JPWO2015046388A1 - 骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の予防、治療または転移の予防のための薬剤、動脈塞栓術用局所注入剤、および、人工骨 - Google Patents

骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の予防、治療または転移の予防のための薬剤、動脈塞栓術用局所注入剤、および、人工骨 Download PDF

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Abstract

本発明は、PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質を有効成分として含有する、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の予防、治療または転移の予防のための薬剤、動脈塞栓術用局所注入剤、および、人工骨を提供する。本発明の予防剤、治療剤もしくは転移予防剤、ならびに、動脈塞栓術用局所注入剤もしくは人工骨は、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫にアポトーシスを引き起こして腫瘍を消滅させることができ、また、脂肪細胞へ分化誘導して腫瘍を消滅させることのできる根本的な治療剤ないし治療材料である。【選択図】87

Description

本発明は、PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質を用いる骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の予防剤、治療剤または転移予防剤などに関する。本発明はまた、PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質を含む、動脈塞栓術用局所注入剤または人工骨に関する。本発明は、さらに、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫にアポトーシスまたは脂肪細胞分化を誘導する物質を骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の予防剤、治療剤または転移予防剤として選択するためのスクリーニング方法に関する。
骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍として、骨に発生する骨巨細胞腫（Giant Cell Tumor of Bone、以下「GCTB」という。）、軟部に発生する限局型の腱鞘巨細胞腫（Giant Cell Tumor of Tendon Sheath-Localized Type、以下、「GCTT」という。）、色素性絨毛結節性滑膜炎（Pigmented Villonodular Synovitis、以下、「PVNS」という。）などが知られている。本明細書においては、GCTBとGCTTとPVNSを併せて巨細胞性腫瘍（Giant Cell Tumors）という。一般に、巨細胞性腫瘍のうち、特に腱鞘巨細胞腫（GCTT）と色素性絨毛結節性滑膜炎（PVNS）を併せて、腱鞘巨細胞腫と総称することがある。本明細書においては、単に腱鞘巨細胞腫といえば狭義の限局型の腱鞘巨細胞腫（GCTT）を指して用い、広義の腱鞘巨細胞腫を指す場合には腱鞘巨細胞腫群（Tenosynovial Giant Cell Tumors）の用語を用いる。
また、骨・軟部に発生する腫瘍として、軟骨肉腫が知られている。同様に、骨組織に原発する悪性腫瘍として、骨肉腫が知られている。
骨巨細胞腫(GCTB)は、若年〜中高年の膝関節周囲に好発する良性腫瘍であり、骨原発腫瘍の3〜8%、良性骨腫瘍の15〜20%を占める。骨巨細胞腫(GCTB)の罹患率は、やや女性が高く、男女比は1:1.3〜1.5である。骨巨細胞腫(GCTB)は、20歳〜45歳に好発し、日本では年間約150人が新たに発症すると言われている。骨巨細胞腫(GCTB)は、全骨腫瘍のうちの約5%、良性骨腫瘍のうちの約20%を占めている。
骨巨細胞腫(GCTB)の発生部位としては、長管骨に発生しやすく、半数近くが大腿骨遠位端（つまり膝の上）または脛骨近位端（つまり膝の下）に発生する。これらに次ぐ骨巨細胞腫(GCTB)の好発部位としては、橈骨遠位端（つまり、肘と手首をつなぐ２本の骨のうちの親指側の骨である橈骨の親指の付け根に接する部分）、上腕骨近位端（つまり肩の下）、仙骨（つまり骨盤の中央に位置する背骨の下端近くの逆三角形の骨）の順に発生頻度が高い。骨巨細胞腫(GCTB)に特有の症状はなく、自覚症状は、骨強度の低下に伴う微小骨折による患部の痛み、自発痛、荷重時痛、腫脹、温感、関節が動きにくくなるなどの非特異的な症状である。
骨巨細胞腫(GCTB)は、良性腫瘍に分類されるが、増大速度は速く、再発率が10〜30%と高いなど、悪性と良性の中間の性質を有している。骨巨細胞腫は、1〜10年の間で数％が肺に転移し、そのうち、25%が腫瘍の増殖により死に至る。骨巨細胞腫(GCTB)は、稀に高悪性度肉腫に転化する場合があり、この場合の予後は、化学療法と広範切除による治療後の5年生存率が50%と報告されている。
成長軟骨板の閉鎖によって身長の伸びが停止する前に発生した骨巨細胞腫や早期に発見された骨巨細胞腫は骨幹端（つまり関節の一部である骨端よりも骨幹側に位置する長管骨の骨幹の端の部分）に存在するため、基本的には骨幹端に発生してすみやかに骨端に浸潤する腫瘍と考えられている。病理所見では多核巨細胞と単球細胞の増生が主体で、間に紡錘形細胞をみとめる。多核巨細胞は、形態と機能が破骨細胞に類似する。骨巨細胞腫の腫瘍の本体は、間質に存在する繊維芽細胞や骨芽細胞に類似した紡錘形細胞であって、多核巨細胞と単球細胞は、腫瘍細胞の産生するサイトカインに反応して集まってきている細胞であると考えられている。骨巨細胞腫は、おそらく、骨髄内の未分化間葉系細胞に由来する腫瘍であろうと考えられているが、細胞起源は不明である。
骨巨細胞腫(GCTB)の根本的な治療法は、切除手術のみである。通常の切除手術では、病巣を掻爬ないし切除した後に、残存する腫瘍細胞を死滅させて再発を防ぐ目的で、フェノール処理、アルコール処理、塩化亜鉛処理、液体窒素による凍結、メチルメタクリレート骨セメントの重合熱による温熱処理が行われており、これらの処理をしなかった場合の30〜50%の再発率を10〜25%に下げることに成功している。
骨巨細胞腫(GCTB)は、致死的な経過をたどることが稀ではあるものの、再発を繰り返すことにより、骨および関節の運動機能が徐々に損なわれるとともに手術による神経障害が生じて、生活の質が大きく損なわれる疾患であるので、手術によらず、再発や肺転移をもたらさない、内科的な治療方法が望まれている。
なお、手術によらない骨巨細胞腫(GCTB)の治療法としては、抗RANKLヒト型モノクローナル抗体であり、多発性骨髄腫による骨病変及び固形癌骨転移による骨病変の治療薬として臨床使用されているデノスマブ（商品名：ランマーク）の骨巨細胞腫への適用が検討されているが、破骨細胞の形成・活性化に必要なＲＡＮＫＬ蛋白質の機能を抑えることによって骨の破壊を防ぐことを意図した治療薬であるので、腫瘍の増殖自体を抑えることを目的とした治療薬ではなく、投与ルートも皮下投与となる。
したがって、経口服用可能で、腫瘍の増殖自体を抑えることのできる骨巨細胞腫(GCTB)の治療薬が望まれている。
腱鞘巨細胞腫(GCTT)は、四肢末梢の関節及び腱鞘周辺に好発する軟部腫瘍であり、特に、手指の指節間関節周囲の腱鞘に隣接して発生する例が圧倒的に多い。腱鞘巨細胞腫(GCTT)は、手指の関節近傍や屈筋腱上に約85%が発生し、次いで足趾に発生する。腱鞘巨細胞腫(GCTT)は、骨内に浸潤することもある。腱鞘巨細胞腫(GCTT)は、結節性腱鞘滑膜炎（nodular tenosynovitis）と同義であるが、炎症性疾患ではなく、腫瘍である。腱鞘巨細胞腫(GCTT)の正確な発生頻度を記載した報告は知られていないが、整形外科医が治療目的に切除する良性軟部腫瘍の中では脂肪腫、神経鞘腫に次いで多い疾患であり、稀な疾患ではない。腱鞘巨細胞腫(GCTT)は、30〜50歳代の成人、特に女性に多く、男女比は1:2と報告されている。腱鞘巨細胞腫(GCTT)の自覚症状は特になく、痛みのあまりない手指の皮下腫瘤として発症し、緩徐な発育を示し医師の診察を受けるまでに数年を経ていることが一般的である。
病理的には、腱鞘巨細胞腫(GCTT)は境界の鮮明な腫瘤中に、卵円形〜紡錘形の組織球様単核細胞のびまん性増殖と破骨細胞様の多核巨細胞が混在している。腱鞘巨細胞腫(GCTT)の原因は不明であり、腫瘍細胞の起源も不明である。
腱鞘巨細胞腫(GCTT)は、良性腫瘍に分類されており、致死的な経過を辿ることはほとんどないものの、周囲に増殖して広がる傾向が強く、摘出手術を行っても、20〜30%が再発する。腱鞘巨細胞腫(GCTT)は、腱鞘に強く付着しているため切除しにくく、摘出手術を行うと伸筋腱や屈筋腱の癒着および神経や血管の損傷を生じやすい。また、腱鞘巨細胞腫(GCTT)が進行すると、骨、関節及び靭帯が破壊される。そのため、手術によらず、再発や肺転移をもたらさない、内科的な腱鞘巨細胞腫(GCTT)の治療方法が望まれている。また、経口服用可能で、腫瘍の増殖を抑えることのできる腱鞘巨細胞腫(GCTT)の治療薬が望まれている。
色素性絨毛結節性滑膜炎（PVNS）は、40歳以下の比較的若年成人に発症する良性腫瘍であり、やや女性に多く発症する。PVNSの発症部位は、膝関節が最も多く、股・足・肘・肩関節などの大型関節およびその周囲に発症することが多い。PVNSとは、関節の内側を覆っている滑膜の組織が異常に増殖し、腫瘤ができて出血を繰り返す病気である。絨毯の毛の様にあたり一面にびっしり腫瘤が発生する「びまん型」と、腫瘤が点々と連なって発生する「限定型（結節型）」とがあり、両方同時に見られるケースも少なくない。
自覚症状としては、関節が腫れて鈍く痛む、関節がひっかかるような感じがする、一定以上曲げ伸ばしができない、膝が熱く感じる、などがあり、しばしば、関節内に血がたまる。
PVNSは、WHO分類ではびまん型巨細胞腫と同義とされており、良性の軟部腫瘍に分類されている。たしかに、PVNSの腫瘤自体は、ほかの臓器や器官に転移することはなく、ゆっくりと発育するので生命に関わるものではない。しかしながら、PVNSを放置すると骨の変形・破壊が進み、変形性膝関節症を引き起こして、患者の生活の質を大きく損なうため、早めの治療が必要な疾患である。またPVNSはびまん性に浸潤するために完全切除が難しく、患者の約50%が再発する。組織学的には、滑膜細胞様の単核細胞がびまん性の増殖を示し、破骨細胞様の多核巨細胞、泡沫細胞、ヘモジデリン貪食細胞、炎症性細胞などが混在する。PVNSの細胞起源は不明である。
PVNSの治療法は、切除手術のみである。PVNSの切除手術は、内視鏡下で、または、関節を切開して、増殖した滑膜を切除することになるが、関節包や靭帯組織を損傷しないように手術したとしても、骨への浸潤があるときにはこれも掻爬除去する必要があり、骨への浸潤の程度によっては、人工関節や四肢の切断が必要になることもある。
したがって、手術によらない、内科的な治療方法が望まれている。また、経口服用可能で、腫瘍の増殖を抑えることのできるPVNSの治療薬が望まれている。
このように、骨巨細胞腫、腱鞘巨細胞腫、PVNSはいずれも、現時点では手術以外の有効な治療法は開発されていない。
軟骨肉腫は原発性悪性骨腫瘍の約20%を占め、骨肉腫に次いで頻度が高い悪性腫瘍である。20〜60歳代と幅広い年齢層の人に発症し、中でも40歳以上の中・高年に比較的多く見られ全体の半数近くを占める。男女比では男性が女性の約２倍発症する。
軟骨肉腫の発症部位としては、大腿骨（つまり膝の太ももの骨）、上腕骨（つまり肘から肩にかけての骨）、骨盤、肋骨、肩甲骨、扁平骨によく発症し、全体の7〜8割を占める。
軟骨肉腫の自覚症状としては、患部の腫れや運動障害で気づくことが多いが、痛みの少ない固い腫瘤や、骨折による痛みで気づくこともある。軟骨肉腫は、組織像としては、豊富な硝子軟骨基質あるいは粘液性基質を有し、分葉状に増殖する。一般に軟骨肉腫の組織像としては(1)細胞成分が多いこと、(2)核の肥大、(3)肥大した2核細胞の出現、(4)多核のクロマチンに富む巨態軟骨細胞の出現などが挙げられる。軟骨肉腫の腫瘍の境界は比較的明瞭であるが、骨梁（つまり長管骨の骨端の海綿質組織の、細かくほぐれた部分）の間やHavers管（つまり長管骨の骨幹の緻密質の骨層板の集合の中央にある血管の通路）への浸潤がみられる。軟骨肉腫の原因および細胞起源は不明である。
軟骨肉腫の根本的な治療法は切除手術のみである。軟骨肉腫に対しては、放射線治療や抗がん剤治療の効果は十分ではない。軟骨肉腫は悪性腫瘍であるため、腫瘍の周りの組織を正常組織でくるむように切除する広範切除術を行う。そのため、手術によって運動機能を損なう危険性があり、患肢の切断もやむを得ないことがある。5年生存率は70〜80%であるが、再発を繰り返して10年以上の長期的経過の後に死亡に至る例も少なくない。
したがって、手術によらない、内科的な治療方法が望まれている。また、経口服用可能で、腫瘍の増殖を抑えることのできる軟骨肉腫の治療薬が望まれている。
骨肉腫は、骨組織に原発する悪性腫瘍で、直接類骨（骨組織の構成要素で基質と繊維からなるもの）、あるいは骨を産生する悪性腫瘍である。骨肉腫は骨原発の悪性腫瘍のなかで最も多く、100万人に1〜2人の割合で発症し、年間約200人が我が国で発生する。骨肉腫患者は、10歳代が60％で、20歳代が15％を占める。男女別では、女性より男性の発生が若干多い。骨肉腫は、骨に原発する悪性腫瘍の約33％を占める。
骨肉腫は長幹骨に発生しやすく、骨肉腫の発生部位としては、膝（大腿骨遠（つまり膝の上）位と脛骨近位（つまり膝の下））が60％、股関節が15％、肩関節が10％、顎が6％という順番の発生頻度となっており、骨巨細胞腫の部位別発生頻度に類似する。骨肉腫の自覚症状としては、持続する痛みが生じ、スポーツ活動に伴って痛みを生じることから、筋肉痛と間違われる場合があるので注意が必要である。
骨肉腫の5年生存率は、施設にもよるが、転移がない場合で約70％とする報告がある。骨肉腫は骨巨細胞腫と同様に肺に転移することが多く、初診時に転移がある場合の予後は悪く、先進的な施設でも約20％の5年生存率にとどまる。
組織病理学的には、骨肉腫は、低分化の紡錘形・多核細胞肉腫であるが、組織像の幅は広く、一見反応性の骨形成もしくは線維化にしかみえないものから、骨・類骨形成の著しい硬化像を示すもの、著名な軟骨形成を示すもの、更には類骨をほとんど伴わないまったくの未分化肉腫の所見を示すものまで、かなり変化に富み、同一の腫瘍内でも部位によって表れ方が異なるのが常である。多核巨細胞の出現は必発に近く、破骨細胞様のおとなしいものから、一見して悪性と映る奇怪なものまで、質的にも量的にも様々で、時として骨巨細胞腫様の像を呈することもある。
骨肉腫の治療方法としては、主に化学療法と手術療法が行われる。骨肉腫の化学療法は、他の癌種と違って、手術前から化学療法を行うことを特徴としており、これによって、既に存在している目に見えない微小転移巣（肺，肝，骨など）を撲滅あるいは抑制できるとともに、有効な抗癌剤を判定できるので術後化学療法（手術の後に行うもの）や再発時の化学療法で使用する抗癌剤を選択することができる。現在は、シスプラチン、アドリアマイシン、イホスファミド、シクロホスファミド、エトポシド、メトトレキセート、ドキソルビシン、ブレオマイシン、カフェインを適宜組み合わせて用いることが多い。例えば、カフェイン併用療法では、シスプラチン、アドリアマイシン、カフェインが併用される。これらの抗がん剤の大半は点滴する必要がある。
骨肉腫の局所治療で最も重要なのは、原発巣の確実な切除である。しかし、若年者に多発することを考えると、運動機能の温存も重要である。近年は四肢を切断せず、患肢を温存できる場合が多くなったが、人工関節を用いざるを得ない場合には、人工関節の耐用年数は20年程度であるので、完治しても人工関節を置換するための再手術が必要になるという問題点がある。
したがって、経口服用可能で、骨肉腫細胞の増殖を抑えることができる骨肉腫の治療薬が望まれている。また、骨肉腫細胞の肺転移を抑えることができる骨肉腫の治療薬が望まれている。
このように、骨巨細胞腫(GCTB)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)、色素性絨毛結節性滑膜炎（PVNS）、軟骨肉腫、骨肉腫は、骨軟部に発生する腫瘍であり、いずれも、切除手術以外の根本的な治療法がなく、切除出術を行っても再発を繰り返して患者の生活の質が損なわれ続けるという点で共通する。しかしながら、その原因および起源細胞は不明である。骨巨細胞腫(GCTB)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)、PVNS、骨肉腫の間では、組織学的に破骨細胞様の多核巨細胞が観察される点では共通するものの、腫瘍の本体は破骨細胞様の多核巨細胞ではないと推定されており、したがって、当然ながら、骨巨細胞腫(GCTB)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)、色素性絨毛結節性滑膜炎（PVNS）、軟骨肉腫に共通するメカニズムに基づく治療方法ないし創薬の試みは知られていない。
そして、これまでに知られている骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍の治療薬に関する報告としては、本特許出願の発明者自身による報告を除けば、核酸のプリン合成系の阻害作用に基づく免疫抑制剤であるミゾリビンがインビトロでPVNSの増殖を僅かに阻害したことが報告されているのみである（特許文献１）。なお、新規性喪失の例外またはグレースピリオドが適用される本特許出願の発明者自身による報告は、先行技術として本欄に記載するわけではない。
ところで、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ（Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γ;PPARγ）は、脂肪細胞、マクロファージなどに存在する核内受容体スーパーファミリーに属する転写因子タンパクである。PPARγは、レチノイドX受容体（RXR）タンパクとヘテロ複合体を形成して存在している。
PPARγとRXRのヘテロ複合体は、PPARγアゴニストが存在しない状態では、コリプレッサータンパク複合体と結合して、ゲノム遺伝子の脂質代謝関連遺伝子のプロモーター領域に存在するPPAR応答領域（PPRE）に結合し、その下流に存在するアポトーシス関連遺伝子、リポ蛋白リパーゼ（LPL）、脂肪酸輸送蛋白（FATP）などの種々の脂質代謝関連遺伝子もしくは脂肪細胞分化関連遺伝子、動脈硬化関連遺伝子、ならびに、抗炎症関連遺伝子のmRNAの転写を抑制していると考えられている。しかし、PPARγにPPARγアゴニストが結合すると、PPARγとRXRのヘテロ複合体からコリプレッサータンパク複合体が解離するのと入れ代わるかたちで、PPARγとRXRのヘテロ複合体にコアクチベータータンパク複合体が結合して、PPAR応答領域（PPRE）の下流に存在するアポトーシス関連遺伝子、リポ蛋白リパーゼ（LPL）、脂肪酸輸送蛋白（FATP）などの種々の脂質代謝関連遺伝子もしくは脂肪細胞分化関連遺伝子、動脈硬化関連遺伝子、ならびに、抗炎症関連遺伝子のmRNAの転写を促進すると考えられている。
PPARγアゴニストとしては、イルベサルタン、テルミサルタンなどのアンジオテンシンII受容体拮抗剤、チアゾリジンジオン誘導体、非ステロイド性抗炎症剤、ならびに、15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジンJ2(15d-PGJ2)、15-hydroxyeicosatetraenoic acid(15-HETE)、9-hydroxyoctadecadienoic acid(9-HODE)、13-hydroxyoctadecadienoic acid(15-HODE)、ニトロリノール酸、酸化LDL、長鎖脂肪酸、エイコサノイド、リゾリン脂質などの内因性リガンドが知られている。なお、長鎖脂肪酸とは、分子に含まれる炭素数が11以上の脂肪酸をいう。
アンジオテンシンII受容体拮抗剤は、昇圧物質であるアンジオテンシンIIがその受容体に結合するのを阻害することにより、血圧を下げる薬剤である。イルベサルタンおよびテルミサルタンは、現在臨床使用されているアンジオテンシンII受容体拮抗剤であり、アンジオテンシンII受容体拮抗作用に加えて、PPARγの部分的アゴニスト（パーシャルアゴニスト）作用も有することが知られている。
アンジオテンシンII受容体拮抗剤を骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の予防、治療または転移の予防に用いうることを記載した先行技術は知られていない。
チアゾリジンジオン誘導体は、２型糖尿病の治療薬として知られており、ピオグリタゾンとロシグリタゾンが臨床使用されている。チアゾリジンジオン誘導体は、インスリン抵抗性を惹起する遊離脂肪酸、TNFα、レジスチン、MCP-1、PAI-1などを分泌する肥大化した脂肪細胞を、アポトーシスによって消滅させるか、あるいは、アディポネクチンを血中に分泌する小型の脂肪細胞に分化誘導することによって、インスリン抵抗性の改善、肝における糖産生の抑制、末梢細胞における糖取り込みの促進、脂肪酸の燃焼、インスリン受容体の感受性の亢進、動脈硬化抑制、抗炎症、心筋肥大抑制などの作用をもたらす。
チアゾリジンジオン誘導体としては、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、トログリタゾン、イサグリタゾン、ネトグリタゾン、リボグリタゾン、バラグリタゾン、ロベグリタゾン、エングリタゾン、シグリタゾンなどが知られているが、重篤な副作用を生じる場合があることから、現在、2型糖尿病の治療薬として臨床使用されている薬は、ピオグリタゾンとロシグリタゾンのみである。
ピオグリタゾン等のチアゾリジンジオン誘導体は、2型糖尿病の治療薬としての作用のほか、実験室レベルでは、大腸癌（非特許文献1、非特許文献2）、胃癌（非特許文献3、非特許文献4）、非小細胞性肺癌細胞（非特許文献5）、軟骨肉腫（非特許文献6）、悪性黒色腫（非特許文献7）の増殖を阻害することが知られている。また、抗癌活性を有するチモキノンは乳癌細胞におけるPPARγ活性を上昇させることも知られている（非特許文献8）。
上記以外に、特開2005-200419（特許文献2）の特許請求の範囲には、メバロン酸経路阻害剤とPPARγアゴニストを併用して癌を治療する方法が記載されているが、実施例の記載は皆無であることから、裏付けのない発明であり、先行技術としての意義を有さない。同様に特表2009-533467（特許文献3）の請求項9および14〜17には、チアゾリジンジオン骨格を有する一般式化合物について、癌、肉腫、骨巨細胞腫の治療用途が記載されているが、特許文献2と同様に、薬理作用を示した実施例は何ら記載されていない。
このように、本特許出願の発明者自身による報告を除けば、チアゾリジンジオン誘導体を骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍の予防、治療または転移の予防に用いうることを、科学的裏付けを伴って記載した先行技術は知られていない。
一方、非ステロイド性抗炎症剤は、アスピリン（つまりアセチルサリチル酸）に代表される抗炎症作用、鎮痛作用、解熱作用を有する非ステロイド性の薬剤であり、比較的に安全な薬剤として知られている。非ステロイド性抗炎症剤の作用機序は、シクロオキシゲナーゼ１および／またはシクロオキシゲナーゼ２の阻害活性を通じて、抗炎症作用、鎮痛作用、解熱作用をもたらすことが知られている。
非ステロイド性抗炎症剤としては、ザルトプロフェン、ジクロフェナク、インドメタシン、プログルメタシン、インドメタシンファルネシル、セレコキシブ、エトドラク、メロキシカム、モフェゾラク、アセメタシン、オキサプロジン、アセトアミノフェン、ロルノキシカム、アンピロキシカム、ピロキシカム、ナプロキセン、ロキソプロフェン、ロフェコキシブ、エテンザミド、ジフルニサル、アルミノプロフェン、ナブメトン、ケトプロフェン、アセチルサリチル酸、イブプロフェン、プラノプロフェン、スリンダクなどが知られており、頭痛、歯痛、生理痛、発熱の症状を和らげる薬として、様々な種類の薬剤が広く臨床使用されている。
なお、プログルメタシンおよびそのマレイン酸塩は、体内でインドメタシンに代謝されて効力を発揮するプロドラッグである。同じく、インドメタシンファルネシルは体内でインドメタシンに代謝されて効力を発揮するプロドラッグである。同様に、アンピロキシカムは体内でピロキシカムに代謝されて効力を発揮するプロドラッグである。
非ステロイド性抗炎症剤の腫瘍治療用途については、特開2005-343802（特許文献4）の実施例に、ヒト骨肉腫由来培養細胞であるOST細胞を移植したヌードマウスに対してケトプロフェンを経皮投与したところ、4週間後の腫瘍重量をプラセボ群の48%に減少させたことが記載されている。また、特表2006-501136（特許文献5）の特許請求の範囲には、PPARγアゴニストまたはシクロオキシゲナーゼ2の選択的阻害剤による、疼痛、炎症、がん、アルツハイマー病、心臓血管疾患の治療方法が記載されているが、薬理作用を示した実施例の結果は何ら記載されていない。
一方、PPARγアゴニストと非ステロイド性抗炎症剤の関連について記載した先行技術としては、1,2-ジメチルヒドラジン二塩酸塩を繰り返しラットに投与することによる大腸癌の発生を、ジクロフェナクまたはセレコキシブが予防すること、および、同時にこれらの薬剤が大腸におけるNF-kBのタンパク量を低下させるとともに、PPARγタンパク量を増加させることが報告されている（非特許文献9）。
また、リウマチ患者由来の滑膜細胞に対する作用として、トログリタゾン、インドメタシン、ジクロフェナク、オキサプロジン、ザルトプロフェンはPPARγを活性化するとともにアポトーシスを引き起こしてその増殖を抑制した一方で、選択的シクロオキシゲナーゼ2阻害剤であるNS-398は細胞増殖を抑制するもののPPARγの活性化とアポトーシスは引き起こさず、ケトプロフェンとアセトアミノフェンンはPPARγの活性化もアポトーシスも増殖抑制も生じさせなかったことが報告されている（非特許文献10）。
さらに、患者由来の骨巨細胞腫(GCTB)にザルトプロフェンを作用させると、骨巨細胞腫の細胞の増殖を抑制したこと、骨巨細胞腫細胞のPPARγの発現を亢進したこと、および、脂肪細胞への分化を誘導したことが、本特許出願の発明者によって報告されている（非特許文献11、非特許文献12）。
同様に、患者由来の骨巨細胞腫(GCTB)にザルトプロフェンまたはトログリタゾンを作用させると、これらの薬剤が骨巨細胞腫細胞の増殖を抑制したこと、骨巨細胞腫細胞のPPARγの発現を亢進したこと、および、ザルトプロフェンが脂肪細胞への分化を誘導したことが本特許出願の発明者によって報告されている（非特許文献13、非特許文献14、非特許文献15、非特許文献16）。
また、添付文書に記載された標準服用量である1日240mgのザルトプロフェンを4週間服用した患者の骨巨細胞腫が消失し、代わりに、PPARγの発現が亢進した脂肪細胞様の細胞が観察されたことも本特許出願の発明者によって報告されている（非特許文献13および非特許文献17）。
同様に、ザルトプロフェン、ピオグリタゾン、トログリタゾンは、軟骨肉腫細胞株であるH-EMC-SSにアポトーシスを引き起こして増殖を抑制するとともに、PPARγの発現を亢進させたことが本特許出願の発明者によって報告されている（非特許文献18、非特許文献19）。
