CN105229164A - 指示癌症疗法的srm测定 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供来自ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFRI蛋白质的特异性肽和所述肽的来源电离特性，其特别有利于通过选择反应监测(SRM)质谱法或多反应监测(MRM)质谱法的方法直接定量在已经固定在福尔马林中的生物样品中的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFRI蛋白质。

Description

指示癌症疗法的SRM测定
引言
肺癌是最普遍的癌症(美国每年>200,000个新增病例)且具有五年低存活率(约15％)。肺癌的疗法从使用由放射、叶酸代谢、基于铂的药物和/或基于紫杉醇的药物组成的疗法的有限选择过渡到需要组织学表征肿瘤和/或关键生物标志物或治疗靶标蛋白质的存在与否的更大程度靶向的治疗。所有肺癌中有整整80％的肺癌属于非小细胞肺癌(NSCLC)类型且该一般类型可基于组织学分析分成4种不同的亚型：腺癌、鳞状细胞癌、细支气管肺泡癌和大细胞未分化癌。剩余20％的肺癌被称为小细胞肺癌(SCLC)。近来利用的靶向癌症疗法已经在治疗NSCLC患者和SCLC患者两方面显示出激动人心的成功。癌症疗法的靶向方法在癌症的生长是由一种或多种特异性靶标蛋白质驱动时最有利，其中该一种或多种靶标癌症的蛋白质被设计并制造成抑制该一种或多种靶标蛋白质的治疗剂特异性攻击，因此抑制癌症的生长。提供肽和肽序列以便在SRM/MRM测定中使用，该SRM/MRM测定可用以定量地确定在来源于肺癌患者的肿瘤组织中直接表达或过度表达的蛋白质靶标。这容许改进对于靶向肺癌疗法的治疗判断。还提供一种SRM/MRM测定，其可用以定量地确定在来源于具有除肺癌外的癌症的患者的肿瘤组织中直接表达或过度表达的蛋白质靶标，从而改进对于不是肺癌的任何其它癌症的靶向治疗判断。
概述
提供来源于以下蛋白质的子序列的特异性肽：ALK、Ros、Ron、Ret、TS和FGFR1。ALK也称作ALK酪氨酸激酶受体和CD246且在本文中称为ALK。Ros也称作c-Ros受体酪胺酸激酶且在本文中称为Ros。Ron也称作巨噬细胞-刺激蛋白质受体CD136和p185-Ron且在本文中称为Ron。Ret也称作原致癌基因酪氨酸-蛋白激酶受体Ret和原致癌基因c-Ret且在本文中称为Ret。TS也称作胸苷酸合酶且在本文中称为TS。FGFR1也称作成纤维细胞生长因子受体1和CD331且在本文中称为FGFR1。
来源于蛋白质的各种肽的肽序列和碎裂/过渡离子可潜在地用于基于质谱的选择性反应监测(SRM)测定中，其在本文中也称为多反应监测(MRM)测定，在下文中简称为SRM/MRM测定。描述了用于ALK、Ros、Ron、Ret、TS和FGFR1蛋白质和那些蛋白质的同种型的SRM/MRM分析的肽的用途。
可使用一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或五种或六种SRM/MRM测定来检测来自ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的特异性肽中的一种或多种的存在并测量其相对或绝对定量水平，且由此提供通过质谱法测量在从生物样品中获得的给定蛋白质制剂中那些蛋白质中的每一种的总量的方法。可自那些蛋白质得到的肽中的全部或全部的一部分也可在单一SRM/MRM测定中同时分析或可在单个SRM/MRM测定的任何组合中分析。所述肽各自提供通过质谱法测量在从生物样品中获得的给定蛋白质制剂中相应蛋白质中的每一种的总量的潜在方法。
本文描述的SRM/MRM测定可直接测量在由从例如福尔马林固定的癌症患者组织(例如，活检)的患者组织样品取得的细胞制备的复杂蛋白质溶胞样品中的这些肽。由福尔马林固定的组织制备蛋白质样品的方法描述在美国专利7,473,532号中，其内容以引用的方式整体并入本文中。在该专利中描述的方法可使用自ExpressionPathologyInc.(Rockville,MD)得到的LiquidTissue试剂和方案方便地进行。
甲醛/福尔马林固定从癌症患者中手术移出的组织是在病理学实践中已经接受的惯例。因此，甲醛/福尔马林固定的石蜡包埋组织是来自那些患者的组织的最广泛可用的形式。甲醛/福尔马林固定通常采用称为福尔马林的甲醛水溶液。“100％”福尔马林由甲醛在水中的饱和溶液(约40体积％甲醛或37质量％)组成，其具有少量用以限制氧化和聚合程度的通常为甲醇的稳定剂。保藏组织的最常用方式是将整体组织在通常称为10％中性缓冲的福尔马林的水性甲醛中持续时间(8小时-48小时)浸泡，接着在室温下将固定的整体组织包埋在石蜡中以便长期储存。因此，分析福尔马林固定的癌症组织的分子分析方法将是用于分析癌症患者组织的最被接受且大量利用的方法。
来自所述一种或多种SRM/MRM测定的结果可用于关联在自其中收集并保藏组织(生物样品)的患者或受试者的具体组织样品(例如，癌症组织样品)内这些蛋白质中的任一种或全部的准确且精确的定量水平，加之这些蛋白质的潜在同种型的准确且精确的定量水平。这不仅提供关于癌症的诊断信息，而且容许医师或其它医疗专业人员确定用于患者或受试者的适当疗法。提供关于在患病组织中或在另一患者/受试者样品中蛋白质表达水平的诊断和治疗重要信息的这一测定称为伴随诊断测定。例如，这一测定可设计用以诊断癌症的阶段、程度或组织学并确定将最有效阻止癌症细胞生长的治疗剂，从而确定患者或受试者将最可能应答的治疗剂。
更具体地讲，在来自患者的癌症细胞中的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或多种、五种或多种的检测和/或定量指示最值得注意的是肺癌的癌症的生长，并鉴定可通过靶向治疗方案靶向的蛋白质。
详述
本文所述的测定量化或测量来自包括ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的蛋白质的特异性未修饰肽的相对或绝对水平并且可测量来自那些蛋白质的特异性修饰肽的相对或绝对水平。修饰的实例包括在所述肽上存在的磷酸化氨基酸残基和糖基化氨基酸残基。
蛋白质和潜在同种型的相对定量水平可通过SRM/MRM方法学，例如通过比较SRM/MRM波形特征峰面积(例如，波形特征峰面积或积分的片段离子强度)来确定。单个ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1肽的相对水平可在不同样品(例如，对照样品和由患者或受试者的组织制备的样品)中确定。或者，在各种肽具有其自己的具体SRM/MRM波形特征峰的情况下，可以比较ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1波形特征肽中的一种或多种的多个SRM/MRM波形特征峰面积。通过比较峰面积，可以确定在一种生物样品中或在一种或多种额外或不同的生物样品中相对ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质和潜在蛋白质同种型的含量。以此方式，可通过可在相同实验条件下测定多个(例如，2、3、4、5或更多个)生物样品来确定来自那些蛋白质的一种或多种特定肽的相对量且因此确定ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质及其潜在同种型的相对量。另外，相对定量可通过比较通过SRM/MRM方法学得到的一种或多种给定肽的波形特征峰面积与来自在来自生物样品的相同蛋白质制剂内的一种或多种不同蛋白质的一种或多种另外且不同的肽的波形特征峰面积而对于来自在单一样品内的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的所述一种或多种给定肽来确定。
使用所述方法学，可确定来自ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的特定肽的量，因此确定相应蛋白质及其潜在同种型中的每一种的量，所述量是相对于在同一样品内或在不同样品中的一者对于另一者而言的。因为单个肽或多种肽的相对定量可相对于在样品内或在样品之间另外一种或多种肽的量来进行，所以可以确定所存在的肽的相对量(例如，通过确定一种肽相对于另一种肽的峰面积)，而与在生物样品中蛋白质的绝对重量:体积或重量:重量的量无关。因此，在来自生物样品的蛋白质制剂中ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1肽的量可用来确定在各种样品内及在各种样品之间那些蛋白质的量。通常将关于在不同样品之间单个波形特征峰面积的相对定量数据标准化成每种样品中所分析蛋白质的量(例如，使用样品的总蛋白质浓度和所分析的体积来使样品标准化)。相对定量可对于来自多种蛋白质的许多肽和在单一样品中的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质同时进行和/或对于许多样品进行，以获得对于相对蛋白质量和/或一种肽/蛋白质相对于其它肽/蛋白质的进一步了解。
ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的绝对定量水平通过例如SRM/MRM方法学确定，由此将来自在一种生物样品中的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的单个肽的SRM/MRM波形特征峰面积与在已知量的样品中“示踪的”已知量的一种或多种内标物(例如，同位素标记的标准物)的SRM/MRM波形特征峰面积相比较。在一个实施方案中，所述内标物为合成形式的相同的精确的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1肽，其含有用一种或多种重同位素标记的一个或多个氨基酸残基。合成所述同位素标记的内标物，由此质谱分析产生与天然ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1肽波形特征峰不同且截然不同并可用作比较峰的可预测且一致的SRM/MRM波形特征峰。因此，当内标物以已知量示踪到来自已知量的生物样品的蛋白质或肽制剂中并通过质谱分析时，可将天然肽的SRM/MRM波形特征峰面积与内标肽的SRM/MRM波形特征峰面积相比较。数值比较容许计算在来自生物样品的原始蛋白质制剂中存在的天然肽的绝对摩尔浓度和/或绝对重量，可由其确定相应蛋白质的浓度和重量。片段肽的绝对定量数据通常根据每种样品中所分析的蛋白质的量来显示。绝对定量可对于许多肽进行，其容许同时定量确定在单一样品中的多种蛋白质(例如，两种、三种、四种、五种等)；和/或对于多种样品进行，以获得对于在单个生物样品中和/或在整组的单个样品中绝对蛋白质量的了解。在一个实施方案中，蛋白质的定量可使用如由Gygi等在美国专利7,501,286中描述的肽标准物来进行。
除非另作指定，否则本文使用的术语量化(quantify)、量化(quantifying)、测量(measure)或测量(measuring)意指测定例如蛋白质、多肽、肽、标准物(例如，内标物)的分析物的相对或绝对水平。
本文所述的测定法可在采用例如源自患者或源自受试者的组织如福尔马林固定的组织时用作确定癌症的阶段的辅助手段。本文所述的SRM/MRM测定也可用作确定哪种治疗剂将最有利地用于治疗该患者或受试者的辅助手段。
为了检验与本文所述的肺癌相关的蛋白质的水平，可对经由手术除去部分或全部肿瘤或经由为了确定疑似疾病的存在与否而进行的活检方法从患者或受试者移出的癌性组织或怀疑患癌的组织进行分析。分析所述组织的样品以确定ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质中的一种或多种和那些蛋白质的形式在患者或受试者的组织中是否存在。此外，可确定那些蛋白质中的一种或多种的表达水平并将其与在健康组织中见到的“正常”或参考水平相比较。在健康组织中的蛋白质的正常或参考水平可来源于例如没有癌症的一个或多个个体的有关组织。或者，可通过分析未受癌症影响的有关组织(例如，相同器官的部分)对于具有癌症的个体获得正常或参考水平。
蛋白质或肽的水平或量可定义为通过SRM/MRM测定确定的蛋白质或肽的以摩尔、质量或重量表示的量。可将该水平或量标准化成在所分析的溶胞产物中的蛋白质或另一组分的总水平或量(例如，以微摩尔/微克蛋白质或微克/微克蛋白质表示)或甚至标准化成以重量计的DNA的量(例如，微摩尔或微克/微克DNA)。另外，蛋白质或肽的水平或量可基于体积确定，例如以微摩尔或纳克/微升表示。如通过SRM/MRM测定确定的蛋白质或肽的水平或量也可标准化成所分析的细胞的数目。
关于ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质和这些蛋白质的同种型的信息可通过关联或比较所述ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质及其同种型或片段肽的水平与在正常组织中观察到的水平而用以帮助确定癌症的组织阶段或等级。一旦确定了癌症的组织阶段和/或等级和/或ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质表达特征，则可将信息与经研发以特异性治疗由例如所测定的一种或多种蛋白质(例如，ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1)的异常表达为特征的癌症组织的治疗剂(化学和生物)列表相匹配。使来自具体个体的来自ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质测定的信息与特异性靶向表达ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的细胞/组织的治疗剂列表相匹配代表着治疗包括肺癌的癌症的个性化用药方法。本文所述的测定法通过使用来自患者或受试者自身的组织的蛋白质的分析作为诊断和治疗判断的来源形成个性化用药方法的基础。
肽产生
原则上，通过已知特异性的任何蛋白水解方法制备的来源于ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的任何预测肽都可用作代理报告基因来确定ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的丰度。在一个实施方案中，将样品用已知特异性的一种或多种蛋白酶(胰蛋白酶和/或胞内蛋白酶Lys-C中的一种或多种)消化。可将由蛋白水解处理产生的一种或多种肽用作代理报告基因以在例如基于质谱的SRM/MRM测定的合适测定中确定ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质中的一种或多种的丰度。类似地，也可使用含有在ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质中已知将修饰的位点处的氨基酸残基的任何预测肽序列来测定在样品中ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的修饰程度。
ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1片段肽可通过包括使用在美国专利7,473,532中提供的LiquidTissueTM方案的多种方法来产生。LiquidTissueTM方案和试剂能够通过蛋白质水解消化在组织/生物样品中的蛋白质而由福尔马林固定的石蜡包埋组织生成适合质谱分析的肽样品。在LiquidTissueTM方案中，组织/生物制剂维持在缓冲液中在高温下历时持续的时间(例如，约80℃-约100℃，约10分钟-约4小时的时间)以逆转或释放蛋白质交联。所采用的缓冲液为中性缓冲液(例如，基于Tris的缓冲液或含有洗涤剂的缓冲液)，且有利地为不妨碍质谱分析的缓冲液。紧接着，将组织/生物样品用包括但不限于胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶和胞内蛋白酶Lys-C的一种或多种蛋白酶处理历时足以破坏所述生物样品的组织和多孔结构并使所述样品液化的时间(例如，在约37℃-约65℃的温度下约30分钟-约24小时的时间)。加热和蛋白水解的结果为液态可溶性可稀释的生物分子溶胞产物。在一个实施方案中，在生物样品的蛋白水解处理中采用选自胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶和胞内蛋白酶Lys-C的两种或更多种蛋白酶。
肽分离和测定
一旦制备出溶胞产物，则可对在样品中的肽进行促进其分析和测量(定量)的各种技术。在分析通过质谱进行的情况下，可采用一种或多种色谱法来促进分析。
在一个实施方案中，所述肽在通过质谱仪分析之前通过液相色谱法(LC)分离。例如，肽可在具有用JupiterProteoC12,4μm树脂(Phenomenex,Torrance,CA)自填充到12cm的床长度的PicoFrit(100μmID/10μm尖端ID,NewObjective)柱的nanoAcquityLC系统(Waters,Milford,MA)或EASY-nLCII(ThermoScientific,SanJose,CA)上分离。肽可经含有0.1％甲酸的1％-50％乙腈的12分钟色谱梯度且以800nL/min的流速洗脱。一旦通过液相色谱分离，则将洗脱的肽引导到质谱仪中以便分析。在一个实施方案中，质谱仪装备有纳米喷雾来源。
