JPWO2015170562A1

JPWO2015170562A1 - リンポルフィリン化合物及びその製造方法、並びに生体分子損傷剤

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Publication number: JPWO2015170562A1
Application number: JP2016517852A
Authority: JP
Inventors: 和貴平川; 東彦欧陽
Original assignee: Shizuoka University NUC
Current assignee: Shizuoka University NUC
Priority date: 2014-05-08
Filing date: 2015-04-16
Publication date: 2017-04-20
Anticipated expiration: 2035-04-16
Also published as: WO2015170562A1; JP6469096B2

Abstract

下記一般式（１）で表されるカチオンを有するリンポルフィリン化合物が開示される。【化１】Ｒ1は水酸基、アミノ基、アンモニウム基及びフルオロ基から選ばれる少なくとも１種の置換基で置換されていてもよい炭素数１〜４の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基を示し、Ｒ２は炭素数１〜４の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基を示す。

Description

本発明は、リンポルフィリン化合物及びその製造方法、並びに生体分子損傷剤に関する。

近年、がんを低侵襲的に治療できる療法として光線力学的療法が注目されている。非特許文献１には、光線力学的療法において用いられることを想定した光増感剤として、ジメトキシリン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリンクロライド（ＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＰＰ）及びテトラキス（１−メチル−４−ピリジニオ）ポルフィリン（Ｈ_２ＴＭＰｙＰ）といったポルフィリン化合物が開示されている。

Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆ＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙＬｅｔｔｅｒｓ, ２０１３，２３，２７０４-２７０７

医療分野での適用を考慮すると、人体に影響の少ない５５０〜６７０ｎｍ程度の長波長の光を用いることが望まれる。また、例えばがん細胞内の生体分子の場合、低酸素の環境下で生体分子を損傷させることが必要なこともある。しかし、従来、５５０〜６７０ｎｍ程度の長波長の光を用いながら、低酸素下で生体分子を十分効率的に損傷させることは困難であった。

そこで、本発明の主な目的は、長波長の光を用いた場合であっても、低酸素下で高い効率で生体分子を損傷させることができる生体分子損傷剤を提供することにある。

一つの側面において、本発明は、下記一般式（１）で表されるカチオンを有するリンポルフィリン化合物に関する。

式（１）中、Ｒ¹は水酸基、アミノ基、アンモニウム基及びフルオロ基から選ばれる少なくとも１種の置換基で置換されていてもよい炭素数１〜４の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基を示し、Ｒ^２は炭素数１〜４の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基を示す。同一分子中の複数のＲ^１及びＲ^２は、それぞれ同一でも異なっていてもよい。

別の側面において、本発明は、上記リンポルフィリン化合物を製造する方法に関する。一形態に係る方法は、下記一般式（２）で表されるカチオンを有する化合物と、Ｒ^１ＯＨで表される化合物（Ｒ^１は水酸基、アミノ基、アンモニウム基及びフルオロ基から選ばれる少なくとも１種の置換基で置換されていてもよい炭素数１〜４の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基を示す。）とを反応させて、式（１）で表されるリンポルフィリン化合物を生成させる工程を備える。

式（２）中、Ｘはブロモ基又はクロロ基を示し、Ｒ^２は炭素数１〜４の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基を示す。同一分子中の複数のＲ^２は、同一でも異なっていてもよい。

別の側面において、本発明は、上記一般式（１）又は（２）で表されるカチオンを有するリンポルフィリン化合物を含む、生体分子損傷剤に関する。この生体分子損傷剤によれば、長波長の光を用いた場合であっても、生体分子からの電子移動機構によって、生体分子を損傷させるための光増感剤として機能することができる。したがって、主として一重項酸素（活性酸素）の生成に基づく反応によって生体分子を損傷させる光増感剤と比較して、低酸素下においてより高い効率で生体分子を損傷させることができる。

上記生体分子損傷剤は、５５０〜６７０ｎｍの光によって生体分子を損傷させるために用いることができる。したがって、本発明の生体分子損傷剤は、５５０〜６７０ｎｍの光を照射することを含む方法によって生体分子を損傷させるために用いることができる。生体分子の損傷のためにこのような長波長の光を用いることは、人体への影響を抑えるとともに、生体内組織の深部に到達する点で有利である。

