JPWO2013147096A1 - 同位体標識ピリリウム化合物 - Google Patents
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Abstract
Description
そのため、より高い感度を実現するために、蛍光標識の使用が提案されており、それにより、約10倍以上の高感度化が実現されている。
更に、それでも検出できない低濃度のアミノ酸に対しては、液体クロマト分離した後に質量分析して検出する方法が採用されている。この場合、分離したアミノ酸をイオン化し易くするために、アミノ基と反応する試薬を用いてアミノ酸を誘導体化してから、それを液体クロマト分離および質量分析に供する方法が採用されてきた。しかしながら、この方法論に従った場合でも、従来の技術では高感度分析には限界があった。
本発明者等は更に、該化合物をアミンやアミノ酸等のアミノ基含有非ペプチド化合物の分析に適用することを試みた。アミノ基含有非ペプチド化合物の分析のためには、標識化合物間に2の質量差があればピーク間の干渉を回避できるので、互いに2の質量差を有して、なるべく多種類の同位体標識化合物を用意できることが分析効率の点で有益である。そこで更に合成実験を重ねた結果、上記PyII−0に対して質量差2、4、8または10を有する化合物(後述のPyII−2、PyII−4、PyII−8、PyII−10)を高純度で合成することに成功した。これらの同位体標識化合物を用いて分析を行うことで、生体試料中のアミノ基含有非ペプチド化合物を高感度に検出し得るのみならず、複数試料を同時に定量して、各試料中に含まれるアミノ基含有非ペプチド化合物を網羅的に分析できることを見出した。また、アミノ基含有非ペプチド化合物のPy誘導体は、ナノ液体クロマトグラフィーシステムにおいて必須である、分析カラムへの導入前に一旦導入されるトラップカラム(ODSカラム)への結合性が低いため、オートサンプラーを用いた高感度自動分析に繋げることは容易でないことが本発明者等により確認されていた。しかし、PyII化合物は、Py化合物と比べて環の側鎖の疎水性が高く、疎水性吸着能の向上に寄与するため、トラップカラムとしてODSカラムを利用して、アミノ基含有非ペプチド化合物の高感度分析を自動化する可能性を拓くことが分かった。
本発明者等は上記の知見に基づき更に検討を進めた結果、本発明を完成するに至った。
[1]式(I):
[2]式(I)において質量数13の炭素を1つ以上有する、上記[1]記載の化合物またはその塩。
[3]式(II):
[4]同位体標識により互いに異なる質量を有する2つ以上の式(I):
[5]質量差が6以上である2つ以上の式(I)で表される化合物またはそれらの塩を含み、かつ標的物質がタンパク質である、上記[4]記載のキット。
[6]質量数13の炭素原子を含まない式(I)で表される化合物、
質量数13の炭素原子を6個有する式(I)で表される化合物、および
質量数13の炭素原子を12個有する式(I)で表される化合物
またはそれらの塩を含む、上記[5]記載のキット。
[7]式(III):
[8]質量差が2以上である2つ以上の式(I)で表される化合物またはそれらの塩を含み、かつ標的物質がアミノ基含有非ペプチド化合物である、上記[4]記載のキット。
[9]質量数13の炭素原子を含まない式(I)で表される化合物、
質量数13の炭素原子を2個有する式(I)で表される化合物、
質量数13の炭素原子を4個有する式(I)で表される化合物、
質量数13の炭素原子を6個有する式(I)で表される化合物、
質量数13の炭素原子を8個有する式(I)で表される化合物、
質量数13の炭素原子を10個有する式(I)で表される化合物、および
質量数13の炭素原子を12個有する式(I)で表される化合物
からなる群から選択される2つ以上の化合物またはそれらの塩を含む、上記[8]記載のキット。
[10]式(II):
[11]質量分析計を用いて2以上の生体試料中のアミノ基を含有する標的物質を定量分析するための方法であって、
(1)分析に供する2以上の生体試料を調製する工程、
(2)試料間で標的物質に質量差を与えるように、同位体標識により互いに異なる質量を有する2つ以上の式(I):
(3)標識に供された全ての試料から混合物を調製する工程、
(4)混合物を質量分析に供し、該標識により互いに質量差を有する標的物質について、質量スペクトルにおけるそれらのピーク強度の比に基づいて、該混合物中でのそれらの標的物質の存在比を求め、得られた存在比と工程(3)における試料の混合比とから、混合物の調製に供された試料間での該標的物質の量比を決定する工程