在另一实施方案中，所述肽可通过亲和技术如基于免疫的纯化(例如，免疫亲和纯化)；在离子选择性介质上色谱分离；或如果肽是被修饰的，则通过使用例如用于分离碳水化合物修饰的肽的凝集素的适当介质分离来分离。在又一实施方案中，采用SISCAPA方法，其在质谱分析之前采用肽的免疫分离。SISCAPA技术例如描述在美国专利7,632,686号中。在其它实施方案中，在通过质谱法分析之前可使用凝集素亲和方法(例如，亲和纯化)和/或色谱法来从溶胞产物中分离肽。包括基于凝集素的方法的分离肽组的方法例如描述在Geng等，J.ChromatographyB,752:293-306(2001)中。免疫亲和色谱技术、凝集素亲和技术及其它形式的亲和分离和/或色谱法(例如，逆相、基于尺寸的分离、离子交换)可以任何合适的组合使用以促进通过质谱法分析肽。
已经惊奇地发现来自ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的许多潜在肽序列并不适合在基于质谱的SRM/MRM测定中使用或者在基于质谱的SRM/MRM测定中使用是低效的，其原因并不明显。具体地讲，发现来自ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的许多胰蛋白酶肽不能在来自福尔马林固定的石蜡包埋组织的LiquidTissueTM溶胞产物中有效地检测或在其中根本不能检测。因此，MRM/SRM测定不可能预测最适合的肽，所以必须在实验上鉴定在真实LiquidTissueTM溶胞产物中修饰和未修饰的肽以研发用于ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的可靠且准确的SRM/MRM测定。尽管不希望受任何理论约束，但认为一些肽可能例如难以通过质谱法检测，因为它们不会彻底地电离或生成与其它蛋白质截然不同的片段，肽也可能无法在分离(例如，液相色谱)中彻底地解析或者附着到玻璃或塑料器具上。因此，可在由福尔马林固定的组织样品制备的LiquidTissueTM溶胞产物中检测的来自ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的那些肽(例如，在表1和表2中的肽)为在ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质SRM/MRM测定中可采用SRM/MRM测定的肽。在一个实施方案中，在单一样品中ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的片段的同时制备中采用的蛋白酶将是胰蛋白酶。
在本文所述的各种实施方案中见到的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1肽(例如，表1和/或表2)通过胰蛋白酶消化在由从福尔马林固定的癌症组织中取得的细胞制备的复杂LiquidTissueTM溶胞产物内的所有蛋白质而来源于ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质。除非另外指出，否则在各种情况下，该蛋白酶都为胰蛋白酶。LiquidTissueTM溶胞产物随后通过质谱法分析以确定通过质谱法检测并分析的来源于ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的那些肽。用于质谱分析的具体优选的肽亚组的鉴定基于：1)实验确定在LiquidTissueTM溶胞产物的质谱分析中电离的来自蛋白质的一种或多种肽，和2)肽经受住在制备LiquidTissueTM溶胞产物中使用的方案和实验条件的能力。后一性质不仅扩展到肽的氨基酸序列，而且扩展到在肽内的修饰氨基酸残基在样品制备期间以修饰形式继续存在的能力。
来自从福尔马林(甲醛)固定的组织中直接取得的细胞的蛋白质溶胞产物使用LiquidTissueTM试剂和方案制备，LiquidTissueTM试剂和方案要求经由组织显微解剖将细胞收集到样品管中，接着在LiquidTissueTM缓冲液中持续时间加热细胞。一旦负面地影响到福尔马林诱发的交联，组织/细胞则使用例如胰蛋白酶的蛋白酶以可预测的方式消化完成，不过可使用其它蛋白酶。各种蛋白质溶胞产物通过用蛋白酶消化完整的多肽而转化成肽的集合。分析(例如，通过离子阱质谱法)各LiquidTissueTM溶胞产物以进行肽的多重整体蛋白组学调查，其中数据作为来自在各种蛋白质溶胞产物中存在的所有细胞蛋白质的与可通过质谱法鉴定的肽一样多的肽的鉴定而提供。对于分析，通常采用离子阱质谱仪或能够进行整体剖析的另一形式的质谱仪以便鉴定来自单一复杂蛋白质/肽溶胞产物的尽可能多的肽。尽管可研发SRM/MRM测定并且在包括MALDI、离子阱或三重四极质谱仪的任何类型的质谱仪上进行，但用于SRM/MRM测定的最有利的仪器平台常考虑的是三重四极仪器平台。
一旦在所采用的条件下在单一溶胞产物的单一MS分析中鉴定出尽可能多的肽，则将肽的列表合并用用以确定在该溶胞产物中检测到的蛋白质。该过程对于多种LiquidTissueTM溶胞产物重复，且将非常大的肽列表合并成单一数据集。可将该类型的数据集视为代表可在被分析的生物样品类型(例如，蛋白酶消化之后)中，且特别是在生物样品的LiquidTissueTM溶胞产物中检测到的肽，且因此包括例如ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的具体蛋白质的肽。
在一个实施方案中，被鉴定为可用于确定ALK(例如，NCBI登录号：Q9UM73，SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:5)；Ros(例如，NCBI登录号：P08922，SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8)；Ron(例如，NCBI登录号：Q04912，SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13)；Ret(例如，NCBI登录号：P07949，SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25和SEQIDNO:26)；TS(例如，NCBI登录号：P04818，SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34和SEQIDNO:35)；和/或FGFR1(例如，NCBI登录号：P11362，SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38和SEQIDNO:39)的绝对或相对量的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1胰蛋白酶肽包括以下肽中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种或十种或更多种或全部：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16.SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38和SEQIDNO:39，其各自列在表1中。那些肽各自在由福尔马林固定的石蜡包埋组织制备的LiquidTissueTM溶胞产物中通过质谱法检测。因此，在表1中的每种肽或那些肽的任意组合(例如，在表1中列举的那些肽中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种或七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种或十种或更多种)为用于直接包括在福尔马林固定的患者或受试者组织中的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的定量SRM/MRM测定的候选物。
表1
