JPWO2013105363A1 - 細胞の封入方法及び細胞の観察方法 - Google Patents

Abstract

デパートのブースや店舗または化粧品ユーザーの客先において販売員でも簡単に製造することができる位相差顕微鏡観察に用いられる細胞の封入方法、および位相差顕微鏡を用いた細胞の観察方法を提供することを課題とする。位相差顕微鏡での観察に用いるための細胞の封入方法であって、透明粘着テープの粘着層と透明粘着テープの粘着層との間に細胞を配置し、該２つの粘着テープの粘着層で細胞を挟持貼着することを特徴とする、細胞の封入方法。

Description

本発明は、位相差顕微鏡での観察に用いるための細胞の封入方法、および位相差顕微鏡を用いた、新たな細胞の観察方法に関する。

肌の状態に適した化粧料を選択する際に、その適用される肌の特性を知ることは非常に重要なことである。このような肌の特性を知るための方法として、角層細胞を用いる方法が検討されている。角層細胞は採取が容易であり、肌情報を多く有していることから、採取した角層細胞を観察し、得られた情報を化粧料の選択に利用しようとする試みが提案されている（例えば、特許文献１参照）。

特許文献１では、皮膚より採取した角層細胞を色素で染色し、光学顕微鏡によって角層細胞を観察することで、この結果を皮膚バリア機能が良好か否かを鑑別し、化粧料の選択に適用することが記載されている。

光学顕微鏡を用いる場合、細胞のような無色透明な試料を観察するために、染色液を用いる必要があり、特許文献１においてもズダンブラックＢが用いられている。しかしながら、生きたまま試料を観察したい場合には、染色することで試料を殺してしまう場合があり、このような場合には位相差顕微鏡を用いることで、無色透明に近い試料を染色することなく観察が可能となる（非特許文献１参照）。

特開２００７−１５１８９９号公報

"位相差顕微鏡"、科学のつまみ食い［平成２３年８月２６日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.rikagaku.info/microscope9908/microscope07.htm＞

肌状態のカウンセリングやアドバイスを行って化粧品の選択が行われるのは、主にデパートのブースや店舗または化粧品ユーザーの客先であることから、簡便に角層細胞の観察ができることが好ましい。上記位相差顕微鏡を用いると、無色透明な試料を観察することが可能となり、染色液を使用する必要がなくなることから、簡便な角層細胞の観察には好ましい方法である。

一方、位相差顕微鏡を用いて角層などの各種細胞を観察する場合、細胞を封入することなくそのまま観察すると、観察像上の物体の周辺に「ハロー」と呼ばれる光輪が現れる。そのため、位相差顕微鏡を用いて細胞を観察する場合には、液体の封入剤及びカバーガラスにより細胞を封入する必要がある。このような封入作業は、実際に肌の角層細胞を観察し、その結果に基づいて化粧料を選択するデパートのブースや店舗または化粧品ユーザーの客先では手間がかかり、また、カバーガラスが薄く割れやすいなど作業の難易度も高い。本発明はこのような状況下行われたものであり、デパートのブースや店舗または化粧品ユーザーの客先において販売員でも簡単に取り扱うことができる細胞の封入方法、および位相差顕微鏡を用いた細胞の観察方法を提供するものである。

本発明者らは、上記課題を解決すべく簡単な封入法を求め鋭意研究を行ったところ、粘着層を有する粘着テープを用い、該粘着テープにより両側から細胞を挟持貼着するという簡便な方法を採用することで問題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。