を含む、方法。
[12]標的物質が、アミノ基を含有する非ペプチド化合物である、上記[11]記載の方法。
[13]標識化合物が、質量差が2以上である2つ以上の式(I)で表される化合物またはそれらの塩を含む、上記[12]記載の方法。
[14]標識化合物が、
質量数13の炭素原子を含まない式(I)で表される化合物、
質量数13の炭素原子を2個有する式(I)で表される化合物、
質量数13の炭素原子を4個有する式(I)で表される化合物、
質量数13の炭素原子を6個有する式(I)で表される化合物、
質量数13の炭素原子を8個有する式(I)で表される化合物、
質量数13の炭素原子を10個有する式(I)で表される化合物、および
質量数13の炭素原子を12個有する式(I)で表される化合物
からなる群から選択される2つ以上の化合物またはそれらの塩を含む、上記[13]記載の方法。
[15]標識化合物が、式(II):
[16]工程(1)において調製された試料の一つが、既知濃度の標的物質を含有する内部標準試料であり、かつ、
工程(4)における存在比の決定が、内部標準試料以外の各試料由来の標的物質と、内部標準試料由来の標的物質とのピーク強度の比を求めることを含む、
上記[11]記載の方法。
[17]質量分析計を用いて2以上の生体試料中のタンパク質を定量分析するための方法であって、
(1)分析に供する2以上の生体試料を調製する工程、
(2)試料間で同一タンパク質に質量差を与えるように、同位体標識により互いに異なる質量を有する2つ以上の式(I):
(3)標識に供された全ての試料から混合物を調製する工程、
(4)混合物中のタンパク質を制限酵素により消化してペプチドを得る工程、
(5)得られたペプチドを質量分析に供し、該標識により互いに質量差を有するペプチドについて、質量スペクトルにおけるそれらのピーク強度の比に基づいて、該混合物中でのそれらのペプチドの存在比を決定する工程、および、
(6)存在比を決定されたペプチドについて、それが由来するタンパク質を特定し、該存在比および工程(3)における試料の混合比から、混合物の調製に供された試料間での該タンパク質の量比を決定する工程
を含む、方法。
[18]標識化合物が、質量差が6以上である2つ以上の式(I)で表される化合物またはそれらの塩を含む、上記[17]記載の方法。
[19]標識化合物が、
質量数13の炭素原子を含まない式(I)で表される化合物、
質量数13の炭素原子を6個有する式(I)で表される化合物、および
質量数13の炭素原子を12個有する式(I)で表される化合物
またはそれらの塩を含み、3つの生体試料中のタンパク質を定量分析する、上記[18]記載の方法。
[20]標識化合物が、下記式(III):
[21]工程(1)において調製された試料の一つが、他の全ての調製された試料を混合して得られた内部標準試料であり、かつ、
工程(5)における存在比の決定が、内部標準試料以外の各試料由来のペプチドと、内部標準試料由来のペプチドとのピーク強度の比を求めることを含む、
上記[17]記載の方法。
[22]無水酸存在下で、3−エチル−3−ペンタノール又は3−エチル−2−ペンテンと無水プロピオン酸とを縮合し、式(I):
[23]式(IV):
本発明の同位体標識化合物はまた、複数試料(例、7種)中に含有されるアミノ基含有非ペプチド化合物を一斉に高感度で分析することを可能とする。更に、トラップカラムを用いた自動化により、フェムトモルレベルの高感度分析を24時間自動で行うことができる体制を構築し得る。
本発明は、下記式(I):
無水酸としては、トリフルオロメタンスルホン酸、ヘキサフルオロリン酸、テトラフルオロホウ酸、過塩素酸、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル、メタンスルホン酸等が挙げられ、中でも塩の結晶性がよく比較的安全性が高いトリフルオロメタンスルホン酸が好ましい。
反応温度は、通常40〜100℃、好ましくは50〜65℃であり、反応時間は通常10分〜24時間、好ましくは1〜1.5時間である。
原料化合物の量としては、3−エチル−2−ペンタノールを用いる場合、3−エチル−2−ペンタノールに対して無水プロピオン酸を通常3〜20モル当量、好ましくは約4モル当量である。一方、3−エチル−2−ペンテンを用いると、無水プロピオン酸の消費量を低減させることが可能であり、具体的には、3−エチル−2−ペンテンに対して無水プロピオン酸は通常3〜10モル当量、好ましくは約3モル当量とすることができる。トリフルオロメタンスルホン酸等の無水酸は、3−エチル−2−ペンタノールまたは3−エチル−2−ペンテンに対して、通常0.8〜1.2モル当量で添加される。