本発明の生体分子損傷剤によれば、長波長の光を用いた場合であっても、低酸素下で高い効率で生体分子を損傷させることができる。

リンポルフィリン化合物の吸収スペクトルである。リンポルフィリン化合物に対する光照射時間とヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の損傷量との関係を示すグラフである。

以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

いくつかの実施形態に係る生体分子損傷剤は、下記一般式（１）で表されるカチオンと、任意のアニオンとから構成されるリンポルフィリン化合物を含む。

式（１）中、Ｒ¹は水酸基、アミノ基、アンモニウム基及びフルオロ基から選ばれる少なくとも１種の置換基で置換されていてもよい炭素数１〜４の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基を示す。同一分子中の複数のＲ^１及びＲ^２は、それぞれ同一でも異なっていてもよい。リンポルフィリン化合物がリン原子に結合するアルコキシ基（−ＯＲ^１）等を有していることにより、光増感剤としての高い感度を維持しながら、水に対する溶解性を高めることができる。生体内で生体分子を損傷させるためには、光増感剤が高い水溶性を有していることが望ましい。

Ｒ^１は、炭素数１〜４のアルキル基であってもよく、直鎖、分岐又は環状のアルキル基であってもよい。これらは上記置換基によって置換されていてもよい。Ｒ^１は、例えば、メチル基、エチル基、２−ヒドロキシエチル基（−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ）、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、３−ヒドロキシプロピル基（−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ）、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基及びこれらの基の１個以上の水素原子をフッ素原子に置換して形成される基であってもよい。フッ素原子を有するＲ^１の例としては、ジフルオロエチル基（−ＣＨ_２ＣＨＦ_２）、トリフルオロエチル基（−ＣＨ_２ＣＦ_３）、トリフルオロプロピル基（−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＦ_３等の異性体を含む）、ヘキサフルオロプロピル基（−ＣＨ_２（ＣＦ_３）_２等の異性体を含む）、トリフルオロブチル基（−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＦ_３等の異性体を含む）、ヘキサフルオロブチル基（−ＣＨ_２ＣＦ_２ＣＨＦＣＦ_３等の異性体を含む）、ヘプタフルオロブチル基（−ＣＨ_２ＣＦ_２ＣＦ_２ＣＦ_３等の異性体を含む）、及びノナフルオロブチル基（−Ｃ（ＣＦ_３）_３等の異性体を含む）が挙げられる。リンポルフィリン化合物の水溶性の観点からは、Ｒ^１は、メチル基、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基（２−ヒドロキシエチル基、３−ヒドロキシプロピル基等）、アミノメチル基、２−アミノエチル基、３−アミノ−１−プロピル基、及び４−アミノ−１−ブチル基から選ぶことができる。

式（１）中のＲ^２は炭素数１〜４の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基である。ポルフィリン環がこのような特定の置換フェニル基で置換されているリンポルフィリン化合物は、吸収極大波長が、より長波長にシフトし得るため、長波長の光の作用により、低酸素下でも電子移動反応によって生体分子を効率的に損傷させることができる。生体分子の特に効率的な損傷のために、Ｒ^２は、メチル基、エチル基、及びトリフルオロエチル基から選ばれる基であってもよい。

他の実施形態に係る生体分子損傷剤は、下記一般式（２）で表されるカチオンと、任意のアニオンとから構成されるリンポルフィリン化合物を含む。

式（２）中のＲ^２は、式（１）中のＲ^２と、その好適な態様も含めて同義である。Ｘはブロモ基又はクロロ基を示す。式（２）のカチオンを有するリンポルフィリン化合物も、ポルフィリン環が特定の置換フェニル基で置換されていることから、長波長の光の作用により、低酸素下でも電子移動反応によって生体分子を効率的に損傷させることができる。

リンポルフィリン化合物を構成するアニオンは、式（１）又は（２）のカチオンの対アニオンとして機能し得るものであれば制限はないが、生体分子損傷剤が生体に投与される場合、薬学的に許容される塩を形成するアニオンが選択される。アニオンの具体例としては、Ｃｌ⁻、Ｂｒ⁻等のハロゲン化物イオンがある。

