JPWO2013147123A1 - C1q−アディポネクチン複合体及びその利用 - Google Patents
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Abstract
Description
しかし、現状では、これらの測定方法は精度が十分であるとはいえず、更に精度の高いマーカーが必要とされている。
また、Total−APN量測定では、SDS存在下で加熱処理することにより立体構造を解離するため、アディポネクチンの質的変化は検出できない。更に、また、HMW−APN量測定では、6量体以上のアディポネクチン多量体を検出できる一方、検出できる多量体構造に特異性はない。
非特許文献10:Arita Y, Kihara S, Ouchi N et al., Adipocyte-derived plasma protein adiponectin acts as a platelet-derived growth factor-BB-binding protein and regulates growth factor-induced common postreceptor signal in vascular smooth muscle cell. Circulation. 2002; 105: 2893-8.
非特許文献11:Takemura Y, Ouchi N, Shibata R、et al., Adiponectin modulates inflammatory reactions via calreticulin receptor-dependent clearance of early apoptotic bodies. J Clin Invest. 2007; 117: 375-86.
非特許文献12:Komura N, Kihara S, Sonoda M, et al., Increment and impairment of adiponectin in renal failure. Cardiovasc Res. 2010; 86: 471-7.
非特許文献13:Peake PW et al., Human adiponectin binds to bacterial lipopolysaccharide. Biochem Biophys Res Commun. 341:108-115,2006.
非特許文献14:Maeda K, Okubo K, Shimomura I, et al., Analysis of an expression profile of genes in the human adipose tissue. Gene. 1997; 190: 227-35
非特許文献15:Yokota T, Oritani K, Takahashi I, et al., Adiponectin, a new member of the family of soluble defense collagens, negatively regulates the growth of myelomonocytic progenitors and the functions of macrophages. Blood. 2000; 96: 1723-32.
非特許文献16:Ebina K, Oshima K, Matsuda M, et al., Adenovirus-mediated gene transfer of adiponectin reduces the severity of collagen-induced arthritis in mice. Biochem Biophys Res Commun. 2009; 378: 186-91.
本発明者らは、まず、ゲル濾過クロマトグラフィーにてヒト血清を分子量分画し、各分画におけるC1q−アディポネクチン複合体の存在量を測定した。本解析から、C1q−アディポネクチン複合体は、高分子量及び中分子量分画のアディポネクチンと同一の分子量サイズに存在していることを見出した。
項2.項1に記載のC1q−アディポネクチン複合体の量の測定方法であって、当該複合体の量を免疫学的測定法によって測定することを含む方法。
項3.免疫学的測定法がELISA法である項2に記載の測定方法。
項4.ELISA法が抗アディポネクチン抗体及び抗C1q抗体を用いるサンドイッチELISA法である項3に記載の測定方法。
項5.抗アディポネクチン抗体がF(ab’)2である項4に記載の測定方法。
