KR20180080342A - 암 요법을 지시하는 srm 검정 - Google Patents

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익스프레션 패톨로지, 인크.
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Abstract

본 발명은 특정한 펩티드, 그리고 선별된 반응 모니터링 (SRM) 질량 분광분석법, 또는 복수 반응 모니터링 (MRM) 질량 분광분석법의 방법에 의해, 포르말린에서 고정된 생물학적 표본에서 직접적으로 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질을 정량하는데 특히 유리한 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질로부터 도출된 이들 펩티드의 이온화 특징을 제공한다. 이런 생물학적 표본은 화학적으로 보존되고 고정되고, 여기서 생물학적 표본은 포르말린-고정된 조직/세포, 포르말린-고정된/파라핀 포매된 (FFPE) 조직/세포, FFPE 조직 블록과 이들 블록으로부터 세포, 그리고 포르말린 고정되고 및 또는 파라핀 포매된 조직 배양 세포를 비롯하여, 포름알데히드 내포 작용제/고정제로 처리된 조직과 세포에서 선택된다. 단백질 표본은 Liquid Tissue™ 시약과 프로토콜을 이용하여 생물학적 표본으로부터 제조되고, 그리고 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질은 설명된 펩티드 중에서 최소한 하나 또는 그 이상을 단백질 표본에서 정량함으로써, SRM/MRM 질량 분광분석법의 방법에 의해 Liquid Tissue™ 표본에서 정량된다. 이들 펩티드는 그들이 변형된 또는 변형되지 않은 형태에서 존속하면 정량될 수 있다. ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단편 펩티드의 변형된 형태의 실례는 펩티드 서열 내에서 티로신, 트레오닌, 세린, 및/또는 다른 아미노산 잔기의 인산화이다.

Description

암 요법을 지시하는 SRM 검정{SRM Assay to Indicate Cancer Therapy}
도입
폐암은 가장 유력한 암 (>200,000건의 새로운 US 사례/년)이고 낮은 5년 생존율 (~15%)을 갖는다. 폐암에 대한 요법은 방사선, 엽산염 물질대사, 백금-기초된 약물, 및/또는 탁솔-기초된 약물로 구성되는 요법의 제한된 선별의 이용으로부터, 종양의 조직학적 특성화 및/또는 핵심 생물마커 또는 치료 표적 단백질의 존재 또는 부재를 필요로 하는 더욱 표적화된 치료로 이행하고 있다. 모든 폐암 중에서 최대 80%는 비소세포 폐암 (NSCLC) 유형이고, 그리고 이러한 일반적인 유형은 조직학적 분석에 기초하여 4가지 상이한 아형으로 분할될 수 있다: 선암종, 편평상피 세포 암종, 세기관지 암종, 그리고 큰-세포 미분화 암종. 폐암 중에서 나머지 20%는 소세포 폐암 (SCLC)으로서 알려져 있다. 최근에-활용된 표적화된 암 요법은 NSCLC와 SCLC 환자 둘 모두를 치료하는데 있어서 흥미로운 성공을 보여주었다. 암 요법에 대한 표적화된 접근법은 암의 성장이 특정한 표적 단백질, 또는 단백질들에 의해 주동될 때, 그리고 암을 주동하는 표적 단백질, 또는 단백질들이 표적 단백질, 또는 단백질을 저해하고, 그리고 따라서 암의 성장을 저해하도록 설계되고 제조된 치료적 작용제에 의해 특이적으로 공격되는 경우에 가장 유리하다. 펩티드와 펩티드 서열은 어떤 단백질 표적이 폐암 환자로부터 유래된 종양 조직에서 직접적으로 발현되거나, 또는 과다발현되는 지를 정량적으로 결정하는데 이용될 수 있는 SRM/MRM 검정에서 이용을 위해 제공된다. 이것은 표적화된 폐암 요법에 대한 향상된 치료 결정을 허용한다. 폐암이 아닌 임의의 다른 암에 대한 표적화된 치료 결정을 향상시키기 위해, 어떤 단백질 표적이 폐암 이외에 암을 앓는 환자로부터 유래된 종양 조직에서 직접적으로 발현되거나, 또는 과다발현되는 지를 정량적으로 결정하는데 이용될 수 있는 SRM/MRM 검정 역시 제공된다.
요약
다음의 단백질의 하위서열로부터 유래된 특정한 펩티드가 제공된다: ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 그리고 FGFR1. ALK는 또한, ALK 티로신 키나아제 수용체와 CD246으로서 알려져 있고 본원에서 ALK로서 지칭된다. Ros는 또한, c-Ros 수용체 티로신 키나아제로서 알려져 있고 본원에서 Ros로서 지칭된다. Ron은 또한, 대식세포-자극 단백질 수용체, CD136, 그리고 p185-Ron으로서 알려져 있고, 그리고 본원에서 Ron으로서 지칭된다. Ret는 또한, 원종양유전자 티로신-단백질 키나아제 수용체 Ret와 원종양유전자 c-Ret로서 알려져 있고 본원에서 Ret로서 지칭된다. TS는 또한, 티미딜산염 신타아제로서 알려져 있고 본원에서 TS로서 지칭된다. FGFR1은 또한, 섬유모세포 성장 인자 수용체 1과 CD331으로서 알려져 있고, 그리고 본원에서 FGFR1로서 지칭된다.
단백질로부터 유래된 각 펩티드에 대한 펩티드 서열과 단편화/전이 이온은 질량 분광분석법-기초된 선별된 반응 모니터링 (SRM) 검정(들)에서 잠재적으로 유용한데, 이것은 또한, 아래에 SRM/MRM 검정(들)으로서 지칭된 복수 반응 모니터링 (MRM) 검정(들)로서 지칭될 수 있다. ALK, Ros, Ron, Ret, TS와 FGFR1 단백질 및 이들 단백질의 동종형의 SRM/MRM 분석을 위한 펩티드의 이용이 설명된다.
하나 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 4개 또는 그 이상, 또는 5개 또는 6개 SRM/MRM 검정(들)이 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질로부터 특정한 펩티드 중에서 하나 또는 그 이상의 존재를 검출하고 상대적 또는 절대적 정량적 수준을 계측하고, 그리고 따라서 질량 분광분석법에 의해, 생물학적 표본으로부터 획득된 소정의 단백질 제조물에서 이들 단백질 각각의 총량을 계측하는 수단을 제공하는데 이용될 수 있다. 이들 단백질로부터 모든 가용한 펩티드의 전부 또는 일부는 또한, 단일 SRM/MRM 검정에서 동시에 분석될 수 있거나 또는 개별 SRM/MRM 검정의 임의의 조합으로 분석될 수 있다. 각 펩티드는 질량 분광분석법에 의해, 생물학적 표본으로부터 획득된 소정의 단백질 제조물에서 상응하는 단백질 각각의 총량을 계측하는 잠재적 수단을 제공한다.
본원에서 설명된 SRM/MRM 검정(들)은 환자 조직 표본, 예를 들면, 포르말린 고정된 암 환자 조직 (가령, 생검)으로부터 입수된 세포로부터 제조된 복합체 단백질 용해물 표본에서 직접적으로 이들 펩티드를 계측할 수 있다. 포르말린 고정된 조직으로부터 단백질 표본을 제조하는 방법은 U.S. 특허 번호 7,473,532에서 설명되고, 이의 내용은 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다. 상기 특허에서 설명된 방법은 Expression Pathology Inc. (Rockville, MD)로부터 가용한 액상 조직(Liquid Tissue) 시약과 프로토콜을 이용하여 편의하게 수행될 수 있다.
암 환자로부터 외과적으로 제거된 조직의 포름알데히드/포르말린 고정은 병리학 관례에서 인정되는 규약이다. 결과적으로, 포름알데히드/포르말린 고정된 파라핀 포매된 조직은 이들 환자로부터 조직의 가장 폭넓게 가용한 형태이다. 포름알데히드/포르말린 고정은 포르말린으로서 지칭된 포름알데히드의 수성 용액을 전형적으로 이용한다. "100%" 포르말린은 산화작용 및 중합화의 정도를 제한하기 위해, 소량의 안정제, 통상적으로 메탄올과 함께, 물에서 포름알데히드 (부피로 약 40% 포름알데히드 또는 질량으로 37%)의 포화 용액으로 구성된다. 조직이 보존되는 가장 흔한 방식은 10% 중성 완충된 포르말린으로 통상적으로 명명된 수성 포름알데히드에서 연장된 기간 (8 시간 내지 48 시간) 동안 전체 조직을 담그고, 그 이후에 고정된 전체 조직을 파라핀 밀랍에서 실온에서 장기간 보관을 위해 포매하는 것이다. 따라서 포르말린 고정된 암 조직을 분석하는 분자 분석법은 암 환자 조직의 분석을 위해 가장 인정되고 면밀히 활용되는 방법일 것이다.
SRM/MRM 검정(들)으로부터 결과는 조직 (생물학적 표본)이 수집되고 보존된 환자 또는 개체의 특정한 조직 표본 (가령, 암 조직 표본) 내에서, 이들 단백질의 잠재적 동종형의 정확하고 엄밀한 정량적 수준에 더하여, 임의의 또는 모든 이들 단백질의 정확하고 엄밀한 정량적 수준을 상관하는데 이용될 수 있다. 이것은 암에 관한 진단적 정보를 제공할 뿐만 아니라, 주치의 또는 다른 의학적 전문가가 환자 또는 개체에 대한 적절한 요법을 결정하는 것을 허용한다. 병든 조직에서 또는 다른 환자/개체 표본에서 단백질 발현의 수준에 관한 진단적으로 및 치료적으로 중요한 정보를 제공하는 이런 검정은 동반자 진단적 검정으로서 명명된다. 가령, 이런 검정은 암의 시기, 정도, 또는 조직학을 진단하고, 그리고 암 세포가 성장하는 것을 정지시키고, 환자 또는 개체가 어떤 치료적 작용제에 아마도 반응할 지의 결정을 야기하는데 가장 효과적일 치료적 작용제를 결정하도록 설계될 수 있다.
더욱 특정하게는, 환자로부터 암 세포에서 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 중에서 하나 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 4개 또는 그 이상, 5개 또는 그 이상의 검출 및/또는 정량은 암 성장, 특히 폐암을 지시하고, 그리고 표적화된 치료 섭생에 의해 표적화될 수 있는 단백질을 확인한다.
상세한 설명
본원에서 설명된 검정은 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질을 포함하는 단백질로부터 특정한 변형되지 않은 펩티드의 상대적 또는 절대적 수준을 정량하거나 또는 계측하고, 그리고 또한, 이들 단백질로부터 특정한 변형된 펩티드의 상대적 또는 절대적 수준을 계측할 수 있다. 변형의 실례는 펩티드 상에 존재하는 인산화된 아미노산 잔기와 당화된 아미노산 잔기를 포함한다.
