JPWO2013084371A1

JPWO2013084371A1 - ヒト心筋由来トロポニンｉに特異的にかつ速やかに結合できる組み換えタンパク質

Info

Publication number: JPWO2013084371A1
Application number: JP2013548052A
Authority: JP
Inventors: 淳福永
Original assignee: Panasonic Corp; Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp; Panasonic Holdings Corp
Priority date: 2011-12-06
Filing date: 2012-03-05
Publication date: 2015-04-27
Anticipated expiration: 2032-03-05
Also published as: JP5528643B2; WO2013084371A1

Abstract

本発明は、ヒト心筋由来トロポニンＩに特異的かつ速やかに結合できる組み換えタンパク質を提供する。本発明は、ヒト心筋由来のトロポニンＩに特異的に結合する組み換えタンパク質であって、以下を具備する：配列番号：６３によって表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、および配列番号：６５によって表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域。

Description

本発明は、ヒト心筋由来トロポニンＩに特異的にかつ速やかに結合できる組み換えタンパク質に関する。

非特許文献１および非特許文献２は、心筋由来トロポニンＩの濃度が、急性心筋梗塞に罹患した患者の血液中で急速に高くなることを開示している。

Aleksei G. Katrukha et. al., "Troponin I is released in bloodstream of patients with acute myocardial infarction not in free form but as complex", Clinical Chemistry, Vol. 43, Issue 8, p.p. 1379-1385 (1997) Till Keller et. al.,."Sensitive Troponin I Assay in Early Diagnosis of Acute Myocardinal Infarction", The NEW ENGLAND JOURNAL of MEDICINE, Vol. 361, pages 868-877 (2009)

本発明の目的は、ヒト心筋由来トロポニンＩに特異的かつ速やかに結合できる組み換えタンパク質を提供することである。

本発明は、ヒト心筋由来のトロポニンＩに特異的に結合する組み換えタンパク質であって、以下を具備する：
配列番号：６３によって表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、および
配列番号：６５によって表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域。

前記組み換えタンパク質が抗体であり得る。
前記組み換えタンパク質が抗体フラグメントであり得る。
前記抗体フラグメントがＦａｂ抗体フラグメントであり得る。
前記抗体フラグメントがＦ（ａｂ’）_２抗体フラグメントであり得る。
前記抗体フラグメントがｓｃＦｖ抗体フラグメントであり得る。

本発明は、組み換えタンパク質をヒト心筋由来のトロポニンＩに特異的に結合させる方法であって、以下の工程を具備する：
前記組み換えタンパク質を用意する工程（ａ）、ここで
前記組み換えタンパク質は以下を具備する：
配列番号：６３によって表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、および
配列番号：６５によって表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
前記組み換えタンパク質に前記ヒト心筋由来のトロポニンＩを接触させ、前記組み換えタンパク質を前記ヒト心筋由来のトロポニンＩに特異的に結合させる工程（ｂ）。
好ましくは、前記方法において、工程（ｂ）は、インビトロにて行う。

前記組み換えタンパク質が抗体であり得る。
前記組み換えタンパク質が抗体フラグメントであり得る。
前記抗体フラグメントがＦａｂ抗体フラグメントであり得る。
前記抗体フラグメントがＦ（ａｂ’）_２抗体フラグメントであり得る。
前記抗体フラグメントがｓｃＦｖ抗体フラグメントであり得る。

本発明は、ヒト心筋由来トロポニンＩに特異的かつ速やかに結合できる組み換えタンパク質を提供する。
本発明の組み換えタンパク質および方法は、急性心筋梗塞の早期検出に利用できる。

図１は抗体を示す。図２は、工程（ｃ−２）におけるＰＣＲ法を示す。

以下、本発明の実施形態が説明される。

（用語の説明）
まず、本明細書において用いられる用語が説明される。
図１は、抗体を示す。広く知られているように、抗体１は「Ｙ」文字の形状を有する。抗体１は２つのＦａｂ領域および１つのＦｃ領域からなる。抗体１は、２本の重鎖２および２本の軽鎖３からなる。各重鎖２は、重鎖定常領域１（参照符号：２２）、重鎖定常領域２（参照符号：２３）、重鎖定常領域３（参照符号：２４）、および重鎖可変領域２１からなる。各軽鎖３は、軽鎖可変領域３１および軽鎖定常領域３２からなる。

各Ｆａｂ領域は、１つの重鎖可変領域２１、１つの重鎖定常領域１（参照符号：２２）、１つの軽鎖可変領域３１、および１つの軽鎖定常領域３２からなる。軽鎖３はリンカ４により重鎖２に連結されている。重鎖２は先端に１つの重鎖可変領域２１を有している。軽鎖３は先端に１つの軽鎖可変領域３１を有している。抗体１には抗原が特異的に結合する。より詳細には、抗原は重鎖可変領域２１および軽鎖可変領域３１からなるＦｖ領域に特異的に結合する。本明細書においては、抗原はヒト心筋由来のトロポニンＩである。