なお、本特許出願の発明者自身による報告である上記の非特許文献１１〜19については、新規性喪失の例外またはいわゆるグレースピリオドが適用される場合には、本特許出願の先行技術とはならない。
このように、本特許出願の発明者自身による報告を除けば、非ステロイド性抗炎症剤を骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の予防、治療または転移の予防に用いうることを記載した先行技術は知られていない。
また、現在、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍の治療としては切除手術以外に根本的な治療方法があるとは考えられておらず、また、軟骨肉腫または骨肉腫の治療方法としては広範囲に切除することによって生存率を上げることが最優先課題であると考えられているため、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫を患う患者の日常活動を遂行する能力を改善するという課題は認識されていない。
WO2008/026729 特開2005-200419 特表2009-533467 特開2005-343802 特表2006-501136
Jpn J Cancer Res.1999;90:75-80 Cancer Lett.2010;297:65-74 FEBS Lett.1999;455:135-139 Zhongguo yishi zazhi 2010;12(6):743-747 Mol Pharmacol.2007;72:674-685 British Journal of Cancer 2002;86:1303-1309 Medical Oncology 2006;23(3):393-402 Biochem Pharmacol.2011;82:464-475 Tumor Biology 2010;31:427-436 J Pharmacol Exp Ther.2002;302:18-25 日本整形外科学会誌2012;86巻8号:S1319:2-9-18 日本整形外科学会誌2013;87(8):1-8-22 2013 AAOS Annual Meeting Abstract Paper 341 (2013年アメリカ整形外科学会発表要旨Paper341) 26th Eur. Musculoskeletal Oncology Society Meeting P4:103(2013年ヨーロッパ骨軟部腫瘍学会発表要旨P4:103) 日本整形外科学会誌2013;87(6):1-2-FP3-8 ISOLS 2013 AbstractN°205 (2013年国際患肢温存外科学会発表要旨N°310) Anticancer Research 2013;33:2169-2174 日本整形外科学会誌2013;87(8):1-8-20 ISOLS 2013 AbstractN°205 (2013年国際患肢温存外科学会発表要旨N°205)
本発明の目的は、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍(Giant Cell Tumors)、軟骨肉腫または骨肉腫に対する手術によらない予防方法、治療方法および転移予防方法を提供することである。本発明の目的は、また、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫に対する、経口服用可能で、腫瘍の増殖自体を抑えることのできる予防薬、治療薬および転移予防薬を提供することである。本発明の目的は、また、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫に対する、経口服用可能で、腫瘍を消滅および／または脂肪細胞へ分化誘導することのできる予防薬、治療薬および転移予防薬を提供することである。
本発明の目的は、さらに、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍(Giant Cell Tumors)、軟骨肉腫または骨肉腫の再発および／または転移を抑制することのできる薬剤を提供することである。本発明の目的は、さらにまた、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の患者の運動機能を回復し、生活の質を改善することのできる薬剤を提供することである。
さらに、本発明の目的は、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍(Giant Cell Tumors)、軟骨肉腫または骨肉腫を治療することができるとともに、その再発および／または転移を抑制することのできる動脈塞栓術用局所注入剤および／または人工骨を提供することである。本発明のさらなる目的は、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫に対する予防剤、治療剤または転移予防剤をスクリーニングするための方法を提供することである。
整形外科医師である本発明者らは、骨巨細胞腫(GCTB)の唯一の根本的な治療方法である切除手術に際して、偶然にも、切除した骨組織中に骨巨細胞に特徴的な細胞が存在せず、代わりに脂肪細胞様の細胞が存在する症例に遭遇した。特異な症例として、自然治癒の理由を見過ごしても不思議ではないところ、本発明者らは、当該患者の履歴を丹念に調べ、基本に忠実に患者自身から症状と生活状態を聴きだす中で、当該患者が骨巨細胞腫による関節の痛みを和らげるために、ザルトプロフェンを添付文書に記載された標準服用量である1日240mgの用量で4週間にわたって服用していたことに注目し、自然治癒の原因と何かの関連があることを閃き、非ステロイド性消炎鎮痛剤が骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の増殖を抑制するとともに、脂肪細胞へ分化誘導するという本発明の着想を得た。
そして、本発明者らは、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫を患う患者から切除した細胞に対して種々の非ステロイド性消炎鎮痛剤を接触させて、その増殖を阻害すること、および、PPARγの発現を誘導すること、および脂肪細胞様の細胞へ分化誘導することを確認し、さらには、非ステロイド性消炎鎮痛剤以外のPPARγアゴニストもまた、骨巨細胞腫(GCTB)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)、PVNS、軟骨肉腫の増殖を阻害することを確認して、本発明を完成するに到った。
すなわち、本発明は、
[1] PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質を有効成分として含有する、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の予防剤、治療剤または転移予防剤；
[2] PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質が、非ステロイド性抗炎症剤、チアゾリジンジオン誘導体、PPARγアゴニスト活性を有するアンジオテンシンII受容体拮抗剤、ならびに、内因性のPPARγアゴニストからなる群から選択される1以上のPPARγアゴニストである、[1]に記載の予防剤、治療剤または転移予防剤；
[3] PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質がザルトプロフェン、ジクロフェナク、インドメタシン、プログルメタシン、インドメタシンファルネシル、セレコキシブ、エトドラク、メロキシカム、モフェゾラク、アセメタシン、オキサプロジン、アセトアミノフェン、ロルノキシカム、アンピロキシカム、ピロキシカム、ナプロキセン、ロキソプロフェン、ロフェコキシブ、エテンザミド、ジフルニサル、アルミノプロフェン、ナブメトン、ケトプロフェン、アセチルサリチル酸、イブプロフェン、プラノプロフェン、スリンダクからなる群から選択される1以上の非ステロイド性抗炎症剤である、[1]または[2]に記載の予防剤、治療剤または転移予防剤；
[4] PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質が、トログリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、バラグリタゾン、リボグリタゾン、イサグリタゾン、ネトグリタゾン、ロベグリタゾン、エングリタゾン、シグリタゾンからなる群から選択される1以上のチアゾリジンジオン誘導体である、[1]〜[3]のいずれか1項に記載の予防剤、治療剤または転移予防剤；
[5] PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質が、イルベサルタン、テルミサルタンからなる群から選択される１以上のPPARγアゴニスト活性を有するアンジオテンシンII受容体拮抗剤である、[1]〜[4]のいずれか1項に記載の予防剤、治療剤または転移予防剤；
[6] PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質が、15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジンJ2、15-hydroxyeicosatetraenoic acid、9-hydroxyoctadecadienoic acid、13-hydroxyoctadecadienoic acid、ニトロリノール酸、長鎖脂肪酸からなる群から選択される1以上の内因性のPPARγアゴニストである、[1]〜[5]のいずれか1項に記載の予防剤、治療剤または転移予防剤；
[7] 骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍が、骨巨細胞腫、腱鞘巨細胞腫および色素性絨毛結節性滑膜炎からなる群から選択される、[1]から[6]のいずれか1項に記載の予防剤、治療剤または転移予防剤；
[8] さらに抗RANKL抗体を含有することを特徴とする、[1]から[7]のいずれか1項に記載の予防剤、治療剤または転移予防剤；
[9] 抗RANKL抗体がデノスマブである、[8]に記載の予防剤、治療剤または転移予防剤；
[10] さらにビスホスホネートを含有することを特徴とする、[1]から[9]のいずれか1項に記載の予防剤、治療剤または転移予防剤；
[11] ビスホスホネートが、エチドロネート、クロドロネート、チルドロネート、パミドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート、アレンドロネート、イバンドロネート、チルドロネート、インカドロネート、リセドロネート、ミノドロネート、ゾレドロネート、ソルバドロネート、メドロネート、リセンドロネート、アミノ−オルパドロネート、シマドロネート、ピリドロネート、レジドロネート、EB1053、YH 529からなる群から選択される1以上のビスホスホネートである、[10]に記載の予防剤、治療剤または転移予防剤；
[12] PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質を有効成分として含有する、動脈塞栓術用局所注入剤または人工骨；
[13] PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質が、非ステロイド性抗炎症剤、チアゾリジンジオン誘導体、PPARγアゴニスト活性を有するアンジオテンシンII受容体拮抗剤、ならびに、内因性のPPARγアゴニストからなる群から選択される1以上のPPARγアゴニストである、[12]に記載の動脈塞栓術用局所注入剤または人工骨；
[14] PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質がザルトプロフェン、ジクロフェナク、インドメタシン、プログルメタシン、インドメタシンファルネシル、セレコキシブ、エトドラク、メロキシカム、モフェゾラク、アセメタシン、オキサプロジン、アセトアミノフェン、ロルノキシカム、アンピロキシカム、ピロキシカム、ナプロキセン、ロキソプロフェン、ロフェコキシブ、エテンザミド、ジフルニサル、アルミノプロフェン、ナブメトン、ケトプロフェン、アセチルサリチル酸、イブプロフェン、プラノプロフェン、スリンダクからなる群から選択される非ステロイド性抗炎症剤である、[12]または[13]に記載の動脈塞栓術用局所注入剤または人工骨；
[15] PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質がトログリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、バラグリタゾン、リボグリタゾン、イサグリタゾン、ネトグリタゾン、ロベグリタゾン、エングリタゾン、シグリタゾンからなる群から選択されるチアゾリジンジオン誘導体である、[12]〜[14]のいずれか１項に記載の動脈塞栓術用局所注入剤または人工骨；
[16] PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質が、イルベサルタン、テルミサルタンからなる群から選択される1以上のPPARγアゴニスト活性を有するアンジオテンシンII受容体拮抗剤である、[12]〜[15]のいずれか1項に記載の動脈塞栓術用局所注入剤または人工骨；
[17] PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質が、15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジンJ2、15-hydroxyeicosatetraenoic acid、9-hydroxyoctadecadienoic acid、13-hydroxyoctadecadienoic acid、ニトロリノール酸、長鎖脂肪酸からなる群から選択される１以上の内因性のPPARγアゴニストである、[12]〜[16]のいずれか1項に記載の動脈塞栓術用局所注入剤または人工骨；
[18] さらに抗RANKL抗体を含有することを特徴とする、[12]から[17]のいずれか1項に記載の動脈塞栓術用局所注入剤または人工骨；
[19] 抗RANKL抗体がデノスマブである、[18]に記載の動脈塞栓術用局所注入剤または人工骨；
[20] さらにビスホスホネートを含有することを特徴とする、[12]から[19]のいずれか1項に記載の動脈塞栓術用局所注入剤または人工骨；
[21] ビスホスホネートが、エチドロネート、クロドロネート、チルドロネート、パミドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート、アレンドロネート、イバンドロネート、チルドロネート、インカドロネート、リセドロネート、ミノドロネート、ゾレドロネート、ソルバドロネート、メドロネート、リセンドロネート、アミノ−オルパドロネート、シマドロネート、ピリドロネート、レジドロネート、EB1053、YH 529からなる群から選択される1以上のビスホスホネートである、[20]に記載の動脈塞栓術用局所注入剤または人工骨；
[22] 骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の予防、治療または転移の予防に使用するための、PPARγアゴニストおよび／もしくはPPARγ発現誘導活性を有する物質、またはそれらの組み合わせ；
[23] 非ステロイド性抗炎症剤、チアゾリジンジオン誘導体、PPARγアゴニスト活性を有するアンジオテンシンII受容体拮抗剤、ならびに、内因性のPPARγアゴニストからなる群から選択される1以上の物質である、[22]に記載のPPARγアゴニストおよび／もしくはPPARγ発現誘導活性を有する物質、またはそれらの組み合わせ；
[24] PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質がザルトプロフェン、ジクロフェナク、インドメタシン、プログルメタシン、インドメタシンファルネシル、セレコキシブ、エトドラク、メロキシカム、モフェゾラク、アセメタシン、オキサプロジン、アセトアミノフェン、ロルノキシカム、アンピロキシカム、ピロキシカム、ナプロキセン、ロキソプロフェン、ロフェコキシブ、エテンザミド、ジフルニサル、アルミノプロフェン、ナブメトン、ケトプロフェン、アセチルサリチル酸、イブプロフェン、プラノプロフェン、スリンダクからなる群から選択される1以上の非ステロイド性抗炎症剤である、[22]または[23]に記載のPPARγアゴニストおよび／もしくはPPARγ発現誘導活性を有する物質、またはそれらの組み合わせ；
[25] PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質が、トログリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、バラグリタゾン、リボグリタゾン、イサグリタゾン、ネトグリタゾン、ロベグリタゾン、エングリタゾン、シグリタゾンからなる群から選択される1以上のチアゾリジンジオン誘導体である、[22]〜[24]のいずれか1項に記載のPPARγアゴニストおよび／もしくはPPARγ発現誘導活性を有する物質、またはそれらの組み合わせ；
[26] PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質が、イルベサルタン、テルミサルタンからなる群から選択される1以上のPPARγアゴニスト活性を有するアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗剤である、[22]〜[25]のいずれか1項に記載のPPARγアゴニストおよび／もしくはPPARγ発現誘導活性を有する物質、またはそれらの組み合わせ；
[27] PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質が、15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジンJ2、15-hydroxyeicosatetraenoic acid、9-hydroxyoctadecadienoic acid、13-hydroxyoctadecadienoic acid、ニトロリノール酸、長鎖脂肪酸からなる群から選択される１以上の内因性のPPARγアゴニストである、[22]〜[26]のいずれか１項に記載のPPARγアゴニストおよび／もしくはPPARγ発現誘導活性を有する物質、またはそれらの組み合わせ；
[28] 骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍が、骨巨細胞腫、腱鞘巨細胞腫および色素性絨毛結節性滑膜炎からなる群から選択される、[22]から[27]のいずれか1項に記載のPPARγアゴニストおよび／もしくはPPARγ発現誘導活性を有する物質、またはそれらの組み合わせ；
[29] さらに抗RANKL抗体を含有することを特徴とする、[22]から[28]のいずれか1項に記載のPPARγアゴニストおよび／もしくはPPARγ発現誘導活性を有する物質、またはそれらの組み合わせ；
[30] 抗RANKL抗体がデノスマブである、[29]に記載のPPARγアゴニストおよび／もしくはPPARγ発現誘導活性を有する物質、またはそれらの組み合わせ；
[31] さらにビスホスホネートを含有することを特徴とする、[22]から[30]のいずれか1項に記載のPPARγアゴニストおよび／もしくはPPARγ発現誘導活性を有する物質、またはそれらの組み合わせ；
[32] ビスホスホネートが、エチドロネート、クロドロネート、チルドロネート、パミドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート、アレンドロネート、イバンドロネート、チルドロネート、インカドロネート、リセドロネート、ミノドロネート、ゾレドロネート、ソルバドロネート、メドロネート、リセンドロネート、アミノ−オルパドロネート、シマドロネート、ピリドロネート、レジドロネート、EB1053、YH 529からなる群から選択される1以上のビスホスホネートである、[31]に記載のPPARγアゴニストおよび／もしくはPPARγ発現誘導活性を有する物質、またはそれらの組み合わせ；
[33] PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質の有効量を対象に投与することを含む、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の予防方法、治療方法または転移予防方法；
[34] PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質が、非ステロイド性抗炎症剤、チアゾリジンジオン誘導体、PPARγアゴニスト活性を有するアンジオテンシンII受容体拮抗剤、ならびに、内因性のPPARγアゴニストからなる群から選択される１以上のPPARγアゴニストである、[33]に記載の骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の予防方法、治療方法または転移予防方法；
[35] PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質ザルトプロフェン、ジクロフェナク、インドメタシン、プログルメタシン、インドメタシンファルネシル、セレコキシブ、エトドラク、メロキシカム、モフェゾラク、アセメタシン、オキサプロジン、アセトアミノフェン、ロルノキシカム、アンピロキシカム、ピロキシカム、ナプロキセン、ロキソプロフェン、ロフェコキシブ、エテンザミド、ジフルニサル、アルミノプロフェン、ナブメトン、ケトプロフェン、アセチルサリチル酸、イブプロフェン、プラノプロフェン、スリンダクからなる群から選択される1以上の非ステロイド性抗炎症剤である、[33]または[34]に記載の骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の予防方法、治療方法または転移予防方法；
[36] PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質が、トログリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、バラグリタゾン、リボグリタゾン、イサグリタゾン、ネトグリタゾン、ロベグリタゾン、エングリタゾン、シグリタゾンからなる群から選択される1以上のチアゾリジンジオン誘導体である、[33]〜[35]のいずれか1項に記載の骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の予防方法、治療方法または転移予防方法；
[37] PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質が、イルベサルタン、テルミサルタンからなる群から選択される1以上のPPARγアゴニスト活性を有するアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗剤である、[33]〜[36]のいずれか1項に記載の骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の予防方法、治療方法または転移予防方法；
[38] PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質が、15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジンJ2、15-hydroxyeicosatetraenoic acid、9-hydroxyoctadecadienoic acid、13-hydroxyoctadecadienoic acid、ニトロリノール酸、長鎖脂肪酸からなる群から選択される1以上の内因性のPPARγアゴニストである、[33]〜[37]のいずれか1項に記載の骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の予防方法、治療方法または転移予防方法；
[39] 骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍が、骨巨細胞腫、腱鞘巨細胞腫および色素性絨毛結節性滑膜炎からなる群から選択される、[33]から[38］のいずれか1項に記載の骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の予防方法、治療方法または転移予防方法；
[40] さらに抗ＲＡＮＫＬ抗体を含有することを特徴とする、[33]から[39]のいずれか1項に記載の骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の予防方法、治療方法または転移予防方法；
[41] 抗RANKL抗体がデノスマブである、[40]に記載の骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の予防方法、治療方法または転移予防方法；
[42] さらにビスホスホネートを含有することを特徴とする、[33]から[41]のいずれか1項に記載の骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の予防方法、治療方法または転移予防方法；
[43] ビスホスホネートが、エチドロネート、クロドロネート、チルドロネート、パミドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート、アレンドロネート、イバンドロネート、チルドロネート、インカドロネート、リセドロネート、ミノドロネート、ゾレドロネート、ソルバドロネート、メドロネート、リセンドロネート、アミノ−オルパドロネート、シマドロネート、ピリドロネート、レジドロネート、EB1053、YH 529からなる群から選択される1以上のビスホスホネートである、[42]に記載の骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の予防方法、治療方法または転移予防方法；
[44] 以下の工程を含む、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の予防剤、治療剤または転移予防剤のスクリーニング方法
(1)骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫もしくは骨肉腫に由来する細胞または組織を被検物質の存在下または非存在下で培養する工程、
(2)被検物質の存在下または非存在下で、下記の(a)~(g)からなる群から選択される1以上の指標を測定する工程；
(a) PPARγの遺伝子発現量、PPARγのタンパク量からなる群から選択される１以上の指標、
(b) アポトーシス関連遺伝子の遺伝子発現量、アポトーシス関連遺伝子の翻訳産物のタンパク量、アポトーシス関連遺伝子の翻訳産物の生物活性からなる群から選択される１以上の指標、
(c) 脂肪細胞分化関連遺伝子の遺伝子発現量、脂肪細胞分化関連遺伝子の翻訳産物のタンパク量、脂肪細胞分化関連遺伝子の翻訳産物の生物活性、からなる群から選択される1以上の指標、
(d) 動脈硬化関連遺伝子の遺伝子発現量、動脈硬化関連遺伝子の翻訳産物のタンパク量、動脈硬化関連遺伝子の翻訳産物の生物活性、からなる群から選択される１以上の指標、