上記縮合反応後の反応液を自体公知の方法により濃縮、中和、抽出等を行った後、再結晶することにより所望の化合物を得ることができる。
上述の本発明の同位体標識化合物であって、同位体標識により質量数が異なる以外は同一の化合物を2つ以上組み合わせて、質量分析計を用いた生体試料中のアミノ基を含有する標的物質の定量用キット(以下、本発明のキットともいう)とすることができる。標的物質としては、アミノ基を含有する限り任意の化合物であってよく、典型的には、アミノ基含有非ペプチド化合物(例、アミン、アミノ酸等)、アミノ基含有ペプチド化合物、およびタンパク質である。
標的物質がタンパク質の場合、質量スペクトルにおいて同位体ピーク間の干渉を回避できる点で、いずれの化合物間についても質量差が6以上となる組み合わせが好ましい。そのような組み合わせとしては例えば、質量数13の炭素原子を含まない式(I)で表される化合物、質量数13の炭素原子を6個有する式(I)で表される化合物、および質量数13の炭素原子を12個有する式(I)で表される化合物、またはそれらの塩を含むものが挙げられる。好ましい組み合わせの具体例としては、上記のPyII−0、PyII−6およびPyII−12を含むものが挙げられる。
一方、標的物質がアミノ基含有非ペプチド化合物の場合、いずれの化合物間についても質量差が2以上であれば、同位体ピーク間の干渉を回避できる。そのため、該組み合わせとしては、質量差が2以上である2つ以上の式(I)で表される化合物またはそれらの塩を含むものが挙げられる。そのような組み合わせとしては例えば、質量数13の炭素原子を含まない式(I)で表される化合物、質量数13の炭素原子を2個有する式(I)で表される化合物、質量数13の炭素原子を4個有する式(I)で表される化合物、質量数13の炭素原子を6個有する式(I)で表される化合物、質量数13の炭素原子を8個有する式(I)で表される化合物、質量数13の炭素原子を10個有する式(I)で表される化合物、および質量数13の炭素原子を12個有する式(I)で表される化合物からなる群から選択される2つ以上の化合物、またはそれらの塩を含むものが挙げられる。好ましい組み合わせの具体例としては、上記のPyII−0、PyII−2、PyII−4、PyII−6、PyII−8、PyII−10およびPyII−12のうちの2つ以上を含むものが挙げられる。また、より多くの試料を一括で処理できるという観点から、上記の各例示した組み合わせには、式(I)で表される化合物またはその塩が、好ましくは3つ以上、より好ましくは4つ以上、更により好ましくは5つ以上、特により好ましくは6つ以上、最も好ましくは7つ含まれる。
本発明はまた、上述の本発明の同位体標識化合物の2つ以上を利用する、質量分析計を用いて2以上の生体試料中のアミノ基を含有する標的物質を定量分析するための方法(以下、本発明の定量分析方法ともいう)を提供する。標的物質としては、アミノ基含有非ペプチド化合物、アミノ基含有ペプチド化合物、およびタンパク質等が挙げられる。本発明の定量分析方法は、標的物質の種類によらず、本質的には同様のステップに従って実行できる。但し、タンパク質の定量分析方法(以下、本発明のタンパク質分析方法ともいう)については、制限酵素による消化、ペプチド断片からのタンパク質の同定等、特有の処理が通常為されるため、後に別途説明する。また、アミノ酸の個数が一般に2個から十数個程度までであるいわゆるペプチド化合物の定量分析については、後述するタンパク質の分析方法の説明に基づいて当業者は適宜実施し得るため、別段の説明は行わない。以下、アミノ基含有非ペプチド化合物の定量分析方法(以下、本発明の非ペプチド化合物分析方法ともいう)について説明する。
本明細書においてアミノ基含有非ペプチド化合物またはアミノ基を含有する非ペプチド化合物とは、分子内に1つ以上のアミノ基を有し、かつ、分子内にペプチド結合を有しない任意の化合物を意味し、ここでアミノ基とは、アンモニア、第一級アミン(即ち、アンモニアの水素原子を任意に置換されていてもよい任意の炭化水素基で1つ置換した化合物)または第二級アミン(即ち、アンモニアの水素原子を、それぞれ同一または異なる任意に置換されていてもよい任意の炭化水素基で、2つ置換した化合物)から水素を除去した1価の官能基をいう。従って、アミノ基含有非ペプチド化合物は、NH3、NH2R、またはNHRR’(式中、RおよびR’はそれぞれ同一または異なって、任意に置換されていてもよい任意の炭化水素基をそれぞれ示す。)の化学式を有する非ペプチド性の化合物である。但し、NHRR’の化学式を有する化合物については、本発明の方法で用いられる標識試薬とは反応しないか、もしくは極めて低反応性であると考えられる。それ故、本発明の方法の対象となるアミノ基含有非ペプチド化合物は、通常、NH2R(式中、Rは水素または任意に置換されていてもよい任意の炭化水素基を示す。)の化学式を有する非ペプチド性の化合物である。