即ち本発明は以下のとおりである。
（１）位相差顕微鏡での観察に用いるための細胞の封入方法であって、
透明粘着テープの粘着層と透明粘着テープの粘着層との間に細胞を配置し、該２つの粘着テープの粘着層で細胞を挟持貼着することを特徴とする、細胞の封入方法。
（２）前記透明粘着テープは、光の直線透過率が８０％以上である、（１）に記載の細胞の封入方法。
（３）前記透明粘着テープの光屈折率と前記細胞の光屈折率との差が０．０３以上である、（１）または（２）に記載の細胞の封入方法。
（４）前記２つの透明粘着テープの間に気泡を有しない、（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞の封入方法。
（５）前記細胞が角層細胞である（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞の封入方法。
（６）位相差顕微鏡を用いた細胞の観察方法であって、
細胞が粘着層に貼着した透明粘着テープを準備する工程、
前記細胞が貼着した透明粘着テープの粘着層と、別の透明粘着テープの粘着層とを貼着し、細胞が封入された透明粘着テープ積層体を準備する工程、および
前記工程で準備した積層体を位相差顕微鏡で観察する工程、
を含む、位相差顕微鏡を用いた細胞の観察方法。
（７）フィルム層と粘着層からなる透明粘着テープを、互いの粘着層が対向するように貼着した透明粘着テープ積層体であって、粘着層と粘着層との間に細胞が封入された透明粘着テープ積層体。
（８）位相差顕微鏡の観察に用いられる、（７）に記載の透明粘着テープ積層体。

本発明の細胞の封入方法により、細胞が封入された粘着テープ積層体を簡便に作成することが可能となり、専門的なスキルを有しなくても、デパートのブースや店舗または化粧品ユーザーの客先で販売員が簡単に角層細胞などを観察することができる。また、本発明の細胞を封入した粘着テープ積層体は、位相差顕微鏡を用いて観察した際にハローが発生せず、角層細胞を観察する場合には十分に角層細胞内のメラニン、核、配列規則性などの観察ができるため、簡便かつ即時に角層細胞からの情報を得ることが可能となる。

本発明の細胞が封入された透明粘着テープ積層体の断面模式図である。 本発明の細胞の製造に用いる部材の例を示す。 本発明の位相差顕微鏡を用いた細胞の観察方法の工程の一例を示す概念図である。 本発明の実施例１において、位相差顕微鏡で角層細胞を観察した結果の写真である（図面代用写真）。 本発明の参考例において、位相差顕微鏡で角層細胞を観察した結果の写真である（図面代用写真）。

本発明の第一の態様は、位相差顕微鏡での観察に用いるための細胞の封入方法である。本発明の封入方法は、位相差顕微鏡で細胞を観察することを可能とするため、透明粘着テープの粘着層と透明粘着テープの粘着層との間に細胞を配置し、該２つの粘着テープの粘着層で挟持貼着するものである。本発明で観察する細胞は特に限定されるものではないが、特に角層細胞、角化細胞（ケラチノサイト）、線維芽細胞などの皮膚の状態を評価するために使用する細胞が好ましく例示される。以下、角層細胞を例に挙げて説明をする。

角層細胞は、角層を構成する厚さ１μｍ程度の扁平な細胞であり、肌情報を多く有していることから、角層細胞を評価することで化粧料の選択の際に考慮すべき肌の特性を知ることが可能となる。角層細胞内には主要な成分であるケラチンが繊維を形成して充満し、きわめて強固な細胞構造を構築しており、外界のさまざまな刺激から皮膚内部を守っている。しかしながら角層最外層においては、角層細胞同士の接着力が減弱するため容易に採取が可能となる。本発明では、既に人から取得した角層細胞を使用するため、人から角層細胞を採取する工程は本発明の範囲には含まれない。

本発明は位相差顕微鏡での観察に用いるための細胞の封入方法である。位相差顕微鏡は、光線の位相差をコントラストに変換して観察できる光学顕微鏡であり、標本を無染色・非侵襲的に観察することができるものである。

