BRPI0717854A2

BRPI0717854A2 - Métodos para ligar covalentemente uma etiqueta de afinidade a uma proteína, para isolar peptídeos, para simultaneamente analisar a ocorrência de uma ou mais proteínas e, para identificar a presença de uma proteína em uma amostra de proteína, composto, conjunto de reagentes, uso de um composto ou do conjunto de reagentes marcadores, banco de dados de peptídeos, uso de banco de dados, e, dispositivo para análise e marcação por multiplexação de amostras de proteína

Info

Publication number: BRPI0717854A2
Application number: BRPI0717854-9A
Authority: BR
Inventors: Ralf Hoffmann; Helga Hummel; Volker Weiler
Original assignee: Koninkl Philips Electronics Nv
Priority date: 2006-11-06
Filing date: 2007-10-26
Publication date: 2013-10-29
Also published as: US8097463B2; WO2008056290A9; EP2086984A1; RU2009121557A; WO2008056290A1; JP2010509569A; CN101535316A; EP1921081A1; US20100041162A1

Description

"MÉTODOS PARA LIGAR COVALENTEMENTE UMA ETIQUETA DE AFINIDADE A UMA PROTEÍNA, PARA ISOLAR PEPTÍDEOS, PARA SIMULTANEAMENTE ANALISAR A OCORRÊNCIA DE UMA OU MAIS PROTEÍNAS E, PARA IDENTIFICAR A PRESENÇA DE UMA PROTEÍNA EM UMA AMOSTRA DE PROTEÍNA, COMPOSTO, CONJUNTO DE REAGENTES, USO DE UM COMPOSTO OU DO CONJUNTO DE REAGENTES MARCADORES, BANCO DE DADOS DE PEPTÍDEOS, USO DE BANCO DE DADOS, E, DISPOSITIVO PARA ANÁLISE E MARCAÇÃO POR MULTIPLEXAÇÃO DE AMOSTRAS DE PROTEÍNA" CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se aos métodos para a análise simultânea de amostras de proteína usando Espectroscopia de Massa, permitindo o isolamento seletivo de peptídeos de uma mistura de proteínas clivadas. A presente invenção adicionalmente se refere às técnicas para purificar peptídeos e análise de dados de dados de Espectrometria de Massa. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Para a análise de uma amostra de proteína complexa (uma amostra de tecido ou um fluido corporal tal como soro, ou urina) por métodos proteômicos, a amostra é geralmente clivada em peptídeos, os peptídeos são separados e analisados por Espectrometria de Massa. O maior problema a ser superado em uma tal abordagem "shotgun" é a redução em complexidade da mistura de peptídeos clivados. Pela digestão das proteínas com proteases com o propósito de se obterem fragmentos adequados para a análise pela instrumentação de Espectrometria de Massa correntemente usada (faixa de análise ótima das máquinas está dentro da ordem de 2.000 - 4.000 m/z), o número de moléculas a serem analisadas é dramaticamente aumentado comparado com a amostra original. Visto que peptídeos diferentes na mistura originam-se da mesma proteína parental sob clivagem, a análise de todos estes peptídeos pode em alguns casos ser redundante. Por outro lado, a análise dos vários peptídeos correspondendo à mesma proteína pode servir como uma confirmação adicional na identificação da proteína parental.

Em algumas análises, entretanto, não é necessário que todos os peptídeos originários de uma proteína sejam analisados. Um ou uns poucos peptídeos são muitas vezes suficientes para identificar uma certa proteína em uma amostra. Para reduzir o número de peptídeos após a clivagem, grupos funcionais diferentes de aminoácidos têm sido usados para seletivamente isolar ou marcar peptídeos específicos. Grupos funcionais que têm sido descritos como adequados para este propósito são o grupo tiol de Cisteína, o grupo carboxila de Ácido Aspártico, Ácido Glutâmico e a terminação carboxila, os grupos amina de Lisina e a terminação amina dos próprios peptídeos.

Cisteína é muitas vezes usada como grupo funcional em proteômica para o isolamento ou a marcação seletiva de peptídeos. Ela ocorre em cerca de 85 % de todas as proteínas e em média ocorre com uma freqüência de cerca de 2 a 3 % dentro de um polipeptídeo. Conseqüentemente, análise de apenas os peptídeos contendo Cisteína de uma amostra de proteína tem sido considerada como adequadamente representativa da coleção inteira de proteína. Ademias, o grupo tiol de Cisteína não ocorre em qualquer outro aminoácido, permitindo a etiquetação ou marcação específica. Uma desvantagem entretanto é que os resíduos de Cisteína dentro de uma proteína muitas vezes formam pontes de dissulfeto, que contribuem para a estrutura terciária ou quaternária de uma proteína e assim estão muitas vezes presentes em pares. O uso de Cisteína para a marcação de peptídeos portanto marcará muitas vezes pelo menos dois peptídeos da mesma proteína, resultando na geração de informação redundante. Além disso, resíduos de Cisteína estão muitas vezes localizados em domínios de uma proteína que contribuem para a estrutura da proteína. Tais domínios estão muitas vezes conservados entre proteínas com função diferente. Conseqüentemente, identificação inequívoca de uma proteína baseada em um seu peptídeo contendo Cisteína pode ser difícil. Uma outra desvantagem da Cisteína é que, embora a ocorrência de Cisteína em proteínas seja relativamente alta, sua distribuição é um pouco desigual. Embora existam numerosas proteínas ricas em Cisteína, nem todas as proteínas contêm Cisteína (e.g. proteínas ribossomais). Assim algumas proteínas serão negligenciadas pela marcação ou etiquetação Cisteína- direcionada enquanto que outras serão excessivamente representadas. Finalmente, durante manipulação de uma amostra, resíduos de Cisteína podem se tornar oxidados. Tais aminoácidos oxidados. Tais aminoácidos oxidados não podem mais ser usados para a marcação ou etiquetação específica de tiol.

O grupo imidazol de Histidina, outro grupo funcional singular em proteínas, é amplamente usado para cromatografia de afinidade, baseado em sua afinidade inerente por metal, mas tem sido raramente usado como um alvo para modificação de proteína.

Biomoléculas Histidina-marcadas, tipicamente

compreendendo uma cauda de 6 resíduos de Histidina são purificadas por cromatografia de afinidade por íon de metal imobilizado (IMAC). Proteínas com uma seqüência naturalmente ocorrente ou artificialmente adicionada compreendendo múltiplas Histidinas, Cisteínas ou Triptofanos na configuração correta podem ser ligadas em uma matriz de coluna contendo íons de metal quelados covalentemente ligados. Mais comumente, cromatografia de quelato de Ni é usada como uma matriz em cromatografia de afinidade para purificar proteínas recombinantes que têm sido expressadas como proteínas de fusão com uma ou mais etiquetas His6 na terminação-N ou -C da proteína. Tipicamente, os íons níquel são ligados na matriz de coluna via grupos nitrilotriacetato e interagem com os resíduos de Histidina na proteína selecionada em troca por água. Eluição é ocasionada quer usando um gradiente de concentração crescente de imidazol, quer em procedimento em etapas. À parte do Ni2+ outros íons de metal são interessantes para MAC tais como Cu2+, Zn2+, Co2+, Fe3+, Hg2+.

O uso de IMAC para a seleção de peptídeos contendo Histidina de digestos trípticos é revisto em Mirzaei & Regnier (2005) J. Chrom. 5 817, 23-34. O uso de ácido aril-borônico para copular películas diagnosticas em anticorpos via o grupo imidazol é descrito em W02006064451, que é baseado em uma reação catalisada por cobre descrita em Collman et ai. (2001) J. Org. Chem. 66,1528-1531 (veja Figura 1). Ácido borônico é conhecido no campo médico como um reagente que covalentemente se liga em grupos cis-diol de açúcares acima de pH 8,0. O uso de peptídeos modificados com Ácido Borônico é descrito para a inibição de serina proteases.

W003/008547 e W002/099077 descrevem moléculas de

etiquetação compreendendo ácido aril borônico como sítio de ancoragem para ancorar a etiqueta a uma fase sólida, por exemplo, um suporte de resina. As moléculas de etiquetação descritas nestes documentos adicionalmente compreendem um grupo reativo a proteína, que podem reagir com certos grupos funcionais em proteína. Estes documentos entretanto são em relação à marcação específica de peptídeos contendo histidina.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona ferramentas e métodos para covalentemente etiquetar e opcionalmente marcar e seletivamente isolar peptídeos contendo Histidina de misturas de proteínas complexas antes de aplicá-las em análise subseqüente por técnicas de separação como cromatografia líquida seguida por análise espectrométrica de massa.

Uma vantagem proporcionada pelos métodos e ferramentas da presente invenção é que pelo isolamento de peptídeos contendo Histidina após clivagem proteolítica de uma amostra de proteína, cada proteína é representada por um número limitado de peptídeos, acarretando uma redução forte em complexidade da amostra a ser analisada, mas sem perda de informação significativa com respeito ao teor de proteína da amostra de

segue-se a página 4a 4a proteína original.

Outra desvantagem dos métodos e ferramentas da presente invenção é que os peptídeos contendo Histidina de todas as proteínas do proteoma são conhecidos (ou podem ser deduzidos) para aqueles organismos dos quais o genoma tem sido seqüenciado (e.g. homem, e numerosos organismos modelos tal como camundongo e rato). Os pesos moleculares exatos destes peptídeos podem ser preditos, os quais podem ser usados para confirmar a identificação do peptídeo gerando um sinal em MS e

segue-se a página 5 opcionalmente a identificação da proteína parental.

Aspectos particulares e preferidos da invenção são descritos nas reivindicações dependentes e independentes acompanhantes. Características das reivindicações dependentes podem ser combinadas com características das reivindicações independentes e com características de outras reivindicações dependentes conforme o caso e não meramente como explicitamente descrito nas reivindicações.

O primeiro aspecto da invenção refere-se a um método da invenção relates to a método de covalentemente ligar uma etiqueta de afinidade em uma proteína ou um peptídeo compreendendo uma Histidina. Este método compreende a etapa de:

contactar a proteína ou o peptídeo com um reagente etiquetador que é um composto com a estrutura geral (I):

(D

sendo que A é uma etiqueta de afinidade, B é boro e L é um ligante opcional, na presença de um catalisador de cobre.

De acordo com uma modalidade deste método, o composto tendo estrutura geral (I) está adicionalmente substituído no anel aromático com um halogênio, um grupo alcoxila ou um grupo alquila.

Em modalidades específicas dos métodos da invenção, a etiqueta de afinidade A é biotina.

De acordo com uma modalidade particular deste método, o reagente etiquetador é um composto que é uma molécula com fórmula (II):

(II)

De acordo com outra modalidade particular deste método, o reagente etiquetador é um composto com fórmula (III):

(111)

De acordo com uma outra modalidade dos métodos da presente invenção, o reagente etiquetador tendo a fórmula geral (I) mais particularmente os reagentes etiquetadores tendo uma fórmula estrutural geral correspondendo a (II) ou (III), adicionalmente compreende uma marcação. De acordo com uma modalidade particular, a marcação presente nos reagentes etiquetadores consiste de um ou mais isótopos de átomo pesado.

Um outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para isolar peptídeos contendo Histidina de uma amostra de proteína ou uma mistura de amostras de proteína reunidas compreendendo as etapas de: (a) clivar as proteínas intactas na(s) amostra(s) de proteína com um agente clivador em peptídeos, (b) contactar a(s) amostra(s) de proteína com um reagente etiquetador aril-borônico tendo a fórmula estrutural geral (I),

(!)

sendo que A é uma etiqueta de afinidade, B é boro, e L é um ligante opcional, na presença de um catalisador de cobre, de modo a permitir a reação do reagente etiquetador aril-borônico com Histidina onde presente nos peptídeos; (c) ligar os peptídeos etiquetados em uma matriz de afinidade via a etiqueta de afinidade; e (d) remover os peptídeos etiquetados ligados da matriz de afinidade para obter peptídeos isolados contendo Histidina. De acordo com modalidades particulares dos métodos de

acordo com este aspecto da invenção, etapa (b) é realizada antes/depois da etapa (a) e o reagente etiquetador aril-borônico é contactado com proteína(a) não-clivada(s) na(s) amostra(s), resultando em uma etiquetação de Histidina onde presente nas proteínas.

Um outro aspecto da presente invenção proporciona métodos para simultaneamente analisar a ocorrência de uma ou mais proteínas compreendendo Histidina em amostras diferentes, que compreende as etapas de:

a) opcionalmente clivar as proteínas intactas na(s) amostra(s) com um agente clivador em peptídeos, b) contactar cada uma das amostras com um de um conjunto

de reagentes marcadores aril-borônicos na presença de um catalisador de cobre, por meio do qual os reagentes marcadores aril-borônicos têm a fórmula estrutural geral (I),

(D

sendo que A é uma etiqueta de afinidade, B é boro, e L é um

ligante opcional, e sendo que cada um dos reagentes aril-borônicos do conjunto adicionalmente compreende uma marcação que é uma marcação isotópica ou isobárica, de tal modo que a estrutura de cada um dos reagentes marcadores é essencialmente a mesma,

c) reunir as amostras diferentes para obter uma mistura de

amostra de peptídeo ou polipeptídeo,

d) seletivamente isolar os peptídeos ou polipeptídeos marcados da mistura de amostra de peptídeo ou polipeptídeo via a etiqueta de afinidade, e

e) analisar os peptídeos ou polipeptídeos marcados isolados por Espectrometria de Massa de modo a determinar a ocorrência de cada um

dos polipeptídeos marcados. Por meio do qual a ocorrência do polipeptídeo marcado é representativa da ocorrência da proteína correspondente na amostra.

métodos para identificar a presença de uma proteína em uma amostra de proteína compreendendo as etapas de:

amostra de proteína pelo contato das proteínas com um reagente marcador com a estrutura geral (I):

sendo que A é uma etiqueta de afinidade, B é boro e L é um ligante opcional, na presença de um catalisador de cobre,

b) clivar as proteínas na amostra de proteína em peptídeos com um agente clivador,

c) isolar destes peptídeos os peptídeos contendo Histidina, via a etiqueta de afinidade,

d) purificar os peptídeos isolados contendo Histidina por uma ou mais etapas de purificação de peptídeo, de modo a obter os peptídeos purificados contendo Histidina,

e) determinar ou calcular pelo menos uma propriedade físico- química, diferente da massa, dos peptídeos purificados contendo Histidina,

f) determinar a massa dos peptídeos isolados e purificados contendo Histidina em MS, e

g) comparar, para cada peptídeo isolado e purificado compreendendo Histidina, a massa e a pelo menos uma outra propriedade físico- química com um banco de dados compreendendo a massa e uma ou mais propriedades físico-químicas de todos peptídeos contendo Histidina gerados pelo agente clivador, de modo a identificar a proteína parental correspondente do

Ainda um outro aspecto da presente invenção proporciona

a) modificar a função amina de Histidina das proteínas na

(!) peptídeo purificado compreendendo Histidina, identificando desta maneira a presença da proteína parental na amostra de proteína.

De acordo com uma modalidade deste método, etapa (g) compreende identificar para cada um dos peptídeos isolados e purificados contendo Histidina, um ou mais peptídeos contendo Histidina no banco de dados com uma massa correspondendo à massa do peptídeo isolado e purificado contendo Histidina, e, quando mais do que um peptídeo são identificados para um peptídeo isolado e purificado contendo Histidina, comparar pelo menos um outro parâmetro físico-químico do peptídeo isolado e purificado contendo Histidina com aqueles de mais do que um dos peptídeos identificados no banco de dados.