測定の対象とするアミノ基含有非ペプチド化合物の分子量は、本発明の方法を可能とする限り特に限定されないが、一般的には低分子量の化合物である。具体的な分子量としては17〜1000であり、好ましくは17〜700、より好ましくは17〜500である。測定の対象とするアミノ基含有非ペプチド化合物としては、例えば、生理活性アミン、アミノ酸、薬物、覚醒剤、麻薬、不揮発性腐敗アミン、および、それらの代謝物でアミノ基を保有する化合物等が挙げられる。一度の分析において、複数種類のアミノ基含有非ペプチド化合物を測定の対象とすることもできる。
内部標準試料の調製は例えば、標的非ペプチド化合物の市販品を所定の濃度(例、0.05M)のHClに溶解することによって行うことができる。また、内部標準試料中に存在する、標的非ペプチド化合物の濃度は特に制限されないが、一般には、分析に供される他の試料中での該化合物の想定される濃度と近いことが好ましい。内部標準試料は、通常、標的非ペプチド化合物を既知の濃度で含有する。それにより、試料中に存在する標的化合物の絶対量を決定することが可能となる。
LC条件は分離用カラムとしてモノリス型のMonoCap for FastFlow (0.05 mm IDx150mmL, GLサイエンス社)、トラップカラムとしてC18-Monolithトラップカラム(0.05mm IDx150mm L GLサイエンス社)を用い、流量200 nl/分、移動層としてA)ギ酸/水/アセトニトリル(0.1:98:2)、B) ギ酸/水/アセトニトリル(0.1:2:98)からなるグラジエント溶出を行う(すなわち、A/B=98/2(0分)−2/98(50分)-2/98(50.1-70分)−98/2(70.1-90分))。質量測定部設定として、イオン化モードはナノESI(正イオン化)、スプレー電圧は1600 V、検出器電圧は1950 V、カウンター窒素ガス量は0.8 L/分、スキャン範囲は100-500 m/zとし、質量分析の記録時間は50分とする。
以下、本発明のタンパク質分析方法について、各工程を説明する。
上記目的のために、内部標準試料は、分析される試料中に存在するあらゆるタンパク質を含むことが好ましい。そのために、内部標準試料は、例えば、上述のようにして調製された分析される全てのタンパク質含有試料を混合することにより調製されたものであり得る。その場合、上述のようにして調製された各試料から総タンパク質含有量が等しい出発試料をそれぞれ調製した後、該出発試料を混合(例、等量混合)することにより内部標準試料を調製することも、その調製法の例として挙げることができる。
内部標準試料を用いるタンパク質の定量分析方法については、上記特許文献1にも説明されている。
(a)該混合物を1次元ゲル分離、2次元ゲル分離または適当なクロマトメディアで大まかに分離する等したタンパク質をタンパク質分解酵素で加水分解し、ペプチドを遊離する;
(b)(a)のように前以て含有タンパク質を相互分離のためにゲル分離やクロマト展開することなく、該混合物を直接タンパク質分解酵素で分解する、
のいずれかに従う。タンパク質の分解は自体公知の手順に従って行うことができる。一次選択のトリプシン以外に、ArgペプチダーゼやGluペプチダーゼ等を二次選択として用いることができるが、Lysエンドペプチダーゼは用いない。
(a)の操作により分離したタンパク質から遊離した標識ペプチドおよび非標識ペプチドについては、ペプチドの分離操作無しで直接MALDI−TOF/MSにより質量分析する場合もある。また、液体クロマトグラフによりペプチドを分離後、ESI/MS/MS分析することもできる。
(b)の操作により遊離したペプチドは、2次元液体クロマトグラフシステムによって、例えば、1次元分離をSCXカラムで行い、溶出した成分を第2の逆相樹脂カラムにより分離し、ESI/MS/MSに導入することで、標識ペプチドの相対強度とそのアミノ酸配列情報を一度の分析で獲得する。