本発明は、細胞を封入するために透明粘着テープを用いることを特徴とするものである。本発明で透明とは、光を透過することが可能であり、先のものが見えるものを意味し、位相差顕微鏡にて対象が観察されるかぎりその程度や着色については何ら限定されるものではない。光の直線透過率が８０％以上であるものが好ましく、９０％以上であるものがより好ましい。また、透明粘着テープは光学特性の濁度ＨＡＺＥが１．５％未満であるものが好ましく、１．０％未満であるものがより好ましい。また、無色であることが好ましい。なお、濁度ＨＡＺＥ（曇度）とは、物体の曇りの度合いを示す値（％）で、数値が小さいほど透明粘着テープに曇りが無く透明性が高いことを示す。（濁度ＨＡＺＥ（％）＝Tｄ／Tｔ × 100（Td：拡散透過率 Tt：全光線透過率）また、「光の直線透過率（平行透過率）」及び「濁度ＨＡＺＥ（曇度）」は、日本工業規格ＪＩＳＫ７１３６（国際標準化機構規格ＩＳＯ１４７８２）、ＪＩＳＫ７３６１（国際標準化機構規格ＩＳＯ１３４６８）に基づいて測定される値を表し、例えば日本電色工業株式会社製ＨＡＳＥ ＭＥＴＥＲ ＮＤＨ５００を用いて測定することができる。但し、「光の直線透過率」及び「濁度ＨＡＺＥ」は、透明粘着テープの断面方向について測定した値を表すものとする。

本発明に用いる粘着テープは、透明なフィルム層および粘着層からなる、一般的な粘着テープを用いることができ、市販されているものを用いることができる。具体的にはＳｃｏｔｃｈ（登録商標）透明美色（３Ｍ社製）、Ｓｃｏｔｃｈ（登録商標）３１３（３Ｍ社製）、Ｓｃｏｔｃｈ（登録商標）３４５０（３Ｍ社製）、Ｓｃｏｔｃｈ（登録商標）ＰＲＯ（３Ｍ社製）、ダイアハロー（登録商標）（三菱樹脂社製）、セロテープ（登録商標）（ニチバン社製）、ダンプロン（登録商標）（日東電工社製）、セキスイオリエン・セキスイカットロン・セキスイタフライト・セキスイエバーセル・セキスイシュープリーム（登録商標）（積水化学社製）、などが挙げられる。
これらのうち、位相差顕微鏡の特性を考慮すると、細胞の屈折率と異なる屈折率を有する粘着テープを用いることが好ましく、より好ましくは、粘着テープの屈折率と細胞の屈折率との差が０．０３以上である粘着テープを用いることが好ましい。屈折率の上限は特段限定されないが、通常０．６０以下である。なお、角層細胞の屈折率は、１．５５である。

粘着テープのフィルム層の材質は、上記透明である要件を満たせば特段限定されず、また、粘着層の材質についても特段限定はされない。フィルム層の材質は、一般的にはポリエチレン、ポリプロピレン、セロハン（化学名：セルロース）、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）、ポリオレフィン、などが用いられ、粘着層の材質は、一般的はアクリル系コポリマー、オレフィン系コポリマー、ウレタン系コポリマー、エポキシ系コポリマー、合成ゴム、天然ゴムなどが用いられる。また、粘着テープの厚さについても特段限定されず、位相差顕微鏡で観察可能であればよい。

本発明の封入方法では、２つの粘着テープの粘着層の間に細胞を配置し、そして２つの粘着テープの粘着層で細胞を挟持貼着することを特徴とする。このように、粘着テープの間に細胞を挟持し貼着することで、液体の封入剤及びカバーガラスを用いなくとも、ハローが発生することなく、位相差顕微鏡による細胞の観察が可能となる。

本発明の封入方法では、２つの粘着テープの粘着層の間に、気泡を有しないことが好ましい。粘着層の間に気泡が入る場合には、その気泡の位置によっては、気泡（空気）による屈折率の変化によりハローが生じる場合がある。

本発明の封入方法により細胞が封入された透明粘着テープ積層体は、本発明の第二の態様である。すなわち、本発明の第二の態様は、フィルム層と粘着層からなる透明粘着テープを、互いの粘着層が対向するように貼着した透明粘着テープ積層体であって、粘着層と粘着層との間に細胞が封入された透明粘着テープ積層体である。

また、本発明の第三の態様は、位相差顕微鏡を用いた細胞の観察方法であって、細胞が粘着層に貼着した透明粘着テープを準備する工程、前記細胞が貼着した透明粘着テープの粘着層と、別の透明粘着テープの粘着層とを貼着し、細胞が封入された透明粘着テープ積層体を準備する工程、および、前記工程で準備した積層体を位相差顕微鏡で観察する工程、を含む、位相差顕微鏡を用いた細胞の観察方法。
以下、図を用いてこれら本発明の第一の態様乃至は第三の態様を説明する。

