JPWO2013151186A1

JPWO2013151186A1 - エリスロポエチン産生細胞の誘導方法

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Publication number: JPWO2013151186A1
Application number: JP2014509231A
Authority: JP
Inventors: 健二長船; 浩史人見
Original assignee: Kyoto University
Current assignee: Kyoto University
Priority date: 2012-04-06
Filing date: 2013-04-04
Publication date: 2015-12-17
Anticipated expiration: 2033-04-04
Also published as: EP2837681A1; US20150087060A1; WO2013151186A1; US9334475B2; JP6112733B2; EP2837681B1; EP2837681A4

Abstract

本発明の課題は、ヒト多能性幹細胞からエリスロポエチン産生細胞を分化誘導する方法を提供することにある。特定の増殖因子および化合物を含む培地を用いたヒト多能性幹細胞からエリスロポエチン産生細胞を分化誘導する方法を提供することにより、上記課題を解決する。

Description

本発明は、多能性幹細胞からエリスロポエチン産生細胞を分化誘導する方法に関する。本発明はまた、多能性幹細胞からエリスロポエチン産生細胞を効率的に分化誘導する方法に関する。

赤血球造血は、赤血球数の恒常性維持のために必須のプロセスである。赤血球の平均寿命はヒトでは約１２０日であり、老化赤血球は循環系から継続的に除かれるため、毎日、約千億個の赤血球が成人体内で新たに産生されている。赤血球造血は、主に造血因子のエリスロポエチン（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ；ＥＰＯ）によって恒常性が維持されている。ＥＰＯは主に腎臓で産生され、血液中を循環し、骨髄中の後期赤芽球系前駆細胞（ＣＦＵ−Ｅ）に作用して増殖、分化を刺激することで赤血球造血を促進する。ＥＰＯが正常レベルに産生されず不足すると、ＣＦＵ−Ｅが減少し、赤血球造血が低下した結果、貧血になる。貧血はヘモグロビン濃度が不十分で身体の酸素輸送要求を満足できない病的状態であり、労作意欲の低下、易疲労感、息切れ、立ちくらみ、動悸等の臨床症状を呈するため、症状を改善することが望まれる。各種の疾患がＥＰＯ不足による貧血をもたらすことが知られるが、最も一般的な例は、腎臓病である。慢性腎不全患者は、腎臓が損傷することによりＥＰＯ産生が低下するために腎性貧血を呈する。慢性腎不全患者のうちの多くは、腎機能代替のため頻繁な透析を必要とする透析患者であり、透析患者の約９割は貧血を患う。現在、腎性貧血の治療法として、組換えヒトＥＰＯ（ｒＨｕＥＰＯ）の投与が広く用いられている。透析患者の多くはｒＨｕＥＰＯを投与されており、それらのうち多くは貧血改善効果が認められている。しかしながら、ｒＨｕＥＰＯの投与は、長期間にわたる治療となるためにコストの増大などが問題となっている。
一方、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や、体細胞へ未分化細胞特異的遺伝子を導入することで得られる人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）など多能性を有する細胞がこれまでに報告されている（特許文献１および２）。そこで、腎性貧血の治療方法として、これらの多能性幹細胞から分化誘導されたＥＰＯ産生細胞を移植する治療法が検討されている。しかしながら、ヒト多能性幹細胞からＥＰＯ産生細胞を分化誘導する技術については、現在のところ十分に確立されていない。

ＵＳＰ５，８４３，７８０ＷＯ２００７／０６９６６６

上述した実情に鑑み、本発明は、ヒト多能性幹細胞からエリスロポエチン産生細胞を分化誘導する新規な方法を提供することを目的とする。本発明はまた、多能性幹細胞からエリスロポエチン産生細胞を効率的に分化誘導する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、特定の因子を含む培地で培養を行うことにより、ヒト多能性幹細胞からエリスロポエチン産生細胞を分化誘導できることを初めて見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下を包含する：
［１］以下の工程を含む、ヒト多能性幹細胞からのエリスロポエチン産生細胞の製造方法：
（ｉ）ヒト多能性幹細胞を、ＡｃｔｉｖｉｎとＧＳＫ−３β阻害剤とを含む培地で培養する工程；および
（ｉｉ）工程（ｉ）の後、ヒト多能性幹細胞を、ＩＧＦファミリー遺伝子産物を含む培地で培養する工程、
［２］前記ＧＳＫ−３β阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１である、［１］に記載の方法、
［３］前記ＩＧＦファミリー遺伝子産物がＩＧＦ−１である、［１］または［２］に記載の方法、
［４］前記ヒト多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞またはヒトＥＳ細胞である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法、
［５］前記工程（ｉ）において、培地がＨＤＡＣ阻害剤をさらに含む、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法、
［６］前記ＨＤＡＣ阻害剤がＮａＢである、［５］に記載の方法、
［７］前記工程（ｉｉ）において、培地がジメチルスルホキシドをさらに含む、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法、
［８］前記工程（ｉ）において、前記ヒト多能性幹細胞を単一細胞へ分散させることを含む、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法、
［９］前記工程（ｉｉ）が８〜１２日間の培養期間である、［１］〜［８］のいずれかに記載の方法、
［１０］前記工程（ｉ）が６日間の培養期間であり、および、前記工程（ｉｉ）が１０日間の培養期間である、［９］に記載の方法、
［１１］前記工程（ｉｉ）が低酸素条件下で行われる、［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法、
［１２］前記低酸素条件下における酸素濃度が５％である、［１１］に記載の方法、
［１３］ヒト多能性幹細胞からエリスロポエチン産生細胞を製造するためのキットであって、Ａｃｔｉｖｉｎ、ＧＳＫ−３β阻害剤およびＩＧＦファミリー遺伝子産物を含む、前記キット、
［１４］前記ＧＳＫ−３β阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１である、［１３］に記載のキット、
［１５］前記ＩＧＦファミリー遺伝子産物がＩＧＦ−１である、［１３］または［１４］に記載のキット、
［１６］ＨＤＡＣ阻害剤をさらに含む、［１３］〜［１５］のいずれかに記載のキット、
［１７］前記ＨＤＡＣ阻害剤がＮａＢである、［１６］に記載のキット、
［１８］ジメチルスルホキシドをさらに含む、［１３］〜［１７］のいずれかに記載のキット、
［１９］ヒト多能性幹細胞を単一分散させる試薬をさらに含む、［１３］〜［１８］のいずれかに記載のキット、
［２０］ＲＯＣＫ阻害剤をさらに含む、［１３］〜［１９］のいずれかに記載のキット、
［２１］前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ−２７６３２である、［２０］に記載のキット。
本明細書は本願の優先権の基礎である米国仮出願Ｎｏ．６１／６２１，２５６の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
本発明に示す方法により、ヒト多能性幹細胞からエリスロポエチン産生細胞を製造することが可能となる。また、得られたエリスロポエチン産生細胞から産生されるＥＰＯは市販のＥＰＯと同等もしくはそれ以上の機能を有するため、当該エリスロポエチン産生細胞を用いて腎性貧血などの疾患の効果的な治療が可能となる。