ここで、次工程のMSスペクトルの測定に用いるペプチドの分子量は特に限定されないが、例えば500〜3000であり、好ましくは1000〜2500である。従って、本工程は、好ましくは、タンパク質の消化産物から、上記範囲の分子量を有するペプチドを単離することを含む。
なお、工程(2)における標識において互いに質量差6以上の標識化合物を用いた場合には通常必要でないが、そうでない場合は、ピーク強度の対比において、例えば特開2005−181011に教示されているようにして、天然に存在する同位体元素に起因するペプチドの同位体ピークとの重なりを除去して量比の補正をする点に留意する。
ここで該ペプチドについて工程(5)で得られた存在比は、該ペプチドが由来するタンパク質の前記混合物中での存在比に等しいため、該存在比と、工程(3)における試料の混合比とから、混合物の調製に供された試料間での該タンパク質の量比を決定することができる。
本発明は更に、式(IV):
化合物の同定および重水素化率の算出はNMR又はMSを測定することで行った。
(2−1)装置
・NMR分析
日本電子株式会社製 フーリエ変換核磁気共鳴(NMR)装置
JNM−ECS400
・化学純度分析
GLサイエンス株式会社製 高速液体クロマトグラフィー(HPLC)装置
GL−7400シリーズ
・EI−MS分析
日本電子株式会社製 電子衝撃質量分析(EI−MS)装置
JMS−AX505W
(2−2)同定
・GC−MS測定による化合物の同定
重水素化されていない試料と13C標識された試薬についてGC−MSを測定して、13C標識に伴う分子量の変化を支持するデータが得られていることを確認することで行った。
・NMR測定による化合物の同定
D2Oを用いて試料を溶解し、観測されたピーク情報より確認を行った。13C標識された炭素に隣接するプロトンは大きくカップリングすることにより、13C標識部位の確認ができる。
(2−3)13C濃縮率の算出方法
重水素化されていない試料と13C標識された試薬について、同条件でGC−MSを測定して、得られたフラグメントのピーク強度比より算出した。
(2−4)化学純度分析
HPLC分析を行い、得られたピーク面積比より化学純度を算出した。
(3)試薬
東京化成工業株式会社製:一般試薬
大陽日酸株式会社製またはIsotec製:13C標識原料
化学純度:99.6%
1H−NMR(270MHz、D2O):δ:1.06(3H、t、J=7.7Hz)、1.27(6H、t、J=7.4Hz)、2.30(6H、s)、2.85(2H、q、J=7.7Hz)、3.07(4H、q、J=7.5Hz)
EI−MS:m/z for C13H21O+(M−CF3SO3)calculated 193.16、found 193.2
化学純度:99.6%
13C濃縮度:99.3atom%13C
1H−NMR(270MHz、D2O):δ:1.07(3H、t、J=7.7Hz)、1.28(6H、td、J=7.4Hz、5.1Hz)、2.31(6H、d、J=5.3Hz)、2.81(2H、q、J=7.7Hz)、3.08(4H、dt、J=14.2Hz、6.3Hz)
EI−MS:m/z for 13C2C11H21O+(M−CF3SO3)calculated 195.29、found 195.2
化学純度:99.9%
13C濃縮度:99.1atom%13C
1H−NMR(270MHz、D2O):δ:1.06(3H、ddd、J=127.8Hz、)、1.28(6H、t、J=7.3Hz)、2.31(6H、dd、J=129.8Hz、3.7Hz)、2.86(2H、dt、J=19.9Hz、6.8Hz)、3.08(4H、q、J=7.4Hz)
EI−MS:m/z for 13C4C9H21O+(M−CF3SO3)calculated 197.28、found 197.2
化学純度:98.8%
13C濃縮度:99.5atom%13C
1H−NMR(270MHz、D2O):δ:1.06(3H、ddt、J=128.5Hz、12.8Hz、4.7Hz)、1.27(6H,t,J=7.4Hz)、2.30(6H、dd、129.6Hz、5.9Hz)、2.85(2H、dm、J=129.6Hz)、3.07(4H、ddd、J=14.8Hz、7.3Hz、2.2Hz)
EI−MS:m/z for 13C6C7H21O+(M−CF3SO3)calculated 199.26、found 199.2
化学純度:99.8%
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EI−MS:m/z for 13C8C5H21O+(M−CF3SO3)calculated 201.25、found 201.2
