JP6412100B2 - 癌療法を示すためのsrmアッセイ - Google Patents
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Description
肺癌は、最も蔓延している癌(米国内新規症例200,000超/年)であり、低い5年生存率(約15%)を有する。肺癌のための療法は、放射線、葉酸代謝、白金系薬剤、及び/またはタキソール系薬剤からなる療法の限定的な選択肢の使用から、腫瘍、及び/または重要なバイオマーカーもしくは治療標的タンパク質の有無の組織学的特徴付けを必要とする、より標的化された治療へと移行している。全肺癌の80%もが、非小細胞肺癌(NSCLC)型であり、この一般的な型は、組織学的分析に基づいて、腺癌、扁平上皮癌、細気管支肺胞上皮癌、及び大細胞未分化癌の4つの異なるサブタイプに分類することができる。残りの20%の肺癌は、小細胞肺癌(SCLC)として知られている。近年利用されている標的癌療法は、NSCLC及びSCLC両方の患者の治療において劇的な成功を示している。癌療法に対する標的化されたアプローチは、癌の成長が特定の標的タンパク質(1つまたは複数)によって推進されるとき、かつ癌を推進している標的タンパク質(1つまたは複数)が標的タンパク質(1つまたは複数)を阻害するように設計及び製造された治療剤によって特異的に攻撃され、それ故に癌の成長を阻害する場合に、最も有利である。ペプチド及びペプチド配列が、どのタンパク質標的が肺癌患者由来の腫瘍組織内で直接発現または過剰発現されるかを定量的に決定するために使用することのできるSRM/MRMアッセイでの使用のために提供される。これにより、標的肺癌療法のための改善された治療決定が可能になる。また、肺癌でない任意の他の癌のための標的治療決定を改善するために、どのタンパク質標的が、肺癌以外の癌を有する患者由来の腫瘍組織内で直接発現または過剰発現されるかを定量的に決定するために使用することのできるSRM/MRMアッセイも提供される。
原理的には、既知の特異性の任意のタンパク質分解プロセスによって調製される、ALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質由来の任意の予測されるペプチドが、ALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質の存在量を決定するために、代理レポーターとして使用され得る。一実施形態において、試料は、既知の特異性のプロテアーゼ(1つまたは複数)(例えば、トリプシン及び/またはエンドプロテイナーゼLys−Cのうちの1つ以上)で消化される。タンパク質分解処理から生じる1つ以上のペプチドを代理レポーターとして使用して、質量分析ベースのSRM/MRMアッセイなどの好適なアッセイにおいて、ALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質のうちの1つ以上の存在量を決定することができる。同様に、ALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質中で修飾されることが知られている部位にアミノ酸残基を含有する、任意の予測されるペプチド配列を使用して、試料中のALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質の修飾の程度をアッセイしてもよい。
一旦溶解物が調製されると、試料中のペプチドは、それらの分析及び測定(定量化)を促進する様々な技術に供され得る。分析を質量分析により行う場合、分析を促進するために、1つ以上のクロマトグラフ法を用いてもよい。
本発明の特定の実施形態が以下に記載される。
該量が相対量または絶対量である、方法。
1.以下に記載される方法は、1)ALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質の質量分析ベースのSRM/MRMアッセイのために使用することのできるALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質由来の候補ペプチドを特定し、2)ALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質由来の標的ペプチドのための個別のSRM/MRMアッセイ(1つまたは複数)を開発し、3)定量アッセイを癌診断及び/または最適治療の選択に適用するために使用された。ALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質のためのSRM/MRM候補断片ペプチドの特定:
a.プロテアーゼ(1つまた複数)(トリプシンを含んでも含まなくてもよい)を使用して、ホルマリン固定生体試料からLiquid Tissue(商標)タンパク質溶解物を調整して、タンパク質を消化させる。
b.イオントラップタンデム質量分析計において、Liquid Tissue(商標)溶解物中の全タンパク質断片を分析し、ALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質由来の全断片ペプチドを特定し、この場合、個別の断片ペプチドは、リン酸化またはグリコシル化などのいかなるペプチド修飾も含有しない。
