JP6316822B2 - 膵外分泌細胞の誘導方法 - Google Patents

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Description

本発明は、PDX1陽性の膵前駆細胞から膵外分泌細胞を分化誘導する方法に関する。本発明はまた、PDX1陽性の膵前駆細胞が多能性幹細胞から誘導されていてもよいことから、多能性幹細胞から膵外分泌細胞を分化誘導する方法に関する。さらに、前記細胞を膵外分泌細胞へと分化誘導するキットに関する。
膵臓は、消化酵素を含む膵液を分泌し消化管に送り込む外分泌機能とインスリンやグルカゴンなどのホルモンを血液中に分泌する内分泌機能とを有する臓器である。内分泌はランゲルハンス島と呼ばれる膵臓内に散在する細胞の塊に依拠しており、膵臓の95％以上は外分泌機能を担う。膵外分泌細胞より分泌された膵液は、膵管を通り、十二指腸乳頭部から十二指腸へと送り出される。
外分泌腺細胞に長期間持続的に炎症が起こることで徐々にその細胞が壊され、壊れた細胞が線維組織に置き換わるといった慢性膵炎が引き起こされる。慢性膵炎は、アルコールの多飲、胆石等による膵管の閉塞により引き起こされるものもあるが、原因不明のものもある。慢性膵炎に対しては、消化酵素薬の投与など保存治療が行われているが、根本的な治療法は確立されていない。
近年、胚性幹細胞（ES細胞）や体細胞へ未分化細胞特異的遺伝子を導入することで得られる人工多能性幹細胞（iPS細胞）など多能性を有する細胞が報告されており、これらの細胞より得られた組織体細胞を用いて病気の原因の解明と治療薬の開発が望まれている。
内分泌細胞と外分泌細胞への分化能を持つ膵前駆細胞は、PDX1を発現していることから、このPDX1を遺伝子マーカーとして利用することで、多能性幹細胞からの誘導方法が開発されてきた（Chen S, et al., Nat Chem Biol. 2009, 5, 258-265）。このように得られた膵前駆細胞からのインスリン産生細胞への誘導方法については多くの研究がなされているが、膵外分泌細胞へ特化した分化誘導方法の知見は少ない。
Chen S, et al., Nat Chem Biol. 2009, 5, 258-265
本発明は、PDX1陽性の膵前駆細胞から膵外分泌細胞を分化誘導する新規な方法を提供することを目的とする。本発明はまた、多能性幹細胞からPDX1陽性の膵前駆細胞を分化誘導する方法と合わせることで、多能性幹細胞から膵外分泌細胞を効率的に分化誘導する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤および/またはNotchシグナル受容体のリガンドタンパク質、ならびにプロテインキナーゼC活性化剤を組み合わせて含む培地でPDX1陽性の膵前駆細胞の培養を行うことにより、膵外分泌細胞を高効率で分化誘導できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下を包含する。
[１] PDX1陽性の膵前駆細胞から膵外分泌細胞を製造する方法であって、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤および/またはNotchシグナル受容体のリガンドタンパク質、ならびにプロテインキナーゼC活性化剤を添加した培養液中で、PDX1陽性の膵前駆細胞を培養する工程を含む、前記方法。
[２] ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、（式１）
（式中、lが１〜６であり、mが１または２であり、nが４〜６であり、R1が炭素数１〜６のアルキル基であり、R2が炭素数１〜６のアルキル基であり、Xが次の（式２）〜（式９）から成る群から選択される置換基である）
の構造を有する化合物である、[１]に記載の方法。
[３] ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、以下の（式１０）の構造を有する化合物である、[１]または[２]に記載の方法。
[４] Notchシグナル受容体のリガンドタンパク質が、DLL4および/またはJAG1である、[１]〜[３]のいずれかに記載の方法。
[５] 前記プロテインキナーゼC活性化剤が、インドラクタムVである、[１]〜[４]のいずれかに記載の方法。
[６] 前記培養工程を少なくとも2日実施する、[１]〜[５]のいずれかに記載の方法。
[７] 前記PDX1陽性の膵前駆細胞が、次の（i）〜（iv）の工程により多能性幹細胞から誘導されたPDX1陽性の膵前駆細胞である、[１]〜[６]のいずれかに記載の方法；
（i）多能性幹細胞をGSK-3β阻害剤およびアクチビンAを添加した培養液中で培養する工程、
（ii）(i)で得られた細胞をFGF10およびSMO阻害剤を添加した培養液中で培養する工程、
（iii）(ii)で得られた細胞をレチノイン酸、FGF10およびSMO阻害剤を添加した培養液中で培養する工程、ならびに
（iv）(iii)で得られた細胞をプロテインキナーゼC活性化剤およびFGF10を添加した培養液中で培養する工程。
[８] 前記GSK-3β阻害剤がCHIR99021である、[７]に記載の方法。
[９] 前記SMO阻害剤が、KAAD-シクロパミンである、[７]または[８]に記載の方法。
[１０] 前記プロテインキナーゼC活性化剤が、インドラクタムVである、[７]〜[９]のいずれかに記載の方法。
[１１] 前記工程（i）において、多能性幹細胞を単一細胞へ分散させることを含む、[７]〜[１０]のいずれかに記載の方法。
[１２] 前記培養工程（i）を少なくとも4日実施する、[７]〜[１１]のいずれかに記載の方法。
[１３] 前記培養工程（ii）を少なくとも1日実施する、[７]〜[１２]のいずれかに記載の方法。
[１４] 前記培養工程（iii）を少なくとも2日実施する、[７]〜[１３]のいずれかに記載の方法。
[１５] 前記培養工程（iv）を少なくとも2日実施する、[７]〜[１４]のいずれかに記載の方法。
[１６] 前記PDX1陽性の膵前駆細胞が、PDX1陽性のヒト膵前駆細胞である、[１]〜[１５]のいずれかに記載の方法。
[１７] [１]〜[１６]のいずれかに記載の方法で製造された膵前駆細胞。
[１８] PDX1陽性の膵前駆細胞から膵外分泌細胞を製造するためのキットであって、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤および/またはNotchシグナル受容体のリガンドタンパク質、ならびにプロテインキナーゼC活性化剤を含む、前記キット。
[１９] ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、（式１１）
（式中、lが１〜６であり、mが１または２であり、nが４〜６であり、R1が炭素数１〜６のアルキル基であり、R2が炭素数１〜６のアルキル基であり、Xが次の（式１２）〜（式１９）から成る置換基のいずれか一つである）
の構造を有する化合物である、[１８]に記載のキット。
[２０] ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、以下の（式２０）の構造を有する化合物である、[１８]または[１９]に記載のキット。
[２１] Notchシグナル受容体のリガンドタンパク質が、DLL4および/またはJAG1である、[１８]〜[２０]のいずれかに記載のキット。
[２２] 前記プロテインキナーゼC活性化剤が、インドラクタムVである、[１８]〜[２１]のいずれかに記載のキット。
[２３] 多能性幹細胞から膵外分泌細胞を製造するためのキットであって、[１８]〜[２２]のいずれかに記載のキットに加え、さらに、GSK-3β阻害剤、アクチビンA 、FGF10、およびSMO阻害剤を含む、前記キット。
[２４] 前記GSK-3β阻害剤がCHIR99021である、[２３]に記載のキット。
[２５] 前記SMO阻害剤が、KAAD-シクロパミンである、[２３]または[２４]に記載のキット。
本発明に示す方法により、膵前駆細胞から膵外分泌細胞を製造することが可能となる。また、得られた膵外分泌細胞を用いて慢性膵炎などの疾患の治療薬の開発が可能となる。
図1は、多能性幹細胞から膵外分泌細胞を製造するスキームを示す。図中、KAAD-CYCは、KAAD-シクロパミン、RAはレチノイン酸、ILVはインドラクタムV、CHAP108はヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の一つを示す。 図2は、各ステージ（St）後の細胞におけるRT-PCRの結果を示す。ステージ3についは4日後および8日後のデータを示す。 図3は、ヒトES細胞から分化誘導された膵外分泌細胞の免疫染色像を示す。図中青色はDAPIによる核の染色像を示し、緑色は抗アミラーゼ抗体による染色像を示す。DMSOは陰性対照であり、図上部には、CHAP108、hDLL4およびhJAG1を加えてからの日数を示す。 図4は、ヒトES細胞から分化誘導された膵外分泌細胞の免疫染色像を示す。図中青色はDAPIによる核の染色像を示し、緑色は抗アミラーゼ抗体による染色像を示す。DMSOは陰性対照であり、図上部には、CHAP108(ILVなし)、ILV(CHAP108なし)、あるいはCHAP108およびILVを加えてからの日数を示す。
本発明を以下に詳細に説明する。
本発明は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤および/またはNotchシグナル受容体のリガンドタンパク質、ならびにプロテインキナーゼC活性化剤を添加した培養液中で、PDX1陽性の膵前駆細胞を培養する工程を含む、膵前駆細胞から膵外分泌細胞を製造する方法を提供する。