(e) 抗炎症関連遺伝子の遺伝子発現量、抗炎症関連遺伝子の翻訳産物のタンパク量、抗炎症関連遺伝子の翻訳産物の生物活性、からなる群から選択される１以上の指標、
(f) PPARγアゴニスト活性であって、アポトーシス関連遺伝子、脂肪細胞分化関連遺伝子、動脈硬化関連遺伝子、抗炎症関連遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子の転写を促進することができる活性である指標、
(g) 脂肪細胞または脂肪組織中に含まれる脂質の量；
(3)被検物質非存在下における細胞内指標と比較して、被検物質の存在下における細胞内指標を変動させる被検物質を選択する工程；
[45] 骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍が、骨巨細胞腫、腱鞘巨細胞腫および色素性絨毛結節性滑膜炎からなる群から選択される、[44]に記載のスクリーニング方法；
を提供する。
本発明の予防剤、治療剤もしくは転移予防剤は、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫を手術によらずに治療することができる。また、本発明の予防剤、治療剤もしくは転移予防剤を骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の切除手術とともに用いる場合には、切除しきれなかった腫瘍による再発もしくは転移を防止することができる。さらに、本発明の予防剤、治療剤もしくは転移予防剤は、経口投与可能である。
本発明の予防剤、治療剤もしくは転移予防剤、ならびに、動脈塞栓術用局所注入剤もしくは人工骨は、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫にアポトーシスを引き起こして腫瘍を消滅させることができ、また、脂肪細胞へ分化誘導して腫瘍を消滅させることのできる根本的な治療剤ないし治療材料である。本発明の予防剤、治療剤もしくは転移予防剤、ならびに、動脈塞栓術用局所注入剤もしくは人工骨は、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の再発および転移を抑制することができる。本発明の予防剤、治療剤もしくは転移予防剤、ならびに、動脈塞栓術用局所注入剤もしくは人工骨は、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の患者の運動機能を回復し、神経障害を防ぐことができ、生活の質を劇的に改善することができる。
本発明の予防剤、治療剤もしくは転移予防剤、ならびに、動脈塞栓術用局所注入剤もしくは人工骨は、たとえ、腫瘍が消失しない場合であっても、患者の日常活動を遂行する能力を向上ないし維持することができる。本発明の予防剤、治療剤もしくは転移予防剤、ならびに、動脈塞栓術用局所注入剤もしくは人工骨は、たとえ、腫瘍が消失しない場合であっても、骨の修復、形成もしくは硬化を促進し、運動機能を向上ないし維持することができる。
本発明の治療剤ないし治療材料が非ステロイド性抗炎症剤を含有する場合には、患部の炎症を鎮め、患部の痛みを和らげる効果を併せ持つ。
本発明の予防剤、治療剤もしくは転移予防剤は、外科手術前または後の化学療法剤としても用いることができる。
また、本発明によれば、PPARγおよびアポトーシスまたは脂肪細胞分化を制御する被検物質を選択することにより、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫に対する新規予防剤、治療剤または転移予防剤の探索が可能となる。

ザルトプロフェン含有培地で培養したGCTB培養細胞の増殖抑制の結果を示す図である。GCTcase1およびGCTcase2の表示は、それぞれ、由来の異なる骨巨細胞腫培養細胞を表す。WST assayの表示は、テトラゾリウム塩WST-8を発色基質として使用するDojindo社のCell Counting Kit-8(CCK-8)を用いて細胞増殖を測定したことを表す。横軸はザルトプロフェンの濃度を、縦軸は450nmの吸光度で測定した生細胞数を表す。P<の右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 ザルトプロフェン含有培地で培養したGCTB培養細胞における、Tunel assayの結果を示す図である。Tunel assayは、アポトーシスの過程で生じる断片化DNAを, TdT-mediated dUTP nick end labeling法(TUNEL)により検出した。濃度はザルトプロフェンの濃度を、時間はザルトプロフェン存在下での培養時間を夫々示す。DAPIの表示は、蛍光色素であるDAPIによる核染色の結果であることを示す。 ザルトプロフェン含有培地で培養したGCTB培養細胞における、Tunel陽性細胞の割合を示すグラフである。濃度はザルトプロフェンの濃度を、時間はザルトプロフェン存在下での培養時間を夫々示す。縦軸はTunel陽性細胞の割合を示す。P<の右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 ザルトプロフェン含有培地で培養したGCTB培養細胞における、Caspase3染色の結果を示す図である。濃度はザルトプロフェンの濃度を、時間はザルトプロフェン存在下での培養時間を夫々示す。DAPIの表示は、蛍光色素であるDAPIによる核染色の結果であることを示す。 ザルトプロフェン含有培地で培養したGCTB培養細胞における、Caspase3陽性細胞の割合を示すグラフである。濃度はザルトプロフェンの濃度を、時間はザルトプロフェン存在下での培養時間を夫々示す。縦軸はCaspase3陽性細胞の割合を示す。P<の右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 ザルトプロフェン含有培地で培養したGCTB培養細胞における、PPARγ染色の結果を示す図である。濃度はザルトプロフェンの濃度を示す。DAPIの表示は、蛍光色素であるDAPIによる核染色の結果であることを示す。 ザルトプロフェン含有培地で培養したGCTB培養細胞における、PPARγ陽性細胞の割合を示すグラフである。横軸の濃度はザルトプロフェンの濃度を示す。縦軸は、PPARγ陽性細胞の割合を示す。P<の右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 ザルトプロフェン含有培地で培養したGCTB培養細胞における、脂質染色の結果を示す図である。濃度はザルトプロフェンの濃度を示す。DAPIの表示は、蛍光色素であるDAPIによる核染色の結果であることを示す。 ザルトプロフェン含有培地で培養したGCTB培養細胞における、脂質陽性細胞の割合を示すグラフである。横軸の濃度はザルトプロフェンの濃度を示す。縦軸は、脂質陽性細胞の割合を示す。濃度はザルトプロフェンの濃度を示す。P<の右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 ザルトプロフェン投与されたGCTB患者由来のGCTB標本における、Tunel assayおよびCaspase3染色の結果を示す図である。DAPIの表示は、蛍光色素であるDAPIによる核染色の結果であることを示す。 ザルトプロフェン投与されたGCTB患者由来のGCTB標本における、PPARγ染色の結果を示す図である。DAPIの表示は、蛍光色素であるDAPIによる核染色の結果であることを示す。 アセトアミノフェン、インドメタシン、ジクロフェナクまたはトログリタゾン含有培地で培養したGCTB培養細胞の増殖抑制の結果を示す図である。GCTcase1の表示は、骨巨細胞腫培養細胞の由来を表す。WST assayの表示は、テトラゾリウム塩WST-8を発色基質として使用するDojindo社のCell Counting Kit-8(CCK-8)を用いて細胞増殖を測定したことを表す。横軸は各薬剤の濃度を、縦軸は450nmの吸光度で測定した生細胞数を表す。P<の右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 アセトアミノフェン、インドメタシン、ジクロフェナクまたはトログリタゾン含有培地で培養したGCTB培養細胞の増殖抑制の結果を示す図である。GCTcase2の表示は、骨巨細胞腫培養細胞の由来を表す。WST assayの表示は、テトラゾリウム塩WST-8を発色基質として使用するDojindo社のCell Counting Kit-8(CCK-8)を用いて細胞増殖を測定したことを表す。横軸は各薬剤の濃度を、縦軸は450nmの吸光度で測定した生細胞数を表す。P<の右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 ザルトプロフェンまたはトログリタゾン含有培地で培養したGCTB培養細胞に対するPPARγ ｓｉＲＮＡの効果を示す図である。GCTcase1の表示は、骨巨細胞腫培養細胞の由来を表す。WST assayの表示は、テトラゾリウム塩WST-8を発色基質として使用するDojindo社のCell Counting Kit-8(CCK-8)を用いて細胞増殖を測定したことを表す。横軸は各薬剤の濃度を、縦軸は450nmの吸光度で測定した生細胞数を表す。Pの右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 ザルトプロフェンまたはトログリタゾン含有培地で培養したGCTB培養細胞に対するPPARγ siRNAの効果を示す図である。GCTcase2の表示は、骨巨細胞腫培養細胞の由来を表す。WST assayの表示は、テトラゾリウム塩WST-8を発色基質として使用するDojindo社のCell Counting Kit-8(CCK-8)を用いて細胞増殖を測定したことを表す。横軸は各薬剤の濃度を、縦軸は450nmの吸光度で測定した生細胞数を表す。Pの右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 ザルトプロフェン含有培地で培養した腱鞘巨細胞腫(GCTT)の培養細胞または色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)の培養細胞の増殖抑制の結果を示す図である。WST assayの表示は、テトラゾリウム塩WST-8を発色基質として使用するDojindo社のCell Counting Kit-8(CCK-8)を用いて細胞増殖を測定したことを表す。横軸はザルトプロフェンの濃度を、縦軸は450nmの吸光度で測定した生細胞数を表す。P<の右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 トログリタゾン含有培地で培養した腱鞘巨細胞腫(GCTT)の培養細胞または色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)の培養細胞の増殖抑制の結果を示す図である。WST assayの表示は、テトラゾリウム塩WST-8を発色基質として使用するDojindo社のCell Counting Kit-8(CCK-8)を用いて細胞増殖を測定したことを表す。横軸はトログリタゾンの濃度を、縦軸は450nmの吸光度で測定した生細胞数を表す。P<の右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 ザルトプロフェンまたはトログリタゾン含有培地で培養した腱鞘巨細胞腫(GCTT)の培養細胞における、Tunel assayの結果を示す図である。Tunel assayは、アポトーシスの過程で生じる断片化DNAを, TdT-mediated dUTP nick end labeling法(TUNEL)により検出した。DAPIの表示は、蛍光色素であるDAPIによる核染色の結果であることを示す。 ザルトプロフェンまたはトログリタゾン含有培地で培養した腱鞘巨細胞腫(GCTT)の培養細胞における、Tunel陽性細胞の割合を示すグラフである。縦軸はTunel陽性細胞の割合を、横軸は各薬剤の濃度を示す。Pの右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 ザルトプロフェンまたはトログリタゾン含有培地で培養した色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)の培養細胞における、Tunel assayの結果を示す図である。Tunel assayは、アポトーシスの過程で生じる断片化DNAを, TdT-mediated dUTP nick end labeling法(TUNEL)により検出した。DAPIの表示は、蛍光色素であるDAPIによる核染色の結果であることを示す。 ザルトプロフェンまたはトログリタゾン含有培地で培養した色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)の培養細胞における、Tunel陽性細胞の割合を示すグラフである。縦軸はTunel陽性細胞の割合を、横軸は各薬剤の濃度を示す。Pの右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 ザルトプロフェンまたはトログリタゾン含有培地で培養した腱鞘巨細胞腫(GCTT)の培養細胞における、Caspase3染色の結果を示す図である。DAPIの表示は、蛍光色素であるDAPIによる核染色の結果であることを示す。 ザルトプロフェンまたはトログリタゾン含有培地で培養した腱鞘巨細胞腫(GCTT)の培養細胞における、Caspase3陽性細胞の割合を示すグラフである。縦軸はCaspase3陽性細胞の割合を、横軸は各薬剤の濃度を示す。Pの右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 ザルトプロフェンまたはトログリタゾン含有培地で培養した色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)の培養細胞における、Caspase3染色の結果を示す図である。DAPIの表示は、蛍光色素であるDAPIによる核染色の結果であることを示す。 ザルトプロフェンまたはトログリタゾン含有培地で培養した色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)の培養細胞における、Caspase3陽性細胞の割合を示すグラフである。縦軸はCaspase3陽性細胞の割合を、横軸は各薬剤の濃度を示す。Pの右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 ザルトプロフェンまたはトログリタゾン含有培地で培養した腱鞘巨細胞腫(GCTT)の培養細胞における、PPARγ染色の結果を示す図である。DAPIの表示は、蛍光色素であるDAPIによる核染色の結果であることを示す。 ザルトプロフェンまたはトログリタゾン含有培地で培養した腱鞘巨細胞腫(GCTT)の培養細胞における、PPARγ陽性細胞の割合を示すグラフである。縦軸はPPARγ陽性細胞の割合を、横軸は各薬剤の濃度を示す。Pの右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 ザルトプロフェンまたはトログリタゾン含有培地で培養した色素性絨毛結節性滑膜炎（PVNS)の培養細胞における、PPARγ染色の結果を示す図である。DAPIの表示は、蛍光色素であるDAPIによる核染色の結果であることを示す。 ザルトプロフェンまたはトログリタゾン含有培地で培養した色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)の培養細胞における、PPARγ陽性細胞の割合を示すグラフである。縦軸はPPARγ陽性細胞の割合を、横軸は各薬剤の濃度を示す。Pの右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 ザルトプロフェン含有培地で培養した腱鞘巨細胞腫(GCTT)の培養細胞または色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)の培養細胞における、脂質染色の結果を示す図である。DAPIの表示は、蛍光色素であるDAPIによる核染色の結果であることを示す。 ザルトプロフェン含有培地で培養した腱鞘巨細胞腫(GCTT)の培養細胞または色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)の培養細胞における、脂質陽性細胞の割合を示すグラフである。縦軸は脂質陽性細胞の割合を、横軸は各薬剤の濃度を示す。Ｐの右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 ピオグリタゾン含有培地で培養した骨巨細胞腫(GCTB)培養細胞、腱鞘巨細胞腫(GCTT)の培養細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)の培養細胞の増殖抑制の結果を示す図である。CTcase1およびGCTcase2の表示は、それぞれ、由来の異なる骨巨細胞腫培養細胞を表す。横軸はピオグリタゾンの濃度を、縦軸はテトラゾリウム塩WST-8を発色基質として使用するDojindo社のCell Counting Kit-8(CCK-8)を用いて450nmの吸光度で測定した生細胞数を表す。P<の右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 骨盤部に骨巨細胞腫(GCTB)を再発した患者のザルトプロフェン服用前の骨盤部のレントゲン画像を示す図である。なお、この症例は、図79の症例aと同じ症例である。 骨盤部に骨巨細胞腫(GCTB)を再発した患者のザルトプロフェン服用前の骨盤部のMRI画像を示す図である。なお、この症例は、図79の症例aと同じ症例である。 骨盤部に骨巨細胞腫(GCTB)を再発した患者のザルトプロフェン服用後２ヶ月経過後の骨盤部のMRI画像を示す図である。矢印は腫瘍の壊死領域を示す。なお、この症例は、図79の症例aと同じ症例である。 骨盤部に骨巨細胞腫(GCTB)を再発した患者のザルトプロフェン服用後４ヶ月経過後の骨盤部のMRI画像を示す図である。矢印は腫瘍の壊死領域を示す。なお、この症例は、図79の症例aと同じ症例である。 右膝部に色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)を再発した患者のザルトプロフェン投与前の右膝部の矢状面のMRI画像を示す図である。なお、この症例は、図86の症例iと同じ症例である。 右膝部に色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)を再発した患者のザルトプロフェン投与前の右膝部の横断面のMRI画像を示す図である。なお、この症例は、図86の症例iと同じ症例である。 右膝部に色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)を再発した患者のザルトプロフェン投与後３ヶ月経過後の右膝部の矢状面のMRI画像を示す図である。矢印はMRI造影効果の減弱を示す。なお、この症例は、図86の症例iと同じ症例である。 右膝部に色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)を再発した患者のザルトプロフェン投与後３ヶ月経過後の右膝部の横断面）のMRI画像を示す図である。矢印はMRI造影効果の減弱を示す。なお、この症例は、図86の症例iと同じ症例である。 右膝部に色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)を再発した患者のザルトプロフェン投与前の右膝部の冠状面のMRI画像を示す図である。なお、この症例は、図86の症例bと同じ症例である。 右膝部に色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)を再発した患者のザルトプロフェン投与前の右膝部の横断面のMRI画像を示す図である。なお、この症例は、図86の症例bと同じ症例である。 右膝部に色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)を再発した患者のザルトプロフェン投与後2ヶ月経過後の右膝部の冠状面のMRI画像を示す図である。矢印は腫瘤の縮小を示す。なお、この症例は、図86の症例bと同じ症例である。 右膝部に色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)を再発した患者のザルトプロフェン投与後２ヶ月経過後の右膝部の横断面のMRI画像を示す図である。矢印は腫瘤の縮小を示す。なお、この症例は、図86の症例bと同じ症例である。 ザルトプロフェン、トログリタゾンまたはピオグリタゾンを含有する培地で培養した軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS)の増殖抑制の結果を示す図である。細胞増殖は、テトラゾリウム塩WST-8を発色基質として使用するDojindo社のCell Counting Kit-8(CCK-8)を用いて測定した。横軸は各薬剤の濃度を、縦軸は450nmの吸光度で測定した生細胞数を表す。P<の右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 ザルトプロフェン、トログリタゾンまたはピオグリタゾンを含有する培地で培養した軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS)における、Caspase3染色の結果を示す図である。DAPIの表示は、蛍光色素であるDAPIによる核染色の結果であることを示す。 ザルトプロフェン、トログリタゾンまたはピオグリタゾンを含有する培地で培養した軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS)における、Caspase3陽性細胞の割合を示すグラフである。縦軸はCaspase3陽性細胞の割合を、横軸は各薬剤の濃度を示す。Pの右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 ザルトプロフェン、トログリタゾンまたはピオグリタゾンを含有する培地で培養した軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS)における、PPARγ染色の結果を示す図である。DAPIの表示は、蛍光色素であるDAPIによる核染色の結果であることを示す。 ザルトプロフェン、トログリタゾンまたはピオグリタゾンを含有する培地で培養した軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS)における、PPARγ陽性細胞の割合を示すグラフである。縦軸はPPARγ陽性細胞の割合を、横軸は各薬剤の濃度を示す。Pの右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 ピオグリタゾンを含有する培地で培養した骨巨細胞腫の培養細胞(GCT-1、GCT-2)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)の培養細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎の培養細胞、軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS、SW1353）の増殖抑制の結果を示す図である。横軸は薬剤の濃度を、縦軸はCCK-8(Dojindo社)を用いて450nmの吸光度で測定した生細胞数を表す。P<の右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 トログリタゾンを含有する培地で培養した骨巨細胞腫の培養細胞(GCT-1、GCT-2)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)の培養細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎の培養細胞、軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS、SW1353)の増殖抑制の結果を示す図である。横軸は薬剤の濃度を、縦軸はCCK-8(Dojindo社)を用いて450nmの吸光度で測定した生細胞数を表す。P<の右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 ロシグリタゾンを含有する培地で培養した骨巨細胞腫の培養細胞(GCT-1、GCT-2)、腱鞘巨細胞腫の培養細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎の培養細胞、軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS、SW1353)の増殖抑制の結果を示す図である。横軸は薬剤の濃度を、縦軸はCCK-8(Dojindo社)を用いて450nmの吸光度で測定した生細胞数を表す。P<の右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 ザルトプロフェンを含有する培地で培養した骨巨細胞腫の培養細胞(GCT-1、GCT-2)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)の培養細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎の培養細胞、軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS、SW1353)の増殖抑制の結果を示す図である。横軸は薬剤の濃度を、縦軸はCCK-8(Dojindo社)を用いて450nmの吸光度で測定した生細胞数を表す。P<の右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 ジクロフェナクを含有する培地で培養した骨巨細胞腫の培養細胞(GCT-1、GCT-2)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)の培養細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎の培養細胞、軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS、SW1353)の増殖抑制の結果を示す図である。横軸は薬剤の濃度を、縦軸はCCK-8(Dojindo社)を用いて450nmの吸光度で測定した生細胞数を表す。P<の右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 インドメタシンを含有する培地で培養した骨巨細胞腫の培養細胞(GCT-1、GCT-2)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)の培養細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎の培養細胞、軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS、SW1353)の増殖抑制の結果を示す図である。横軸は薬剤の濃度を、縦軸はCCK-8(Dojindo社)を用いて450nmの吸光度で測定した生細胞数を表す。