단백질과 잠재적 동종형의 상대적 정량적 수준은 예로서, SRM/MRM 서명 피크 구역 (가령, 서명 피크 구역 또는 통합된 단편 이온 강도)을 비교함으로써, SRM/MRM 방법론에 의해 결정될 수 있다. 개별 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 펩티드의 상대적 수준은 상이한 표본 (가령, 대조 표본 및 환자 또는 개체의 조직으로부터 제조된 표본)에서 결정될 수 있다. 대안으로, 각 펩티드가 자체의 특정한 SRM/MRM 서명 피크를 갖는 경우에, ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 서명 펩티드 중에서 하나 또는 그 이상에 대한 복수 SRM/MRM 서명 피크 구역을 비교하는 것이 가능하다. 피크 구역을 비교함으로써, 하나의 생물학적 표본에서 또는 하나 또는 그 이상의 추가 또는 상이한 생물학적 표본에서 상대적 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질과 잠재적 단백질 동종형 함량을 결정하는 것이 가능하다. 이러한 방식으로, 이들 단백질로부터 특정 펩티드, 또는 펩티드들의 상대적 양, 그리고 이런 이유로, ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질과 이들의 잠재적 동종형의 상대적 양이 동일한 실험적 조건 하에, 복수 (가령, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상)의 생물학적 표본에 걸쳐 결정될 수 있다. 이에 더하여, SRM/MRM 방법론에 의해 하기 펩티드에 대한 서명 피크 구역을 다른 상이한 펩티드에 대한, 또는 생물학적 표본으로부터 동일한 단백질 제조물 내에서 상이한 단백질, 또는 단백질들로부터 펩티드에 대한 서명 피크 구역과 비교함으로써, 단일 표본 내에서 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질로부터 소정의 펩티드, 또는 펩티드들에 대한 상대적 정량이 결정될 수 있다.
이런 방법론을 이용하여, ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질로부터 특정 펩티드의 양, 그리고 이런 이유로 각각의 상응하는 단백질과 이들의 잠재적 동종형의 양이 동일한 표본 내에서 또는 상이한 표본에서 서로에 상대적으로 결정될 수 있다. 개별 펩티드, 또는 펩티드들의 상대적 정량이 표본 내에서 또는 표본 사이에 다른 펩티드, 또는 펩티드들의 양에 비하여 수행될 수 있기 때문에, 생물학적 표본에서 이들 단백질의 절대적 중량 대 부피 또는 중량 대 중량 양에 상관없이, 존재하는 펩티드의 상대적 양을 결정하는 것이 가능하다 (가령, 서로에 상대적 피크 구역을 결정함으로써). 따라서, 생물학적 표본으로부터 단백질 제조물에서 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 펩티드의 양은 다양한 표본 내에서 및 다양한 표본 사이에서 이들 단백질의 양을 결정하는데 이용될 수 있다. 상이한 표본 사이에 개별 서명 피크 구역에 관한 상대적 정량적 데이터는 일반적으로, 표본당 분석된 단백질의 양에 정규화된다 (가령, 표본의 전체 단백질 농도 및 분석된 부피가 표본을 정규화하는데 이용된다). 상대적 정량은 상대적 단백질 양, 및/또는 다른 펩티드/단백질에 대하여 한 펩티드/단백질에 관한 추가 통찰력을 획득하기 위해, 단일 표본에서 동시에 및/또는 많은 표본에 걸쳐, 복수 단백질 및 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질(들)로부터 많은 펩티드에 걸쳐 수행될 수 있다.
ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 절대적 정량적 수준은 예로서, SRM/MRM 방법론에 의해 결정되는데, 여기서 한 생물학적 표본에서 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질로부터 개별 펩티드의 SRM/MRM 서명 피크 구역이 공지된 양에서 표본 내에 "스파이크된" 공지된 양의 하나 또는 그 이상의 내부 표준 (가령, 동위원소 표지화된 표준)의 SRM/MRM 서명 피크 구역과 비교된다. 한 구체예에서, 내부 표준은 하나 또는 그 이상의 무거운 동위원소로 표지화된 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 내포하는 동일한 정확한 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 펩티드의 합성 이형이다. 이런 동위원소 표지화된 내부 표준은 질량 분광분석법 분석이 선천적 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 펩티드 서명 피크와 상이하고 구별되고, 그리고 비교측정기 피크로서 이용될 수 있는 예측가능하고 일관된 SRM/MRM 서명 피크를 산출하도록 합성된다. 따라서, 내부 표준이 공지된 양에서 생물학적 표본으로부터 공지된 양에서 단백질 또는 펩티드 제조물 내로 스파이크되고 질량 분광분석법에 의해 분석될 때, 선천적 펩티드의 SRM/MRM 서명 피크 구역이 내부 표준 펩티드의 SRM/MRM 서명 피크 구역에 비교될 수 있다. 수치 비교는 생물학적 표본으로부터 본래 단백질 제조물 내에 존재하는 선천적 펩티드의 절대적 몰농도 및/또는 절대적 중량의 계산을 허용하고, 이로부터 상응하는 단백질의 농도 또는 중량이 결정될 수 있다. 단편 펩티드에 대한 절대적 정량적 데이터는 표본당 분석된 단백질의 양에 따라 전형적으로 전시된다. 절대적 정량은 많은 펩티드에 걸쳐 수행될 수 있는데, 이것은 개별 생물학적 표본에서 및/또는 개별 표본의 전체 코호트에서 절대적 단백질 양에 관한 통찰력을 획득하기 위한, 단일 표본에서 동시에 및/또는 복수 표본에 걸쳐 복수 단백질 (가령, 2개, 3개, 4개, 5개 등)의 정량적 결정을 허용한다. 한 구체예에서, 단백질의 정량은 U.S. 특허 7,501,286에서 Gygi 등에 의해 설명된 바와 같은 펩티드 표준을 이용하여 수행될 수 있다.
달리 명시되지 않으면, 본원에서 이용된 바와 같이 용어 "정량하다", "정량하는", "계측하다" 또는 "계측하는"은 피분석물, 예를 들면, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 표준 (가령, 내부 표준)의 상대적 또는 절대적 수준을 결정하는 것을 의미한다.
본원에서 설명된 검정 방법은 예로서, 환자-유래된 또는 개체-유래된 조직, 예를 들면, 포르말린 고정된 조직을 이용할 때, 암의 시기를 결정하기 위한 보조로서 이용될 수 있다. 본원에서 설명된 SRM/MRM 검정은 또한, 어떤 치료적 작용제가 환자 또는 개체를 치료하는데 이용을 위해 가장 유리할 것인 지를 결정하는데 있어서 보조로서 이용될 수 있다.
본원에서 설명된 폐암과 연관된 단백질의 수준을 조사하기 위해, 부분적인 또는 전체 종양의 외과적 제거를 통해, 또는 의심되는 질환의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 수행된 생검 절차를 통해, 환자 또는 개체로부터 제거되는 암성 조직 또는 암성인 것으로 의심되는 조직에서 분석이 수행될 수 있다. 조직의 표본은 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질(들) 중에서 하나 또는 그 이상이 환자 또는 개체의 조직에서 존재하는 지의 여부, 그리고 이들 단백질의 어떤 형태가 환자 또는 개체의 조직에서 존재하는 지를 결정하기 위해 분석된다. 게다가, 이들 단백질 중에서 하나 또는 그 이상의 발현 수준이 결정되고, 그리고 건강한 조직에서 발견된 "정상적인" 또는 참고 수준과 비교될 수 있다. 건강한 조직에서 발견된 정상적인 또는 참고 수준의 단백질은 예로서, 암을 갖지 않는 한 명 또는 그 이상의 개체의 유관한 조직으로부터 유래될 수 있다. 대안으로, 정상적인 또는 참고 수준은 암에 의해 영향을 받지 않은 유관한 조직 (가령, 동일한 장기의 부분)의 분석에 의해, 암을 앓는 개체에 대해 획득될 수 있다.
단백질 또는 펩티드의 수준 또는 양은 SRM/MRM 검정에 의해 결정된 단백질 또는 펩티드의 몰, 질량 또는 중량에서 표현된 양으로서 규정될 수 있다. 수준 또는 양은 분석된 용해물에서 단백질 또는 다른 성분의 전체 수준 또는 양 (가령, 마이크로몰/마이크로그램의 단백질 또는 마이크로그램 /마이크로그램의 단백질로 표현됨)에 정규화되거나 또는 심지어, 중량당 기초에서 DNA의 양 (가령, 마이크로몰 또는 마이크로그램/마이크로그램의 DNA)에 정규화될 수 있다. 이에 더하여, 단백질 또는 펩티드의 수준 또는 양은 예로서, 마이크로몰 또는 나노그램/마이크로리터로 표현된 부피 기초에서 결정될 수 있다. 단백질 또는 펩티드의 수준 또는 양은 SRM/MRM 검정에 의해 결정될 때, 분석된 세포의 숫자에 또한 정규화될 수 있다.
ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질, 그리고 이들 단백질의 동종형에 관한 정보는 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질, 그리고 이들의 동종형, 또는 단편 펩티드의 수준을 정상적인 조직에서 관찰된 수준과 상관하거나 또는 비교함으로써, 암의 조직학적 시기 또는 등급을 결정하는데 있어서 보조하는데 이용될 수 있다. 일단 암의 조직학적 시기 및/또는 등급, 및/또는 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질-발현 특징이 결정되면, 상기 정보는 예로서, 검정된 단백질 또는 단백질(들) (가령, ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1)의 비정상적인 발현에 의해 특징화되는 암 조직을 특이적으로 치료하기 위해 개발된 치료적 작용제 (화학적 및 생물학적)의 목록에 정합될 수 있다. ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질(들)을 발현하는 세포/조직을 특이적으로 표적으로 하는 치료적 작용제의 목록에, 특정한 개체로부터 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 검정으로부터 정보를 정합하는 것은 폐암을 비롯한 암을 치료하는 개인맞춤된 약제 접근법을 대표한다. 본원에서 설명된 검정 방법은 환자 또는 개체의 자체 조직으로부터 단백질의 분석을 진단 결정과 치료 결정을 위한 출처로서 이용함으로써, 개인맞춤된 약제 접근법의 기초를 형성한다.