c.イオントラップタンデム質量分析計において、Liquid Tissue(商標)溶解物中の全タンパク質断片を分析し、例えば、リン酸化またはグリコシル化残基などのペプチド修飾を有するALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質由来の全断片ペプチドを特定する。
d.完全長ALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質全体から特定の消化方法により生成された全ペプチドを測定することは潜在的に可能であるが、SRM/MRMアッセイの開発に使用される好ましいペプチドは、ホルマリン固定生体試料から調製された複合Liquid Tissue(商標)タンパク質溶解物中で直接質量分析により特定されるものである。
e.患者または対象組織中で特異的に修飾され(リン酸化、グリコシル化等)、かつイオン化され、故に、ホルマリン固定生体試料からのLiquid Tissue(商標)溶解物を分析するとき、質量分析計中で検出することができるペプチドは、ALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質のペプチド修飾をアッセイするための候補ペプチドとして特定される。
a.Liquid Tissue(商標)溶解物中で特定された個別の断片ペプチドのための三連四重極質量分析計におけるSRM/MRMアッセイが、ALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質由来のペプチドに適用される。
i.ゲル電気泳動法、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動法、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または逆相高速液体クロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されない、最適クロマトグラフィー条件のための断片ペプチドに対する最適保持時間を決定する。
ii.それぞれのペプチドに対するSRM/MRMアッセイを開発するために、ペプチドのモノアイソトピック質量、それぞれのペプチドに対する前駆物質電荷状態、それぞれのペプチドに対する前駆物質m/z値、それぞれのペプチドに対するm/z遷移イオン、及びそれぞれの断片ペプチドに対するそれぞれの遷移イオンのイオン型を決定する。
iii.次いで、(i)及び(ii)からの情報を用いて、三連四重極質量分析計においてSRM/MRMアッセイを行うことができ、この場合、それぞれのペプチドは、三連四重極質量分析計で行われる独特のSRM/MRMアッセイを明確に規定する特徴的かつ固有のSRM/MRM特徴的ピークを有する。
b.SRM/MRM質量分析の分析から固有のSRM/MRM特徴的ピーク面積の関数として、検出されるALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質の断片ペプチドの量が、特定のタンパク質溶解物中のALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質の相対及び絶対量の両方を示すことができるように、SRM/MRM分析を実施する。
i.相対的定量化は、以下により得ることができる。
1.(a)1つのホルマリン固定生体試料からのLiquid Tissue(商標)溶解物中で検出された所与のALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1ペプチドのSRM/MRM特徴的ピーク面積を、(b)少なくとも第2、第3、第4、またはそれを超えるホルマリン固定生体試料からの少なくとも第2、第3、第4、またはそれを超えるLiquid Tissue(商標)溶解物中の同一のALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1断片ペプチドの同一のSRM/MRM特徴的ピーク面積と比較することにより、ALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質の存在の増加または減少を決定すること。
2.(a)1つのホルマリン固定生体試料からのLiquid Tissue(商標)溶解物中で検出された所与のALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1ペプチドのSRM/MRM特徴的ピーク面積を、(b)異なる別個の生物学的起源由来の他の試料中の他のタンパク質由来の断片ペプチドから生成されたSRM/MRM特徴的ピーク面積と比較することにより、ALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質の存在の増加または減少を決定し、この場合、2つの試料間のペプチド断片に対するSRM/MRM特徴的ピーク面積の比較は、各試料中で分析されたタンパク質の量に正規化される。
3.ALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質の変化するレベルを、様々な細胞条件下でのそれらの発現レベルを変化させない他のタンパク質のレベルに正規化するために、(a)所与のALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1ペプチドのSRM/MRM特徴的ピーク面積を、(b)ホルマリン固定生体試料からの同一のLiquid Tissue(商標)溶解物中の異なるタンパク質に由来する他の断片ペプチドのSRM/MRM特徴的ピーク面積と比較することにより、ALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質の存在の増加または減少を決定すること。