生体分子損傷剤は、上記リンポルフィリン化合物のみを有効成分として含んでいてもよい。当業者には理解されるように、生体分子損傷剤は、水等の溶媒を含んでいてもよいし、他の任意の成分を更に含んでいてもよい。生体分子損傷剤におけるリンポルフィリン化合物の濃度は、生体分子損傷剤の質量を基準として、例えば０．０１質量％以上又は９０質量％以上であってもよいし、１００質量％以下であってもよい。

生体分子損傷剤は、光の照射により標的とする細胞の生体分子を損傷させるための光増感剤として用いることができる。例えば、生体分子損傷剤を患者に投与すること、及び生体内の標的細胞が有する生体分子を光の照射により選択的に損傷させることの両方を含む、光線力学的療法のための光増感剤として生体分子損傷剤を用いることができる。あるいは、生体分子損傷剤を、細菌感染した歯又は歯肉の光殺菌治療等のための光殺菌剤として用いることもできる。

本実施形態に係る生体分子損傷剤によれば、低酸素下であっても、電子移動機構によって効率的に標的細胞のタンパク質分子等の生体分子を攻撃し、標的細胞を死滅させることができる。電子移動機構は、光の照射により励起された分子が、生体分子から直接電子を引き抜くことにより、生体分子を酸化損傷させる機構である。電子移動機構は、酸素を必要とする一重項酸素機構と比較して、低酸素下でも生体分子に対してより有効に作用することができる。腫瘍細胞（がん細胞）を含む腫瘍組織は一般に低酸素下にあるが、電子移動機構によれば、腫瘍細胞のような低酸素下の標的細胞を効率的に攻撃することができる。

加えて、本実施形態に係る生体分子損傷剤は、人体への影響が少なく、生体内組織の深部に到達する５５０〜６７０ｎｍ程度の長波長の光の照射によって、生体分子を効率的に損傷させることができる。言い換えると、生体分子損傷剤を、５５０〜６７０ｎｍの波長の光を照射することを含む方法により、生体分子を損傷させるための光増感剤として用いることができる。用いられる光の波長は、６００〜６７０ｎｍであってもよい。

式（２）で表されるリンポルフィリン化合物は、例えば、下記一般式（１０）で表される置換テトラフェニルポルフィリンと塩化ホスホリル又は臭化ホスホリルとの反応により得ることができる。式（１０）の置換テトラフェニルポルフィリンは、当業者であれば、置換ベンズアルデヒド及びピロール、又は、ポルフィリン等を出発物質とする公知の合成経路により容易に製造することができる。

式（１）で表されるリンポルフィリン化合物は、例えば、式（２）で表されるカチオンを有するリンポルフィリン化合物とＲ^１ＯＨで表される化合物（Ｒ^１は水酸基、アミノ基、アンモニウム基及びフルオロ基から選ばれる少なくとも１種の置換基で置換されていてもよい炭素数１〜４の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基を示す。）とを反応させて、リンポルフィリン化合物を生成させる工程を備える方法により、製造することができる。この反応は、メタノール等の溶媒中で行ってもよく、そこに塩基を加えてもよい。用いられる塩基としては、特に限定されないが、例えば、ピリジンが挙げられる。塩基は、乾燥処理されたものであってもよい。Ｒ^１ＯＨとの反応性の観点からは、式（２）中のＸはクロロ基であってもよい。

上記工程は、必要により加熱しながら行うことができる。加熱温度は出発原料、塩基、Ｒ_１ＯＨで表される化合物、その他反応に用いる試薬によって異なるが、加熱還流しながら反応を行うことができる。反応時間は、通常、数時間〜数日程度である。また、本工程は、乾燥条件下で行うことができる。

以下、実施例を挙げて本発明について更に具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１〜３において得られた化合物の構造は、^１Ｈ−ＮＭＲ（ＪＥＯＬ，ＪＮＭ−ＡＬ−３００）、質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ，ＪＥＯＬ，ＴｈｅＭＳｔａｔｉｏｎＪＭＳ−７００）で確認した。

実施例１：ジクロロリン（Ｖ）テトラキス（４−メトキシフェニル）ポルフィリンクロライド（Ｃｌ₂Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ）の合成