図１は、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導されたＥＰＯ産生細胞におけるＥＰＯの産生を示す。データは、工程２（Ｓｔａｇｅ２）の１８日目における細胞を抗体染色することにより得られた。
図２は、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導されたＥＰＯ産生細胞におけるＥＰＯｍＲＮＡ発現およびＥＰＯタンパク質産生を示す。ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方において、ＥＰＯ産生が確認された。
図３は、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導されたＥＰＯ産生細胞におけるＥＰＯｍＲＮＡ発現の経時的変化を示す。工程２の６日目よりＥＰＯｍＲＮＡの転写量が多くなることが確認された。
図４は、工程２におけるＩＧＦ−１のＥＰＯ産生亢進作用を示す。ＩＧＦ−１は、ＩＧＦ−２と比較して、より強力にＥＰＯ産生を亢進させることが確認された。
図５は、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導されたＥＰＯ産生細胞における種々のＩＧＦ−１濃度でのＥＰＯ分泌を示す。データは、工程２の８日目における細胞のＥＰＯ分泌を示す。
図６は、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導されたＥＰＯ産生細胞における種々のＩＧＦ−１濃度でのＥＰＯ分泌の経時的変化を示す。ＩＧＦ−１５０ｎｇ／ｍＬでは工程２の１０日目において最大のＥＰＯ分泌が確認された。ＩＧＦ−１１００ｎｇ／ｍＬでは工程２の１２日目までその分泌の増加傾向が確認された。
図７は、低酸素条件下でヒトｉＰＳ細胞から分化誘導されたＥＰＯ産生細胞におけるＥＰＯ産生の経時的変化を示す。Ｓｔａｇｅ２の第１日目より低酸素培養を施行した。
図８は、ＥＰＯ産生細胞の培養上清による造血幹細胞の赤芽球への分化誘導効率を示す。コントロールとして、市販のリコンビナントＥＰＯを用いた。
図９は、ＥＰＯ産生細胞の培養上清によるマウスの腎性貧血の改善効果を示す。コントロールとして、市販のリコンビナントＥＰＯを用いた。