図１は、本発明の第二の態様を示す、細胞を封入した透明粘着テープ積層体の断面模式図である。なお、封入した細胞は角層細胞である。
本発明の透明粘着テープ積層体１は、粘着テープ２と粘着テープ３の互いの粘着層６が対向するように貼着されている。そして、粘着層６と粘着層６との間に、角層細胞４が封入されたものである。本発明の透明粘着テープ積層体１の製造方法、および本発明の透明粘着テープ積層体１による、位相差顕微鏡を用いた角層細胞の観察方法を、図３を用いて説明する。

図３は、位相差顕微鏡を用いた角層細胞の観察方法の工程の一例を示す概念図である。まず、本発明では、角層細胞が粘着層に貼着した透明粘着テープを準備する。角層細胞が貼着した透明粘着テープはどのような方法によって準備してもよいが、図２に示すテープストリップキット７を用いると簡便である。図２のテープストリップキットはプラスチック材質の板からなり、中央部に採取孔を有する。採取孔は図面奥側から粘着テープが貼られており、採取孔部分は粘着テープ２の粘着層が露出している。そのため、テープストリップキット７の採取孔を人の皮膚に押し当てることで、簡単に角層細胞が採取可能である。

図３の（ａ）に示すように、人のホホなどにテープストリップキット７を押し当てることにより、角層細胞が粘着層に貼着した透明粘着テープを準備する。なお、テープストリップキット７を人のホホに押し当てる工程は、本発明には含まれない。

次に、角層細胞が貼着した透明粘着テープの粘着層と、別の透明粘着テープの粘着層とを貼着し、角層細胞が封入された透明貼着テープ積層体を準備する。角層細胞４を粘着層に貼着した透明粘着テープは、図３の（ｂ）に示すように、その粘着層と別の粘着テープ３の粘着層を対向させ、粘着層同士を貼着することで、存在する角層細胞４を封入する。この際、気泡が入らないように封入することが好ましい。このようにして、本発明の第二の態様である、透明粘着テープ積層体１を製造することができる。

次に、図３の（ｃ）に示すように、準備した積層体を位相差顕微鏡で観察する。本発明の透明粘着テープ積層体１を位相差顕微鏡９で観察すると、封入液やカバーガラスを使用しなくても、簡便な方法で角層細胞が観察可能となる。

以下、実施例と比較例を挙げて、本発明を更に詳細に説明するが、以下の実施例に示す具体的な形態にのみ限定的に解釈されることはない。

＜実施例１＞
図２に示すテープストリッピングキット（プラスチックの板状部材）を用いて、被験者の頬部より角層細胞を採取した。図２に示すテープストリッピングキットに用いた粘着テープは、ダイアハローテープ（三菱樹脂社製）であり、屈折率が1.48〜1.50であり、光の直線透過率は92.374%、濁度ＨＡＺＥは0.55%であった。なお、光の直線透過率（平行透過率）及び濁度ＨＡＺＥは、日本電色工業株式会社製ＨＡＳＥ ＭＥＴＥＲ ＮＤＨ５００を使用し、ダイアハローテープの断面方向を５回測定して得られた平均値である。
採取した角層細胞は、同じ粘着テープを用いて、粘着層と粘着層を対向させて貼着して角層細胞を封入し、粘着テープ積層体１を作製した。この際、目視により確認したところ、空気の気泡の混入はなかった。

粘着テープ積層体１を位相差顕微鏡に設置し、角層細胞を観察したところ、ハローの発生もなく、はっきりと角層細胞が観察できた。角層細胞の観察写真を図４に示す。

＜実施例２＞
粘着テープを３Ｍ社製のＳｃｏｔｃｈ透明美色に変更した以外は実施例１と同様にして、位相差顕微鏡で角層細胞を観察したところ、ハローの発生もなく、はっきりと角層細胞が観察できた。なお、３Ｍ社製Ｓｃｏｔｃｈ透明美色の光の直線透過率は91.882％、濁度ＨＡＺＥは0.82%であった。