4.これらのアッセイを、ALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質の非修飾断片ペプチド、ならびに修飾断片ペプチドの両方に適用することができ、この場合、修飾には、リン酸化及び/またはグリコシル化が含まれるが、これらに限定されず、修飾ペプチドの相対レベルは、非修飾ペプチドの相対量を決定するのと同一の様式で決定される。
ii.所与のペプチドの絶対定量化は、(a)個別の生体試料中のALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質由来の所与の断片ペプチドのSRM/MRM特徴的ピーク面積を、(b)生体試料からのタンパク質溶解物中にスパイクされた内部断片ペプチド標準物のSRM/MRM特徴的ピーク面積と比較することにより、達成され得る。
1.内部標準物は、調べられているALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質由来の断片ペプチドの標識された合成バージョンである。この標準物は、既知量で試料中にスパイクされ、SRM/MRM特徴的ピーク面積は、生体試料中の内部断片ペプチド標準物及び天然断片ペプチドの両方に対し、個別に決定され、その後、両方のピーク面積が比較され得る。
2.これは、非修飾断片ペプチド及び修飾断片ペプチドに適用可能であり、この場合、修飾には、リン酸化及び/またはグリコシル化が含まれるが、これに限定されず、また、修飾ペプチドの絶対レベルは、非修飾ペプチドの絶対的量を決定するのと同一の方法で決定され得る。
a.ALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質の断片ペプチドレベルの相対及び/または絶対定量化を実施し、癌の分野で十分に理解されている、ALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質発現と患者及び対象の腫瘍組織における癌の病期/グレード/状態との以前に決定された関連性が確認されることを実証する。
b.ALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質の断片ペプチドレベルの相対及び/または絶対定量化を実施し、異なる治療戦略からの臨床転帰との相関を実証し、この場合、この相関は、この分野ですでに実証されているか、または患者もしくは対象のコホート、及びそれらの患者もしくは対象からの組織にわたる相関研究により将来実証することができる。一旦以前に確立された相関関係、または将来得られる相関関係のいずれかがこのアッセイにより確認されると、本アッセイ方法を使用して、最適治療戦略を決定することができる。
a.タンパク質溶解物中のALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質の相対及び/または絶対量を決定するために検出されるALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質の断片ペプチドの量を決定するためのSRM/MRMアッセイ。
i.相対定量化は、下記により得ることができる。
1.(a)1つのホルマリン固定生体試料からのLiquid Tissue(商標)溶解物中で検出される所与のALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質ペプチドのSRM/MRM特徴的ピーク面積を、(b)少なくとも第2、第3、第4、またはそれを超えるホルマリン固定生体試料からの少なくとも第2、第3、第4、またはそれを超えるLiquid Tissue(商標)溶解物中の同一のALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質断片ペプチドの同一のSRM/MRM特徴的ピーク面積と比較することにより、ALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質の存在の増加または減少を決定すること。
2.(a)1つのホルマリン固定生体試料からのLiquid Tissue(商標)溶解物中で検出される所与のALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質ペプチドのSRM/MRM特徴的ピーク面積を、(b)異なる別個の生物学的起源由来の他の試料中の他のタンパク質由来の断片ペプチドから生成したSRM/MRM特徴的ピーク面積と比較することにより、ALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質の存在の増加または減少を決定することであり、2つの試料間のペプチド断片に対するSRM/MRM特徴的ピーク面積比較は、各試料中で分析されたタンパク質の量に正規化される。