本発明において、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤とはヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）の活性を阻害する物質として定義され、例えば、ヒドロキサム酸誘導体、環状テトラペプチド、短鎖脂肪酸（SCFA）誘導体、ベンズアミド誘導体、求電子ケトン誘導体およびその他のHDAC阻害剤を含むがこれらに限定されない。
ヒドロキサム酸誘導体としては、例えば、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（SAHA）（Richon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 3003-3007 (1998)）；m-カルボキシケイ皮酸ビスヒドロキサミド（CBHA）（Richon et al., supra）；ピロキサミド；トリコスタチンA（TSA）およびトリコスタチンCなどのトリコスタチン類縁体（Koghe et al., Biochem. Pharmacol. 56: 1359-1364(1998)）；サリチルヒドロキサム酸（Andrews et al., International J. Parasitology 30,761-768 (2000)）；スベロイルビスヒドロキサム酸（SBHA）（米国特許第5,608,108号）；アゼライン酸ビスヒドロキサム酸（ABHA）（Andrews et al., supra）；アゼライン酸-1-ヒドロキサメート-9-アニリド（AAHA）（Qiu et al., Mol. Biol. Cell 11, 2069-2083 (2000)）；6-(3-クロロフェニルウレイド)carpoicヒドロキサム酸（3Cl-UCHA）；オキサムフラチン［(2E)-5-[3-[(フェニルスルホニル)アミノフェニル]-ペンタ-2-エン-4-イノヒドロキサム酸］（Kim et al., Oncogene, 18: 2461-2470 (1999)）；A-161906、スクリプタイド（Su et al., Cancer Research, 60: 3137-3142(2000)）；PXD-101（Prolifix）；LAQ-824；CHAP；MW2796（Andrews et al., supra）；MW2996（Andrews et al., supra）；または米国特許第5,369,108号、第5,932,616号、第5,700,811号、第6,087,367号および第6,511,990号に開示されているヒドロキサム酸のいずれかなどが挙げられるがこれらに限定されない。
環状テトラペプチドとしては、例えば、（式１）の構造式を有する環状テトラペプチド（WO2004/113366およびNishino N et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 14, 2427-2431, (2004)）、トラポキシンA（TPX）-環状テトラペプチド（シクロ-(L-フェニルアラニル-L-フェニルアラニル-D-ピペコリニル-L-2-アミノ-8-オキソ-9,10-エポキシデカノイル)）（Kijima et al., J Biol. Chem. 268,22429-22435 (1993)）；FR901228（FK 228、デプシペプチド）（Nakajima et al., Ex. Cell Res. 241,126-133 (1998)）；FR225497環状テトラペプチド（H. Mori et al., WO 00/08048 (17 February 2000)）；アピシジン環状テトラペプチド［シクロ(N-O-メチル-L-トリプトファニル-L-イソロイシニル-D-ピペコリニル-L-2-アミノ-8-オキソデカノイル)］（Darkin-Rattray et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93,13143-13147 (1996)）；アピシジンIa、アピシジンIb、アピシジンIc、アピシジンIIa、およびアピシジンIIb（P. Dulski et al., WO 97/11366）；CHAP、HC-トキシン環状テトラペプチド（Bosch et al., Plant Cell 7, 1941-1950 (1995)）；WF27082環状テトラペプチド（WO 98/48825）；ならびにクラミドシン（Bosch et al., supra）などが挙げられるがこれらに限定されない。
好ましい、環状テトラペプチドとして、式１中、lが１〜６であり、mが１または２であり、nが４〜６であり、R1が炭素数１〜６のアルキル基であり、R2が炭素数１〜６のアルキル基であり、Xが次の（式２）〜（式９）から成る群から選択される置換基である化合物が例示される。ここで、炭素数１〜６のアルキル基とは直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基を意味し、例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、シクロブチル基、n-ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、tert-ペンチル基、シクロペンチル基、n-ヘキシル基、2,2-ジメチルブチル基、3,3-ジメチルブチル基、2-エチルブチル基、およびシクロヘキシル基が挙げられる。
より好ましい環状テトラペプチドとして、CHAP108と称される（式１０）に記載された構造を有する化合物が例示される。
短鎖脂肪酸（SCFA）誘導体としては、例えば、酪酸ナトリウム（NaB）（Cousens et al., J. Biol. Chem. 254,1716-1723 (1979)）；イソ吉草酸塩（McBain et al., Biochem. Pharm. 53: 1357-1368 (1997)）；吉草酸塩（McBain et al., supra）；4-フェニル酪酸塩（4-PBA）（Lea and Tulsyan, Anticancer Research, 15,879-873 (1995)）；フェニル酪酸塩（PB）（Wang et al., Cancer Research, 59, 2766-2799 (1999)）；プロピオン酸塩（McBain et al., supra）；ブチルアミド（Lea and Tulsyan, supra）；イソブチルアミド（Lea and Tulsyan, supra）；フェニル酢酸塩（Lea and Tulsyan, supra）；3-ブロモプロピオン酸塩（Lea and Tulsyan, supra）；トリブチリン（Guan et al., Cancer Research, 60,749-755 (2000)）；バルプロ酸、バルプロ酸塩およびPivanex（商標）などが挙げられるがこれらに限定されない。
ベンズアミド誘導体としては、例えば、CI-994；MS-275［N-(2-アミノフェニル)-4-[N-(ピリジン-3-イルメトキシカルボニル)アミノメチル]ベンズアミド]（Saito et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 4592-4597 (1999)）；およびMS-275の3'-アミノ誘導体（Saito et al., supra）などが挙げられるがこれらに限定されない。
求電子ケトン誘導体としては、例えば、トリフルオロメチルケトン（Frey et al, Bioorganic & Med. Chem. Lett., 12, 3443-3447(2002); U.S. 6,511,990）およびN-メチル-α-ケトアミドなどのα-ケトアミドなどが挙げられるがこれらに限定されない。
その他のHDAC阻害剤としては、例えば、天然物、サマプリン、およびデプデシン（Kwon et al.. PNAS 95: 3356-3361(1998））などが挙げられるがこれらに限定されない。
また本発明において、Notchシグナル受容体とは、１回膜貫通型タンパク質であり、細胞外ドメイン（NECD）、膜貫通ドメイン（TM）および細胞内ドメイン（NICD）からなるNotch受容体がプロセッシングによりTM-NICDへと切断された後の、NECDとTM-NICDからなるヘテロ二量体を意味する。このNotchシグナル受容体のリガンドとしては、Delta-likeファミリー(DLL1、DLL3、DLL4)およびJaggedファミリー(JAG1、JAG2)のメンバーが例示される。Notchシグナル受容体のリガンドは、組み換え体であってもよく、例えばAdipogen社から市販されており容易に利用することができる。本発明において使用されるNotchシグナル受容体のリガンドは、好ましくは、DLL4またはJAG1である。
また本発明において、プロテインキナーゼC活性化剤は、プロテインキナーゼC（PKC）を活性させる物質として定義され、ジテルペン（例えば、ホルボールエステル）、インドールアルカロイド（例えば、テレオシジン、リングビアトキシン、およびインドラクタムV）、ポリアセテート（例えば、アプリシアトキシンおよびオシラトキシン）、ジアミノベンジルアルコールのある種の誘導体、(2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(Trifluoromethyl)phenyl)- 2,4-pentadiemoylamino) benzolactam（TPB）およびブリオスタチンを含むがこれらに限定されない。本発明で使用されるPKC活性化剤は、好ましくは、インドラクタムVである。