項6.項2〜5のいずれかに記載の測定方法により、診断対象から採取した血液中の項1に記載のC1q−アディポネクチン複合体の量を測定することを含む、メタボリックシンドローム又は動脈硬化リスクの診断方法。
項7.血液中の総アディポネクチン量に対する項1に記載のC1q−アディポネクチン複合体の量の比(C1q−APN/Total−APN比)を指標とする、項6に記載の診断方法。
項8.項1に記載のC1q−アディポネクチン複合体の量を測定するための測定用キットであって、抗アディポネクチン抗体及び抗C1q抗体を含有するキット。
項9.メタボリックシンドローム又は動脈硬化リスクを診断するための項8に記載のキット。
アディポネクチンは244アミノ酸より構成される生理活性タンパク質であり、脂肪細胞から分泌される。N末端側にはシグナルペプチド・コラーゲン様ドメイン、そしてC末端側には球状ドメインを有する。特に球状ドメインは、コラーゲンV又はVIII、そして補体成分C1qと高いホモロジーを有することが知られている(非特許文献17)。ヒトにおいてアディポネクチンは、4〜30μg/mLの濃度にて血中に存在しており、内臓脂肪の蓄積に伴い低下することが示されている(非特許文献18)。アディポネクチンはコラーゲン様ドメインなど特徴的な立体構造を有していることから、血液中では、3量体、6量体、それ以上の多量体(HMW;High molecular weight multimer)といった多様な立体構造を形成していることが想定されている(非特許文献19)。
本発明における天然型アディポネクチンは、これらのいずれであってもよく、また、これらの混合物であってよい。
非特許文献18:Arita Y, Kihara S, Ouchi N, et al., Paradoxical decrease of an adipose-specific protein, adiponectin, in obesity. Biochem Biophys Res Commun. 1999; 257:79-83
非特許文献19:Pajvani UB, Du X, Combs TP, Berg AH, Rajala MW, Schulthess T, Engel J, Brownlee M, Scherer PE. Structure-function studies of the adipocyte-secreted hormone Acrp30/adiponectin. Implications fpr metabolic regulation and bioactivity. J Biol Chem. 2003 Mar 14;278(11):9073-85
天然型アディポネクチンは、好ましくは、血液から単離されるアディポネクチンである。なお、本明細書中、「血液から単離される」とは、間接的に血液から単離されることを包含する。すなわち、例えば、血清から単離されるアディポネクチンは、血液から単離されるアディポネクチンである。
天然型アディポネクチンは、自然界から単離されるアディポネクチンと同じ構造を有する限り、遺伝子工学的手法によって製造された、組換えアディポネクチンであってもよい。組換えアディポネクチンは、この分野で周知慣用の手法に従って、大腸菌、酵母、又は哺乳動物細胞株(例、293細胞、CHO細胞)の遺伝子組換えによって作製することができる。
C1qは、18サブユニット(各6分子ずつのA鎖・B鎖・C鎖)より構成される約462kDaのタンパク質であり、非特許文献20によれば、ヒト血中には80μg/mLにて存在している。C1qは補体活性化経路の第1因子C1の主要構成因子であり、抗原抗体複合体を認識する。
本発明におけるC1qは、特に限定されず、例えば自然界から単離されるC1qであることができる。
攪拌時の温度は、好ましくは、20〜40℃である。
試料の採取方法は、測定の目的等に応じて適宜決定すればよいが、例えば、空腹時の検査対象からの採血などによって行われる。
このような、免疫学的測定法は、それぞれについて慣用の方法に従って実施すればよい。
当該抗体は、例えば、アディポネクチン、C1q、又はそれらの部分ペプチドを抗原として用いて得ることができるが、これらの抗体は、市販品として入手することも可能である。
以下に、抗アディポネクチン抗体、及び抗C1q抗体の製造方法を説明する。
温血動物に感作させる抗原であるアディポネクチン及びC1qとしては、それぞれ前記で説明したアディポネクチン及びC1q又はそれらの部分ペプチドを用いればよい。当該部分ペプチドは、アディポネクチン及びC1qをそれぞれ適当なペプチダーゼで切断すること、又は固相合成法等の化学的合成方法によって合成すること等の公知の製造方法によって得ることができる。