De acordo com outra modalidade deste método, a amostra de proteína é de uma espécie e o banco de dados compreende a massa e pelo menos uma outra propriedade físico-química de todos os peptídeos contendo Histidina daquela espécie gerados pelo agente clivador.

De acordo com uma modalidade, o método descrito acima é usado para a identificação simultânea de uma proteína em duas ou mais amostras e o método compreende:

-em etapa (a) realizar a modificação para cada uma das amostras com um de um conjunto de reagentes etiquetadores compreendendo um componente de marcação diferencial,

-uma etapa adicional de reunir as duas ou mais amostras antes

da etapa (d),

-antes da etapa (f), a etapa de identificar a natureza da marcação de modo a identificar a amostra da qual o peptídeo se origina.

De acordo com modalidades particulares dos métodos descritos acima, a pelo menos uma propriedade físico-química é determinada durante a uma ou mais etapas de purificação de peptídeo.

Mais particularmente, a presente invenção proporciona modalidades dos métodos descritos acima nas quais a pelo menos uma propriedade físico-química é selecionada do grupo consistindo de pi, tempo de retenção durante cromatografia em fase inversa e a taxa de absorção de UV em 280 e 214 nm.

Ainda um outro aspecto da presente invenção proporciona reagentes etiquetadores para etiquetar Histidina em uma proteína ou um peptídeo, os compostos tendo a estrutura geral (I):

OH

ZTVb (D

A-(L)-V / "

V ^=/ OH

sendo que A é uma etiqueta de afinidade selecionada do grupo consistindo de biotina ou uma molécula derivada de biotina, maltose, uma lectina, um hapteno ligante em anticorpos específicos para hapteno, e glutationa, B é boro e L é um ligante opcional.

Em modalidades particulares dos reagentes etiquetadores, o anel aromático de estrutura (I) está adicionalmente substituído com um halogênio, um grupo alcoxila ou um grupo alquila.

Em outra modalidade, a etiqueta de afinidade A no composto é

biotina.

Em uma modalidade particular, os reagentes etiquetadores da presente invenção têm a estrutura de fórmula (II):

(li)

v v NH B'

I

-S

Em outra modalidade particular, os reagentes etiquetadores da presente invenção têm a estrutura de fórmula (III):

(Ill) Modalidades particulares dos reagentes etiquetadores da presente invenção adicionalmente compreendem um componente marcador, mais particularmente, um componente marcador consistindo de um ou mais isótopos pesados. Mais particularmente, os reagentes etiquetadores têm a estrutura geral de formula (I), pode meio da qual um ou mais átomos de carbono e/ou um ou mais átomos de hidrogênio no ligante (L) entre a etiqueta

13 f *

de Afinidade e o grupo aril-borônico são substituídos por C ou deuténo respectivamente. Em uma outra modalidade, o reagente etiquetador da presente invenção tem a estrutura geral de fórmula (III), por meio da qual um ou mais átomos de carbono e/ou um ou mais átomos de hidrogênio no ligante

13

entre o grupo biotina e o grupo aril-borônico estão substituídos por C ou deutério respectivamente.

Ainda um outro aspecto da presente invenção refere-se a um conjunto de reagentes marcadores para análise por Espectrometria de Massa de polipeptídeos, sendo que todos os reagentes marcadores no conjunto possuem uma estrutura química idêntica (I) como descrito, e sendo que cada reagente marcador no conjunto tem um componente marcador isotópico singular.

Em uma modalidade dos conjuntos de reagentes marcadores da invenção, os reagentes marcadores individuais do conjunto têm uma estrutura de acordo com formula (III): na qual um ou mais átomos de carbono e/ou um ou mais átomos de hidrogênio no ligante entre o grupo biotina e o grupo aril-borônico estão substituídos por 13C e deutério respectivamente.

O

(III)

Um outro aspecto da presente invenção refere-se ao uso de um reagente marcador e reagentes etiquetadores e marcadores combinados descritos acima para etiquetação e marcação (diferencial) de proteínas.

Um outro aspecto da presente invenção proporciona um banco de dados de peptídeos de proteínas contendo Histidina de um organismo clivadas in silico por um agente clivador sendo que cada peptídeo é caracterizado por um identificador de proteína, sua composição de aminoácido e sua massa, sendo que a massa é a massa do peptídeo não modificado ou a massa do peptídeo após modificação ou marcação.

Em uma modalidade dos bancos de dados proporcionados na presente invenção, peptídeos no banco de dados com uma seqüência diferente e a mesma massa são adicionalmente caracterizados por pelo menos um parâmetro físico-químico do peptídeo diferente de sua massa.

Em outra modalidade, os bancos de dados da presente invenção, são bancos de dados de peptídeos contendo Histidina de proteínas de um organismo clivadas in silico por um agente clivador que é tripsina.

Ainda outro aspecto da presente invenção refere-se ao uso de um banco de dados como descrito acima para a identificação de proteínas.

Ainda outro aspecto da presente invenção refere-se a um dispositivo (100) para marcação por multiplexação e análise de amostras de proteína compreendendo pelo menos uma fonte de amostras (101), uma unidade de etiquetação e marcação (103) e correspondendo às fontes de reagentes etiquetadores/marcadores (104) para os reagentes aril-borônicos da presente invenção, uma unidade de clivagem de proteína (105), uma unidade de separação por afinidade (106) uma unidade de separação (107), uma unidade de espectrômetro de massa (109) e uma unidade de análise de dados (110) conectada com banco de dados anotado (112) de peptídeos compreendendo Histidina clivados in silico.

Em uma modalidade, o dispositivo adicionalmente compreende uma unidade de separação de amostra (102) e/ou uma unidade de análise (108) para determinar uma ou mais propriedades físico-químicas dos peptídeos purificados na unidade de separação (107).

As acima e outras características, aspectos e vantagens da presente invenção se tornarão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada, tomada conjuntamente com os desenhos acompanhantes, que ilustram, por meio de exemplo, os princípios da invenção. Esta descrição é dada no interesse de apenas exemplificar, sem limitar o escopo da invenção. Os Números de referência citados abaixo referem-se aos desenhos anexados. DESCRIÇÃO BREVE DOS DESENHOS

Fig. 1 mostra a reação de ácido aril-borônico com imidazol na presença de um catalisador de cobre de acordo com Collman et al. citado acima.

Fig. 2 mostra de acordo com uma modalidade particular da presente invenção a reação catalisada por cobre de um reagente aril-borônico marcador com Histidina presente em um polipeptídeo como exemplificado em exemplo 2.

Fig. 3 demonstra de acordo com uma modalidade particular da presente invenção um método para o isolamento seletivo de peptídeos contendo Histidina de uma solução de proteína. (1): desnaturação de proteína; (2): clivagem proteolítica em peptídeos N-terminais (a), internos (b) e C- terminais (c); (3): reação com um reagente marcador reativo a Histidina; (4) copulação de peptídeos etiquetados a etiqueta de afinidade (seta cinza) em um suporte sólido com um reagente de captura (seta preta).

Fig. 4 demonstra a análise simultânea de múltiplas amostras usando reagentes marcadores reativos à Histidina compreendendo um componente marcador isotópico de acordo com modalidades particulares da presente invenção.

Fig. 5 mostra de acordo com uma modalidade particular da presente invenção um dispositivo (100) para análise por multiplexação de 4 amostras de proteína, compreendendo pelo menos quatro fontes de amostra (101), uma unidade de preparação de amostra (102), uma unidade de marcação (103) com fontes de reagente marcador (104), uma unidade de clivagem de proteína (105) uma unidade de purificação por afinidade (106) (e.g. sistema de cromatografia de afinidade por avidina), uma unidade de separação (107) compreendendo dois sistemas de separação consecutivamente acoplados (1107) e (2107), uma unidade de espectrômetro de massa (109) e uma unidade de controle e de circuito de análise e de análise de dados (111) acoplada em um sistema de leitura (112). Unidade (108) é uma unidade de análise para determinar propriedades físico-químicas de peptídeos purificados em unidade (107) e unidade (110) compreende um banco de dados anotado de peptídeos contendo Histidina, (linhas tracejadas indicam a aquisição de dados experimentais e in silico).

Fig. 6 mostra a síntese dos reagentes etiquetadores de acordo com uma modalidade particular da presente invenção baseada na reação de biotina NHS-funcionalizada com um ácido m-amino-fenil-borônico como exemplificado em exemplo 1.

Fig. 7 mostra de acordo com uma modalidade particular da presente invenção os espectros em IR de reagentes e da mistura reacional na síntese descrita em Exemplo 1.

Fig. 8 mostra em painel A a copulação mediada por EDC de biotina em ácido m-amino-fenil-borônico de acordo com uma modalidade particular da presente invenção e em painel B o esquema de reação detalhado da reação geral como mostrado em painel A no qual o grupo biotina é substituído por círculos pretos.

Fig. 9 mostra de acordo com uma modalidade particular da presente invenção a reação catalisada por cobre do reagente etiquetador com um peptídeo compreendendo Histidina como exemplificado em exemplo 2. DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES

A presente invenção será descrita com respeito às modalidades particulares e com referência a certos desenhos mas a invenção não é para ser limitada aos mesmos mas apenas pelas reivindicações. Quaisquer sinais de referência nas reivindicações não devem ser entendidos como limitantes do escopo. Os desenhos descritos são apenas esquemáticos e não são limitantes. Nos desenhos, o tamanho de alguns dos elementos pode estar exagerado e não desenhado em escala para propósitos ilustrativos. Onde o termo "compreendendo" é usado na presente descrição e nas reivindicações, ele não exclui outros elementos ou etapas. Onde um artigo definido ou indefinido é usado quando se refere a um substantivo singular por exemplo "um", "uma", "o" ou "a", este não exclui um plural daquele substantivo a não ser que alguma outra coisa seja especificamente declarada.

Ademais, os termos primeiro, segundo, terceiro e semelhantes na descrição e nas reivindicações, são usados para distinguir entre elementos similares e não necessariamente para descrever uma ordem seqüencial ou cronológica. É para ser entendido que os termos assim usados são intercambiáveis sob circunstâncias apropriadas e que as modalidades da invenção aqui descritas são capazes de operação em seqüências diferentes das aqui descritas ou ilustradas.

Os seguintes termos ou definições são fornecidos apenas para auxiliar no entendimento da invenção. Estas definições não devem ser entendidas como tendo um escopo menor do que o entendido por uma pessoa ordinariamente experiente na arte.

O termo "polipeptídeo" ou "proteína", como aqui usado, refere-se a uma pluralidade de aminoácidos naturais ou modificados conectados via uma ligação peptídica. O comprimento de um polipeptídeo pode variar de 2 a vários milhares de aminoácidos (o termo assim também inclui o que é geralmente chamado de oligopeptídeos). Incluídos dentro deste escopo estão os polipeptídeos compreendendo um ou mais aminoácidos que são modificados por modificações de pós-tradução in vivo tais como glicosilação, fosforilação, etc. e/ou compreendendo um ou mais aminoácidos que têm sido modificados in vitro com agentes modificadores de proteína (e.g. agentes de alquilação).

O termo "fragmento de polipeptídeo" ou "peptídeo" como aqui usado é utilizado para se referir à seqüência de aminoácidos obtida após clivagem de uma proteína ou de um polipeptídeo. Um fragmento de polipeptídeo ou peptídeo não é limitado em tamanho ou natureza.

Os termos "interno", "amino-terminal" e "carbóxi-terminal" quando se referem a um peptídeo são aqui usados para se referirem à localização correspondente de um peptídeo em uma proteína ou em um polipeptídeo. Por exemplo, em uma clivagem tríptica de proteína NH2-X1-K- X2-R-X3-K-X4-COOH (sendo que X1, X2, X3 e X4 são seqüências de peptídeo de comprimento indiferente sem Lisina (K) ou Arginina (R)), o peptídeo amino-terminal és NH2-X1-K-COOH, os peptídeos internos são NH2-X2-R- COOH e NH2-X3-K-COOH e o peptídeo carbóxi-terminal é NH2-X4-COOH.

O termo "clivagem de proteína" como aqui usado refere-se à hidrólise de uma ligação peptídica entre dois aminoácidos em um polipeptídeo. Esta inclui hidrólise tanto química quanto enzimática. Conseqüentemente o termo "agente clivador" como aqui usado refere-se a um composto capaz de hidrolisar uma ligação peptídica entre dois aminoácidos em um polipeptídeo ou peptídeo.

O termo "proteína parental" refere-se a uma proteína não- clivada da qual um peptídeo clivado é derivado.

O termo "fragmentação" como aqui usado refere-se à quebra de uma ou mais ligações químicas e subseqüente liberação de uma ou mais partes de uma molécula como obtida e.g. por dissociação induzida por colisão (CID) em análise de Espectrometria de Massa (MS) em Tandem ou MS/MS.em certas modalidades a ligação é uma ligação peptídica, mas não é limitada à mesma. O termo "grupo reativo à proteína/peptídeo (PRG)" como aqui usado refere-se a uma função química em um composto (e.g. um reagente marcador) que é capaz de reagir com um grupo funcional em um aminoácido de uma proteína ou de um peptídeo resultando na ligação (covalente ou não- covalente) de tal composto no aminoácido. A presente invenção fornece moléculas de ácido aril-borônico de acordo com a estrutura descrita abaixo como grupos reativos a proteína/peptídeo com o grupo funcional de um aminoácido Histidina.

O termo "etiqueta" ou "etiqueta de afinidade" como aqui usado refere-se a uma estrutura química que pode ser covalentemente ligada em um peptídeo ou polipeptídeo, e que, baseado em sua interação específica com outra estrutura química, pode ser usado para isolar o peptídeo ou polipeptídeo no qual está ligado de uma mistura. Conseqüentemente, o termo "reagente marcador" como aqui usado compreende a etiqueta não-ligada, antes da reação com uma proteína ou um peptídeo, e compreende um grupo reativo à proteína /peptídeo para ligação covalente da etiqueta em uma proteína ou um peptídeo. Nos reagentes etiquetadores da presente invenção, o grupo reativo à proteína/peptídeo (PRG) é um ácido aril-borônico que reage com Histidina.

O termo "marcador" como aqui usado refere-se a uma estrutura química que está ou pode estar covalentemente ligada em um peptídeo ou polipeptídeo e que, baseado em suas propriedades particulares é detectável em um espectrômetro de massa, ou por métodos ópticos. Geralmente o termo "marcador" será usado para se referir à molécula como presente no polipeptídeo ou peptídeo, e o termo "reagente marcador" é usado para se referir à combinação do componente marcador e o grupo reativo à proteína/peptídeo. O componente marcador (i.e. parte do reagente marcador gerador da marcação) pode ser incorporado ao grupo reativo à proteína/peptídeo do reagente marcador ou pode ser uma estrutura química separada dentro, ou ligada no, grupo reativo à proteína. Onde um reagente marcador de acordo com a presente invenção compreende um componente marcador este reagente pode ser usado como um reagente marcador e será chamado como tal.

O termo "massa" na presente invenção refere-se à razão de massa-para-carga (m/z). A abreviação m/zé usada para denotar a quantidade adimensional formada pela divisão do número de massa de um íon pelo seu número de carga. A "massa monoisotópica" refere-se à massa do íon contendo apenas os isótopos mais abundantes. "Massa média" refere-se à massa de uma partícula ou molécula de dada fórmula empírica calculada usando pesos atômicos para cada elemento.