펩티드 산출
원칙적으로, 공지된 특이성의 임의의 단백질분해 과정에 의해 제조된, ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질로부터 유래된 임의의 예측된 펩티드는 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 존재비를 결정하기 위한 대용 리포터로서 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 표본은 공지된 특이성의 프로테아제 또는 프로테아제들 (가령, 트립신 및/또는 엔도프로테이나아제 Lys-C 중에서 하나 또는 그 이상)로 소화된다. 단백질분해 처리로부터 발생하는 하나 또는 그 이상의 펩티드는 적합한 검정, 예를 들면, 질량 분광분석법-기초된 SRM/MRM 검정에서 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 중에서 하나 또는 그 이상의 존재비를 결정하기 위한 대용 리포터로서 이용될 수 있다. 유사하게, ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질에서 변형되는 것으로 알려져 있는 부위에서 아미노산 잔기를 내포하는 임의의 예측된 펩티드 서열 역시 표본에서 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 변형의 정도를 검정하는데 이용될 수 있다.
ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단편 펩티드는 US 특허 7,473,532에서 제공된 Liquid Tissue™ 프로토콜의 이용을 비롯한 다양한 수단에 의해 산출될 수 있다. Liquid Tissue™ 프로토콜과 시약은 조직/생물학적 표본에서 단백질의 단백질분해 소화에 의해, 포르말린 고정된 파라핀 포매된 조직으로부터 질량 분광 분석에 적합한 펩티드 표본을 생산할 수 있다. Liquid Tissue™ 프로토콜에서, 조직/생물체는 단백질 교차연결을 역전시키거나 또는 방출하기 위해 연장된 기간 동안 완충액에서 상승된 온도에서 유지된다 (가령, 약 10 분 내지 약 4 시간의 기간 동안 약 80 ℃ 내지 약 100 ℃). 이용된 완충액은 중성 완충액 (가령, Tris-기초된 완충액, 또는 세정제를 내포하는 완충액)이고, 그리고 유리하게는, 질량 분광계 분석을 간섭하지 않는 완충액이다. 그 다음, 조직/생물학적 표본은 상기 생물학적 표본의 조직과 세포 구조를 교란하고 상기 표본을 액화하는데 충분한 시간 동안 트립신, 키모트립신, 펩신, 그리고 엔도프로테이나아제 Lys-C가 포함되지만 이들에 한정되지 않는 하나 또는 그 이상의 프로테아제로 처리된다 (가령, 약 37 ℃ 내지 약 65 ℃의 온도에서 약 30 분 내지 약 24 시간의 기간). 가열과 단백질분해의 결과는 액상, 가용성, 희석가능한 생체분자 용해물이다. 한 구체예에서, 트립신, 키모트립신, 펩신, 그리고 엔도프로테이나아제 Lys-C에서 선택되는 2개 또는 그 이상의 프로테아제가 생물학적 표본의 단백질분해 처리에서 이용된다.
펩티드 분리와 검정
일단 용해물이 제조되면, 표본 내에 펩티드는 그들의 분석과 계측 (정량)을 용이하게 하는 다양한 기술에 종속될 수 있다. 분석이 질량 분광분석법에 의해 수행되는 경우에, 분석을 용이하게 하기 위해 하나 또는 그 이상의 크로마토그래피 방법이 이용될 수 있다.
한 구체예에서, 펩티드는 질량분광계 기기에 의한 분석에 앞서 액체 크로마토그래피 (LC)에 의해 분리된다. 가령, 펩티드는 Jupiter Proteo 90Å C12, 4μm 수지 (Phenomenex, Torrance, CA)로 12cm의 베드 길이까지 자가-충전된 PicoFrit (100μm ID/10μm 팁 ID, New Objective) 칼럼이 구비된 nanoAcquityLC 시스템 (Waters, Milford, MA) 또는 EASY-nLC II (Thermo Scientific, San Jose, CA)에서 분리될 수 있다. 펩티드는 0.1% 포름산을 내포하는, 1%에서부터 50% 아세토니트릴의 12 분 크로마토그래피 구배에 걸쳐, 그리고 800nL/분의 유속에서 용리될 수 있다. 일단 액체 크로마토그래피에 의해 분리되면, 용리된 펩티드는 분석을 위해 질량분광계로 지향된다. 한 구체예에서, 질량분광계는 나노스프레이 공급원으로 장비된다.
다른 구체예에서, 펩티드는 친화성 기술, 예를 들면, 예로서 면역학적으로-기초된 정제 (가령, 면역친화성 크로마토그래피), 이온 선택 매체에서 크로마토그래피 또는, 펩티드가 변형되면, 탄수화물 변형된 펩티드의 분리를 위한 적절한 매체, 예를 들면, 렉틴을 이용한 분리에 의해 분리될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 질량 분광계 분석에 앞서 펩티드의 면역학적 분리를 이용하는 SISCAPA 방법이 이용된다. SISCAPA 기술은 예로서, U.S. 특허 번호 7,632,686에서 설명된다. 또 다른 구체예에서, 렉틴 친화성 방법 (가령, 친화성 정제 및/또는 크로마토그래피가 질량 분광분석법에 의한 분석에 앞서 용해물로부터 펩티드를 분리하는데 이용될 수 있다. 렉틴-기초된 방법을 비롯하여, 펩티드의 군의 분리를 위한 방법은 예로서, Geng et al., J. Chromatography B, 752:293-306 (2001)에서 설명된다. 면역친화성 크로마토그래피 기술, 렉틴 친화성 기술 및 다른 형태의 친화성 분리 및/또는 크로마토그래피 (가령, 역상, 크기 기초된 분리, 이온 교환)가 질량 분광분석법에 의한 펩티드의 분석을 용이하게 하는 임의의 적절한 조합에서 이용될 수 있다.
놀랍게도, ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질로부터 많은 잠재적 펩티드 서열은 분명하지 않은 이유로 질량 분광분석법-기초된 SRM/MRM 검정에서 이용에 적합하지 않거나 또는 무효한 것으로 밝혀졌다. 특히, ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질로부터 많은 트립신 펩티드는 포르말린 고정된, 파라핀 포매된 조직으로부터 Liquid Tissue™ 용해물에서 효율적으로 또는 전혀 검출될 수 없는 것으로 밝혀졌다. MRM/SRM 검정을 위한 가장 적합한 펩티드를 예측하는 것이 가능하지 않았기 때문에, ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질에 대한 신뢰할 만한 정확한 SRM/MRM 검정을 개발하기 위해 실제 Liquid Tissue™ 용해물에서 변형된 펩티드와 변형되지 않은 펩티드를 실험적으로 확인하는 것이 필요하였다. 임의의 이론에 의해 한정됨 없이, 일부 펩티드는 질량 분광분석법에 의해 검출하는 것이 어려울 수도 있을 것으로 생각되는데, 그 이유는 이들이 충분히 이온화하거나 또는 다른 단백질과 구별되는 단편을 생산하지 않고, 펩티드가 또한, 분리 (가령, 액체 크로마토그래피) 동안 충분히 분해하는데 실패하거나, 또는 유리 또는 플라스틱 웨어에 부착하기 때문이다. 따라서, 포르말린 고정된 조직 표본으로부터 제조된 Liquid Tissue™ 용해물에서 검출될 수 있는 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질로부터 펩티드 (가령, 표 1과 2에서 펩티드)는 SRM/MRM 검정이 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 SRM/MRM 검정에서 이용될 수 있는 펩티드이다. 한 구체예에서, 단일 표본에서 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 단편의 동시적 제조에서 이용된 프로테아제는 트립신일 것이다.
본원에서 설명된 다양한 구체예에서 발견된 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 펩티드 (가령, 표 1 및/또는 2)는 포르말린 고정된 암 조직으로부터 입수된 세포로부터 제조된 복합적 Liquid Tissue™ 용해물 내에서 모든 단백질의 트립신 소화에 의해 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질로부터 유래되었다. 달리 언급되지 않으면, 각 경우에서 프로테아제는 트립신이었다. Liquid Tissue™ 용해물은 이후, 질량 분광분석법에 의해 검출되고 분석되는 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질로부터 유래된 펩티드를 결정하기 위해 질량 분광분석법에 의해 분석되었다. 질량 분광계 분석을 위한 펩티드의 특정한 바람직한 부분집합의 확인은 다음에 기초된다: 1) 단백질로부터 어떤 펩티드 또는 펩티드들이 Liquid Tissue™ 용해물의 질량 분광분석법 분석에서 이온화하는 지의 실험적 결정, 그리고 2) Liquid Tissue™ 용해물을 제조하는데 이용된 프로토콜과 실험적 조건을 견뎌내는 펩티드의 능력. 이러한 후자 성질은 펩티드의 아미노산 서열뿐만 아니라 표본 제조 동안 변형된 형태에서 생존하는 펩티드 내에서 변형된 아미노산 잔기의 능력을 연장한다.
포르말린 (포름알데히드) 고정된 조직으로부터 직접적으로 입수된 세포로부터 단백질 용해물은 조직 미세해부를 통해 세포를 표본 튜브 내로 수집하고, 그 이후에 Liquid Tissue™ 완충액에서 세포를 연장된 기간 동안 가열하는 것을 수반하는 Liquid Tissue™ 시약과 프로토콜을 이용하여 제조되었다. 일단 포르말린-유도된 교차연결이 부정적으로 영향을 받으면, 조직/세포는 이후, 프로테아제, 예를 들면, 트립신을 이용한 예측가능한 방식으로 완전히 소화되고, 하지만 다른 프로테아제가 이용될 수도 있다. 각 단백질 용해물은 프로테아제로 무손상 폴리펩티드의 소화에 의해 펩티드의 수집물로 바뀐다. 각 Liquid Tissue™ 용해물이 펩티드의 복수 전체 프로테오믹 조사를 수행하기 위해 분석되었고 (가령, 이온 트랩 질량 분광분석법), 여기서 상기 데이터는 각 단백질 용해물에서 존재하는 모든 세포 단백질로부터 질량 분광분석법에 의해 확인될 수 있었던 가능한 많은 펩티드의 확인으로서 제공되었다. 단일 복합체 단백질/펩티드 용해물로부터 가능한 많은 펩티드의 확인을 위해, 전체 프로파일링을 수행할 수 있는 이온 트랩 질량분광계 또는 다른 형태의 질량분광계가 분석을 위해 전형적으로 이용된다. 비록 SRM/MRM 검정이 개발되고 MALDI, 이온 트랩, 또는 삼중 사중극을 비롯한 임의의 유형의 질량분광계에서 수행될 수 있지만, SRM/MRM 검정을 위한 가장 유리한 기기 플랫폼은 종종, 삼중 사중극 기기 플랫폼인 것으로 고려된다.