これらの抗原は、そのまま、又は免疫動物の抗体産生能を高めるため、フロインド完全アジュバント、フロインド不完全アジュバント等のアジュバントと混合、又はエマルションを調製して前記動物に投与してもよい。
通常、0.1〜100μg/bodyの量の抗原を用い、1回から数回程度(隔週程度で免疫する)の免疫を行う。抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の2〜5日後に、牌臓、胸腺、又はリンパ節を摘出し、それらから採取した細胞を、マウスミエローマ細胞株(例、SP2/0、P3U1)とポリエチレングリコール法等の公知の方法を用いて融合させ、ハイブリドーマを作製する。
ハイブリドーマの選別は、抗原を吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、次いで標識した抗免疫グロブリン抗体等を反応させることにより、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法等の公知の方法によって行うことができる。
抗アディポネクチン抗体を不溶化する段階、
当該不溶化された抗体に試料を接触させて、当該抗体に試料中のC1q−アディポネクチン複合体を結合させる段階、
前記C1q−アディポネクチン複合体に、抗C1q抗体を結合させる段階、及び
標識された抗体(二次抗体)を前記C1q−アディポネクチン複合体に結合した抗C1q抗体に結合させる段階
を含む。
ここで、C1qは、抗アディポネクチン抗体のFc領域に不都合に結合し得るので、抗アディポネクチン抗体としては、F(ab’)2が好ましい。
前記フラグメントは、抗体をパパイン又はペプシン等の酵素で処理するか、又はこれら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを任意の宿主細胞中で発現させることで得ることができる。
本発明のメタボリックシンドローム又は動脈硬化リスクの診断方法は、診断対象から採取した血液中のC1q−アディポネクチン複合体の量を測定することを含む。
すなわち、C1q−アディポネクチン複合体は、メタボリックシンドローム又は動脈硬化のマーカーとして有効に用いられる。
血液中のC1q−アディポネクチン複合体の量、
血液中の総アディポネクチン量に対するC1q−アディポネクチン複合体量の比(C1q−APN/Total−APN比)、
血液中の高分子量アディポネクチン(HMW−APN)量に対するC1q−アディポネクチン複合体量の比(C1q−APN/HMW−APN比)
が挙げられる。
これらのなかでも、メタボリックシンドローム又は動脈硬化との相関関係の高さから、好ましくは、C1q−APN/Total−APN比、又はC1q−APN/HMW−APN比であり、より好ましくはC1q−APN/Total−APN比である。ここで、高分子量アディポネクチン量と、総アディポネクチン量とは、相関性が高いことが知られている。
例えば、C1q−APN/Total−APN比を用いる場合、かかる基準値より高い場合に、メタボリックシンドローム又は動脈硬化に罹患しているか、或いはそのリスクが高いと判断される。
本発明によれば、前記方法を利用した、C1q−アディポネクチン複合体を選択的に測定するためのキットもまた提供される。
本発明のキットは、抗C1q−アディポネクチン複合体抗体、又は抗アディポネクチン抗体及び抗C1q抗体の組み合わせを備える。
これらの抗体としては、それぞれ前記したものを用いることができる。
(1)C1qに対するアディポネクチンの結合評価
組換えアディポネクチンタンパク質(rhAPN、200μg)のビオチン標識は、EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotin(Pierce社)を用いて添付文書に従い行った。ヒトC
1q精製タンパク質(100ng)をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)にて分離後、ニトロセルロースメンブレン(Protran BA 85 Nitrocellulose Membrane)(Whatman社)に転写した。前記メンブレンはBlock Ace(DS pharma社)にて室温で1時間ブロッキングを行った。その後、前記メンブレンを、1μg/mLに希釈したビオチン標識rhAPNにて4℃で18時間インキュベートした。PBSTにて3回洗浄した後、10000倍希釈したHRP標識ストレプトアビジン(Invitrogen社)にて室温で1時間攪拌した。最後に、再度3回洗浄した後、ECL Plus Western Blotting Detection Reagent(GE healthcare社)にて検出した。