化学純度:97.7%
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EI−MS:m/z for 13C10C3H21O+(M−CF3SO3)calculated 203.23、found 203.2
化学純度:99.3%
13C濃縮度:99.5atom%13C
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EI−MS:m/z for 13C12C1H21O+(M−CF3SO3)calculated 205.22、found 205.2
モデルタンパク質であるウシ血清アルブミン(BSA)およびヒト血清トランスフェリン(Tfn)をそれぞれPyII-0、PyII-6、PyII-12で標識し、全ての試料を下記の混合比で混合した。
SCX分画の条件は下記の通りである:
カラム : Poly Sulfoethyl A 4.6x100mm
溶離液 : A=10mM KH2PO4(pH2.8) 25%ACN
B=10mM KH2PO4(pH2.8) 25%ACN 1M KCl
システム : HPLC ELITE Lachrom(日立)
サンプルループ : 2mL、流速: 1mL/min
Detect : 220nm 、8min〜32minまで1min/Tube採取
ヒト血漿タンパク質(健常者および動脈硬化患者)をPyII試薬で標識した。健常者由来のタンパク質をPyII-0およびPyII-12で、動脈硬化患者由来のタンパク質をPyII-6で標識し、図6に示すプロトコルに従って分析した。また、上記検体についての分析結果を、既に実施済みのcICAT解析結果と比較してデータの妥当性を評価した。
以上から、Lys残基へのPyII導入率は高いことが確認された。
この実験にはヒト由来細胞株のHeLa細胞を1試料あたり106個用い、沈殿した細胞塊に100μLのCLSを加えて溶解し氷上に30分置いた後で15,000回転で20分間遠心して上清に全細胞タンパク質を回収した。これを2群準備し、両者のタンパク質量を等しくし、一方には緑色の蛍光色素のCy3を、もう一方には赤色のCy5を全タンパク質について平均2%位結合するように蛍光量を調節して結合させた。どのタンパク質のリジン残基も平均して2%程度が蛍光色素で標識されたことになる。両者を等量混合して2D-DIGE法で展開し、蛍光色素の分布をレーザー蛍光スキャナーで検出すると、多くの蛍光スポットが透明ゲル板上に検出された。Cy3とCy5は異なった蛍光特性をもつので、Cy3の蛍光とCy5蛍光を区別して見ることができた。両者の蛍光を重ねることも出来た。同じタンパク質をCy3とCy5で蛍光標識し混合して2次元電気泳動分離すると同じ位置にスポットを作り、蛍光が重ね合わさったスポットは混合色である黄色になった(図8の左図の右下の四角内のスポット)。Cy5で標識した方には更にPyII試薬による標識を行なった。即ち、CLS(pH9.6)に溶解したCy5標識タンパク質に対して10mMPyIIにより50℃で3時間標識した。PyII標識タンパク質に等量のPyII標識しないCy3標識タンパク質を混合し2次元電気泳動分離し、蛍光スキャナーで2色蛍光を検出した。両蛍光を重ね合わせた結果が図8の右図である。タンパク質の緑蛍光スポットはゲル一面に分布していた。各スポット近傍の分子量増大方向(上方向)に赤蛍光スポットの移動が認められる。しかも弱い蛍光(タンパク質の含量が低い)スポットでも近傍に赤蛍光が見られることから、PyII標識により分子量が増大したことを反映する結果と見られる。
以上から、PyII標識は、現在の標識法では細胞内蛋白質の多くを標識できる能力を持っていることが示された。
次に、官能基にフェニルホウ酸(PBA)を持つカラム(MonoSpin PBA、GLサイエンス)を用いて試料中のドーパミン−PyII化合物の精製を行った。試料をPBAに結合させ、アセトニトリル、次に100 mM リン酸K緩衝液pH 8.0、さらに0.5 %トリフルオロ酢酸含有5 %アセトニトリル溶液で洗浄してから、0.5 %トリフルオロ酢酸含有30 %アセトニトリル溶液で溶出した。溶出液を減圧遠心濃縮機により濃縮し、孔径0.22 μmのフィルター(DURAPORE PVDF 0.22μm、MILLIPORE)で濾過し、ナノLC/MSシステムにより分析を行った。