일단 가능한 많은 펩티드가 이용된 조건 하에 단일 용해물의 단일 MS 분석에서 확인되면, 펩티드의 목록이 수집분석되고 상기 용해물에서 검출되는 단백질을 결정하는데 이용되었다. 상기 과정은 복수 Liquid Tissue™ 용해물에 대해 반복되었고, 그리고 펩티드의 매우 큰 목록이 단일 데이터세트 내로 수집분석되었다. 상기 유형의 데이터세트는 분석된 (프로테아제 소화 후에) 생물학적 표본의 유형에서, 그리고 구체적으로 생물학적 표본의 Liquid Tissue™ 용해물에서 검출될 수 있고, 그리고 따라서, 특정한 단백질, 예를 들면, 예로서 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질에 대한 펩티드를 포함하는 펩티드를 나타내는데 고려될 수 있다.
한 구체예에서, 다음의 절대적 또는 상대적 양의 결정에서 유용한 것으로 확인된 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 트립신 펩티드: ALK (가령, NCBI 수탁 번호: Q9UM73, 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 그리고 서열 번호:5), Ros (가령, NCBI 수탁 번호: P08922, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 그리고 서열 번호:8; Ron (가령, NCBI 수탁 번호: Q04912, 서열 번호: 9, 서열 번호:10, 서열 번호:11. 서열 번호:12, 그리고 서열 번호:13); Ret (가령, NCBI 수탁 번호: P07949, 서열 번호:14, 서열 번호:15, 서열 번호:16, 서열 번호:17, 서열 번호:18, 서열 번호:19, 서열 번호:20, 서열 번호:21, 서열 번호:22, 서열 번호:23, 서열 번호:24, 서열 번호:25, 그리고 서열 번호:26); TS (가령, NCBI 수탁 번호: P04818, 서열 번호:27, 서열 번호:28, 서열 번호:29, 서열 번호:30, 서열 번호:31, 서열 번호:32, 서열 번호:33, 서열 번호:34, 그리고 서열 번호:35), 및/또는 FGFR1 (가령, NCBI 수탁 번호: P11362, 서열 번호:36, 서열 번호:37, 서열 번호:38, 그리고 서열 번호:39)은 표 1에서 각각 열거되는 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:9, 서열 번호:10, 서열 번호:11, 서열 번호:12, 서열 번호:13, 서열 번호:14, 서열 번호:15, 서열 번호:16, 서열 번호:17, 서열 번호:18, 서열 번호:19, 서열 번호:20, 서열 번호:21, 서열 번호:22, 서열 번호:23, 서열 번호:24, 서열 번호:25, 서열 번호:26, 서열 번호:27, 서열 번호:28, 서열 번호:29, 서열 번호:30, 서열 번호:31, 서열 번호:32, 서열 번호:33, 서열 번호:34, 서열 번호:35, 서열 번호:36, 서열 번호:37, 서열 번호:38, 그리고 서열 번호:39 중에서 하나 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 4개 또는 그 이상, 5개 또는 그 이상, 6개 또는 그 이상, 7개 또는 그 이상, 8개 또는 그 이상, 9개 또는 그 이상, 또는 10개 또는 그 이상 또는 모든 펩티드를 포함한다. 각각의 이들 펩티드는 포르말린 고정된, 파라핀 포매된 조직으로부터 제조된 Liquid Tissue™ 용해물에서 질량 분광분석법에 의해 검출되었다. 따라서, 표 1에서 각각의 펩티드, 또는 이들 펩티드의 임의의 조합 (가령, 표 1에서 언급된 펩티드 중에서 하나 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 4개 또는 그 이상, 5개 또는 그 이상, 6개 또는 그 이상, 또는 7개 또는 그 이상, 8개 또는 그 이상, 9개 또는 그 이상, 또는 10개 또는 그 이상)이 포르말린 고정된 환자 또는 개체 조직에서 직접적으로 포함된 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질에 대한 정량적 SRM/MRM 검정에서 이용을 위한 후보이다.
서열 번호 단백질 펩티드 서열
서열 번호:1 ALK SLAVDFVVPSLFR
서열 번호:2 ALK DSFPFLSHR
서열 번호:3 ALK SLSAVDFFALK
서열 번호:4 ALK SNQEVLEFVTSGGR
서열 번호:5 ALK DPEGVPPLLVSQQAK
서열 번호:6 ROS IQDQLQLFR
서열 번호:7 ROS GEGLLPVR
서열 번호:8 ROS EGVTVLINEDK
서열 번호:9 RON ILQVELVR
서열 번호:10 RON LHVLGPDLK
서열 번호:11 RON VDGTSVLR
서열 번호:12 RON DLISFGLQVAR
서열 번호:13 RON DLDSALLAEVK
서열 번호:14 RET TLGEGEFGK
서열 번호:15 RET NILVAEGR
서열 번호:16 RET ALPSTWIENK
서열 번호:17 RET ISDFGLSR
서열 번호:18 RET DVYEEDSYVK
서열 번호:19 RET VGPGYLGSGGSR
서열 번호:20 RET AGYTTVAVK
서열 번호:21 RET DLLSEFNVLK
서열 번호:22 RET ATAFHLK
서열 번호:23 RET NLVLGK
서열 번호:24 RET ILEDPK
서열 번호:25 RET ADGTNTGFPR
서열 번호:26 RET QVNHPHVIK
서열 번호:27 TS GSTNAK
서열 번호:28 TS VIDTIK
서열 번호:29 TS TNPDDR
서열 번호:30 TS HFGAEYR
서열 번호:31 TS DEFPLLTTK
서열 번호:32 TS DFLDSLGFSTR
서열 번호:33 TS GVLEELLWFIK
서열 번호:34 TS EEGDLGPVYGFQWR
서열 번호:35 TS AEDFQIEGYNPHPTIK
서열 번호:36 FGFR1 DDVQSINWLR
서열 번호:37 FGFR1 DGVQLAESNR
서열 번호:38 FGFR1 LHAVPAAK
서열 번호:39 FGFR1 HPAQLANGGLK
표 1에서 열거된 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 펩티드는 전립선, 결장과 유방을 비롯한 상이한 인간 장기의 복수 상이한 포르말린 고정된 조직의 복수 Liquid Tissue™ 용해물로부터 검출된 것들을 포함한다. 이들 펩티드 각각은 포르말린 고정된 조직에서 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 정량적 SRM/MRM 검정에 유용한 것으로 고려된다. 이들 실험의 추가 데이터 분석은 임의의 특정한 장기 부위로부터 임의의 특정한 펩티드에 대한 선호가 관찰되지 않는다는 것을 지시하였다. 따라서, 이들 펩티드 각각은 임의의 생물학적 표본으로부터 유래하는 임의의 포르말린 고정된 조직으로부터 또는 체내에서 임의의 장기 부위로부터 Liquid Tissue™ 용해물에서 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 SRM/MRM 검정을 수행하는데 적합한 것으로 생각된다.다른 구체예에서, SRM/MRM 검정은 TS와 FGFR1 각각에 대한 1개 또는 2개의 펩티드 (가령, 표 1에서 열거된 펩티드로부터)를 이용한다. 다른 구체예에서, SRM/MRM 검정은 ALK, Ros, Ron, 및/또는 Ret 각각에 대한 1개 또는 2개의 펩티드 (가령, 표 1에서 열거된 펩티드로부터)를 이용한다.
다른 구체예에서, ALK와 Ros 단백질 중에서 한쪽 또는 양쪽이 검정되고, 그리고 Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 중에서 1개, 2개, 3개 또는 4개가 SRM/MRM 검정(들)을 이용하여 검정된다. 이런 구체예의 한 가지 실례에서, Ron과 Ret 단백질 중에서 한쪽 또는 양쪽에 대한 최소한 하나의 펩티드 또는 최소한 2개의 펩티드가 SRM/MRM 검정에 의해 검정된다 (가령, 표 1에서 열거된 Ron과 Ret 펩티드); 그리고 ALK, Ros, TS, 및/또는 FGFR1 중에서 임의의 1개, 2개, 3개 또는 4개에 대한 최소한 하나의 펩티드 또는 최소한 2개의 펩티드가 검정된다 (가령, 표 1에서 열거된 펩티드). 이런 구체예의 다른 실례에서: ALK와 Ros 단백질 중에서 한쪽 또는 양쪽에 대한 최소한 하나의 또는 최소한 2개의 펩티드가 SRM/MRM 검정에 의해 검정된다 (가령, 표 1에서 열거된 펩티드); 그리고 Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 중에서 한 가지에 대한 최소한 하나의 또는 최소한 2개의 펩티드가 검정된다 (가령, 표 1에서 열거된 펩티드). 동위원소적으로 표지화되지만, 이들 구체예 중에서 한 가지에서 진술된 펩티드 중에서 하나 또는 그 이상과 다른 모든 면에서 동일한 펩티드를 포함하는 조성물이 본원에서 제공되고, 그리고 이들의 제조와 용도, 특히 질량 분광분석법 표준으로서 용도가 아래에 설명된다.
한 구체예에서, 표 1에서 하나 또는 그 이상의 펩티드, 또는 이들 펩티드의 임의의 조합 (가령, 하나 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 4개 또는 그 이상, 5개 또는 그 이상, 6개 또는 그 이상, 7개 또는 그 이상, 8개 또는 그 이상, 9개 또는 그 이상, 또는 모두 11개)이 면역학적 방법 (가령, 웨스턴 블롯팅 또는 ELISA)이 포함되지만 이들에 한정되지 않는, 질량 분광법에 의존하지 않는 방법에 의해 검정된다. 한 구체예에서, 이들 검정은 포르말린 고정된 조직을 이용하여 수행된다. 펩티드(들)의 양 (절대적 또는 상대적)에 관계하는 정보가 어떻게 획득되는 지에 상관없이, 상기 정보는 환자 또는 개체에서 암의 존재를 지시하거나 (진단하거나), 암의 시기/등급/상태를 결정하거나, 예후를 제공하거나, 또는 환자 또는 개체에 대한 치료적 또는 치료 섭생을 결정하는 것을 포함하는 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지에서 이용될 수 있다.