rhAPN(200ng)はSDS−PAGEにて分離後、ニトロセルロースメンブレンに転写した。メンブレンはBlock Ace(DS pharma社)にて室温、1時間ブロッキングを行った。その後、1μg/mLに希釈したヒトC1q精製タンパク質にて室温で3時間インキュベートした。PBSTにて3回洗浄した後、1000倍希釈したHRP標識抗ヒトC1qポリクローナル抗体にて室温で1時間攪拌した。最後に、再度3回洗浄した後、前記1)と同様にECL Plus試薬にて検出した。
各100μgの抗ヒトアディポネクチン−F(ab’)2抗体、及び抗ヒトC1q−F(ab’)2抗体は、添付文書に従い磁気ビーズ(Dynabeads M-280 tosylactivated)(Invitrogen社)にカップリングさせた。検体希釈液(1% Tween20、1M NaCl、0.1% ProClin300を含むPBS(−))にて希釈したヒト血清は、各抗体を結合させた前記磁気ビーズと混合し、4℃で18時間転倒混和した。
前記磁気ビーズを検体希釈液にて3回洗浄した後、各免疫沈降産物をSDS−PAGE及びウェスタンブロッティングに用いた。
抗アディポネクチンモノクローナル抗体は、市販のキット(ImmunoPure IgG1 Fab and F(ab')2 Preparation Kit)(Pierce社)を用い使用説明書に従ってF(ab’)2抗体を作製した。EIA/RIA用96ウェルマイクロタイタープレート(96-Well EIA/RIA 1x8 Stripwell Plate、Cornig社)に3μg/mLに調整した抗アディポネクチン−F(ab’)2抗体を100μL添加して4℃で18時間インキュベートして固相化した。その後、洗浄液(0.05% Tween20を含むD−PBS(−))にて1回洗浄し、ブロッキング液(1% ウシ血清アルブミン(BSA)、5% D−Sorbitolを含むD−PBS(−))を300μLにて添加し4℃で18時間インキュベートした。プレートは、ブロッキング液を除去し、ドライルーム内にて乾燥し使用時まで4℃保存した。
次に、各ウェルを洗浄液350μLにて3回洗浄後、一次抗体希釈液(1% BSA、1% ブタ血清、0.1% Tween20、1M NaCl、0.1% ProClin300を含むPBS(−))にて5000倍希釈した抗ヒトC1qポリクローナル抗体(DAKO社)を100μL添加し、25℃にて1時間インキュベートした。その後、3回洗浄後、二次抗体希釈液(1% BSA、1% ブタ血清、0.1% Tween20、0.1% ProClin300を含むPBS(−))にて10000倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識抗ウサギIgG抗体を100μL添加し、25℃にて1時間インキュベートした。最後に、各ウェルを洗浄液で3回洗浄後、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)発色液100μLを添加し、室温で15分間発色させた。発色後のウェルは、1N希硫酸100μLを添加して反応を停止させ、450nm吸光度(参照波長650nm)(Abs(450-650nm))をマイクロプレートリーダーVmax(Molecular Devices社)にて測定した。血清中のC1q−APN複合体量は、Softmax Pro software(Molecular Devices社)にて標準曲線を作成し算出した。
ヒト血清(150μL)は、0.22 μmシリンジフィルターにて濾過後、AKTA Explorer 10S(GE healthcare社)に接続したSuperdex−200(GE healthcare社)クロマトグラフィーにて分画した。各フラクションは、280nm吸収を測定下、流速0.5mL/minにて分取した。
ファーウエスタンブロット法によるアディポネクチンとC1qの結合評価結果を図1に示した。還元・加熱下にて組換えアディポネクチンタンパク質(rhAPN)のSDS−PAGEを実施した後、ブロットしたメンブレンをヒトC1q精製タンパク質と反応させ、その後、抗ヒトC1qポリクローナル抗体にて検出した(図1.A 左(APN))。