また本発明において、膵前駆細胞とは、内分泌細胞、外分泌細胞および導管細胞の3種の細胞に分化しうる細胞を意味し、PDX1およびSOX17が発現している細胞である。本発明におけるPDX1は、ヒトにおいてはNCBIのAccession番号NM_000209において示される核酸配列を有する。同様に、SOX17は、NM_022454において示される核酸配列を有する。
また本発明において、膵外分泌細胞とは、特に限定されないが、トリプシン、キモトリプシノーゲン、アミラーゼおよびリパーゼなどの消化酵素を分泌する細胞であり、好ましくはその細胞内においてアミラーゼのmRNAを発現する細胞である。アミラーゼのmRNAは、ヒトにおいては、AMY2AまたはAMY2Bであり、それぞれNCBIのAccession番号NM_000699またはNM_020978において示される核酸配列を有する。
本発明において、膵前駆細胞から膵外分泌細胞への分化誘導に用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばIMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、およびこれらの混合培地などが包含される。好ましくは、RPMI 1640培地である。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'-チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得る。好ましい培地は、B27サプリメントとL-グルタミンを含有するDMEMである。
また、培養に際して、コーティング処理された培養皿を用いて培養してもよい。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（BD）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、マトリゲルである。
培養期間は、特に限定されないが、少なくとも2日以上であり、長期の培養により特段の問題が起きないため、2日以上の培養日数については適宜選択することができる。例えば、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日またはそれ以上の日数が挙げられる。
上記に示した添加する物質の濃度については、当業者がその効力により適宜選択して用いてもよいが、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤として、CHAP108（式１０）を選択した場合、通常、100nM〜10μM、例えば、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μMまたは10μMが例示される。同様に、Notchシグナル受容体のリガンドタンパク質は、細胞内においてHES1の発現を誘導させる濃度で培養液に添加すればよく、DLL4またはJAG1を選択した場合、いずれも通常、1μg/ml〜100μg/ml、例えば、1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/mlまたは100μg/mlが例示される。同様に、プロテインキナーゼC活性化剤として、インドラクタムVを選択した場合、通常、100nM〜1μM、例えば、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nMおよび1μMが例示される。
本発明において、膵前駆細胞は、生体内から単離された膵前駆細胞でもよく、in vitroで他の細胞種より誘導された細胞でもよいが、好ましくは多能性幹細胞から誘導される細胞である。
＜多能性幹細胞＞
本発明で使用可能な多能性幹細胞は、生体に存在する全ての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、それには、例えば胚性幹(ES)細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹(ntES)細胞、精子幹（GS）細胞、胚性生殖（EG）細胞、人工多能性幹(iPS)細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）などが含まれる。本発明では、胚の破壊を行わずに得られるという意味では、iPS細胞またはMuse細胞を用いることが好ましい。
(A) 胚性幹細胞
ES細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。
ES細胞は、受精卵の8細胞期、桑実胚後の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚由来の幹細胞であり、成体を構成するあらゆる細胞に分化する能力、いわゆる分化多能性と、自己複製による増殖能とを有している。ES細胞は、マウスで1981年に発見され(M.J. Evans and M.H. Kaufman (1981), Nature 292:154-156)、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもES細胞株が樹立された (J.A. Thomson et al. (1999), Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848;J.A. Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165)。
ES細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor (LIF))、塩基性線維芽細胞成長因子(basic fibroblast growth factor (bFGF))などの物質を添加した培養液を用いて行うことができる。ヒトおよびサルのES細胞の樹立と維持の方法については、例えばUSP5,843,780; Thomson JA, et al. (1995), Proc Natl. Acad. Sci. U S A. 92:7844-7848； Thomson JA, et al. (1998), Science. 282:1145-1147； H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932； M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9554-9559； H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222:273-279;H. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1580-1585；Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444:481-485などに記載されている。
ES細胞作製のための培養液として、例えば0.1mM 2-メルカプトエタノール、0.1mM 非必須アミノ酸、2mM L-グルタミン酸、20% KSRおよび4ng/ml bFGFを補充したDMEM/F-12培養液を使用し、37℃、5% CO2/95% 空気の湿潤雰囲気下でヒトES細胞を維持することができる(O. Fumitaka et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26:215-224)。また、ES細胞は、3〜4日おきに継代する必要があり、このとき、継代は、例えば1mM CaCl2および20% KSRを含有するPBS中の0.25% トリプシンおよび0.1mg/mlコラゲナーゼIVを用いて行うことができる。
ES細胞の選択は、一般に、アルカリホスファターゼ、Oct-3/4、Nanogなどの遺伝子マーカーの発現を指標にしてReal-Time PCR法で行うことができる。特に、ヒトES細胞の選択では、OCT-3/4、NANOG、ECADなどの遺伝子マーカーの発現を指標とすることができる(E. Kroon et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26:443-452)。
ヒトES細胞株は、例えばWA01(H1)およびWA09(H9)は、WiCell Reserch Instituteから、KhES-1、KhES-2およびKhES-3は、京都大学再生医科学研究所(京都、日本)から入手可能である。
(B) 精子幹細胞
精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ES細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)。神経膠細胞系由来神経栄養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF))を含む培養液で自己複製可能であるし、またES細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる(竹林正則ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊),41〜46頁,羊土社(東京、日本))。
(C) 胚性生殖細胞
胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、LIF、bFGF、幹細胞因子(stem cell factor)などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)。
(D) 人工多能性幹細胞
人工多能性幹(iPS)細胞は、特定の初期化因子を、DNAまたはタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；WO 2007/069666）。初期化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNAまたはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-coding RNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3またはGlis1等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO2010/111409、WO2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotechnol., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。
上記初期化因子には、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸 (VPA)、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool(R)(Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、MEK阻害剤（例えば、PD184352、PD98059、U0126、SL327およびPD0325901）、Glycogen synthase kinase-3阻害剤（例えば、BioおよびCHIR99021）、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、5-azacytidine）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、BIX-01294 等の低分子阻害剤、Suv39hl、Suv39h2、SetDBlおよびG9aに対するsiRNAおよびshRNA等の核酸性発現阻害剤など）、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644)、酪酸、TGFβ阻害剤またはALK5阻害剤（例えば、LY364947、SB431542、616453およびA-83-01）、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA）、ARID3A阻害剤（例えば、ARID3Aに対するsiRNAおよびshRNA）、miR-291-3p、miR-294、miR-295およびmir-302などのmiRNA、Wnt Signaling（例えばsoluble Wnt3a）、神経ペプチドY、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンE2およびプロスタグランジンJ2）、hTERT、SV40LT、UTF1、IRX6、GLISl、PITX2、DMRTBl等の樹立効率を高めることを目的として用いられる因子も含まれており、本明細書においては、これらの樹立効率の改善目的にて用いられた因子についても初期化因子と別段の区別をしないものとする。
初期化因子は、タンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、HIV由来のTATおよびポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。
一方、DNAの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007）、アデノウイルスベクター(Science, 322, 945-949, 2008)、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（WO 2010/008054）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC、PAC)などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる(Science, 322:949-953, 2008)。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子(例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質(GFP)、βグルクロニダーゼ(GUS)、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、初期化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にLoxP配列を有してもよい。
また、RNAの形態の場合、初期化因子を例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良く、分解を抑制するため、5-メチルシチジンおよびpseudouridine (TriLink Biotechnologies)を取り込ませたRNAを用いても良い（Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7:618-630）。
iPS細胞誘導のための培養液としては、例えば、10〜15％FBSを含有するDMEM、DMEM/F12またはDME培養液（これらの培養液にはさらに、LIF、penicillin/streptomycin、puromycin、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）または市販の培養液[例えば、マウスES細胞培養用培養液(TX-WES培養液、トロンボＸ社)、霊長類ES細胞培養用培養液（霊長類ES/iPS細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（mTeSR、Stemcell Technology社）]などが含まれる。
培養法の例としては、例えば、37℃、5％CO2存在下にて、10％FBS含有DMEMまたはDMEM/F12培養液上で体細胞と初期化因子とを接触させ約4〜7日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞(例えば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上にまきなおし、体細胞と初期化因子の接触から約10日後からbFGF含有霊長類ES細胞培養用培養液で培養し、該接触から約30〜約45日またはそれ以上ののちにiPS様コロニーを生じさせることができる。
あるいは、37℃、5% CO2存在下にて、フィーダー細胞(例えば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上で10％FBS含有DMEM培養液（これにはさらに、LIF、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約25〜約30日またはそれ以上ののちにES様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4:e8067またはWO2010/137746）、もしくは細胞外基質（例えば、Laminin-5（WO2009/123349）およびマトリゲル（BD社））を用いる方法が例示される。
この他にも、血清を含有しない培地を用いて培養する方法も例示される（Sun N, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:15720-15725）。さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件（0.1％以上、15％以下の酸素濃度）によりiPS細胞を樹立しても良い（Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:237-241またはWO2010/013845）。
上記培養の間には、培養開始2日目以降から毎日1回新鮮な培養液と培養液交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ100cm2あたり約5×103〜約5×106細胞の範囲である。
iPS細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。一方、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Oct3/4、Nanog）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入した場合は、対応する薬剤を含む培養液（選択培養液）で培養を行うことにより樹立したiPS細胞を選択することができる。また、マーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、iPS細胞を選択することができる。
