。

シアンメトヘモグロビン法以外の測定方法が特許文献１に開示されている。この方法はポリエチレングリコール−ｐ−アルキルフェニルエーテルやその誘導体等のノニオン性界面活性剤を用いてヘモグロビンの測定を可能にしている。この方法では毒性のない界面活性剤を使用する点でシアンメトヘモグロビン法よりも優れているが、界面活性剤を含む試薬によって試料の表面張力が低下して、ピペットで試料を吸引する際に誤差が大きくなり、測定精度が低下する等の問題があった。

特開昭５４−１４８５９５号公報

上述のように、既存の測定方法は試薬に有害物質が含まれる点、測定精度が劣る点、多段階の反応を経て測定するため操作が煩雑な点などの問題があり、これらの問題点を解決した測定方法が望まれていた。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、ポリ−γ−グルタミン酸のカルボキシル基にＮ−ヒドロキシアミン系物質を反応させることによって得られる活性エステル化ポリ−γ−グルタミン酸が血液中のヘモグロビンと吸着することを見出した。本発明者はさらに、この知見を基に、前記活性エステル化ポリ−γ−グルタミン酸を含むヘモグロビン測定用組成物、当該ヘモグロビン測定用組成物を使用した分析用試験片、当該試験片の製造方法、当該試験片を使用したヘモグロビンの定量方法などの発明を完成させた。

すなわち、代表的な本願発明は以下の通りである。
（１）ポリ−γ−グルタミン酸とＮ−ヒドロキシアミン系化合物とからなる活性エステル化ポリ−γ−グルタミン酸を含有するヘモグロビン測定用組成物。
（２）ポリ−γ−グルタミン酸を構成するグルタミン酸がＬ−グルタミン酸である、（１）に記載のヘモグロビン測定用組成物。
（３）Ｎ−ヒドロキシアミン系化合物がＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド、２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸エチルエステル、２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸アミド、Ｎ−ヒドロキシピペリジン、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシイミダゾールおよびＮ−ヒドロキシマレイミドからなる群より選択される１種以上である、（１）または（２）に記載のヘモグロビン測定用組成物。
（４）Ｎ−ヒドロキシアミン系化合物がＮ−ヒドロキシスクシンイミドである、（１）または（２）に記載のヘモグロビン測定用組成物。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載のヘモグロビン測定用組成物を含む、ヘモグロビン測定用試験片。
（６）（５）に記載のヘモグロビン測定用試験片の製造方法。
（７）（５）に記載のヘモグロビン測定用試験片を用いてヘモグロビンを測定する方法。
（８）（１）〜（４）のいずれかに記載のヘモグロビン測定用組成物に用いる活性エステル化ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。

本発明のヘモグロビン測定用組成物を構成する活性エステル化ポリ−γ−グルタミン酸は生分解性である。加えてＮ−ヒドロキシアミン系化合物はペプチド合成分野で一般的に使用されている。従って、本発明により安全性に優れ、簡便で精度の高いヘモグロビン測定用組成物を提供することができる。

本発明で使用するヘモグロビン測定用試験片の一例を示す。 ヘモグロビン測定用試験片を用いて、血液検体（ヘモグロビン濃度８０ｇ/Ｌ、１３５ｇ/Ｌ、１９０ｇ/Ｌ）を測定した際の写真を示す。 血液検体のヘモグロビン濃度と発色強度の関係を示す。 本発明で用いる活性エステル化ＰＧＡの構造例を示す。

本発明の実施形態の１つは、ポリ−γ−グルタミン酸（以下、ＰＧＡとも表記する。）とＮ−ヒドロキシアミン系化合物を反応させて得られる活性エステル化ポリ−γ−グルタミン酸（以下、活性エステル化ＰＧＡとも表記する。）を含有するヘモグロビン測定用組成物である。

（活性エステル化ＰＧＡ）
本発明で用いる活性エステル化ＰＧＡの構造を図４に例示する。活性エステル化ＰＧＡは、ＰＧＡのカルボキシル基にＮ−ヒドロキシアミン系物質を脱水縮合剤存在下で反応させ、エステル結合を生成させたものである。図４は、Ｎ−ヒドロキシアミン系物質として、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを用いた場合の例である。図４の構造式において、ｎは特に限定されないが３０００〜６５００の間が好ましい。