3.ALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質の変化するレベルを、様々な細胞条件下でのそれらの発現レベルを変化させない他のタンパク質のレベルに正規化するために、(a)所与のALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1ペプチドのSRM/MRM特徴的ピーク面積を、(b)ホルマリン固定生体試料からの同一のLiquid Tissue(商標)溶解物中の異なるタンパク質に由来する他の断片ペプチドのSRM/MRM特徴的ピーク面積と比較することにより、ALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質の存在の増加または減少を決定すること。
4.これらのアッセイを、ALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質の非修飾断片ペプチド、ならびに修飾断片ペプチドの両方に適用することができ、修飾には、リン酸化及び/またはグリコシル化が含まれるが、これらに限定されず、修飾ペプチドの相対レベルは、非修飾ペプチドの相対量を決定するのと同一の様式で決定される。
ii.所与のペプチドまたはそれが由来するタンパク質の絶対定量化は、(a)個別の生体試料中のALK、Ros、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質由来の所与の断片ペプチドのSRM/MRM特徴的ピーク面積を、(b)生体試料からのタンパク質溶解物中にスパイクされた内部断片ペプチド標準物のSRM/MRM特徴的ピーク面積と比較することにより達成され得る。
Claims (13)
- ホルマリン固定組織のヒト生体試料中のALKタンパク質の量を測定するための方法であって、質量分析を使用して前記生体試料から調製されたタンパク質消化物中のALKタンパク質断片ペプチドの量を検出及び定量化することと、前記試料中のALKタンパク質の量を計算することとを含んでなり、ここで、前記ALKタンパク質断片ペプチドは、配列番号5のアミノ酸配列を有するペプチドであり、前記量が、相対量または絶対量である、方法。
- 前記ALKタンパク質断片ペプチドの量を検出及び定量化する前に、前記タンパク質消化物を分画するステップをさらに含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質消化物がプロテアーゼ消化物を含んでなる、請求項1または2に記載の方法。
- 前記ヒト生体試料が腫瘍から取得されるものである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 1つ以上のRos、Ron、Ret、TS、及び/またはFGFR1タンパク質断片ペプチドを定量化することをさらに含んでなる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ALKタンパク質断片ペプチドを定量化することが、1つの生体試料中の前記ALKタンパク質断片ペプチドの量を、異なる別個の生体試料中の同一のALKタンパク質断片ペプチドの量と比較することを含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記ALKタンパク質断片ペプチドを定量化することが、生体試料中の前記ALKタンパク質断片ペプチドの量を、既知量の添加内部標準ペプチドとの比較によって決定することを含んでなり、前記生体試料中の前記ALKタンパク質断片ペプチドが、同一のアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較される、請求項1に記載の方法。
- 前記内部標準ペプチドが同位体標識ペプチドである、請求項7に記載の方法。
- 前記タンパク質消化物中の前記ALKタンパク質断片ペプチドの量を検出及び定量化することが、前記生体試料中の修飾または非修飾ALKタンパク質の存在、及び前記生体試料が得られた患者または対象における、肺癌を含む癌との関連性を示す、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ALKタンパク質断片ペプチドの量、または前記ALKタンパク質の量の前記検出及び定量化の結果を、肺癌を含む前記癌の診断上の病期/グレード/状態と相関させることをさらに含んでなる、請求項9に記載の方法。
- 前記ALKタンパク質断片ペプチドの量、または前記ALKタンパク質の量の前記検出及び定量化の結果を、前記癌の診断上の病期/グレード/状態と相関させることが、他のタンパク質または他のタンパク質由来のペプチドの量を検出及び/または定量化することと多重形式で組み合わされて、肺癌を含む前記癌の診断上の病期/グレード/状態に関するさらなる情報を提供する、請求項10に記載の方法。
- 前記生体試料が得られた患者または対象に治療的有効量の治療剤を投与するための治療レジメンを決定するための指標を、医師または他の医療従事者に提供することをさらに含んでなり、前記治療剤及び/または投与される前記治療剤の量が、前記ALKタンパク質断片ペプチドの量、またはALKタンパク質の量に基づいて決定される、請求項11に記載の方法。
- 前記治療剤がALKタンパク質を発現する癌細胞に指向される、請求項12に記載の方法。
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