本明細書中で使用する「体細胞」なる用語は、精子、精母細胞、卵子、卵母細胞、ES細胞などの生殖系列細胞または分化全能性細胞を除くあらゆる動物細胞（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞）をいう。体細胞には、非限定的に、胎児(仔)の体細胞、新生児(仔)の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（1）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、（3）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
また、iPS細胞を移植用細胞の材料として用いる場合、拒絶反応が起こらないという観点から、移植先の個体のHLA遺伝子型が同一もしくは実質的に同一である体細胞を用いることが望ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にHLA遺伝子型が一致していることであり、例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-DRの3遺伝子座あるいはHLA-Cを加えた4遺伝子座が一致するHLA型を有する体細胞である。
(E) 核移植により得られたクローン胚由来のES細胞
nt ES細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のES細胞であり、受精卵由来のES細胞とほぼ同じ特性を有している （T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450:497-502）。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞がnt ES(nuclear transfer ES)細胞である。nt ES細胞の作製のためには、核移植技術（J.B. Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16:642-646）とES細胞作製技術(上記)との組み合わせが利用される(若山清香ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊), 47〜52頁)。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。
(F) Multilineage-differentiating Stress Enduring cells（Muse細胞）
Muse細胞は、WO2011/007900に記載された方法にて製造された多能性幹細胞であり、詳細には、線維芽細胞または骨髄間質細胞を長時間トリプシン処理、好ましくは8時間または16時間トリプシン処理した後、浮遊培養することで得られる多能性を有した細胞であり、SSEA-3およびCD105が陽性である。
＜多能性幹細胞からの膵前駆細胞の分化誘導法＞
本発明において、多能性幹細胞から膵前駆細胞への分化誘導は、当業者に周知の方法を用いてもよく、特に限定されないが、例えば、アクチビンAを用いる方法（特願2008-40781）、微弱パルス電流および熱を印加する方法（特願2010-153907）、M15細胞と共培養する方法（WO2006/126574）、アクチビンAおよびWnt3aを含有する培地で培養後、FGF10およびKAAD-シクロパミンを含有する培地で培養し、さらにFGF10、KAAD-シクロパミンおよびレチノイン酸を含む培地で培養する多段階誘導法（Chen S, et al., Nat Chem Biol. 2009, 5, 258-265）、アクチビンAを含む培地で培養後、レチノイン酸を含有する培地で培養する誘導法（Jiang W, et al., Cell Res. 2007, 17, 333-344.）などが挙げられる。好ましくは、本発明では、多能性幹細胞から膵前駆細胞への分化誘導に際して、以下の４つの工程を含む方法を用いることができる：
（i）ヒト人工多能性幹細胞等の多能性幹細胞を、アクチビンAとGSK-3β(Glycogen Synthase Kinase 3β)阻害剤とを含む培地で培養する工程(第1工程)、
（ii）工程(i)で得られた細胞をFGF10およびSmoothened（SMO）阻害剤を添加した培養液中で培養する工程(第2工程)、
（iii）工程(ii)で得られた細胞をレチノイン酸、FGF10およびSMO阻害剤を添加した培養液中で培養する工程(第3工程)、ならびに
（iv）工程(iii)で得られた細胞をプロテインキナーゼC活性化剤およびFGF10を添加した培養液中で培養する工程(第4工程)。
(第1工程) 多能性幹細胞を、アクチビンAとGSK-3β阻害剤とを含む培地で培養する工程
本工程では、ヒト多能性幹細胞を、任意の方法で分離し、浮遊培養により培養してもよく、あるいはコーティング処理された培養皿を用いて接着培養してもよい。本発明における培養方法として、好ましくは接着培養が採用される。ここで、ヒト多能性幹細胞の分離方法としては、例えば、力学的に分離する方法、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、Accutase(TM)およびAccumax(TM)など）またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離方法が挙げられる。好ましくは、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（特に好ましくは、Accutase(TM)）を用いてヒト多能性幹細胞を解離し、力学的に細かく単一細胞へ分散する方法が用いられる。ここで、使用されるヒト多能性幹細胞は、使用したディッシュに対して80％コンフルエントになるまで培養されたコロニーであることが好ましい。
浮遊培養とは、細胞を培養皿へ非接着の状態で培養することであり、特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）されていない培養皿、若しくは、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（poly-HEMA）によるコーティング処理）した培養皿を使用して行うことができる。
また、接着培養においては、コーティング処理された培養皿にて、任意の培地中で培養する。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（BD）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、マトリゲルである。
本工程における培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばIMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、およびこれらの混合培地などが包含される。好ましくは、RPMI 1640培地である。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'-チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得る。
増殖因子は、Wnt1、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt7a、およびアクチビンなどを含むがこれらに限定されない。本工程においては、少なくともアクチビンAを増殖因子として用いる。
培地におけるアクチビンAの濃度は、通常、1ng/ml〜200ng/ml、例えば、1ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、95ng/ml、100ng/ml、110ng/ml、120ng/ml、130ng/ml、140ng/ml、150ng/ml、160ng/ml、170ng/ml、180ng/ml、190ng/ml、200ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、100ng/mlである。
本工程における低分子化合物は、例えば、GSK-3β阻害剤またはROCK（Rho dependent protein kinase）阻害剤などを含むがこれらに限定されない。本工程においては、少なくともGSK-3β阻害剤を低分子化合物として用いる。
GSK-3β阻害剤は、GSK-3βタンパク質のキナーゼ活性（例えば、βカテニンに対するリン酸化能）を阻害する物質として定義され、既に多数のものが知られているが、例えば、インジルビン誘導体であるBIO（別名、GSK-3β阻害剤IX；6-ブロモインジルビン3'-オキシム）、マレイミド誘導体であるSB216763（3-(2,4-ジクロロフェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるGSK-3β阻害剤VII（4-ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるL803-mts（別名、GSK-3βペプチド阻害剤；Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2）および高い選択性を有するCHIR99021(6-[2-[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-ylamino]ethylamino]pyridine-3-carbonitrile)が挙げられる。これらの化合物は、例えばCalbiochem社やBiomol社等から市販されており容易に利用することが可能であるが、他の入手先から入手してもよく、あるいはまた自ら作製してもよい。