本発明を以下に詳細に説明する。
＜多能性幹細胞＞
本発明で使用可能な多能性幹細胞は、生体に存在する全ての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、それには、以下のものに限定されないが、例えば胚性幹（ＥＳ）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞、精子幹細胞（「ＧＳ細胞」）、胚性生殖細胞（「ＥＧ細胞」）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞、およびｉＰＳ細胞である。
（Ａ）胚性幹細胞
ＥＳ細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。
ＥＳ細胞は、受精卵の８細胞期、桑実胚後の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚由来の幹細胞であり、成体を構成するあらゆる細胞に分化する能力、いわゆる分化多能性と、自己複製による増殖能とを有している。ＥＳ細胞は、マウスで１９８１年に発見され（Ｍ．Ｊ．ＥｖａｎｓａｎｄＭ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ（１９８１），Ｎａｔｕｒｅ２９２：１５４−１５６）、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもＥＳ細胞株が樹立された（Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎｅｔａｌ．（１９９８），Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２：１１４５−１１４７、Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎｅｔａｌ．（１９９５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：７８４４−７８４８、Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎｅｔａｌ．（１９９６），Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５５：２５４−２５９、およびＪ．Ａ．ＴｈｏｍｓｏｎａｎｄＶ．Ｓ．Ｍａｒｓｈａｌｌ（１９９８），Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，３８：１３３−１６５）。
ＥＳ細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ））、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ））などの物質を添加した培地を用いて行うことができる。ヒトおよびサルのＥＳ細胞の樹立と維持の方法については、例えばＨ．Ｓｕｅｍｏｒｉｅｔａｌ．（２００６），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３４５：９２６−９３２、Ｍ．Ｕｅｎｏｅｔａｌ．（２００６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：９５５４−９５５９、Ｈ．Ｓｕｅｍｏｒｉｅｔａｌ．（２００１），Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２２２：２７３−２７９、およびＨ．Ｋａｗａｓａｋｉｅｔａｌ．（２００２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１５８０−１５８５などに記載されている。
ＥＳ細胞作製のための培地として、例えば０．１ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、２ｍＭＬ−グルタミン酸、２０％ＫＳＲおよび４ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦを補充したＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を使用し、３７℃、５％ＣＯ_２湿潤雰囲気下でヒトＥＳ細胞を維持することができる。また、ＥＳ細胞は、３〜４日おきに継代する必要があり、このとき、継代は、例えば１ｍＭＣａＣｌ_２および２０％ＫＳＲを含有するＰＢＳ中の０．２５％トリプシンおよび０．１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶを用いて行うことができる。
ＥＳ細胞の選択は、一般に、アルカリホスファターゼ、Ｏｃｔ−３／４、Ｎａｎｏｇなどの遺伝子マーカーの発現を指標にして行うことができる。特に、ヒトＥＳ細胞の選択では、ＯＣＴ−３／４、ＮＡＮＯＧなどの遺伝子マーカーの発現をＲｅａｌ−ＴｉｍｅＰＣＲ法で検出したり、細胞表面抗原であるＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１を免疫染色法にて検出することで行うことができる（ＫｌｉｍａｎｓｋａｙａＩ，ｅｔａｌ．（２００６），Ｎａｔｕｒｅ．４４４：４８１−４８５）。
ヒトＥＳ細胞株である例えばＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２およびＫｈＥＳ−３は、京都大学再生医科学研究所（京都、日本）から入手可能である。
（Ｂ）精子幹細胞
精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ＥＳ細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ（Ｍ．Ｋａｎａｔｓｕ−Ｓｈｉｎｏｈａｒａｅｔａｌ．（２００３）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，６９：６１２−６１６；Ｋ．Ｓｈｉｎｏｈａｒａｅｔａｌ．（２００４），Ｃｅｌｌ，１１９：１００１−１０１２）。精子幹細胞は、神経膠細胞系由来神経栄養因子（ｇｌｉａｌｃｅｌｌｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ））を含む培地で自己複製可能であるし、またＥＳ細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる（竹林正則ら（２００８），実験医学，２６巻，５号（増刊），４１〜４６頁，羊土社（東京、日本））。
（Ｃ）胚性生殖細胞
胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ＥＳ細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、幹細胞因子（ｓｔｅｍｃｅｌｌｆａｃｔｏｒ）などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立し得る（Ｙ．Ｍａｔｓｕｉｅｔａｌ．（１９９２），Ｃｅｌｌ，７０：８４１−８４７；Ｊ．Ｌ．Ｒｅｓｎｉｃｋｅｔａｌ．（１９９２），Ｎａｔｕｒｅ，３５９：５５０−５５１）。
（Ｄ）人工多能性幹細胞
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、ある特定の核初期化物質を、ＤＮＡまたはタンパク質の形態で体細胞に導入するか、または薬剤によって当該核初期化物質の内在性のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を上昇させることによって作製することができる、ＥＳ細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（Ｋ．ＴａｋａｈａｓｈｉａｎｄＳ．Ｙａｍａｎａｋａ（２００６）Ｃｅｌｌ，１２６：６６３−６７６、Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉｅｔａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ，１３１：８６１−８７２、Ｊ．Ｙｕｅｔａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８：１９１７−１９２０、Ｍ．Ｎａｋａｇａｗａｅｔａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：１０１−１０６、国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６および国際公開ＷＯ２０１０／０６８９５５）。核初期化物質は、ＥＳ細胞に特異的に発現している遺伝子またはＥＳ細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子若しくはその遺伝子産物であればよく、特に限定されないが、例えば、Ｏｃｔ３／４，Ｋｌｆ４，Ｋｌｆ１，Ｋｌｆ２，Ｋｌｆ５，Ｓｏｘ２，Ｓｏｘ１，Ｓｏｘ３，Ｓｏｘ１５，Ｓｏｘ１７，Ｓｏｘ１８，ｃ−Ｍｙｃ，Ｌ−Ｍｙｃ，Ｎ−Ｍｙｃ，ＴＥＲＴ，ＳＶ４０ＬａｒｇｅＴａｎｔｉｇｅｎ，ＨＰＶ１６Ｅ６，ＨＰＶ１６Ｅ７，Ｂｍｉｌ，Ｌｉｎ２８，Ｌｉｎ２８ｂ，Ｎａｎｏｇ，Ｅｓｒｒｂ、ＥｓｒｒｇまたはＧｌｉｓ１が例示される。これらの初期化物質は、ｉＰＳ細胞樹立の際には、組み合わされて使用されてもよい。例えば、上記初期化物質を、少なくとも１つ、２つ若しくは３つ含む組み合わせであり、好ましくは４つを含む組み合わせである。
上記の各核初期化物質のマウスおよびヒトｃＤＮＡのヌクレオチド配列並びに当該ｃＤＮＡにコードされるタンパク質のアミノ酸配列情報は、ＷＯ２００７／０６９６６６に記載のＮＣＢＩａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒｓを参照すること、またＬ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｅｓｒｒｂ、ＥｓｒｒｇおよびＧｌｉｓ１のマウスおよびヒトのｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列情報については、それぞれ下記ＮＣＢＩａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒｓを参照することにより取得できる。当業者は、当該ｃＤＮＡ配列またはアミノ酸配列情報に基づいて、常法により所望の核初期化物質を調製することができる。
遺伝子名マウスヒト
Ｌ−ＭｙｃＮＭ＿００８５０６ＮＭ＿００１０３３０８１
Ｌｉｎ２８ＮＭ＿１４５８３３ＮＭ＿０２４６７４
Ｌｉｎ２８ｂＮＭ＿００１０３１７７２ＮＭ＿００１００４３１７
ＥｓｒｒｂＮＭ＿０１１９３４ＮＭ＿００４４５２
ＥｓｒｒｇＮＭ＿０１１９３５ＮＭ＿００１４３８
Ｇｌｉｓ１ＮＭ＿１４７２２１ＮＭ＿１４７１９３
これらの核初期化物質は、タンパク質の形態で、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチドとの結合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよいし、あるいは、ＤＮＡの形態で、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Ｃｅｌｌ，１２６，ｐｐ．６６３−６７６，２００６；Ｃｅｌｌ，１３１，ｐｐ．８６１−８７２，２００７；Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８，ｐｐ．１９１７−１９２０，２００７）、アデノウイルスベクター（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２２，９４５−９４９，２００８）、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（ＰｒｏｃＪｐｎＡｃａｄＳｅｒＢＰｈｙｓＢｉｏｌＳｃｉ．８５，３４８−６２，２００９）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ、ＰＡＣ）などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用し得る（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２２：９４９−９５３，２００８）。ベクターは、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができる。使用されるプロモーターとしては、例えばＥＦ１αプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）ＬＴＲ、ＨＳＶ−ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、ＥＦ１αプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＭｏＭｕＬＶＬＴＲ、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが挙げられる。さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ＦＬＡＧなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターは、体細胞への導入後、核初期化物質をコードする遺伝子若しくはプロモーターとそれに結合する核初期化物質をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にＬｏｘＰ配列を有してもよい。別の好ましい一実施態様においては、トランスポゾンを用いて染色体に導入遺伝子を組み込んだ後に、プラスミドベクター若しくはアデノウイルスベクターを用いて細胞に転移酵素を作用させ、導入遺伝子を完全に染色体から除去する方法が用いられ得る。好ましいトランスポゾンとしては、例えば、鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンであるｐｉｇｇｙＢａｃ等が挙げられる（Ｋａｊｉ，Ｋ．ｅｔａｌ．，（２００９），Ｎａｔｕｒｅ，４５８：７７１−７７５、Ｗｏｌｔｊｅｎｅｔａｌ．，（２００９），Ｎａｔｕｒｅ，４５８：７６６−７７０、ＷＯ２０１０／０１２０７７）。さらに、ベクターは、染色体への組み込みがなくとも複製されて、エピソーマルに存在するように、リンパ指向性ヘルペスウイルス（ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、ＢＫウイルスおよび牛乳頭腫（Ｂｏｖｉｎｅｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）の起点とその複製に係る配列を含んでいてもよい。例えば、ＥＢＮＡ−１およびｏｒｉＰ若しくはＬａｒｇｅＴおよびＳＶ４０ｏｒｉ配列を含むことが挙げられる（ＷＯ２００９／１１５２９５、ＷＯ２００９／１５７２０１およびＷＯ２００９／１４９２３３）。また、複数の核初期化物質を同時に導入するために、ポリシストロニックに発現させる発現ベクターを用いてもよい。ポリシストロニックに発現させるためには、遺伝子をコードする配列の間は、ＩＲＥＳまたは口蹄病ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａコード領域により結合されていてもよい（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２２：９４９−９５３，２００８並びにＷＯ２００９／０９２０４２およびＷＯ２００９／１５２５２９）。
核初期化に際して、ｉＰＳ細胞の誘導効率を高めるために、上記の因子の他に、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤［例えば、バルプロ酸（ＶＰＡ）（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６（７）：７９５−７９７（２００８））、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、ＭＣ１２９３、Ｍ３４４等の低分子阻害剤、ＨＤＡＣに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ（例えば、ＨＤＡＣ１ｓｉＲＮＡＳｍａｒｔｐｏｏｌ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＨｕＳＨ２９ｍｅｒｓｈＲＮＡＣｏｎｓｔｒｕｃｔｓａｇａｉｎｓｔＨＤＡＣ１（ＯｒｉＧｅｎｅ）等）等の核酸性発現阻害剤など］、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば５’−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６（７）：７９５−７９７（２００８））、Ｇ９ａヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤［例えば、ＢＩＸ−０１２９４（ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ，２：５２５−５２８（２００８））等の低分子阻害剤、Ｇ９ａに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ（例えば、Ｇ９ａｓｉＲＮＡ（ｈｕｍａｎ）（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）等）等の核酸性発現阻害剤など］、Ｌ−ｃｈａｎｎｅｌｃａｌｃｉｕｍａｇｏｎｉｓｔ（例えばＢａｙｋ８６４４）（ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ，３，５６８−５７４（２００８））、ｐ５３阻害剤（例えばｐ５３に対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）（ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ，３，４７５−４７９（２００８））、ＷｎｔＳｉｇｎａｌｉｎｇａｃｔｉｖａｔｏｒ（例えばｓｏｌｕｂｌｅＷｎｔ３ａ）（ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ，３，１３２−１３５（２００８））、ＬＩＦまたはｂＦＧＦなどの増殖因子、ＡＬＫ５阻害剤（例えば、ＳＢ４３１５４２）（Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６：８０５−８（２００９））、ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ阻害剤、ｇｌｙｃｏｇｅｎｓｙｎｔｈａｓｅｋｉｎａｓｅ−３阻害剤（ＰｌｏＳＢｉｏｌｏｇｙ，６（１０），２２３７−２２４７（２００８））、ｍｉＲ−２９１−３ｐ、ｍｉＲ−２９４、ｍｉＲ−２９５などのｍｉＲＮＡ（Ｒ．Ｌ．Ｊｕｄｓｏｎｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２７：４５９−４６１（２００９））等を使用することができる。
薬剤によって核初期化物質の内在性のタンパク質の発現を上昇させる方法における薬剤としては、６−ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ−３’−ｏｘｉｍｅ、ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ−５−ｎｉｔｒｏ−３’−ｏｘｉｍｅ、ｖａｌｐｒｏｉｃａｃｉｄ、２−（３−（６−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）−ｌＨ−ｐｙｒａｚｏｌ−４−ｙｌ）−１，５−ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎｅ、１−（４−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）−２−（４，５，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２−ｉｍｉｎｏ−３（２Ｈ）−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ）ｅｔｈａｎｏｎｅＨＢｒ（ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−ａｌｐｈａ）、ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎＪ２およびｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎＥ２等が例示される（ＷＯ２０１０／０６８９５５）。
ｉＰＳ細胞誘導のための培養培地としては、例えば（１）１０〜１５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＤＭＥ培地（これらの培地にはさらに、ＬＩＦ、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）、（２）ｂＦＧＦまたはＳＣＦを含有するＥＳ細胞培養用培地、例えばマウスＥＳ細胞培養用培地（例えばＴＸ−ＷＥＳ培地、トロンボＸ社）または霊長類ＥＳ細胞培養用培地（例えば霊長類（ヒト＆サル）ＥＳ細胞用培地（リプロセル、京都、日本）、ｍＴｅＳＲ−１）などが含まれる。
培養法の例としては、例えば、３７℃、５％ＣＯ_２存在下にて、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で体細胞と核初期化物質（ＤＮＡまたはタンパク質）を接触させ約４〜７日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞（例えば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上にまきなおし、体細胞と核初期化物質の接触から約１０日後からｂＦＧＦ含有霊長類ＥＳ細胞培養用培地で培養し、該接触から約３０〜約４５日またはそれ以上の後にＥＳ細胞様コロニーを生じさせることができる。また、ｉＰＳ細胞の誘導効率を高めるために、５〜１０％と低い酸素濃度の条件下で細胞を培養してもよい。
あるいは、その代替培養法として、フィーダー細胞（例えば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上で１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（これにはさらに、ＬＩＦ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約２５〜約３０日またはそれ以上の後にＥＳ様コロニーを生じさせることができる。
上記培養の間には、培養開始２日目以降から毎日１回新鮮な培地と培地交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ１００ｃｍ^２あたり約５×１０^３〜約５×１０^６細胞の範囲である。
マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子を用いた場合は、対応する薬剤を含む培地（選択培地）で培養を行うことによりマーカー遺伝子発現細胞を選択することができる。またマーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、マーカー遺伝子発現細胞を検出することができる。
本明細書中で使用する「体細胞」は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット等）由来の生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、例えば、角質化する上皮細胞（例えば、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例えば、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例えば、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例えば、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例えば、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例えば、Ｉ型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例えば、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例えば、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例えば、線維芽細胞）、収縮性細胞（例えば、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例えば、Ｔリンパ球）、感覚に関する細胞（例えば、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例えば、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例えば、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例えば、星状グリア細胞）、色素細胞（例えば、網膜色素上皮細胞）、およびそれらの前駆細胞（組織前駆細胞）等が挙げられる。細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、未分化な前駆細胞（体性幹細胞も含む）であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、例えば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。
本発明において、体細胞を採取する由来となる哺乳動物個体は特に制限されないが、好ましくはヒトである。
（Ｅ）核移植により得られたクローン胚由来のＥＳ細胞
ｎｔＥＳ細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のＥＳ細胞であり、受精卵由来のＥＳ細胞とほぼ同じ特性を有している（Ｔ．Ｗａｋａｙａｍａｅｔａｌ．（２００１），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：７４０−７４３；Ｓ．Ｗａｋａｙａｍａｅｔａｌ．（２００５），Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，７２：９３２−９３６；Ｊ．Ｂｙｒｎｅｅｔａｌ．（２００７），Ｎａｔｕｒｅ，４５０：４９７−５０２）。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたＥＳ細胞がｎｔＥＳ（ｎｕｃｌｅａｒｔｒａｎｓｆｅｒＥＳ）細胞である。ｎｔＥＳ細胞の作製のためには、核移植技術（Ｊ．Ｂ．Ｃｉｂｅｌｌｉｅｔａｌ．（１９９８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：６４２−６４６）とＥＳ細胞作製技術（上記）との組み合わせが利用される（若山清香ら（２００８），実験医学，２６巻，５号（増刊），４７〜５２頁）。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで再プログラム化することができる。
（Ｆ）融合幹細胞
融合幹細胞は、体細胞と卵子若しくはＥＳ細胞とを融合させることにより、融合させたＥＳ細胞と同様な多能性を有し、さらに体細胞に特有の遺伝子も有する幹細胞である（ＴａｄａＭｅｔａｌ．ＣｕｒｒＢｉｏｌ．１１：１５５３−８，２００１；ＣｏｗａｎＣＡｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００５Ａｕｇ２６；３０９（５７３９）：１３６９−７３）。
＜多能性幹細胞からのエリスロポエチン産生細胞の分化誘導法＞
本発明によれば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞からエリスロポエチン産生細胞への分化誘導に際して、以下の工程を含む方法を用いることができる：
（ｉ）ヒト多能性幹細胞等の多能性幹細胞を、ＡｃｔｉｖｉｎとＧＳＫ−３β（ＧｌｙｃｏｇｅｎＳｙｎｔｈａｓｅＫｉｎａｓｅ３β）阻害剤とを含む培地で培養する工程（第１工程）；および、
（ｉｉ）工程（ｉ）の後、多能性幹細胞を、ＩＧＦファミリー遺伝子産物を含む培地で培養する工程（第２工程）。
本発明において、エリスロポエチン産生細胞とは、エリスロポエチンを産生可能な任意の細胞を意味し、尿細管間質細胞など特定の組織細胞であることを限定しない。好ましくは、当該細胞がおかれた環境が低酸素状況の場合、エリスロポエチンの産生を増幅させるなど、酸素分圧に対して応答性を有している細胞であるが、特にこれに限定されない。また、本発明におけるエリスロポエチンとは、ＮＣＢＩのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＭ＿０００７９９において示される核酸配列から翻訳されるタンパク質であり、好ましくは、シグナルペプチドが切断などの修飾を受けた１６５個のアミノ酸からなるタンパク質である。
本発明において、分化誘導されたエリスロポエチン産生細胞は、他の細胞種が含まれる細胞集団として提供されてもよく、あるいは純化された集団であってもよい。
（Ａ）ヒト多能性幹細胞を、ＡｃｔｉｖｉｎとＧＳＫ−３β阻害剤とを含む培地で培養する工程（第１工程）
本工程では、前述のように得られたヒト多能性幹細胞を、任意の方法で分離し、浮遊培養により培養してもよく、あるいはコーティング処理された培養皿を用いて接着培養してもよい。本発明における培養方法として、好ましくは接着培養が採用される。ここで、ヒト多能性幹細胞の分離方法としては、例えば、力学的に分離する方法、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＴＭ）およびＡｃｃｕｍａｘ（ＴＭ）など）またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離方法が挙げられる。好ましくは、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（特に好ましくは、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＴＭ））を用いてヒト多能性幹細胞を解離し、力学的に細かく単一細胞へ分散する方法が用いられる。ここで、使用されるヒト多能性幹細胞は、使用したディッシュに対して８０％コンフルエントになるまで培養されたコロニーであることが好ましい。
浮遊培養とは、細胞を培養皿へ非接着の状態で培養することであり、特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）されていない培養皿、若しくは、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（ｐｏｌｙ−ＨＥＭＡ）によるコーティング処理）した培養皿を使用して行うことができる。
また、接着培養においては、コーティング処理された培養皿にて、任意の培地中で培養する。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（ＢＤ）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、マトリゲルである。
本工程における培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばＴＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓＦ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、およびこれらの混合培地などが包含される。好ましくは、ＲＰＭＩ１６４０培地である。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、ＫｎｏｃｋｏｕｔＳｅｒｕｍＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有し得る。
本工程においては、増殖因子としてＡｃｔｉｖｉｎを含む培地を用いる。本工程の培地はその他の増殖因子を含んでいてもよい。その他の増殖因子は、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ７ａ、ＴＧＦ−β、Ｎｏｄａｌ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＩＧＦファミリー遺伝子産物（例えば、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２）およびＧＤＦなどを含むがこれらに限定されない。
培地におけるＡｃｔｉｖｉｎの濃度は、通常１ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５０ｎｇ／ｍｌ〜１５０ｎｇ／ｍｌ、例えば、１ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、９５ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１１０ｎｇ／ｍｌ、１２０ｎｇ／ｍｌ、１３０ｎｇ／ｍｌ、１４０ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、１６０ｎｇ／ｍｌ、１７０ｎｇ／ｍｌ、１８０ｎｇ／ｍｌ、１９０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌであるがこれらに限定されない。特に好ましくは、１００ｎｇ／ｍｌである。
本工程においては、低分子化合物としてＧＳＫ−３β阻害剤を含む培地を用いる。本工程の培地はその他の低分子化合物を含んでいてもよい。その他の低分子化合物は、例えば、ＨＤＡＣ（Ｈｉｓｔｏｎｅｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ）阻害剤またはＲＯＣＫ（Ｒｈｏｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ）阻害剤などを含むがこれらに限定されない。
ＧＳＫ−３β阻害剤は、ＧＳＫ−３βタンパク質のキナーゼ活性（例えば、βカテニンに対するリン酸化能）を阻害する物質として定義され、既に多数のものが知られているが、例えば、インジルビン誘導体であるＢＩＯ（別名、ＧＳＫ−３β阻害剤ＩＸ；６−ブロモインジルビン３’−オキシム）、マレイミド誘導体であるＳＢ２１６７６３（３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるＧＳＫ−３β阻害剤ＶＩＩ（４−ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるＬ８０３−ｍｔｓ（別名、ＧＳＫ−３βペプチド阻害剤；Ｍｙｒ−Ｎ−ＧＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ−ＮＨ_２）および高い選択性を有するＣＨＩＲ９９０２１（６−［２−［４−（２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｍｅｔｈｙｌ−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−２−ｙｌ）ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−２−ｙｌａｍｉｎｏ］ｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ−３−ｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅ）が挙げられる。これらの化合物は、例えばＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社やＢｉｏｍｏｌ社等から市販されており容易に利用することが可能であるが、他の入手先から入手してもよく、あるいはまた自ら作製してもよい。
本発明で使用されるＧＳＫ−３β阻害剤は、好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１であり得る。
培地におけるＣＨＩＲ９９０２１の濃度は、通常１ｎＭ〜５０μＭ、好ましくは５０ｎＭ〜５μＭ、例えば、１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭであるがこれらに限定されない。特に好ましくは、１μＭである。
本工程における培地はさらに、ＨＤＡＣ阻害剤を含んでいてもよい。
ＨＤＡＣ阻害剤は、ＨＤＡＣの脱アセチル化活性を阻害する物質として定義され、例えば、ヒドロキサム酸誘導体、環状テトラペプチド、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）誘導体、ベンズアミド誘導体、求電子ケトン誘導体およびその他のＨＤＡＣ阻害剤を含むがこれらに限定されない。
ヒドロキサム酸誘導体としては、例えば、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）（Ｒｉｃｈｏｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５，３００３−３００７（１９９８））；ｍ−カルボキシケイ皮酸ビスヒドロキサミド（ＣＢＨＡ）（Ｒｉｃｈｏｎｅｔａｌ．，ｓｕｐｒａ）；ピロキサミド；トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）およびトリコスタチンＣなどのトリコスタチン類縁体（Ｋｏｇｈｅｅｔａｌ．１９９８．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５６：１３５９−１３６４）；サリチルヒドロキサム酸（Ａｎｄｒｅｗｓｅｔａｌ．，ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ３０，７６１−７６８（２０００））；スベロイルビスヒドロキサム酸（ＳＢＨＡ）（米国特許第５，６０８，１０８号）；アゼライン酸ビスヒドロキサム酸（ＡＢＨＡ）（Ａｎｄｒｅｗｓｅｔａｌ．，ｓｕｐｒａ）；アゼライン酸−１−ヒドロキサメート−９−アニリド（ＡＡＨＡ）（Ｑｉｕｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ１１，２０６９−２０８３（２０００））；６−（３−クロロフェニルウレイド）ｃａｒｐｏｉｃヒドロキサム酸（３Ｃｌ−ＵＣＨＡ）；オキサムフラチン［（２Ｅ）−５−［３−［（フェニルスルホニル）アミノフェニル］−ペンタ−２−エン−４−イノヒドロキサム酸］（Ｋｉｍｅｔａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１８：２４６１２４７０（１９９９））；Ａ−１６１９０６、スクリプタイド（Ｓｕｅｔａｌ．２０００ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，６０：３１３７−３１４２）；ＰＸＤ−１０１（Ｐｒｏｌｉｆｉｘ）；ＬＡＱ−８２４；ＣＨＡＰ；ＭＷ２７９６（Ａｎｄｒｅｗｓｅｔａｌ．，ｓｕｐｒａ）；ＭＷ２９９６（Ａｎｄｒｅｗｓｅｔａｌ．，ｓｕｐｒａ）；または米国特許第５，３６９，１０８号、第５，９３２，６１６号、第５，７００，８１１号、第６，０８７，３６７号および第６，５１１，９９０号に開示されているヒドロキサム酸のいずれかなどが挙げられるがこれらに限定されない。
環状テトラペプチドとしては、例えば、トラポキシンＡ（ＴＰＸ）−環状テトラペプチド（シクロ−（Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｄ−ピペコリニル−Ｌ−２−アミノ−８−オキソ−９，１０−エポキシデカノイル））（Ｋｉｊｉｍａｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，２２４２９−２２４３５（１９９３））；ＦＲ９０１２２８（ＦＫ２２８、デプシペプチド）（Ｎａｋａｊｉｍａｅｔａｌ．，Ｅｘ．ＣｅｌｌＲｅｓ．２４１，１２６−１３３（１９９８））；ＦＲ２２５４９７環状テトラペプチド（Ｈ．Ｍｏｒｉｅｔａｌ．，ＰＣＴ出願ＷＯ００／０８０４８（１７Ｆｅｂｒｕａｒｙ２０００））；アピシジン環状テトラペプチド［シクロ（Ｎ−Ｏ−メチル−Ｌ−トリプトファニル−Ｌ−イソロイシニル−Ｄ−ピペコリニル−Ｌ−２−アミノ−８−オキソデカノイル）］（Ｄａｒｋｉｎ−Ｒａｔｔｒａｙｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３，１３１４３１３１４７（１９９６））；アピシジンＩａ、アピシジンＩｂ、アピシジンＩｃ、アピシジンＩＩａ、およびアピシジンＩＩｂ（Ｐ．Ｄｕｌｓｋｉｅｔａｌ．，ＰＣＴ出願ＷＯ９７／１１３６６）；ＣＨＡＰ、ＨＣ−トキシン環状テトラペプチド（Ｂｏｓｃｈｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ７，１９４１−１９５０（１９９５））；ＷＦ２７０８２環状テトラペプチド（ＰＣＴ出願ＷＯ９８／４８８２５）；ならびにクラミドシン（Ｂｏｓｃｈｅｔａｌ．，ｓｕｐｒａ）などが挙げられるがこれらに限定されない。
短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）誘導体としては、例えば、酪酸ナトリウム（ＮａＢ）（Ｃｏｕｓｅｎｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４，１７１６−１７２３（１９７９））；イソ吉草酸塩（ＭｃＢａｉｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．５３：１３５７−１３６８（１９９７））；吉草酸塩（ＭｃＢａｉｎｅｔａｌ．，ｓｕｐｒａ）；４−フェニル酪酸塩（４−ＰＢＡ）（ＬｅａａｎｄＴｕｌｓｙａｎ，ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，１５，８７９−８７３（１９９５））；フェニル酪酸塩（ＰＢ）（Ｗａｎｇｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，５９，２７６６−２７９９（１９９９））；プロピオン酸塩（ＭｃＢａｉｎｅｔａｌ．，ｓｕｐｒａ）；ブチルアミド（ＬｅａａｎｄＴｕｌｓｙａｎ，ｓｕｐｒａ）；イソブチルアミド（ＬｅａａｎｄＴｕｌｓｙａｎ，ｓｕｐｒａ）；フェニル酢酸塩（ＬｅａａｎｄＴｕｌｓｙａｎ，ｓｕｐｒａ）；３−ブロモプロピオン酸塩（ＬｅａａｎｄＴｕｌｓｙａｎ，ｓｕｐｒａ）；トリブチリン（Ｇｕａｎｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，６０，７４９−７５５（２０００））；バルプロ酸、バルプロ酸塩およびＰｉｖａｎｅｘ（商標）などが挙げられるがこれらに限定されない。
ベンズアミド誘導体としては、例えば、ＣＩ−９９４；ＭＳ−２７５［Ｎ−（２−アミノフェニル）−４−［Ｎ−（ピリジン−３−イルメトキシカルボニル）アミノメチル］ベンズアミド］（Ｓａｉｔｏｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６，４５９２−４５９７（１９９９））；およびＭＳ−２７５の３’−アミノ誘導体（Ｓａｉｔｏｅｔａｌ．，ｓｕｐｒａ）などが挙げられるがこれらに限定されない。
求電子ケトン誘導体としては、例えば、トリフルオロメチルケトン（Ｆｒｅｙｅｔａｌ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．（２００２），１２，３４４３−３４４７；Ｕ．Ｓ．６，５１１，９９０）およびＮ−メチル−α−ケトアミドなどのα−ケトアミドなどが挙げられるがこれらに限定されない。
その他のＨＤＡＣ阻害剤としては、例えば、天然物、サマプリン、およびデプデシン（Ｋｗｏｎｅｔａｌ．１９９８．ＰＮＡＳ９５：３３５６−３３６１）などが挙げられるがこれらに限定されない。
本発明で使用されるＨＤＡＣ阻害剤は、好ましくは、酪酸ナトリウム（ＮａＢ）であり得る。
培地におけるＮａＢの濃度は、通常０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭ〜１ｍＭ、例えば、０．０１ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭ、０．５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭまたは１０ｍＭであるがこれらに限定されない。特に好ましくは、０．５ｍＭである。
本工程におけるＮａＢは、任意の時期に任意の期間において培地に添加することができる。本工程におけるＮａＢの添加期間は、例えば、１日間、２日間、３日間、４日間または５日間であり、好ましくは３日間である。添加時期は、培養の１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目または１０日目である。好ましくは、培養の２日目にＮａＢを添加し、３日間添加培地で培養することである。
本工程における培地はさらに、ＲＯＣＫ阻害剤を含んでいてもよい。特に、本工程が多能性幹細胞を単一細胞へ分散させる工程を含む場合には、培地にＲＯＣＫ阻害剤が含まれていることが好ましい。
ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Ｙ−２７６３２（例えば、Ｉｓｈｉｚａｋｉｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７，９７６−９８３（２０００）；Ｎａｒｕｍｉｙａｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．３２５，２７３−２８４（２０００）参照）、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７（例えば、Ｕｅｎａｔａｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３８９：９９０−９９４（１９９７）参照）、Ｈ−１１５２（例えば、Ｓａｓａｋｉｅｔａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．９３：２２５−２３２（２００２）参照）、Ｗｆ−５３６（例えば、Ｎａｋａｊｉｍａｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＣｈｅｍｏｔｈｅｒＰｈａｒｍａｃｏｌ．５２（４）：３１９−３２４（２００３）参照）およびそれらの誘導体、ならびにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ＲＯＣＫ阻害剤としては他の低分子化合物も知られているので、本発明においてはこのような化合物またはそれらの誘導体も使用できる（例えば、米国特許出願公開第２００５０２０９２６１号、同第２００５０１９２３０４号、同第２００４００１４７５５号、同第２００４０００２５０８号、同第２００４０００２５０７号、同第２００３０１２５３４４号、同第２００３００８７９１９号、及び国際公開第２００３／０６２２２７号、同第２００３／０５９９１３号、同第２００３／０６２２２５号、同第２００２／０７６９７６号、同第２００４／０３９７９６号参照）。本発明では、１種または２種以上のＲＯＣＫ阻害剤が使用され得る。
本発明で使用されるＲＯＣＫ阻害剤は、好ましくは、Ｙ−２７６３２（（Ｒ）−（＋）−ｔｒａｎｓ−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド）であり得る。
Ｙ−２７６３２の濃度は、通常１００ｎＭ〜５０μＭ、好ましくは例えば、１００ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭであるがこれらに限定されない。特に好ましくは、１０μＭである。
低分子化合物の置換基は、当分野における技術常識に基づいて当業者により容易に置換され得るものであり、例えば上記した化合物（ＧＳＫ−３β阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤など）の性質を保持し得る限りにおいて任意に変更することができる。
本工程において好ましい培地として、Ｂ２７およびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、ならびにＡｃｔｉｖｉｎおよびＣＨＩＲ９９０２１を含有するＲＰＭＩ培地であり、適宜、ＨＤＡＣ阻害剤又はＲＯＣＫ阻害剤を添加された培地が例示される。
培養温度は、以下に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ_２含有空気の雰囲気下で培養が行われる。ＣＯ_２濃度は、約２〜５％、好ましくは５％である。培養期間は、例えば１２日以下の培養であり、好ましくは６日である。
（Ｂ）ヒト多能性幹細胞を、ＩＧＦファミリー遺伝子産物を含む培地で培養する工程（第２工程）
本工程では、前述の第１工程が接着培養であった場合、本工程では得られた細胞を、培地の交換により継続培養してもよい。あるいは、前述の第１工程が浮遊培養であった場合、得られた細胞集団をそのままコーティング処理された培養皿にて、任意の培地中で培養してもよい。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（ＢＤ）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、マトリゲルである。
本工程の培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓＦ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、およびこれらの混合培地などが包含される。好ましくは、ＤＭＥＭ培地である。培地には、血清が含まれていないことが望ましい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、ＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム含有）、ＫｎｏｃｋｏｕｔＳｅｒｕｍＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有し得る。
本工程においては、増殖因子としてＩＧＦファミリー遺伝子産物（例えば、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２）を含む培地を用いる。本工程の培地はその他の増殖因子を含んでいてよい。その他の増殖因子としては、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ７ａ、ＴＧＦ−β、Ａｃｔｉｖｉｎ、Ｎｏｄａｌ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、およびＧＤＦが挙げられる。本工程においては、ＩＧＦ−１を増殖因子として用いることが望ましい。
培地におけるＩＧＦ−１の濃度は、例えば、１ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲内であるがこれらに限定されず、好ましくは、５０ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲内である。培地におけるＩＧＦ−１の濃度は、例えば、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１２５ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、１７５ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、２２５ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌであり、好ましくは、５０ｎｇ／ｍｌである。
本工程において培地は、低分子化合物として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むことが好ましい。
本工程において好ましい培地として、ＫＳＲ、Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）、２−メルカプトエタノールおよびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、ならびにＤＭＳＯおよびＩＧＦ−１を含有するＤＭＥＭ培地が例示される。
培養温度は、以下に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ_２含有空気の雰囲気下で培養が行われる。ＣＯ_２濃度は、約２〜５％、好ましくは５％である。培養期間は、例えば３日以上の培養であり、好ましくは８〜１２日間の培養である。特に好ましい培養期間は、１０日間である。
本工程は、任意の酸素濃度条件下で行われ得るが、低酸素条件下で行われることが好ましい。
本明細書において「低酸素条件」とは、細胞を培養する際の雰囲気中の酸素濃度が、大気中のそれよりも有意に低いことを意味する。例えば、細胞を培養する際の雰囲気中の酸素濃度が２０％以下の条件が該当する。好ましくは、雰囲気中の酸素濃度は、１５％以下（例、１４％以下、１３％以下、１２％以下、１１％以下など）、１０％以下（例、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下など）、または５％以下（例、４％以下、３％以下、２％以下など）である。また、雰囲気中の酸素濃度は、好ましくは０．１％以上（例、０．２％以上、０．３％以上、０．４％以上など）、０．５％以上（例、０．６％以上、０．７％以上、０．８％以上、０．９％以上など）、または１％以上（例、１．１％以上、１．２％以上、１．３％以上、１．４％以上、１．５％以上、１．６％以上、１．７％以上、１．８％以上、１．９％以上など）である。好ましい雰囲気中の酸素濃度は、１〜５％であり、特に好ましくは、５％である。
細胞の環境において低酸素状態を創出する手法は特に制限されないが、酸素濃度の調節可能なＣＯ_２インキュベーター内で細胞を培養する方法が最も容易であり、好適な例として挙げられる。酸素濃度の調節可能なＣＯ_２インキュベーターは、種々の機器メーカーから販売されている（例えば、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、池本理化学工業、十慈フィールド、和研薬株式会社などのメーカー製の低酸素培養用ＣＯ_２インキュベーターを用いることができる）。
＜エリスロポエチン産生細胞＞
本発明は、上述した分化誘導法によって作製されたエリスロポエチン産生細胞（別名、ＥＰＯ産生細胞）を指標に用いて純化してもよい。エリスロポエチン産生細胞は、例えば、ＥＰＯｍＲＮＡもしくはＥＰＯタンパク質、またはエリスロポエチン産生細胞の任意のマーカーによって染色することで同定し、当業者に周知の方法で純化され得る。
このように得られたエリスロポエチン産生細胞は、エリスロポエチンの産生低下により引き起こされる疾患、例えば、腎性貧血患者へ投与することで、当該疾患の治療薬として用いる事ができる。エリスロポエチン産生細胞は、単体で投与してもよく、好ましくは、生着を促すような足場材と共に投与され得る。ここで足場材とは、コラーゲンなどの生体由来の成分やこれに代替するポリ乳酸などの合成ポリマーが例示されるが、これらに限定されない。投与部位は、血管に隣接する組織であれば、特に限定されないが、腎臓、肝臓、膵臓、小腸、皮下組織等への投与が例示される。特に好ましくは、皮下組織である。また、投与する細胞数は、投与対象において適正な赤血球量またはエリスロポエチン濃度（３〜３０ｍｌＵ／ｍＬ）が得られるような細胞数であり、対象内の赤血球量またはエリスロポエチン濃度を観察しながら投与細胞数を適宜決定する事によって行われ得る。
＜多能性幹細胞からのエリスロポエチン産生細胞の分化誘導用キット＞
本発明は、多能性幹細胞からエリスロポエチン産生細胞を分化誘導するためのキットを提供する。本キットには、上述した分化誘導に用いる増殖因子、化合物、培養液、解離溶液（ヒト多能性幹細胞を単一分散させる試薬を含む）、および培養皿のコーティング剤を含んでもよい。本キットには、さらに分化誘導の手順を記載した書面や説明書を含んでもよい。
本発明を以下の実施例でさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はそれら実施例に限定されないものとする。