Os termos "marcadores isotópicos" e "reagentes marcadores isotópicos" como aqui usados referem-se a um conjunto de marcadores e reagentes marcadores tendo a mesma fórmula química mas diferindo uns dos outros no número e/ou tipo de isótopos presentes de um ou mais átomos, resultando em uma diferença em massa em MS. Assim, peptídeos idênticos marcados com marcadores isotópicos diferentes podem ser diferenciados como tais em MS baseado em diferença em massa. Embora marcadores isobáricos (veja abaixo) em princípio constituam um tipo específico de marcadores isotópicos, no contexto da presente invenção, o termo marcador isotópico será usado para se referir aos marcadores que não são isobáricos, mas podem como tais ser diferenciados baseado em seu peso molecular sem fragmentação.

Os termos "marcadores isobáricos" e "reagentes marcadores isobáricos" como aqui usados referem-se a um conjunto de marcadores tendo a mesma estrutura, e a mesma massa, que sob fragmentação liberam um fragmento particular com a mesma estrutura para todos os marcadores isobáricos daquele conjunto, que difere em massa entre os marcadores isobáricos individuais naquele conjunto, devido a uma contribuição diferencial de isótopos dentro dos marcadores isobáricos. Marcadores isobáricos tipicamente compreendem um grupo repórter (RG), que é um fragmento relativamente pequeno e um grupo de balanço (BG). A "massa combinada" de um conjunto de marcadores isobáricos refere-se à massa total do grupo repórter e o grupo de balanço refere-se àquele conjunto de marcadores isobáricos.

O termo "grupo funcional" como aqui usado refere-se a uma função química em um aminoácido, que pode ser usado para ligar (geralmente, ligação covalente) em um composto químico. Grupos funcionais podem estar presentes na cadeia lateral de um aminoácido ou na terminação- amino ou terminação-carboxila de um polipeptídeo ou peptídeo. O termo inclui ambos grupos funcionais que estão naturalmente presentes em um peptídeo ou polipeptídeo e aqueles introduzidos via e.g. uma reação química usando agentes modificadores de proteína.

Um aspecto da invenção refere-se aos reagentes etiquetadores que são compostos compreendendo um grupo reativo à proteína reagindo com o grupo funcional imidazol de Histidina e compreendendo uma etiqueta de afinidade. Mais particularmente, o PRG que reage com Histidina é um ácido aril-borônico substituído ou não-substituído.

Os reagentes da presente invenção são geralmente referidos aos ácidos aril-borônicos substituídos, tendo uma estrutura geral (I):

sendo que A é uma etiqueta de afinidade, B é boro, e L é um ligante opcional.

O grupo A-(L)- no benzeno pode estar em posição orto, meta ou para em relação a B(OH)2.

invenção, as posições restantes do grupo benzeno, estão substituídas com um

(!)

25

Em modalidades particulares dos reagentes da presente ou mais substituintes independentemente selecionados do grupo consistindo de uma alquila (e.g. metila, etila, propila), um halogênio (e.g. F), uma alcoxila (e.g. metoxila), ou um grupo funcional tal como um grupo carboxila, um grupo amino ou um tiol.

A preparação dos reagentes da invenção é realizada de acordo com métodos comumente conhecidos em química orgânica para a preparação de reagentes marcadores de proteína. Tipicamente isto é garantido pela reação de (ou ácidos alquil-aril-borônicos) compreendendo um grupo funcional adicional (e.g. grupo amino) com uma etiqueta de afinidade ou um ligante trazendo um grupo funcional capaz de reagir com o grupo funcional no ácido aril-borônico de modo a resultar em uma ligação covalente. A preparação de numerosos compostos é ilustrada na seção de exemplos. Os reagentes etiquetadores da presente invenção garantem a ligação de uma etiqueta de afinidade (A) em uma proteína ou peptídeo cuja etiqueta pode ser usada para isolamento seletivo das proteínas ou dos peptídeos nas(os) quais a etiqueta está ligada

A natureza da etiqueta de afinidade nos compostos e métodos da presente invenção não é crítica. Exemplos típicos de etiquetas de afinidade bem estabelecidas incluem d-biotina (ou moléculas derivadas de biotina), maltose e outro açúcar/ligação de açúcar, hapteno ligando em anticorpos específicos para hapteno, e glutationa. Outras modalidades de etiquetas de afinidade úteis no contexto da presente invenção são detalhadas abaixo.

Etiquetas de afinidade podem ser volumosas e podem exigir a presença de um ligante L entre o PRG e a etiqueta de afinidade. O ligante L pode ser uma estrutura molecular servindo apenas para este propósito (i.e. distanciar a etiqueta de afinidade do grupo reativo à proteína para evitar interferência) ou pode ao mesmo tempo compreender todos ou parte dos componentes marcadores (como detalhados abaixo). Adicional ou alternativamente o ligante pode dar uma ligação clivável entre a etiqueta de afinidade e o resto do composto (também detalhado abaixo).

Uma modalidade particular da presente invenção fornece os reagentes etiquetadores como descritos acima, que, em adição compreendem um componente marcador. Mais especificamente um conjunto de dois ou mais reagentes etiquetadores é fornecido cada reagente marcador dentro do conjunto compreendendo um de um conjunto de componentes marcadores para marcação diferencial de proteínas ou peptídeos em Espectrometria de Massa. De acordo com esta modalidade, os reagentes etiquetadores da presente invenção são chamados de reagentes marcadores.

De acordo com uma modalidade, os reagentes marcadores da presente invenção compreendem como um componente marcador, um grupo que é detectável por métodos ópticos e.g. adsorve luz visível ou UV, ou é fluorescente ou fosforescente.

De acordo com modalidade particular contido, os reagentes marcadores da presente invenção compreendem um componente marcador, que é um componente marcador isotópico (i.e. um componente marcador pertencendo a um conjunto de componentes marcadores isotópicos). Conseqüentemente, o uso de tais reagentes marcadores isotópicos permite a identificação de peptídeos diferentemente marcados dentro de uma mistura de peptídeos reunidos.

De acordo com uma modalidade, os componentes marcadores isotópicos nos reagentes marcadores isotópicos da presente invenção compreendem uma estrutura molecular adicional na qual, em cada componente marcador, um ou mais átomos estão substituídos com um isótopo estável, de modo a gerar dois ou mais compostos com a mesma fórmula química, mas que são isotopicamente distinguíveis baseado em sua diferença em massa. Por exemplo, qualquer um ou mais dos átomos de hidrogênio, nitrogênio, oxigênio ou enxofre no componente marcador isotópico pode ser

•2 13 15 17 18

substituído por seus isótipos isotopicamente estáveis H, ,JC, ,JN, "O, 1O ou 34S, respectivamente. Por exemplo, hidrogênio é substituído por deutério ou carbono 12C é substituído por 13C. Usando um ou mais dos isótopos acima, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, ou um número ainda maior de componentes marcadores isotópicos pode ser gerado, cada um tendo a mesma estrutura mas com uma Mr diferente. Como indicado acima, a diferença em Mr destes componentes marcadores, sob ligação de cada um dos reagentes marcadores em polipeptídeos idênticos em uma amostra diferente, é refletida na Mr resultante do polipeptídeo ou peptídeo gerado da mesma

Exemplos de grupos que podem funcionar como componentes marcadores isotópicos por introdução diferencial de um ou mais isótopos incluem mas não são limitados a éteres, poliéteres, éter-diaminas, poliéter- diaminas, diaminas, amidas, poliamidas, politioéteres, dissulfetos, silil-éteres, cadeias alquila ou alquenila (cadeia linear, ramificada ou com porções que são cíclicas),, grupos arila, diarila ou alquil-arila.Em modalidades particulares, grupos arila no componente isotópico dos reagentes marcadores da presente invenção contêm um ou mais heteroátomos (e.g., átomos de Ν, O ou S).

De acordo com uma modalidade particular, o componente marcador isotópico do reagente marcador é al que não sofre fragmentação semelhante a peptídeo durante a análise (MS)n. Para promover ionização, o componente marcador isotópico, e mais particularmente o grupo isotópico no mesmo, pode conter grupos ou agrupamentos tais como grupos ácidos ou básicos, e.g., COOH, SO3H, grupos amino primário, secundário ou terciário, heterociclos nitrogenados, éteres, ou combinações destes grupos. Em modalidades particulares, o componente marcador isotópico contém grupos tendo uma carga permanente, e.g., grupos fosfônio, grupos amônio quaternário, grupos sulfônio, íons de metal quelados, tetra-alquil- ou tetra- aril-borato ou carbânions estáveis.

O componente marcador isotópico dos reagentes marcadores da presente invenção podem ser uma parte separada da molécula ou podem ser incorporados em ou combinados com o grupo reativo à proteína. De acordo com a última modalidade, os isótopos do componente marcador isotópico podem ser incorporados no grupo aromático do ácido aril-borônico, em substituintes neste anel aromático, ou no ligante (L), quando presente, que conecta o ácido aril-borônico com a etiqueta de afinidade

A preparação de reagentes marcadores isotópicos de acordo com esta modalidade da invenção é similar à preparação de reagentes marcadores isotópicos mostrados nos exemplos de US 6.852.544, sendo que o grupo reativo á proteína é um ácido aril-borônico.

De acordo com outra modalidade, os reagentes marcadores da presente invenção compreendem, como componentes marcadores, um componente marcador isobárico. Similar aos reagentes compreendendo componente marcador isotópico, o uso de reagentes marcadores isobáricos permite a identificação de peptídeos diferencialmente marcados dentro de uma mistura de peptídeos reunidos.

Componentes marcadores isobáricos para uso no contexto da presente invenção têm sido descritos na arte. Como detalhado acima, componentes marcadores isobáricos compreendem um grupo repórter (RG), que é um fragmento relativamente pequeno e um grupo de balanço (BG), por meio do que a massa combinada do grupo repórter e o grupo de balanço é idêntica para todos os componentes marcadores isobáricos dentro de um conjunto, enquanto que a massa do RG é diferente para cada componente marcador isobárico dentro do conjunto e é usado para a identificação diferencial de peptídeos idênticos.

Naquelas modalidades nas quais um marcador isobárico está presente, a etiqueta de afinidade é tipicamente posicionada em uma posição onde ele não interfere com a liberação do grupo repórter após Dissociação Induzida por Colisão (CID).

O componente marcador isobárico dos reagentes marcadores da presente invenção pode ser uma estrutura separada. Alternativamente, os grupos repórter e de balanço são tipicamente partes do ligante ou substituintes do ligante. Em modalidades particulares, o anel aromático e os substituintes no mesmo são usados para incorporar isótopos e para atuar como um grupo de balanço. Em muitas modalidades particulares, a estrutura conectando a etiqueta de afinidade com o grupo reativo à Histidina, que pode ser considerada como um ligante, atua como um componente marcador isobárico por meio do qual a estrutura principal do ligante é o grupo de balanço e o grupo repórter reside em uma cadeia lateral do ligante. Em uma outra modalidade muito particular, ambos o grupo de balanço e o grupo repórter são uma parte do ligante pela distribuição específica de isótopos em regiões dedicadas do ligante e obtenção de ligações adjacentes ao grupo repórter que são suscetíveis à clivagem por CID, para liberar tal grupo repórter.

A preparação de reagentes marcadores isobáricos de acordo com este aspecto da presente invenção em uma modalidade corresponde à preparação de reagentes marcadores isobáricos mostrada nos exemplos de W02004070352, sendo que o grupo reativo à proteína é um ácido (alquil)aril- borônico.

Como indicado acima, a presença de uma etiqueta de afinidade nos reagentes etiquetadores e marcadores da presente invenção, permite a ligação seletiva de peptídeos ou polipeptídeos etiquetados ou opcionalmente marcados, quer covalente quer não-covalentemente com afinidade alta por um reagente de captura (CR). Tipicamente a ligação da etiqueta de afinidade no reagente de captura é forte de tal modo que ela é resistente à lavagem extensiva e/ou múltipla com qualquer uma de ou uma combinação de uma variedade de soluções que garantes a remoção de peptídeos ou polipeptídeos não-especificamente ligados no reagente de captura. Tipicamente a etiqueta de afinidade não sofre fragmentação semelhante a peptídeo durante análise por MS. Como indicado acima, e mais particularmente para uso nos métodos da presente invenção, a natureza das etiquetas de afinidade não é crítica, desde que ela permita a ligação seletiva em um reagente de captura (CR) e opcionalmente a remoção do mesmo, sem afetar a ligação de peptídeo ou polipeptídeo na etiqueta de afinidade.

Conseqüentemente, exemplos não-limitantes de pares de Etiquetas de Afinidade (A) e reagente de captura (CR) incluem:

-d-biotina ou reagentes baseados em biotina estruturalmente modificada, incluindo d-imino-biotina, que se liga em avidina/estreptavidina (por exemplo como estrepavidina-Agarose, avidina oligomérica-Agarose, ou avidina monomérica-Agarose),

-maltose que se liga em Proteína Ligante de Maltose; ou outros pares de açúcar/Proteína Ligante de Açúcar que obedecem os critérios acima mencionados de etiquetas de afinidade,

-um hapteno, tal como grupo dinitro-fenila, que se liga no anticorpo anti-hapteno correspondente tal como IgG anti-dinitro-fenila, -glutationa que se liga em glutationa-S-transferase. Em modalidades particulares da presente invenção, uma purificação por afinidade de peptídeos ou polipeptídeos marcados é realizada antes da análise por MS. Conseqüentemente, visto que os peptídeos ou polipeptídeos ligados são exigidos para análise posterior, remoção do reagente de captura ou dissociação da etiqueta de afinidade do peptídeo é exigida. Isto pode ser garantidos em diferentes maneiras.

Em modalidades particulares, a etiqueta de afinidade é conectada no reagente marcador por uma ligação clivável (tal como, mas não limitada a ligação lábil a ácido, lábil a tiol, lábil à base, lábil a periodato, ou lábil à hidroxil-amina).

Em outras modalidades particulares, a ligação entre etiqueta de afinidade e reagente marcador também pode ser clivável por reação química, térmica ou fotoquímica. Um grupo fotoclivável adequado é 1-(2-nitro-fenil)- etila. Ligações termicamente lábeis são por exemplo, ácidos nucleicos de fita dupla, fitas duplas de um ácido nucleico com ácido peptídeo-nucleico, ou fitas de ácido peptídeo-nucleico de fita dupla que se dissociarão sob aquecimento. Grupos cliváveis também incluem aqueles tendo ligações dissulfeto, grupos lábeis a ácido ou à base, grupos lábeis a periodato, ou grupos lábeis à hidroxil-amina incluindo dentre outros, grupos diaril-metila ou trimetil-aril- metila, silil-éteres, carbamatos, óxi-ésteres, tio-ésteres, tiono-ésteres, e ésteres e amidas alfa-fluorados. Grupos enzimaticamente cliváveis são por exemplo, amidas ou ésteres sensíveis à protease, análogos de beta-lactama sensíveis à beta-lactamase e ligações que são cliváveis por nuclease, ou cliváveis por glicosidase.

De acordo com esta modalidade, a etiqueta de afinidade pode ser removida pelo tratamento da proteína marcada ou do peptídeo marcado com um reagente adequado. Remoção da etiqueta de afinidade também pode ser desejável por outras razões, e.g. para evitar interferência em análise do peptídeo, e.g. em MS. Tipicamente, a etiqueta de afinidade é clivada após o isolamento por afinidade dos peptídeos ou polipeptídeos marcados.

