JPWO2015033781A1 - 二置換アミノ酸残基を含むジペプチド誘導体の製造方法 - Google Patents

二置換アミノ酸残基を含むジペプチド誘導体の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
JPWO2015033781A1
JPWO2015033781A1 JP2015535415A JP2015535415A JPWO2015033781A1 JP WO2015033781 A1 JPWO2015033781 A1 JP WO2015033781A1 JP 2015535415 A JP2015535415 A JP 2015535415A JP 2015535415 A JP2015535415 A JP 2015535415A JP WO2015033781 A1 JPWO2015033781 A1 JP WO2015033781A1
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
amino acid
formula
fmoc
protected
salt
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2015535415A
Other languages
English (en)
Other versions
JP6275150B2 (ja
Inventor
恵介 松山
恵介 松山
和也 児玉
和也 児玉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nagase and Co Ltd
Original Assignee
Nagase and Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nagase and Co Ltd filed Critical Nagase and Co Ltd
Publication of JPWO2015033781A1 publication Critical patent/JPWO2015033781A1/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6275150B2 publication Critical patent/JP6275150B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K5/00Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06Dipeptides
    • C07K5/06008Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06078Dipeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07BGENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B51/00Introduction of protecting groups or activating groups, not provided for in the preceding groups
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K1/00General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/02General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K5/00Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06Dipeptides
    • C07K5/06008Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K5/00Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06Dipeptides
    • C07K5/06008Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K5/00Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06Dipeptides
    • C07K5/06008Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • C07K5/06043Leu-amino acid
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K5/00Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06Dipeptides
    • C07K5/06008Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0606Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing heteroatoms not provided for by C07K5/06086 - C07K5/06139, e.g. Ser, Met, Cys, Thr
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K5/00Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06Dipeptides
    • C07K5/06086Dipeptides with the first amino acid being basic
    • C07K5/06095Arg-amino acid

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

下記式(1)で示されるN−末端が保護されたジペプチド又はその塩の製造方法であって、下記式(2)で示されるN−末端が保護されたα−一置換アミノ酸若しくはグリシン又はそれらの塩と、下記式(3)で示される二置換アミノ酸又はその塩とを、[各式において、それぞれの置換基は明細書等における各置換基と同様に定義される。]縮合剤の存在下で縮合させることを含む、製造方法。

Description

本発明は、二置換アミノ酸残基を含むジペプチド誘導体の製造方法に関する。
ペプチドは、アミノ酸が縮合してできる化合物であり、生体内で多種多様な機能を発現することから、医薬としての応用が期待されている。ペプチド医薬は、アミノ酸の新規な配列を検討したり、非天然アミノ酸を導入したりすることで、種々の新規な優れた機能を発揮することが期待される反面、体内の各種酵素によって速やかに分解されてしまうといった問題点を有する。これに対し、α−炭素原子が二つの置換基によって置換された二置換アミノ酸をペプチドに導入することで、生体内のペプチダーゼに対する安定性を高めることができることが見出されている。
特開平1−163197号公報 特開昭59−31744号公報
ところで、ペプチド合成において一般的なペプチド固相合成法では、ペプチドは、アミノ基が保護されたアミノ酸のカルボキシル基に固相合成用樹脂を結合させた後、アミノ基の脱保護及びアミノ基が保護された次のアミノ酸の結合を繰り返すことで得られ、得られたペプチドは、最後に当該樹脂から切り出される。
しかし、二置換アミノ酸残基を有するペプチドを上記ペプチド固相合成法により製造しようとする場合、二置換アミノ酸残基の不斉炭素周りの立体障害のために、そのN−末端にさらに次のアミノ酸残基を結合する場合に反応性が低くなる場合がある。
このため、二置換アミノ酸残基の次に来るべきアミノ酸残基が一部欠損したまま固相合成が継続され、この結果、得られたペプチドを固相合成用樹脂から切り出した際に、二置換アミノ酸残基の次に来るべきアミノ酸残基が一部欠損した副生成物が含まれてしまい、結果として、二置換アミノ酸残基を含むペプチド合成の収率や純度が低くなることが問題となっている。
そこで、上記二置換アミノ酸のアミノ基にアミノ基が保護されたアミノ酸が結合したジペプチド誘導体を予め合成し、当該ジペプチド誘導体をペプチド固相合成に利用すれば、上記の反応性の低い工程を回避できることが期待される。
N−末端アミノ基が保護されたジペプチド誘導体は、従来、ランダムなペプチド結合形成を回避するため、もっぱら、アミノ基が保護されたアミノ酸とカルボキシル基がエステル保護されたアミノ酸とを縮合剤の存在下で縮合させ、その後、カルボキシル基のエステル保護基を脱エステル化する方法で合成されている(例えば上記特許文献1及び2を参照。)。
上記合成方法は、確実ではあるが工程数が多く、また、各構成アミノ酸の側鎖に保護基を有する場合には、その保護基の種類によっては、エステル保護基の脱エステル化が困難となる可能性がある。
本発明は、上述したような事情に鑑みてなされたものであり、従来のジペプチドの製造方法より工程数が少なく、且つ各構成アミノ酸の側鎖の保護基の種類にかかわらず、所望のジペプチド誘導体を収率よく得ることが可能なジペプチド誘導体の製造方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、カルボキシル基がエステル保護されていない無保護のアミノ酸を原料として用いた場合であっても、二置換のアミノ酸であれば、驚くべきことに、懸念されたランダムなペプチド結合反応は起こらず、一工程で目的とするジペプチド誘導体を収率よく得ることが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、下記式(1)で示されるN−末端が保護されたジペプチド又はその塩の製造方法であって、
Figure 2015033781

[式(1)において、Xはアミノ基の保護基を表し、Rは、α−一置換アミノ酸の側鎖、又は水素原子を表し、該側鎖は保護されていてもよく、
は、Rと結合して前記側鎖を形成する基、又は水素原子を表し、
Ra及びRbは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基又は置換基を有していてもよいアラルキル基を表す。]
下記式(2)で示されるN−末端が保護されたα−一置換アミノ酸若しくはグリシン又はそれらの塩と、
Figure 2015033781

[式(2)において、X、R及びRは式(1)におけるX、R及びRと同様に定義される。]
下記式(3)で示される二置換アミノ酸又はその塩とを、
Figure 2015033781