P<の右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 セレコキシブを含有する培地で培養した骨巨細胞腫の培養細胞(GCT-1、GCT-2)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)の培養細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎の培養細胞、軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS、SW1353)の増殖抑制の結果を示す図である。横軸は薬剤の濃度を、縦軸はCCK-8(Dojindo社)を用いて450nmの吸光度で測定した生細胞数を表す。P<の右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 エトドラクを含有する培地で培養した骨巨細胞腫の培養細胞(GCT-1、GCT-2)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)の培養細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎の培養細胞、軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS、SW1353)の増殖抑制の結果を示す図である。横軸は薬剤の濃度を、縦軸はCCK-8(Dojindo社)を用いて450nmの吸光度で測定した生細胞数を表す。P<の右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 メロキシカムを含有する培地で培養した骨巨細胞腫の培養細胞(GCT-1、GCT-2)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)の培養細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎の培養細胞、軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS、SW1353)の増殖抑制の結果を示す図である。横軸は薬剤の濃度を、縦軸はCCK-8(Dojindo社)を用いて450nmの吸光度で測定した生細胞数を表す。P<の右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 モフェゾラクを含有する培地で培養した骨巨細胞腫の培養細胞(GCT-1、GCT-2)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)の培養細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎の培養細胞、軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS、SW1353)の増殖抑制の結果を示す図である。横軸は薬剤の濃度を、縦軸はCCK-8(Dojindo社)を用いて450nmの吸光度で測定した生細胞数を表す。P<の右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 アセメタシンを含有する培地で培養した骨巨細胞腫の培養細胞(GCT-1、GCT-2)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)の培養細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎の培養細胞、軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS、SW1353)の増殖抑制の結果を示す図である。横軸は薬剤の濃度を、縦軸はCCK-8(Dojindo社)を用いて450nmの吸光度で測定した生細胞数を表す。P<の右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 オキサプロジンを含有する培地で培養した骨巨細胞腫の培養細胞(GCT-1、GCT-2)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)の培養細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎の培養細胞、軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS、SW1353)の増殖抑制の結果を示す図である。横軸は薬剤の濃度を、縦軸はCCK-8(Dojindo社)を用いて450nmの吸光度で測定した生細胞数を表す。P<の右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 アセトアミノフェンを含有する培地で培養した骨巨細胞腫の培養細胞(GCT-1、GCT-2)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)の培養細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎の培養細胞、軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS、SW1353)の増殖抑制の結果を示す図である。横軸は薬剤の濃度を、縦軸はCCK-8(Dojindo社)を用いて450nmの吸光度で測定した生細胞数を表す。P<の右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 ロルノキシカムを含有する培地で培養した骨巨細胞腫の培養細胞(GCT-1、GCT-2)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)の培養細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎の培養細胞、軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS、SW1353)の増殖抑制の結果を示す図である。横軸は薬剤の濃度を、縦軸はCCK-8(Dojindo社)を用いて450nmの吸光度で測定した生細胞数を表す。P<の右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 アンピロキシカムを含有する培地で培養した骨巨細胞腫の培養細胞(GCT-1、GCT-2)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)の培養細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎の培養細胞、軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS、SW1353)の増殖抑制の結果を示す図である。横軸は薬剤の濃度を、縦軸はCCK-8(Dojindo社)を用いて450nmの吸光度で測定した生細胞数を表す。P<の右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 ナプロキセンを含有する培地で培養した骨巨細胞腫の培養細胞(GCT-1、GCT-2)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)の培養細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎の培養細胞、軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS、SW1353)の増殖抑制の結果を示す図である。横軸は薬剤の濃度を、縦軸はCCK-8(Dojindo社)を用いて450nmの吸光度で測定した生細胞数を表す。P<の右側の数字は統計解析の結果得られた有意水準を示す。 ザルトプロフェン、ロシグリタゾンまたはトログリタゾンを含有する培地で培養した軟骨肉腫の培養細胞(OUMS-27)の増殖抑制の結果を示す図である。横軸は薬剤の濃度を、縦軸はCCK-8(Dojindo社)を用いて450nmの吸光度で測定した生細胞数を表す。 ザルトプロフェン、ロシグリタゾンまたはトログリタゾンを含有する培地で培養した軟骨肉腫の培養細胞(OUMS-27)の増殖抑制の結果を示す図である。横軸は薬剤の濃度を、縦軸はCCK-8(Dojindo社)を用いて450nmの吸光度で測定した生細胞数を表す。黒塗りの棒は、PPARγの不可逆的なアンタゴニストであるGW9662(Sigma-Aldrich社 M6191)を終濃度1μMとなるように予め加えてインキュベートした後にザルトプロフェン、ロシグリタゾンまたはトログリタゾンを加えたときの生細胞数表す。白抜きの棒はGW9662の代わりにDMSOのみを加えてインキュベートした後にザルトプロフェン、ロシグリタゾンまたはトログリタゾンを加えたときの生細胞数表す。 ザルトプロフェンを含有する培地で培養した軟骨肉腫の培養細胞(SW1353)の増殖抑制の結果を示す図である。横軸は薬剤の設定を、縦軸はCCK-8(Dojindo社)を用いて450nmの吸光度で測定した生細胞数を表す。黒塗りの棒は、PPARγの不可逆的なアンタゴニストであるGW9662を終濃度1μMとなるように予め加えてインキュベートした後にザルトプロフェンを加えたときの生細胞数表す。白抜きの棒はGW9662の代わりにDMSOのみを加えてインキュベートした後にザルトプロフェンを加えたときの生細胞数表す。左端の群は、薬剤を一切加えずに培養した群を表し、左から2番目の群は、1μMのGW9662によるインキュベーションを行った後にザルトプロフェンの代わりにDMSOを添加した群を表す。 ザルトプロフェンまたはロシグリタゾンを含有する培地で培養した軟骨肉腫の培養細胞(SW1353)の増殖抑制の結果を示す図である。横軸は実験群を、縦軸はCCK-8(Dojindo社)を用いて450nmの吸光度で測定した生細胞数を表す。左から順に、「Si Control」と記載された群はPPARγ-siRNAでPPARγ遺伝子の発現を抑制した後にvehivle controlとしてDMSOを加えて培養した群を表す。「Si Zalto」と記載された群はPPARγ-siRNAでPPARγ遺伝子の発現を抑制した後にザルトプロフェンを加えて培養した群を表す。「SiN Control」と記載された群は対照群としてネガティブ-siRNAを感染させた後にvehivle controlとしてDMSOを加えて培養した群を表す。「SiN Zalto」と記載された群は照群としてネガティブ-siRNAを感染させた後にザルトプロフェンを加えて培養した群を表す。「Si Control」と記載された群はPPARγ-siRNAでPPARγ遺伝子の発現を抑制した後にvehivle controlとしてDMSOを加えて培養した群を表す。「Si Rosi」と記載された群はPPARγ-siRNAでPPARγ遺伝子の発現を抑制した後にロシグリタゾンを加えて培養した群を表す。「SiN Control」と記載された群は対照群としてネガティブ-siRNAを感染させた後にvehivle controlとしてDMSOを加えて培養した群を表す。「SiN Rosi」と記載された群は照群としてネガティブ-siRNAを感染させた後にロシグリタゾンを加えて培養した群を表す。 ザルトプロフェンを含有する培地で培養した軟骨肉腫の培養細胞(H-EMC-SS)の増殖抑制の結果を示す図である。横軸は実験群を、縦軸はCCK-8(Dojindo社)を用いて450nmの吸光度で測定した生細胞数を表す。左から順に、「Si Control」と記載された群はPPARγ-siRNAでPPARγ遺伝子の発現を抑制した後にvehivle controlとしてDMSOを加えて培養した群を表す。「Si Zalto」と記載された群はPPARγ-siRNAでPPARγ遺伝子の発現を抑制した後にザルトプロフェンを加えて培養した群を表す。「SiN Control」と記載された群は対照群としてネガティブ-siRNAを感染させた後にvehivle controlとしてDMSOを加えて培養した群を表す。「SiN Zalto」と記載された群は照群としてネガティブ-siRNAを感染させた後にザルトプロフェンを加えて培養した群を表す。 ザルトプロフェンまたはロシグリタゾンを含有する培地で培養したPVNS細胞の増殖抑制の結果を示す図である。横軸は実験群を、縦軸はCCK-8(Dojindo社)を用いて450nmの吸光度で測定した生細胞数を表す。左側の図は、遺伝子発現を抑制しないようにデザインされたネガティブ-siRNAを感染させた群を表す。右側の図は、PPARγ遺伝子の発現を抑制するようにデザインしたPPARγ-siRNAを感染させた群を表す。左側の図の実験群は、左から順に、ネガティブ-siRNAを感染させた後にvehivle controlとしてDMSOを加えて培養した群、ネガティブ-siRNAを感染させた後に100μMのロシグリタゾンを加えて培養した群、ネガティブ-siRNAを感染させた後に400μMのザルトプロフェンを加えて培養した群を夫々表す。右側の図の実験群は、左から順に、PPARγ-siRNAを感染させた後にvehivle controlとしてDMSOを加えて培養した群、PPARγ-siRNAを感染させた後に100μMのロシグリタゾンを加えて培養した群、PPARγ-siRNAを感染させた後に400μMのザルトプロフェンを加えて培養した群を夫々表す。 ザルトプロフェンを含有する培地で培養した骨肉腫の培養細胞(HOS)の増殖抑制の結果を示す図である。横軸は薬剤の濃度を、縦軸は遊走した細胞の相対数を表す。 アセトアミノフェン、セレコキシブ、インドメタシンまたはジクロフェナクを含有する培地で培養した軟骨肉腫の培養細胞(SW1353)の細胞遊走(cell migration)の抑制の結果を示す図である。横軸は薬剤の濃度を、縦軸は遊走した細胞の相対数を表す。Controlは薬剤の代わりにDMSOを添加したvehicle control群を表す。加えた薬剤の種類はそれぞれの図の上に示してある。 ロシグリタゾン、トログリタゾン、ザルトプロフェンまたはピオグリタゾンを含有する培地で培養した軟骨肉腫の培養細胞(SW1353)の細胞遊走(cell migration)の抑制の結果を示す図である。横軸は薬剤の濃度を、縦軸は遊走した細胞の相対数を表す。Controlは薬剤の代わりにDMSOを添加したvehicle control群を表す。加えた薬剤の種類はそれぞれの図の上に示してある。 トログリタゾン、ピオグリタゾン、ザルトプロフェン、ジクロフェナク、ロシグリタゾン、アセトアミノフェン、インドメタシンまたはセレコキシブを含有する培地で培養した軟骨肉腫の培養細胞(SW1353)の細胞浸潤(cell invasion)の抑制の結果を示す図である。横軸は薬剤の種類及び濃度を、縦軸は浸潤した細胞の相対数を表す。Controlは薬剤の代わりにDMSOを添加したvehicle control群を表す。 アセトアミノフェン、ピオグリタゾン、インドメタシン、ジクロフェナク、またはセレコキシブを含有する培地で培養した軟骨肉腫の培養細胞(SW1353)の細胞浸潤(cell invasion)した細胞を示す図である。Controlは薬剤の代わりにDMSOを添加したvehicle control群を表す（実施例24を参照）。細胞浸潤の解析にはマトリゲルをマトリックスとして用いるBD Bioscience社のMatrigelTM invasion chamber（カタログ番号：354480）を用いた。各薬剤を添加した条件下で浸潤した細胞の写真を示す。夫々、アセトアミノフェン(200μM)、ピオグリタゾン(100μM)、インドメタシン(200μM)、ジクロフェナク(200μM)、セレコキシブ(50μM)を添加した条件で、マトリゲルをコートしたメンブレンを通り抜けた細胞の写真を示す。「Control」は、薬剤添加に用いたのと同量のDMSOのみを添加したvehicle control を表す。なお、50μMのセレコキシブを添加した条件では、細胞の数がまばらにしかなく、小さく丸まっていることから、浸潤抑制のみでなく細胞障害も伴っていることがわかる。 ザルトプロフェン、トログリタゾンまたはロシグリタゾンを含有する培地で培養した軟骨肉腫の培養細胞(SW1353)の細胞浸潤(cell invasion)した細胞を示す図である。Controlは薬剤の代わりにDMSOを添加したvehicle control群を表す（実施例24を参照）。細胞浸潤の解析にはマトリゲルをマトリックスとして用いるBD Bioscience社のMatrigelTM invasion chamber（カタログ番号：354480）を用いた。各薬剤を添加した条件下で浸潤した細胞の写真を示す。夫々、ザルトプロフェン(200μM、300μM、400μM)、トログリタゾン(50μM、100μM)、ロシグリタゾン(100μM、200μM)を添加した条件で、マトリゲルをコートしたメンブレンを通り抜けた細胞の写真を示す。「Control」は、薬剤添加に用いたのと同量のDMSOのみを添加したvehicle control を表す。なお、400μM のザルトプロフェンあるいは100μMのトログリタゾンを添加した条件では、細胞の数がまばらにしかなく、小さく丸まっていることから、浸潤抑制のみでなく細胞障害も伴っていることがわかる。 ザルトプロフェンを含有する培地で培養した軟骨肉腫の培養細胞(SW1353)の細胞浸潤の抑制の結果を示す図である。横軸は薬剤の設定を、縦軸は浸潤した細胞の相対数を表す。黒塗りの棒は、PPARγの不可逆的なアンタゴニストであるGW9662を終濃度1μMとなるように予め加えてインキュベートした後にザルトプロフェンを加えたときの浸潤した細胞の相対数を表す。白抜きの棒はGW9662の代わりにDMSOのみを加えてインキュベートした後にザルトプロフェンを加えたときの浸潤した細胞の相対数を表す。左端の群は薬剤を一切加えずに培養した群を表し、左から2番目の群は1μMのGW9662によるインキュベーションを行った後に200μMのザルトプロフェンを添加した群を、左から3番目の群は1μMのGW9662によるインキュベーションを行った後に300μMのザルトプロフェンを添加した群を、右端の群は1μMのGW9662によるインキュベーションを行った後に400μMのザルトプロフェンを添加した群を、夫々表す。 ザルトプロフェン（ソレトン錠（登録商標））を服用した骨巨細胞腫を患う症例をまとめた表である。各症例ごとに年齢、性別、骨巨細胞腫の発生部位、初発/再発の別、経過観察期間、奏効率、術後期間、治療/服用期間、術後の再発の有無、コメントおよび患部写真を掲載した場合にはその図面番号を記載している。奏効率の欄の「PR」は「部分奏効」を、「SD」は「安定」を、「PD」は「進行」をそれぞれ表す。コメントの欄のゾメタ（登録商標）は「ゾレドロン酸水和物注射液」を、「デノスマブ」は「抗RANKLヒト型モノクローナル抗体（商品名：ランマーク）」を表す。 ザルトプロフェン（ソレトン錠（登録商標））を服用した骨巨細胞腫患者の骨巨細胞腫の縮小率を示すグラフである。縦軸は縮小率を表す。縮小率が70％であればザルトプロフェンを服用する前の骨巨細胞腫の大きさの30％の大きさに縮小したことを表し、縮小率が-20％であればザルトプロフェンを服用する前の骨巨細胞腫の大きさの120％の大きさに増加したことを表す。横軸のアルファベットは症例を特定するアルファベットである（図79を参照）。なお、本出願において、縮小率とは、ザルトプロフェン服用前の腫瘍の大きさを基準としてザルトプロフェンの継続服用後に腫瘍の大きさが縮小した割合をいう。より具体的には、本出願において、縮小率とは、ザルトプロフェン服用前のMRIもしくはX線CTの画像に映った腫瘍の最大割面での１方向の長さを分母とし、ザルトプロフェン継続服用後の画像における対応する値を分子とした比を百分率で表した値を求めて、これを100から引いた値をいう。例えば、ザルトプロフェン服用前後で、腫瘍の最大割面の一方向の長さが50mmから35mmに縮小した場合の縮小率は30％である。 ザルトプロフェン（ソレトン錠（登録商標））を服用した骨巨細胞腫患者（症例c）のザルトプロフェンの服用前（2012年12月13日）および服用後（2013年2月13日）の患部（左腓骨近位部）の横断面のMRI画像である。約9週間にわたってザルトプロフェンを服用することによって、骨巨細胞腫の直径が23.3mmから21.0mmへ縮小したことがわかる。 ザルトプロフェン（ソレトン錠（登録商標））を服用した骨巨細胞腫患者（症例d）のザルトプロフェンの服用前（2013年7月4日）の前額面および横断面のMRI画像ならびに服用後（2013年8月29日）の患部（右脛骨遠位部）の前額面および横断面のX線CT画像である。約8週間にわたってザルトプロフェンを服用することによって、骨巨細胞腫の直径が21.7mmから20.5mmへ縮小したことがわかる。 ザルトプロフェン（ソレトン錠（登録商標））を服用した骨巨細胞腫患者（症例e）のザルトプロフェンの服用前（2013年1月17日）および服用後（2013年9月19日）の患部（肺転移部）の横断面のX線CT画像である。約35週間にわたってザルトプロフェンを服用することによって、肺に転移した骨巨細胞腫の直径が8.2mmから7.9mmへ縮小したことがわかる。 カルノフスキーのパフォーマンスステータス（Karnofsky Performance Status，KPS）の評価基準を示す表である。KPSは、図84に示す基準に従って、患者の状態を100〜0の10段階に分類する評価方法であり、スコアが高いほど患者が日常活動をよりよく行えることを意味している。 骨巨細胞腫に対するザルトプロフェン（ソレトン錠（登録商標））継続服用の効果を纏めた表である。各症例ごとにザルトプロフェンの服用開始前および服用継続後のKPS、レントゲン骨硬化の有無、CTで判別した骨硬化の有無、および骨巨細胞腫の縮小率を記載している。 ザルトプロフェン（ソレトン錠（登録商標））を服用したPVNSを患う症例をまとめた表である。各症例ごとに年齢、性別、PVNSの発生部位、初発/再発の別、治療期間、服用期間、奏効率、コメントおよび患部写真を掲載した場合にはその図面番号を記載している。奏効率の欄の「PR」は「部分奏効」を、「SD」は「安定」を、「PD」は「進行」をそれぞれ表す。 ザルトプロフェン（ソレトン錠（登録商標））を服用したPVNS患者のPVNSの縮小率を示すグラフである。縦軸は縮小率を表す。縮小率が70％であればザルトプロフェンを服用する前の骨巨細胞腫の大きさの30％の大きさに縮小したことを表し、縮小率が-10％であればザルトプロフェンを服用する前の骨巨細胞腫の大きさの110％の大きさに増加したことを表す。横軸のアルファベットは症例を特定するアルファベットである（図86を参照）。 ザルトプロフェン（ソレトン錠（登録商標））を服用したPVNS患者（症例a）のザルトプロフェンの服用前（2012年9月6日）および服用後（2013年8月20日）の患部（肩関節）の前額面のMRI画像である。約50週間にわたってザルトプロフェンを服用することによって、PVNSの直径が27.7mmから7.9mmへ縮小したことがわかる。 ザルトプロフェン（ソレトン錠（登録商標））を服用したPVNS患者（症例c）のザルトプロフェンの服用前（2012年12月6日）および服用後（2013年8月1日）の患部（右膝関節）の矢状面のMRI画像である。約35週間にわたってザルトプロフェンを服用することによって、PVNSの長径が59.5mmから47.2mmへ縮小したことがわかる。 PVNSに対するザルトプロフェン（ソレトン錠（登録商標））継続服用の効果を纏めた表である。各症例ごとにザルトプロフェンの服用開始前および服用継続後のKPSおよび骨巨細胞腫の縮小率を記載している。
本発明は、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫を患う患者の治療、予防もしくは転移の予防を目的として、PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質を有効成分として含有する薬剤を製造することによって実施できる。
本発明はまた、PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質を有効成分として含有する薬剤を、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫を患う患者に投与することによって実施できる。
本発明が適用できる対象は、脊椎動物であれば特に限定されず、好ましくは哺乳動物、より好ましくは、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、最も好ましくはヒトを意味する。
本発明が適用できる対象がヒトである場合、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫であることが臨床的に診断された者に限らず、その疑いがある者、または将来的な発症が予測される者にも適用できる。また、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫を原発病変とする細胞が転移した場合にも本発明が適用できる。
本発明の予防剤、治療剤もしくは転移予防剤の実施形態としては、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫を患う患者の骨を修復ないし形成するための用途も含まれる。同様に、本発明の予防剤、治療剤もしくは転移予防剤の実施形態としては、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫を患う患者の日常活動を遂行する能力を改善するための用途も含まれる。
本発明が適用できる骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍としては、骨・軟部に発生する巨細胞が観察される腫瘍であれば特に制限はない。特に、本発明は、骨、関節や腱鞘周辺に巨細胞を生じる腫瘍に好ましく適用することができる。骨・軟部に発生する巨細胞が観察される腫瘍としては、良性腫瘍であることが好ましい。そのような腫瘍としては、例えば、骨巨細胞腫(GCTB)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)、色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)などが挙げられる。また、その他の骨・軟部に発生する良性の巨細胞性腫瘍としては、軟骨芽細胞腫、非骨化性線維腫、骨芽細胞腫、動脈瘤様骨嚢腫なども挙げられる。
また、本発明が適用できる軟骨肉腫としては、通常型軟骨肉腫、骨膜性軟骨肉腫、間葉性軟骨肉腫、脱分化型軟骨肉腫、淡明細胞型軟骨肉腫、骨外性粘液型軟骨肉腫などが挙げられる。
また、本発明が適用できる骨肉腫としては、通常型と呼ばれる骨芽細胞型，軟骨芽細胞型，線維芽細胞型，血管拡張型，小細胞型，傍骨型骨肉腫などが挙げられる。
本発明は、PPARγの発現を認める腫瘍にも適用できる。PPARγの発現を認める腫瘍としては、乳癌、大腸癌、肺癌、甲状腺癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、悪性黒色腫、白血病、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、平滑筋肉腫、骨肉腫などが挙げられる。
ここで、PPARγとは、核内受容体スーパーファミリーに属する転写因子タンパクであり、PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質は、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫にPPARγを介したアポトーシスまたは脂肪細胞への分化を誘導できる。