Alternativamente, a etiqueta de afinidade pode estar presente nos reagentes etiquetadores e marcadores da presente invenção ligados no grupo reativo à proteína/peptídeo com uma ligação não-clivável. Com o objetivo de garantir que os peptídeos purificados por afinidade possam ser recuperados, se a etiqueta de afinidade não é removível, é usada uma etiqueta de afinidade que pode de algum modo ser dissociada do reagente de captura (CR). Em modalidades particulares, biotina e etiquetas de afinidade baseadas em biotina são usadas. De interesse particular são as biotinas estruturalmente modificadas, tal como d-imino- biotina, que eluirá de colunas de avidina ou estreptavidina sob condições de solvente compatíveis com análise por ESI-MS, tais como ácidos diluídos contendo 10-20% de solvente orgânico. Tem sido estabelecido que compostos etiquetados com d-imino-biotina eluirão em solventes abaixo de pH 4.

Adicional ou alternativamente, ligantes de deslocamento (DL) são usados para deslocar a etiqueta de afinidade (A) (e o peptídeo ou a proteína ligada na mesma) do reagente de captura (CR). Quando se elui com um DL pelo menos uma fração deste DL estará presente no eluente compreendendo o(s) peptídeo(s) de interesse. Em modalidades particulares os métodos da invenção podem compreender o uso de um DL que é uma molécula que não sofre fragmentação semelhante a peptídeo durante análise por MS, e cuja presença em uma amostra não suprime significativamente a ionização dos conjugados de produto de reação, substrato ou peptídeo etiquetado. Particularmente, o ligante de deslocamento pode ser escolhido de tal modo que ele mesmo é minimamente ionizado durante análise espectrométrica de massa e que a formação de íons compostos de agrupamentos de DL é mínima.

A natureza de um ligante de deslocamento (DL) adequado, depende da natureza de A e de CR que são empregados. Em geral, o DL é selecionado para deslocar A de CR em uma escala de tempo razoável, no máximo dentro de uma semana de sua adição, mas mais preferivelmente dentro de uns poucos minutos ou até uma hora. A afinidade de DL por CR deve ser comparável ou mais forte do que a afinidade dos compostos etiquetados contendo A por CR. Ademais, o DL deve ser solúvel no solvente usado durante a eluição de compostos etiquetados contendo a etiqueta de afinidade A, do CR. Em modalidades particulares o DL corresponde a uma etiqueta de afinidade A livre ou um derivado ou modificação estrutural de A. Exemplos de ligantes de deslocamento assim incluem, d-biotina ou derivados de d-biotina.

Como referido acima, em algumas modalidades da presente invenção, os reagentes etiquetadores ou marcadores compreendem um ligante entre a etiqueta de afinidade e o grupo reativo à Histidina (ácido aril-borônico). Este ligante pode ser o restante da reação entre o ácido (alquil)aril-borônico e a etiqueta de afinidade. O ligante também pode ser usado para fisicamente separar a etiqueta de afinidade (volumosa) do grupo reativo à proteína, de modo a prevenir interferência da etiqueta de afinidade na ligação do reagente no peptídeo. Como indicado acima, nos reagentes marcadores da presente invenção, o ligante pode opcionalmente incorporar isótopos ou função como uma armação para componentes marcadores ópticos ou para o grupo repórter de um componente marcador isobárico. Como indicado acima, em algumas modalidades muito particulares, o ligante atua como um grupo de balanço e os grupos repórter residem em uma cadeia lateral do ligante. Em outra modalidade muito particular, tanto o grupo de balanço quanto o grupo repórter são uma parte do ligante pela distribuição específica de isótopos em regiões dedicadas do ligante e obtenção de ligações adjacentes ao grupo repórter que são suscetíveis à clivagem por CID, para liberação de tal grupo repórter.

de afinidade presente no reagente etiquetador ou marcador é biotina. Em outras modalidades particulares, o ácido aril-borônico é ácido fenil-borônico. Em uma modalidade muito particular o composto da presente invenção é uma molécula com a fórmula (II):

sendo que a estrutura geral em adição compreende, como um componente marcador um ou mais isótopo 'pesados'.

Em uma outra modalidade o reagente marcador da presente invenção é uma molécula com a fórmula (III). O

Em modalidades particulares da presente invenção, a etiqueta

dl)

H

N

ι O.

O

H

N

ι

O

(IIl)

O

H' sendo que opcionalmente um ou mais átomos de carbono e/ou um ou mais átomos de hidrogênio no ligante entre o grupo biotina e o grupo aril-borônico são substituídos respectivamente por 13C ou deutério.

Os reagentes etiquetadores e marcadores descritos acima podem ser usados para reduzir a complexidade de amostras de proteína pela permissão de isolamento seletivo de peptídeos contendo Histidina.

Com o propósito de um reagente etiquetador e/ou marcador garantir o isolamento seletivo de numerosos peptídeos representativos, o reagente idealmente seleciona quase todas as proteínas em uma amostra para obter uma cobertura máxima do proteoma em uma amostra. Ao mesmo tempo, quando se considera cada proteína individual, o número de grupos funcionais na proteína reagindo com o reagente é idealmente baixo, de modo a reduzir a complexidade da análise (número de peptídeos a serem analisados desta proteína em uma amostra é apenas um ou um número limitado).

Nas ferramentas e métodos da presente invenção, Histidina é usada como o grupo funcional para etiquetar e/ou marcar. Marcação de Histidina dá um compromisso aceitável entre cobertura máxima (marcação de cada proteína em uma amostra) e complexidade mínima (marcação de cada proteína em uma amostra apenas uma vez ou um número de vezes limitado). Histidina ocorre com uma freqüência de 2-3% (uma em cada 30- 50 aminoácidos) em uma seqüência de polipeptídeo. Ademais, marcação com Histidina não modifica outras partes de uma proteína como é o caso com a marcação de grupos amina que ocorre tanto em Lisina quanto na terminação- amino ou como é o caso com a marcação de grupos carboxila que ocorre em ambos Ácido Aspártico, Ácido Glutâmico e a terminação-carboxila.

Conseqüentemente o uso dos reagentes da presente invenção envolve a ligação covalente de um reagente etiquetador ou marcador ácido aril-borônico no imidazol de Histidina em um polipeptídeo (veja Figura 2 - embora a Figura mostre um peptídeo compreendendo uma hexa-Histidina, a presença de múltiplas Histidinas não é exigida de acordo com a presente invenção para etiquetar pela reação com um grupo aril-borônico).

A reação de ácidos aril-borônicos com imidazol em condições aquosas em valores de pH entre 4,6 e 9,0 na presença de um catalisador de cobre, e.g. [Cu(OH)TMEDAJ2Cl2, é mostrada em Collman et al. (2001), J. Org. Chem. 66,1528-1531 e esquematicamente exibida em Figura 1. Contido em vista da aplicação da presente invenção a reação é tipicamente realizada em valores de pH abaixo de 8 para evitar a reação de reagente etiquetador ou marcador com polipeptídeos glicosilados. Embora, nos métodos da presente invenção, o contato do reagente etiquetador ou marcador ácido aril-borônico com a amostra de proteína é tipicamente realizado em condições aquosas, a reação também pode ser conduzida na presença de solventes orgânicos ou até mesmo completamente em solventes orgânicos tal como CH2Cl2 como mostrado em Collman etal. (2001)/. Org. Chem. 66,7892-7897. Conseqüentemente, um outro aspecto da invenção refere-se ao

uso de reagentes etiquetadores tendo uma estrutura geral correspondendo à fórmula (I) descrita acima, para a etiquetação covalente de peptídeos contendo Histidina.

Mais especificamente, a presente invenção proporciona métodos para ligar covalentemente uma etiqueta de afinidade a uma proteína compreendendo uma Histidina, compreendendo a etapa de contactar a proteína com um composto com a estrutura geral (I):

A-(I)-XL

sendo que A é uma etiqueta de afinidade e L é um ligante opcional, na presença de um catalisador de cobre. Modalidades específicas da invenção fornecem métodos para

isolar peptídeos contendo Histidina de uma amostra de proteína compreendendo as etapas de clivar as proteínas intactas na amostra de proteína com um agente clivador em peptídeos e contactar a amostra de proteína com um reagente marcador aril-borônico tendo a fórmula estrutural geral (I), descrita acima, na presença de um catalisador de cobre, de modo a permitir a reação do reagente etiquetador aril-borônico com Histidina onde presente nos peptídeos. Os peptídeos etiquetados são então ligados em uma matriz de afinidade via a etiqueta de afinidade, e os peptídeos etiquetados ligados são removidos da matriz de afinidade para obter os peptídeos isolados. Modalidades específicas dos métodos da presente invenção envolve o uso de reagentes etiquetadores específicos aqui descritos, e onde apropriado, a remoção dos peptídeos ligados em um método de afinidade usando métodos apropriados, dependendo da natureza da etiqueta de afinidade e onde ou não está conectado dentro do reagente etiquetador e no peptídeo com uma ligação clivável, como detalhado acima. Ainda outro aspecto da invenção refere-se ao uso de reagentes

marcadores da presente invenção na análise simultânea por Espectrometria de Massa de amostras de proteína diferentes. Análise simultânea de amostras evita a variabilidade técnica nos métodos de análise.

Conseqüentemente, os métodos e ferramentas este aspecto da invenção são de interesse particular na análise de uma ou de um conjunto de duas ou mais amostras para as quais uma análise comparável é exigida. Um tal conjunto de amostras pode ser, mas não é limitado a, amostras de um paciente retiradas em instantes de tempo diferentes, a ostras de versões clínicas diferentes de uma doença, amostras de pacientes diferentes etc.. A presente invenção assim proporciona métodos e ferramentas para identificar marcadores de progressão de doença, para diagnose diferencial, e além disso para análise por multiplexação em ensaios bioquímicos ou fisiológicos.

De acordo com este aspecto da invenção métodos e ensaios são fornecidos, sendo que duas ou mais amostras são marcadas usando os reagentes marcadores da presente invenção, para permitir análise simultânea com MS.

Os métodos de acordo com este aspecto da invenção compreendem uma etapa de marcar na qual cada amostra é marcada em Histidina com um (de um conjunto) de reagentes marcadores, pelo contato da proteína com um composto com a estrutura geral (I), descrita acima compreende um componente marcador, na presença de um catalisador de cobre. O conjunto de reagentes marcadores usados nos métodos da presente invenção tem a mesma ou essencialmente a mesma estrutura química. Mais particularmente, compreendem, como um componente marcador, um componente marcador isotópico ou isobárico.

Nos métodos de acordo com esta aspecto da presente invenção, adicionalmente à etapa de marcar usando os reagentes marcadores da presente invenção, que resulta em uma marcação diferencial de proteínas em cada uma das amostras, as amostras diferentes são reunidas. Pela reunião das amostras diferentes uma mistura de amostra de polipeptídeo é obtida. Isto permite a comparação imediata das amostras diferentes na análise.

Nas etapas posteriores à marcação, os peptídeos marcados são isolados e analisados. Mais comumente, as amostras serão reunidas antes do isolamento dos peptídeos. Entretanto, pode ser considerado que a reunião das amostras é realizada após uma ou mais etapas de isolamento ou purificação.

Como detalhado abaixo, as amostras individuais ou a mistura de amostras reunidas é tipicamente submetida a uma etapa de separação se peptídeo, para permitir a análise dos peptídeos individuais em MS. Conseqüentemente, onde os métodos compreendem a etapa de marcar duas ou mais amostras com reagentes marcadores isobáricos ou isotópicos de acordo com a presente invenção, a estrutura química dos marcadores isobáricos ou isotópicos resultantes nos peptídeos é a mesma ou é essencialmente a mesma para todos os reagentes dentro de um conjunto de reagentes marcadores, de tal modo que os marcadores como presentes nos peptídeos não gerarão uma diferença significativa em propriedades em técnicas de cromatografia (multi- dimensional), entre peptídeos idênticos que são diferentemente marcados. Conseqüentemente, peptídeos com a mesma seqüência de aminoácidos que são diferentemente marcados terão o mesmo comportamento nestes métodos de separação. Onde amostras diferencialmente marcadas têm sido reunidas, peptídeos idênticos diferencialmente marcados são separados juntos.

Os métodos e ferramentas da presente invenção referem-se à análise de amostras de proteína. O termo 'amostra' como aqui usado não é intencionado para necessariamente incluir ou excluir quaisquer etapas de processamento antes da realização dos métodos da invenção. As amostras podem ser amostras brutas não processadas, frações de proteína extraídas, frações de proteína purificadas etc. De acordo com uma modalidade as amostra de proteínas são pré-processadas por imunodepleção de proteínas abundantes.

Amostras de proteína que são adequadas para análise com os reagentes etiquetadores ou marcadores e métodos da presente invenção incluem amostras de origem viral, de procariota, bacteriana, de eucariota, fúngica, de levedura, vegetal, de invertebrado, de vertebrado, de mamífero e de humano. A preparação de amostras difere dependendo do organismo, tecido ou órgão investigado, mas procedimentos padrão estão normalmente disponíveis e são conhecidos pelo perito. Com respeito às amostras de proteína de mamífero e de humano elas cobrem o isolamento de células cultivadas, células microdissecadas a laser, tecido de corpo, fluidos corporais, ou outras amostras relevantes de interesse. Com respeito ao fracionamento de proteínas em uma amostra, Iise de célula é a primeira etapa em fracionamento celular e purificação de proteína. Muitas técnicas estão disponíveis para o rompimento de células, incluindo métodos físicos, enzimáticos e baseados em detergente. Historicamente, Iise física tem sido o método de escolha para rompimento de célula; (homogeneização, Iise osmótica, rompimento de célula por ultrassom) entretanto, muitas vezes exige equipamento caro, inconveniente e envolve protocolos que são algumas vezes difíceis de repetir devido à variabilidade no aparelho (tais como mãos de almofariz para homogeneização de encaixe apertado ou de encaixe frouxo). Em anos recentes, Iise baseada em detergente (usando e.g. Poppers Reagens (Pierce Chemicals)) tem se tornado muito popular devido à facilidade de uso, ao custo baixo e aos protocolos eficientes.

Células de mamífero têm uma membrana plasmática, uma bicamada proteína-lipídica que forma uma barreira separando o conteúdo da célula do ambiente extracelular. Lipídeos compreendendo a membrana plasmática são anfipáticos, tendo grupos hidrofílicos e hidrofóbicos que se associam espontaneamente para formarem uma película bimolecular fechada. Proteínas de membrana estão embebidas na bicamada lipídica, mantidas no lugar por um ou mais domínios abarcando o núcleo hidrofóbico. Em adição, proteínas periféricas ligam a superfície interna ou externa da bicamada através de interações com proteínas de membrana integrais ou com grupos de cabeça lipídicos polares. A natureza do teor de lipídeo e de proteína varia com o tipo de célula. Claramente, a técnica escolhida para o rompimento de células, quer física quer baseada em detergente, precisa levar em consideração a origem das células ou dos tecidos sendo examinados e a facilidade ou dificuldade inerente em rompimento de sua(s) camada(s) externa(s). Em adição, o método precisa ser compatível com a quantidade de material a ser processado e as aplicações intencionadas a jusante.