[式(3)において、Ra及びRbは式(1)におけるRa及びRbと同様に定義される。]
縮合剤の存在下で縮合させることを含む、製造方法を提供する。
本発明に係るジペプチド誘導体の製造方法を採用することによって、従来のジペプチドの製造方法より工程数が少なく、且つ各構成アミノ酸の側鎖の保護基の種類にかかわらず、所望のジペプチド誘導体を収率よく得ることが可能となる。
上記製造方法において、式(2)で示されるN−末端が保護されたα−一置換アミノ酸若しくはグリシン又はそれらの塩と、式(3)で示される二置換アミノ酸又はその塩とを、化学量論量以上の縮合剤の存在下で縮合させることが好ましい。縮合剤を化学量論量以上存在させることで、縮合反応をより効率よく進行させることができる。
上記製造方法において、式(2)で示されるN−末端が保護されたα−一置換アミノ酸若しくはグリシン又はそれらの塩の反応率が70〜80%に達した時点でN−末端が保護されたα−一置換アミノ酸若しくはグリシン又はそれらの塩と二置換アミノ酸又はその塩との反応を終了させることが好ましい。これによって、目的とするジペプチド誘導体のカルボキシル基にさらにアミノ酸が縮合することを防ぐことができるため、より収率よく所望のジペプチド誘導体を得ることができる。
本発明によれば、従来のジペプチドの製造方法より工程数が少なく、且つ各構成アミノ酸の側鎖の保護基の種類にかかわらず、所望のジペプチド誘導体を収率よく得ることが可能なジペプチド誘導体の製造方法を提供することができる。
以下、本発明の好適な実施形態について説明するが、本発明は、これらの実施形態に何ら限定されるものではない。
本明細書において、アミノ酸の表記を3文字又は1文字で表記する場合がある。すなわち、例えば、アラニンはAla又はA、アルギニンはArg又はR、アスパラギンはAsn又はN、アスパラギン酸はAsp又はD、システインはCys又はC、グルタミン酸はGlu又はE、グルタミンはGln又はQ、グリシンはGly又はG、ヒスチジンはHis又はH、イソロイシンはIle又はI、ロイシンはLeu又はL、リジンはLys又はK、メチオニンはMet又はM、フェニルアラニンはPhe又はF、プロリンはPro又はP、セリンはSer又はS、トレオニンはThr又はT、トリプトファンはTrp又はW、チロシンはTyr又はY、バリンはVal又はVと表記する場合がある。
本実施形態において、下記式(1)で示されるN−末端が保護されたジペプチド又はその塩の製造方法は、
Figure 2015033781

[式(1)において、Xはアミノ基の保護基を表し、Rは、α−一置換アミノ酸の側鎖、又は水素原子を表し、該側鎖は保護されていてもよく、
は、Rと結合して前記側鎖を形成する基、又は水素原子を表し、
Ra及びRbは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基又は置換基を有していてもよいアラルキル基を表す。]
下記式(2)で示されるN−末端が保護されたα−一置換アミノ酸若しくはグリシン又はそれらの塩と、
Figure 2015033781

[式(2)において、X、R及びRは式(1)におけるX、R及びRと同様に定義される。]
下記式(3)で示される二置換アミノ酸又はその塩とを、
Figure 2015033781