本発明で使用されるGSK-3β阻害剤は、好ましくは、CHIR99021であり得る。
培地におけるCHIR99021の濃度は、通常、1nM〜50μM、例えば、1nM、10nM、50nM、100nM、500nM、750nM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、40μM、50μMであるがこれらに限定されない。好ましくは、1μMである。
ROCK阻害剤は、Rhoキナーゼ(ROCK)の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Y-27632（例えば、Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000)；Narumiya et al., Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)参照）、Fasudil/HA1077（例えば、Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)参照）、H-1152（例えば、Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002)参照）、Wf-536（例えば、Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52(4): 319-324 (2003)参照）およびそれらの誘導体、ならびにROCKに対するアンチセンス核酸、RNA干渉誘導性核酸（例えば、siRNA）、ドミナントネガティブ変異体、およびそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ROCK阻害剤としては他の低分子化合物も知られており、本発明においてはこのような化合物またはそれらの誘導体も使用できる（例えば、米国特許出願公開第20050209261号、同第20050192304号、同第20040014755号、同第20040002508号、同第20040002507号、同第20030125344号、同第20030087919号、および国際公開第2003/062227号、同第2003/059913号、同第2003/062225号、同第2002/076976号、同第2004/039796号参照）。本発明では、好ましくは１種または２種以上のROCK阻害剤が使用され得る。
本発明で使用されるROCK阻害剤は、好ましくは、Y-27632（(R)-(+)-trans-4-(1-アミノエチル)-N-(4-ピリジル)シクロヘキサンカルボキサミド）であり得る。
Y-27632の濃度は、通常、100nM〜50μM、例えば、100nM、500nM、750nM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、40μM、50μMであるがこれらに限定されない。好ましくは、10μMである。
低分子化合物の置換基は、当分野における技術常識に基づいて当業者により容易に置換され得るものであり、例えば上記した化合物（GSK-3β阻害剤、ROCK阻害剤など）の性質を保持し得る限りにおいて任意に変更することができる。
本工程において好ましい培地として、B27,Penicillin/Streptomycin、アクチビンAおよびCHIR99021を含有するRPMI1640培地に、適宜、ROCK阻害剤が添加された培地が例示される。
培養温度は、以下に限定されないが、約30〜40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。CO2濃度は、約2〜5％、好ましくは5％である。培養時間は、少なくとも3日以上であり、例えば3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日および12日が挙げられる。好ましくは少なくとも4日であり、より好ましくは4日〜6日である。
(第2工程) 第1工程で得られた細胞をFGF10およびSMO阻害剤を添加した培養液中で培養する工程
本工程では、前述の第1工程が接着培養であった場合、得られた細胞を、培地の交換により継続して培養してもよい。あるいは、前述の第1工程が浮遊培養であった場合、得られた細胞集団をそのままコーティング処理された培養皿にて、任意の培地中で培養してもよい。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（BD）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、マトリゲルである。
本工程の培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばIMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、およびこれらの混合培地などが包含される。好ましくは、DMEMである。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、ITS-X（Invitrogen）（インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム含有）、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'-チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得る。
本工程において好ましい増殖因子とは、Wnt1、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt7a、アクチビンおよびFGFファミリー（例えば、bFGF、FGF7またはFGF10が例示される）が挙げられる。本工程においては、少なくともFGF10を増殖因子として用いる。
培地におけるFGF10の濃度は、通常、1ng/ml〜200ng/ml、例えば、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、125ng/ml、150ng/ml、175ng/ml、200ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、50ng/mlである。
本工程における低分子化合物は、例えば、SMO阻害剤またはROCK（Rho dependent protein kinase）阻害剤などを含むがこれらに限定されない。本工程においては、少なくともSMO阻害剤を用いる。
SMO阻害剤は、7回膜貫通型タンパク質であるSMOに作用し、そのシグナル伝達を阻害する物質として定義され、例えば、シクロパミン、3-Keto-N-(aminoethyl-aminocaproyl- dihydro-cinnamoyl)（KAAD）-シクロパミン、CUR-61414、SANT-1、2、3、4、IPI-926、IPI-269609、GDC-0449およびNVP-LDE-225が挙げられる。本発明で使用されるSMO阻害剤は、好ましくは、KAAD-シクロパミンである。
培地におけるKAAD-シクロパミンの濃度は、通常、10nM〜2.5μM、例えば、10nM、50nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM、500nM、1μM、1.5μM、2μM、2.5μMであるがこれらに限定されない。好ましくは、250nMである。
本工程において好ましい培地として、L-glutamine、B27、Penicillin/Streptomycin、KAAD-シクロパミンおよびFGF10を含有するDMEM培地が例示される。
培養温度は、以下に限定されないが、約30〜40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。CO2濃度は、約2〜5％、好ましくは5％である。培養時間は、少なくとも1日以上の培養であり、1日、2日、3日、4日、5日などが例示される。好ましくは1日である。
(第3工程) 第2工程で得られた細胞をレチノイン酸、FGF10およびSMO阻害剤を添加した培養液中で培養する工程
本工程では、前述の第2工程で得られた細胞を、培地の交換により継続して培養してもよいし、分離して再度接着培養してもよい。分離方法としては、例えば、力学的に分離する方法、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、Accutase(TM)およびAccumax(TM)など）またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離方法が挙げられる。
また、接着培養においては、コーティング処理された培養皿にて、任意の培地中で培養する。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（BD）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