在表1中列出的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1肽包括从包括前列腺、结肠和乳腺的不同人类器官的多种不同福尔马林固定的组织的多种LiquidTissueTM溶胞产物中检测到的那些。那些肽各自被视为可用于在福尔马林固定的组织中的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的定量SRM/MRM测定。这些实验的进一步数据分析指示，并不优选观察来自任何具体器官位点的任何特异性肽。因此，这些肽中的每一种被认为是适合对来自来源于任何生物样品或体内的任何器官位点的任何福尔马林固定的组织的LiquidTissueTM溶胞产物进行ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的SRM/MRM测定。
在另一实施方案中，SRM/MRM测定对于TS和FGFR1中的每一种采用一种或两种肽(例如，来自在表1中列出的肽)。在另一实施方案中，SRM/MRM测定对于ALK、Ros、Ron和/或Ret中的每一种采用一种或两种肽(例如，来自在表1中列出的肽)。
在其它实施方案中，测定ALK和Ros蛋白质中的一种或两种，且使用一种或多种SRM/MRM测定来测定Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质中的一种、两种、三种或四种。在所述实施方案的一个实例中，对于Ron和Ret蛋白质中的一种或两种，通过SRM/MRM测定来测定至少一种肽或至少两种肽(例如，在表1中列出的Ron和Ret肽)；且对于ALK、Ros、TS和/或FGFR1中的任一种、两种、三种或四种，测定至少一种肽或至少两种肽(例如，在表1中列出的肽)。在所述实施方案的另一实例中，对于ALK和Ros蛋白质中的一种或两种，通过SRM/MRM测定来测定至少一种肽或至少两种肽(例如，在表1中列出的肽)；且对于Ron、Ret、TS和/或FGFR1中的任一种，测定至少一种或至少两种肽(例如，在表1中列出的肽)。包含同位素标记、但在其它方面与在这些实施方案中的任一个中阐述的肽中的一种或多种相同的肽的组合物提供在本文中且其制备和特定地用作质谱标准物的用途描述如下。
在一个实施方案中，在表1中的一种或多种肽或那些肽的任意组合(例如，一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种或全部十一种)通过包括但不限于免疫方法(例如，Western印迹或ELISA)的不依赖于质谱法的方法测定。在一个实施方案中，所述测定使用福尔马林固定的组织进行。与如何获得涉及一种或多种肽的量(绝对或相对)的信息无关，所述信息可用于本文所述的方法中的任一种中，包括指示(诊断)在患者或受试者中癌症的存在、确定癌症的阶段/等级/状况、提供预后或确定对于患者或受试者的治疗性或治疗方案。
在其它实施方案中，测定所述ALK和Ros蛋白质中的一种或两种且测定所述Ron、Ret、TS和FGFR1蛋白质中的一种、两种、三种或四种，其通过包括但不限于免疫方法(例如，Western印迹或ELISA)的不依赖于质谱法的方法进行。在所述实施方案的一个实例中，对于ALK和Ros蛋白质中的一种或两种，测定至少一种或至少两种肽(例如，在表1中列出的ALK和ROS肽)；且对于Ron、Ret、TS和FGFR1蛋白质中的任一种、两种、三种或四种，测定至少一种或至少两种肽(例如，在表1中列出的肽)。在所述实施方案的另一实例中，对于ALK和Ron蛋白质中的一种或两种，测定至少一种或至少两种肽(例如，在表1中列出的ALK和Ron肽)；且对于Ros、Ret、TS和FGFR1蛋白质中的任一种，测定至少一种或至少两种肽(例如，在表1中列出的肽)。
在进行SRM/MRM测定时一种重要的考虑因素为可在肽的分析中采用的仪器的类型。尽管可研发SRM/MRM测定并且在包括MALDI、离子阱或三重四极质谱仪的任何类型的质谱仪上进行，但目前用于SRM/MRM测定的最有利的仪器平台常考虑的是三重四极仪器平台。该类型的质谱仪常被视为分析在可由来自在细胞内包含的所有蛋白质的成千上万至几百万个单个肽组成的很复杂的蛋白质溶胞产物内的单一分离的靶标肽的最适合的仪器。
为了对来源于ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的各种肽最有效地实施SRM/MRM测定，需要在分析中利用除了肽序列之外的信息。该额外信息可用于引导并指导质谱仪(例如，三重四极质谱仪)来对一种或多种特异性靶向肽进行恰当且集中的分析，从而可有效地进行测定。
关于通常靶标肽且关于特异性ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1肽的额外信息可包括各种肽的单同位素质量、其前体电荷状态、前体m/z值、m/z过渡离子和各过渡离子的离子类型中的一种、两种、三种、四种或更多种。对于来自在表1中的列表的12种ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1肽，可用以研发用于ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的SRM/MRM测定的额外肽信息示于表2中。可制备、获得如在表2中所示的对于肽描述的该额外信息并将其应用到包括在其它蛋白酶或蛋白酶组合(例如，胰蛋白酶和/或LysC)的作用下生成的那些肽的来自ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的任何其它肽的分析中。
表2
表2(续)
在一些实施方案中，适合ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的测定的肽(例如，在表1中阐述并显示为SEQID,No.1-39的肽)可含有在如果被切割则将生成亚肽的肽序列的内部的额外蛋白水解位点。所述亚肽可通过对于所要蛋白酶的蛋白水解切割位点评价所鉴定肽的序列来识别。在一个实施方案中，胰蛋白酶肽可包括可在由胰蛋白酶进一步切割时产生亚肽的额外内部胰蛋白酶切割位点。在另一实施方案中，胰蛋白酶肽可含有用于包括但不限于胰蛋白酶、GluC、AspN、糜蛋白酶和/或LysC的蛋白酶的内部位点，其可引起在通过胰蛋白酶、GluC、AspN、糜蛋白酶和/或LysC中的任一种、两种或更多种切割时形成亚肽。在另一实施方案中，LysC肽可含有用于例如GluC、AspN、糜蛋白酶和/或胰蛋白酶的其它蛋白酶的内部位点，其可引起在通过GluC、AspN、糜蛋白酶和/或胰蛋白酶中的任一种、两种或更多种切割时形成亚肽。应理解在SEQIDNo.1-39中阐述的肽中的任一种或多种的此类亚肽且特别是胰蛋白酶、GluC、AspN、糜蛋白酶和/或LysC切割片段都被阐述且在本公开内容的范围内。
在本文中阐述的实施方案包括包含在表1和表2中的肽中的一种或多种的组合物且可任选包括同位素标记、但在其它方面与在表1和表2中见到的肽中的一种或多种相同的肽。在一些实施方案中，所述组合物包含在表1和表2中的肽中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种或者所有三十九(39)种。此类组合物可任选包含其氨基酸序列包含同位素标记、但在其它方面与在表1和表2中见到的肽中的一种或多种相同的肽的肽、多肽或蛋白质。在采用包含在表1和表2中的肽中的一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种的同位素标记的合成或天然的肽、多肽或蛋白质的情况下，蛋白酶处理释放同位素标记、但在其它方面与在表1和表2中的肽相同的肽。所述同位素标记的生物制剂或生物合成肽可例如在程序设计的细胞溶胞产物中或在细胞培养物中使用同位素标记的氨基酸制备。同位素标记的肽中的每一种可用独立地选自由以下各物组成的组的一种或多种同位素标记：18O、17O、34S、15N、13C、2H或其组合。包含来自ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的肽(无论是同位素标记的，还是未标记的)的组合物不必含有来自该蛋白质的所有肽(例如，整组的胰蛋白酶肽)。在一些实施方案中，所述组合物并不含有来自ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的以组合的所有肽且特定地出现在表1和表2中的所有肽。含有肽的组合物可以干燥或冻干物质、液体(例如，水性)溶液或悬浮液、阵列或印迹(blot)的形式。
在一个实施方案中，所述关于特异性ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1肽的额外信息对于由ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的LysC蛋白水解产生的肽包括各种肽的单同位素质量、其前体带电状态、前体m/z值、m/z过渡离子和各过渡离子的离子类型中的一种或多种、两种或更多种或三种或更多种。