[式(3)において、Ra及びRbは式(1)におけるRa及びRbと同様に定義される。]
縮合剤の存在下で縮合させることを含む。
ここで縮合剤は、通常化学合成における化学的な試薬を指し、基質から一分子の水を奪って縮合物を与えるものであって、醗酵法等において用いられる酵素等の生体触媒とは異なるものと当業者に理解される。生体触媒は基質特異性が高く、目的とするペプチドによってそれぞれ適した触媒を用いなければならないうえ、特に、基質に二置換アミノ酸等の非天然アミノ酸を用いる場合、適当な生体触媒を見出すことは通常困難である。
本実施形態において用いられる縮合剤は、化学的合成反応で一般に用いられる当業者に公知の縮合剤であれば、特に制限なく使用することが可能である。縮合剤は、例えば、HBTU(ヘキサフルオロリン酸2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウム)、DCC(ジシクロヘキシルカルボジイミド)、EDC(1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド)からなる群から選ばれる少なくとも1種であってもよい。この中でもHBTUが特に好ましい。
また、本実施形態において、縮合剤は、化学量論量以上存在させることが好ましい。すなわち、本実施形態において、式(2)で示されるN−末端が保護されたα−一置換アミノ酸若しくはグリシン又はそれらの塩と式(3)で示される二置換アミノ酸又はその塩との脱水縮合反応によって生成する水と当量以上の縮合剤を存在させることが好ましい。これによって、縮合反応をより効率よく進行させることができる。
本実施形態に係る原料である式(2)で示されるN−末端が保護されたα−一置換アミノ酸若しくはグリシン又はそれらの塩において、Xはアミノ基の保護基を表す。アミノ基の保護基としては、当業者に公知のアミノ基の保護基を特に制限なく採用することが可能である。アミノ基の保護基は、例えば、Fmoc(9−フルオレニルメトキシカルボニル)、Z(ベンジルオキシカルボニル)、Alloc(アリルオキシカルボニル)、Troc(2,2,2−トリクロロエトキシカルボニル)、Boc(t−ブチルオキシカルボニル)等のカーバメート、Ac(アセチル)、Bz(ベンゾイル)等のアミドからなる群から選ばれる少なくとも1種であってもよい。この中でも特にFmocが好ましい。
式(2)で示されるN−末端が保護されたα−一置換アミノ酸若しくはグリシン又はそれらの塩において、Rは場合により保護されていてもよいα−一置換アミノ酸の側鎖、又は水素原子を表す。α−一置換アミノ酸としては、天然、非天然を問わず採用することが可能であり、また、D−体、L−体のどちらでもよい。このようなα−一置換アミノ酸の側鎖の一例として、Alaの側鎖であるMe、Argの側鎖である−CHCHCHNHC(=NH)NH、Asnの側鎖である−CHCONH、Aspの側鎖である−CHCOOH、Cysの側鎖である−CHSH、Gluの側鎖である−CHCHCOOH、Glnの側鎖である−CHCHCONH、Hisの側鎖である−CHIm(Imは4−イミダゾリル基を表す。)、Ileの側鎖である−CH(CH)CHCH、Leuの側鎖である−CHCH(CH、Lysの側鎖である−CHCHCHCHNH、Metの側鎖である−CHCHSCH、Pheの側鎖である−CHPh、Serの側鎖である−CHOH、Thrの側鎖である−CH(OH)CH、Trpの側鎖である−CHInd(Indは3−インドリル基を表す。)、Tyrの側鎖である−CH(4−OH−Ph)、Valの側鎖である−CH(CH、ホモシステインの側鎖である−CHCHSH、アリルグリシンの側鎖である−CHCH=CH等が好適に挙げられる。その中でも、Thrの側鎖である−CH(OH)CH、Argの側鎖である−CHCHCHNHC(=NH)NH、Leuの側鎖である−CHCH(CH、Pheの側鎖である−CHPh、ホモシステインの側鎖である−CHCHSH、アリルグリシンの側鎖である−CHCH=CHがより好ましい。
α−一置換アミノ酸の側鎖は保護されていてもよい。側鎖を保護する保護基は、特に限定されず、一般的な側鎖の保護基として用いられるものから適宜選択することができる。保護基としては、例えばグアニジル基の保護基であるPbf(2,2,4,6,7−ペンタメチル−2,2−ジヒドロベンゾフラン−5−スルホニル)、水酸基の保護基であるt−ブチル、チオール基の保護基であるトリチル、アミノ基の保護基であるFmoc、Z、Troc、Ac、Bz及びBoc、並びにインドリル基の保護基であるベンジルからなる群から選ばれる少なくとも1種を挙げることができる。
式(2)で示されるN−末端が保護されたα−一置換アミノ酸若しくはグリシン又はそれらの塩において、RはRと結合して前記側鎖を形成する基、又は水素原子を表す。Rと結合して側鎖を形成する場合、Rに隣接する炭素原子及びRに隣接する窒素原子と一緒になって環状基を形成するが、このような環状基は、含窒素環状構造を有していれば特に限定されるものではなく、例えば5〜15員の単環、二環又は三環等を形成することができ、また、飽和環であっても部分不飽和環であってもよい。さらに、当該環は場合により置換基を有していてもよい。上記のような環状基を例示するとすれば、例えばピロリジン、ピペリジン等を挙げることができる。
上記式(2)で示されるN−末端が保護されたα−一置換アミノ酸又はグリシンは、場合により塩として用いることもできる。N−末端が保護されたα−一置換アミノ酸又はグリシンの塩の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、ジシクロヘキシルアミン(DCHA)塩等がある。
以上のような本実施形態に係る原料である式(2)で示されるN−末端が保護されたα−一置換アミノ酸若しくはグリシン又はそれらの塩として、好適な例を以下に示す。
Fmoc−Gly−OH
Fmoc−Thr(Ot−Bu)−OH
Fmoc−D−Phe−OH
Fmoc−D−Hcy(Tr)−OH
Fmoc−Hcy(Tr)−OH
Fmoc−Arg(Pbf)−OH
Fmoc−Leu−OH
Fmoc−Phe−OH
Ac−(Allyl)Gly−OH
Boc−(Allyl)Gly−OH・DCHA
本実施形態に係る原料である式(3)で示される二置換アミノ酸又はその塩において、Ra及びRbは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基又は置換基を有していてもよいアルキニル基を表す。アルキル基、アルケニル基、アルキニル基は、例えばそれぞれ炭素数1〜14個(好ましくは、1〜8個)を有する直鎖又は分枝鎖の構造を有することが可能であり、上記置換基としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ハロ、ニトロ、保護されていてもよいヒドロキシ、保護されていてもよいメルカプト、場合によりハロ置換されたアルコキシ、場合により置換されていてもよいフェニル等のアリール、カルボキシ若しくはそのエステル、場合により置換若しくは保護されていてもよいアミノ、場合により置換若しくは保護されていてもよいインドール等のヘテロアリール等が好適に挙げられる。
RaとRbは、どちらか一方がメチルであることがより好ましい。RaとRbのどちらか一方がメチルである二置換アミノ酸を含むペプチドによって一置換アミノ酸を置換した場合、例えば、ペプチドの医薬としての作用を維持しつつ、安定性向上のような効果を得ることが特に容易であることが多い。
上記式(3)で示される二置換アミノ酸は、塩として用いることもできる。二置換アミノ酸の塩の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、ジシクロヘキシルアミン(DCHA)塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、臭化水素酸塩等が挙げられる。
以上のような本実施形態に係る原料である式(3)で示される二置換アミノ酸として、好適な例を以下に示す。
(S)−α−(4−Pentenyl)Ala−OH
(R)−α−(4−Pentenyl)Ala−OH
(S)−α−(7−Octenyl)Ala−OH
(R)−α−(7−Octenyl)Ala−OH
(S)−α−(Allyl)Ala−OH・H
(R)−α−(Allyl)Ala−OH・H
(S)−α−(Propargyl)Ala−OH
(R)−α−(Propargyl)Ala−OH
(S)−α−(Ethyl)Ala−OH・H
(R)−α−(Ethyl)Ala−OH・H
(S)−α−Me−Asp(Ot−Bu)−OH
(R)−α−Me−Asp(Ot−Bu)−OH
(S)−α−Me−Leu−OH
(R)−α−Me−Leu−OH
(S)−α−Me−Phe−OH・H
(R)−α−Me−Phe−OH・H
(S)−α−Me−Val−OH
(R)−α−Me−Val−OH
(S)−α−Me−o−fluoroPhe−OH
(R)−α−Me−o−fluoroPhe−OH
(S)−α−Me−m−fluoroPhe−OH
(R)−α−Me−m−fluoroPhe−OH
(S)−α−Me−p−fluoroPhe−OH
(R)−α−Me−p−fluoroPhe−OH
(S)−α−Me−2,6−difluoroPhe−OH
(R)−α−Me−2,6−difluoroPhe−OH
(S)−α−Me−p−CFO−Phe−OH
(R)−α−Me−p−CFO−Phe−OH
(S)−α−Me−o−bromoPhe−OH・H
(R)−α−Me−o−bromoPhe−OH・H
(S)−α−Me−m−bromoPhe−OH・H
(R)−α−Me−m−bromoPhe−OH・H
(S)−α−Me−p−bromoPhe−OH
(R)−α−Me−p−bromoPhe−OH
(S)−α−Me−m−iodoPhe−OH・H
(R)−α−Me−m−iodoPhe−OH・H
(S)−α−Me−p−iodoPhe−OH
(R)−α−Me−p−iodoPhe−OH
(S)−α−Me−o−nitroPhe−OH・H
(R)−α−Me−o−nitroPhe−OH・H
(S)−α−Me−m−nitroPhe−OH・H
(R)−α−Me−m−nitroPhe−OH・H
(S)−α−Me−p−phenylPhe−OH・H
本実施形態において、原料の式(2)で示されるN−末端が保護されたα−一置換アミノ酸若しくはグリシン又はそれらの塩と、式(3)で示される二置換アミノ酸又はその塩との仕込み比率は、特に制限されるものではなく、用いる各原料化合物の物性や、縮合反応終了後に余剰分を取り除く場合の取り除き易さ等を考慮して、当業者が適宜実験的に変更することが可能である。例えば、式(2)で示されるN−末端が保護されたα−一置換アミノ酸又はグリシンに対し、式(3)で示される二置換アミノ酸を理論当量以上使用した場合、反応終了後に余剰分として存在する式(3)で示される二置換アミノ酸を、当業者にとって一般的な手法を用いて取り除くことができる。
本実施形態に係る製造方法において、原料の式(2)で示されるN−末端が保護されたα−一置換アミノ酸又はグリシンと、式(3)で示される二置換アミノ酸とを縮合させる時間は、縮合反応の進行に伴って変化する式(1)、(2)、(3)のそれぞれの量をモニタリングしながら制御することが好ましい。
縮合の反応時間は、用いる原料の種類、各種反応条件等によって異なるが、縮合時間が短いと式(1)で示されるジペプチドが十分に生成されず収率が低下し、縮合時間が長いと式(1)で示されるジペプチドにおけるカルボキシル基がさらに反応し、結果として所望の式(1)で示されるジペプチドの収率が低下する。このような観点から、本実施形態においては、式(2)で示されるN−末端が保護されたα−一置換アミノ酸若しくはグリシン又はそれらの塩の反応率が70〜80%に達した時点で反応を終了させることが好ましい。ここで、反応率とは、反応の進行による原料の消費量を、その仕込み量に対する割合で示したものである。上記モニタリングは、当業者に公知の種々のモニタリング方法を採用することが可能である。例えば、反応途中で反応液よりサンプリングを行い、HPLCで分析する方法等が好適に挙げられる。この場合、例えば、HPLC分析により得られるクロマトグラムにおいて、原料のN−末端が保護されたα−一置換アミノ酸又はグリシン、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド及びペンタペプチドの合計のピーク面積SをN−末端が保護されたα−一置換アミノ酸又はグリシンの仕込み量とみなし、合計のピーク面積S及びN−末端が保護されたα−一置換アミノ酸又はグリシンのピーク面積Sから、式:反応率(%)=(1−S/S)×100により反応率を計算することができる。