＜実施例３＞
粘着テープをニチバン社製のセロテープに変更した以外は実施例１と同様にして、位相差顕微鏡で角層細胞を観察したところ、ハローの発生もなく、はっきりと角層細胞が観察できた。なお、ニチバン社製のセロテープの光の直線透過率は89.608％、濁度ＨＡＺＥは2.31%であった。

＜実施例４＞
粘着テープを３Ｍ社製のＳｃｏｔｃｈ３１３に変更した以外は実施例１と同様にして、位相差顕微鏡で角層細胞を観察したところ、ハローの発生もなく、はっきりと角層細胞が観察できた。なお、３Ｍ社製Ｓｃｏｔｃｈ３１３の光の直線透過率は92.30%、濁度ＨＡＺＥは0.88%であった。

＜実施例５＞
粘着テープを３Ｍ社製のＳｃｏｔｃｈ３４５０に変更した以外は実施例１と同様にして、位相差顕微鏡で角層細胞を観察したところ、ハローの発生もなく、はっきりと角層細胞が観察できた。なお、３Ｍ社製Ｓｃｏｔｃｈ３４５０の光の直線透過率は91.76%、濁度ＨＡＺＥは1.29%であった。

＜実施例６＞
粘着テープを積水化学社製の透明包装用テープＰ８３Ｔに変更した以外は実施例１と同様にして、位相差顕微鏡で角層細胞を観察したところ、ハローの発生もなく、はっきりと角層細胞が観察できた。なお、積水化学社製透明包装用テープＰ８３Ｔの光の直線透過率は92.45%、濁度ＨＡＺＥは0.48%であった。

＜参考例＞
位相差顕微鏡観察で通常行われている方法である方法で角層細胞の観察を行った。図２に示すテープストリッピングキットを用いて角層細胞を採取した後、液体の封入剤を採取孔に一滴落とし、カバーガラスを用いて封入した。角層細胞の観察写真を図５に示す。
本発明の粘着テープを用いた簡易的な方法でも、従来位相差顕微鏡観察で行われていた方法と同様に、はっきりと角層細胞が観察できた。

産業上利用可能性

本発明の封入方法、観察方法、粘着テープ積層体は、デパートのブースや店舗または化粧品ユーザーの客先において化粧料を選択する際に、販売員でも容易に角層細胞を観察することが可能となり、この観察結果に基づいて適切な化粧料を選択し、販売することができる。

１ 透明粘着テープ積層体
２、３ 粘着テープ
４ 角層細胞
５ フィルム層
６ 粘着層
７ テープストリップキット
８ 顔
９ 位相差顕微鏡

Claims (8)

1. 位相差顕微鏡での観察に用いるための細胞の封入方法であって、
   透明粘着テープの粘着層と透明粘着テープの粘着層との間に細胞を配置し、該２つの粘着テープの粘着層で細胞を挟持貼着することを特徴とする、細胞の封入方法。
2. 前記透明粘着テープは、光の直線透過率が８０％以上である、請求項１に記載の細胞の封入方法。
3. 前記透明粘着テープの光屈折率と前記細胞の光屈折率との差が０．０３以上である、請求項１または２に記載の細胞の封入方法。
4. 前記２つの透明粘着テープの間に気泡を有しないことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞の封入方法。
5. 前記細胞が角層細胞である請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞の封入方法。
6. 位相差顕微鏡を用いた細胞の観察方法であって、
   細胞が粘着層に貼着した透明粘着テープを準備する工程、
   前記細胞が貼着した透明粘着テープの粘着層と、別の透明粘着テープの粘着層とを貼着し、細胞が封入された透明貼着テープ積層体を準備する工程、および
   前記工程で準備した積層体を位相差顕微鏡で観察する工程、
   を含む、位相差顕微鏡を用いた細胞の観察方法。
7. フィルム層と粘着層からなる透明粘着テープを、互いの粘着層が対向するように貼着した透明粘着テープ積層体であって、粘着層と粘着層との間に細胞が封入された透明粘着テープ積層体。
8. 位相差顕微鏡の観察に用いられる、請求項７に記載の透明粘着テープ積層体。

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