（ＰＧＡ）
前記縮合反応に使用するＰＧＡは、グルタミン酸のα−アミノ基とγ−カルボキシル基とがアミド結合したポリアミノ酸である。ＰＧＡの種類は、特に制限されない。例えば、Ｌ−グルタミン酸のみからなるもの、Ｄ−グルタミン酸のみからなるもの、両方を含むものがあるが、何れも用いることができる。但し、重合体における一方の割合がより多い方が、立体規則性に優れ、強度なども高くなるので好ましい。さらに、Ｌ−グルタミン酸からなるものの方が生分解性に優れるので、Ｌ−グルタミン酸の含有割合が９０％以上であるＰＧＡを用いることが好ましい。前記Ｌ−グルタミン酸の含有割合は、さらに好ましくは９５％以上であり、さらに好ましくは９８％以上であり、さらにより好ましくは９９％以上であり、特に好ましくは実質的に１００％である。

前記ＰＧＡの分子サイズも特に制限されないが、平均分子質量で１０ｋＤ以上のものが好適である。一般的に、分子サイズが大きいほど強度などの性能が高くなる。一方、分子サイズが過剰に大きなＰＧＡは製造コストが大きく、また、製造が技術的に難しい場合もあるので、通常は１，０００ｋＤ以下とすることが好ましい。

前記ＰＧＡは、市販されているものがあればそれを用いてもよいし、別途公知の方法でグルタミン酸を重合して製造してもよい。また、微生物を使って生合成させてもよい。ＰＧＡを生産する微生物としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（納豆菌）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（戦国醤菌）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、Ｎａｔｒｉａｌｂａ ａｅｇｙｐｔｉａｃａ、Ｈｙｄｒａなどがある。分子サイズの大きいＰＧＡを製造できる微生物としては、枯草菌であるＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓや超好塩古細菌であるＮａｔｒｉａｌｂａ ａｅｇｙｐｔｉａｃａがある。この中でも、Ｌ−グルタミン酸のみからなるＰＧＡを生産する微生物であるＮａｔｒｉａｌｂａ ａｅｇｙｔｉａｃａによって生産されたＰＧＡを用いるのが好ましい。具体的には、例えば、特開２０１１−０９２２１３および特開２００７−３１４４３４などに記載の方法で生産することができる。

（Ｎ−ヒドロキシアミン系化合物）
前記縮合反応に使用するＮ−ヒドロキシアミン系化合物は、特に制限されないが、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド、２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸エチルエステル、２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸アミド、Ｎ−ヒドロキシピペリジン、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシイミダゾール、Ｎ−ヒドロキシマレイミド等が挙げられる。これら化合物を２種以上用いてもよい。中でも、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（以下、ＮＨＳとも表記する。）が、比較的安価で、入手し易いことやペプチド合成分野等で実績があることから、より好適である。

（脱水縮合剤）
前記縮合反応に使用する脱水縮合剤としては、特に制限されないが、たとえば１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩、１−シクロヘキシル−（２−モルホニル−４−エチル）−カルボジイミド・メソｐ−トルエンスルホネート等が挙げられる。中でも、１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌとも表記する。）がペプチド合成分野等で汎用的な水溶性縮合剤として実績があることから、より好適である。

（ＰＧＡへの活性エステル基の導入）
本発明に係る活性エステル化ポリ−γ−グルタミン酸における活性エステル基の導入量は、Ｎ−ヒドロキシアミン系化合物と脱水縮合剤の仕込み量を調整することで制御することができる。ヘモグロビンに対する吸着性を高めるためには、活性エステル基の導入量は高いものが望ましい。より具体的には、活性エステル化ポリ−γ−グルタミン酸におけるカルボキシル基のモル数に対して活性エステル基のモル数が、０．５モル倍以上であることが好ましく、０．６モル倍以上であることがより好ましく、０．７モル倍以上であることがさらに好ましい。活性エステル基の導入量の上限に制限はなく、１．０モル倍以下であれば良い。