したがって、本発明において、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の予防剤、治療剤または転移予防剤として用いることができる物質としては、PPARγの発現誘導活性および／またはPPARγ作動活性を有する物質が望ましい。
本発明において、PPARγアゴニスト活性とは、PPARγに結合して、PPAR応答領域(PPRE)の下流に存在する遺伝子の転写を促進することができる活性をいう。また、かかる活性を有する物質であれば、PPARγアゴニストであるということができる。ここで、PPAR応答領域(PPRE)の下流に存在する遺伝子としては、アポトーシス関連遺伝子、脂肪細胞分化関連遺伝子、動脈硬化関連遺伝子、抗炎症関連遺伝子が挙げられる。
ただし、本発明において、PPARγアゴニストとは、PPARγに結合して、PPAR応答領域(PPRE)の下流に存在する遺伝子の転写を促進することができる物質、または、非ステロイド性抗炎症剤、チアゾリジンジオン誘導体、PPARγアゴニスト活性を有するアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗剤、内因性のPPARγアゴニストからなる群から選択される物質をいう。
本発明において以下に例示するPPARγアゴニストは、たとえ明示的に「塩」、「溶媒和物」、「互変異性体」、「立体異性体」等の表示がなくとも、例示された物質そのものに加えて、その薬理学的に許容される塩、溶媒和物、互変異性体または立体異性体も包含する。
本発明において、PPARγの発現誘導活性を有する物質とは、ゲノム遺伝子からPPARγ遺伝子の転写を促進することができる物質をいう。
本発明において、PPARγの発現誘導活性を有する物質としては、非ステロイド性抗炎症剤を挙げることができる。
非ステロイド性抗炎症剤は、PPARγの発現誘導活性を有し、かつ、PPARγアゴニスト活性を有する。
本発明において、非ステロイド性抗炎症剤とは、一般的な意味での非ステロイド性抗炎症剤を意味し、シクロオキシゲナーゼ１および／またはシクロオキシゲナーゼ２を阻害することにより抗炎症作用、鎮痛作用、解熱作用を有する物質であれば特に制限されない。
非ステロイド性抗炎症剤としては、たとえば、ザルトプロフェン、ジクロフェナク、インドメタシン、プログルメタシン、インドメタシンファルネシル、セレコキシブ、エトドラク、メロキシカム、モフェゾラク、アセメタシン、オキサプロジン、アセトアミノフェン、ロルノキシカム、アンピロキシカム、ピロキシカム、ナプロキセン、ロキソプロフェン、ロフェコキシブ、エテンザミド、ジフルニサル、アルミノプロフェン、ナブメトン、ケトプロフェン、アセチルサリチル酸、イブプロフェン、プラノプロフェン、スリンダクが挙げられる。
中でも、本発明において好ましい非ステロイド性抗炎症剤は、ザルトプロフェン、ジクロフェナク、インドメタシン、プログルメタシン、インドメタシンファルネシル、セレコキシブ、エトドラク、メロキシカム、モフェゾラク、アセメタシン、オキサプロジン、アセトアミノフェン、ロルノキシカム、アンピロキシカム、ピロキシカム、ナプロキセン、ロキソプロフェン、ロフェコキシブ、エテンザミド、ジフルニサル、アルミノプロフェン、ナブメトンである。
本発明においてより好ましい非ステロイド性抗炎症剤は、ザルトプロフェン、ジクロフェナク、インドメタシン、プログルメタシン、インドメタシンファルネシル、セレコキシブ、エトドラク、メロキシカム、モフェゾラク、アセメタシン、オキサプロジン、アセトアミノフェン、ロルノキシカム、アンピロキシカム、ピロキシカム、ナプロキセンである。
そして、本発明において最も好ましい非ステロイド性抗炎症剤は、ザルトプロフェン、ジクロフェナク、インドメタシン、プログルメタシン、インドメタシンファルネシル、セレコキシブ、エトドラク、メロキシカム、モフェゾラク、アセメタシン、である。
本発明において、チアゾリジンジオン誘導体とは、チアゾリジンジオン骨格を有する物質であって、かつ、PPARγアゴニスト活性を有する物質であれば、特に限定されない。
チアゾリジンジオン誘導体の例としては、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、トログリタゾン、イサグリタゾン、ネトグリタゾン、リボグリタゾン、バラグリタゾン、ロベグリタゾン、エングリタゾン、シグリタゾンなどが挙げられる。
本発明において、PPARγアゴニスト活性を有するアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗剤とは、アンジオテンシンII受容体拮抗作用を有し、かつ、PPARγアゴニストとしての活性を有する物質であれば、特に限定されない。PPARγアゴニスト活性を有するアンジオテンシンII受容体拮抗剤としては、特に、イルベサルタンおよびテルミサルタンが好ましい。
本発明において、内因性のPPARγアゴニストとは、生体が自身の体内に内因性に有している物質であって、かつ、PPARγアゴニストとしての活性を有する物質であれば、特に限定されない。内因性のPPARγアゴニストとしては、15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジンJ2、15-hydroxyeicosatetraenoic acid、9-hydroxyoctadecadienoic acid、13-hydroxyoctadecadienoic acid、ニトロリノール酸、または、長鎖脂肪酸が好ましい。
抗がん剤の効果をみる基準として用いられる奏効率とは、抗がん剤などの薬物療法の効果を示す割合のことである。 CT検査などの画像診断で評価対象とした一般的な基準（RECIST）では、腫瘍が完全に消失した「完全奏効（CR）」と、30％以上小さくなった「部分奏効（PR）」の合計を意味する。ここで、「完全奏効」（CR，Complete Response）とは腫瘍が完全に消失した状態を示し、「部分奏効」（PR，Partial Response）とは腫瘍の大きさの和が30％以上減少した状態を示す。また、「安定」（SD，Stable Disease）とは腫瘍の大きさが変化しない状態を示し、「進行」（PD，Progressive Disease）とは腫瘍の大きさの和が20％以上増加かつ絶対値でも5mm以上増加した状態、あるいは新病変が出現した状態を指す。抗がん剤は完全奏効もしくは部分奏効することが望ましいが、「安定」や「進行」であっても、日常活動を遂行する能力が維持されるのであれば、望ましい治療効果であるといえる。
本発明において、日常活動を遂行する能力は、例えば、カルノフスキーのパフォーマンスステータス（以下、「KPS」という。）によって測定することができる。KPSのスコアは0点から100点まであり、スコアが高いほど患者が日常活動をよりよく行えることを意味している。KPSは、患者の予後の判定、活動能力の変化の測定、臨床試験に参加できるかどうかの決定などに用いられる。KPSは、生活の質を測る指標のひとつとしても有用である。
本発明の予防剤、治療剤または転移予防剤の投与量は、有効成分の種類、投与対象、投与対象の年齢、体重、性別及び状態（一般的状態、病状、合併症の有無など）、投与時間、剤形、投与方法などに応じて、適宜選択できる。例えば、ザルトプロフェンをヒト成人に経口投与する場合の投与量は、好ましくは80〜1200mg／日、より好ましくは160〜960mg／日、さらに好ましくは240〜720mg／日、もっとも好ましくは480mg／日である。
本発明の予防剤、治療剤または転移予防剤は、有効成分の他、担体成分、必要により添加剤などを用いて、慣用の製剤化方法、例えば、第十六改正日本薬局方記載の製造法又はこの製造方法に準じた方法により調製できる。
本発明の予防剤、治療剤または転移予防剤の投与方法は、経口投与であってもよく、非経口投与であってもよい。非経口的投与としては、例えば、筋肉内投与、経腸投与、経粘膜投与、経肺投与、経皮投与、経鼻投与、経膣投与、口腔内投与、硬膜外投与、静脈内投与、脊髄内投与、舌下投与、直腸投与、点眼投与、動脈内投与、尿道内投与、皮下投与皮内投与、腹腔内投与が挙げられる。非経口的投与用の剤形としては、例えば、注射剤（液剤、凍結乾燥製剤、懸濁剤等）、坐剤（肛門座剤、膣座剤など）、外用液剤（注入剤、湿布剤、エアゾール剤など）、吸入剤、貼付剤、経皮吸収テープ、パップ剤、皮膚外用剤、クリーム剤、ゲル剤、軟膏剤（パスタ剤、リニメント剤、ローション剤など）などが挙げられる。また、経口投与の剤形としては、例えば、グミ剤、シロップ剤、ゼリー剤、チュアブル錠、トローチ錠、ドライシロップ剤、バッカル錠、フィルムコート錠、フィルム状製剤、丸剤、経口投与用液剤懸濁剤、口腔内崩壊錠、硬カプセル剤、細粒剤、散剤、舌下錠、素錠、腸溶錠、糖衣錠、軟カプセル剤、乳剤、付着錠、粉剤、顆粒剤などが使用できる。
本発明の予防剤、治療剤または転移予防剤の製剤においては、投与経路や剤形などに応じて、公知の添加剤を適宜使用することができる。このような添加剤としては、例えば、滑沢剤、崩壊補助剤、抗酸化剤又は酸化防止剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、溶解剤、溶解補助剤、増粘剤、ｐＨ調整剤又は緩衝剤、安定剤、防腐剤又は保存剤、殺菌剤又は抗菌剤、帯電防止剤、矯味剤又はマスキング剤、着色剤、矯臭剤又は香料、清涼化剤、消泡剤、等張化剤、無痛化剤などが使用できる。これらの添加剤は単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。
本発明の予防剤、治療剤または転移予防剤は、例えば、日本薬局方（局方）の他、(1)医薬品添加物ハンドブック、丸善（株）、(1989)、(2)「医薬品添加物事典2007」（薬事日報社、2007年7月発行）、(3)薬剤学、改訂第５版、（株）南江堂(1997)、及び(4)医薬品添加物規格2003（薬事日報社、2003年8月）などに収載されている成分（例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング剤など）の中から、投与経路及び製剤用途に応じて担体ないし賦形剤を適宜選択して使用できる。
これらの製剤に用いる担体や賦形剤としては、例えば、乳糖、ブドウ糖、白糖、マンニトール、ソルビトール、キシリトールなどの糖類又は糖アルコール類、馬鈴薯デンプン、トウモロコシデンプンなどのデンプン類、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース（微結晶セルロースも含む）などの多糖類、軽質無水ケイ酸などの酸化ケイ素又はケイ酸塩、カンゾウ末、ゲンチアナ末などが使用できる。
これらの製剤に用いる結合剤としては、例えば、」ゼラチン、アルファ化デンプン、部分アルファ化デンプンなどの可溶性デンプン類、アラビアゴム、トラガントゴム、デキストリン、アルギン酸ナトリウムなどの多糖類；ポリビニルピロリドン(PVP)、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール(PVA)、カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸系ポリマー、ポリ乳酸、ポリエチレングリコールなどの合成高分子；メチルセルロース(MC)、エチルセルロース(EC)、カルボキシメチルセルロース(CMC)、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース(HEC)、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)などのセルロースエーテル類などが使用できる。
崩壊剤としては、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、カルメロース、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスポピドン、ゼラチン末、デンプン、寒天、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロースなどが使用できる。
これらの製剤に用いる滑沢剤としては例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マクロゴールなどが使用できる。
注射剤を調製する場合は、必要に応じて、pH調節剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤などを添加して調製できる。
錠剤、顆粒剤を調製する場合は、必要に応じて、コーティング剤としては、例えば、糖類、ヒドロキシプロピルセルロース、ソルビトール、精製セラック、ゼラチン、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロースなどのセルロース誘導体、ポリオキシエチレングリコール、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルメタクリレート−（メタ）アクリル酸共重合体、オイドラギット（メタアクリル酸・アクリル酸共重合物）などを用いることができる。コーティング剤は、セルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルメタクリレート−（メタ）アクリル酸共重合体などの腸溶性成分であってもよく、ジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリレートなどの塩基性成分を含むポリマー（オイドラギットなど）で構成された胃溶性成分であってもよい。また、製剤は、これらの腸溶性成分や胃溶性成分を剤皮に含むカプセル剤であってもよい。
本発明はまた、PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質を有効成分として含有する、動脈塞栓術用局所注入剤または人工骨を、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫を患う患者の手術に際して、患部の動脈に注入するか、または、埋め込むことによって実施できる。
PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質は、動脈塞栓術用局所注入剤または人工骨に含有させて使用することもできる。PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質を有効成分として含有する動脈塞栓術用局所注入剤または人工骨は、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫を患う患者の手術に際して、患部の動脈に注入するか、または、埋め込むことによって、巨細胞性腫瘍または軟骨肉腫にアポトーシスを引き起こして消滅させることができ、また、脂肪細胞へ分化誘導して腫瘍を消滅させることができる。さらに、PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質を有効成分として含有する動脈塞栓術用局所注入剤または人工骨を用いることにより、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の再発および／または転移を防止することができる。
動脈塞栓術とは、動脈にカテーテルを通して、巨細胞性腫瘍または軟骨肉腫の手前の動脈血管を詰まらせる物質を注入することにより、巨細胞性腫瘍または軟骨肉腫へ栄養と酸素が届かないようにして、腫瘍を死滅させる治療法である。
動脈塞栓術用局所注入剤の素材としては、動脈を塞栓することができ、生体に馴染む物質であれば特に制限はないが、ゼラチンスポンジ、ポリビニルアルコール製の球状粒子の他、種々の球状粒子が臨床使用されている。
ゼラチンスポンジは、ゼラチンをスポンジ状に成形したものであり、スポンゼル（登録商標）、ゼルフォーム（登録商標）という名前でも知られている。ゼラチンスポンジの細片を動脈内に注入すると、ゼラチンスポンジは目的の動脈内に停滞して、そこで形成された血栓とともに、その動脈のみをある一定期間閉塞させる。血栓と一体となったゼラチンスポンジ細片は、その場で徐々に体内に吸収されていき、およそ１−２週間で動脈は再開通し、１ヵ月後にはゼラチンスポンジは体内から消失する。
ポリビニルアルコールを100〜300μm、300〜500μm粒、500〜700μm粒程度の大きさの微小片とした物質は、塞栓した血管内に永久的に残存する動脈塞栓術用局所注入剤であり、規格化された大きさの球状物質であるので、カテーテル内で詰まることがなく、使用しやすい。
動脈塞栓術用の球状粒子としては、種々のものが開発されてきており、球状PVA(Biocompatibles社のBead Block)、豚ゼラチンを含浸およびコーティングしたアクリル系共重合体からなる非吸水性の球状粒子(Biosphere Medical社のEmbosphere)、薬剤溶出能を持たせた球状PVA(Biocompatibles社のDC-Bead)、ポリビニルアルコール・アクリル酸共重合体からなる吸水性および膨潤性のあるビーズ(Biosphere Medical社のHepasphere)、特殊フッ素コーティングを施したアクリル系ハイドロゲル(CeloNova社のEmbozene)などが臨床使用されている。
予めこれらの動脈塞栓術用局所注入剤にPPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質を含有させておくことにより、単に巨細胞性腫瘍または軟骨肉腫へ栄養と酸素が届かないようにして死滅させるだけではなく、巨細胞性腫瘍または軟骨肉腫にアポトーシスを引き起こして消滅させることができ、また、脂肪細胞へ分化誘導して腫瘍を消滅させることができるのでより強力な治療効果を得ることができる。
また、動脈塞栓術の前に、腫瘍の直前まで挿入したカテーテルを通して抗がん剤を混ぜたヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルを腫瘍に注入することも良く行われている。ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルは、油性造影剤であるので、抗がん剤の注入状況を確認しつつ、腫瘍細胞の内部まで抗がん剤を到達させることができる。したがって、ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルにPPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質を混ぜたものを動脈に挿入したカテーテルを通して巨細胞性腫瘍または軟骨肉腫に注入し、その後、動脈塞栓術を行うことにより、より強力な治療効果を得ることができる。ヨード化ケシ油脂肪酸エチルエステルは、リピオドール（登録商標）として良く知られている。
本発明において、人工骨とは、骨の欠損部分を補う人工的な素材、および、そのような素材を用いて作製された人工関節を意味する。ここで、人工骨の素材は、非生物由来の素材に限らず、生物由来の素材も含む。また、生物由来の素材は、PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質を含有させる等の人為的な工程を経て調製された自家骨、同種骨、異種骨を含む。
骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の根本的な治療法として切除手術を行った場合、病巣を掻爬ないし切除した後にできる欠損部分を人工骨で補填して骨の強度を確保する必要がある。また、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫は、関節近傍に発生することが多いため、根本的な治療法として切除手術を行った場合、病巣を掻爬ないし切除した後に、人工関節を用いて運動機能を回復する必要がある。
PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質を有効成分として含有する人工骨を用いることにより、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の再発および／または転移を防止することができる。
人工骨の素材には、強度に加えて、加工しやすさや骨との親和性が求められ、そのような人工骨の素材としては、ヒドロキシアパタイト等のリン酸カルシウム系素材、チタン、チタン合金、ステンレス、コバルトクロム合金、タングステンなどの金属、ポリ乳酸、クロスリンクポリエチレン樹脂、シリコンラバー、テフロン（登録商標）、ポリエステル、ＰＶＡハイドロゲルなどのポリマー、ガラス、アルミナ、ジルコニアなどのセラミック、ポリメチルメタクリレートなどの骨セメント、コラーゲン、フィブリンなどのタンパク質、キチン、キトサンなどの多糖類、サンゴ素材、これらの複合材料を用いることができる。
人工骨は、素材の削りだし、充填、立体印刷技術などにより手術前に成型することもできる。そのような人工骨素材としては、骨の成分に近いリン酸カルシウム系の人工骨素材の種類が最も豊富であり、アパセラム（登録商標）、スーパーポア（登録商標）、バイオペックス（登録商標）、ボーンタイト（登録商標）、ボンフィル（登録商標）、ネオボーン（登録商標）、リジェノス（登録商標）、オスフェリオン（登録商標）など、様々な種類のものが商業生産されて臨床使用されている。
人工関節は、通常は、金属、セラミック、ポリエチレン樹脂などの素材を組み合わせた既製品から選択して骨に埋め込んで固定する。
人工骨の素材における、PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質の含有量は、好ましくは、人工骨の素材の重量の約０．１％〜約25%、より好ましくは約1%〜約20％、さらに好ましくは約5％〜約15%である。
本発明のスクリーニング方法は、以下の工程により実施できる；
(1)骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫に由来する細胞または組織を被検物質の存在下または非存在下で培養する工程；
(2)被検物質の存在下または非存在下で、下記の(a)〜(g)からなる群から選択される１以上の指標を測定する工程；
(a)PPARγの遺伝子発現量、PPARγのタンパク量からなる群から選択される１以上の指標、
(b)アポトーシス関連遺伝子の遺伝子発現量、アポトーシス関連遺伝子の翻訳産物のタンパク量、アポトーシス関連遺伝子の翻訳産物の生物活性からなる群から選択される１以上の指標、
(c)脂肪細胞分化関連遺伝子の遺伝子発現量、脂肪細胞分化関連遺伝子の翻訳産物のタンパク量、脂肪細胞分化関連遺伝子の翻訳産物の生物活性、からなる群から選択される１以上の指標、
(d)動脈硬化関連遺伝子の遺伝子発現量、動脈硬化関連遺伝子の翻訳産物のタンパク量、動脈硬化関連遺伝子の翻訳産物の生物活性、からなる群から選択される１以上の指標、
(e)抗炎症関連遺伝子の遺伝子発現量、抗炎症関連遺伝子の翻訳産物のタンパク量、抗炎症関連遺伝子の翻訳産物の生物活性、からなる群から選択される１以上の指標、
(f)PPARγアゴニスト活性であって、アポトーシス関連遺伝子、脂肪細胞分化関連遺伝子、動脈硬化関連遺伝子、抗炎症関連遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子の転写を促進することができる活性である指標、
(g)脂肪細胞または脂肪組織中に含まれる脂質の量；
(3)被検物質非存在下における細胞内指標と比較して、被検物質の存在下における前記の細胞内指標を変動させる被検物質を選択する工程。
本発明のスクリーニング方法に用いる骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫に由来する細胞の調製は、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫であることが臨床的に診断された患者の腫瘍切除手術により摘出した細胞を初代培養して、あるいは、これを公知の方法により株化細胞にしたものを使用することができる。
細胞の株化は当該分野で通常実施されている方法や、公知文献に従って調製することができる。また、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫に由来する細胞は、該細胞を含む任意の組織（例、滑膜、関節、軟骨等）であってもよい。
本発明のスクリーニング方法に用いる骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫に由来する細胞の培養条件は、公知の方法に従って適宜調整可能であるが、具体的には、たとえば、本明細書の実施例に記載の方法にしたがって培養できる。
本発明において、PPARγアゴニスト活性およびPPARγ発現誘導活性は、公知の方法で確認することができる。
具体的には、PPARγの遺伝子発現量の測定は、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫から通常の方法でｍＲＮＡを抽出し、PPARγ転写産物を増幅できるようなプライマーを用いて、逆転写反応およびＰＣＲを行う方法により測定することができる。PPARγの転写産物、翻訳産物は公知であり、例えば、転写産物としてGenBankのaccession No.BC006811に塩基配列情報が開示されている。
アポトーシス関連遺伝子、脂肪細胞分化関連遺伝子、動脈硬化関連遺伝子、抗炎症関連遺伝子の各遺伝子発現量もまた、既に述べたPPARγの遺伝子発現量の測定と同様に、各遺伝子について公知の遺伝子情報に基づいて公知の方法により測定できる。
また、たとえば、PPARγのタンパク量の測定は、PPARγタンパクに対する抗体を用いて、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の固定標本または細胞破砕物を測定試料として、PPAR抗原抗体反応により測定することができる。PPARγ遺伝子の翻訳産物は、GenBankのaccession No.AAH06811にアミノ酸配列情報が開示されている。
また、PPARγ作動活性は、例えば、PPARγとRXRのヘテロ複合体からコリプレッサータンパク複合体が解離したことを検出してもよいし、PPARγとRXRのヘテロ複合体にコアクチベータータンパク複合体が結合したことを検出してもよい。また、PPARγ作動活性は、下流遺伝子の発現レベルまたは脂質の発現レベルを測定することによっても確認することができる。
また、アポトーシス関連遺伝子、脂肪細胞分化関連遺伝子、動脈硬化関連遺伝子、抗炎症関連遺伝子の各翻訳産物のタンパク量もまた、既に述べたPPARγのタンパク量の測定と同様に、各遺伝子について公知の情報に基づいて公知の方法により測定できる。
PPARγアゴニスト活性の測定方法は、PPARγに結合してPPARγタンパクの立体構造を変化させる能力を測定することもできるし、PPAR応答領域(PPRE)の下流に存在する遺伝子の転写物ないしその翻訳産物の量を測定することもできる。PPARγタンパクの立体構造を変化させる能力の測定方法としては、既知のアゴニストとの競合的結合を指標としても良いし、表面プラズモン共鳴を利用してもよい。
PPAR応答領域(PPRE)の下流遺伝子としては、例えば、アポトーシス関連遺伝子、脂肪細胞分化関連遺伝子、動脈硬化関連遺伝子、抗炎症関連遺伝子などが挙げられる。
ここで、アポトーシス関連遺伝子としては、アポトーシスシグナルを担う遺伝子であってよいし、アポトーシスのマーカー遺伝子であってもよい。アポトーシス関連遺伝子としては、例えば、Caspase3、p53などが挙げられる。