在另一实施方案中，所述关于特异性ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1肽的额外信息对于由ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的胰蛋白酶蛋白水解产生的肽包括各种肽的单同位素质量、其前体带电状态、前体m/z值、m/z过渡离子和各过渡离子的离子类型中的一种或多种、两种或更多种或三种或更多种。
在又一实施方案中，所述关于特异性ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1肽的额外信息对于由ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的胰蛋白酶和/或LysC蛋白水解产生的肽包括各种肽的单同位素质量、其前体带电状态、前体m/z值、m/z过渡离子和各过渡离子的离子类型中的一种或多种、两种或更多种或三种或更多种。在一个实施方案中，来自ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质中的每一种的单一胰蛋白酶和/或LysC蛋白水解肽与有关额外信息一起用于诊断确定中。因此，例如SEQIDNO4、7、9、16、31和/或36的肽和关于那些肽的额外信息(见表3)用于诊断分析中。
表3
某些实施方案
以下描述本发明的某些实施方案。
1.一种测量在生物样品中ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的水平的方法，其包括使用质谱法检测和/或量化在由所述生物样品制备的蛋白质消化液中一种或多种修饰和/或未修饰的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽的量；和计算在所述样品中修饰或未修饰的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的水平；和
其中所述量为相对量或绝对量。
2.实施方案1的方法，其进一步包括在检测和/或量化一种或多种修饰或未修饰的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽的量之前分级所述蛋白质消化液的步骤。
3.实施方案2的方法，其中所述所述分级步骤选自凝胶电泳、液相色谱、毛细管电泳、纳米反相液相色谱、高效液相色谱或逆相高效液相色谱。
4.实施方案1-3中任一项的方法，其中所述生物样品的所述蛋白质消化液通过LiquidTissueTM方案制备。
5.实施方案1-3中任一项的方法，其中所述蛋白质消化液包括蛋白酶消化液。
6.实施方案5的方法，其中所述蛋白质消化液包括胰蛋白酶和/或lysC消化液。
7.实施方案1-6中任一项的方法，其中所述质谱包括串联质谱、离子阱质谱、三重四极质谱、MALDI-TOF质谱、MALDI质谱和/或飞行时间质谱。
8.实施方案7的方法，其中所使用的质谱的模式为选择反应监测(SRM)、多反应监测(MRM)和/或多选择反应监测(mSRM)或其任意组合。
9.实施方案1-8中任一项的方法，其中所述ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽包含如下阐述的氨基酸序列：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38和SEQIDNO:39。
10.实施方案1-9中任一项的方法，其中所述生物样品为血液样品、尿样品、血清样品、腹水样品、痰液样品、淋巴液、唾液样品、细胞或实质组织。
11.实施方案1-10中任一项的方法，其中所述生物样品为福尔马林固定的组织。
12.实施方案1-11中任一项的方法，其中所述生物样品为石蜡包埋的组织。
13.实施方案1-12中任一项的方法，其中所述生物样品为从肿瘤中获得的组织。
14.实施方案13的方法，其中所述肿瘤为原发肿瘤。
15.实施方案13的方法，其中所述肿瘤为继发肿瘤。
16.实施方案1-15中任一项的方法，其进一步包括量化修饰和/或未修饰的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽。
17(a).实施方案1-16中任一项的方法，其中量化所述ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽包括比较在一种生物样品中包含ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的约8至约45个氨基酸残基的氨基酸序列的一种或多种ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽的量与在不同且单独的样品或生物样品中相同ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽的量。
17(b).实施方案1-16中任一项的方法，其中量化所述ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽包括比较在一种生物样品中的包含如在以下序列中所示的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的约8至约45个氨基酸残基的氨基酸序列的一种或多种ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽的量与在不同且单独的生物样品中相同ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽的量：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38和SEQIDNO:39。
18.实施方案17(a)或17(b)的方法，其中量化一种或多种ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽包括通过与以已知量加入的内标肽相比较确定在生物样品中所述ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽中的每一种的量，其中将在所述生物样品中所述ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽中的每一种与具有相同氨基酸序列的加入的内标肽相比较。
19.实施方案18的方法，其中所述内标肽为同位素标记的肽。
20.实施方案19的方法，其中所述同位素标记的内标肽包含选自18O、17O、34S、15N、13C、2H或其组合的一种或多种重稳定同位素。
21.实施方案1-20中任一项的方法，其中检测和/或量化在所述蛋白质消化液中一种或多种修饰或未修饰的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽的量指示修饰或未修饰的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的存在和与在患者或受试者中的癌症的关联性。
22.实施方案21的方法，其进一步包括关联所述检测和/或量化一种或多种修饰或未修饰的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽的量或所述ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的量的结果与所述癌症的诊断阶段/等级/状况。
23.实施方案22的方法，其中关联所述检测和/或量化一种或多种修饰或未修饰的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽的量或所述ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的量的结果与所述癌症的诊断阶段/等级/状况与检测和/或量化其它蛋白质或来自其它蛋白质的肽的量以多路格式组合，从而提供关于所述癌症的诊断阶段/等级/状况的额外信息。
24.实施方案1-23中任一项的方法，其进一步包括基于一种或多种ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽的存在、不存在或量或者ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的量为自其获得所述生物样品的患者或受试者选择治疗。