上記の活性エステル基の導入量の高い活性エステル化ポリ−γ−グルタミン酸を得るためには、エステル化反応時にＮ−ヒドロキシアミン系化合物の仕込み量の比を調製することで制御することができる。その条件は特に限定されるものではないが、例えば、ＰＧＡの全カルボキシル基のモル数に対してＮ−ヒドロキシアミン系化合物のモル数を、１．２モル倍以上、好ましくは１．４モル倍以上、さらに好ましくは１．５モル倍以上添加すればよい。一方、前記モル比の上限に制限はなく、１０．０モル倍以下であれば良い。また、前記条件において、Ｎ−ヒドロキシアミン系化合物と脱水縮合剤の仕込み量の比は原則として１：１であるが、現実のＰＧＡへの活性エステル基の導入状況に応じて適宜増減してもよい。

本発明の活性エステル化ポリ−γ−グルタミン酸は、溶媒中、ＰＧＡとＮ−ヒドロキシアミン系化合物と脱水縮合剤とを混合するのみで、極めて容易に製造することができる。ここで使用する溶媒としては、特に限定されないが、ＰＧＡ、Ｎ−ヒドロキシアミン系化合物、脱水縮合剤を良好に溶解できる蒸留水が好適である。

反応温度は、特に限定されない。好ましい下限は１０℃、より好ましくは２０℃である。好ましい上限は５０℃、より好ましくは４０℃である。反応時間は、反応温度によって異なるが、特に限定されない。好ましい下限は１時間、より好ましくは１２時間である。好ましい上限は４８時間、より好ましくは２４時間である。

反応液中に含まれる未反応のＮ−ヒドロキシアミン系化合物や脱水縮合剤は、濾過や遠心分離などにより水溶媒から容易に分離することができる。

上記のような活性エステル化ＰＧＡの製造方法もまた、本発明の実施形態のひとつである。

（活性エステル化ＰＧＡを含有するヘモグロビン測定用組成物）
本発明のヘモグロビン測定用組成物は、前記の方法で得られた活性エステル化ＰＧＡを含む。前記活性エステル化ＰＧＡの含有量は、特に限定されないが、好ましい下限は、前記組成物中０．００１重量％であり、より好ましくは０．００５重量％であり、さらに好ましくは０．０１重量％である。好ましい上限は、前記組成物中１０重量％であり、より好ましくは２重量％であり、さらに好ましくは１重量％である。

前記組成物の組成について、活性エステル化ＰＧＡを含むこと以外は特に限定されない。

本発明の別の実施形態として、前記のヘモグロビン測定用組成物を含むヘモグロビン測定用試験片、前記試験片の製造方法、および、前記試験片を使用したヘモグロビンの測定方法などを示すことができる。

（ヘモグロビン測定用試験片）
本発明の試験片の形態は特に限定されない。例えば、前記活性エステル化ＰＧＡを、適当な基材に固定化することで、イムノクロマトグラフ等で使用可能な試験片を作製することができる。本発明の活性エステル化ポリ−γ−グルタミン酸は、イムノクロマトグラフ等で一般的に使用されるメンブレンに固定化することができる。メンブレンの材質としては、特に限定されないが、セルロース、セルロース誘導体、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロンが挙げられる。これらの材質で構成された膜、布帛、繊維状又は不織布状マトリックス等が好適である。好ましくはセルロース誘導体の膜が用いられ、より好ましくはニトロセルロース膜が用いられる。

続いて、本発明の活性エステル化ポリ−γ−グルタミン酸を含むヘモグロビン測定用試験片の一例を、図面を参照して説明する。図１において、１はニトロセルロースメンブレン、２はサンプルパッド、３は吸収パッド、４は粘着シート、５は活性エステル化ポリ−γ−グルタミン酸の固定化部位を示す。

図１の例では、ヘモグロビン測定用試験片は、幅５ｍｍ、長さ６０ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース製メンブレンフィルターで作製されている。ヘモグロビン測定用試験片には、ニトロセルロースメンブレンのクロマト展開始点側の末端から約３０ｍｍの位置に、活性エステル化ポリ−γ−グルタミン酸が固定化され、ヘモグロビンの捕捉部位５が形成される。