Em modalidades particulares, extração de proteína também inclui o pré-fracionamento de proteínas celulares originárias de compartimentos diferentes (tais como proteínas extracelulares, proteínas de membrana, proteínas citosólicas, proteínas nucleares, proteínas mitocondriais). Outros métodos de pré-fracionamento separam proteínas baseados em propriedades físicas tais como ponto isoelétrico, carga e peso molecular.

De acordo com uma modalidade particular, as amostras são pré-tratadas antes da etiquetação/marcação ou clivagem, de modo a desnaturar as proteínas para acesso otimizado aos reagentes ou às proteases, usando agentes apropriados (e.g., cloreto de guanidínio, uréia, ácidos (e.g. ácido trifluórico 0,1 %), bases (e.g. piridina 50 %) e detergentes iônicos ou não- iônicos). Resíduos de Cisteína são reduzidos com agentes redutores tais como (ditiotreitol (DTT), 2-mercapto-etanol e 2-mercapto-etil-amina, e aqueles que são fosfinas e seus derivados, tais como Tris(carbóxi-etil)-fosfina (TCEP) ou Cloridrato de Tris(2-carbóxi-etil)-fosfma).

Em modalidades específicas os métodos da presente invenção podem incluir uma ou mais etapas nas quais um ou mais grupos funcionais de aminoácidos (diferentes de Histidina) são irreversível ou reversivelmente modificados com agentes de modificação de proteína, antes dos métodos de etiquetação ou marcação da invenção. Exemplos são etapas para modificação do grupo tiol de Cisteína, modificação do grupo hidroxila de Serina e Treonina com agentes de sililação, acetilação do grupo amina de Lisina,

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modificação do grupo carboxila de Acido Aspártico e de Acido Glutâmico. Exemplos específicos de tais modificações são detalhados abaixo:

-Grupos reativos a tiol reagem com a cadeia lateral de Cisteína. Grupos reativos a tiol incluem epóxidos, grupo alfa-halo-acila, nitrilas, alquil- ou aril-tióis sulfonados, haletos de alquila, aril-amidas e maleimidas. Um exemplo particular é iodo-acetamida ou um seu derivado.

-Grupos reativos a amino reagem com o grupo épsilon-amina da cadeia lateral de Lisina ou reagem com a amina na terminação-N de um polipeptídeo. Grupos reativos a amino etiquetam grupos amino em proteínas e incluem haletos de sulfonila, isocianatos, isotiocianatos, ésteres ativos, incluindo tetra-fluoro-fenil-ésteres, pentafiuoro-fenil-ésteres, N-hidróxi- succinimidil-ésteres, N-hidróxi-sulfo-succinimidil-ésteres, 2-nitro-fenil- ésteres, 4-nitro-fenil-ésteres, 2,4-dinitro-fenil-ésteres, 2,4-di-halo-fenil- ésteres, haletos de ácido, e anidridos de ácido e anidridos mistos. Em adição, grupos reativos a amino incluem aldeídos ou cetonas na presença ou ausência de NaBH4 ou NaCNBH3.

-Grupos reativos a ácido carboxílico reagem com as cadeias laterais de ácido aspártico e ácido glutâmico ou reagem com a terminação-C de um polipeptídeo. Grupos reativos a ácido carboxílico incluem aminas ou alcoóis na presença de um agente copulante tal como diciclo-hexil- carbodiimida, ou 2,3,5,6-tetrafluoro-fenil-trifluoro-acetato na presença ou ausência de um catalisador de copulação tal como 4-dimetil-amino-piridina; e complexos de diamina-metal de transição incluindo Cu(II)-fenantrolina.

-Grupos reativos a éster incluem aminas que, por exemplo, reagem com homoserina-lactona. Metionina é convertida sob homosseriona- lactona durante clivagem com CNBr.

-Grupos reativos a fosfato reagem com aminoácidos fosforilados tais como fosfoSer, fosfoThr e fosfoTyr. Grupos reativos a fosfato incluem metal quelado onde o metal é, por exemplo, Fe(III) ou Ga(III), quelado por, por exemplo, ácido nitrilotriacético ou ácido imino- diacético. Estes reagentes reagem com aminoácidos fosforilados (tais como fosfo-serina, fosfo-treonina, e fosfo-tirosina).

-Grupos reativos a aldeído ou cetona incluem amina mais NaBH4 ou NaCNBH3, ou estes reagentes após primeiro tratamento de um carboidrato com periodato para gerar um aldeído ou uma cetona. Grupos reativos a hidroxila reagem com serina e treonina.

Grupos reativos a hidroxila incluem haletos de tritila ou um grupo reativo a haleto de silila que está quer substituído quer não substituído.

De acordo com modalidades particulares, os métodos de etiquetação e marcação da invenção compreendem uma etapa de clivagem, por meio da qual as proteínas de uma ou mais amostras de proteína são processadas em peptídeos. Esta etapa de clivagem pode ocorrer quer antes quer depois da etapa de etiquetação/marcação. Esta etapa de clivagem é geralmente realizada para permitir a análise de peptídeos menores, em vez de as proteínas de comprimento total. É mais fácil separar peptídeos do que proteínas em sistemas de produtividade alta tal como LC, e para interpretar os dados de seqüências dos peptídeos em MS/MS.

A clivagem de peptídeos pode ser realizada por agentes clivadores diferentes.

Agentes químicos adequados para clivagem de proteína incluem brometo de cianogênio (CNBr), BNPS escatol (2-(2'-Nitro-fenil- lsulfonil)-3-metil-3-Bromo-indolenina), ácido fórmico, hidroxil-amina, ácido iodo-benzóico, NTCB +Ni (ácido 2-nitro-5-tiociano-benzóico). Enzimas proteolíticas adequadas incluem Asp-N Endopeptidase, Caspase 1,2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10, Quimotripsina; Clostripaina, Enterocinase, Fator Xa, Glutamil Endopeptidase, Granzime B, LysC Lysyl endopeptidase, Papaína, Pepsina, Prolina-Endopeptidase, Proteinasa K, Peptidase I Staphylococal, Termolisina, Trombina, Tripsina.

Dependendo do tipo de amostra de proteína, uma combinação de clivagem química e enzimática é realizada ou uma digestão enzimática dupla é realizada.

De acordo com uma modalidade particular, a clivagem de proteínas é realizada usando tripsina, que é a enzima com a eficiência e a especificidade mais altas (Lisina e Arginina). Em vertebrados Lisina ocorre em proteínas com uma freqüência de 7,4 % e Arginina com uma freqüência de 4,2 %. Um digesto tríptico portanto resulta em peptídeos com um comprimento médio de 9 aminoácidos. Alternativamente, onde lisina tem sido modificada para não mais atuar como um substrato para tripsina peptídeos com um comprimento médio de 25 aminoácidos são formados pela clivagem com tripsina. Tais peptídeos são bem adequados para técnicas cromatográficas e MS.

Conseqüentemente, uma modalidade particular da presente invenção proporciona métodos que compreendem uma etapa de etiquetação/marcação antes de uma etapa de clivagem sendo que as proteínas etiquetadas/marcadas são digeridas com tripsina. De acordo com uma modalidade mais particular, antes da digestão, as proteínas marcadas são tratadas com um agente de acetilação para modificar as cadeias laterais de lisina antes de uma digestão com tripsina ser realizada. A Lisina modificada não mais será reconhecida como um substrato para tripsina. Deve ser considerado, entretanto, que resíduos de Cisteína não modificados, quando reagidos com um agente de acetilação tal como e.g. anidrido de ácido acético para formar homoarginina, se tornarão um substrato para tripsina. Conseqüentemente, outras modalidades específicas destes métodos incluem uma etapa na qual resíduos de Cisteína são modificados antes da modificação de Lisina. Adicionalmente, deve ser notado que, como uma conseqüência do tratamento de polipeptídeos com um agente de acetilação, a terminação-amino dos polipeptídeos também será acetilada. Isto pode ser relevante se a terminação-amino dos peptídeos for considerada para e.g. outras etapas de marcação (e.g. em métodos envolvendo marcação dupla, veja abaixo).

Nos métodos da presente invenção, proteínas compreendendo Histidina presentes em uma amostra de proteína, que são etiquetadas/marcadas na etapa de etiquetação/marcação, mas que não compreendem um sítio de clivagem de proteína, serão processadas como tais no restante da análise como outros peptídeos. Conseqüentemente, proteínas ou peptídeos não compreendendo uma Histidina, são removidos da amostra na etapa de purificação por afinidade dos métodos da presente invenção e não são levados em consideração na análise.

Os métodos de etiquetação/marcação fazendo uso dos reagentes etiquetadores e marcadores aqui descritos são tipicamente de uso no contexto da análise de amostras de proteína usando MS. Análise de amostras de proteína usando MS tipicamente exige, antes do MS real, a purificação dos peptídeos individuais por uma ou mais técnicas de separação de peptídeo. Conseqüentemente, onde as amostras de proteínas a serem analisadas são complexas, os métodos da presente invenção tipicamente compreendem uma ou mais etapas de separação de peptídeos nas quais, a uma amostra ou uma mistura de amostras reunidas é submetida a uma ou mais técnicas de separação de peptídeo para seletivamente isolar os polipeptídeos ou peptídeos etiquetados/marcados da mistura de amostras de polipeptídeo. Técnicas de separação adequadas, que permitem a separação de uma amostra complexa de peptídeo ou proteína em duas ou mais, até múltiplas frações (no contexto do isolamento de peptídeos marcados ou etiquetados) são conhecidas pela pessoa experiente na arte e incluem, mas não são limitadas a focalização isoelétrica, SDS P AGE, 2-eletroforese em gel dimensional, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de troca iônica, HPLC em fase inversa, cromatografia por afinidade,... etc.

Quando a amostra consiste de peptídeos maiores (e.g. entre Mr 3.000 e 100.000) 2D GE pode ser usada. Para amostras de peptídeo, obtidas de e.g. digestões proteolíticas, abordagens de 2D LC são mais adequadas para separação, e também a automação e produtividade é significativamente melhor. Várias tecnologias para separar digestos de proteína/peptídeo por cromatografia líquida têm sido descritas, HPLC em fase inversa (RP-HPLC), e cromatografia líquida bidimensional. Também eletroforese capilar (CE) é um método adequado para a separação de peptídeos.

2D-LC geralmente usa colunas de troca iônica (normalmente, troca catiônica forte, SCX) acoplada em linha com uma coluna de fase inversa, operada em uma série de ciclos. Em cada ciclo a concentração de sal é aumentada na coluna de troca iônica, com o propósito de eluir peptídeos de acordo com sua carga iônica no sistema de fase inversa. Aqui, peptídeos são separados baseado em hidrofobicidade por e.g. um gradiente com CH3CN.

Muitos parâmetros influenciam o poder de resolução e subseqüentemente o número de proteínas que pode ser exibido por LC-MS. Normalmente, a configuração 'em linha' entre a técnica de separação unidimensional (SCX) e a abordagem de separação por RP-HPLC é configurada para fracionamento de amostra. Cromatografia de troca iônica pode ser realizada por eluição em etapas com concentração de sal crescente ou por um gradiente de sal. Tipicamente, SCX é realizada na presença de, e.g. até 30% de acetonitrila, para minimizar interações hidrofóbicas durante cromatografia SCX. Antes da Cromatografia em Fase Inversa em e.g. uma coluna C18, solventes orgânicos tais como acetonitrila são removidos, ou fortemente reduzidos por e.g. evaporação.

Os métodos de etiquetação e marcação da presente invenção são aqui em diante ilustrados pelos seguintes esquemas exemplares.

Uma modalidade dos métodos da presente invenção é ilustrada pela Figura 3, na qual a etiquetação de uma amostra de proteína usando um reagente marcador ácido borônico com uma etiqueta de afinidade de biotina via um ligante compreendendo um dissulfeto é exemplificada.

Em uma primeira etapa, as proteínas em um lisado de células são desnaturadas, e Cisteínas são modificadas por carboximetilação com iodo- acetamida. Em uma etapa seguinte as proteínas são clivadas em peptídeos com tripsina. Depois os peptídeos com Histidina são marcados com um reagente marcador reativo à Histidina. Os peptídeos etiquetados são ligados em uma matriz com avidina como reagente de captura, na qual os peptídeos etiquetados com Histidina se ligam. Após remoção dos peptídeos não ligados, os peptídeos são removidos da matriz de afinidade com um agente redutor (e.g. ditiotreitol) que cliva o peptídeo da etiqueta de afinidade ligada. Os peptídeos eluídos são subseqüentemente separados por cromatografia uni- ou bidimensional e analisados por MS.

Uma outra modalidade dos métodos da presente invenção é ilustrada em Figura 4. O esquema de marcação ilustrado pela Figura 4 envolve a marcação de 4 amostras de proteína usando reagentes marcadores de acordo com a presente invenção, compreendendo um grupo reativo à proteína (PRG) que é um grupo reativo à Histidina como aqui descrito.

Em uma etapa de pré-processamento as amostras são desnaturadas, reduzidas e subseqüentemente todas as Cisteínas são modificadas por carboximetilação e as aminas de todas as lisinas são modificadas. As etapas diferentes do esquema de marcação compreendem:

-As 4 amostras de proteína são cada uma marcadas com um de um conjunto de reagentes marcadores de acordo com uma modalidade da presente invenção, sendo que cada reagente marcador tem um componente marcador isotópico diferente, e por meio do qual os reagentes marcadores compreendem uma etiqueta de afinidade de biotina que é conectada no PRG via um ligante compreendendo um grupo dissulfeto.

-Após a marcação, todas as amostras são reunidas e tratadas como uma mistura reacional que diminui variações devido à manipulação de amostras individuais.

-A mistura de amostras reunidas marcadas com Histidina assim obtida é digerida com tripsina.

-Para reduzir o número de peptídeos para análise posterior, os peptídeos marcados são isolados via a etiqueta de afinidade de biotina introduzida pelo reagente marcador nos peptídeos. Isto é feito usando técnicas de afinidade por (estrep)avidina. A etiqueta de afinidade é removida dos peptídeos marcados por incubação deles em condições redutoras.

Após a etapa de afinidade, cada um dos peptídeos isolados compreende uma Histidina modificada e traz um marcador isotópico. Conseqüentemente, cada peptídeo é informativo sob análise via MS. O método adicionalmente inclui as seguintes etapas nas quais:

-Os peptídeos reunidos são separados por e.g. cromatografia líquida. Aqui os peptídeos que são idênticos mas que se originam de uma amostra diferente e são portanto diferentemente marcados comportam-se em uma maneira essencialmente idêntica. Apesar dos marcadores isotópicos diferentes que estão presentes nos peptídeos idênticos originários de uma amostra diferente, isto não afetará sua eluição porque os marcadores diferentes em cada conjunto de marcadores têm a mesma fórmula química ou essencialmente a mesma fórmula química.

Cada fração de peptídeo separada é analisada por MS, que deve gerar quatro sinais, com uma massa diferente, correspondendo à presença de um componente marcador isotópico "mais leve" ou "mais pesado".

A modalidade particular de métodos da invenção ilustrada acima usa um conjunto de reagentes marcadores com 4 marcadores isotópicos diferentes. Um número mais alto de amostras pode ser analisado simultaneamente quando um conjunto de reagentes marcadores é usado sendo que um número mais elevado de combinações de isótopos diferentes é possível. Alternativamente, pode ser feito de uso de reagentes marcadores isobáricos.

O protocolo de marcação exemplar descrito acima é adequado para determinar e.g. differenças em nível de expressão de proteínas individuais em amostras diferentes. Protocolos alternativos diferentes são considerados, dependendo das aplicações particulares.