エリスロポエチン産生細胞への分化誘導
ヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ６、２０１Ｂ７および２５３Ｇ４）は、京都大学の山中教授より受領し、従来の方法で培養した（ＴａｋａｈａｓｈｉＫ，ｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ．１３１：８６１−７２）。ＳＮＬ細胞（ＭｃＭａｈｏｎ，Ａ．Ｐ．ａｎｄＢｒａｄｌｅｙ，Ａ．（１９９０）Ｃｅｌｌ６２；１０７３−１０８５）をフィーダー細胞として用いて、６ｃｍディッシュ上で８０−９０％コンフルエントになるまでｉＰＳ細胞を培養した。該細胞をＣＴＫ溶液の添加により解離させ、フィーダー細胞を除去し、１ｍＬのＡｃｃｕｔａｓｅ（ＴＭ）を加えてｉＰＳ細胞を単一細胞へ分散させた。
次いで、１０μＭＹ−２７６３２、２％Ｂ２７およびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含有するＲＰＭＩ培地にｉＰＳ細胞を懸濁し、マトリゲルでコートした２４ウェルプレートに細胞数２５０，０００／ウェルとなるように播種した。１００ｎｇ／ｍＬＡｃｔｉｖｉｎおよび１μＭＣＨＩＲ９９０２１を加えて、培地量が０．５ｍＬ／ウェルとなるように調整し、６日間培養した（Ｓｔａｇｅ１）。この時、２日目に、０．５ｍＭＮａＢを培地中に添加し（培地交換なし）、３日目に、１００ｎｇ／ｍＬＡｃｔｉｖｉｎ、１μＭＣＨＩＲ９９０２１および０．５ｍＭＮａＢを含む培地へ交換し、５日目に、１００ｎｇ／ｍＬＡｃｔｉｖｉｎ、１μＭＣＨＩＲ９９０２１を含む培地へ交換した。
６日間の培養後、培地を、１％ＤＭＳＯ、５０ｎｇ／ｍＬＩＧＦ−１、２０％ＫＳＲ、２ｍＭＬ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）、１００μＭ・−ＭＥ（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）、５０ｍＵ／ＬＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎおよび５０μｇ／ＬＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含有するＤＭＥＭに培地を置換し、所定の日数ｉＰＳ細胞を培養した（Ｓｔａｇｅ２）。この間、隔日で培地交換を行った。