本実施形態に係る製造方法において、縮合反応に用いる溶媒は特に限定されず、ペプチド合成における縮合反応で一般に用いられる公知の溶媒を適宜選択可能である。このような溶媒の好適な例として、THF、DMF、NMP等が挙げられる。
本実施形態に係る製造方法において、縮合反応における温度は特に限定されず、ペプチド合成の際に当業者が一般的に用いるであろう温度範囲で適宜設定が可能である。操作のし易さから、室温で反応させることが好ましい。
本実施形態における製造方法によって製造された式(1)で示されるN−末端が保護されたジペプチドは、高純度の状態で得ることが可能である。また、得られた式(1)で示されるN−末端が保護されたジペプチドの純度をさらに上げるため、各種当業者に公知の手法を用いることによって、高純度で単離、精製してもよい。
このようにして製造することができる本実施形態に係る式(1)で示されるN−末端が保護されたジペプチドにおいて、X、R、R、Ra及びRbは、式(2)或いは式(3)におけるそれぞれの置換基と同様に定義される。
また、上記式(1)で示されるN−末端が保護されたジペプチドは、場合により塩として得ることもできる。
本実施形態に係る式(1)で示されるN−末端が保護されたジペプチドの製造方法は、従来のジペプチドの製造方法に比べて、カルボキシル基の脱保護工程を省略できることから、製造工程の短縮が可能となるばかりでなく、二置換アミノ酸を原料として用いた場合であれば、カルボキシル基がエステル保護されていない無保護のものを用いた場合であっても、懸念されたランダムなペプチド結合形成は起こらず、目的とする式(1)で示されるN−末端が保護されたジペプチドを収率よく得ることが可能となる。
本実施形態に係る方法によって製造された式(1)で示されるジペプチドは、N−末端アミノ基が保護されている。したがって、当該ジペプチドは、ペプチド固相合成法における原料ジペプチドとして用いるのに適している。
また、ペプチド固相合成法において一般に採用される手法、すなわち、一つのアミノ酸を順に結合させる手法によって、二置換アミノ酸残基を含むペプチドを合成しようとすると、二置換アミノ酸残基の不斉炭素周りの立体障害の影響によりそのN末端における反応性が低下し収率の低下を招く可能性があった。しかし、上記の式(1)で示されるN−末端が保護されたジペプチドを上記ペプチド固相合成法に用いることにより、このような立体障害の影響を抑制させることができ、当該ジペプチドを結合させた後に、そのN末端に新たに次のアミノ酸を結合する場合の反応性を高めることができることから、副生成物であるアミノ酸欠損体の生成を抑えられるため、結果として二置換アミノ酸残基を含むペプチド合成の効率や純度を高めることができる。
本実施形態に係る製造方法によって得られた式(1)で示されるN−末端が保護されたジペプチドを用いてペプチドを合成する方法としては、当業者に公知のペプチド固相合成法を用いることができる。用いる固相合成用樹脂担体としては、限定されるものではないが、Rink Amide MBHA resin(100〜200mesh)等を好適に挙げることができる。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。
以下の記載では、以下の略号を用いた。
Fmoc:9−フルオレニルメトキシカルボニル;
THF:テトラヒドロフラン;
HBTU:ヘキサフルオロリン酸2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウム;
TEA:トリエチルアミン;
MTBE:メチルt−ブチルエーテル;
Hcy:ホモシステイン;
Tr:トリチル;
NMP:N−メチルピペリドン;
HOBt:1−ヒドロキシベンゾトリアゾール;
DIPEA:ジイソプロピルエチルアミン;
TFA:トリフルオロ酢酸;
Pbf:2,2,4,6,7−ペンタメチル−2,2−ジメチルベンゾフラン−5−スルホニル。
[式(1)で示されるN−末端が保護されたジペプチドの製造]
(実施例1)
Fmoc−Gly−(R)−α−(4−Pentenyl)Ala−OHの合成
Figure 2015033781
25mLの反応容器に、0.64g(2.2mmol)のFmoc−Gly−OHと、0.38g(2.4mmol)の(R)−α−(4−Pentenyl)Ala−OHとを仕込み、THF(7.7mL)に懸濁させた。この懸濁液に、1.19g(3.14mmol)のHBTUと、0.49mL(3.5mmol)のTEAを加え、室温下で23時間撹拌を行った。
反応途中で反応液よりサンプリングを行い、HPLC(UV264nmで検出)で分析した。
Fmoc−Gly−OH、
Fmoc−Gly−(R)−α−(4−Pentenyl)Ala−OH(ジペプチド)、
Fmoc−Gly−(R)−α−(4−Pentenyl)Ala−(R)−α−(4−Pentenyl)Ala−OH(トリペプチド)、
Fmoc−Gly−(R)−α−(4−Pentenyl)Ala−(R)−α−(4−Pentenyl)Ala−(R)−α−(4−Pentenyl)Ala−OH(テトラペプチド)、
Fmoc−Gly−(R)−α−(4−Pentenyl)Ala−(R)−α−(4−Pentenyl)Ala−(R)−α−(4−Pentenyl)Ala−(R)−α−(4−Pentenyl)Ala−OH(ペンタペプチド)、
のそれぞれに相当するピークの面積比は、4.5時間では31:68:1.5:0.065:未検出(反応率69%)、5.5時間では30:68:2.0:0.091:未検出(反応率70%)、7.9時間では27:70:3.2:0.17:未検出(反応率73%)、23時間では24:68:7.6:0.45:0.047(反応率76%)であった。反応率は、Fmoc−Gly−OH、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド及びペンタペプチドの合計面積に対するFmoc−Gly−OHの面積の割合から計算した。
上水(8mL)と、酢酸エチル(8mL)を加え、室温下で撹拌後、静置し分液した。有機層を飽和重層水(40mL)、上水(8mL)、0.5mol/Lの塩酸(12mL)の順で洗浄後、減圧下で濃縮した。残渣にMTBE(11mL)、ノルマルヘキサン(1mL)、酢酸エチル(9mL)を加え、分散、静置後、上清を除去した。残渣にMTBE(6mL)を加え、分散、静置後、上清を除去した。残渣を乾燥させ、0.23gのFmoc−Gly−(R)−α−(4−Pentenyl)Ala−OHを類白色結晶として得た(収率24%)。
Fmoc−Gly−(R)−α−(4−Pentenyl)Ala−OH;
融点:130〜133℃(未校正)。
HNMR(400MHz、CDCl)δppm:1.2〜1.4(m、2H);1.60(s、3H);1.86(dt、J=12.8Hz、J=4.7Hz、1H);1.9〜2.1(m、2H);2.16(dt、J=12.8Hz、J=3.6Hz、1H);3.8〜4.0(m、2H);4.21(t、J=7.2Hz、1H);4.39(d、J=7.2Hz、2H);4.9〜5.0(m、2H);5.70(dt、J=12.0Hz、J=10.0Hz、1H);5.78(br.s、1H);6.87(br.s、1H);7.30(dt、J=7.5Hz、J=0.9Hz、2H);7.39(t、J=7.5Hz、2H);7.58(d、J=7.5Hz、2H);7.75(d、J=7.5Hz、2H)。
HRMSm/z:437.2071(C2529([M+H])に対する計算値);437.2078(実測値)。
Fmoc−Gly−(R)−α−(4−Pentenyl)Ala−(R)−α−(4−Pentenyl)Ala−OH;
HRMSm/z:576.3068(C3342([M+H])に対する計算値);576.3072(実測値)。
Fmoc−Gly−(R)−α−(4−Pentenyl)Ala−(R)−α−(4−Pentenyl)Ala−(R)−α−(4−Pentenyl)Ala−OH;
HRMSm/z:715.4065(C4155([M+H])に対する計算値);715.4063(実測値)。
Fmoc−Gly−(R)−α−(4−Pentenyl)Ala−(R)−α−(4−Pentenyl)Ala−(R)−α−(4−Pentenyl)Ala−(R)−α−(4−Pentenyl)Ala−OH;
HRMSm/z:854.5062(C4967([M+H])に対する計算値);854.5061(実測値)。
(実施例2)
Fmoc−Thr(Ot−Bu)−(S)−α−Me−o−fluoroPhe−OHの合成
Figure 2015033781
100mLの反応容器に、2.17g(5.46mmol)のFmoc−Thr(Ot−Bu)−OHと、1.45g(7.35mmol)の(S)−α−Me−o−fluoroPhe−OHを仕込み、THF(28mL)に懸濁させた。この懸濁液に、6.80g(17.9mmol)のHBTUと、2.56mL(1.84mmol)のTEAを加え、室温下で62時間撹拌を行った。上水(35mL)と、酢酸エチル(48mL)を加え、室温下で撹拌後、静置し分液した。有機層に0.5mol/Lの塩酸(34mL)を加え、室温下で3.5時間撹拌後、静置し分液した。飽和重層水(56mL)を加え、撹拌後吸引濾過し、酢酸エチル(6mL)で洗い込んだ。濾洗液を静置、分液し、有機層を飽和重層水(14mL)、0.5mol/L塩酸(6mL)、上水(42mL)の順で洗浄後、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、0.35gのFmoc−Thr(Ot−Bu)−(S)−α−Me−o−fluoroPhe−OHを白色非晶質固体として得た(収率11%)。
融点:61〜81℃(未校正)。
HRMSm/z:577.2078(C3337FN([M+H])に対する計算値);577.2710(実測値)。
(実施例3)
Fmoc−Thr(Ot−Bu)−(S)−α−Me−o−fluoroPhe−OHの合成
Figure 2015033781
50mLの反応容器に、1.17g(2.94mmol)のFmoc−Thr(Ot−Bu)−OHと、0.73g(3.7mmol)の(S)−α−Me−o−FluoroPhe−OHとを仕込み、THF(14mL)に懸濁させた。この懸濁液に、3.41g(8.99mmol)のHBTUと、1.26mL(9.04mmol)のTEAを加え、室温下で31時間撹拌を行った。
反応途中で反応液よりサンプリングを行い、HPLC(UV264nmで検出)で分析した。
Fmoc−Thr(Ot−Bu)−OH、
Fmoc−Thr(Ot−Bu)−α−Me−o−FluoroPhe−OH(ジペプチド)、
Fmoc−Thr(Ot−Bu)−α−Me−o−fluoroPhe−α−Me−o−fluoroPhe−OH(トリペプチド)
のそれぞれに相当するピークの面積比は、22時間では23:76:1.7(反応率77%)、31時間では20:78:1.9(反応率80%)であった。反応率は、Fmoc−Thr(Ot−Bu)−OH、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド及びペンタペプチドの合計面積に対するFmoc−Thr(Ot−Bu)−OHの面積の割合から計算した。ただし、テトラペプチド及びペンタペプチドのピークは未検出であった。
Fmoc−Thr(Ot−Bu)−α−Me−o−fluoroPhe−OHの主たる2種の異性体比は22時間では97.3:2.7、31時間では97.4:2.6であった。
Fmoc−Thr(Ot−Bu)−α−Me−o−fluoroPhe−OH;
HRMSm/z:756.3455(C4348([M+H])に対する計算値);756.3455(実測値)。
(実施例4)
Fmoc−D−Hcy(Tr)−(S)−α−Me−o−fluoroPhe−OHの合成
Figure 2015033781