図１に示すようなヘモグロビン測定用試験片は、ニトロセルロースメンブレン１を粘着シート４の中程の位置に貼着し、サンプルパッド２をニトロセルロースメンブレンの末端の上に重ね合わせて連接するとともに、吸収パッド３をニトロセルロースメンブレンの逆側の末端上に重ね合わせて連接することで作製することができる。

サンプルパッド２としては、血液検体を速やかに吸収、展開できる材質のものであればよく、特に限定されないが、セルロース製の濾紙、不織布や、多孔質合成樹脂製のポリエチレン、ポリプロピレンなどが挙げられる。この中でも濾紙が好適である。

吸収パッド３としては、血液検体を速やかに吸収、保持できる材質のものであればよく、特に限定されないが、セルロース製の濾紙、不織布や、多孔質合成樹脂製のポリエチレン、ポリプロピレンなどが挙げられる。この中でも濾紙が好適である。

さらに、ヘモグロビン測定用試験片は、サンプルパッド部位２と捕捉部位５の上方にそれぞれ血液検体を注入するための開口部、捕捉されたヘモグロビン量を定量するための開口部を有する適当なプラスチック製のケースに収容しても良い。

（ヘモグロビン測定用試験片の製造方法）
本発明の試験片の製造方法は特に限定されない。例えば、メンブレン上に一定量の活性エステル化ポリ−γ−グルタミン酸を均一に塗布すればよい。メンブレン上に一定量の活性エステル化ポリ−γ−グルタミン酸を均一に塗布する方法は、特に限定されないが、イムノクロマトディスペンサーを使用することができる。活性エステル化ポリ−γ−グルタミン酸の塗布量は特に限定されないが、好ましくはライン長１０ｃｍ辺り１０μｌ以下、より好ましくは８μｌ以下、さらに好ましくは６μｌ以下である。

メンブレン上に塗布した活性エステル化ポリ−γ−グルタミン酸は乾燥するのみで極めて容易に固定化することが出来る。乾燥温度は特に限定されないが、好ましくは２０℃〜８０℃、より好ましくは３０〜７０℃、さらに好ましくは４０〜６０℃である。乾燥時間は乾燥温度によって異なるが、通常は０．５〜２４時間、好ましくは１〜１２時間である。

（ヘモグロビン測定用試験片を使用したヘモグロビンの測定方法）
上記のようなヘモグロビン測定用試験片を用いて測定を行う方法は特に限定されない。例えば、以下の方法が例示される。まず血液検体を必要に応じて適当な展開溶媒と混合して展開可能な混合液を得た後、当該混合液をサンプルパッド部位２上に注入する。当該混合液は、サンプルパッド２を通過してニトロセルロースメンブレン上に展開し、毛細管現象によって吸収パッド側に流れる。ニトロセルロースメンブレン上の捕捉部位５に到達すると、血液検体中に含まれるヘモグロビンは、活性エステル化ポリ−γ−グルタミン酸によって捕捉され集積し、捕捉部位５が赤色に発色する。他の展開溶媒は５を通過して吸収パッドで吸収される。捕捉部位５の発色強度をイムノクロマトリーダー等を使用して測定することでヘモグロビンの濃度を測定することができる。

（実施例１） ポリ−γ−グルタミン酸とＮ−ヒドロキシスクシンイミドのエステル化合物の合成
ポリ−γ−グルタミン酸は、商品名ＰＧＡ−３０２（東洋紡株式会社製）を使用した。１０ｍｇのＰＧＡ−３０２を２ｍｌの蒸留水で溶解し、０．５％ＰＧＡ−３０２水溶液を調整した。０．５ｍｌの０．５％ＰＧＡ−３０２水溶液に１０ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ナカライテスク株式会社製）と１０ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ナカライテスク株式会社製）を添加し、室温で１時間緩やかに攪拌した。その後、室温で静置し、ポリ−γ−グルタミン酸とＮ−ヒドロキシスクシンイミドのエステル化合物の合成を完了した。