エリスロポエチン産生細胞の評価と培養条件検討
Ｓｔａｇｅ２において１８日間の培養後、当該細胞を解析した結果、エリスロポエチン（ＥＰＯ）のｍＲＮＡおよびタンパク質での発現が確認された（図１および２）。また、Ｓｔａｇｅ２の培養日数とＥＰＯのｍＲＮＡの転写量を比較したところ、６日目よりその転写量が多くなることが確認された（図３）。さらに、Ｓｔａｇｅ２において、ＩＧＦ−１とＩＧＦ−２のＥＰＯ産生亢進能を比較したところ、ＩＧＦ−１は、ＩＧＦ−２と比較して、より強力にＥＰＯ産生を亢進させることが確認された（図４）。
続いて、発現したＥＰＯタンパク質が、細胞外へ分泌されるかについてＥＬＩＳＡ法を用いて検討したところ、細胞外において確認された。また、Ｓｔａｇｅ２においてＩＧＦ−１の添加濃度とＥＰＯの細胞外分泌濃度について比較したところ、１ｎｇ／ｍＬ以上の添加量でＥＰＯの細胞外分泌量を増加できることが確認された（図５）。さらに、ＩＧＦ−１の添加量と培養日数について検討したところ、５０ｎｇ／ｍＬで１０日間培養したときのＥＰＯ分泌量が最も高かった（図６）。この時、２４ｗｅｌｌプレートを用いて得られる量のＥＰＯ産生細胞が、０．５ｍＬ／ｗｅｌｌの培地へ、ヒト血清中の正常範囲より高い濃度のＥＰＯを分泌できる能力を有していることが確認された。