その結果を図9に示す。質量326.1から338.2に質量差約2で7種の化合物が生成しているのが確認された。
得られた結果をドーパミンとDHBAの比を縦軸として作図すると直線関係が得られた(図10)。従って、DHBAを内部標準としてPyIIによりドーパミンが定量できることが判明した。
LC条件は分離用カラムとしてモノリス型のMonoCap for FastFlow (0.05 mm IDx150mmL,GLサイエンス社)、トラップカラムとしてC18-Monolithトラップカラム(0.05mm IDx150mm L, GLサイエンス社)を用い、流量200 nl/分、移動層としてA)ギ酸/水/アセトニトリル(0.1:98:2)、B) ギ酸/水/アセトニトリル(0.1:2:98)からなるグラジエント溶出を行った(すなわち、A/B=98/2(0分)−2/98(50分)-2/98(50.1-70分)−98/2(70.1-90分))。
質量測定部設定は以下の通りである。イオン化モードはナノESI(正イオン化)、スプレー電圧は1600 V、検出器電圧は1950 V、カウンター窒素ガス量は0.8 L/分、スキャン範囲は100-500 m/zとし、質量分析の記録時間は50分とした。
今回測定した各々のPyII誘導体について、質量M/z値の示すイオンクロマトグラフを図12に、図12のピーク部分の質量スペクトルを図13に示している。測定した8種それぞれについて、単独のクロマトピークおよび理論値と一致した質量ピークが同定された。
本発明の同位体標識化合物はまた、複数試料(例、7種)中に含有されるアミノ基含有非ペプチド化合物を一斉に高感度で分析することを可能とする。更に、トラップカラムを用いた自動化により、フェムトモルレベルの高感度分析を24時間自動で行うことができる体制を構築し得る。
Claims (23)
- 式(I):
で表される化合物またはその塩。 - 式(I)において質量数13の炭素を1つ以上有する、請求項1記載の化合物またはその塩。
- 式(II):
(式中、黒丸で示された原子は、質量数13の炭素原子を示す。)で表されるPyII−0、PyII−2、PyII−4、PyII−6、PyII−8、PyII−10およびPyII−12からなる群から選択される1つの化合物である、請求項1記載の化合物またはその塩。 - 同位体標識により互いに異なる質量を有する2つ以上の式(I):
で表される化合物またはそれらの塩を標識化合物として含む、質量分析計を用いた生体試料中のアミノ基を含有する標的物質の定量用キット。 - 質量差が6以上である2つ以上の式(I)で表される化合物またはそれらの塩を含み、かつ標的物質がタンパク質である、請求項4記載のキット。
- 質量数13の炭素原子を含まない式(I)で表される化合物、
質量数13の炭素原子を6個有する式(I)で表される化合物、および
質量数13の炭素原子を12個有する式(I)で表される化合物
またはそれらの塩を含む、請求項5記載のキット。 - 式(III):
(式中、黒丸で示された原子は、質量数13の炭素原子を示す。)で表されるPyII−0、PyII−6およびPyII−12を含む、請求項6記載のキット。 - 質量差が2以上である2つ以上の式(I)で表される化合物またはそれらの塩を含み、かつ標的物質がアミノ基含有非ペプチド化合物である、請求項4記載のキット。
- 質量数13の炭素原子を含まない式(I)で表される化合物、
質量数13の炭素原子を2個有する式(I)で表される化合物、
質量数13の炭素原子を4個有する式(I)で表される化合物、
質量数13の炭素原子を6個有する式(I)で表される化合物、
質量数13の炭素原子を8個有する式(I)で表される化合物、
質量数13の炭素原子を10個有する式(I)で表される化合物、および
質量数13の炭素原子を12個有する式(I)で表される化合物
からなる群から選択される2つ以上の化合物またはそれらの塩を含む、請求項8記載のキット。 - 式(II):
(式中、黒丸で示された原子は、質量数13の炭素原子を示す。)で表されるPyII−0、PyII−2、PyII−4、PyII−6、PyII−8、PyII−10およびPyII−12からなる群から選択される2つ以上の化合物を含む、請求項9記載のキット。 - 質量分析計を用いて2以上の生体試料中のアミノ基を含有する標的物質を定量分析するための方法であって、
(1)分析に供する2以上の生体試料を調製する工程、
(2)試料間で標的物質に質量差を与えるように、同位体標識により互いに異なる質量を有する2つ以上の式(I):