本工程の培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばIMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、およびこれらの混合培地などが包含される。好ましくは、DMEMである。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、ITS-X（Invitrogen）（インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム含有）、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'-チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得る。
本工程において好ましい増殖因子とは、Wnt1、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt7a、アクチビンおよびFGFファミリー（例えば、bFGF、FGF7またはFGF10が例示される）が挙げられる。本工程においては、少なくともFGF10を増殖因子として用いる。
培地におけるFGF10の濃度は、通常、1ng/ml〜200ng/ml、例えば、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、125ng/ml、150ng/ml、175ng/ml、200ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、50ng/mlである。
本工程における低分子化合物は、例えば、SMO阻害剤およびレチノイン酸またはROCK阻害剤などを含むがこれらに限定されない。本工程においては、少なくともSMO阻害剤およびレチノイン酸を低分子化合物として用いる。SMO阻害剤は、上述した化合物を用いることができる。
SMO阻害剤としてKAAD-シクロパミンを選択した場合、培地における濃度は、通常、10nM〜2.5μM、例えば、10nM、50nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM、500nM、1μM、1.5μM、2μM、2.5μMであるがこれらに限定されない。好ましくは、250nMである。
また、培地におけるレチノイン酸の濃度は、通常、100nM〜20μM、例えば、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、1μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM、4μM、5μM、10μM、20μMであるがこれらに限定されない。好ましくは、2μMである。
本工程において好ましい培地として、L-glutamine、B27、Penicillin/Streptomycin、KAAD-シクロパミン、FGF10およびレチノイン酸を含有するDMEM培地が例示される。
培養温度は、以下に限定されないが、約30〜40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。CO2濃度は、約2〜5％、好ましくは5％である。培養時間は、少なくとも2日以上の培養であり、2日、3日、4日、5日および6日などが例示される。好ましくは2日である。
(第4工程) 第3工程で得られた細胞をプロテインキナーゼC活性化剤およびFGF10を添加した培養液中で培養する工程
本工程では、前述の第3工程で得られた細胞を、培地の交換により継続して培養してもよし、分離して再度接着培養してもよい。分離方法としては、例えば、力学的に分離する方法、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、Accutase(TM)およびAccumax(TM)など）またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離方法が挙げられる。
また、接着培養においては、コーティング処理された培養皿にて、任意の培地中で培養する。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（BD）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
本工程の培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばIMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、およびこれらの混合培地などが包含される。好ましくは、DMEMである。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、ITS-X（Invitrogen）（インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム含有）、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'-チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得る。
本工程において好ましい増殖因子とは、Wnt1、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt7a、アクチビン、およびFGFファミリー（例えば、bFGF、FGF7またはFGF10が例示される）が挙げられる。本工程においては、少なくともFGF10を増殖因子として用いる。
培地におけるFGF10の濃度は、通常、1ng/ml〜200ng/ml、例えば、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、125ng/ml、150ng/ml、175ng/ml、200ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、50ng/mlである。
本工程における低分子化合物は、例えば、プロテインキナーゼC活性化剤またはROCK阻害剤などを含むがこれらに限定されない。本工程においては、少なくともプロテインキナーゼC活性化剤を低分子化合物としても用いる。プロテインキナーゼC活性化剤は、上述した化合物を用いることができる。
本工程においてプロテインキナーゼC活性化剤としてインドラクタムVを選択した場合、培地へ添加する濃度は、通常、30nM〜3μM、例えば、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1μM、2μM、3μMであるがこれらに限定されない。好ましくは、300nMである。
本工程において好ましい培地として、L-glutamine、B27、Penicillin/Streptomycin、、インドラクタムVおよびFGF10を含有するDMEM培地が例示される。
培養温度は、以下に限定されないが、約30〜40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。CO2濃度は、約2〜5％、好ましくは5％である。培養時間は、少なくとも2日以上の培養であり、2日、3日、4日、5日、6日、7日および8日が例示される。好ましくは2日〜4日である。
＜膵外分泌細胞＞
本発明は、上述した分化誘導法によって作製された膵外分泌細胞を指標に用いて純化してもよい。膵外分泌細胞は、例えば、AMY2A、AMY2Bまたは他の膵外分泌細胞の任意のマーカーによって染色することで同定し、当業者に周知の方法で純化され得る。
このように得られた膵外分泌細胞は、例えば、慢性膵炎の治療薬のスクリーニングに用いることができる。
＜膵前駆細胞からの膵外分泌細胞の分化誘導用キット＞
本発明は、膵前駆細胞から膵外分泌細胞を分化誘導するためのキットを提供する。本キットには、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤および/またはNotchシグナルのリガンドタンパク質、ならびにプロテインキナーゼC活性化剤が含まれる。本キットには、さらに上述した分化誘導に用いる増殖因子、化合物、培養液、解離溶液および培養皿のコーティング剤を含んでもよい。本キットには、さらに分化誘導の手順を記載した書面や説明書を含んでもよい。
＜多能性幹細胞からの膵外分泌細胞の分化誘導用キット＞
本発明は、多能性幹細胞から膵外分泌細胞を分化誘導するためのキットを提供する。本キットには、上述した膵前駆細胞からの膵外分泌細胞の分化誘導用キットに加えて、多能性幹細胞から膵前駆細胞への分化誘導に用いる増殖因子、化合物、培養液、解離溶液（ヒト多能性幹細胞を単一分散させる試薬を含む）、および培養皿のコーティング剤を含んでもよい。好ましくは、さらにGSK-3β阻害剤、アクチビンA、FGF10、およびSMO阻害剤を含む。本キットには、さらに分化誘導の手順を記載した書面や説明書を含んでもよい。
（実施例１）
ヒトES細胞（KhES3）は、京都大学より受領し、従来の方法で培養した（Mori H, et al., Biochem Biophys Res Commun. 2006, 345, 926-932）。6cmディッシュ上で80-90%コンフルエントになるまで培養し、1mL のAccutase（TM）を加えてES細胞を単一細胞へ分散させた。
単一分散させたES細胞を図１に示したプロトコールに従って膵外分泌細胞を誘導した。詳細には以下の５つの工程を実施した。
（Stage 1）2% B27およびPenicillin/Streptomycinを含有するRPMI1640培地にES細胞を懸濁し、マトリゲルでコートした24 ウェルプレートに250,000/ウェルとなるように播種した。100ng/mL アクチビンAおよび1μM CHIR99021を加えて、培地量が0.5mL/ウェルとなるように調整し、6日間培養した。