低酸素条件下でのエリスロポエチン産生細胞への分化誘導
実施例１と同様の方法で、エリスロポエチン産生細胞への分化誘導工程をＳｔａｇｅ１まで行い、培地を、１％ＤＭＳＯ、５０ｎｇ／ｍＬＩＧＦ−１、２０％ＫＳＲ、２ｍＭＬ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）、１００μＭ β−ＭＥ（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）、５０ｍＵ／ＬＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎおよび５０μｇ／ＬＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含有するＤＭＥＭに置換した。次いで、本培地中で、１４日間ｉＰＳ細胞を培養した（Ｓｔａｇｅ２）。この間、隔日で培地交換を行った。Ｓｔａｇｅ２の第１日目より低酸素培養を施行した。低酸素培養は、マルチガスインキュベーターを用いて行った（Ｏ_２濃度５％、ＣＯ_２濃度５％）。低酸素培養後２日目、４日目、６日目、８日目、１０日目、１２日目および１４日目に培地と細胞懸濁液を回収し、ＥＬＩＳＡでＥＰＯタンパク質量を、ＰＣＲでＥＰＯｍＲＮＡ発現量を確認した。その結果、低酸素条件下での培養により、ＥＰＯ産生細胞によるＥＰＯ産生量が増加した（図７）。