25.实施方案1-24中任一项的方法，其进一步包括向自其获得所述生物样品的患者或受试者施用治疗有效量的治疗剂，其中所述治疗剂和/或所述治疗剂的施用量基于一种或多种修饰或未修饰的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽的量或ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的量。
26.实施方案24和25的方法，其中所述治疗或所述治疗剂针对表达ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的癌症细胞。
27.实施方案1-27的方法，其中所述生物样品为已经采用LiquidTissueTM方案和试剂处理以便量化一种或多种修饰或未修饰的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽的量的福尔马林固定的肿瘤组织。
28.实施方案1-28中任一项的方法，其中所述一种或多种修饰或未修饰的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽为在表1中的肽中的一种或多种。
29.一种组合物，其包含在表1中的肽中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种或者十种或更多种和/或其抗体。
30.实施方案30的组合物，其包含在表2中的肽中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种或者十种或更多种和/或其抗体。
例示性SRM/MRM测定法
1.如下所述的方法用以：1)鉴定可用于ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的基于质谱的SRM/MRM测定的来自ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的候选肽，2)对于来自ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的靶标肽研发单个SRM/MRM测定或多种SRM/MRM测定，和3)将定量测定应用到癌症诊断和/或最佳疗法的选择。ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的SRM/MRM候选片段肽的鉴定：
a.使用一种或多种蛋白酶(可能包括胰蛋白酶或可能不包括胰蛋白酶)来消化蛋白质而由福尔马林固定的生物样品制备LiquidTissueTM蛋白质溶胞产物
b.在离子阱串联质谱仪上分析在LiquidTissueTM溶胞产物中的所有蛋白质片段并鉴定来自ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的所有片段肽，其中单个片段肽不含例如磷酸化或糖基化的任何肽修饰
c.在离子阱串联质谱仪上分析在LiquidTissueTM溶胞产物中的所有蛋白质片段并鉴定来自带有例如磷酸化或糖基化残基的肽修饰的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的所有片段肽
d.可潜在地测量通过具体消化方法由全部全长ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质产生的所有肽，但用于研发SRM/MRM测定的优选肽为通过质谱在由福尔马林固定的生物样品制备的复杂LiquidTissueTM蛋白质溶胞产物中直接鉴定的那些
e.在分析来自福尔马林固定的生物样品时将在患者或受试者组织中特异性修饰(磷酸化、糖基化等)并在质谱仪中电离化且因此可检测的肽鉴定为用于测定ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的肽修饰的候选肽
2.来自ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的片段肽的质谱测定：
a.将在三重四极质谱仪上对于在LiquidTissueTM溶胞产物中鉴定的单个片段肽的SRM/MRM测定应用到来自ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的肽
i.对于片段肽对于包括但不限于凝胶电泳、液相色谱、毛细管电泳、纳米逆相液相色谱、高效液相色谱或逆相高效液相色谱的最佳色谱条件确定最佳保留时间
ii.确定肽的单同位素质量、各种肽的前体电荷状态、各种肽的前体m/z值、各种肽的m/z过渡离子和各片段肽的各过渡离子的离子类型以研发用于各肽的SRM/MRM测定。
iii.SRM/MRM测定因此可使用来自(i)和(ii)的信息在三重四极质谱仪上进行，其中各种肽具有特征性且独特的SRM/MRM波形特征峰，这些峰精确地限定如在三重四极质谱仪上进行的独特SRM/MRM测定
b.进行SRM/MRM分析使得作为来自SRM/MRM质谱分析的独特SRM/MRM波形特征峰面积的函数的所检测的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的片段肽的量可指示在特定蛋白质溶胞产物中ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的相对量和绝对量两者。
i.相对定量可通过以下实现：
1.通过比较以下来确定ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的存在增加或减少：(a)来自在来自一种福尔马林固定的生物样品的LiquidTissueTM溶胞产物中检测到的给定ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1肽的SRM/MRM波形特征峰面积与(b)在来自至少第二、第三、第四或以上福尔马林固定的生物样品的至少第二、第三、第四或以上LiquidTissueTM溶胞产物中相同ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1片段肽的相同SRM/MRM波形特征峰面积
2.通过比较以下来确定ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的存在增加或减少：(a)来自在来自一种福尔马林固定的生物样品的LiquidTissueTM溶胞产物中检测到的给定ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1肽的SRM/MRM波形特征峰面积与(b)由来自在来源于不同且单独的生物来源的其它样品中的其它蛋白质的片段肽发展的SRM/MRM波形特征峰面积，其中将对于肽片段而言在这两种样品之间的SRM/MRM波形特征峰面积比较标准化成在各样品中分析的蛋白质的量。
3.通过比较以下来确定ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的存在增加或减少：(a)给定ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1肽的SRM/MRM波形特征峰面积与(b)来自来源于在来自福尔马林固定的生物样品的相同LiquidTissueTM溶胞产物内的不同蛋白质的其它片段肽的SRM/MRM波形特征峰面积，从而将ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的变化水平标准化成在各种细胞条件下都不改变其表达水平的其它蛋白质的水平。
4.这些测定可应用到ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的未修饰的片段肽和修饰的片段肽两者，其中修饰包括但不限于磷酸化和/或糖基化，且其中修饰肽的相对水平以与确定未修饰肽的相对量相同的方式确定。
ii.给定肽的绝对定量可通过比较以下来实现：(a)来自在单个生物样品中的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的给定片段肽的SRM/MRM波形特征峰面积与(b)示踪到来自生物样品的蛋白质溶胞产物中的内部片段肽标准物的SRM/MRM波形特征峰面积。
1.内标物为正查询的来自ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的标记的合成形式的片段肽。将该标准物以已知量示踪到样品中，且SRM/MRM波形特征峰面积可对于内部片段肽标准物和在生物样品中的天然肽片段单独地确定，接着比较两种峰面积
2.这可应用到未修饰的片段肽和修饰的片段肽两者，其中修饰包括但不限于磷酸化和/或糖基化，且其中修饰肽的绝对水平可以与确定未修饰肽的绝对水平相同的方式来确定。