25mLの反応容器に、0.28g(0.45mmol)のFmoc−D−Hcy(Tr)−OHと、0.11g(0.56mmol)の(S)−α−Me−o−fluoroPhe−OHとを仕込み、THF(2mL)に懸濁させた。この懸濁液に、0.52g(1.4mmol)のHBTUと、0.20mL(1.4mmol)のTEAを加え、室温下で5.8時間撹拌を行った。上水(2.5mL)と、酢酸エチル(3.5mL)を加え、室温下で撹拌後、静置し分液した。有機層を飽和重層水(4mL)、0.5mol/Lの塩酸(2mL)、上水(6mL)の順で洗浄後、減圧下で濃縮した。残渣に酢酸エチル(1.9mL)を加え、分散、静置後、吸引ろ過をした。白色粉末を乾燥させ、0.21gのFmoc−D−Hcy(Tr)−(S)−α−Me−o−fluoroPhe−OHを得た(収率59%)。
HNMR(400MHz、CDCl)δppm:1.3〜1.6(m、1H);1.46(s、3H);1.6〜1.8(m、1H);2.1〜2.3(m、2H);3.23(d、J=14.0Hz、1H);3.32(d、J=14.0Hz、1H);4.0〜4.2(m、2H);4.17(t、J=6.6Hz、1H);4.34(d、J=6.6Hz、2H);5.29(d、J=8.0Hz、1H);6.49(s、1H);6.9〜7.0(m、2H);7.07(t、J=7.0Hz、1H);7.1〜7.5(m、20H);7.57(d、J=7.0Hz、2H);7.74(d、J=7.0Hz、2H)。
(実施例5)
Fmoc−Hcy(Tr)−(S)−α−Me−o−fluoroPhe−OHの合成
Figure 2015033781