ＥＰＯ産生細胞より産生されたエリスロポエチンのｉｎｖｉｔｒｏ機能評価
得られたＥＰＯの造血幹細胞から赤芽球への分化誘導能について検討するため、ＣＤ３４陽性細胞を用いて評価した。詳細には、免疫磁気ビーズ法（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ；Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）により、臍帯血または動員末梢血から０．５−１×１０^５のＣＤ３４陽性細胞を単離した。単離したＣＤ３４陽性細胞は、９５％以上の純度であることをフローサイトメーターにより確認した。得られた１０^５個のＣＤ３４陽性細胞は、５０ｎｇ／ｍＬＳＣＦ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌｆａｃｔｏｒ）および、０、０．０５ｕｎｉｔまたは０．５ｕｎｉｔの市販リコンビナントＥＰＯもしくは０．０５ｕｎｉｔまたは０．５ｕｎｉｔの限外濾過膜（アミコンウルトラ：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮したＥＰＯ産生細胞の培養上清を添加したＭｅｔｈｏＣｕｌｔＧＦ＋ｓｅｍｉｓｏｌｉｄｍｅｄｉｕｍ（＃４４３５；ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中へ懸濁させ、１ｘ１０^４個分の細胞を３５ｍｍディッシュへ播種した。１４日間の培養後、コロニーの形態および色を倒立顕微鏡を用いて観察し、赤芽球系（ＢＦＵ−Ｅ）への分化について評価した。その結果、ＥＰＯ産生細胞の培養上清は、市販のＥＰＯと同等に、ヒト臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞を赤芽球系へ分化誘導することが確認された（図８）。