Caspase3の転写産物としては、例えば、GenBankのaccession No.BC016926に塩基配列情報が開示されており、またその翻訳産物としては、GenBankのaccession No.AAH16926にアミノ酸配列情報が開示されている。Caspase3遺伝子の翻訳産物の生物活性は、アポトーシスによって測定できるほか、システインプロテアーゼ活性によっても測定できる。
p53の転写産物としては、例えば、GenBankのaccession No.NM_000546に塩基配列情報が開示されており、またその翻訳産物としては、GenBankのaccession No.NP_000537にアミノ酸配列情報が開示されている。p53遺伝子の翻訳産物の生物活性は、アポトーシスによって測定できるほか、細胞周期の制御の変化によっても測定できる。
また、脂肪細胞分化関連遺伝子としては、脂肪細胞への分化を誘発する遺伝子であってよいし、脂肪細胞分化のマーカー遺伝子であってもよい。
脂肪細胞分化関連遺伝子としては、例えば、Setd8(SET domain containing(lysine methyltransferase)8)、Setdb1(SET domain, bifurcated 1)、LPL(Lipoprotein Lipase)、Leptin、FABP4/aP2(fatty acid-binding protein-4)、Adiponectin、a2Col6(α chain 2 of type 6 collagen)などが挙げられる。
Ｓｅｔｄ８の転写産物としては、例えば、GenBankのaccession No.NM_020382に塩基配列情報が開示されており、またその翻訳産物としては、GenBankのaccession No.NP_065115にアミノ酸配列情報が開示されている。Setd8遺伝子の翻訳産物の生物活性は、脂質産生量によって測定できるほか、ヒストンH4タンパクの20番目のリジンをメチル化する酵素活性によっても測定できる。
Setdb1の転写産物としては、例えば、GenBankのaccession No.NM_012432に塩基配列情報が開示されており、またその翻訳産物としては、GenBankのaccession No.NP_036564にアミノ酸配列情報が開示されている。Setdb1遺伝子の翻訳産物の生物活性は、脂質産生量によって測定できるほか、ヒストンH3タンパクの9番目のリジンをメチル化する酵素活性によっても測定できる。
LPLの転写産物としては、例えば、GenBankのaccession No.NM_000237に塩基配列情報が開示されており、またその翻訳産物としては、GenBankのaccession No.NP_000228にアミノ酸配列情報が開示されている。LPL遺伝子の翻訳産物の生物活性は、リポプロテインリパーゼ活性によって測定できる。
Leptinの転写産物としては、例えば、GenBankのaccession No.NM_000230に塩基配列情報が開示されており、またその翻訳産物としては、GenBankのaccession No.NP_000221にアミノ酸配列情報が開示されている。Leptin遺伝子の翻訳産物の生物活性は、哺乳動物に静脈投与したときの食欲抑制作用によって測定できるほか、レプチン受容体を発現する細胞にレプチンタンパクが結合した際の細胞内信号によっても測定できる。
FABP4/aP2（脂肪細胞特異的脂肪酸結合タンパク質 ）の転写産物としては、例えば、GenBankのaccession No.NM_001442に塩基配列情報が開示されており、またその翻訳産物としては、GenBankのaccession No.NP_001433にアミノ酸配列情報が開示されている。FABP4/aP2遺伝子の翻訳産物の生物活性は、これを発現する細胞の脂肪分解の効率によって測定できる。
Adiponectinの転写産物としては、例えば、GenBankのaccession No.NM_004797に塩基配列情報が開示されており、またその翻訳産物としては、GenBankのaccession No.NP_004788にアミノ酸配列情報が開示されている。Adiponectin遺伝子の翻訳産物の生物活性は、これを肝または骨格筋の細胞に作用させたときに生じるAMPキナーゼの活性化作用、脂肪酸燃焼作用、糖取込み促進作用によって測定できる
a2Col6の転写産物としては、例えば、GenBankのaccession No.BC065509に塩基配列情報が開示されており、またその翻訳産物としては、GenBankのaccession No.AAH65509にアミノ酸配列情報が開示されている。a2Col6遺伝子の翻訳産物の生物活性は、脂肪細胞への分化を指標として測定できる。
動脈硬化関連遺伝子としては、例えば、AT1R(angiotensin II receptor I)などが挙げられる。AT1Rの転写産物としては、例えば、GenBankのaccession No.NM_000685に塩基配列情報が開示されており、またその翻訳産物としては、GenBankのaccession No.NP_000676にアミノ酸配列情報が開示されている。AT1R遺伝子の翻訳産物の生物活性は、アンジオテンシンIIをリガンドとした発現細胞の検出によって測定できる。
抗炎症関連遺伝子としては、例えば、NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)などが挙げられる。NF-κＢの転写産物としては、例えば、GenBankのaccession No.NM_003998に塩基配列情報が開示されており、またその翻訳産物としては、GenBankのaccession No.NP_003989にアミノ酸配列情報が開示されている。NF-κB遺伝子の翻訳産物の生物活性は、IκBとの解離によって測定できるほか、NF-κBの核内移行によっても測定できる。
また、脂肪細胞または脂肪組織中に含まれる脂質としては、特に制限されないが、リン脂質、糖脂質、リポタンパク質、中性脂肪、セラミドなどが挙げられる。
具体的には、PPARγ発現誘導活性の測定は、細胞からRNA(例:全RNA、mRNA)画分を調製し、該画分中に含まれるPPARγ遺伝子の転写産物を検出することにより調べることができる。ＲＮＡ画分の調製は、グアニジン-CsCl超遠心法、AGPC法など公知の手法を用いて行うことができるが、市販のＲＮＡ抽出用キット（例：RNeasy Mini Kit;QIAGEN社製等）を用いて、少ない細胞から迅速且つ簡便に高純度の全ＲＮＡを調製することができる。ＲＮＡ画分中の該遺伝子の転写産物を検出する手段としては、例えば、ハイブリダイゼーション（ノーザンブロット、ドットブロット、ＤＮＡチップ解析等）を用いる方法、あるいはPCR(RT-PCR、競合PCR、リアルタイムPCR等）を用いる方法などが挙げられる。微量試料から迅速且つ簡便に定量性よく該遺伝子の発現変動を検出できる点で競合PCRやリアルタイムPCRなどの定量的PCR法が好ましい。
かかる測定方法の詳細については、例えば、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)第2版(J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab.Press,1989)を参照して実施できる。
細胞におけるPPARγ遺伝子の発現は、該細胞からタンパク質画分を調製し、該画分中に含まれる該遺伝子の翻訳産物（即ち、PPARγタンパク）を検出することにより調べることができる。PPARγの検出は、該タンパク質を特異的に認識する抗体を用いて、免疫学的測定法（例：ELISA、FIA、RIA、ウェスタンブロット等）によって行うこともできるし、該タンパク質の有する活性を、公知の手法を用いて測定することによっても行い得る。あるいはまた、該タンパク質の検出は、MALDI-TOFMS等の質量分析法を用いても行うことができる。
これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。例えば、入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」Vol.70(Immunochemical Techniques(PartA))、同書Vol.73(Immunochemical Techniques(PartB))、同書Vol.74(Immunochemical Techniques(PartC))、同書Vol.84(Immunochemical Techniques(PartD:Selected Immunoassays))、同書Vol.92(Immunochemical Techniques(PartE:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同書Vol.121(Immunochemical Techniques(PartI:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
PPARγ作動活性の測定は、前述したPPARγ発現誘導活性の測定と同様に、細胞からRNA画分、タンパク質画分または脂質画分を調製し、該画分中に含まれるPPARγの下流遺伝子（例えば、アポトーシス関連遺伝子、脂肪細胞分化関連遺伝子、動脈硬化関連遺伝子、抗炎症関連遺伝子など）の転写産物、翻訳産物または脂質を検出することにより調べることができる。RNA画分、タンパク質画分の調製方法およびその検出方法は、前述したPPARγ発現誘導活性の測定方法に従ってよい。
脂質の調製方法としては、公知の方法を用いて調製してよく、例えば、脂質を含有する試料中からクロロホルム−メタノール混合物等の溶媒を試料の数倍容加えて抽出するフォルヒ(Folch)法や、クロロホルム−メタノール−水混合物等の溶媒を数倍容加えて抽出するブライ−ダイアー(Bligh-Dyer)法等が用いられうる。また、分離された脂質の検出方法としては、液体クロマトグラフィー(LC)、ガスクロマトグラフィー(GC)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)などの公知の手法を用いて検出することができる。あるいは、脂肪細胞、組織に含有される脂質を直接検出する方法も用いられうる。そのような方法に用いることができる試薬等は市販されており、たとえば、HCS LipidTOXリン脂質症／脂質症検出キット(Invitrogen社)などを用いることができる。
本発明のスクリーニング方法において測定される細胞内指標の変動とは、細胞内指標の増加であってもよいし、細胞内指標の低下であってもよいが、細胞内指標の増加が好ましい。
以下において、実施例および参考例により本発明をより具体的にするが、この発明はこれらに限定されるものではない。
実施例1 ヒト骨巨細胞腫(GCT)培養細胞にザルトプロフェンを添加して培養した後の細胞増殖抑制およびアポトーシスの解析。
GCTB培養細胞(case1:右大腿骨遠位部骨巨細胞腫患者、20歳代；case2:右大腿骨遠位部骨巨細胞腫患者、20歳代）は、Cheng YYらの報告(Cheng YY, Huang L, Lee KM, et al. 2004. Bisphosphonates induce apoptosis of stromal tumor cells in giant cell tumor of bone. Calcif Tissue Int 75:71-77.)を参照して患者由来の腫瘍組織から2mM L-グルタミン，10%ウシ胎仔血清(FBS),100U/mL ペニシリンおよび100μg/mL ストレプトマイシンを添加したDMEM培地を用いて細胞培養を行い、初期には多核巨細胞が混在した状態から徐々に紡錘形細胞のみが存在する状態となるまで継代を繰り返して、その後の解析に用いた。細胞増殖抑制の解析は、2mM L-グルタミン，10%ウシ胎仔血清 (FBS)，100 U/mL ペニシリンおよび100μg/mL ストレプトマイシンを添加したDMEM培地を用いて、37℃の5%CO2/95%airインキュベーター中で、96wellの培養プレートで一晩、サブコンフルエントになるまで培養し、ザルトプロフェンを各濃度(5、10、50、100、200μM)で添加し、24時間後にCell Counting Kit-8(CCK-8)(Dojindo社)で発色し、3時間後に450nmの吸光度を測定した(図1)。その結果、ザルトプロフェン濃度依存的に、細胞増殖が抑制されていることが確認できた。なお、ザルトプロフェンは、終濃度の1000倍の濃度のDMSO(ジメチルスルホキシド)を用意して、これを培地の0.1%の量で添加した。以下の実施例において、他の薬剤についても同様である。
また、上記case1のGCTB培養細胞を、チャンバーカバースライドガラス上に培養し、24時間後にザルトプロフェンを、各濃度(100、200μM)で添加した。8時間後と24時間後に、４％パラホルムアルデヒドで固定し、Caspase3の染色と、Tunel assayを行いアポトーシスの有無について解析した。Tunel assayは、アポトーシスの過程で生じる断片化DNAを, TdT-mediated dUTP nick end labeling法(TUNEL)により検出した。観察は、Keyence社の蛍光顕微鏡(BZ-9000)で行い、各濃度における陽性像を定量的に観察した（図2-5）。その結果、ザルトプロフェン濃度および投与時間依存的に、Tunel陽性率およびCaspase3陽性率が上昇していることが確認できた。
したがって、ザルトプロフェンは骨巨細胞腫(GCT)の予防または治療に有用であることが実証された。また、ザルトプロフェンによる骨巨細胞腫(GCT)の増殖抑制はアポトーシスによる細胞死に基づくものであることが実証された。
実施例2 ヒト骨巨細胞腫(GCTB)培養細胞にザルトプロフェンを添加して培養した後のPPARγ免疫染色。
上記case1のGCTB培養細胞を、チャンバーカバースライドガラス上に培養し、24時間後に、ザルトプロフェンを、各濃度(10、50、100、200μM)で添加した。24時間後に、4%パラホルムアルデヒドで固定し、PPARγの免疫組織化学染色を行った。PPARγタンパクの検出は、一次抗体としてSanta Cruz Biotechnology, Inc. のSC-7273の抗体を用い、二次抗体としてeBioscience 社のRat anti-mouse IgG FITC（11-4011-85）を用いて蛍光検出した。観察は、Keyence社の蛍光顕微鏡(BZ-9000)で行い、各濃度における陽性像を定量的に観察した(図6、7)。その結果、ControlではPPARγの発現は約15%であったが、ザルトプロフェン濃度依存的に、PPARγの発現が亢進していることが確認できた。
したがって、ザルトプロフェンは、PPARγの発現の亢進に基づいて骨巨細胞腫(GCTB) の予防または治療をすることができることが実証された。
実施例3 ヒト骨巨細胞腫(GCTB)培養細胞にザルトプロフェンを添加して培養した後のGCTB培養細胞の脂肪細胞分化の解析。
PPARγは、脂肪細胞分化に必須の転写因子であることが報告されている。そこで、上記case1のGCTB培養細胞を、チャンバーカバースライドガラス上で培養し、コンフレントとなったところで、ザルトプロフェンを、各濃度(10、50、100μM)で添加した。24時間後より脂肪分化誘導培地(STREMPRO Adipogenesis Differentiation Kit;Invitrogen)で7〜14日培養し、脂肪細胞への分化をHCS Lipid TOX Green neutral lipid stain(Invitrogen)で解析した（図８、９）。その結果、ControlではHCS Lipid TOX Greenの陽性像がわずかであったが、ザルトプロフェン濃度依存的に、HCS Lipid TOX Greenの陽性像が亢進していることが確認できた。
したがって、ザルトプロフェンは、骨巨細胞腫(GCTB)を脂肪細胞へ分化誘導して消滅させることにより骨巨細胞腫(GCTB) の予防または治療をすることができることが実証された。
実施例4 ザルトプロフェンを投与された骨巨細胞腫(GCTB)患者の患部の細胞のアポトーシスの解析。
腫瘍による疼痛に対して、ザルトプロフェン錠であるソレトン錠80（一般名：ザルトプロフェン80mg、日本ケミファ株式会社）を３錠／日で約28日間投与された後に手術を施行した30代の男性の手術切除標本と、対照としてザルトプロフェン未投与の患者（標準的治療により通常の手術で切除した症例）から摘出した骨巨細胞腫の手術切除標本をCaspase3の染色と、Tunel assayを行いアポトーシスの有無について解析した。Caspase3タンパクの検出は、一次抗体としてAnti-ACTIVE Caspase-3 Ab（ロッシュ）（G7481）(12-4739-81)を用い、二次抗体としてeBioscience 社のDonkey F2 Fragment anti-Rabbit IgG PEを用いて蛍光検出した。観察は、Keyence社の蛍光顕微鏡(BZ-9000)で行った(図10)。その結果、ザルトプロフェン未投与のGCTB患者由来の細胞ではTunel陽性細胞およびCaspase3陽性細胞がほとんど確認できなかったが、ザルトプロフェン投与された患者由来の細胞では、Tunel陽性細胞およびCaspase3陽性細胞が確認できた。
したがって、ザルトプロフェンによる骨巨細胞腫(GCTB)の増殖抑制はアポトーシスによる細胞死に基づくものであることがヒトで実証された。
実施例5 ザルトプロフェンを投与された骨巨細胞腫(GCTB)患者の患部の細胞のPPARγ免疫染色。
腫瘍による疼痛に対して、ザルトプロフェン錠であるソレトン錠80（一般名：ザルトプロフェン80mg、日本ケミファ株式会社）を3錠／日で約28日間投与された後に手術を施行した30代の男性の手術切除標本と、対照としてザルトプロフェン未投与の患者（標準的治療により通常の手術で切除した症例）から摘出した骨巨細胞腫の手術切除標本をPPARγの染色を行い、PCR法によってPPARγの発現を解析した。PCRには、QIAGEN 社のHs_PPARG_1_SG QuantiTect Primer Assay (200) (QT00029841)を用いた。観察は、Keyence社の蛍光顕微鏡(BZ-9000)で行った(図11)。その結果、ザルトプロフェン未投与のGCTB患者由来の細胞ではPPARγ発現細胞がほとんど確認できなかったが、ザルトプロフェンを投与された患者由来の細胞では、PPARγ発現細胞が確認でき、さらに脂肪分化が確認された。
したがって、ザルトプロフェンは、PPARγの発現の亢進に基づいて骨巨細胞腫(GCTB)を脂肪細胞へ分化誘導して消滅させることにより骨巨細胞腫(GCTB) の予防または治療をすることができることがヒトで実証された。
実施例6 ヒト骨巨細胞腫(GCTB)培養細胞に非ステロイド性抗炎症剤を添加して培養した後の細胞増殖抑制の解析。
実施例１と同様の方法で、GCTB培養細胞(case1、case2)を培養し、非ステロイド性抗炎症剤（アセトアミノフェン、インドメタシンまたはジクロフェナク）またはトログリタゾンを各濃度で添加して450nmの吸光度を測定した(図12、13)。その結果、薬剤濃度依存的に、細胞増殖が抑制されていることが確認できた。
したがって、これらの非ステロイド性抗炎症剤（アセトアミノフェン、インドメタシンおよびジクロフェナク）ならびにトログリタゾンは、骨巨細胞腫(GCTB) の予防または治療をすることができることが実証された。
実施例7 PPARγ siRNAの存在／非存在下で培養したヒト骨巨細胞腫(GCTB)培養細胞におけるザルトプロフェンおよびトログリタゾンの細胞増殖阻害PPAR効果。
96wellの培養プレートで細胞(case1、case2)を培養し、PPARγの発現を選択的に抑制するPPARγ-siRNA(Dharmacon社製のカタログ番号M-003436-02-0005)及びコントロールsiRNA(Dharmacon社製のカタログ番号D-001206-14-05, 終濃度100nM)、遺伝子発現抑制作用を有さないようにデザインされたネガティブコントロールsiRNAおよびトランスフェクション試薬のみ(Thermo Scientific DharmaFECT:Thermo Scientific社）を48時間反応させたのちに通常の培養液で48時間培養し、その後ザルトプロフェンを200μMまたはトログリタゾンを60μMで添加し、72時間後にCell Counting Kit-8(CCK-8) (Dojindo社）で発色し、3時間後に450nmの吸光度を測定した(図14、15)。その結果、PPARγ siRNA添加群では、ザルトプロフェンおよびトログリタゾンのGCTB培養細胞に対する細胞増殖阻害効果が有意に抑制されたことが確認できた。
したがって、ザルトプロフェンおよびトログリタゾンは骨巨細胞腫(GCTB)の予防または治療に有用であることが実証された。また、ザルトプロフェンおよびトログリタゾンによる骨巨細胞腫(GCTB)の増殖抑制にはPPARγの発現が必須であることが実証された。
実施例8 ヒト腱鞘巨細胞腫(GCTT)細胞またはヒト色素性絨毛結節性滑膜炎（PVNS）細胞に非ステロイド性抗炎症剤またはチアゾリジン誘導体を添加して培養した後の細胞増殖抑制およびアポトーシスの解析。
解析に用いた腱鞘巨細胞腫(GCTT)の培養細胞（標準的治療により手術のみ施行した右膝腱鞘巨細胞腫患者、30歳代）および色素性絨毛結節性滑膜炎（PVNS）の培養細胞（症例kの左膝色素性絨毛結節性滑膜炎患者、30歳代）は、実施例１と同様に、Cheng YYらの報告（Cheng YY, Huang L, Lee KM, et al. 2004. Bisphosphonates induce apoptosis of stromal tumor cells in giant cell tumor of bone. Calcif Tissue Int 75:71-77.）を参照して患者由来の腫瘍組織から2mM L-グルタミン，10%ウシ胎仔血清（FBS），100U/mL ペニシリンおよび 100μg/mL ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地を用いて細胞培養を行い、初期には多核巨細胞が混在した状態から徐々に紡錘形細胞のみが存在する状態となるまで継代を繰り返して、その後の解析に用いた。細胞増殖抑制の解析は、2mM L-グルタミン，10%ウシ胎仔血清（FBS），100 U/mL ペニシリンおよび100μｇ／mL ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地を用いて、37℃の5％CO2/95%airインキュベーター中で、96wellの培養プレートで一晩、サブコンフルエントになるまで培養し、ザルトプロフェン（50、100、200、400、800μM）またはトログリタゾン（12.5、25、50、100、200μM）を添加し、24時間後にCell Counting Kit-8(CCK-8)(Dojindo社)で発色し、3時間後に450nmの吸光度を測定した（図16、17）。その結果、ザルトプロフェンまたはトログリタゾンの濃度依存的に、細胞増殖が抑制されていることが確認できた。
したがって、ザルトプロフェンおよびトログリタゾンは腱鞘巨細胞腫(GCTT)および色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)の予防または治療に有用であることが実証された。
また実施例1と同様に、ヒト腱鞘巨細胞腫(GCTT)培養細胞およびヒト色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)培養細胞について、Caspase3の染色およびTunel assayを行いアポトーシスの有無を解析した(図18-25)。その結果、ザルトプロフェンを濃度400μMまたはトログリタゾンを濃度200μMで添加された細胞は、Controlに比べて、Tunel陽性率およびCaspase3陽性率が上昇していることが確認できた。
したがって、ザルトプロフェンおよびトログリタゾンは、アポトーシスによる細胞死に基づいて腱鞘巨細胞腫(GCTT)および色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)の細胞増殖を抑制することが実証された。
実施例9 ヒト腱鞘巨細胞腫(GCTT)細胞または色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)細胞に非ステロイド性抗炎症剤またはチアゾリジン誘導体を添加して培養した後のPPARγ免疫染色。
実施例2と同様に、腱鞘巨細胞腫(GCTT)細胞または色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)細胞に、ザルトプロフェンを濃度400μMまたはトログリタゾンを濃度200μMで添加し、PPARγ陽性像を観察した(図26-29)。その結果、ザルトプロフェンまたはトログリタゾン添加細胞ではPPARγの発現が確認できた。
したがって、ザルトプロフェンおよびトログリタゾンは、PPARγの発現の亢進に基づいて腱鞘巨細胞腫(GCTT)および色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)の予防または治療をすることができることが実証された。
実施例10 ヒト腱鞘巨細胞腫(GCTT)細胞またはヒト色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)細胞に非ステロイド性抗炎症剤を添加して培養した後の脂肪細胞分化の解析。
PPARγは、脂肪細胞分化に必須の転写因子であることが報告されている。そこで、実施例3と同様に、腱鞘巨細胞腫(GCTT)細胞または色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)細胞に、ザルトプロフェンを濃度400μMで添加し、脂肪細胞への分化を解析した(図30、31)。その結果、ザルトプロフェン添加細胞ではHCS LipidTOX Greenの陽性像がControlに比べて亢進していることが確認できた。
したがって、ザルトプロフェンは、腱鞘巨細胞腫(GCTT)および色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)を脂肪細胞へ分化誘導して消滅させることにより腱鞘巨細胞腫(GCTT)および色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS) の予防または治療をすることができることが実証された。
実施例11 ヒト骨巨細胞腫(GCTB)培養細胞、腱鞘巨細胞腫(GCTT) 培養細胞および色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)培養細胞にピオグリタゾンを添加して培養した後の細胞増殖抑制の解析。
実施例1と同様の方法で、GCTB培養細胞(case1、case2)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)細胞または色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)細胞を培養し、チアゾリジン誘導体であるピオグリタゾンを各濃度で添加して450nmの吸光度を測定した(図32)。その結果、ピオグリタゾン濃度依存的に、細胞増殖が抑制されていることが確認できた。
したがって、ピオグリタゾンは骨巨細胞腫(GCTB)、腱鞘巨細胞腫(GCTT) および色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)の予防または治療に有用であることが実証された。