25mLの反応容器に、0.23g(0.42mmol)のFmoc−Hcy(Tr)−OHと、0.11g(0.51mmol)の(S)−α−Me−o−fluoroPhe−OH・HOとを仕込み、THF(2mL)に懸濁させた。この懸濁液に、0.52g(1.4mmol)のHBTUと、0.20mL(1.4mmol)のTEAを加え、室温下で3.2時間撹拌を行った。上水(2.5mL)と、酢酸エチル(4.3mL)を加え、室温下で撹拌後、静置し分液した。有機層を飽和重層水(4mL)、0.5mol/Lの塩酸(2mL)、上水(6mL)の順で洗浄後、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、0.11gのFmoc−Hcy(Tr)−(S)−α−Me−o−fluoroPhe−OHを無色油状物質として得た(収率32%)。
HNMR(400MHz、CDCl)δppm:1.48(s、3H);1.5〜1.7(m、1H);1.7〜1.9(m、1H);2.1〜2.4(m、2H);3.28(s、2H);4.0〜4.1(m、1H);4.1〜4.2(m、1H);4.2〜4.3(m、1H);4.3〜4.4(m、1H);5.25(br.s、1H);6.56(br.s、1H);6.9〜7.0(m、2H);7.06(t、J=6.8Hz、1H);7.1〜7.5(m、20H);7.54(d、J=7.0Hz、2H);7.73(d、J=7.0Hz、2H)。
(実施例6)
Fmoc−D−Phe−(R)−α−(7−Octenyl)Ala−OHの合成
Figure 2015033781
30mLの反応容器に、0.69g(1.8mmol)のFmoc−D−Phe−OHと、0.42g(2.1mmol)の(R)−α−(7−Octenyl)Ala−OHとを仕込み、THF(8.4mL)に懸濁させた。この懸濁液に、0.88g(2.3mmol)のHBTUと、0.37mL(2.7mmol)のTEAを加え、室温下で31時間撹拌を行った。
上水(9mL)と、酢酸エチル(9mL)を加え、室温下で撹拌後、静置し分液した。有機層に0.5mol/Lの塩酸(17mL)を加え、室温下で37時間撹拌を行った。酢酸エチル(27mL)を加え、上水洗浄(16mL)した。溶媒を約23g濃縮し、残渣に上水(8mL)を加えた。吸引濾過を行い、沈殿を乾燥した。0.47gのFmoc−D−Phe−(R)−α−(7−Octenyl)Ala−OHを白色粉末として得た(収率46%)。
HNMR(400MHz、CDCl)δppm:0.9〜1.0(m、1H);1.0〜1.2(m、1H);1.70(t、J=13.3Hz、1H);1.96(dd、J=13.3Hz、J=7.0Hz、2H);2.09(t、J=11.0Hz、1H);2.9〜3.1(m、1H);3.0〜3.2(m、1H);4.18(t、J=6.8Hz、1H);4.2〜4.4(m、2H);4.56(br.s、1H);4.8〜5.0(m、2H);5.63(d、J=8.0Hz、1H);5.6〜5.8(m、1H);6.54(br.s、1H);7.2〜7.3(m、5H);7.30(t、J=7.5Hz、2H);7.39(t、J=7.5Hz、2H);7.54(dd、J=7.5Hz、J=2.2Hz、2H);7.76(d、J=7.5Hz、2H)。
(実施例7)
Fmoc−Gly−(S)−α−(4−Pentenyl)Ala−OHの合成
Figure 2015033781
実施例1と同様の方法で、Fmoc−Gly−(S)−α−(4−Pentenyl)Ala−OHを微黄色固体として得た。
融点:129〜132℃(未校正)。
(実施例8)
Fmoc−Arg(Pbf)−(S)−α−(4−Pentenyl)Ala−OHの合成
Figure 2015033781
実施例6と同様の方法で、Fmoc−Arg(Pbf)−(S)−α−(4−Pentenyl)Ala−OHを白色非晶質固体として得た。
融点:102〜147℃(未校正)。
HNMR(400MHz、CDCl)δppm:1.35(br.s、2H);1.42(s、6H);1.51(s、3H);1.6〜1.7(m、2H);1.7〜1.8(m、1H);1.8〜1.9(m、3H);1.9〜2.1(m、2H);2.06(s、3H);2.49(s、3H);2.56(s、3H);2.90(s、2H);3.1〜3.3(m、2H);4.0〜4.2(m、1H);4.2〜4.3(m、3H);4.8〜5.0(m、2H);5.69(dt、J=16.8Hz、J=6.5Hz、1H);6.42、6.70(br.s、3H);7.20(t、J=7.6Hz、2H);7.43(t、J=7.6Hz、2H);7.55(d、J=7.6Hz、2H);7.71(d、J=7.6Hz、2H)。
(実施例9)
Fmoc−Leu−(S)−α−(4−Pentenyl)Ala−OHの合成
Figure 2015033781
実施例6と同様の方法で、Fmoc−Leu−(S)−α−(4−Pentenyl)Ala−OHを淡橙色非晶質固体として得た。
HNMR(400MHz、CDCl)δppm:0.8〜1.0(m、6H);1.1〜1.3(m、1H);1.2〜1.4(m、1H);1.5〜1.7(m、3H);1.62(s、3H);1.84(dt、J=12.8Hz、J=4.0Hz、1H);1.97(dd、J=12.8Hz、J=6.4Hz、2H);2.30(dt、J=12.8Hz、J=4.0Hz、1H);4.19(t、J=7.0Hz、2H);4.3〜4.5(m、2H);4.48(br.s、1H);4.8〜5.0(m、2H);5.5〜5.7(m、2H);7.21(br.s、1H);7.30(dt、J=7.4Hz、J=0.6Hz、2H);7.39(t、J=7.4Hz、2H);7.57(dd、J=7.4Hz、J=2.8Hz、2H);7.75(d、J=7.5Hz、2H)。
(実施例10)
Fmoc−D−Leu−(S)−α−(4−Pentenyl)Ala−OHの合成
Figure 2015033781
実施例6と同様の方法で、Fmoc−D−Leu−(S)−α−(4−Pentenyl)Ala−OHを淡橙色非晶質固体として得た。
HNMR(400MHz、CDCl)δppm:0.94(br.s、6H);1.2〜1.3(m、1H);1.3〜1.4(m、1H);1.5〜1.7(m、3H);1.62(s、3H);1.82(dt、J=13.1Hz、J=4.4Hz、1H);2.0〜2.1(m、2H);2.2〜2.4(m、1H);4.20(t、J=7.1Hz、1H);4.3〜4.4(m、1H);4.42(dd、J=10.0Hz、J=7.1Hz、1H);4.55(br.s、1H);4.9〜5.0(m、2H);5.5〜5.6(m、1H);5.72(dt、J=17.0Hz、J=6.8Hz、1H);7.21(br.s、1H);7.30(t、J=7.5Hz、2H);7.39(t、J=7.5Hz、2H);7.57(d、J=7.5Hz、2H);7.76(d、J=7.5Hz、2H)。
(実施例11)
Fmoc−Phe−(R)−α−(7−Octenyl)Ala−OHの合成
Figure 2015033781
実施例6と同様の方法で、Fmoc−Phe−(R)−α−(7−Octenyl)Ala−OHを白色粉末として得た。
HNMR(400MHz、CDCl)δppm:1.0〜1.1(m、2H);1.21(br.s、4H);1.32(br.s、2H);1.53(s、3H);1.6〜1.8(m、1H);1.9〜2.0(m、2H);2.0〜2.1(m、1H);3.0〜3.1(m、2H);4.15(t、J=7.2Hz、1H);4.2〜4.3(m、1H);4.35(dd、J=10.2Hz、J=7.2Hz、1H);4.71(br.s、1H);4.8〜5.0(m、2H);5.7〜5.9(m、2H);6.85(br.s、1H);7.2〜7.3(m、5H);7.28(t、J=7.5Hz、2H);7.39(t、J=7.5Hz、2H);7.5〜7.6(m、2H);7.75(d、J=7.5Hz、2H)。
[一置換アミノ酸を用いたN−末端が保護されたジペプチドの製造]
(比較例1)
Fmoc−Thr(Ot−Bu)−(S)−o−FluoroPhe−OHの合成
Figure 2015033781
15mLの反応容器に、97.06mg(0.2442mmol)のFmoc−Thr(Ot−Bu)−OHと、56.61mg(0.3090mmol)の(S)−o−fluoroPhe−OHとを仕込み、THF(1.2mL)に懸濁させた。この懸濁液に、0.28g(0.74mmol)のHBTUと、0.104mL(0.746mmol)のTEAを加え、室温下で4.1時間撹拌を行った。
反応途中で反応液よりサンプリングを行い、HPLC(UV264nmで検出)で分析した。
Fmoc−Thr(Ot−Bu)−OH、
Fmoc−Thr(Ot−Bu)−o−fluoroPhe−OH(ジペプチド)、
Fmoc−Thr(Ot−Bu)−o−fluoroPhe−o−fluoroPhe−OH(トリペプチド)、
Fmoc−Thr(Ot−Bu)−o−fluoroPhe−o−fluoroPhe−o−fluoroPhe−OH(テトラペプチド)、
のそれぞれに相当するピークの面積比は、1.8時間では72:11:12:5.7(反応率29%)、3時間では72:9.9:13:5.3(反応率28%)、4.1時間では71:9.5:12:7.2(反応率29%)であった。反応率は、Fmoc−Thr(Ot−Bu)−OH、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド及びペンタペプチドの合計面積に対するFmoc−Gly−OHの面積の割合から計算した(ペンタペプチドは未検出)。
Fmoc−Thr(Ot−Bu)−o−fluoroPhe−OHの主たる2種の異性体比は、1.8時間では54:46、3時間では53:47、4.1時間では51:49であった。
Fmoc−Thr(Ot−Bu)−o−fluoroPhe−OH;
HRMSm/z:585.2371(C3235FNNaO([M+Na])に対する計算値);585.2371(実測値)。
Fmoc−Thr(Ot−Bu)−o−fluoroPhe−o−fluoroPhe−OH;
HRMSm/z:728.3142(C4144([M+H])に対する計算値);728.3138(実測値)。
Fmoc−Thr(Ot−Bu)−o−fluoroPhe−o−fluoroPhe−o−fluoroPhe−OH;
HRMSm/z:893.3732(C5052([M+H])に対する計算値);893.3729(実測値)。
上記比較例1の結果から分かるように、一置換アミノ酸を用いてジペプチドを製造しようとした場合、当該アミノ酸のカルボキシル基が保護されていないと、生成したジペプチドのカルボキシル基に順次アミノ酸が結合して多量体が生じてしまい、全く実用性がなかった。さらに、生じたジペプチドの立体異性体純度も低く、ほぼ等量の混合物が得られた。これは、縮合反応後にもカルボキシ基が活性化され得るため、さらなる縮合までは起こらなくとも、エピメリ化が起こるためと考えられる。
これに対し、例えば実施例3の結果から分かるように、二置換アミノ酸を用いて縮合反応を行った場合には、当該アミノ酸のカルボキシル基が保護されていないにもかかわらず、懸念された多量体が生じず、所望の化合物を収率よく得ることができた。さらに、二置換アミノ酸を用いていることから、原理的にエピメリ化も起こらず、得られた化合物の立体異性体純度も高いものとなった。
[ペプチドの製造]
(参考例1)
H−Leu−Arg−(S)−α−(4−Pentenyl)Ala−Phe−NHの合成
Figure 2015033781
Rink Amide MBHA resin(100〜200mesh)を担体としたFmoc法固相ペプチド合成により4つのアミノ酸残基を結合し、H−Leu−Arg−(S)−α−(4−Pentenyl)Ala−Phe−NHを合成した。溶媒はNMP、縮合条件はHBTU/HOBt/DIPEA、脱Fmoc化はピペリジン、担体からの脱離はTFA/上水/トリイソプロピルシランを用いた。生成物中には目的物の他に、目的物に対し25%のH−Leu−(S)−α−(4−Pentenyl)Ala−Phe−NHが混入した。
H−Leu−Arg−(S)−α−(4−Pentenyl)Ala−Phe−NH
HRMSm/z:573.3871(C2949([M+H])に対する計算値);573.3876(実測値)。
H−Leu−(S)−α−(4−Pentenyl)Ala−Phe−NH
HRMSm/z:417.2860(C2337([M+H])に対する計算値);417.2860(実測値)。
MSデータ
(参考例2)
H−Leu−Arg−(S)−α−(4−Pentenyl)Ala−Phe−NHの合成
Figure 2015033781
Fmoc−Arg(Pbf)−OH、(S)−Fmoc−α−(4−Pentenyl)Ala−OHの代わりに実施例8で調製したFmoc−Arg(Pbf)−(S)−α−(4−Pentenyl)Ala−OHを用い、参考例1と同様の方法でH−Leu−Arg−(S)−α−(4−Pentenyl)Ala−Phe−NHを合成した。目的物中に、H−Leu−(S)−α−(4−Pentenyl)Ala−Phe−NHの混入はなかった。
HEMSm/z:573.3871(C2949([M+H])に対する計算値);573.3874(実測値)。
(参考例3)
H−Leu−D−Hcy−(S)−α−Me−o−fluoroPhe−Phe−NHの合成
Figure 2015033781