Os métodos da presente invenção são úteis para a detecção de biomarcadores, e.g. no contexto de doença. Quando se comparam amostras de doença (e.g. doença vs. controle), dependendo da amostra, um número grande de proteínas está presente e assim um número grande de peptídeos tem que ser analisado por MS e MS/MS. Esta quantidade pode ser tão alta quanto várias centenas ou até mesmo maior do que mil. Para muitos deles entretanto, a presença e a quantidade relativa serão as mesmas nas amostras diferentes. Entretanto, diferenças significativas na presença e na quantidade relativa em amostras diferentes podem ser observadas para um número limitado de peptídeos que estão correlacionados com uma condição da doença.

Análise de peptídeos contendo Histidina obtidos destas amostras torna possível, quer por análise de seqüência quer, como descrito abaixo, por comparação com um banco de dados, a determinação da proteína da qual o peptídeo se origina. A análise será ainda mais confiável quando é observado que, para peptídeos diferentes de uma mesma proteína, é detectado um nível de expressão idêntico.

Será reconhecido que os métodos de marcação da presente invenção são aplicáveis em proteômica, perfil de expressão de proteína, descoberta de biomarcador e descoberta de alvo.

Multiplexação alta como obtida com algumas modalidades dos métodos da presente invenção permite a análise de numerosas condições diferentes em um único experimento. O método é particularmente útil para estudar o perfil de expressão de uma amostra obtida de estados de doença diferentes. Amostras que são analisadas são diferentes de uma ou mais de uma pessoa saudável, uma pessoa com um distúrbio benigno, uma pessoa com um distúrbio maligno (suave ou agressivo), de pessoas respondendo ou não respondendo a um tratamento, de pessoas tendo um distúrbio que se manifesta em partes diferentes do corpo, de pessoas antes durante a após tratamento e de pessoas sob outros aspectos saudáveis tendo um ou mais sintomas de um distúrbio. Distúrbios que são considerados no contexto da presente invenção incluem infecções virais ou bacterianas, distúrbios imunológicos, distúrbios cardiovasculares e câncer.

As modalidades acima ilustram a aplicação mais direta dos reagentes etiquetadores e marcadores e métodos exemplares de uso dos mesmos proporcionados pela presente invenção. Deve ser observado que os reagentes etiquetadores e marcadores da presente invenção também podem ser usados em aplicações mais complexas, e.g. em combinação com outros reagentes marcadores que garantem marcação através de um grupo funcional do peptídeo que é diferente de Histidina, mais particularmente os grupos amino ou carboxila na terminação-N ou terminação-C de peptídeos após clivagem. Conseqüentemente, a presente invenção também considera métodos nos quais peptídeos de uma amostra de proteína são etiquetados usando os reagentes etiquetadores da presente invenção e, em uma etapa de marcação que pode ocorrer quer antes quer depois da etapa de etiquetação, são reagidos com um reagente tal como e.g. [sic] Os reagentes marcadores específicos para Histidina da presente invenção também são adequados para métodos de marcação dupla, nos quais uma primeira marcação é realizada em Histidina com um reagente marcador da presente invenção e uma segunda marcação é realizada em outro grupo funcional em uma proteína ou em um peptídeo. De acordo com uma modalidade, proteínas em uma amostra são primeiro marcadas em Histidina, depois da qual as proteínas são clivadas. Os peptídeos clivados são então marcados quer na terminação-N quer na terminação-C (i.e. grupos funcionais que estão presentes em todos os peptídeos clivados). 0 isolamento de peptídeos compreendendo Histidina pode se realizado antes ou após a segunda etapa de marcação. De acordo com outra modalidade, proteínas em uma amostra são primeiro clivadas depois a terminação-N ou a terminação-C é marcada. Depois, estes peptídeos marcados são adicionalmente marcados em Histidina com os reagentes marcadores da presente invenção. Depois os peptídeos duplamente marcados são isolados por purificação por afinidade.

Nos métodos de marcação dupla descritos acima, a natureza do segundo reagente marcador será dependente da natureza do reagente marcador de acordo com a presente invenção usado (ou visa versa). Tipicamente, é usada uma combinação de reagentes isobários e isotópicos, por meio da qual os reagentes marcadores reativos à Histidina da presente invenção podem ter um componente marcador quer isotópico quer isobárico. Em uma modalidade muito particular, uma marcação é realizada com um reagente marcador reativo à Histidina compreendendo um marcador isobárico

enquanto que a outra marcação é realizada por incorporação mediada por

18 * « j protease (e.g. tripsina) de um ou dois isótopos de O na terminação-C de

peptídeos clivados. Marcação com 18O mediada por protease é realizada como

descrito em et al. (2003) J. Am. Soe. Mass Spectrom. 14(7), 704-718 e

Schnolzer et al. (1996) Electrophoresis 17, 945-953.

Um outro aspecto da presente invenção proporciona métodos para identificar proteínas em uma amostra, baseado na marcação ou no isolamento seletivo de peptídeos contendo Histidina como descrito para os reagentes etiquetadores acima, a determinação da massa dos peptídeos etiquetados contendo Histidina e a identificação dos peptídeos compreendendo Histidina isolados, baseadas na comparação com um banco de dados de peptídeos contendo Histidina. Mais especificamente os métodos de identificação da presente invenção envolve a clivagem de proteínas de uma amostra em peptídeos, a etiquetação seletiva de peptídeos contendo Histidina usando reagentes etiquetadores ácido aril-borônico da presente invenção, seguida por isolamento seletivo dos mesmos, e, depois purificação, a determinação da massa dos peptídeos isolados contendo-His e a comparação desta massa e opcionalmente uma ou mais outras propriedades fisico- químicas, dos peptídeos isolados contendo-His com um banco de dados de peptídeos contendo-His. Conseqüentemente, este aspecto da presente invenção refere-se à determinação da massa por MS de peptídeos purificados contendo Histidina de uma mistura e identificação do peptídeo por comparação da massa identificada com um bando de dados de massas. Os métodos da presente invenção permitem a identificação de peptídeos contendo Histidina (e conseqüentemente de sua correspondente proteína parental), com acurácia alta sem a necessidade de determinação de seqüência de novo em MS/MS.

Uma vantagem do procedimento proposto é que os peptídeos contendo Histidina de todas as proteínas são conhecidos para organismos para os quais seu genoma tem sido seqüenciado (tal como homem, camundongo e rato mas também organismos inferiores tais como Drosophila, C. elegans e leveduras/ Podem ser preditos os pesos moleculares exatos destes peptídeos, que podem ser usados para confirmar a identificação do peptídeo subjacente ao sinal de espectro de massa medido. Isto é particularmente verdadeiro para as técnicas espectrométricas de massa de desempenho alto correntemente disponíveis como FT-ICR, que podem alcançar resoluções da ordem de >500.000 e uma acurácia de massa de <1 ppm.

Ademais, visto que é conhecida a natureza dos peptídeos compreendendo Histidina esperados a partir de análises in silico de seqüências genômicas, uma biblioteca de peptídeos sintéticos pode ser gerada e as características exatas de cada peptídeo durante o processo de preparação (e.g., tempo de retenção em materiais cromatográficos diferentes, comportamento em ESI/MALDI-TOF) podem ser determinadas e comparadas com peptídeos identificados da mistura de proteínas complexa. Isto melhora significativamente a confiança em identificações corretas de proteína.

Conseqüentemente, tipicamente o banco de dados é um banco de dados compreendendo a massa de todos os peptídeos contendo Histidina gerados por um agente de clivagem específico quando se cliva o proteoma de um organismo específico. Mais especificamente um tal banco de dados compreende a massa destes peptídeos que são identificados por um identificador de peptídeo e inclui informação sobre as uma ou mais proteínas parentais dais quais o peptídeo se origina. Comparação da massa de um peptídeo isolado com o banco de dados permite a identificação da proteína parental.

É observado que sob reação de um ácido aril-borônico com uma Histidina dentro de um peptídeo, pelo menos um grupo benzila torna-se ligado no peptídeo. Este grupo absorve luz UV e aumenta a massa de um peptídeo em pelo menos 78 para cada Histidina modificada. Conseqüentemente, esta mudança em peso (e potencialmente em outras propriedades) deve ser levada em consideração em análise por MS e conseqüentemente sob comparação com o banco de dados. Onde a etiqueta de afinidade não é removida, ou onde um componente marcador adicional é adicionado, a massa do peptídeo etiquetado isolado e purificado pode ser adicionalmente aumentada. Opcionalmente as massas proporcionadas no banco de dados podem ser corrigidas para a presença de um grupo benzila com ou sem uma etiqueta ou um marcador para cada Histidina presente no mesmo.

De acordo com a presente invenção, a identificação de proteínas dentro de uma amostra opcionalmente inclui a consideração de uma ou mais outras propriedades físico-químicas dos peptídeos contendo Histidina. Opcionalmente, onde a massa do peptídeo isolado corresponde mais do que um peptídeo no banco de dados, as uma ou mais propriedades físico-químicas podem ser consideradas na comparação, para permitir a identificação positiva.

Tipicamente, os métodos de identificação da presença de uma proteína em uma amostra de acordo com este aspecto da presente invenção compreendem as etapas de modificação das proteínas compreendendo Histidina em uma amostra de proteína pelo contato das proteínas com um reagente marcador com a estrutura geral (I), aqui descrita na presença de um catalisador de cobre, de modo a seletivamente etiquetar todas as Histidinas na amostra de proteína. O método então adicionalmente compreende a etapa de clivagem das proteínas na amostra de proteína em peptídeos com um agente clivador, e o isolamento destes peptídeos gerados compreendendo Histidina, via a etiqueta de afinidade. Em outras etapas os peptídeos isolados contendo Histidina são purificados por uma ou mais etapas de purificação de peptídeo, de modo a obter os peptídeos purificados contendo Histidina. Adicionalmente, ou durante estas etapas de purificação de peptídeo, é determinada pelo menos uma propriedade físico-química, diferente da massa, dos peptídeos purificados contendo Histidina. Alternativamente a pelo menos uma propriedade físico-química adicional pode ser calculada, baseado na informação obtida durante as etapas de purificação de peptídeo. Na etapa seguinte, a massa dos peptídeos isolados e purificados contendo Histidina é determinada em MS. Finalmente, para cada peptídeo isolado e purificado compreendendo Histidina, a massa e a pelo menos uma outra propriedade físico-química é comparada com um banco de dados compreendendo a massa e uma ou mais propriedades físico-químicas de todos peptídeos contendo Histidina como descrito acima.

Com o objetivo de garantir uma identificação acurada de peptídeos usando o banco de dados o padrão de clivagem teórico de uma amostra por um agente clivador deve corresponder tão rigorosamente quanto possível à situação experimental. Por exemplo, pode ser necessário considerar que o uso de CNBr para clivagem C-terminal de Metionina também pode resultar na clivagem C-terminal de Triptofano. Quimotripsina que cliva preferencialmente C-terminalmente aminoácidos aromáticos também clivará C-terminalmente outros aminoácidos hidrofóbicos, dependendo do tempo de incubação e da concentração de enzima na amostra.

Também, com o propósito de permitir uma identificação definitiva de peptídeos usando um banco de dados (i.e. com o objetivo de que o banco de dados inclua um número máximo de peptídeos diferentes e um número mínimo de peptídeos idênticos originários de uma proteína originária diferente), o tamanho médio dos peptídeos gerados é importante. Quanto mais curtos os peptídeos, maior a chance de que os peptídeos de proteínas diferentes tenham a mesma massa e ainda tenham a mesma seqüência e se comportarão em um modo idêntico em método de purificação e de análise. Conseqüentemente, dependendo da natureza e da complexidade da amostra, uma enzima com um sítio de clivagem menos comumente ocorrente pode ser preferida.

Opcionalmente os métodos de identificação da presente invenção incluem a análise de peptídeos de controle quer durante a análise da amostra (controle interno) quer em uma corrida de teste.

Nesta modalidade, um ou mais até uma biblioteca de peptídeos sintéticos contendo Histidina é gerado e são determinadas as características exatas de cada peptídeo durante o processo de separação (e.g., tempo de retenção em materiais cromatográficos diferentes, comportamento em ESI/MALDI-TOF). Onde os peptídeos gerados são idênticos aos peptídeos específicos gerados de uma amostra de proteína, a informação gerada para os peptídeos sintéticos pode ser usada para comparar os dados obtidos para os peptídeos naturais. É esperado que isto significativamente melhore a confiança em identificação correta..

Como descrito no contexto dos métodos de etiquetação e marcação acima, modalidades particulares dos métodos de identificação da presente invenção envolvem uma etapa de clivagem usando tripsina, por causa suas especificidade e eficiência altas. Alternativamente, onde uma clivagem em ambas Lys e Arg resulta nos peptídeos que são muito curtos, outras enzimas podem ser usadas tais como endoproteinase Arg-C (específica para Arginina), endoproteinase Lys-C (específica para Lisina), S. aureus V8 protease (específica para Asp/Glu). Alternativamente, como descrito acima, as cadeias laterais de Lisina são modificadas por acetilação para limitar a clivagem tríptica em resíduos de Arginina (e opcionalmente Cisteína não modificada que é acetilada em homoarginina e se torna um substrato para tripsina, veja acima).

Os métodos de identificação da presente invenção compreendem uma etapa de identificação, que é baseada em comparação de dados sobre características físico-químicas dos peptídeos com aqueles de um banco de dados de peptídeos.

Conseqüentemente, para cada fração de peptídeo obtida em uma ou mais etapas de separação dos métodos da presente invenção, dados são colhidos e armazenados em relação ao comportamento do peptídeo no método de separação, e.g. durante cromatografia. Tais dados incluem por exemplo o pH no qual a purificação foi realizada, a percentagem de solvente orgânico na qual um peptídeo elui de uma coluna de fase inversa, a concentração de sal em um dado pH no qual um peptídeo elui de uma matriz de troca iônica, a ligação (ou não ligação) do peptídeo em uma certa resina em um dado pH etc...

Adicional ou alternativamente, outros dados podem ser colhidos para cada peptídeo, que não é diretamente obtido da(s) etapa(s) de separação e purificação de peptídeo nos métodos da presente invenção. Conseqüentemente, para cada peptídeo, uma fração do peptídeo isolado pode ser armazenada para realizar ensaios para determinar as propriedades que não são determinadas durante purificação. Tais ensaios por exemplo incluem determinação da solubilidade, do coeficiente de partição em sistemas de solvente orgânico/água, detecção de grupos laterais de aminoácidos específicos (e.g. -OH, -SH, -NH2), etc.

Em uma outra etapa dos métodos de identificação da presente invenção, as frações de peptídeo compreendendo Histidina que têm sido isoladas como descrito acima, são analisadas por Espectrometria de Massa.

É observado que, os métodos de identificação da presente invenção, podem ser usados para a identificação de proteínas dentro de uma amostra ou para a identificação de proteínas dentro de uma mistura de amostras reunidas. No último caso, em adição à etiquetação de proteínas compreendendo Histidina nas amostras, as amostras são diferencialmente marcadas para permitir identificação da origem dos peptídeos etiquetados purificados. De acordo com uma modalidade particular, marcação diferencial é garantida usando os reagentes marcadores da presente invenção que permitem etiquetação e marcação simultâneas de peptídeos contendo Histidina. Conseqüentemente; onde duas ou mais amostras são analisadas simultaneamente como uma mistura de amostras reunidas, a fração de peptídeo potencialmente contém peptídeos idênticos contendo Histidina que são diferencialmente marcados.