ＥＰＯ産生細胞より産生されたエリスロポエチンのｉｎｖｉｖｏ機能評価
６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＣＬＥＡＪａｐａｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｅａ−ｊａｐａｎ．ｃｏｍ）へアデニン（０．５％ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ中、５０ｍｇ／ｋｇ）を４週間経口投与することにより、腎性貧血を誘導させ、アデニン誘導腎性貧血モデルとして用いた。腎性貧血の確認は、マウス尾静脈から採血し、ヘマトクリット（Ｈｃｔ）を測定することで行った。限外濾過膜（アミコンウルトラ：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮したＥＰＯ産生細胞の培養上清または市販リコンビナントＥＰＯ製剤（コントロール）を、各々、０ｕｎｉｔ／日、０．１ｕｎｉｔｓ／日または５ｕｎｉｔｓ／日で、腎性貧血モデルマウスに皮下投与した。投与は、１週間に３回を４週間行った。投与後４週間ですべてのマウスを屠殺し、貧血の改善効果をヘマトクリットで評価した。その結果、ＥＰＯ産生細胞の培養上清は、市販のＥＰＯよりも高効率にマウスの腎性貧血を改善することが確認された（図９）。尚、実験は全て動物実験等の実施に関する指針に則して行われた。

本発明により、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などのヒト多能性幹細胞から、エリスロポエチン産生細胞を作製することが可能となる。エリスロポエチン産生細胞は、腎性貧血などの治療を目的とした再生医療の分野で使用することができるために大変有用である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参照により本明細書にとり入れるものとする。

Claims

以下の工程を含む、ヒト多能性幹細胞からのエリスロポエチン産生細胞の製造方法：
（ｉ）ヒト多能性幹細胞を、ＡｃｔｉｖｉｎとＧＳＫ−３β阻害剤とを含む培地で培養する工程；および
（ｉｉ）工程（ｉ）の後、ヒト多能性幹細胞を、ＩＧＦファミリー遺伝子産物を含む培地で培養する工程。
前記ＧＳＫ−３β阻害剤が６−［２−［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）ピリミジン−２−イルアミノ］エチルアミノ］ピリジン−３−カルボニトリル（ＣＨＩＲ９９０２１）である、請求項１に記載の方法。
前記ＩＧＦファミリー遺伝子産物がＩＧＦ−１である、請求項１または２に記載の方法。
前記ヒト多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞またはヒトＥＳ細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
前記工程（ｉ）において、培地がＨＤＡＣ阻害剤をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
前記ＨＤＡＣ阻害剤がＮａＢである、請求項５に記載の方法。
前記工程（ｉｉ）において、培地がジメチルスルホキシドをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
前記工程（ｉ）において、前記ヒト多能性幹細胞を単一細胞へ分散させることを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
前記工程（ｉｉ）が８〜１２日間の培養期間である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
前記工程（ｉ）が６日間の培養期間であり、および、前記工程（ｉｉ）が１０日間の培養期間である、請求項９に記載の方法。
前記工程（ｉｉ）が低酸素条件下で行われる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
前記低酸素条件下における酸素濃度が５％である、請求項１１に記載の方法。
ヒト多能性幹細胞からエリスロポエチン産生細胞を製造するためのキットであって、Ａｃｔｉｖｉｎ、ＧＳＫ−３β阻害剤およびＩＧＦファミリー遺伝子産物を含む、前記キット。
前記ＧＳＫ−３β阻害剤が６−［２−［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）ピリミジン−２−イルアミノ］エチルアミノ］ピリジン−３−カルボニトリル（ＣＨＩＲ９９０２１）である、請求項１３に記載のキット。
前記ＩＧＦファミリー遺伝子産物がＩＧＦ−１である、請求項１３または１４に記載のキット。
ＨＤＡＣ阻害剤をさらに含む、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のキット。
前記ＨＤＡＣ阻害剤がＮａＢである、請求項１６に記載のキット。
ジメチルスルホキシドをさらに含む、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載のキット。
ヒト多能性幹細胞を単一分散させる試薬をさらに含む、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載のキット。
ＲＯＣＫ阻害剤をさらに含む、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載のキット。
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、（Ｒ）−（＋）−ｔｒａｎｓ−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド（Ｙ−２７６３２）である、請求項２０に記載のキット。