（実施例２） ヘモグロビン測定用試験片の作製
ヘモグロビン測定用試験片は、イムノクロマトグラフで一般的に使用されるスライド構成で作製した。具体的には、サンプルパッド（商品名シュアウィック（メルクミリポア株式会社製））、ニトロセルロースメンブレン（商品名Ｈｉ−Ｆｌｏｗ ＰｌｕｓタイプＨＦ１２０（メルクミリポア株式会社製））、吸収パッド（商品名シュアウィック（メルクミリポア株式会社製））で作製した。ヘモグロビン測定用試験片を横幅約３ｍｍになるようにカットした。次に、実施例１で作製したニトロセルロースメンブレン上に活性エステル化ポリ−γ−グルタミン酸を０．５μｌ滴下し、４５℃、３０分間乾燥し、固定化した。

（実施例３） ヘモグロビン検体の調整
ヘモグロビンコントロール液はＮＯＤ^ＴＭ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｋｉｔ ３ ＬＥＶＥＬ（ＮＯＶＡ ＯＮＥ（登録商標） Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を使用した。ヘモグロビン濃度は８０ｇ/Ｌ（ＬＥＶＥＬ１）、１３５ｇ/Ｌ（ＬＥＶＥＬ２）、１９０ｇ/Ｌ（ＬＥＶＥＬ３）を使用した。これらのヘモグロビンコントロール液を蒸留水で４１倍希釈し、ヘモグロビン検体とした。

（実施例４） ヘモグロビンの検出
実施例２で作製したヘモグロビン測定用試験片を水平な台に設置した。次に、実施例３で作製した３水準のヘモグロビン検体を４０μｌピペットで取り、サンプルパッドに滴下した。検体を滴下してから２分後に撮影した写真を図２に示す。ヘモグロビンが活性エステル化ポリ−γ−グルタミン酸を固定化した部位に集積し、赤色に発色していることが確認できた。加えて、発色強度はヘモグロビン濃度に対応して増加していることが確認できた。

（実施例５） ヘモグロビンの定量
実施例４のヘモグロビン測定用試験片の発色強度をイムノクロマトリーダーを用いて測定した。イムノクロマトリーダーは、Ｃ１００６０−１０（浜松ホトニクス社製）を使用した。結果を表１に示す。ヘモグロビン濃度の８０ｇ/Ｌの発色強度は反射吸光度５２．６ｍＡｂｓ、１３５ｇ/Ｌの発色強度は反射吸光度７６．３ｍＡｂｓ、１９０ｇ/Ｌの発色強度は反射吸光度１０６．９ｍＡｂｓであった。次に、ヘモグロビン濃度と発色強度の関係を図３に示す。ヘモグロビン濃度と発色強度の関係はＹ＝０．４９Ｘ＋１１．８９、Ｒ^２＝０．９９であり、良好な直線関係が得られた。

本発明により安全性に優れ、簡便で精度の高いヘモグロビン測定用組成物を提供することができる。

Claims (8)

1. ポリ−γ−グルタミン酸とＮ−ヒドロキシアミン系化合物とからなる活性エステル化ポリ−γ−グルタミン酸を含有するヘモグロビン測定用組成物。
2. ポリ−γ−グルタミン酸を構成するグルタミン酸がＬ−グルタミン酸である、請求項１に記載のヘモグロビン測定用組成物。
3. Ｎ−ヒドロキシアミン系化合物がＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド、２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸エチルエステル、２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸アミド、Ｎ−ヒドロキシピペリジン、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシイミダゾールおよびＮ−ヒドロキシマレイミドからなる群より選択される１種以上である、請求項１または２に記載のヘモグロビン測定用組成物。
4. Ｎ−ヒドロキシアミン系化合物がＮ−ヒドロキシスクシンイミドである、請求項１または２に記載のヘモグロビン測定用組成物。
5. 請求項１〜４のいずれかに記載のヘモグロビン測定用組成物を含む、ヘモグロビン測定用試験片。
6. 請求項５に記載のヘモグロビン測定用試験片の製造方法。
7. 請求項５に記載のヘモグロビン測定用試験片を用いてヘモグロビンを測定する方法。
8. 請求項１〜４のいずれかに記載のヘモグロビン測定用組成物に用いる活性エステル化ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。