다른 구체예에서, ALK와 Ros 단백질 중에서 한쪽 또는 양쪽이 검정되고, 그리고 Ron, Ret, TS, 그리고 FGFR1 단백질 중에서 1개, 2개, 3개 또는 4개가 면역학적 방법 (가령, 웨스턴 블롯팅 또는 ELISA)이 포함되지만 이들에 한정되지 않는, 질량 분광법에 의존하지 않는 방법에 의해 검정된다. 이런 구체예의 한 가지 실례에서: ALK와 Ros 단백질 중에서 한쪽 또는 양쪽에 대한 최소한 하나의 또는 최소한 2개의 펩티드가 검정된다 (가령, 표 1에서 열거된 ALK와 ROS 펩티드); 그리고 Ron, Ret, TS, 그리고 FGFR1 단백질 중에서 임의의 1개, 2개, 3개 또는 4개에 대한 최소한 하나의 또는 최소한 2개의 펩티드가 검정된다 (가령, 표 1에서 열거된 펩티드). 이런 구체예의 다른 실례에서: ALK와 Ron 단백질 중에서 한쪽 또는 양쪽에 대한 최소한 하나의 또는 최소한 2개의 펩티드가 검정된다 (가령, 표 1에서 열거된 ALK와 Ron 펩티드); 그리고 Ros, Ret, TS, 그리고 FGFR1 단백질 중에서 한 가지에 대한 최소한 하나의 또는 최소한 2개의 펩티드가 검정된다 (가령, 표 1에서 열거된 펩티드).
SRM/MRM 검정을 수행할 때 임의의 중요한 고려 사항은 펩티드의 분석에서 이용될 수 있는 기기의 유형이다. 비록 SRM/MRM 검정이 개발되고 MALDI, 이온 트랩, 또는 삼중 사중극을 비롯한 임의의 유형의 질량분광계에서 수행될 수 있지만, 현재 SRM/MRM 검정을 위한 가장 유리한 기기 플랫폼은 종종, 삼중 사중극 기기 플랫폼인 것으로 고려된다. 상기 유형의 질량분광계는 세포 내에 내포된 모든 단백질로부터 수십 만 내지 수백 만 개의 개별 펩티드로 구성될 수 있는 매우 복잡한 단백질 용해물 내에서 단일 단리된 표적 펩티드를 분석하기 위한 가장 적합한 기기인 것으로 고려될 수 있다.
ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질로부터 유래된 각 펩티드에 대한 SRM/MRM 검정을 가장 효율적으로 실행하기 위해, 분석에서 펩티드 서열에 더하여 정보를 활용하는 것이 바람직하다. 추가 정보는 검정이 효과적으로 수행될 수 있도록, 질량분광계 (가령, 삼중 사중극 질량분광계)가 특정한 표적화된 펩티드(들)의 정확하고 집중된 분석을 수행하게 주동하고 명령하는데 이용될 수 있다.
일반적인 표적 펩티드, 그리고 특정한 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 펩티드에 관한 추가 정보는 각 펩티드의 모노 동위원소 질량, 이의 전구체 전하 상태, 전구체 m/z 값, m/z 전이 이온, 그리고 각 전이 이온의 이온 유형 중에서 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상을 포함할 수 있다. ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질에 대한 SRM/MRM 검정을 개발하는데 이용될 수 있는 추가 펩티드 정보는 표 1에서 목록으로부터 12 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 펩티드에 대해 표 2에서 도시된다. 표 2에 나타나 있는 바와 같이 펩티드에 대해 설명된 이러한 추가 정보는 준비되고, 획득되고, 그리고 다른 프로테아제 또는 프로테아제의 조합 (가령, 트립신 및/또는 Lys C)의 작용에 의해 생산된 것들을 비롯하여, ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질로부터 임의의 다른 펩티드의 분석에 적용될 수 있다.
펩티드
서열 		모노
동위원소 질량 		전구체 전하
상태 		전구체 m/z 전이 m/z 이온 유형
ALK
서열
번호
1 SLAVDFVVPSLFR 1448.8027 2 725.409 619.356 y5
2 725.409 718.424 y6
2 725.409 817.493 y7
2 725.409 964.561 y8
2 725.409 1079.588 Y9
2 DSFPFLSHR 1104.5352 2 553.275 512.293 y4
2 553.275 659.362 y5
2 553.275 756.415 y6
4 SNQEVLEFVTSGGR 1521.7423 2 761.878 723.378 y7
2 761.878 852.421 y8
2 761.878 965.505 y9
2 761.878 1064.573 y10
Ros
서열 번호
6 IQDQLQLFR 1159.6349 2 580.825 435.271 y3
2 580.825 563.33 y4
2 580.825 676.414 y5
2 580.825 804.472 y6
2 580.825 919.499 y7
7 GEGLLPVR 839.4865 2 420.75 371.24 y3
2 420.75 484.324 y4
2 420.75 654.429 y6
Ron
서열 번호
9 ILQVELVR 968.6018 2 485.308 516.314 y4
2 485.308 615.382 y5
2 485.308 743.441 y6
2 485.308 856.525 y7
10 LHVLGPDLK 990.5862 2 496.3 529.298 y5
2 496.3 642.382 y6
2 496.3 741.45 y7
Ret
서열 번호
16 ALPSTWIENK 936.4552 2 579.811 390.198 y3
2 579.811 503.282 y4
2 579.811 689.361 y5
2 579.811 790.409 y6
2 579.811 877.441 y7
펩티드
서열 		모노
동위원소 질량 		전구체 전하
상태 		전구체 m/z 전이
m/z 		이온 유형
TS
서열 번호
31 DEFPLLTTK 1062.5597 2 532.287 462.292 y4
2 532.287 575.376 y5
2 532.287 672.429 y6
2 532.287 819.497 y7
35 AEDFQIEGYNPHPTI 1857.8897 3 620.304 458.297 y4
3 620.304 578.293 y10
3 620.304 634.835 y11
3 620.304 692.408 y6
3 620.304 829.912 y14
FGFR1서열 번호
36 DDVQSINWLR 1244.6149 2 623.315 588.325 y4
2 623.315 701.409 y5
2 623.315 788.441 y6
2 623.315 916.499 y7
38 LHAVPAAK 805.481 2 403.748 386.239 y4
2 403.748 485.308 y5
2 403.748 556.345 y6
표 2(계속)일부 구체예에서, ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 검정에 적합한 펩티드 (가령, 표 1에서 진술되고 서열 번호 1-39로서 도시된 펩티드)는 개열되면 하위펩티드를 생산할 펩티드 서열의 내부에 추가 단백질분해 부위를 내포할 수 있다. 이런 하위펩티드는 원하는 프로테아제의 단백질분해 개열 부위에 대한 확인된 펩티드의 서열을 사정함으로써 인식가능하다. 한 구체예에서, 트립신 펩티드는 트립신에 의한 추가 개열 시에 하위펩티드를 야기할 수 있는 추가 내부 트립신 개열 부위를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 트립신 펩티드는 트립신, GluC, AspN, 키모트립신, 및/또는 Lys C 중에서 임의의 1개, 2개 또는 그 이상에 의한 개열 시에 하위펩티드의 형성을 야기할 수 있는, 트립신 GluC, AspN, 키모트립신, 및/또는 Lys C가 포함되지만 이들에 한정되지 않는 프로테아제에 대한 내부 부위를 내포할 수 있다. 다른 구체예에서, Lys C 펩티드는 GluC, AspN, 키모트립신, 및/또는 트립신 중에서 임의의 1개, 2개 또는 그 이상에 의한 개열 시에 하위펩티드의 형성을 야기할 수 있는 다른 프로테아제, 예를 들면, GluC, AspN, 키모트립신, 및/또는 트립신에 대한 내부 부위를 내포할 수 있다. 이런 하위펩티드, 그리고 구체적으로 서열 번호 1-39에서 진술된 펩티드 중에서 임의의 한 가지 또는 그 이상의 트립신, GluC, AspN, 키모트립신, 및/또는 Lys C 개열 단편은 진술되고 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 이해된다.
본원에서 진술된 구체예는 표 1과 2에서 펩티드 중에서 하나 또는 그 이상을 포함하는 조성물을 포함하고, 그리고 동위원소적으로 표지화되지만, 표 1과 2에서 발견된 펩티드 중에서 하나 또는 그 이상과 다른 모든 면에서 동일한 펩티드를 임의선택적으로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 표 1과 2에서 펩티드 중에서 하나 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 4개 또는 그 이상, 5개 또는 그 이상, 6개 또는 그 이상, 7개 또는 그 이상, 8개 또는 그 이상, 9개 또는 그 이상, 또는 39개 모두를 포함한다. 이런 조성물은 아미노산 서열이 동위원소적으로 표지화되지만, 표 1과 2에서 발견된 펩티드 중에서 하나 또는 그 이상과 다른 모든 면에서 동일한 펩티드를 포함하는 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질을 임의선택적으로 포함할 수 있다. 표 1과 2에서 펩티드 중에서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 이상을 포함하는 동위원소적으로 표지화된 합성 또는 자연 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질이 이용되는 경우에, 프로테아제 처리는 동위원소적으로 표지화되지만, 표 1과 2에서 펩티드와 다른 모든 면에서 동일한 펩티드를 방출한다. 이런 동위원소적으로 표지화된 생물학적 또는 생합성 펩티드는 예로서, 동위원소적으로 표지화된 아미노산을 이용하여, 프로그램된 세포 용해물에서 또는 조직 배양액에서 제조될 수 있다. 각각의 동위원소적으로 표지화된 펩티드는 18O, 17O, 34S, 15N, 13C, 2H 또는 이들의 조합으로 구성된 군에서 독립적으로 선택되는 하나 또는 그 이상의 동위원소로 표지화될 수 있다. 동위원소로 표지화되는 지의 여부에 상관없이, ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질로부터 펩티드를 포함하는 조성물은 상기 단백질로부터 모든 펩티드 (가령, 트립신 펩티드의 완전한 세트)를 내포할 필요가 없다. 일부 구체예에서, 조성물은 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질과 합동으로 모든 펩티드, 그리고 특히 표 1과 표 2에서 나타나는 모든 펩티드를 내포하지는 않는다. 펩티드를 내포하는 조성물은 건조된 또는 동결건조된 물질, 액상 (가령, 수성) 용액 또는 현탁액, 어레이, 또는 블롯의 형태일 수 있다.
한 구체예에서, 특정한 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 펩티드에 관한 추가 정보는 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 Lys C 단백질분해로부터 발생하는 펩티드에 대한 각 펩티드의 모노 동위원소 질량, 이의 전구체 전하 상태, 전구체 m/z 값, m/z 전이 이온, 그리고 각 전이 이온의 이온 유형 중에서 하나 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 또는 3개 또는 그 이상을 포함한다.