また、同様に、ヒトC1q精製タンパク質をブロットしたメンブレンをビオチン標識rhAPNと反応後にHRP標識ストレプトアビジンにて反応させた(図1.A 右(C1q))。以上の手法より、アディポネクチンとC1qの直接結合をインビトロにて証明した。
ヒト血清を、還元及び加熱、非還元及び加熱、又は非還元及び非加熱条件下にて、SDS−PAGE、及びウェスタンブロッティングを行うことにより、アディポネクチン及びC1qの多量体構造を検出した。結果を図2.Aに示した。加熱及び還元処理下では、31kDa付近にアディポネクチンに由来するシグナルを、また31、30、26kDa付近にC1qに由来するシグナルを検出した。一方、非還元及び非加熱処理下においては、114kDa以上に、アディポネクチン及びC1qの高分子量体を検出した。
これまでに、インビトロでの検討にて、アディポネクチンとC1qが結合することは報告されていた[非特許文献8]。しかしながら、ヒト血清中にC1q−アディポネクチン複合体が存在することを証明したことは本発明が初めてである。
抗アディポネクチン−F(ab’)2抗体固相化プレートに対し、複合体標準品及び80倍希釈ヒト血清を各ウェルに添加した。検出抗体には、抗ヒトC1qポリクローナル抗体及びHRP標識抗ウサギIgG抗体を使用した。C1q−アディポネクチン複合体標準品は、5−0.315単位/mLまで段階希釈したものにより標準曲線を作成した(図3.A)。ヒト血清希釈検体は、図3.Bに示すように良好な希釈曲線が得られ、対照として用いたマウスIgG−F(ab’)2抗体固相化プレートでは吸光度は確認されなかった。
アディポネクチンは循環血中に高分子分画(High-molecular weight; HMW)、中分子分画(Middle-molecular weight; MMW)、低分子量分画(Low-molecular weight; LMW)の分画パターンにて存在していることが報告されている[Komura N, Kihara S, Sonoda M, et al., Clinical significance of high-molecular weight form of adiponectin in male patients with coronary artery disease. Circ J. 2008 Jan;72(1):23-8]。本発明では、ヒト循環血中においてC1q−アディポネクチン複合体がどのような分布様式にて存在しているかゲル濾過クロマトグラフィー法にて解析した。ヒト血清をSuperdex−200クロマトグラフィーにて分画し、各フラクションにおける総アディポネクチン量及びC1q−アディポネクチン複合体量を測定した。図3.Cに示すように、C1q−アディポネクチン複合体は、HMW及びMMW分画のアディポネクチン中に存在している可能性が示唆された。
血清中C1qに特異的なELISA測定法の構築を行った。抗ヒトC1q−F(ab’)2抗体固相化プレートに対し、ヒトC1q標準品及び3000倍希釈ヒト血清を各ウェルに添加した。検出抗体には、HRP標識抗ヒトC1qポリクローナル抗体を使用した。
ヒトC1q標準品は、150−2.34ng/mLまで段階希釈し標準曲線を作成した(図4.A)。希釈したヒト血清は、図4.Bに示すように良好な希釈曲線が得られ、対照として用いたウサギIgG−F(ab’)2抗体固相化プレートでは吸光度は確認されなかった。
日立健康管理センターにてあらかじめ本研究内容を説明し同意を得た2010年度検診受診者より血清を提供してもらった。30歳から74歳までの腹部CTスキャンを受診している重症疾患(癌、脳血管疾患、心筋梗塞)の罹病歴のない男性329名を対象とした。表1に各検体の臨床背景を示した。対象者を内臓脂肪面積(VFA)<100cm2の非内臓脂肪型肥満者(113名、平均VFA;66±24cm2)、及びVFA≧100cm2の内臓脂肪型肥満者(216名、平均VFA;149±38cm2)に分類した。
表1中、データは、平均値 ± SD (range) 又は分析対象数 (n)である。
略号は以下の通りである。
BMI;ボディー・マス・インデックス、WC;腹囲、VFA;内臓脂肪面積、SFA;皮下脂肪面積、SBP;収縮期血圧、DBP;拡張期血圧、BG;血中グルコース、fIRI;空腹時免疫反応性インスリン、TC;総コレステロール 、HDL−C;高密度リポタンパク質コレステロール、eGFR;推定糸球体濾過量(=194×Cr−1.094×年齢−0.287)、AST;アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ALT;アラニンアミノトランスフェラーゼ、γ−GTP;γ−グルタミルトランスフェラーゼ、Total−APN;総アディポネクチン、HMW−APN;高分子量アディポネクチン、C1q−APN;C1q−アディポネクチン複合体