3.将片段肽定量应用到癌症诊断和治疗
a.进行ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的片段肽水平的相对和/或绝对定量并说明证实了如在癌症领域中充分理解的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质表达与在患者或受试者肿瘤组织的阶段/等级/状况的先前确定的关联性
b.进行ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的片段肽水平的相对和/或绝对定量并说明与来自不同治疗策略的临床结果的关联性，其中该关联性已经在该领域中说明且可在将来经由对于患者或受试者群或来自那些患者或受试者的组织的关联性研究来说明。一旦通过该测定证实了先前确立的关联性或将来得出的关联性，则可将测定法用以确定最佳治疗策略
来自ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的片段肽的质谱测定
a.SRM/MRM测定，用以确定ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的所检测的片段肽的量以确定在蛋白质溶胞产物中ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的相对和/或绝对量。
i.相对定量可通过以下实现：
1.通过比较以下来确定ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的存在增加或减少：(a)来自在来自一种福尔马林固定的生物样品的LiquidTissueTM溶胞产物中检测到的给定ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质肽的SRM/MRM波形特征峰面积与(b)在来自至少第二、第三、第四或以上福尔马林固定的生物样品的至少第二、第三、第四或以上LiquidTissueTM溶胞产物中相同ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽的相同SRM/MRM波形特征峰面积
2.通过比较以下来确定ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的存在增加或减少：(a)来自在来自一种福尔马林固定的生物样品的LiquidTissueTM溶胞产物中检测到的给定ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质肽的SRM/MRM波形特征峰面积与(b)由来自在来源于不同且单独的生物来源的其它样品中的其它蛋白质的片段肽发展的SRM/MRM波形特征峰面积，其中将对于肽片段而言在这两种样品之间的SRM/MRM波形特征峰面积比较标准化成在各样品中分析的蛋白质的量。
3.通过比较以下来确定ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的存在增加或减少：(a)给定ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质肽的SRM/MRM波形特征峰面积与(b)来自来源于在来自福尔马林固定的生物样品的相同LiquidTissueTM溶胞产物内的不同蛋白质的其它片段肽的SRM/MRM波形特征峰面积，从而将ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的变化水平标准化成在各种细胞条件下都不改变其表达水平的其它蛋白质的水平。
4.这些测定可应用到ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的未修饰的片段肽和修饰的片段肽两者，其中修饰包括但不限于磷酸化和/或糖基化，且其中修饰肽的相对水平以与确定未修饰肽的相对量相同的方式确定。
ii.给定肽或得到其的蛋白质的绝对定量可通过比较以下来实现：(a)来自在单个生物样品中ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的给定片段肽的SRM/MRM波形特征峰面积与(b)示踪到来自该生物样品的蛋白质溶胞产物中的内部片段肽标准物的SRM/MRM波形特征峰面积。
该内标物可为正查询的来自ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的标记的合成形式的片段肽(或包含在蛋白水解时释放的标记的合成形式的片段肽的蛋白质或多肽)。将该标准物以已知量示踪到样品中，且SRM/MRM波形特征峰面积可对于内部片段肽标准物和在生物样品中的天然肽片段单独地确定，接着比较两种峰面积。
这可应用到未修饰的片段肽和修饰的片段肽两者，其中修饰包括但不限于磷酸化和/或糖基化，且其中修饰肽的绝对水平可以与确定未修饰肽的绝对水平相同的方式来确定。
基于来源于福尔马林固定的患者或受试者的组织的分析评价在组织中的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质水平可提供关于各特定患者或受试者的诊断、预后和治疗有关的信息。本文描述了一种测量在生物样品中ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的水平的方法，其包括使用质谱法检测和/或量化在由所述生物样品制备的蛋白质消化液中一种或多种修饰和/或未修饰的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽的量；和计算在所述样品中修饰或未修饰的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的水平；且其中所述水平为相对水平或绝对水平。在一个有关实施方案中，量化一种或多种ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽包括通过与以已知量加入的内标肽比较确定在生物样品中所述ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽中的每一种的量，其中将在所述生物样品中所述ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽中的每一种与具有相同氨基酸序列的内标肽相比较。在一些实施方案中，所述内标物为同位素标记的内标肽，其包含选自18O、17O、34S、15N、13C、2H或其组合的一种或多种重稳定同位素。
本文所述的测量在生物样品中ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质(或作为其替代的片段肽)的水平的方法可用作在患者或受试者中的癌症的诊断指标。在一个实施方案中，由ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的水平的测量产生的结果可通过关联(例如，比较)在组织中见到的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的水平与在正常和/或癌性或癌前期组织中见到的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的水平而用以确定癌症的诊断阶段/等级/状况。
用于检测在福尔马林固定的患者组织中的具体蛋白质的水平的唯一目前方法是免疫组织化学法(IHC)。该方法每次对来自患者肿瘤组织样品的单一组织切片仅分析一种蛋白质。因此，为了分析多种蛋白质，必须查询多个组织切片，其耗费很多时间和劳动力。IHC使用抗体来检测靶标蛋白质的存在，且因为该抗体与蛋白质非特异性结合的潜在性，在任何IHC实验中都存在对于信号背景的重大内在潜在性。另外，IHC最多也仅为半定量的。由于这些问题，IHC未能同时提供对于多种蛋白质的客观定量分析。本文描述的方法能够利用患者组织样品的单一切片在100％测定特异性下同时提供ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的客观定量，节省了显著的时间和金钱，同时提供关于ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质表达的更有价值的数据。