５，１０，１５，２０−テトラキス（４−メトキシフェニル）ポルフィリン（東京化成工業株式会社製）２００ｍｇを１２ｍＬの乾燥ピリジンに溶かした。そこに、４．２ｇの塩化ホスホリルを加え、７２時間加熱還流した。このとき、塩化カルシウム管を還流管上部に取り付け、空気中の水分の混入を避けた。その後、反応液の溶媒をロータリーエバポレーターを用いて留去した。展開溶媒をクロロホルム：メタノール＝４：１としたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて反応物を精製し、ジクロロリン（Ｖ）テトラキス（４−メトキシフェニル）ポルフィリンクロライド（Ｃｌ₂Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ）を２３０ｍｇ得た。
¹H-NMR(CDCl₃,TMS):δ4.03(s,12H,meso-phenyl-OCH₃),7.30(d,8H,J_H-H=7.5Hz,meso-m-phenyl-H),7.90(d,8H,J_H-H=7.5Hz,meso-o-phenyl-H),9.12(d,8H,J_H-H=3.0Hz,βH).
FAB-MS:m/z833.2(M⁺).

実施例２：ジメトキシリン（Ｖ）テトラキス（４−メトキシフェニル）ポルフィリンクロライド（ＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ）の合成

実施例１で得られたＣｌ₂Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ（５５ｍｇ）を、０．５ｍＬの乾燥ピリジンを含む５ｍＬの乾燥メタノールの混合液に溶かし、７８℃で１０時間加熱還流した。その後、反応液の溶媒をロータリーエバポレーターを用いて留去した。展開溶媒をクロロホルム：メタノール＝５：１としたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて、反応物を精製し、ジメトキシリン（Ｖ）テトラキス（４−メトキシフェニル）ポルフィリンクロライド（ＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ）を５２ｍｇ得た。
¹H-NMR(CDCl₃,TMS):δ-1.86(d,6H,J_P-H=27Hz,P-OCH₃),4.04(s,12H,meso-phenyl-OCH₃),7.30(d,8H,J_H-H=9.0Hz,meso-m-phenyl-H),7.86(d,8H,J_H-H=9.0Hz,meso-o-phenyl-H),9.06(d,8H,J_H-H=3.0Hz,βH).
FAB-MS:m/z825.3(M⁺).

実施例３：ジエチレングリコキシリン（Ｖ）テトラキス（４−メトキシフェニル）ポルフィリンクロライド（ＥＧ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ）の合成

実施例１で得られたＣｌ₂Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ（７０ｍｇ）を２ｍＬの乾燥エチレングリコールと１ｍＬの乾燥ピリジンとの混合液に溶かし、１４５℃で３時間加熱還流した。その後、反応液の溶媒をロータリーエバポレーターを用いて留去した。次いで、分液ロートを用いた水とクロロホルムの液−液抽出により、残渣から反応物を分離した。展開溶媒をクロロホルム：メタノール＝５：１としたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて、反応物を精製し、ジエチレングリコキシリン（Ｖ）テトラキス（４−メトキシフェニル）ポルフィリンクロライド（ＥＧ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ）を７３ｍｇ得た。
¹H−NMR(CDCl₃,TMS):δ-2.30〜-2.22(m,4H,P-OCH₂CO),0.71(brs,4H,P-OCCH₂O),1.25(s,2H,P-OCCOH),3.99(s,12H,meso-phenyl-OCH₃),7.25(d,8H,J_H-H=9.0Hz,meso-m-phenyl-H),7.91(d,8H,J_H-H=9.0Hz,meso-o-phenyl-H),9.00(brs,8Ｈ,βH).
FAB-MS:m/z885.3(M⁺).

＜Ｃｌ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ、ＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ及びＥＧ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰの物性値評価＞
（吸収スペクトル）
Ｃｌ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ、ＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ及びＥＧ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰの吸収スペクトルを、分光光度計（島津製作所，ＵＶ−１６５０ＰＣ）を用いて測定した。測定には、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）を使用した。

（蛍光分析）
Ｃｌ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ、ＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ及びＥＧ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰについて、蛍光極大波長、蛍光量子収率を測定した。測定は、分光蛍光光度計（株式会社日立ハイテクフィールディング製，Ｆ−４５００）を用い、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）中で行った。

（蛍光寿命測定）
Ｃｌ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ、ＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ及びＥＧ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰについて、蛍光寿命τ_fを測定した。測定は、蛍光寿命測定装置（株式会社堀場製作所製、ＴｅｍＰｒｏ）を用い、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）中で行った。