A determinação acurada da massa dos peptídeos contendo Histidina em espectros MS que permite comparação com um banco de dados in silico para identificação é realizada pela acurácia de massa alta de espectrômetros de massa de resolução alta. Medições de massa por espectrometria são realizadas pela ionização de analitos na fase gasosa. A razão de massa-para-carga (m/z) das moléculas ionizadas é determinada e o número de íons para cada valor de m/z individual é contado. Cada característica em um espectro MS é portanto definida por dois valores, m/z e uma medição do número de íons detectados.

Como indicado acima, em uma outra etapa dos métodos de identificação da presente invenção, a massa experimentalmente determinada de um peptídeo compreendendo Histidina é comparada com as massas de peptídeos gerados in silico em um banco de dados.

A massa de um peptídeo é correlacionada com sua composição de aminoácido. Baseado na massa apenas entretanto, nem sempre é possível positivamente identificar um peptídeo. Por exemplo, massa apenas não permitirá discriminação entre peptídeos tendo a mesma composição e aminoácidos mas uma seqüência diferente (A1-A2-A3-A4-A5 versus A5-A1- A2-A3-A4). Ademais certas massas podem corresponder a um conjunto de peptídeos tendo uma seqüência diferente. Por exemplo um peptídeo curto com aminoácidos com cadeias laterais mais longas pode ter a mesma massa que a de um peptídeo mais longo que tem aminoácidos com cadeias laterais mais curtas.

Usando a etiquetação e o isolamento de peptídeo compreendendo Histidina como descrito na presente invenção, o número de peptídeos gerado de uma amostra de proteína é fortemente reduzido, comparado com o número total de peptídeos gerados pela digestão enzimática da amostra. Conseqüentemente, o banco de dados de peptídeos tríptico in silico usado para a identificação também necessita conter apenas peptídeos contendo Histidina (denominado banco de dados de peptídeos compreendendo Histidina).

Banco de dados de seqüências e proteínas existente podem ser usados como uma base para gerar um banco de dados de peptídeos compreendendo Histidina correspondendo ao proteoma de qualquer organismo. Para uma lista sempre crescente de organismos, o genoma completo, e o proteoma deduzido do mesmo é conhecido (www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes). Assim em banco de dados de peptídeo compreendendo Histidina in silico pode ser gerado no qual a clivagem de proteína e o isolamento de peptídeo são simulados. Dependendo da eficiência de um agente clivador, o banco de dados pode conter peptídeos nos quais a clivagem está incompleta.

Em um banco de dados de peptídeos compreendendo Histidina adequado no contexto deste aspecto da presente invenção, cada entrada inclui o nome da proteína parental e a massa do peptídeo compreendendo Histidina correspondente. Para cada entrada, também a composição de aminoácidos é importante, para calcular as diferenças de massa causadas pelas modificações naturais após a tradução (e.g. fosforilação em Serina, Treonina e Tirosina), tratamento da amostra (e.g. desamidação de Asparagina e Glutamina) ou modificações introduzidas durante a modificação/etiquetação da proteína e isolamento dos peptídeos compreendendo Histidina, em particular o aumento em massa em pelo menos um anel benzeno devido à marcação com ácidos aril-borônicos.

Entretanto, a massa de um peptídeo compreendendo Histidina experimental pode corresponder a peptídeos diferentes no banco de dados de peptídeos compreendendo Histidina correspondente. Para amostras específicas, tal como amostras para as quais pouca informação sobre a natureza esperada das proteínas está presente tal banco de dados pode portanto não ser suficientemente informativo para identificar a proteína parental de um peptídeo compreendendo Histidina apenas sobre a massa daquele peptídeo. Conseqüentemente, modalidades específicas dos métodos de identificação da presente invenção proporcionam uma identificação da proteína parental correspondente dos peptídeos contendo Histidina baseado não apenas na razão m/z, mas pela consideração de uma ou mais características adicionais tais como comprimento (número de aminoácidos), seqüência de aminoácidos, peso, hidrofobicidade, ponto isoelétrico, etc.

De acordo com uma modalidade particular da invenção, o banco de dados de peptídeos contendo Histidina corresponde ao proteoma de um agente clivador específico, e isto para uma dada espécie, correspondendo à origem das amostras. Um tal banco de dados de peptídeos também inclui variantes de editoração anotadas. O banco de dados de peptídeos in silico usado nos métodos da presente invenção, inclui características calculadas de peptídeos contendo Histidina como comprimento em aminoácidos, seqüência de aminoácidos, peso molecular, hidrofobicidade, ponto isoelétrico, etc.

Tem sido considerado que proteínas provenientes de fontes in vivo são muitas vezes modificadas após a tradução, e.g., através de grupos acetila, grupos formila, ou resíduos de ácido piroglutâmico, todos os quais terão uma influência sobre a m/z determinada em um espectro de massa. Conseqüentemente, em uma modalidade da presente invenção peptídeos sintéticos compreendendo Histidina são usados como padrões de referência para validar as características de peptídeo calculadas in silico.

A informação das bibliotecas de peptídeos sintéticos é usada para facilitar a identificação da natureza de picos de peptídeo de Espectrometria de Massa, evitando deste modo opcionalmente o sequenciamento de novo. A identificação será baseada em características medidas como tempo de retenção em HPLC, ponto isoelétrico e valor de m/z de espectro de massa comparado com a informação armazenada na biblioteca de peptídeos in silico.

Tipos diferentes de dados fisico-químicos são considerados, que, em combinação com os dados de m/z dos peptídeos compreendendo Histidina opcionalmente permitem uma identificação adicionalmente positiva da proteína parental sob comparação com um banco de dados de acordo com os métodos da presente invenção.

Um tipo de dados considerado é o de dados que são preditos da informação de seqüência e/ou que podem ser medidos durante etapas de purificação de peptídeo e MS, tais como ponto isoelétrico, carga efetiva em valores de pH diferentes, tempo de retenção hipotético em RP HPLC, absorção de UV a 214 e 280 nm, tendência para eluir de colunas de troca iônica em dados pH e concentrações de sal, hidrofobicidade, hidrofilicidade.

Hidrofobicidade pode ser calculada por exemplo pelo algoritmo de Bull e Breese. (1974) Arch. Biochem. Biophys. 161, 665-670. Pontos isoelétricos podem ser calculados por exemplo em www.expasy.ch/ tools/pi tool.html. Tempos de retenção em colunas de fase inversa são por exemplo preditos de acordo com o método de Krohkin et al. (2004) Mol. Cell. Proteomics 3,908-919.

Adicional ou alternativamente, o banco de dados usado no contexto dos métodos de identificação da presente invenção compreende dados obtidos em experimentos adicionais e não diretamente derivados da purificação de peptídeo, tais como, mas não limitados a, dados sobre solubilidade, partição sobre sistemas de duas fases de solvente orgânico/água, ensaios para a detecção de grupo reativo à proteínas (OH, NH2, SH), potencial de ionização, momento de dipolo, capacidade de ligação de hidrogênio e mobilidade iônica em fase gasosa.

Conseqüentemente, os métodos da presente invenção que proporcionam uma identificação baseada em uma comparação com banco de dados "anotado" de peptídeos compreendendo Histidina (i.e. compreendendo características físico-químicas adicionais que podem ser usadas para propósitos de identificação), permitem identificação da proteína parental correspondente com acurácia aumentada.

Opcional e adicional ou alternativamente aos parâmetros físico-químicos adicionais descritos acima, o banco de dados de peptídeos compreendendo Histidina usado no contexto da presente invenção adicionalmente compreende informação sobre padrões de expressão da proteína parental, etc., que adicionalmente ajuda a identificar a proteína parental. Onde as proteínas parentais diferem em seqüência de aminoácidos esperada para uma seqüência de peptídeo conservada que parece ser a única seqüência compreendendo uma Histidina dentro da proteína, as entradas correspondentes para estes peptídeos no banco de dados anotado de peptídeos compreendendo Histidina indicarão peptídeos contendo Histidina com massa idêntica e propriedades físico-químicas idênticas. A anotação adicional destas entradas com detalhes sobre expressão diferencial possível das proteínas parentais durante desenvolvimento do organismo, ou expressão específica em tecido, pode entretanto permitir a avaliação da proteína parental correta para o peptídeo isolado compreendendo Histidina. De fato, dependendo da origem da amostra de proteína, pode ser possível selecionar possíveis proteínas parentais diferentes, a expressão de uma das quais iguala-se àquela da amostra.

Nos métodos de identificação da presente invenção, para cada peptídeo a massa é determinada e comparada com o banco de dados anotado de peptídeos compreendendo Histidina. Conseqüentemente, são selecionadas aquelas entradas em banco de dados que têm uma massa calculada que corresponde à massa medida do peptídeo isolado. Dependendo do aparelho de MS e do tipo de amostra, comparação é realizada com a massa monoisotópica ou com a massa média.

Quando a massa monoisotópica é usada, tipicamente um erro de medição de 0,1 unidade de massa é incluído para selecionar entradas do banco de dados. Quando a massa média é usada tipicamente um erro de medição de 1 Da é incluído para selecionar entradas do banco de dados. Quando a massa medida corresponde a apenas uma entrada no banco de dados, a proteína parental é imediatamente identificada.

De acordo com modalidades particulares, quando a massa medida corresponde a mais do que uma entrada no banco de dados, todas estas entradas são selecionadas como um subconjunto. Uma outra identificação é realizada baseada na comparação dos parâmetros físico- químicos dos peptídeos isolados com aqueles do subconjunto de entradas no banco de dados. Tipicamente, aqueles parâmetros físico-químicos que podem ser diretamente derivados das etapas de purificação de peptídeo são considerados primeiro. De acordo com uma modalidade particular, pelo menos três características fisico-químicas são consideradas e identificação é realizada baseado em uma análise de "melhor ajuste". Quando apenas um parâmetro adicional é considerado, qual parâmetro é escolhido depende basicamente do poder de discriminação daquele parâmetro dentro do conjunto de peptídeos no banco de dados compreendendo Histidina com a mesma massa. Por exemplo se peptídeos diferentes no banco de dados de peptídeos compreendendo Histidina com uma massa correspondendo a massa experimentalmente determinada de um peptídeo têm quantidades diferentes de aminoácidos aromáticos, a absorção de UV a 214 e 280 nm pode ser usada como um critério de seleção. Entretanto, deve ser observado que pelo uso de reagentes etiquetadores ou marcadores ácido aril-borônico da presente invenção, um anel aromático é incorporado em cada peptídeo compreendendo Histidina. Se em outro exemplo, em um conjunto de 3 peptídeos no banco de dados com a mesma razão m/z, todos estes têm a mesma carga efetiva, mas a distribuição de carga é diferente (e.g. um peptídeo não tem aminoácidos carregados, outro tem uma Arg e um Asp, e outro tem duas Arg e dois Asp), o comportamento sob troca iônica pode ser usado como um critério para correlacionar o peptídeo isolado com um peptídeo específico no subconjunto do banco de dados.

Um outro aspecto da presente invenção proporciona ferramentas e dispositivos para a análise de quer uma única amostra de proteína quer a identificação e/ou quantificação simultâneas de proteínas em amostras diferentes. Como detalhado acima, modalidades particulares dos métodos da presente invenção envolvem a análise por Espectrometria de Massa da ocorrência relativa de peptídeos ou polipeptídeos marcados, isolados, seguida pela identificação de peptídeos.

Conseqüentemente, dispositivos para realizar os métodos da presente invenção compreendem um ou mais instrumentos espectrométricos de massa.

Medições de massa por espectrometria são realizadas pelo isolamento de analitos na fase gasosa. Um instrumento espectrométrico de massa típico consiste de 3 componentes: uma fonte de íons com o propósito de gerar íons das moléculas de interesse, um analisador de massa, que determina a razão de massa-para-carga (m/z) das moléculas ionizadas, e um detector que registra e conta o número de íons para cada valor de m/z individual. Cada característica em um espectro MS é definida por dois valores, m/z e uma medição sobre o número de íons, que alcançou o detector do instrumento.

A ionização de proteínas ou peptídeos para análise de massa em um espectrômetro é normalmente realiza por ionização por Eletropulverização (ESI) ou ionização/dessorção a laser assistida por matriz (MALDI).

Durante o processo de ESI analitos são diretamente ionizados da solução e ESI está portanto muitas vezes diretamente acoplada em ferramentas de separação por cromatografia líquida (e.g., HPLC de fase inversa). MALDI vaporiza via pulsos de laser amostras secas misturadas com moléculas orgânicas pequenas que absorvem a energia de laser como ácido cinâmico para tornar o processo mais efetivo.

O analisador de massa é um componente chave do espectrômetro de massa; parâmetros importantes são sensibilidade, resolução, e acurácia de massa. Há cinco tipos básicos de analisadores de massa correntemente usados em proteômica. Estes incluem a captura de íons, tempo- de-vôo (TOF), quadrupolo, Orbitrap, e cíclotron de íons com transformada de Fourier (FTICR-MS). MS em Tandem ou MS/MS pode ser realizado a tempo (captura de íons) e no seu lugar (com todos os instrumentos híbridos tais como e.g. LTQ-FTICR, LTQ-Orbitrap, Q-TOF, TOF-TOF, quadrupolo triplo e quadrupolo triplo/captura de íons linear híbrido (QTRAP))

A análise de amostras de proteína usando os métodos de etiquetação da presente invenção opcionalmente envolve a identificação adicional dos peptídeos gerados por MS/MS. Alternativamente, os métodos de identificação da presente invenção baseados em comparação com um banco de dados podem ser usados para evitar a análise por MS/MS.

Onde os métodos da invenção envolvem a análise de uma mistura reunida de peptídeos isotopicamente marcados, o espectro gerado em espectrômetro de massa para um de tal peptídeo marcado que tem sido isolado da mistura de peptídeos marcados isolados, contém um conjunto de picos com as diferenças de massa características entre os diferentes componentes marcadores isotópicos com os quais os peptídeos têm sido diferencialmente marcados (o número de picos será menor se uma proteína na qual este polipeptídeo ocorre não é expressada em uma das amostras). Alternativamente, onde os componentes marcadores usados na marcação diferencial são isobáricos, um pico único é gerado em MS. Pela sujeição deste pico à CID em MS/MS, os peptídeos correspondentes com massa idêntica são adicionalmente fracionados para liberar o grupo repórter do componente marcador isobárico para identificação da presença dos peptídeos correspondentes diferentemente marcados. Baseado em Mr do polipeptídeo, a composição de aminoácidos ou a seqüência de aminoácidos, a identidade dos peptídeos individuais é determinada.

Dispositivos adequados para realizar os métodos da presente invenção opcionalmente contêm ou estão conectados em um ou mais instrumentos de separação adequados, tais como instrumentos de eletroforese, instrumentos de cromatografia, tais como, mas não limitados a instrumentos de eletroforese capilar (CE), instrumentos de HPLC em fase inversa ((RP)- HPLC), e/ou instrumentos de cromatografia líquida bidimensional,... etc.