该多路SRM/MRM测定还可包括对于除ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质以外的其它额外蛋白质的同时分析，这些额外蛋白质包括例如EGFR、IGF-1R和cMet的药物靶标蛋白质。这是有价值的，因为额外蛋白质的分析也指示哪种额外药物可用于治疗特定的癌症。基于额外例示性药物靶向蛋白质的分析的额外药物的实例包括艾比特思(Erbitux)，其靶向EGFR受体；Figitumumab，其靶向IGF-1R；和Foretinib，其靶向c-Met和血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)。
因为核酸和蛋白质两者都可由相同的LiquidTissueTM生物分子制剂分析，所以可以由在用于蛋白质分析的相同样品中的核酸产生关于疾病诊断和药物治疗判断的额外信息。例如，如果ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质由某些细胞以增加的水平表达，当通过SRM测定时，该数据则可提供关于细胞的状态及其不受控制地生长的潜在性、潜在抗药性和癌症发展的信息。同时，可从在相同生物分子制剂中存在的核酸中获得关于ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1基因和/或核酸和它们编码的蛋白质的状况的信息(例如，mRNA分子及其表达水平或剪接变化)。在一个实施方案中，关于ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质和/或一种、两种、三种、四种或多种额外蛋白质的信息可通过检查编码那些蛋白质的核酸来评价。那些核酸可例如通过以下方法中的一种或多种、两种或更多种或三种或更多种检查：测序方法；聚合酶链式反应方法；限制性片段多晶型分析；缺失、插入的鉴定；和/或包括但不限于单碱基对多晶型、转换、颠换或其组合的突变存在的确定。
方法和组合物的以上描述和例示性实施方案说明本公开内容的范围。然而，由于对于本领域的技术人员将显而易见的变化，本公开内容并不旨在局限于上述特定实施方案。

Claims (17)

1.一种测量在生物样品中ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质中的至少一种的水平的方法，其包括使用质谱法检测和/或量化在由所述生物样品制备的蛋白质消化液中一种或多种修饰和/或未修饰的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽的量；和计算在所述样品中修饰或未修饰的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的水平；
其中所述量为相对量或绝对量。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在检测和/或量化一种或多种修饰或未修饰的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽的量之前使所述蛋白质消化液分级的步骤。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述生物样品的所述蛋白质消化液通过LiquidTissueTM方案制备。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述蛋白质消化液包含蛋白酶消化液。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述质谱包括串联质谱、离子阱质谱、三重四极质谱、MALDI-TOF质谱、MALDI质谱和/或飞行时间质谱。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽包含如下阐述的氨基酸序列：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38和SEQIDNO:39。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述生物样品为血液样品、尿样品、血清样品、腹水样品、痰液样品、淋巴液、唾液样品、细胞或实质组织。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其进一步包括量化修饰和/或未修饰的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽。
9.根据权利要求8所述的方法，其中量化所述ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽包括比较在一种生物样品中的包含如在以下序列中所示的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的约8至约45个氨基酸残基的氨基酸序列的一种或多种ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽的量与在不同或单独的生物样品中的相同ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽的量：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38和SEQIDNO:39。
10.根据权利要求9所述的方法，其中量化一种或多种ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽包括通过与以已知量加入的内标肽相比较确定在生物样品中所述ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽中的每一种的量，其中将在所述生物样品中所述ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽中的每一种与具有相同氨基酸序列的内标肽相比较。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述内标肽为同位素标记的肽。
12.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中检测和/或量化在所述蛋白质消化液中一种或多种修饰或未修饰的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽的量指示修饰或未修饰的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的存在和与在患者或受试者中的包括肺癌的癌症的关联性。
13.根据权利要求12所述的方法，其进一步包括关联所述检测和/或量化一种或多种修饰或未修饰的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽的量或所述ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的量的结果与包括肺癌的所述癌症的诊断阶段/等级/状况。
14.根据权利要求13所述的方法，其中关联所述检测和/或量化一种或多种修饰或未修饰的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽的量或所述ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的量的结果与所述癌症的诊断阶段/等级/状况与检测和/或量化其它蛋白质或来自其它蛋白质的肽的量以多种形式组合，从而提供关于包括肺癌的所述癌症的诊断阶段/等级/状况的额外信息。
15.根据权利要求13所述的方法，其进一步包括向自其获得所述生物样品的患者或受试者施用治疗有效量的治疗剂，其中所述治疗剂和/或所述治疗剂的施用量基于一种或多种修饰或未修饰的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质片段肽的量或ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的量。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述治疗或所述治疗剂针对表达ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFR1蛋白质的癌症细胞。
17.一种组合物，其包含在表1中的肽(SEQIDNO.1至SEQIDNO.39)中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种或者十种或更多种和/或其抗体。
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