（一重項酸素生成量子収率）
Ｃｌ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ、ＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ及びＥＧ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰの一重項酸素生成量子収率を、以下の方法により算出した。すなわち、近赤外発光分光測定装置（浜松ホトニクス株式会社製，ＮＩＲ−ＰＩＩシステム）により、蒸留水中における一重項酸素の発光強度を測定した。測定された発光強度の、メチレンブルーによる一重項酸素の発光強度（蒸留水中での一重項酸素生成量子収率０．５２）に対する相対的な比率を一重項酸素生成量子収率とした。なお、発光強度の測定には、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）を使用した。

（水への溶解性）
Ｃｌ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ、ＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ及びＥＧ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰの２５℃の蒸留水に対する溶解度を測定した。

Ｃｌ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ、ＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ及びＥＧ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰの水に対する溶解度Ｃ、吸収極大波長λ^Ａ _ｍａｘ、蛍光極大波長λ^ｆ _ｍａｘ、蛍光量子収率Φ_ｆ、蛍光寿命τ_ｆ、一重項酸素生成量子収率Φ_Δを表1に示す。また、測定した吸収スペクトルを図１に示す。

表１及び図１に示すように、Ｃｌ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ、ＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ及びＥＧ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰは、５５０〜６７０ｎｍ付近に吸収極大波長を有していることが確認された。また、ＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ及びＥＧ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰの吸収波長は、Ｃｌ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰよりも更に長波長側にシフトしていることが確認された。さらに、表１に示すように、いずれの化合物も高い蛍光量子収率を有し、蛍光寿命も十分長いことが確認された。また、一重項酸素生成量子収率の値から、いずれの化合物も、赤色光を照射することにより一重項酸素を発生できることが確認された。ＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ及びＥＧ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰは、水に対する高い溶解度を有することも確認された。

＜タンパク質に対する光損傷作用の評価＞
Ｃｌ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ、ＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ及びＥＧ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰの光損傷作用を以下の方法により評価した。

（電子移動寄与率）
５μＭのＣｌ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰと１０μＭのヒト血清アルブミン（水溶性タンパク質、ＨＳＡ）をそれぞれ含む１．２ｍＬの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）を、Ｃｌ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰの評価用溶液１として調製した。同様にして、ＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ及びＥＧ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰそれぞれについて、評価用溶液１を調製した。

光損傷作用の作用機構を確認するため、上記評価用溶液１（１．２ｍＬ）それぞれに一重項酸素の消去剤であるアジ化ナトリウム（０．７８ｍｇ）を添加し、評価用溶液２を作製した。

Ｃｌ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ、ＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ及びＥＧ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰの評価用溶液１及び２に対し、赤色発光ダイオード光源（ＣＣＳ株式会社製、ＩＳＬ−１５０Ｘ１５０−ＲＲ、極大波長: ６５９ｎｍ、２ｍＷ・ｃｍ^−２）を用いて赤色光を照射し、そのときのＨＳＡ中のトリプトファン残基の自家蛍光を分光蛍光光度計（株式会社日立ハイテクフィールディング製、６５０−６０）を用いて測定した。この自家蛍光強度は、評価用溶液に含まれる損傷されていないＨＳＡ量に比例する。赤色光の照射前の自家蛍光強度と比較した自家蛍光強度の減少量から、ＨＳＡの損傷量を求めた。図２は、評価用溶液１に対する赤色光の照射時間とＨＳＡの損傷量との関係を示すグラフである。赤色光の照射時間と自家蛍光強度との関係から、ＨＳＡの単位時間当たりの損傷量（損傷速度、図２のグラフの傾き）を算出した。評価用液２におけるＨＳＡ損傷が全て電子移動機構によるものとみなし、評価用液１におけるＨＳＡ損傷速度に対する、評価用液２におけるＨＳＡ損傷速度の比率を、電子移動寄与率として算出した。

（タンパク質損傷の量子収率）
下記式により、タンパク質損傷の量子収率Φ_Ｄを算出した。
Φ_Ｄ＝（ＨＳＡの損傷速度）／（リンポルフィリン化合物が単位時間当たりに吸収する光子数）
ＨＳＡの損傷速度は、図２のグラフの近似直線の傾きから計算した。Ｃｌ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ、ＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ及びＥＧ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰが単位時間当たりに吸収する光子数は、各化合物の吸収スペクトルと赤色発光ダイオード光源の発光スペクトルの重なりから計算した。