Total−APN量とHMW−APN量は、有意な正の相関関係が認められ(r=0.9518、p<0.0001、図5A)、C1q−APN量とは分散した正の相関関係が認められた(r=0.5657、p<0.0001、図5B)。一方で、Total−APN量とC1q量との相関関係は認められなかった(図5D)。
HMW−APN量は、C1q−APN量と有意な正の相関関係が認められたが(r=0.5577、p<0.0001、図5C)、C1q量との相関関係は認められなかった(図5E)。一方で、C1q量は、C1q−アディポネクチン複合体量と弱い相関関係が認められた(r=0.1140、p=0.0411、図5F)。
C1qは、BMI、WC、VFA、SFA、SBP、DBP、log IRI、TC、log TG、Log ALT、及びリスクファクター数との正の相関が認められ、HDL−Cとの負の相関が認められた。
更に、ステップワイズ重回帰分析(Stepwise multiple regression)解析から、BMI(multivariate BMI)、VFA(multivariate VFA)、及びSFA(multivariate SFA)がC1q−APN複合体量の有意な規定因子であった。一方、BMI、VFA、SFAはC1qの有意な規定因子ではなかった。
表2において、C1q−APN、IRI、TG、AST、ALT及びγ−GTPのレベルのデータは、歪んだ分布を示し、分析前に対数変換した。有意水準は、p<0.05(*)に設定した。逐次重回帰分析を実施して、C1q−APN又はC1qに有意に相関するこれらのパラメーターを決定した。次いで、p<0.05及びF>4.0のパラメータを独立変数として回帰分析に投入した(*)。
これらの略号は表1に同じである。
循環血中の総アディポネクチン(Total−APN)量は、メタボリックシンドロームのバイオマーカーであることが知られている[非特許文献7]。絶対量だけでなく、Total−APNに占める高分子アディポネクチン(HMW−APN)の存在割合(HMW−APN/Total−APN比)又は総アディポネクチン量に占めるC1q−アディポネクチン複合体の存在割合(C1q−APN/Total−APN比)といったアディポネクチンの血中での構造を示す相対指標についても質的変化を観察する上で重要と考えられた。これら循環血中のC1q−APN量、C1q量、C1q−APN/Total−APN比、HMW−APN/Total−APN比、又はC1q−APN/C1q比と、メタボリックシンドロームとの関係については全く不明であった。
脂質異常・高血圧・血糖異常(メタボリックシンドロームの構成要因)を有する集団について、各種アディポネクチン関連指標との関連性を評価した。対象を、VFA<100cm2とVFA≧100cm2の2群に分類し、日本人の内臓脂肪蓄積基準に基づきカットオフ値を選定した。表1にこれら2群の臨床的特徴を示した。
以上から、本指標は動脈硬化症と関連する可能性が強く示唆された。
Claims (9)
- C1q及び天然型アディポネクチンを含有するC1q−アディポネクチン複合体。
- 請求項1に記載のC1q−アディポネクチン複合体の量の測定方法であって、当該複合体の量を免疫学的測定法によって測定することを含む方法。
- 免疫学的測定法がELISA法である請求項2に記載の測定方法。
- ELISA法が抗アディポネクチン抗体及び抗C1q抗体を用いるサンドイッチELISA法である請求項3に記載の測定方法。
- 抗アディポネクチン抗体がF(ab’)2である請求項4に記載の測定方法。
- 請求項2〜5のいずれかに記載の測定方法により、診断対象から採取した血液中の請求項1に記載のC1q−アディポネクチン複合体の量を測定することを含む、メタボリックシンドローム又は動脈硬化リスクの診断方法。
- 血液中の総アディポネクチン量に対する請求項1に記載のC1q−アディポネクチン複合体の量の比(C1q−APN/Total−APN比)を指標とする、請求項6に記載の診断方法。
- 請求項1に記載のC1q−アディポネクチン複合体の量を測定するための測定用キットであって、抗アディポネクチン抗体及び抗C1q抗体を含有するキット。
- メタボリックシンドローム又は動脈硬化リスクを診断するための請求項8に記載のキット。
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