（Stage 2-1）培地を50ng/ml FGF10、0.25μM KAAD（3-Keto-N-(aminoethyl-aminocaproyl- dihydro-cinnamoyl)）-シクロパミン、1% L-Glutamin、2% B27、50m U/L Penicillinおよび50μg/L Streptomycinを含有するDMEMに置換し、1日間培養した。
（Stage 2-2）培地を2μM レチノイン酸、50ng/ml FGF10、0.25μM KAAD-シクロパミン、1% L-Glutamin、2% B27、50m U/L Penicillinおよび50μg/L Streptomycinを含有するDMEMに置換し、２日間培養した。
（Stage 2-3）培地を50ng/ml FGF10、300nM (-)-indolactam V (ILV)、1% L-Glutamin、2% B27、50m U/L Penicillinおよび50μg/L Streptomycinを含有するDMEMに置換し、４日間培養した。
（Stage 3）培地を1μM CHAP108（式１０）、300nM ILV、1% L-Glutamin、2% B27、50m U/L Penicillinおよび50μg/L Streptomycinを含有するDMEMに置換し、４日間または８日間培養した。
各Stageで得られた細胞をPCRにて各マーカー遺伝子（SOX17、PDX1およびAMY2A）の発現について検討した。その結果、Stage 2で得られた膵前駆細胞では、SOX17およびPDX1の発現が確認され、Stage 3で得られた膵外分泌細胞では、SOX17、PDX1およびAMY2Aすべての発現が確認された（図２）。
Stage 3において、CHAP108の代わりにNotchシグナルのリガンドタンパク質である0.5 mg/ml hDLL4または0.5 mg/ml hJAG1を用いて12日間培養した場合とCHAP108を用いて4日間培養した結果を比較したところ、CHAP108（4日間）、hDLL4（12日間）およびhJAG1（12日間）の膵外分泌細胞の誘導効率は、それぞれ、21.4%、28.8%および27.0%の膵外分泌の誘導効率であった（図３）。これらの値は、陰性対照であるDMSOを添加した場合と比較して有意に高かった。
以上より、CHAP108を用いることで、Notchシグナルのリガンドタンパク質と同様にPDX1陽性の膵前駆細胞から膵外分泌細胞を誘導できることが確認された。
（実施例２）
単一細胞へ分散させたES細胞(KhES3)を、図１に示したプロトコールの改変法に従って膵外分泌細胞へと分化誘導した。詳細には以下の５つの工程を実施した。
(Stage 1) 2% B27 およびPenicillin/Streptomycinを含有するRPMI1640培地にES細胞を懸濁し、マトリゲルでコートした24 ウェルプレートに250,000/ウェルとなるように播種した。100ng/mL アクチビンAおよび1μM CHIR99021を加えて、培地量が0.5mL/ウェルとなるように調整し、4日間培養した。
(Stage 2-1) 培地を50ng/ml FGF10、0.25μM KAAD（3-Keto-N-(aminoethyl-aminocaproyl- dihydro-cinnamoyl)）-シクロパミン、1% L-Glutamin、2% B27、50m U/L Penicillinおよび50μg/L Streptomycinを含有するDMEMに置換し、1日間培養した。
(Stage 2-2) 培地を2μM レチノイン酸、50ng/ml FGF10、0.25μM KAAD-シクロパミン、1% L-Glutamin、2% B27、50m U/L Penicillinおよび50μg/L Streptomycinを含有するDMEMに置換し、２日間培養した。
（Stage 2-3）培地を50ng/ml FGF10、300nM (-)-indolactam V (ILV)、1% L-Glutamin、2% B27、50m U/L Penicillinおよび50μg/L Streptomycinを含有するDMEMに置換し、2日間培養した。
（Stage 3）培地を1μM CHAP108（式１０）、300nM ILV、1% L-Glutamin、2% B27、50m U/L Penicillinおよび50μg/L Streptomycinを含有するDMEMに置換し、2日間培養した。
Stage 3の後に得られた細胞を、抗アミラーゼを用いた免疫染色により検討した。その結果、CHAP108を使用した場合にアミラーゼ陽性の割合は56.3%であった（図４）。この値は陰性対照であるDMSOを添加した場合(2.8%)と比較して高かった。以上より、CHAP108を用いる本プロトコールは、PDX1陽性の膵前駆細胞から膵外分泌細胞を誘導するのに有用であるといえる。

Claims (18)

  1. PDX1陽性の膵前駆細胞から膵外分泌細胞を製造する方法であって、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤及び/又はNotchシグナル受容体のリガンドタンパク質、並びにプロテインキナーゼC活性化剤を添加した培養液中で、PDX1陽性の膵前駆細胞を培養する工程を含み、
    前記ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、以下の（式１０）：
    の構造を有する化合物であり、
    前記Notchシグナル受容体のリガンドタンパク質がDLL4及び/又はJAG1であり、
    前記プロテインキナーゼC活性化剤がインドールアルカロイド系のプロテインキナーゼC活性化剤である、
    前記方法。
  2. 前記インドールアルカロイド系のプロテインキナーゼC活性化剤がインドラクタムVである、請求項１記載の方法。
  3. 前記培養工程を少なくとも2日実施する、請求項１又は２記載の方法。
  4. 前記PDX1陽性の膵前駆細胞が、次の（i）〜（iv）の工程により多能性幹細胞から誘導されたPDX1陽性の膵前駆細胞である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法；
    （i）多能性幹細胞をGSK-3β阻害剤及びアクチビンAを添加した培養液中で培養する工程、
    （ii）(i)で得られた細胞をFGF10及びSMO阻害剤を添加した培養液中で培養する工程、
    （iii）(ii)で得られた細胞をレチノイン酸、FGF10及びSMO阻害剤を添加した培養液中で培養する工程、並びに
    （iv）(iii)で得られた細胞をプロテインキナーゼC活性化剤及びFGF10を添加した培養液中で培養する工程であって、前記プロテインキナーゼC活性化剤がインドールアルカロイド系のプロテインキナーゼC活性化剤である、前記工程。
  5. 前記GSK-3β阻害剤がCHIR99021である、請求項４記載の方法。
  6. 前記SMO阻害剤がKAAD-シクロパミンである、請求項４又は５記載の方法。
  7. 前記インドールアルカロイド系のプロテインキナーゼC活性化剤がインドラクタムVである、請求項４〜６のいずれか１項記載の方法。
  8. 前記工程（i）において、多能性幹細胞を単一細胞へ分散させることを含む、請求項４〜７のいずれか１項記載の方法。
  9. 前記培養工程（i）を少なくとも4日実施する、請求項４〜８のいずれか１項記載の方法。
  10. 前記培養工程（ii）を少なくとも1日実施する、請求項４〜９のいずれか１項記載の方法。
  11. 前記培養工程（iii）を少なくとも2日実施する、請求項４〜１０のいずれか１項記載の方法。
  12. 前記培養工程（iv）を少なくとも2日実施する、請求項４〜１１のいずれか１項記載の方法。
  13. 前記PDX1陽性の膵前駆細胞が、PDX1陽性のヒト膵前駆細胞である、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
  14. PDX1陽性の膵前駆細胞から膵外分泌細胞を製造するためのキットであって、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤及び/又はNotchシグナル受容体のリガンドタンパク質、並びにプロテインキナーゼC活性化剤を含み、
    前記ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、以下の（式２０）：
    の構造を有する化合物であり、
    前記Notchシグナル受容体のリガンドタンパク質がDLL4及び/又はJAG1であり、
    前記プロテインキナーゼC活性化剤がインドールアルカロイド系のプロテインキナーゼC活性化剤である、
    前記キット。
  15. 前記インドールアルカロイド系のプロテインキナーゼC活性化剤がインドラクタムVである、請求項１４記載のキット。
  16. 多能性幹細胞から膵外分泌細胞を製造するためのキットであって、請求項１４又は１５記載のキットに加え、さらに、GSK-3β阻害剤、アクチビンA、FGF10及びSMO阻害剤を含む、前記キット。
  17. 前記GSK-3β阻害剤がCHIR99021である、請求項１６記載のキット。
  18. 前記SMO阻害剤がKAAD-シクロパミンである、請求項１６又は１７記載のキット。
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