表２に評価結果を示す。表２には、非特許文献１に記載されている光増感剤（ＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ及びＨ_２ＴＭＰｙＰ）のタンパク質損傷の量子収率Φ_Ｄをあわせて示す。

表２に示すように、Ｃｌ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ、ＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ及びＥＧ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰは高いタンパク質損傷の量子収率を有していることが確認された。Ｃｌ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ、ＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ及びＥＧ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰのタンパク質損傷の量子収率は、ＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ及びＨ_２ＴＭＰｙＰのタンパク質損傷の量子収率（文献値）よりも遥かに高い。また、一重項酸素の消去剤を用いた測定結果から、Ｃｌ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ及びＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰのタンパク質に対する光損傷作用は、主に電子移動機構によるものであり、ＥＧ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰのタンパク質に対する光損傷作用は、一重項酸素機構及び電子移動機構の両方によるものであることが支持された。

（ヒト血清アルブミン含有時の蛍光寿命測定）
評価用液１を用いて、ヒト血清アルブミン（１０μＭ）含有時のＣｌ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ、ＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ及びＥＧ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰの蛍光寿命τ_ｆ ^*（短寿命成分τ_ｆ１ ^*、長寿命成分τ_ｆ２ ^*）を測定した。その結果と、それぞれの化合物単独の蛍光寿命τ_fに基づいて、下記式を用いて電子移動速度定数ｋ_ｅｔを算出した。

Ｃｌ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ、ＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ及びＥＧ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰの蛍光寿命τ_ｆ、ヒト血清アルブミン（１０μＭ）含有時のＣｌ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ、ＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ及びＥＧ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰの蛍光寿命τ_ｆ ^*（短寿命成分τ_ｆ１ ^*、長寿命成分τ_ｆ２ ^*）及び電子移動速度定数ｋ_etを表３に示す。

リンポルフィリン化合物単独の試料に関しては、単一の蛍光寿命の成分が確認された。一方、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む試料の場合、蛍光寿命τ_ｆよりも長い寿命の成分、及び蛍光寿命τ_ｆよりも短い寿命の成分が観測された。長い寿命の成分は、リンポルフィリン化合物とタンパク質分子との相互作用により、励起状態の振動緩和が抑制されて寿命が長くなった成分であると考えられる。短い寿命の成分は、ポルフィリンの励起一重項状態の蛍光寿命が、タンパク質のトリプトファン残基から電子を引き抜くことにより短縮された成分であると考えられる。すなわち、これらの結果は、リンポルフィリン化合物が、電子移動機構によるタンパク質の損傷を生じさせていることを支持している。

【００１４】
［００５５］
光損傷作用の作用機構を確認するため、上記評価用溶液１（１．２ｍＬ）それぞれに一重項酸素の消去剤であるアジ化ナトリウム（０．７８ｍｇ）を添加し、評価用溶液２を作製した。
［００５６］
Ｃｌ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ、ＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ及びＥＧ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰの評価用溶液１及び２に対し、赤色発光ダイオード光源（ＣＣＳ株式会社製、ＩＳＬ−１５０Ｘ１５０−ＲＲ、極大波長：６５９ｎｍ、２ｍＷ・ｃｍ^−２）を用いて赤色光を照射し、そのときのＨＳＡ中のトリプトファン残基の自家蛍光を分光蛍光光度計（株式会社日立ハイテクフィールディング製、６５０−６０）を用いて測定した。この自家蛍光強度は、評価用溶液に含まれる損傷されていないＨＳＡ量に比例する。赤色光の照射前の自家蛍光強度と比較した自家蛍光強度の減少量から、ＨＳＡの損傷量を求めた。図２は、評価用溶液１に対する赤色光の照射時間とＨＳＡの損傷量との関係を示すグラフである。赤色光の照射時間と自家蛍光強度との関係から、ＨＳＡの単位時間当たりの損傷量（損傷速度、図２のグラフの傾き）を算出した。評価用液２におけるＨＳＡ損傷が全て電子移動機構によるものとみなし、評価用液１におけるＨＳＡ損傷速度に対する、評価用液２におけるＨＳＡ損傷速度の比率を、電子移動寄与率として算出した。
［００５７］
（タンパク質損傷の量子収率）
下記式により、タンパク質損傷の量子収率Φ_Ｄを算出した。
Φ_Ｄ＝（ＨＳＡの損傷速度）／（リンポルフィリン化合物が単位時間当たりに吸収する光子数）
ＨＳＡの損傷速度は、図２のグラフの近似直線の傾きから計算した。Ｃｌ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ、ＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ及びＥＧ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰが単位時間当たりに吸収する光子数は、各化合物の吸収スペクトルと赤色発光ダイオード光源の発光スペクトルの重なりから計算した。
［００５８］
表２に評価結果を示す。表２には、非特許文献１に記載されている光増感剤（ＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＰＰ及びＨ_２ＴＭＰｙＰ）のタンパク質損傷の量子収率Φ_Ｄをあわせて示す。