参考例1と同様の方法で、H−Leu−D−Hcy−(S)−α−Me−o−fluoroPhe−Phe−NHを合成した。生成物中には目的物の他に、目的物に対し1.0%のH−Leu−(S)−α−Me−o−fluoroPhe−Phe−NH及び1.2%のH−(S)−α−Me−o−fluoroPhe−Phe−NHが混入した。
H−Leu−D−Hcy−(S)−α−Me−o−fluoroPhe−Phe−NH
HRMSm/z:574.2858(C2941FNS([M+H])に対する計算値);574.2856(実測値)。
H−Leu−(S)−α−Me−o−fluoroPhe−Phe−NH
HRMSm/z:457.2609(C2534FN([M+H])に対する計算値);457.2611(実測値)。
H−(S)−α−Me−o−fluoroPhe−Phe−NH
HRMSm/z:344.1769(C1923FN([M+H])に対する計算値);344.1761(実測値)。
(参考例4)
H−Leu−D−Hcy−(S)−α−Me−o−fluoroPhe−Phe−NHの合成
Figure 2015033781

Fmoc−D−Hcy(Tr)−OH、(S)−Fmoc−α−Me−o−fluoroPhe−OHの代わりに実施例4で調製したFmoc−D−Hcy(Tr)−(S)−α−Me−o−fluoroPhe−OHを用いて、参考例3と同様の方法でH−Leu−D−Hcy−(S)−α−Me−o−fluoroPhe−Phe−NHを合成した。目的物中に、H−Leu−(S)−α−Me−o−fluoroPhe−Phe−NH及びH−(S)−α−Me−o−fluoroPhe−Phe−NHの混入はなかった。
HRMSm/z:574.2858(C2941FNS([M+H])に対する計算値);574.2862(実測値)。
(参考例5)
H−Leu−Leu−(S)−α−(4−Pentenyl)Ala−Phe−NHの合成
Figure 2015033781
参考例1と同様の方法で、H−Leu−Leu−(S)−α−(4−Pentenyl)Ala−Phe−NHを合成した。生成物中には目的物の他に、目的物に対し0.89%のH−Leu−(S)−α−(4−Pentenyl)Ala−Phe−NHが混入した。
H−Leu−Leu−(S)−α−(4−Pentenyl)Ala−Phe−NH
HRMSm/z:530.3701(C2948([M+H])に対する計算値);530.3702(実測値)。
H−Leu−(S)−α−(4−Pentenyl)Ala−Phe−NH
HRMSm/z:417.2860(C2336([M+H])に対する計算値);417.2856(実測値)。
(参考例6)
H−Leu−Leu−(S)−α−(4−Pentenyl)Ala−Phe−NHの合成
Figure 2015033781
Fmoc−Leu−OH、(S)−Fmoc−α−(4−Pentenyl)Ala−OHの代わりに実施例9で調製したFmoc−Leu−(S)−α−(4−Pentenyl)Ala−OHを用いて、参考例5と同様の方法でH−Leu−Leu−(S)−α−(4−Pentenyl)Ala−Phe−NHを合成した。目的物中に、H−Leu−(S)−α−(4−Pentenyl)Ala−Phe−NHの混入はなかった。
HRMSm/z:530.3701(C2948([M+H])に対する計算値);530.3708(実測値)。
従来のペプチド固相合成法に従いアミノ酸を順次結合した参考例1、3及び5では、所望のペプチドの他に、アミノ酸欠損体の混入が確認されたのに対し、本発明に係る製造方法により製造されたジペプチド誘導体を用いて同様のペプチドを合成した参考例2、4及び6では、このようなアミノ酸欠損体の混入は確認されなかった。
本発明によれば、従来のジペプチドの製造方法より工程数が少なく、且つ各構成アミノ酸の側鎖の保護基の種類にかかわらず、所望のジペプチド誘導体を収率よく得ることが可能なジペプチド誘導体の製造方法を提供することができる。