다른 구체예에서, 특정한 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 펩티드에 관한 추가 정보는 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 트립신 단백질분해로부터 발생하는 펩티드에 대한 각 펩티드의 모노 동위원소 질량, 이의 전구체 전하 상태, 전구체 m/z 값, m/z 전이 이온, 그리고 각 전이 이온의 이온 유형 중에서 하나 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 또는 3개 또는 그 이상을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 특정한 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 펩티드에 관한 추가 정보는 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 트립신 및/또는 Lys C 단백질분해로부터 발생하는 펩티드에 대한 각 펩티드의 모노 동위원소 질량, 이의 전구체 전하 상태, 전구체 m/z 값, m/z 전이 이온, 그리고 각 전이 이온의 이온 유형 중에서 하나 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 또는 3개 또는 그 이상을 포함한다. 한 구체예에서, ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 각각으로부터 단일 트립신 및/또는 Lys C 단백질분해 펩티드는 유관한 추가 정보와 함께, 진단적 결정에서 이용된다. 따라서, 예로서, 서열 번호 4, 7, 9, 16, 31 및/또는 36의 펩티드, 그리고 이들 펩티드에 관한 추가 정보 (표 3 참조)가 진단적 분석에서 이용된다.
Figure pat00001
일정한 구체예
본 발명의 일정한 구체예가 아래에 설명된다.
1. 생물학적 표본에서 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 수준을 계측하기 위한 방법, 상기 방법은 질량 분광분석법을 이용하여, 상기 생물학적 표본으로부터 제조된 단백질 소화물에서 하나 또는 그 이상의 변형된 및/또는 변형되지 않은 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드의 양을 검출하고 및/또는 정량하고; 그리고 상기 표본에서 변형된 또는 변형되지 않은 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 수준을 계산하는 것을 포함하고; 그리고
여기서 상기 양은 상대적 양 또는 절대적 양이다.
2. 구체예 1의 방법, 상기 방법은 하나 또는 그 이상의 변형된 또는 변형되지 않은 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드의 양을 검출하고 및/또는 정량하기에 앞서, 상기 단백질 소화물을 분획하는 단계를 더욱 포함한다.
3. 구체예 2의 방법, 여기서 상기 분획하는 단계는 겔 전기영동, 액체 크로마토그래피, 모세관 전기영동, 나노-역상 액체 크로마토그래피, 고성능 액체크로마토그래피, 또는 역상 고성능 액체크로마토그래피로 구성된 군에서 선택된다.
4. 구체예 1 내지 3 중에서 한 가지의 방법, 여기서 상기 생물학적 표본의 상기 단백질 소화물은 Liquid Tissue™ 프로토콜에 의해 제조된다.
5. 구체예 1 내지 3 중에서 한 가지의 방법, 여기서 상기 단백질 소화물은 프로테아제 소화물을 포함한다.
6. 구체예 5의 방법, 여기서 상기 단백질 소화물은 트립신 및/또는 lys C 소화물을 포함한다.
7. 구체예 1 내지 6 중에서 한 가지의 방법, 여기서 상기 질량 분광분석법은 탠덤 질량 분광분석법, 이온 트랩 질량 분광분석법, 삼중 사중극 질량 분광분석법, MALDI-TOF 질량 분광분석법, MALDI 질량 분광분석법, 및/또는 비행시간 질량 분광분석법을 포함한다.
8. 구체예 7의 방법, 여기서 이용된 질량 분광분석법의 방식은 선별된 반응 모니터링 (SRM), 복수 반응 모니터링 (MRM), 및/또는 복수 선별된 반응 모니터링 (mSRM), 또는 이들의 임의의 조합이다.
9. 구체예 1 내지 8 중에서 한 가지의 방법, 여기서 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드는 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:9, 서열 번호:10, 서열 번호:11, 서열 번호:12, 서열 번호:13, 서열 번호:14, 서열 번호:15, 서열 번호:16, 서열 번호:17, 서열 번호:18, 서열 번호:19, 서열 번호:20, 서열 번호:21, 서열 번호:22, 서열 번호:23, 서열 번호:24, 서열 번호:25, 서열 번호:26, 서열 번호:27, 서열 번호:28, 서열 번호:29, 서열 번호:30, 서열 번호:31, 서열 번호:32, 서열 번호:33, 서열 번호:34, 서열 번호:35, 서열 번호:36, 서열 번호:37, 서열 번호:38, 그리고 서열 번호:39로서 진술된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
10. 구체예 1 내지 9 중에서 한 가지의 방법, 여기서 생물학적 표본은 혈액 표본, 소변 표본, 혈청 표본, 복수 표본, 담 표본, 림프액, 타액 표본, 세포, 또는 고형 조직이다.
11. 구체예 1 내지 10 중에서 한 가지의 방법, 여기서 생물학적 표본은 포르말린 고정된 조직이다.
12. 구체예 1 내지 11 중에서 한 가지의 방법, 여기서 생물학적 표본은 파라핀 포매된 조직이다.
13. 구체예 1 내지 12 중에서 한 가지의 방법, 여기서 생물학적 표본은 종양으로부터 획득된 조직이다.
14. 구체예 13의 방법, 여기서 종양은 원발성 종양이다.
15. 구체예 13의 방법, 여기서 종양은 이차성 종양이다.
16. 구체예 1 내지 15 중에서 한 가지의 방법, 상기 방법은 변형된 및/또는 변형되지 않은 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드를 정량하는 것을 더욱 포함한다.
17(a). 구체예 1 내지 16 중에서 한 가지의 방법, 여기서 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드를 정량하는 것은 한 생물학적 표본에서 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 약 8개 내지 약 45개 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 하나 또는 그 이상의 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드의 양을 상이한 별개의 표본 또는 생물학적 표본에서 동일한 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드의 양과 비교하는 것을 포함한다.
17(b). 구체예 1 내지 16 중에서 한 가지의 방법, 여기서 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드를 정량하는 것은 한 생물학적 표본에서 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:9, 서열 번호:10, 서열 번호:11, 서열 번호:12, 서열 번호:13, 서열 번호:14, 서열 번호:15, 서열 번호:16, 서열 번호:17, 서열 번호:18, 서열 번호:19, 서열 번호:20, 서열 번호:21, 서열 번호:22, 서열 번호:23, 서열 번호:24, 서열 번호:25, 서열 번호:26, 서열 번호:27, 서열 번호:28, 서열 번호:29, 서열 번호:30, 서열 번호:31, 서열 번호:32, 서열 번호:33, 서열 번호:34, 서열 번호:35, 서열 번호:36, 서열 번호:37, 서열 번호:38, 그리고 서열 번호:39에 나타나 있는 바와 같이, ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 약 8개 내지 약 45개 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 하나 또는 그 이상의 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드의 양을 상이한 별개의 생물학적 표본에서 동일한 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드의 양과 비교하는 것을 포함한다.
18. 구체예 17(a) 또는 17(b)의 방법, 여기서 하나 또는 그 이상의 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드를 정량하는 것은 공지된 양의 추가된 내부 표준 펩티드에 비해 생물학적 표본에서 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드 각각의 양을 결정하는 것을 포함하고, 여기서 생물학적 표본에서 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드 각각은 동일한 아미노산 서열을 갖는 추가된 내부 표준 펩티드와 비교된다.
19. 구체예 18의 방법, 여기서 내부 표준 펩티드는 동위원소적으로 표지화된 펩티드이다.
20. 구체예 19의 방법, 여기서 동위원소적으로 표지화된 내부 표준 펩티드는 18O, 17O, 34S, 15N, 13C, 2H 또는 이들의 조합에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 무거운 안정성 동위원소를 포함한다.
21. 구체예 1 내지 20 중에서 한 가지의 방법, 여기서 단백질 소화물에서 하나 또는 그 이상의 변형된 또는 변형되지 않은 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드의 양을 검출하고 및/또는 정량하는 것은 변형된 및/또는 변형되지 않은 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 존재 및 환자 또는 개체에서 암과의 연관을 지시한다.
22. 구체예 21의 방법, 상기 방법은 하나 또는 그 이상의 변형된 및/또는 변형되지 않은 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드의 양, 또는 상기 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 양을 상기 검출하고 및/또는 정량하는 것의 결과를 암의 진단적 시기/등급/상태에 상관하는 것을 더욱 포함한다.
23. 구체예 22의 방법, 여기서 하나 또는 그 이상의 변형된 및/또는 변형되지 않은 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드의 양, 또는 상기 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 양을 상기 검출하고 및/또는 정량하는 것의 결과를 암의 진단적 시기/등급/상태에 상관하는 것은 다중 형식에서 다른 단백질 또는 다른 단백질로부터 펩티드의 양을 검출하고 및/또는 정량하여 암의 진단적 시기/등급/상태에 관한 추가 정보를 제공하는 것과 합동된다.
24. 구체예 1 내지 23 중에서 임의의 한 가지의 방법, 상기 방법은 상기 생물학적 표본이 하나 또는 그 이상의 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드의 존재, 부재 또는 양, 또는 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 양에 기초된 처리에 의해 획득된 환자 또는 개체를 선별하는 것을 더욱 포함한다.
25. 구체예 1 내지 24 중에서 임의의 한 가지의 방법, 상기 방법은 상기 생물학적 표본이 획득된 환자 또는 개체에 치료 효과량의 치료적 작용제를 투여하는 것을 더욱 포함하고, 여기서 치료적 작용제 및/또는 투여된 치료적 작용제의 양은 하나 또는 그 이상의 변형된 또는 변형되지 않은 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드의 양 또는 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 양에 기초된다.
26. 구체예 24와 25의 방법, 여기서 치료 또는 치료적 작용제는 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질을 발현하는 암 세포에 지향된다.
27. 구체예 1 내지 27의 방법, 여기서 생물학적 표본은 Liquid Tissue™ 프로토콜과 시약을 이용하여, 하나 또는 그 이상의 변형된 또는 변형되지 않은 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드의 양을 정량하기 위해 처리된 포르말린 고정된 종양 조직이다.
28. 구체예 1 내지 28 중에서 한 가지의 방법, 여기서 상기 하나 또는 그 이상의 변형된 또는 변형되지 않은 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드는 표 1에서 펩티드 중에서 하나 또는 그 이상이다.
29. 표 1에서 펩티드 및/또는 이들에 대한 항체 중에서 하나 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 4개 또는 그 이상, 5개 또는 그 이상, 6개 또는 그 이상, 7개 또는 그 이상, 8개 또는 그 이상, 9개 또는 그 이상, 또는 10개 또는 그 이상을 포함하는 조성물.
30. 구체예 30의 조성물, 상기 조성물은 표 2의 펩티드 또는 이들에 대한 항체 중에서 하나 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 4개 또는 그 이상, 5개 또는 그 이상, 6개 또는 그 이상, 7개 또는 그 이상, 8개 또는 그 이상, 9개 또는 그 이상, 또는 10개 또는 그 이상을 포함한다.