【００１５】
［００５９］
［表２］

［００６０］
表２に示すように、Ｃｌ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ、ＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ及びＥＧ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰは高いタンパク質損傷の量子収率を有していることが確認された。Ｃｌ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ、ＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ及びＥＧ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰのタンパク質損傷の量子収率は、ＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＰＰ及びＨ_２ＴＭＰｙＰのタンパク質損傷の量子収率（文献値）よりも遥かに高い。また、一重項酸素の消去剤を用いた測定結果から、Ｃｌ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ及びＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰのタンパク質に対する光損傷作用は、主に電子移動機構によるものであり、ＥＧ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰのタンパク質に対する光損傷作用は、一重項酸素機構及び電子移動機構の両方によるものであることが支持された。
［００６１］
（ヒト血清アルブミン含有時の蛍光寿命測定）
評価用液１を用いて、ヒト血清アルブミン（１０μＭ）含有時のＣｌ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ、ＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ及びＥＧ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰの蛍光寿命τ_ｆ ^＊（短寿命成分τ_ｆ１ ^＊、長寿命成分τ_ｆ２ ^＊）を測定した。その結果と、それぞれの化合物単独の蛍光寿命τ_ｆに基づいて、下記式を用いて電子移動速度定数ｋ_ｅｔを算出した。
［００６２］
［数１］

［００６３］
Ｃｌ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ、ＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ及びＥＧ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰの蛍光寿命τ_ｆ、ヒト血清アルブミン（１０μＭ）含有時のＣｌ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ、ＭｅＯ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰ及びＥＧ_２Ｐ（Ｖ）ＴＭＰＰの蛍光寿

Claims

下記一般式（１）で表されるカチオンを有するリンポルフィリン化合物。

［式（１）中、Ｒ¹は水酸基、アミノ基、アンモニウム基及びフルオロ基から選ばれる少なくとも１種の置換基で置換されていてもよい炭素数１〜４の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基を示し、Ｒ^２は炭素数１〜４の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基を示し、同一分子中の複数のＲ^１及びＲ^２は、それぞれ同一でも異なっていてもよい。］
請求項１に記載のリンポルフィリン化合物を製造する方法であって、
下記一般式（２）で表されるカチオンを有する化合物と、Ｒ^１ＯＨで表される化合物（Ｒ^１は水酸基、アミノ基、アンモニウム基及びフルオロ基から選ばれる少なくとも１種の置換基で置換されていてもよい炭素数１〜４の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基を示す。）とを反応させて、前記一般式（１）で表されるリンポルフィリン化合物を生成させる工程を備える、方法。

［式（２）中、Ｘはブロモ基又はクロロ基を示し、Ｒ^２は炭素数１〜４の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基を示し、同一分子中の複数のＲ^２は、同一でも異なっていてもよい。］
下記一般式（１）又は（２）で表されるカチオンを有するリンポルフィリン化合物を含む、生体分子損傷剤。

［式（１）中、Ｒ¹は水酸基、アミノ基、アンモニウム基及びフルオロ基から選ばれる少なくとも１種の置換基で置換されていてもよい炭素数１〜４の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基を示し、Ｒ^２は炭素数１〜４の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基を示し、同一分子中の複数のＲ^１及びＲ^２は、それぞれ同一でも異なっていてもよい。］

［式（２）中、Ｘはブロモ基又はクロロ基を示し、Ｒ^２は炭素数１〜４の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基を示し、同一分子中の複数のＲ^２は、同一でも異なっていてもよい。］
５５０〜６７０ｎｍの光を照射することを含む方法によって生体分子を損傷させるために用いられる、請求項３に記載の生体分子損傷剤。