Como detalhado acima, os métodos da presente invenção opcionalmente compreendem um pré-tratamento das amostras, que pode ser realizado em uma etapa de pré-tratamento compreendendo um ou mais métodos de preparação de amostra listados acima. Conseqüentemente, dispositivos adequados para os métodos da presente invenção opcionalmente compreendem uma unidade de preparação de amostra compreendendo um ou mais dispositivos adequados para preparação de amostra e.g. dispositivos de sonificação, sistemas de cromatografia (afinidade, filtração em gel), unidades de ultrafiltração, centrífugas, frascos de reação de temperatura controlada com sistemas de alimentação para tampões, enzimas, detergentes etc... Uma modalidade específica deste aspecto da invenção refere- se a um dispositivo para análise única ou por multiplexação de amostras de proteína (100) compreendendo uma ou mais fontes de amostra (101), uma unidade de etiquetação/marcação (103), com fontes correspondentes de etiquetação/marcação (104), uma unidade de clivagem de proteína (105), uma unidade de separação por afinidade (106), uma unidade de separação de peptídeos (107), uma unidade de espectrômetro de massa (109) e um circuito de controle e unidade de análise de dados (110). Em modalidades particulares unidade de separação (107) compreende dois sistemas de separação ligados consecutivamente (1107) e (2107), sendo que o primeiro sistema de separação (1107) é e.g. um sistema de eletroforese em gel 2D ou um sistema de cromatografia de troca catiônica e sistema de separação, e o segundo sistema de separação (2107) é tipicamente um sistema de HPLC em fase inversa. Elemento espectrômetro de massa (109) é um espectrômetro MS ou MS/MS que separa formas isotópicas, usando MS/MS de novo permite sequenciamento de peptídeo de novo e a detecção diferencial de grupos repórter de marcadores isobáricos, onde usados. Análise por MS/MS pode ser feita utilizando 2 instrumentos fundamentalmente diferentes. No primeiro tipo de instrumento, a captura de íons na qual análise por MS/MS é feita na mesma captura de íons onde MS é realizado, mas MS/MS é feito a tempo (captura é cheia, todos os íons são ejetados exceto íon(s) de interesse e CID é realizada e os íons de fragmento são escaneados. Outros métodos adequados para fragmentar peptídeos incluem CAD (dissociação ativada por colisão), ETD (dissociação por transferência de elétrons), ECD (dissociação por captura de elétrons), IRMPD (dissociação por multifótons infravermelhos) e BIRD (dissociação radioativa no infravermelho por corpo negro).

O segundo tipo de instrumentos, instrumentos híbridos (quadrupolo triplo, q-tof, ltq-ftms, ltq-orbitrap), MS/MS separado no local, e.g. seleção parental é feita no primeiro analisador de massa e fragmentos são escaneados no segundo analisador de massa.

O dispositivo pode compreender adicionalmente numerosos elementos opcionais tais como uma unidade de preparação de amostra (102) nas quais ocorrem e.g. Iise de amostra e imunodepleção ou unidades de modificação adicional de proteína/peptídeo com fontes de reagente de modificação correspondentes. Unidades adequadas para incorporação nos dispositivos da presente invenção como unidades de espectrômetro de massa e unidades de separação são descritas acima.

O dispositivo pode compreender adicionalmente uma unidade de análise (108) na qual u são determinadas ma ou mais propriedades físico- químicas de um peptídeo purificado. Dados sobre a massa experimental de um peptídeo e suas propriedades físico-químicas obtidas durante purificação e opcionalmente obtidas na unidade de análise são comparados com um banco de dados anotado de peptídeos C-terminais (112) (indicado por linhas tracejadas em Figura 5).

Será reconhecido que os reagentes etiquetadores e marcadores e os métodos da presente invenção são aplicados em proteômica, perfil de expressão de proteína, descoberta de biomarcador e descoberta de alvo.

Outros arranjos dos sistemas e métodos e modalidades da invenção serão óbvios para aquelas pessoas experientes na arte.

É para ser entendido que embora modalidades preferidas, construções e configurações específicas, bem como materiais, tenham sido aqui discutidos para dispositivos de acordo com a presente invenção, várias mudanças ou modificações na forma e no detalhe podem ser feitas sem se desviarem do escopo e do espírito desta invenção. EXEMPLOS

r

Exemplo 1: Síntese de Biotina Modificada com Acido Borônico

a: sNHS-biotina + m-APBA

500 \iL· de uma solução de sNHS-biotina (sulfo-N-hidróxi- succinimido-biotina) 10 mM, 25 μΐ. de uma solução de m-APBA (ácido m- amino-fenil-borônico) 10 mM, 60 μΐ, de solução de estoque 10 χ PBS e 60 μΕ de água são misturados na temperatura ambiente por duas horas.

O esquema de reação é ilustrado em Figura 6. Figura 7 mostra espectros no IR dos reagentes sulfo-NHS-biotina (superior) e ácido m-amino- fenil-borônico (meio), e da mistura reacional não purificada após agitação (inferior), compreendendo o produto de reação (i.e. o composto com fórmula (II)). O espectro inferior mostra uma vibração adicional a cerca de 1685 cm"1 (indicado com uma seta em Figura 7) que pode ser atribuída à ligação amida formada entre biotina e ácido m-amino-fenil-borônico. b: copulação mediada por EDC de biotina + m-APBA

A reação de biotina com m-APBA é realizada via copulação mediada por EDC é realizada de acordo com a instrução do fabricante (Pierce Chemical, IL, USA). O esquema de reação é mostrado em Figura 8. Exemplo 2: Copulação de Histidina-Oligopeptideo em Biotina Modificada

r

com Acido Borônico

500 μΕ de uma solução 10 mL de biotina modificada com ácido Borônico como obtida em Exemplo 1 são misturados com 250 μΕ de uma solução 10 mM de FITC-Ahx-His6 (Ácido fluoresceína-isotiocianato-6- amino-hexacarboxílico-hexa-Histidina), 25 μΕ de uma solução 10 mM de [Cu(OH)TMEDAJ2Cl2, 90 μΕ de uma solução de estoque de 10 χ PBS e 35 μΕ de água. A mistura é agitada durante a noite em atmosfera de oxigênio.

O esquema de reação é ilustrado em Figura 9. Ainda que a Figura mostre um peptídeo compreendendo uma hexa-Histidina, a presença de Histidinas múltiplas não é exigida de acordo com a presente invenção para etiquetar por reação com um grupo aril-borônico.

Claims

1. Método para ligar covalentemente uma etiqueta de afinidade a uma proteína compreendendo uma Histidina, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de contactar a proteína com um composto com uma estrutura geral (I): <formula>formula see original document page 65</formula> sendo que A é uma etiqueta de afinidade, B é boro e L é um ligante opcional, na presença de um catalisador de cobre.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto é adicionalmente substituído no anel aromático com um halogênio, um grupo alcoxila ou um grupo alquila.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etiqueta de afinidade A é biotina.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto corresponde a uma molécula com fórmula (II): <formula>formula see original document page 65</formula>

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto adicionalmente compreende um marcador.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o marcador consiste de um ou mais isótopos de metal pesado.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto corresponde a uma molécula com fórmula (III): <formula>formula see original document page 65</formula> (III)

8. Método para isolar peptídeos contendo Histidina de uma amostra de proteína ou uma mistura de amostras de proteína reunidas, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) clivar as proteínas intactas na(s) amostra(s) de proteína com um agente clivador em peptídeos, b) contactar a(s) amostra(s) de proteína com um reagente etiquetador aril-borônico tendo a fórmula estrutural geral (I), sendo que A é uma etiqueta de afinidade, B é boro, e L é um ligante opcional, na presença de um catalisador de cobre, de modo a permitir a reação do reagente etiquetador aril-borônico com Histidina onde presente nos peptídeos, c) ligar os peptídeos etiquetados em uma matriz de afinidade via dita etiqueta de afinidade, e d) remover os peptídeos etiquetados ligados da matriz de afinidade para obter peptídeos isolados contendo Histidina.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a etapa b) é realizada antes da etapa a) e o reagente etiquetador aril-borônico é contactado com proteína(a) não-clivada(s) na(s) amostra(s), resultando em uma etiquetação de Histidina onde presente nas proteínas.

10. Método para simultaneamente analisar a ocorrência de uma ou mais proteínas compreendendo Histidina em amostras diferentes, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) opcionalmente clivar as proteínas intactas na(s) amostra(s) com um agente clivador em peptídeos, b) contactar cada uma das amostras com um de um conjunto de reagentes etiquetadores aril-borônicos na presença de um catalisador de (!) cobre, por meio do qual reagentes marcadores ácido borônico têm a fórmula estrutural geral (I), <formula>formula see original document page 67</formula> sendo que A é uma etiqueta de afinidade, B é boro, e L é um ligante opcional, e adicionalmente compreende uma marcação que é uma marcação isotópica ou isobárica, de tal modo que a estrutura de cada um dos reagentes marcadores seja essencialmente a mesma, c) reunir as amostras diferentes para obter uma mistura de amostra de peptídeo ou polipeptídeo, d) seletivamente isolar os peptídeos ou polipeptídeos marcados da mistura de amostra de peptídeo ou polipeptídeo via a etiqueta de afinidade, e) analisar por Espectrometria de Massa a ocorrência dos polipeptídeos ou peptídeos marcados isolados.

11. Método para identificar a presença de uma proteína em uma amostra de proteína, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) modificar Histidina das proteínas na amostra de proteína pelo contato das proteínas com um reagente marcador com a estrutura geral <formula>formula see original document page 67</formula> sendo que A é uma etiqueta de afinidade, B é boro e L é um ligante opcional, na presença de um catalisador de cobre, b) clivar as proteínas na amostra de proteína em peptídeos com um agente clivador, c) isolar dos ditos peptídeos os peptídeos contendo Histidina, via a etiqueta de afinidade, d) purificar os peptídeos isolados compreendendo Histidina por uma ou mais etapas de purificação de peptídeo, de modo a obter os peptídeos purificados contendo Histidina, e) determinar ou calcular pelo menos uma propriedade físico- química, diferente da massa, dos peptídeos purificados contendo Histidina, f) determinar a massa em MS dos peptídeos isolados e purificados compreendendo Histidina, e g) comparar, para cada peptídeo isolado e purificado compreendendo Histidina, a massa e a pelo menos uma outra propriedade físico-química com um banco de dados compreendendo a massa e a pelo menos uma propriedade físico-química de todos peptídeos contendo Histidina gerados por dito agente clivador, de modo a identificar a proteína parental correspondente do peptídeo purificado compreendendo Histidina, identificando desta maneira a presença da proteína parental na amostra de proteína.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a etapa (g) compreende identificar para cada um dos peptídeos isolados e purificados contendo Histidina, um ou mais peptídeos contendo Histidina no banco de dados com uma massa correspondendo à massa do peptídeo isolado e purificado contendo Histidina, e, quando mais do que um peptídeo são identificados para um peptídeo isolado e purificado contendo Histidina, comparar pelo menos um outro parâmetro físico-químico do peptídeo isolado e purificado contendo Histidina com aqueles de mais do que um dos peptídeos identificados no banco de dados.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a amostra de proteína é de uma espécie e o banco de dados compreende a massa e pelo menos uma outra propriedade físico-química de todos os peptídeos contendo Histidina daquela espécie gerados por dito agente clivador.

14. Método de acordo com a reivindicação 11, em que a proteína é identificada simultaneamente em duas ou mais amostras e sendo caracterizado pelo fato de que compreende: - em etapa (a) realizar a modificação para cada uma das amostras com um de um conjunto de reagentes etiquetadores compreendendo um componente de marcação diferencial, - uma etapa adicional de reunir as duas ou mais amostras antes da etapa (d), e - antes da etapa (f), a etapa de identificar a natureza da marcação de modo a identificar a amostra da qual o peptídeo se origina.

15. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma propriedade físico-química é determinada durante a uma ou mais etapas de purificação de peptídeo.

16. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma propriedade físico-química é selecionada do grupo consistindo de pi, tempo de retenção durante cromatografia em fase inversa e a taxa de absorção de UV em 280 e 214 nm.

17. Composto para etiquetar Histidina em uma proteína ou um peptídeo, caracterizado pelo fato de ter a estrutura geral (I): <formula>formula see original document page 69</formula> sendo que A é uma etiqueta de afinidade selecionada do grupo consistindo de biotina ou uma molécula derivada de biotina, maltose, uma lectina, e um hapteno ligante em anticorpos específicos para hapteno, B é boro e L é um ligante opcional.

18. Composto de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o anel aromático está adicionalmente substituído com um halogênio, um grupo alcoxila ou um grupo alquila.

19. Composto de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a etiqueta de afinidade A é biotina.

20. Composto de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de ter a fórmula (II): <formula>formula see original document page 70</formula> (Il)

21. Composto de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente um componente marcador.

22. Composto de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o componente marcador consiste de um ou mais isótopos pesados.

23. Composto de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de ter a fórmula (III) <formula>formula see original document page 70</formula> (III) sendo que um ou mais átomos de carbono e/ou um ou mais átomos de hidrogênio no ligante entre o grupo biotina e o grupo aril-borônico estão substituídos por 13C e deutério respectivamente.

24. Conjunto de reagentes marcadores para análise por Espectrometria de Massa de polipeptídeos, caracterizado pelo fato de que todos os reagentes marcadores no conjunto têm uma estrutura química idêntica como definida na reivindicação 17, e sendo que cada reagente marcador no conjunto tem um componente marcador isotópico singular.

25. Conjunto de reagentes, caracterizado pelo fato de que os reagentes marcadores individuais de dito conjunto têm uma estrutura de acordo com a fórmula (III): O (III) sendo que um ou mais átomos de carbono e/ou um ou mais átomos de hidrogênio no ligante entre o grupo biotina e o grupo aril-borônico estão substituídos por C e deutério respectivamente.

26. Uso de um composto como definido na reivindicação 17, ou do conjunto de reagentes marcadores como definidos na reivindicação 24, caracterizado pelo fato de ser para a marcação de proteínas.

27. Banco de dados de peptídeos contendo Histidina de proteínas de um organismo clivadas in silico por um agente clivador, caracterizado pelo fato de que cada peptídeo compreende: -um identificador de proteína, -sua composição de aminoácidos, -sua massa, sendo que a massa é a massa do peptídeo não modificado ou a massa do peptídeo após modificação ou marcação.

28. Banco de dados de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que os peptídeos com uma seqüência diferente e uma mesma massa são adicionalmente distinguidos por pelo menos um parâmetro físico-químico de dito peptídeo diferente de sua massa.

29. Banco de dados de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o agente clivador é tripsina.

30. Uso de banco de dados como definido na reivindicação 27, caracterizado pelo fato de ser para a identificação de proteínas.

31. Dispositivo (100) para análise e marcação por multiplexação de amostras de proteína, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos uma fonte de amostras (101), uma unidade de marcação (103) e fontes correspondentes de reagentes marcadores aril- borônicos (104), uma unidade de clivagem de proteína (105), uma unidade de separação por afinidade (106), uma unidade de separação (107), uma unidade de espectrômetro de massa (109) e uma unidade de análise de dados (110) conectada com um banco de dados anotado (112) de peptídeos compreendendo Histidina clivados in silico.

32. Dispositivo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente uma unidade de preparação de amostra (102) e/ou uma unidade de análise (108) para determinar as propriedades físico-químicas dos peptídeos purificados na unidade de separação (107).

33. Uso de um composto, caracterizado pelo fato de ser para etiquetar Histidina em uma proteína ou peptídeo, o composto tendo a estrutura geral (I): <formula>formula see original document page 72</formula> em que A é uma etiqueta de afinidade selecionada do grupo consistindo de biotina ou uma molécula derivada de biotina, maltose, uma lectina, um hapteno que se liga a anticorpos específicos de hapteno, e glutationa, e B é boro e L é um ligante opcional. (D