예시적인 SRM/MRM 검정 방법
1. 아래에 설명된 방법은 1) ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질에 대한 질량 분광분석법-기초된 SRM/MRM 검정을 위해 이용될 수 있는 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질로부터 후보 펩티드를 확인하고, 2) 개별 SRM/MRM 검정, 또는 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질로부터 표적 펩티드에 대한 검정을 개발하고, 그리고 3) 정량적 검정을 암 진단 및/또는 최적 요법의 선택에 적용하는데 이용되었다. ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질에 대한 SRM/MRM 후보 단편 펩티드의 확인:
a. 단백질을 소화하는 프로테아제 또는 프로테아제들 (트립신을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다)을 이용하여 포르말린 고정된 생물학적 표본으로부터 Liquid Tissue™ 단백질 용해물을 제조한다
b. Liquid Tissue™ 용해물에서 모든 단백질 단편을 이온 트랩 탠덤 질량분광계에서 분석하고 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질로부터 모든 단편 펩티드를 확인하고, 여기서 개별 단편 펩티드는 임의의 펩티드 변형, 예를 들면, 인산화 또는 당화를 내포하지 않는다
c. Liquid Tissue™ 용해물에서 모든 단백질 단편을 이온 트랩 탠덤 질량분광계에서 분석하고 펩티드 변형, 예를 들면, 예로서 인산화된 또는 당화된 잔기를 운반하는 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질로부터 모든 단편 펩티드를 확인한다
d. 전체, 전장 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질로부터 특정한 소화 방법에 의해 산출된 모든 펩티드가 잠재적으로 계측될 수 있지만, SRM/MRM 검정의 개발에 이용된 바람직한 펩티드는 포르말린 고정된 생물학적 표본으로부터 제조된 복합적 Liquid Tissue™ 단백질 용해물에서 직접적으로 질량 분광분석법에 의해 확인되는 것들이다
e. 환자 또는 개체 조직에서 특이적으로 변형되고 (인산화, 당화 등), 그리고 이온화하고, 따라서 포르말린 고정된 생물학적 표본으로부터 Liquid Tissue™ 용해물을 분석할 때 질량분광계에서 검출될 수 있는 펩티드는 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 펩티드 변형을 검정하기 위한 후보 펩티드로서 확인된다
2. ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질로부터 단편 펩티드에 대한 질량 분광분석법 검정:
a. Liquid Tissue™ 용해물에서 확인된 개별 단편 펩티드에 대한 삼중 사중극 질량분광계에서 SRM/MRM 검정이 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질로부터 펩티드에 적용된다
* i. 겔 전기영동, 액체 크로마토그래피, 모세관 전기영동, 나노-역상 액체 크로마토그래피, 고성능 액체크로마토그래피, 또는 역상 고성능 액체크로마토그래피가 포함되지만 이들에 한정되지 않는 최적 크로마토그래피 조건을 위한 단편 펩티드에 대한 최적 체류 시간을 결정한다
ii. 각 펩티드에 대한 SRM/MRM 검정을 개발하기 위해, 펩티드의 모노 동위원소 질량, 각 펩티드에 대한 전구체 전하 상태, 각 펩티드에 대한 전구체 m/z 값, 각 펩티드에 대한 m/z 전이 이온, 그리고 각 단편 펩티드에 대한 각 전이 이온의 이온 유형을 결정한다.
iii. SRM/MRM 검정은 이후, (i)와 (ii)로부터 정보를 이용하여 삼중 사중극 질량분광계에서 수행될 수 있고, 여기서 각 펩티드는 삼중 사중극 질량분광계에서 수행된 바와 같은 독특한 SRM/MRM 검정을 정확히 규정하는 특징적이고 독특한 SRM/MRM 서명 피크를 갖는다
b. 검출되는 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 단편 펩티드의 양이 SRM/MRM 질량 분광분석법 분석으로부터 독특한 SRM/MRM 서명 피크 구역의 함수로서, 특정 단백질 용해물에서 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 상대적 양과 절대적 양 둘 모두를 지시할 수 있도록 SRM/MRM 분석을 수행한다.
i. 상대적 정량은 다음에 의해 달성될 수 있다:
1. (a) 하나의 포르말린 고정된 생물학적 표본으로부터 Liquid Tissue™ 용해물에서 검출된 소정의 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 펩티드로부터 SRM/MRM 서명 피크 구역을 (b) 최소한 두 번째, 세 번째, 네 번째 또는 그 이상의 포르말린 고정된 생물학적 표본으로부터 최소한 두 번째, 세 번째, 네 번째 또는 그 이상의 Liquid Tissue™ 용해물에서 동일한 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단편 펩티드의 동일한 SRM/MRM 서명 피크 구역과 비교함으로써, ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 증가된 또는 줄어든 존재를 결정함에 의해
2. (a) 하나의 포르말린 고정된 생물학적 표본으로부터 Liquid Tissue™ 용해물에서 검출된 소정의 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 펩티드로부터 SRM/MRM 서명 피크 구역을 (b) 상이한 별개의 생물학적 공급원으로부터 유래된 다른 표본에서, 다른 단백질로부터 단편 펩티드로부터 발달된 SRM/MRM 서명 피크 구역과 비교함으로써, ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 증가된 또는 줄어든 존재를 결정함에 의해, 여기서 펩티드 단편에 대한 2개 표본 사이에 SRM/MRM 서명 피크 구역 비교는 각 표본에서 분석된 단백질의 양에 정규화된다.
3. 변하는 수준의 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질을 다양한 세포 조건 하에 그들의 발현 수준을 변화시키지 않는 다른 단백질의 수준에 정규화하기 위해, (a) 소정의 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 펩티드에 대한 SRM/MRM 서명 피크 구역을 (b) 포르말린 고정된 생물학적 표본으로부터 동일한 Liquid Tissue™ 용해물 내에서 상이한 단백질로부터 유래된 다른 단편 펩티드로부터 SRM/MRM 서명 피크 구역과 비교함으로써, ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 증가된 또는 줄어든 존재를 결정함에 의해.
4. 이들 검정은 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 변형되지 않은 단편 펩티드와 변형된 단편 펩티드 둘 모두에 적용될 수 있고, 여기서 변형은 인산화 및/또는 당화를 포함하지만 이들에 한정되지 않고, 그리고 여기서 변형된 펩티드의 상대적 수준은 변형되지 않은 펩티드의 상대적 양을 결정할 때와 동일한 방식으로 결정된다.
ii. 소정의 펩티드의 절대적 정량은 (a) 개별 생물학적 표본에서 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질로부터 소정의 단편 펩티드에 대한 SRM/MRM 서명 피크 구역을 (b) 생물학적 표본으로부터 단백질 용해물 내로 스파이크된 내부 단편 펩티드 표준의 SRM/MRM 서명 피크 구역과 비교함으로써 달성될 수 있다
1. 내부 표준은 규문되는 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질로부터 단편 펩티드의 표지화된 합성 이형이다. 이러한 표준은 공지된 양에서 표본 내로 스파이크되고, 그리고 SRM/MRM 서명 피크 구역은 개별적으로 생물학적 표본에서 내부 단편 펩티드 표준과 선천적 단편 펩티드 둘 모두에 대해 결정될 수 있고, 그 이후에 양쪽 피크 구역의 비교가 뒤따른다
2. 이것은 변형되지 않은 단편 펩티드와 변형된 단편 펩티드에 적용될 수 있고, 여기서 변형은 인산화 및/또는 당화를 포함하지만 이들에 한정되지 않고, 그리고 여기서 변형된 펩티드의 절대적 수준은 변형되지 않은 펩티드의 절대적 수준을 결정할 때와 동일한 방식으로 결정될 수 있다.
3. 단편 펩티드 정량을 암 진단과 치료에 적용한다
a. ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 단편 펩티드 수준의 상대적 및/또는 절대적 정량을 수행하고, 그리고 암의 분야에서 널리 이해되는 바와 같이, 환자 또는 개체 종양 조직에서 암의 시기/등급/상태에 대한 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 발현의 이전에-결정된 연관이 확증된다는 것을 증명한다
b. ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 단편 펩티드 수준의 상대적 및/또는 절대적 정량을 수행하고 상이한 치료 전략으로부터 임상적 결과와의 상관을 증명하고, 여기서 이러한 상관은 당해 분야에서 이미 증명되었거나 또는 환자 또는 개체의 코호트 및 이들 환자 또는 개체로부터 조직 전반에서 상관 연구를 통해 장래에 증명될 수 있다. 일단 이전에 확립된 상관 또는 장래에 도출될 상관이 이러한 검정에 의해 확증되면, 이러한 검정 방법은 최적 치료 전략을 결정하는데 이용될 수 있다
ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질로부터 단편 펩티드에 대한 질량 분광분석법 검정
a. 단백질 용해물에서 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 상대적 양 및/또는 절대적 양을 결정하기 위해 검출되는 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 단편 펩티드의 양을 결정하는 SRM/MRM 검정.
i. 상대적 정량은 다음에 의해 달성될 수 있다:
1. (a) 하나의 포르말린 고정된 생물학적 표본으로부터 Liquid Tissue™ 용해물에서 검출된 소정의 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 펩티드로부터 SRM/MRM 서명 피크 구역을 (b) 최소한 두 번째, 세 번째, 네 번째 또는 그 이상의 포르말린 고정된 생물학적 표본으로부터 최소한 두 번째, 세 번째, 네 번째 또는 그 이상의 Liquid Tissue™ 용해물에서 동일한 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드의 동일한 SRM/MRM 서명 피크 구역과 비교함으로써, ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 증가된 또는 줄어든 존재를 결정함에 의해
2. (a) 하나의 포르말린 고정된 생물학적 표본으로부터 Liquid Tissue™ 용해물에서 검출된 소정의 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 펩티드로부터 SRM/MRM 서명 피크 구역을 (b) 상이한 별개의 생물학적 공급원으로부터 유래된 다른 표본에서, 다른 단백질로부터 단편 펩티드로부터 발달된 SRM/MRM 서명 피크 구역과 비교함으로써, ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 증가된 또는 줄어든 존재를 결정함에 의해, 여기서 펩티드 단편에 대한 2개 표본 사이에 SRM/MRM 서명 피크 구역 비교는 각 표본에서 분석된 단백질의 양에 정규화된다.
3. 변하는 수준의 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질을 다양한 세포 조건 하에 그들의 발현 수준을 변화시키지 않는 다른 단백질의 수준에 정규화하기 위해, (a) 소정의 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 펩티드에 대한 SRM/MRM 서명 피크 구역을 (b) 포르말린 고정된 생물학적 표본으로부터 동일한 Liquid Tissue™ 용해물 내에서 상이한 단백질로부터 유래된 다른 단편 펩티드로부터 SRM/MRM 서명 피크 구역과 비교함으로써, ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 증가된 또는 줄어든 존재를 결정함에 의해.