Claims (3)

  1. 下記式(1)で示されるN−末端が保護されたジペプチド又はその塩の製造方法であって、
    Figure 2015033781

    [式(1)において、Xはアミノ基の保護基を表し、
    は、α−一置換アミノ酸の側鎖、又は水素原子を表し、該側鎖は保護されていてもよく、
    は、Rと結合して前記側鎖を形成する基、又は水素原子を表し、
    Ra及びRbは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基又は置換基を有していてもよいアラルキル基を表す。]
    下記式(2)で示されるN−末端が保護されたα−一置換アミノ酸若しくはグリシン又はそれらの塩と、
    Figure 2015033781

    [式(2)において、X、R及びRは式(1)におけるX、R及びRと同様に定義される。]
    下記式(3)で示される二置換アミノ酸又はその塩とを、
    Figure 2015033781

    [式(3)において、Ra及びRbは式(1)におけるRa及びRbと同様に定義される。]
    縮合剤の存在下で縮合させることを含む、製造方法。
  2. 前記式(2)で示されるN−末端が保護されたα−一置換アミノ酸若しくはグリシン又はそれらの塩と、前記式(3)で示される二置換アミノ酸又はその塩とを、化学量論量以上の縮合剤の存在下で縮合させる、請求項1に記載の製造方法。
  3. 前記式(2)で示されるN−末端が保護されたα−一置換アミノ酸若しくはグリシン又はそれらの塩の反応率が70〜80%に達した時点で、前記式(2)で示されるN−末端が保護されたα−一置換アミノ酸若しくはグリシン又はそれらの塩と前記式(3)で示される二置換アミノ酸又はその塩との反応を終了させる、請求項1又は2に記載の製造方法。
JP2015535415A 2013-09-03 2014-08-20 二置換アミノ酸残基を含むジペプチド誘導体の製造方法 Active JP6275150B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013182231 2013-09-03
JP2013182231 2013-09-03
PCT/JP2014/071804 WO2015033781A1 (ja) 2013-09-03 2014-08-20 二置換アミノ酸残基を含むジペプチド誘導体の製造方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2015033781A1 true JPWO2015033781A1 (ja) 2017-03-02
JP6275150B2 JP6275150B2 (ja) 2018-02-07

Family

ID=52628260

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015535415A Active JP6275150B2 (ja) 2013-09-03 2014-08-20 二置換アミノ酸残基を含むジペプチド誘導体の製造方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9605020B2 (ja)
EP (1) EP3042911A4 (ja)
JP (1) JP6275150B2 (ja)
WO (1) WO2015033781A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112888702B (zh) 2018-11-12 2024-02-02 Cj第一制糖株式会社 制备n-乙酰基二肽以及n-乙酰基氨基酸的方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19575012I2 (de) 1980-10-23 2002-01-24 Schering Corp Carboxyalkyl-Dipeptide Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende Arzneimittel
NZ201001A (en) 1982-06-17 1986-02-21 Schering Corp Substituted dipeptide derivatives and method of preparation

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NEBEL, K. ET AL.: "Stereoselective synthesis of isovaline (IVA) and IVA-containing dipeptides for use in peptide synthe", TETRAHEDRON, vol. Vol. 44, No. 15, JPN6014049478, 1988, pages pp. 4793-6 *
PAIRA, T. K. ET AL.: "Peptide-Polymer Bioconjugates via Atom Transfer Radical Polymerization and Their Solution Aggregatio", MACROMOLECULES, vol. Vol. 43, No. 9, JPN6014049480, 2010, pages pp. 4050-4061 *
TANTRY, S. J. ET AL.: "Synthesis of Nα-protected peptide acids by N→C chain extension employing O,N-bis-trimethylsilyl-am", INDIAN JOURNAL OF CHEMISTRY, SECTION B: ORGANIC CHEMISTRY INCLUDING MEDICINAL CHEMISTRY, vol. Vol. 43B, No. 6, JPN6014049479, 2004, pages pp. 1282-1287 *
VERARDO, G. ET AL.: "α-N-Protected dipeptide acids: a simple and efficient synthesis via the easily accessible mixed anh", JOURNAL OF PEPTIDE SCIENCE, vol. Vol. 19, No. 5, JPN6014049477, March 2013 (2013-03-01), pages pp. 315-324 *
VRUDHULA, V. M. ET AL.: "Cephalosporin prodrugs of paclitaxel for immunologically specific activation by L-49-sFv-beta-lact", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, vol. Vol. 13, JPN6017048876, 2003, pages pp. 539-542 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20160207958A1 (en) 2016-07-21
EP3042911A1 (en) 2016-07-13
EP3042911A4 (en) 2017-04-26
JP6275150B2 (ja) 2018-02-07
WO2015033781A1 (ja) 2015-03-12
US9605020B2 (en) 2017-03-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200277327A1 (en) Method for synthesizing peptide containing n-substituted amino acid
KR101238133B1 (ko) 엡티피바타이드 및 관련 중간체 화합물의 제조 방법
JP6500105B2 (ja) ペプチドが結合された安定したアスコルビン酸誘導体、その製造方法、及びそれを含む化粧料組成物
HU205091B (en) Process for producing amino acid-n-carboxyanhydrides protected with urethane group
CN114685646B (zh) 一种多肽侧链类似物的制备方法及其应用
US9850285B2 (en) Process for preparing eptifibatide
JP2021534199A (ja) Wntヘキサペプチドの液相合成
US20210253634A1 (en) Process for the liquid phase synthesis of h-inp-(d)bal-(d)trp-phe-apc-nh2, and pharmaceutically acceptable salts thereof
TW202235429A (zh) 含n-置換-胺基酸殘基之胜肽化合物的製備方法
JP6275150B2 (ja) 二置換アミノ酸残基を含むジペプチド誘導体の製造方法
JPH0665291A (ja) 環状ペプチドの合成方法
JP2005529186A5 (ja)
JPH05508859A (ja) ペプチド合成方法
WO2017092689A1 (en) Method for preparation of rada-16
WO2012108408A1 (ja) ジペプチド及びトリペプチドの製造方法
JP2007332042A (ja) ケージドペプチドの合成法
KR20110060779A (ko) 루프로라이드의 제조방법
JPH04221394A (ja) ペプチド脂質
JP3554399B2 (ja) ペプチド誘導体
JPH0597789A (ja) α−ヒドロキシグリシンアミド誘導体及びその製造方法
JPS5830299B2 (ja) トリペプチドおよびその誘導体
EP1032585A1 (en) Deoxyhypusine reagent and peptides
Gayathri et al. Fmoc-peptide acid chlorides: Preparation, characterization and utility in peptide synthesis
IJsselstijn Synthesis of conformationally restricted beta-turn mimics
EP2343309A1 (en) Method for producing a peptide

Legal Events

Date Code Title Description
RD02 Notification of acceptance of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422

Effective date: 20161205

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20161206

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20161206

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20170210

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20171221

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20180109

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6275150

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250