で表される化合物またはそれらの塩を標識化合物として用いて調製した試料中の標的物質を標識する工程、
(3)標識に供された全ての試料から混合物を調製する工程、
(4)混合物を質量分析に供し、該標識により互いに質量差を有する標的物質について、質量スペクトルにおけるそれらのピーク強度の比に基づいて、該混合物中でのそれらの標的物質の存在比を求め、得られた存在比と工程(3)における試料の混合比とから、混合物の調製に供された試料間での該標的物質の量比を決定する工程
を含む、方法。 - 標的物質が、アミノ基を含有する非ペプチド化合物である、請求項11記載の方法。
- 標識化合物が、質量差が2以上である2つ以上の式(I)で表される化合物またはそれらの塩を含む、請求項12記載の方法。
- 標識化合物が、
質量数13の炭素原子を含まない式(I)で表される化合物、
質量数13の炭素原子を2個有する式(I)で表される化合物、
質量数13の炭素原子を4個有する式(I)で表される化合物、
質量数13の炭素原子を6個有する式(I)で表される化合物、
質量数13の炭素原子を8個有する式(I)で表される化合物、
質量数13の炭素原子を10個有する式(I)で表される化合物、および
質量数13の炭素原子を12個有する式(I)で表される化合物
からなる群から選択される2つ以上の化合物またはそれらの塩を含む、請求項13記載の方法。 - 標識化合物が、式(II):
(式中、黒丸で示された原子は、質量数13の炭素原子を示す。)で表されるPyII−0、PyII−2、PyII−4、PyII−6、PyII−8、PyII−10およびPyII−12からなる群から選択される2つ以上の化合物を含む、請求項14記載の方法。 - 工程(1)において調製された試料の一つが、既知濃度の標的物質を含有する内部標準試料であり、かつ、
工程(4)における存在比の決定が、内部標準試料以外の各試料由来の標的物質と、内部標準試料由来の標的物質とのピーク強度の比を求めることを含む、
請求項11記載の方法。 - 質量分析計を用いて2以上の生体試料中のタンパク質を定量分析するための方法であって、
(1)分析に供する2以上の生体試料を調製する工程、
(2)試料間で同一タンパク質に質量差を与えるように、同位体標識により互いに異なる質量を有する2つ以上の式(I):
で表される化合物またはそれらの塩を標識化合物として用いて調製した試料中のタンパク質を標識する工程、
(3)標識に供された全ての試料から混合物を調製する工程、
(4)混合物中のタンパク質を制限酵素により消化してペプチドを得る工程、
(5)得られたペプチドを質量分析に供し、該標識により互いに質量差を有するペプチドについて、質量スペクトルにおけるそれらのピーク強度の比に基づいて、該混合物中でのそれらのペプチドの存在比を決定する工程、および、
(6)存在比を決定されたペプチドについて、それが由来するタンパク質を特定し、該存在比および工程(3)における試料の混合比から、混合物の調製に供された試料間での該タンパク質の量比を決定する工程
を含む、方法。 - 標識化合物が、質量差が6以上である2つ以上の式(I)で表される化合物またはそれらの塩を含む、請求項17記載の方法。
- 標識化合物が、
質量数13の炭素原子を含まない式(I)で表される化合物、
質量数13の炭素原子を6個有する式(I)で表される化合物、および
質量数13の炭素原子を12個有する式(I)で表される化合物
またはそれらの塩を含み、3つの生体試料中のタンパク質を定量分析する、請求項18記載の方法。 - 標識化合物が、下記式(III):
(式中、黒丸で示された原子は、質量数13の炭素原子を示す。)で表されるPyII−0、PyII−6およびPyII−12を含む、請求項19記載の方法。 - 工程(1)において調製された試料の一つが、他の全ての調製された試料を混合して得られた内部標準試料であり、かつ、
工程(5)における存在比の決定が、内部標準試料以外の各試料由来のペプチドと、内部標準試料由来のペプチドとのピーク強度の比を求めることを含む、
請求項17記載の方法。 - 無水酸存在下で、3−エチル−3−ペンタノール又は3−エチル−2−ペンテンと無水プロピオン酸とを縮合し、式(I):
の化合物またはその塩を得ることを含む、式(I)の化合物またはその塩の製造方法。 - 式(IV):
(式中、Rは任意に置換されていてもよい任意の炭化水素基を示す。)で表される化合物(但し、ペプチド結合を有する化合物を除く。)またはその塩。
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