実施例12 ザルトプロフェンを投与された骨巨細胞腫(GCTB)患者、腱鞘巨細胞腫(GCTT)患者または色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)患者の患部のMRI画像の解析。
骨巨細胞腫(GCTB)患者、腱鞘巨細胞腫(GCTT)患者または色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)患者に対して、ソレトン錠80（一般名：ザルトプロフェン80mg、日本ケミファ株式会社）を3錠／日（朝・昼・夕に1錠ずつ服用）で服用してもらい、数か月ごとにMRIで腫瘍のサイズを評価した。代表症例として、骨巨細胞腫(GCTB)の骨盤部再発例（34歳、女性：図33、34）において、2ヶ月後（図35）、4ヵ月後（図36）において次第に腫瘍の縮退が確認できた。また、右膝の色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)の再発例（26歳、女性：図37、38）において、3ヵ月後（図39、40）にMRI造影効果の減弱が確認でき、疼痛・膝関節可動域に改善が見られた。さらに、別の右膝の色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)の再発例（38歳、女性：図41、42）において2ヵ月後（図43、44）に腫瘤の縮小が確認でき、疼痛改善が見られた。
したがって、ザルトプロフェンは骨巨細胞腫(GCTB)、腱鞘巨細胞腫(GCTT) および色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)の予防または治療に有用であることがヒトで実証された。
実施例13 ヒト軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS)に非ステロイド性抗炎症剤またはチアゾリジン誘導体を添加して培養した後の細胞増殖抑制およびアポトーシスの解析。
実施例1と同様に、軟骨肉腫細胞株を培養し、トログリタゾン、ピオグリタゾンまたはザルトプロフェンを各濃度で添加し、吸光度を測定した（図４５）。なお、H-EMC-SS細胞は理研バイオリソースセンターより入手した。その結果、トログリタゾン、ピオグリタゾンまたはザルトプロフェン濃度依存的に、細胞増殖が抑制されていることが確認できた。
したがって、トログリタゾン、ピオグリタゾンおよびザルトプロフェンは、軟骨肉腫の予防または治療に有用であることが実証された。
また実施例１と同様に、軟骨肉腫細胞株について、Caspase3の染色を行いアポトーシスの有無を解析した（図46、47）。その結果、ザルトプロフェンを濃度200μM、トログリタゾンを濃度100μMまたはピオグリタゾンを濃度200μMで添加された細胞は、Controlに比べて、Caspase3陽性率が上昇していることが確認できた。
したがって、トログリタゾン、ピオグリタゾンおよびザルトプロフェンによる軟骨肉腫の増殖抑制はアポトーシスによる細胞死に基づくものであることが実証された。
実施例14 ヒト軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS)に非ステロイド性抗炎症剤またはチアゾリジン誘導体を添加して培養した後のPPARγ免疫染色。
実施例２と同様に、軟骨肉腫細胞株に、ザルトプロフェンを濃度200μM、トログリタゾンを濃度100μMまたはピオグリタゾンを濃度200μMで添加し、PPARγ陽性像を観察した(図48、49)。その結果、ザルトプロフェン、トログリタゾンまたはピオグリタゾン添加細胞ではPPARγの発現が確認できた。
したがって、ザルトプロフェン、トログリタゾンおよびピオグリタゾンは、PPARγの発現の亢進に基づいて軟骨肉腫の予防または治療をすることができることが実証された。
実施例15 ヒト骨巨細胞腫(GCTB)細胞、ヒト腱鞘巨細胞腫(GCTT)細胞、ヒト色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)細胞、および、ヒト軟骨肉腫細胞株における、各種チアゾリジンジオン誘導体および各種非ステロイド性抗炎症剤の細胞増殖抑制効果の解析。
実施例1、実施例6、実施例8、実施例11、実施例13と同様の方法で、各種のチアゾリジンジオン誘導体および非ステロイド性抗炎症剤の細胞増殖抑制効果を解析した。骨巨細胞腫細胞(GCT-1、GCT-2）については実施例1および実施例6と同様に行い、腱鞘巨細胞腫細胞および色素性絨毛結節性滑膜炎細胞については実施例8と同様に行い、軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS、SW1353)については、実施例13と同様の方法で行い、450nmの吸光度を測定した。なお、H-EMC-SS細胞は理研バイオリソースセンターより入手した。また、SW1353細胞はATCCより入手したものを使用した。その結果、以下の結果が得られた。
ピオグリタゾン(50μm,100μm,200μm)は、濃度依存的に、骨巨細胞腫細胞(GCT-1、GCT-2)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎細胞および軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS、SW1353)の増殖を抑制することが確認できた（図50）。
トログリタゾン(12.5μm,25μm,50μm,100μm,200μm)は、濃度依存的に、骨巨細胞腫細胞(GCT-1、GCT-2)、腱鞘巨細胞腫細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎細胞および軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS、SW1353)の増殖を抑制することが確認できた(図51)。
ロシグリタゾン(50μm,100μm,200μm,400μm,800μm)は、濃度依存的に、骨巨細胞腫細胞(GCT-1、GCT-2)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎細胞および軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS、SW1353)の増殖を抑制することが確認できた（図52）。
ザルトプロフェン(骨巨細胞腫細胞については5μm,10μm,50μm,100μm, 200μm;腱鞘巨細胞腫細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎細胞および軟骨肉腫細胞株については50μm,100μm,200μm,400μm,800μm)は、濃度依存的に、骨巨細胞腫細胞(GCT-1、GCT-2)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎細胞および軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS、SW1353)の増殖を抑制することが確認できた(図53)。
ジクロフェナク(骨巨細胞腫細胞については5μm,10μm,50μm,100μm, 200μm;腱鞘巨細胞腫(GCTT)細胞については25μm,50μm,100μm;色素性絨毛結節性滑膜炎細胞および軟骨肉腫細胞株については25μm,50μm,100μm,200μm, 400μm)は、濃度依存的に、骨巨細胞腫細胞(GCT-1、GCT-2)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎細胞および軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS、SW1353)の増殖を抑制することが確認できた(図54)。
インドメタシン(骨巨細胞腫細胞については5μm,10μm,50μm,100μm, 200μm;腱鞘巨細胞腫(GCTT)細胞については12.5μm,25μm,50μm;色素性絨毛結節性滑膜炎細胞については12.5μm,25μm,50μm,100μm,200μm;軟骨肉腫細胞株については50μm,100μm,200μm,400μm,800μm)は、濃度依存的に、骨巨細胞腫細胞(GCT-1、GCT-2)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎細胞および軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS、SW1353)の増殖を抑制することが確認できた(図55)。
セレコキシブ(12.5μm,25μm,50μm,100μm,200μm)は、濃度依存的に、骨巨細胞腫細胞(GCT-1、GCT-2)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎細胞および軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS、SW1353)の増殖を抑制することが確認できた(図56)。
エトドラク(50μm,100μm,200μm)は、濃度依存的に、骨巨細胞腫細胞(GCT-1、GCT-2)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎細胞および軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS、SW1353)の増殖を抑制することが確認できた(図57)。
メロキシカム(50μm,100μm,200μm)は、濃度依存的に、骨巨細胞腫細胞(GCT-1、GCT-2)、腱鞘巨細胞腫細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎細胞および軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS、SW1353)の増殖を抑制することが確認できた(図58)。
モフェゾラク(12.5μm,25μm,50μm,100μm,200μm)は、濃度依存的に、骨巨細胞腫細胞(GCT-1、GCT-2)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎細胞および軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS、SW1353)の増殖を抑制することが確認できた(図59)。
アセメタシン(50μm,100μm,200μm,400μm,800μm)は、濃度依存的に、骨巨細胞腫細胞(GCT-1、GCT-2)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎細胞および軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS、SW1353)の増殖を抑制することが確認できた(図60)。
オキサプロジン(骨巨細胞腫細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎細胞、および、軟骨肉腫細胞株については50μm,100μm,200μm,400μm,800μm;腱鞘巨細胞腫細胞については、50μm,100μm,200μm)は、濃度依存的に、骨巨細胞腫細胞(GCT-1、GCT-2)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎細胞および軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS、SW1353)の増殖を抑制することが確認できた(図61)。なお、色素性絨毛結節性滑膜炎細胞については、200μmの濃度で若干の増殖抑制が観察されているのみであるが、使用可能な細胞に限りがあったために、400μm以上の高濃度域で細胞増殖の抑制を測定できていないが、巨細胞腫細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎細胞、および、軟骨肉腫細胞株に対する効果から、腱鞘巨細胞腫(GCTT)でも400μm以上の高濃度域では細胞増殖を抑制すると考えられた。
アセトアミノフェン(50μm,100μm,200μm,400μm,800μm)は、濃度依存的に、骨巨細胞腫細胞(GCT-1、GCT-2)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎細胞および軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS、SW1353)の増殖を抑制することが確認できた(図62)。
ロルノキシカム(5μm,10μm,20μm,40μm,80μm)は、濃度依存的に、骨巨細胞腫細胞(GCT-1、GCT-2)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎細胞および軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS、SW1353)の増殖を抑制することが確認できた(図63)。なお、一見、細胞増殖抑制の程度が小さいようにもみえるが、薬剤のDMSO(ジメチルスルホキシド)への溶解度が低かったため、アセトアミノフェンに比べて10分の1の薬剤濃度である80μmまでしか測定できなかった。
アンピロキシカム(1.25μm,2.5μm,5μm,10μm,20μm)は、濃度依存的に、骨巨細胞腫細胞(GCT-1、GCT-2)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎細胞および軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS、SW1353)の増殖を抑制することが確認できた(図64)。なお、一見、細胞増殖抑制の程度が小さいようにもみえるが、薬剤のDMSO(ジメチルスルホキシド)への溶解度が低かったため、最大20μmまでしか測定できなかった。
ナプロキセン(50μm,100μm,200μm,400μm,800μm)は、濃度依存的に、骨巨細胞腫細胞(GCT-1、GCT-2)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)細胞、色素性絨毛結節性滑膜炎細胞および軟骨肉腫細胞株(H-EMC-SS、SW1353)の増殖を抑制することが確認できた(図65)。
したがって、ピオグリタゾン、トログリタゾン、ロシグリタゾン、ザルトプロフェン、ジクロフェナク、インドメタシン、セレコキシブ、エトドラク、メロキシカム、モフェゾラク、アセメタシン、オキサプロジン、アセトアミノフェン、ロルノキシカム、アンピロキシカム、ナプロキセンは、骨巨細胞腫(GCTB)、腱鞘巨細胞腫(GCTT)、色素性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)および軟骨肉腫の予防または治療に有用であることが実証された。
実施例16 ヒト軟骨肉腫細胞（OUMS-27）にザルトプロフェン、ロシグリタゾン、トログリタゾンを添加して培養した後の細胞増殖抑制の解析。
ヒト軟骨肉腫細胞株であるOUMS-27（ICRB 細胞バンクより購入）を実施例1と同様にサブコンフルエントになるまで培養し、50、100、200、400μMの各濃度のザルトプロフェン、ロシグリタゾン、トログリタゾンを添加し、72時間後にCell Counting Kit-8(CCK-8)(Dojindo社)で発色し、さらに3時間後に450nmの吸光度を測定して細胞数の指標とした（図66）。その結果、ザルトプロフェンおよびトログリタゾンは、200μM及び400μMの濃度で、ロシグリタゾンは50μM以上の濃度で、ヒト軟骨肉腫細胞（OUMS-27）の細胞増殖を抑制することが実証された。
したがって、ザルトプロフェン、ロシグリタゾンおよびトログリタゾンは軟骨肉腫の予防または治療に有用であることが実証された。
なお、実施例1と同様に各薬剤は、終濃度の1000倍の濃度のDMSO（ジメチルスルホキシド）を用意して、これを培地の0.1%の量で添加した。以下の実施例において、他の薬剤についても同様である。
実施例17 予めGW9662の存在下／非存在下で培養したヒト軟骨肉腫細胞株（OUMS-27）にザルトプロフェン、ロシグリタゾン、トログリタゾンを添加してさらに培養した後の細胞増殖抑制の解析。
ヒト軟骨肉腫細胞株であるOUMS-27を実施例1と同様にサブコンフルエントになるまで培養した後、PPARγの不可逆的なアンタゴニストであるGW9662(Sigma-Aldrich社 M6191)を終濃度1μMとなるように加えて60分間培養し、50、100、200、400μMの各濃度のザルトプロフェン、トログリタゾンまたは12.5、25、50、100μMの各濃度のロシグリタゾンを添加し、72時間後にCell Counting Kit-8(CCK-8)(Dojindo社)で発色し、さらにその3時間後に450nmの吸光度を測定して、GW9662の溶けていないDMSOのみを加えた場合と比較した（図67）。その結果、ザルトプロフェン、トログリタゾン、ロシグリタゾンによってヒト軟骨肉腫細胞（OUMS-27）の細胞増殖が抑制されること、および、これらの細胞増殖抑制作用は、PPARγの不可逆的なアンタゴニストであるGW9662によって減弱することが確認できた。
したがって、ザルトプロフェン、トログリタゾンおよびロシグリタゾンは軟骨肉腫の予防または治療に有用であることが実証された。また、ザルトプロフェン、トログリタゾンおよびロシグリタゾンはPPARγの活性化に基づいて軟骨肉腫の増殖を抑制することが実証された。
実施例18 予めGW9662の存在下／非存在下で培養したヒト軟骨肉腫細胞株（SW1353）にザルトプロフェンを添加してさらに培養した後の細胞増殖抑制の解析。
ヒト軟骨肉腫細胞株であるSW1353を実施例1と同様にサブコンフルエントになるまで培養した後、PPARγの不可逆的なアンタゴニストであるGW9662を終濃度1μMとなるように加えて60分培養した後、100、200、300、400μMの各濃度のザルトプロフェンを添加し、72時間後にCell Counting Kit-8(CCK-8)(Dojindo社)で発色し、さらにその3時間後に450nmの吸光度を測定して、GW9662の代わりにDMSOのみを加えた場合の吸光度と比較した（図68）。その結果、ザルトプロフェンによってヒト軟骨肉腫細胞（SW1353）の細胞増殖が濃度依存的に抑制されるとともに、ザルトプロフェンによるヒト軟骨肉腫細胞（SW1353）の細胞増殖抑制作用は、PPARγの不可逆的なアンタゴニストであるGW9662によって大幅に減弱することが確認できた。
したがって、ザルトプロフェンは軟骨肉腫の予防または治療に有用であることが実証された。また、ザルトプロフェンはPPARγの活性化に基づいて軟骨肉腫の増殖を抑制することが実証された。
実施例19 予めPPARγの発現を抑制するsiRNAの存在下／非存在下で培養したヒト軟骨肉腫細胞株（SW1353）にザルトプロフェンまたはロシグリタゾンを添加してさらに培養した後の細胞増殖抑制の解析。
ヒト軟骨肉腫細胞株であるSW1353を実施例1と同様にサブコンフルエントになるまで培養した後、PPARγの発現を選択的に抑制するPPARγ-siRNA(Dharmacon社製のカタログ番号M-003436-02-0005)及びコントロールsiRNA(Dharmacon社製のカタログ番号D-001206-14-05)を終濃度100nMとなるように加えて48時間培養し、さらに400μMのザルトプロフェンまたは100μMのロシグリタゾンを添加し、24時間後にCell Counting Kit-8(CCK-8)(Dojindo社)で発色し、3時間後に450nmの吸光度を測定して、PPARγ-siRNAで前処理した場合の吸光度をコントロールsiRNA（遺伝子発現抑制作用を有さない無意な配列の2本鎖RNA）で前処理した場合の吸光度と比較した（図69）。その結果、400μMのザルトプロフェンはヒト軟骨肉腫細胞株（SW1353）の増殖を約38％抑制し、100μMのロシグリタゾンはヒト軟骨肉腫細胞株（SW1353）の増殖を約61％抑制することが確認できた。そして、これらのヒト軟骨肉腫細胞株に対する増殖抑制作用は、siRNAを用いてPPARγの発現を抑制することにより、ほぼ消失した。
したがって、ザルトプロフェンおよびロシグリタゾンは軟骨肉腫の予防または治療に有用であることが実証された。また、ザルトプロフェンおよびロシグリタゾンによる軟骨肉腫の増殖抑制にはPPARγの発現が必須であることが実証された。
実施例20 予めPPARγの発現を抑制するsiRNAの存在下／非存在下で培養したヒト軟骨肉腫細胞株（H-EMC-SS）にザルトプロフェンを添加してさらに培養した後の細胞増殖抑制の解析。
ヒト軟骨肉腫細胞株であるH-EMC-SSを実施例1と同様にサブコンフルエントになるまで培養した後、PPARγの発現を選択的に抑制するPPARγ-siRNA(Dharmacon社製のカタログ番号M-003436-02-0005)及びコントロールsiRNA(Dharmacon社製のカタログ番号D-001206-14-05)を終濃度100nMとなるように加えて48時間培養し、400μMのザルトプロフェンを添加し、24時間後にCell Counting Kit-8(CCK-8)(Dojindo社)で発色し、3時間後に450nmの吸光度を測定して、PPARγ-siRNAで前処理した場合の吸光度をコントロールsiRNA Aで前処理した場合の吸光度と比較した（図70）。その結果、ザルトプロフェンによってヒト軟骨肉腫細胞（H-EMC-SS）の細胞増殖が抑制されること、および、ザルトプロフェンのヒト軟骨肉腫細胞（H-EMC-SS）の増殖抑制作用は、PPARγの発現を選択的に抑制するsiRNAによって完全に打ち消されることが確認できた。
したがって、ザルトプロフェンは軟骨肉腫の予防または治療に有用であることが実証された。また、ザルトプロフェンによる軟骨肉腫の増殖抑制にはPPARγの発現が必須であることが実証された。
実施例21 予めPPARγの発現を抑制するsiRNAの存在下／非存在下で培養したヒト培養PVNS細胞にロシグリタゾンまたはザルトプロフェンを添加してさらに培養した後の細胞増殖抑制の解析。
実施例８と同じ患者（標準的治療により手術のみ施行した右膝腱鞘巨細胞腫患者、30歳代）から切除したPVNS細胞を実施例８と同様にサブコンフルエントになるまで培養した後、PPARγの発現を選択的に抑制するPPARγ-siRNA（Dharmacon社製のカタログ番号M-003436-02-0005）及びコントロールsiRNA（Dharmacon社製のカタログ番号D-001206-14-05）を終濃度100nMとなるように加えて48時間培養し、100μMのロシグリタゾンまたは400μMのザルトプロフェンを添加し、24時間後にCell Counting Kit-8(CCK-8)(Dojindo社)で発色し、3時間後に450nmの吸光度を測定して、PPARγ-siRNAで前処理した場合の吸光度をコントロールsiRNAで前処理した場合の吸光度と比較した（図71）。その結果、ロシグリタゾンまたはザルトプロフェンのヒトPVNS細胞に対する細胞増殖抑制作用は、PPARγの発現を選択的に抑制するsiRNAによってほぼ完全に打ち消されることが確認できた。
したがって、ザルトプロフェンおよびロシグリタゾンはPVNSの予防または治療に有用であることが実証された。また、ザルトプロフェンおよびロシグリタゾンによるPVNSの増殖抑制にはPPARγの発現が必須であることが実証された。
実施例22 ヒト骨肉腫細胞株（HOS）にザルトプロフェンを添加して培養した後の細胞増殖抑制の解析。
ヒト骨肉腫細胞株であるHOS（American Type Culture Collectionより購入）を実施例1と同様にサブコンフルエントになるまで培養し、25、50、100、200、400μMの濃度のザルトプロフェンを添加し、72時間後にCell Counting Kit-8(CCK-8)(Dojindo社)で発色し、さらに3時間後に450nmの吸光度を測定した（図72）。その結果、ザルトプロフェンは、100μM、200μMおよび400μMの濃度で濃度依存的にヒト骨肉腫細胞株（HOS）の細胞増殖を抑制することが確認できた。特に、400μMのザルトプロフェンは、ヒト骨肉腫細胞株（HOS）の増殖を約60％抑制した。
したがって、ザルトプロフェンは骨肉腫の予防または治療に有用であることが実証された。
実施例23 ヒト軟骨肉腫細胞株（SW1353）に非ステロイド性抗炎症剤またはPPARγアゴニストを添加して培養した後の細胞遊走(cell migration)の解析。
細胞遊走の解析はTPP社の6-wellプレートを用いて、Takeuchi A, et al., Cancer Science 104: 740-749, 2013 (Low molecular weight heparin suppresses receptor for advanced glycation end products-mediated expression of malignant phenotype in human fibrosarcoma cells.)に記載した方法に従って行った。ヒト軟骨肉腫細胞株であるSW1353を実施例1と同様にサブコンフルエントになるまで培養した後、、マイクロピペットチップ（200μl）を用いて1mm幅で細胞を剥離させ、アセトアミノフェン（200μM、400μM）、セレコキシブ（25μM、50μM、75μM）、インドメタシン（100μM、200μM）、ジクロフェナク（100μM、200μM）、ロシグリタゾン（200μM、400μM）、トログリタゾン（50μM、100μM）、ザルトプロフェン（100μM、200μM、400μM）、ピオグリタゾン（100μM、200μM）を夫々、括弧内の終濃度となるように添加して72時間後に4%パラホルムアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレッドで染色した。そして、細胞を剥離した領域へ遊走した細胞の面積をImage J software (http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html)を用いて測定した（図73、図74）。その結果、いずれの化合物についても、設定したすべての濃度において、濃度に依存してヒト軟骨肉腫細胞株（SW1353）の細胞遊走を抑制することが確認できた。特に、75μMのセレコキシブはヒト軟骨肉腫細胞株（SW1353）の細胞遊走を80%超抑制し、100μMのトログリタゾンはヒト軟骨肉腫細胞株（SW1353）の細胞遊走を約65％抑制した。また、400μMのザルトプロフェンもヒト軟骨肉腫細胞株（SW1353）の細胞遊走を約40％抑制した。
したがって、アセトアミノフェン、セレコキシブ、インドメタシン、ジクロフェナク、ロシグリタゾン、トログリタゾン、ザルトプロフェンおよびピオグリタゾンは軟骨肉腫の転移の予防に有用であることが実証された。
実施例24 ヒト軟骨肉腫細胞株（SW1353）に非ステロイド性抗炎症剤またはPPARγアゴニストを添加して培養した後の細胞浸潤(cell invasion)の解析。