4. 이들 검정은 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 변형되지 않은 단편 펩티드와 변형된 단편 펩티드 둘 모두에 적용될 수 있고, 여기서 변형은 인산화 및/또는 당화를 포함하지만 이들에 한정되지 않고, 그리고 여기서 변형된 펩티드의 상대적 수준은 변형되지 않은 펩티드의 상대적 양을 결정할 때와 동일한 방식으로 결정된다.
ii. 소정의 펩티드 또는 자신이 유래되는 단백질의 절대적 정량은 (a) 개별 생물학적 표본에서 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질로부터 소정의 단편 펩티드에 대한 SRM/MRM 서명 피크 구역을 (b) 생물학적 표본으로부터 단백질 용해물 내로 스파이크된 내부 단편 펩티드 표준의 SRM/MRM 서명 피크 구역과 비교함으로써 달성될 수 있다.
내부 표준은 규문되는 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질로부터 단편 펩티드의 표지화된 합성 이형 (또는 단백질분해 시에 방출되는 단편 펩티드의 표지화된 합성 이형을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드)일 수 있다. 표준은 공지된 양에서 표본 내로 스파이크되고, 그리고 SRM/MRM 서명 피크 구역은 개별적으로 생물학적 표본에서 내부 단편 펩티드 표준과 선천적 단편 펩티드 둘 모두에 대해 결정될 수 있고, 그 이후에 양쪽 피크 구역의 비교가 뒤따른다.
이것은 변형되지 않은 단편 펩티드와 변형된 단편 펩티드에 적용될 수 있고, 여기서 변형은 인산화 및/또는 당화를 포함하지만 이들에 한정되지 않고, 그리고 여기서 변형된 펩티드의 절대적 수준은 변형되지 않은 펩티드의 절대적 수준을 결정할 때와 동일한 방식으로 결정될 수 있다.
포르말린 고정된 환자-유래된 또는 개체-유래된 조직의 분석에 기초된, 조직에서 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 수준의 사정은 각 특정 환자 또는 개체에 관한 진단적, 예측적, 그리고 치료적으로-유관한 정보를 제공할 수 있다. 생물학적 표본에서 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 수준을 계측하기 위한 방법이 본원에서 설명되고, 상기 방법은 질량 분광분석법을 이용하여, 상기 생물학적 표본으로부터 제조된 단백질 소화물에서 하나 또는 그 이상의 변형된 또는 변형되지 않은 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드의 양을 검출하고 및/또는 정량하고; 그리고 상기 표본에서 변형된 또는 변형되지 않은 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 수준을 계산하는 것을 포함하고; 그리고 여기서 상기 수준은 상대적 수준 또는 절대적 수준이다. 관련된 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드를 정량하는 것은 공지된 양의 추가된 내부 표준 펩티드에 비해 생물학적 표본에서 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드 각각의 양을 결정하는 것을 포함하고, 여기서 생물학적 표본에서 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드 각각은 동일한 아미노산 서열을 갖는 내부 표준 펩티드와 비교된다. 일부 구체예에서, 내부 표준은 18O, 17O, 34S, 15N, 13C, 2H 또는 이들의 조합에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 무거운 안정성 동위원소를 포함하는 동위원소적으로 표지화된 내부 표준 펩티드이다.
본원에서 설명된 생물학적 표본에서 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 (또는 이들의 대용으로서 단편 펩티드)의 수준을 계측하기 위한 방법은 환자 또는 개체에서 암의 진단적 지표로서 이용될 수 있다. 한 구체예에서, ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 수준의 계측으로부터 결과는 조직에서 발견된 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 수준을 정상적인 및/또는 암성 또는 전암성 조직에서 발견된 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 수준과 상관함으로써 (가령, 비교함으로써) 암의 진단적 시기/등급/상태를 결정하는데 이용될 수 있다.
포르말린 고정된 환자 조직에서 특정한 단백질의 수준을 검출하는데 이용되는 유일한 현재 방법은 면역조직화학 (IHC)이다. 이러한 방법은 환자 종양 조직 표본으로부터 단일 조직 섹션에서 한 번에 단지 한 가지 단백질을 분석한다. 따라서, 복수 단백질을 분석하기 위해, 복수 조직 섹션이 규문되어야 하는데, 이것은 많은 시간과 노동을 소모시킨다. IHC는 표적 단백질의 존재를 검출하기 위해 항체를 이용하고, 그리고 단백질에 대한 항체의 비특이적 결합의 가능성 때문에, 임의의 IHC 실험에서 신호 배경에 대한 높은 내재된 가능성이 있다. 이에 더하여, IHC는 기껏해야 단지 반정량적이다. 이들 문제로 인해, IHC는 복수 단백질의 객관적 정량 분석을 동시에 제공하지 못한다. 본원에서 설명된 방법은 환자 조직 표본의 단일 섹션을 활용하여 100% 검정 특이성에서 ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 객관적 정량을 동시에 제공함으로써, ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 발현에 관한 훨씬 귀중한 데이터를 제공하면서 유의미한 시간과 금전을 절약할 수 있다.
이러한 다중 SRM/MRM 검정은 또한, ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질을 뛰어 넘어, 약물 표적 단백질, 예를 들면, EGFR, IGF-1R, 그리고 cMet를 비롯한 다른 추가 단백질의 동시적 분석을 포함할 수 있다. 이것은 귀중한데, 그 이유는 추가 단백질의 분석이 또한, 어떤 추가 약물이 특정 암을 치료하는데 유용할 수 있는 지를 지시하기 때문이다. 추가 실례 약물 표적 단백질의 분석에 기초된 추가 약물의 실례는 EGFR 수용체를 표적으로 하는 어비툭스, IGF-1R을 표적으로 하는 피지투무맙, 그리고 c-Met와 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR-2)를 표적으로 하는 포레티닙을 포함한다.
핵산과 단백질 둘 모두 동일한 Liquid Tissue™ 생체분자 제조물로부터 분석될 수 있기 때문에, 단백질 분석을 위해 이용된 동일한 표본에서 핵산으로부터 질환 진단과 약물 치료 결정에 관한 추가 정보를 산출하는 것이 가능하다. 가령, ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질이 증가된 수준에서 일정한 세포에 의해 발현되면, SRM에 의해 검정될 때 상기 데이터는 이들 세포의 상태에 관한 정보를 제공할 수 있고, 그리고 통제되지 않은 성장, 잠재적 약제 내성과 암의 발달에 대한 이들의 잠재력이 획득될 수 있다. 이와 동시에, ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 유전자 및/또는 이들이 인코딩하는 핵산과 단백질 (가령, mRNA 분자 및 이들의 발현 수준 또는 스플라이스 변이)의 상태에 관한 정보가 동일한 생체분자 제조물 내에 존재하는 핵산으로부터 획득될 수 있다. 한 구체예에서, ALK, Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 및/또는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상 추가 단백질에 관한 정보는 이들 단백질을 인코딩하는 핵산을 조사함으로써 사정될 수 있다. 이들 핵산은 예로서, 다음 중에서 하나 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 또는 3개 또는 그 이상: 염기서열결정 방법, 중합효소 연쇄 반응 방법, 제한 단편 다형성 분석, 결실 또는 삽입의 확인, 및/또는 단일 염기쌍 다형성, 전이, 변위, 또는 이들의 조합이 포함되지만 이들에 한정되지 않는 돌연변이의 존재의 결정에 의해 조사될 수 있다.
방법과 조성물의 상기 설명과 예시적인 구체예는 본 발명의 범위를 예시한다. 하지만, 당업자에게 명백할 변이로 인해, 본 발명은 앞서 설명된 특정 구체예에 한정되는 것으로 의도되지 않는다.
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Claims (13)

  1. 포르말린 고정된 조직의 인간 생물학적 표본에서 인간 Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 중의 적어도 하나의 수준을 측정하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은 질량 분광분석법을 이용하여 상기 인간 생물학적 표본으로부터 제조된 단백질 소화물(digest)에서 Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드의 양을 검출 및 정량하는 단계; 및 상기 표본에서 Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 수준을 계산하는 단계를 포함하고;
    여기서, 상기 양은 상대적 양 또는 절대적 양인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드의 양을 검출 및 정량하기에 앞서, 상기 단백질 소화물을 분획하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단백질 소화물은 프로테아제 소화물을 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질량 분광분석법은 탠덤 질량 분광분석법, 이온 트랩 질량 분광분석법, 삼중 사중극 질량 분광분석법, MALDI-TOF 질량 분광분석법, MALDI 질량 분광분석법, 및/또는 비행시간 질량 분광분석법을 포함하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드는 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 21, 서열 번호: 22, 서열 번호: 23, 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 서열 번호: 33, 서열 번호: 34, 서열 번호: 35, 서열 번호: 36, 서열 번호: 37, 서열 번호: 38, 또는 서열 번호: 39로서 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드를 정량하는 것은 하나의 생물학적 표본에서 하나 또는 그 이상의 Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드의 양을, 상이한 별개의 생물학적 표본에서 동일한 Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드의 양과 비교하는 것을 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드를 정량하는 것은 공지된 양의 추가된 내부 표준 펩티드와 비교하여 생물학적 표본에서 상기 Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드 각각의 양을 결정하는 것을 포함하고, 여기서 상기 생물학적 표본에서 상기 Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드 각각은 동일한 아미노산 서열을 갖는 내부 표준 펩티드와 비교되는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 내부 표준 펩티드는 동위원소적으로 표지화된 펩티드인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 소화물에서 하나 또는 그 이상의 Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드의 양을 검출 및 정량하는 것은 Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 존재 및 환자 또는 개체에서 폐암을 비롯한 암과의 연관을 지시하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드의 양, 또는 상기 Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 양을 상기 검출 및 정량하는 것의 결과를 폐암을 비롯한 암의 진단적 시기/등급/상태에 상관시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드의 양, 또는 상기 Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 양을 상기 검출 및 정량하는 것의 결과를 암의 진단적 시기/등급/상태에 상관시키는 것은 다중 형식에서 다른 단백질 또는 다른 단백질로부터 펩티드의 양을 검출하고/하거나 정량하여 폐암을 비롯한 암의 진단적 시기/등급/상태에 관한 추가 정보를 제공하는 것과 병용되는, 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 생물학적 표본이 수득된 환자 또는 개체에 치료학적 유효량의 치료제를 투여하기 위한 치료 요법(treatment regimen)을 결정하기 위한 지표(index)를 제공하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 치료제 및/또는 투여되는 치료제의 양은 하나 또는 그 이상의 Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질 단편 펩티드의 양 또는 Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질의 양을 기초로 하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 치료 또는 치료제는 Ros, Ron, Ret, TS, 및/또는 FGFR1 단백질을 발현하는 암 세포를 대상으로 하는, 방법.
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