細胞浸潤の解析にはマトリゲルをマトリックスとして用いるBD Bioscience社のMatrigelTM invasion chamber（カタログ番号：354480）を用いた。ヒト軟骨肉腫細胞株であるSW1353を実施例1と同様にサブコンフルエントになるまで培養した後、トログリタゾン（50μM、100μM）、ピオグリタゾン（200μM）、ザルトプロフェン（200μM、300μM、400μM）、ジクロフェナク（200μM）、ロシグリタゾン（100μM、200μM）、アセトアミノフェン（200μM）、インドメタシン（200μM）、セレコキシブ（50μM）を夫々、括弧内の終濃度となるように添加して24時間後に4％パラホルムアルデヒドで固定し、ヘマトキシリンで染色し、浸潤した細胞数を測定した。その結果、いずれの化合物についても、設定したすべての濃度において、濃度に依存してヒト軟骨肉腫細胞株（SW1353）の細胞浸潤を抑制することが確認できた（図75）。特に、100μMのトログリタゾンと50μMのセレコキシブは、ヒト軟骨肉腫細胞株（SW1353）の細胞浸潤を完全に阻止しており、400μMのザルトプロフェンも細胞浸潤を20％未満に抑えた。図76および図77は、4％パラホルムアルデヒド溶液に浸して固定しヘマトキシリンで染色した浸潤細胞の顕微鏡写真である（倍率200倍）。図76および図77の顕微鏡写真から浸潤した細胞の様子が理解できる。100μMトログリタゾンあるいは50μMのセレコキシブを添加した条件では、細胞の数がまばらにしかなく、小さく丸まっていることから、浸潤抑制のみでなく細胞障害も伴っていることがわかる。
したがって、トログリタゾン、ピオグリタゾン、ザルトプロフェン、ジクロフェナク、ロシグリタゾン、アセトアミノフェン、インドメタシンおよびセレコキシブは軟骨肉腫の転移の予防に有用であることが実証された。
実施例25 予めGW9662の存在下／非存在下で培養したヒト軟骨肉腫細胞株（SW1353）にザルトプロフェンを添加してさらに培養した後の細胞浸潤の解析。
ヒト軟骨肉腫細胞株であるSW1353を実施例1と同様にサブコンフルエントになるまで培養した後、PPARγの不可逆的なアンタゴニストであるGW9662を終濃度1μMとなるように加えて60分培養し、200、300、400μMの各濃度のザルトプロフェンを添加し、24時間後にBD Bioscience社のMatrigelTM invasion chamber（カタログ番号：354480)によって細胞浸潤を測定して、GW9662の代わりにDMSOのみを加えた場合の細胞浸潤の程度と比較した（図78）。その結果、400μMのザルトプロフェンによってヒト軟骨肉腫細胞（SW1353）の細胞浸潤が80％超抑制されること、および、400μMのザルトプロフェンによるヒト軟骨肉腫細胞（SW1353）の細胞浸潤の抑制は、PPARγの不可逆的なアンタゴニストであるGW9662（1μM）によってほぼ打ち消されることが確認できた。 したがって、ザルトプロフェンは軟骨肉腫の転移の予防に有用であることが実証された。また、ザルトプロフェンはPPARγの活性化に基づいて軟骨肉腫の転移を予防することが実証された。
実施例26 ザルトプロフェン（ソレトン錠（登録商標））の骨巨細胞腫患者に対する治療効果の解析。
骨巨細胞腫患者にソレトン錠80（一般名：ザルトプロフェン、80mg、日本ケミファ株式会社）を3錠／日（朝・昼・夕に1錠ずつ服用）で服用してもらった。服用開始から4週間後に単純レントゲン、X線CT、MRI（核磁気共鳴イメージ）を撮影して腫瘍サイズを評価した。その後、手術可能な症例については手術により腫瘍を切除するとともに、1日240mgのザルトプロフェン（80mg錠を朝食時、昼食時、夕食時に1錠ずつ服用）の服用を継続し、16週間ごとに単純レントゲン、X線CT、MRI（核磁気共鳴イメージ）を撮影して腫瘍サイズを評価した。一方、手術困難な症例についても、1日240mgのザルトプロフェン（80mg錠を朝食時、昼食時、夕食時に1錠ずつ服用）の服用を継続し、8週間ごとに単純レントゲン、X線CT、MRI（核磁気共鳴イメージ）を撮影して腫瘍サイズを評価した。
ザルトプロフェンによる治療を行った骨巨細胞腫の症例をまとめたものが図79である。21歳から39歳までの男性患者8名と25歳から68歳までの女性患者5名の合計13名の骨巨細胞腫患者にザルトプロフェンを投与した。患部別にみると、骨盤部が4名、大腿骨遠位部が2名、腓骨近位部が1名（肺転移の原発巣も入れると2名）、脛骨遠位部が1名、膝部が1名、上腕骨近位部が1名、仙骨が1名、肺転移が2例（原発は、腓骨近位部1例、脛骨近位部1例）であった。骨盤部に発症した患者は全て女性であり、大腿骨遠位部および腓骨近位部に発症した患者は全て男性であった。再発した患者が5名含まれていた。特に、症例fの患者（25歳，女性，右上腕骨近位部）は5回目の再発であり、症例aの患者（34歳，女性，骨盤）は3回目の再発であった。また、肺転移した患者が2名含まれており（症例eと症例m）、特に症例mの患者（21歳，男性，右脛骨近位部）は多発性肺転移を患っていた。
なお、症例jの患者（32歳，男性，仙骨）についてはゾレドロン酸水和物注射液であるゾメタ（登録商標）の投与と動脈塞栓術を併用した。症例mの患者（21歳，男性，右脛骨近位部，多発性肺転移）については、抗RANKLヒト型モノクローナル抗体であるデノスマブによる治療後に、ゾレドロン酸水和物注射液であるゾメタ（登録商標）と併用した。症例bの患者（32歳，女性，骨盤）については、デノスマブの治験終了後にザルトプロフェンによる治療を行った。
ザルトプロフェンを服用した結果、図79および図80に示すように、13症例の骨巨細胞腫患者のうちで、1症例が部分奏効（PR）、11症例が安定（SD）、1症例が進行（PD）と判定された。部分奏効（PR）と判定された症例aの腫瘍サイズは70％超縮小しており、その後、手術により骨巨細胞腫を切除し、今日に至るまで再発していない。進行（PD）と判定された症例mの患者（21歳，男性，右脛骨近位部）は多発性肺転移を患っており、一時、安定（SD）と判定されたが、時間の経過とともに再び腫瘍が増大する傾向にある。骨巨細胞腫の大きさが19.8％増大した症例lの患者（31歳，男性，左膝部）は、患者本人の判断で半分量ほどしか服用していなかったことが判明している。
骨巨細胞腫が縮小した症例a、症例c、症例d、症例e、症例fの患者はいずれもザルトプロフェンの服用以外の治療を行っていないので、ザルトプロフェンの服用によって腫瘍が縮小したものと考えられた。
症例cの患者について、ザルトプロフェンの服用前（2012年12月13日）および服用後（2013年2月13日）の患部（左腓骨近位部）の横断面のMRI画像を図81に示す。約9週間にわたってザルトプロフェンを服用することによって、骨巨細胞腫の直径が23.3mmから21.0mmへ縮小したことがわかる。
症例dの患者について、ザルトプロフェンの服用前（2013年7月4日）および服用後（2013年8月29日）の患部（右脛骨遠位部）の前額面および横断面のMRI画像とCT画像を図82に示す。約8週間にわたってザルトプロフェンを服用することによって、骨巨細胞腫の直径が21.7mmから20.5mmへ縮小したことがわかる。
症例eの患者について、ザルトプロフェンの服用前（2013年1月17日）および服用後（2013年9月19日）の患部（肺転移部）の横断面のMRI画像を図83に示す。約35週間にわたってザルトプロフェンを服用することによって、肺に転移した骨巨細胞腫の直径が8.2mmから7.3mmへ縮小したことがわかる。
このように、ザルトプロフェンを服用した患者において骨巨細胞腫の縮小が観察された。また、多発性肺転移が見られた1症例を除く12症例では、骨巨細胞腫が部分奏効（PR）または安定（SD）と判定された。さらに肺に転移した骨巨細胞腫の縮小も観察された（症例e，図83）。
そして、患者の自覚的症状も改善傾向が見られたことから、カルノフスキーのパフォーマンスステータス（KPS）によって日常活動を遂行する能力を評価した。KPSは、図84に示す基準に従って、患者の状態を100〜0の10段階に分類する評価方法であり、スコアが高いほど患者が日常活動をよりよく行えることを意味している。ザルトプロフェンの服用前と服用後の骨巨細胞腫患者のKPSの評価結果を図85に示す。
ザルトプロフェンの服用によって骨巨細胞腫が縮小した症例a、症例c、症例dの患者において、「かなり臨床症状あるが、努力して正常の活動可能」な状態（スコア80）から「軽い臨床症状はあるが、正常活動可能」な状態（スコア90）へKPSスコアが改善した。
症例gの患者では、骨巨細胞腫の縮小は見られなかったものの増大もせず、KPSスコアは、「かなり臨床症状あるが、努力して正常の活動可能」な状態（スコア80）から「臨床症状がない」状態（スコア100）へKPSスコアが大幅に改善した。
意外なことに、骨巨細胞腫がやや増大傾向にある患者でもKPSスコアの改善が見られた。症例kの患者では、骨巨細胞腫が約10％大きくなったにも拘らず、KPSスコアは、「かなり臨床症状あるが、努力して正常の活動可能」な状態（スコア80）から「軽い臨床症状はあるが、正常活動可能」な状態（スコア90）へ改善した。同様に、症例jの患者では、骨巨細胞腫が約6％大きくなったにも拘らず、KPSスコアは、「病状を考慮した看護および定期的な医療行為が必要」な状態（スコア50）から「軽い臨床症状はあるが、正常活動可能」な状態（スコア90）へ劇的に改善した。
さらに驚くべきことは、多発性肺転移を患っており、進行（PD）と判定された症例mの骨巨細胞腫患者（21歳，男性，右脛骨近位部）でさえ、KPSスコアは、「軽い臨床症状はあるが、正常活動可能」な状態（スコア90）から「臨床症状がない」状態（スコア100）へ改善したことである。
また、ザルトプロフェンを服用した骨巨細胞腫の症例において、KPSスコアが悪くなった症例は皆無であった。
加えて、ザルトプロフェンの服用によってX線CT画像による判定で骨の硬化が見られるようになった症例が6症例（症例a、症例b、症例d、症例g、症例i、症例j）あったことから、ザルトプロフェンの服用によって骨が修復され、機械的強度が向上したことが窺えた。
このように、ザルトプロフェンの服用によって、骨巨細胞腫患者の腫瘍が縮小するか腫瘍の増大が停止し、骨の硬化が観察されるようになるとともに、日常活動を遂行する能力が大幅に改善された。また、ザルトプロフェンの服用中に、新たな骨巨細胞腫の転移は観察されなかった。さらに、骨巨細胞腫の切除手術を行った患者においては、ザルトプロフェンの服用中に、骨巨細胞腫の再発は生じなかった。
したがって、ザルトプロフェンは、ヒト患者において、骨巨細胞腫の予防、治療および転移予防に有用であることが実証された。また、ザルトプロフェンは、骨巨細胞腫を患うヒト患者の骨を修復ないし形成するとともに、日常活動を遂行する能力を改善することが実証された。
実施例27 ザルトプロフェン（ソレトン錠（登録商標））のPVNS患者に対する治療効果の解析。
PVNS患者にソレトン錠80（一般名：ザルトプロフェン、80mg、日本ケミファ株式会社）を3錠／日（朝・昼・夕に1錠ずつ服用）で服用してもらった。服用開始から4週間後に単純レントゲン、X線CT、MRI（核磁気共鳴イメージ）を撮影して腫瘍サイズを評価した。その後、手術可能な症例については手術により腫瘍を切除するとともに、1日240mgのザルトプロフェン（80mg錠を朝食時、昼食時、夕食時に1錠ずつ服用）の服用を継続し、16週間ごとに単純レントゲン、X線CT、MRI（核磁気共鳴イメージ）を撮影して腫瘍サイズを評価した。一方、手術困難な症例についても、1日240mgのザルトプロフェン（80mg錠を朝食時、昼食時、夕食時に1錠ずつ服用）の服用を継続し、8週間ごとに単純レントゲン、X線CT、MRI（核磁気共鳴イメージ）を撮影して腫瘍サイズを評価した。
ザルトプロフェンによる治療を行ったPVNSの症例をまとめたものが図86である。26歳から65歳までの男性患者5名と16歳から62歳までの女性患者9名の合計14名のPVNS患者にザルトプロフェンを投与した。患部別にみると、膝関節が8名、足関節が4名、肩関節が1名、手関節が1名であった。手関節にPVNSを発症した1名の症例が限局型のPVNSであった他は、残り13症例のすべてがび漫型のPVNSであった。なお、14症例中10症例がPVNSの再発であった。図86および図87に示す通り、奏効率を判定できた11症例中の1症例が部分奏効（PR）と判定され、残り10症例が安定（SD）と判定された。
なお、症例hの患者（16歳，女性，右足関節）、症例iの患者（26歳，男性，右膝）および症例eの患者（40歳，男性，左手関節）についてはPVNS切除手術を行った。また、症例lの患者（31歳，女性，左足関節）、症例mの患者（30歳，女性，左膝）および症例nの患者（38歳，女性，足関節）についてはPVNS切除手術の後にザルトプロフェンの服用を開始したため、奏効率を判定できなかった。
PVNSが縮小した症例a、症例b、症例c、症例d、症例e、症例fの患者はいずれもザルトプロフェンの服用以外の治療を行っていないので、ザルトプロフェンの服用によって腫瘍が縮小したものと考えられた。
症例aの患者について、ザルトプロフェンの服用前（2012年9月6日）および服用後（2013年8月20日）の患部（肩関節）の前額面のMRI画像を図88に示す。約50週間にわたってザルトプロフェンを服用することによって、PVNSの直径が27.7mmから7.9mmへ縮小したことがわかる。
症例cの患者について、ザルトプロフェンの服用前（2012年12月6日）および服用後（2013年8月1日）の患部（右膝関節）の矢状面のMRI画像を図89に示す。約35週間にわたってザルトプロフェンを服用することによって、PVNSの長径が59.5mmから48.0mmへ縮小したことがわかる。
このように、ザルトプロフェンを服用した患者においてPVNSの縮小が観察された。また、ザルトプロフェンを服用したすべてのPVNS患者が部分奏効（PR）または安定（SD）と判定された。
ザルトプロフェンの服用前と服用後のPVNS患者のカルノフスキーのパフォーマンスステータス（KPS）の評価結果を図90の表に示す。ザルトプロフェンの服用によってPVNSが縮小した症例aおよび症例bの患者において、「自分自身の世話はできるが、正常の活動・労働することは不可能」な状態（スコア70）から「臨床症状なし」（スコア100）へKPSスコアが劇的に改善した。同様に、ザルトプロフェンの服用によってPVNSが縮小した症例cおよび症例dの患者において、「かなり臨床症状あるが、努力して正常の活動可能」な状態（スコア80）から「軽い臨床症状はあるが、正常活動可能」（スコア90）へKPSスコアが改善した。
また、ザルトプロフェンを服用したPVNSの症例において、KPSスコアが悪くなった症例は皆無であった。
このように、ザルトプロフェンの服用によって、PVNS患者の腫瘍が縮小するか腫瘍の増大が停止するとともに、日常活動を遂行する能力が大幅に改善された。また、ザルトプロフェンの服用中に、新たなPVNSの転移は観察されなかった。さらに、PVNSの切除手術を行った患者においては、ザルトプロフェンの服用中に、PVNSの再発は生じなかった。
したがって、ザルトプロフェンは、ヒト患者において、PVNSの予防、治療および転移予防に有用であることが実証された。また、ザルトプロフェンは、PVNSを患うヒト患者の日常活動を遂行する能力を改善することが実証された。
以上の実施例によって、PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質を有効成分として含有する本発明の医薬は、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の予防剤、治療剤または転移予防剤として有用であることが実証された。
本発明の予防剤、治療剤または転移予防剤は、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の患者あるいは骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫を発症するおそれがある者に対して有効である。また、本発明によれば、PPARγ遺伝子およびアポトーシスまたは脂肪細胞分化を制御する被検物質を選択することにより、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫に対する新規治療薬の探索が可能となる。

Claims (23)

  1. PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質を有効成分として含有する、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の予防剤、治療剤または転移予防剤。
  2. PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質が、非ステロイド性抗炎症剤、チアゾリジンジオン誘導体、PPARγアゴニスト活性を有するアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗剤、ならびに、内因性のPPARγアゴニストからなる群から選択される１以上のPPARγアゴニストである、請求項１に記載の予防剤、治療剤または転移予防剤。
  3. PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質がザルトプロフェン、ジクロフェナク、インドメタシン、プログルメタシン、インドメタシンファルネシル、セレコキシブ、エトドラク、メロキシカム、モフェゾラク、アセメタシン、オキサプロジン、アセトアミノフェン、ロルノキシカム、アンピロキシカム、ピロキシカム、ナプロキセン、ロキソプロフェン、ロフェコキシブ、エテンザミド、ジフルニサル、アルミノプロフェン、ナブメトン、ケトプロフェン、アセチルサリチル酸、イブプロフェン、プラノプロフェン、スリンダクからなる群から選択される１以上の非ステロイド性抗炎症剤である、請求項１または請求項２に記載の予防剤、治療剤または転移予防剤。
  4. PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質が、トログリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、バラグリタゾン、リボグリタゾン、イサグリタゾン、ネトグリタゾン、ロベグリタゾン、エングリタゾン、シグリタゾンからなる群から選択される１以上のチアゾリジンジオン誘導体である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の予防剤、治療剤または転移予防剤。
  5. PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質が、イルベサルタン、テルミサルタンからなる群から選択される１以上のPPARγアゴニスト活性を有するアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗剤である、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の予防剤、治療剤または転移予防剤。
  6. PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質が、１５−デオキシ−Δ12,14-プロスタグランジンJ2、15-hydroxyeicosatetraenoic acid、9-hydroxyoctadecadienoic acid、13-hydroxyoctadecadienoic aciｄ、ニトロリノール酸、長鎖脂肪酸からなる群から選択される１以上の内因性のPPARγアゴニストである、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の予防剤、治療剤または転移予防剤。
  7. 骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍が、骨巨細胞腫、腱鞘巨細胞腫および色素性絨毛結節性滑膜炎からなる群から選択される、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の予防剤、治療剤または転移予防剤。
  8. さらに抗ＲＡＮＫＬ抗体を含有することを特徴とする、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の予防剤、治療剤または転移予防剤。
  9. 抗ＲＡＮＫＬ抗体がデノスマブである、請求項８に記載の予防剤、治療剤または転移予防剤。
  10. さらにビスホスホネートを含有することを特徴とする、請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の予防剤、治療剤または転移予防剤。
  11. ビスホスホネートが、エチドロネート、クロドロネート、チルドロネート、パミドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート、アレンドロネート、イバンドロネート、チルドロネート、インカドロネート、リセドロネート、ミノドロネート、ゾレドロネート、ソルバドロネート、メドロネート、リセンドロネート、アミノ−オルパドロネート、シマドロネート、ピリドロネート、レジドロネート、EB1053、YH 529からなる群から選択される１以上のビスホスホネートである、請求項１０に記載の予防剤、治療剤または転移予防剤。
  12. PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質を有効成分として含有する、動脈塞栓術用局所注入剤または人工骨。
  13. PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質が、非ステロイド性抗炎症剤、チアゾリジンジオン誘導体、PPARγアゴニスト活性を有するアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗剤、ならびに、内因性のPPARγアゴニストからなる群から選択される１以上のPPARγアゴニストである、請求項１２に記載の動脈塞栓術用局所注入剤または人工骨。
  14. PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質がザルトプロフェン、ジクロフェナク、インドメタシン、プログルメタシン、インドメタシンファルネシル、セレコキシブ、エトドラク、メロキシカム、モフェゾラク、アセメタシン、オキサプロジン、アセトアミノフェン、ロルノキシカム、アンピロキシカム、ピロキシカム、ナプロキセン、ロキソプロフェン、ロフェコキシブ、エテンザミド、ジフルニサル、アルミノプロフェン、ナブメトン、ケトプロフェン、アセチルサリチル酸、イブプロフェン、プラノプロフェン、スリンダクからなる群から選択される非ステロイド性抗炎症剤である、請求項１２または請求項13に記載の動脈塞栓術用局所注入剤または人工骨。
  15. PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質がトログリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、バラグリタゾン、リボグリタゾン、イサグリタゾン、ネトグリタゾン、ロベグリタゾン、エングリタゾン、シグリタゾンからなる群から選択されるチアゾリジンジオン誘導体である、請求項１２〜請求項１４のいずれか１項に記載の動脈塞栓術用局所注入剤または人工骨。
  16. PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質が、イルベサルタン、テルミサルタンからなる群から選択される１以上のPPARγアゴニスト活性を有するアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗剤である、請求項１２〜請求項１５のいずれか１項に記載の動脈塞栓術用局所注入剤または人工骨。
  17. PPARγアゴニストおよび／またはPPARγ発現誘導活性を有する物質が、15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジンJ2、15-hydroxyeicosatetraenoic acid、9-hydroxyoctadecadienoic acid、13-hydroxyoctadecadienoic ａｃｉｄ、ニトロリノール酸、長鎖脂肪酸からなる群から選択される１以上の内因性のPPARγアゴニストである、請求項１２〜請求項１６のいずれか１項に記載の動脈塞栓術用局所注入剤または人工骨。
  18. さらに抗ＲＡＮＫＬ抗体を含有することを特徴とする、請求項１２〜請求項１７のいずれか１項に記載の動脈塞栓術用局所注入剤または人工骨。
  19. 抗RANKL抗体がデノスマブである、請求項１８に記載の動脈塞栓術用局所注入剤または人工骨。
  20. さらにビスホスホネートを含有することを特徴とする、請求項１２〜請求項１９のいずれか１項に記載の動脈塞栓術用局所注入剤または人工骨。
  21. ビスホスホネートが、エチドロネート、クロドロネート、チルドロネート、パミドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート、アレンドロネート、イバンドロネート、チルドロネート、インカドロネート、リセドロネート、ミノドロネート、ゾレドロネート、ソルバドロネート、メドロネート、リセンドロネート、アミノ−オルパドロネート、シマドロネート、ピリドロネート、レジドロネート、EB1053、YH 529からなる群から選択される１以上のビスホスホネートである、請求項２０に記載の動脈塞栓術用局所注入剤または人工骨。
  22. 以下の工程を含む、骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫の予防剤、治療剤または転移予防剤のスクリーニング方法
    （１）骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍、軟骨肉腫または骨肉腫に由来する細胞または組織を被検物質の存在下または非存在下で培養する工程、
    （２）被検物質の存在下または非存在下で、下記の（ａ）〜（ｇ）からなる群から選択される１以上の指標を測定する工程；
    （ａ） PPARγの遺伝子発現量、PPARγのタンパク量からなる群から選択される１以上の指標、
    （ｂ）アポトーシス関連遺伝子の遺伝子発現量、アポトーシス関連遺伝子の翻訳産物のタンパク量、アポトーシス関連遺伝子の翻訳産物の生物活性からなる群から選択される１以上の指標、
    （ｃ）脂肪細胞分化関連遺伝子の遺伝子発現量、脂肪細胞分化関連遺伝子の翻訳産物のタンパク量、脂肪細胞分化関連遺伝子の翻訳産物の生物活性、からなる群から選択される１以上の指標、
    （ｄ） 動脈硬化関連遺伝子の遺伝子発現量、動脈硬化関連遺伝子の翻訳産物のタンパク量、動脈硬化関連遺伝子の翻訳産物の生物活性、からなる群から選択される１以上の指標、
    （ｅ） 抗炎症関連遺伝子の遺伝子発現量、抗炎症関連遺伝子の翻訳産物のタンパク量、抗炎症関連遺伝子の翻訳産物の生物活性、からなる群から選択される１以上の指標、
    （ｆ） PPARγアゴニスト活性であって、アポトーシス関連遺伝子、脂肪細胞分化関連遺伝子、動脈硬化関連遺伝子、抗炎症関連遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子の転写を促進することができる活性である指標、
    （ｇ） 脂肪細胞または脂肪組織中に含まれる脂質の量
    （３）被検物質非存在下における細胞内指標と比較して、被検物質の存在下における細胞内指標を変動させる被検物質を選択する工程。
  23. 骨・軟部に発生する巨細胞性腫瘍が、骨巨細胞腫、腱鞘巨細胞腫および色素性絨毛結節性滑膜炎からなる群から選択される、請求項２２に記載のスクリーニング方法。
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