本実施形態に係る組み換えタンパク質は、配列番号：６３によって表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域３１および配列番号：６５によって表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域２１を具備する。本組み換えタンパク質は、ヒト心筋由来のトロポニンＩに特異的にかつ速やかに結合する。

本組み換えタンパク質は、抗体または抗体フラグメントのいずれかである。

抗体は、図１に示される「Ｙ」文字状の形状を有する。本発明の抗体に含まれる軽鎖可変領域３１および重鎖可変領域２１は、それぞれ、配列番号６３および配列番号６５によって表されるアミノ酸配列からなる。抗体において、軽鎖可変領域３１は重鎖可変領域２１にリンカ（図示せず）を介して連結している。

抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２抗体フラグメント、またはｓｃＦｖ抗体フラグメントである。

Ｆａｂ抗体フラグメントは、１つのＦａｂ領域からなる。言い換えれば、Ｆａｂ抗体フラグメントは、１つの軽鎖可変領域３１（配列番号：６３）、１つの重鎖可変領域２１（配列番号：６５）、１つの軽鎖定常領域３２、１つの重鎖定常領域１（参照符号：２２）、およびリンカ４からなる。軽鎖定常領域３２は、リンカ４を介して重鎖定常領域１（参照番号：２２）に連結している。

Ｆ（ａｂ’）_２抗体フラグメントは、２つのＦａｂ領域からなる。上記の通り、各Ｆａｂ領域は、１つの軽鎖可変領域３１（配列番号：６３）、１つの重鎖可変領域２１（配列番号：６５）、１つの軽鎖定常領域３２、１つの重鎖定常領域１（参照符号：２２）、およびリンカ４からなる。これらの２つのＦａｂ領域は、他のリンカ（図示せず）を介して互いに連結されている。好ましくは、一方の重鎖定常領域１（参照番号：２２）が、他のリンカ（図示せず）を介して他方の重鎖定常領域１（参照番号：２２）に連結している。

ｓｃＦｖ抗体フラグメントは、軽鎖可変領域３１（配列番号：６３）、重鎖可変領域２１（配列番号：６５）、およびリンカからなる。軽鎖可変領域３１（配列番号：６３）は、リンカ（図示せず）を介して重鎖可変領域２１（配列番号：６５）に連結している。

組み換えタンパク質がヒト心筋由来トロポニンＩに特異的かつ速やかに結合できる限り、軽鎖可変領域３１（配列番号：６３）と重鎖可変領域２１（配列番号：６５）を連結するリンカは特に限定されない。リンカの例は５〜２０のアミノ酸からなるペプチドである。より具体的には、リンカの例は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：６４）により表されるアミノ酸配列からなるペプチドである。リンカの他の例は、ジスルフィド結合（−硫黄原子（Ｓ）−硫黄原子（Ｓ）−）である。

組み換えタンパク質がヒト心筋由来トロポニンＩに特異的かつ速やかに結合できる限り、軽鎖可変領域３１（配列番号：６３）のＮ末端はアミノ酸配列によって修飾され得る。Ｃ末端もまた、修飾され得る。

組み換えタンパク質がヒト心筋由来トロポニンＩに特異的かつ速やかに結合できる限り、重鎖可変領域２１（配列番号：６５）のＮ末端はアミノ酸配列によって修飾され得る。Ｃ末端もまた、修飾され得る。重鎖可変領域２１（配列番号：６５）のＣ末端を修飾するアミノ酸配列の例は、ＡＡＡＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号：６６）である。

本組み換えタンパク質はヒト心筋由来トロポニンＩに接触されると、ヒト心筋由来トロポニンＩに特異的にかつ速やかに結合する。より具体的には、本組み換えタンパク質がヒト心筋由来トロポニンＩと混合されると、本組み換えタンパク質はヒト心筋由来トロポニンＩに特異的にかつ速やかに結合する。
本組み換えタンパク質とヒト心筋由来トロポニンＩとの結合の検出は、当業者に周知の抗原抗体結合の検出方法によって行うことができる。かかる検出方法の例としては、サンドウィッチ法が挙げられる。

本組み換えタンパク質は、一般的なタンパク質発現技術を用いて産生され得る。より具体的には、まず、本組み換えタンパク質をコードする遺伝子配列を具備するベクターを用意する。ベクターの例は、プラスミドである。次に、このベクターを用いて細胞（例えば、大腸菌）が形質転換される。この細胞は培養され、本組み換えタンパク質を産生する。

ｓｃＦｖ抗体フラグメントを効率的に得るためには、本組み換えタンパク質は、リフォールディング法により産生されることが好ましい。非特許文献３は、リフォールディング法を開示している。

［非特許文献３］Jun Kamishikiryo et. al., ”Molecular Basis for LLT1 Protein Recognition by Human CD161 Protein (NKRP1A/KLRB1)”, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, VOL. 286, NO. 27, p.p. 23823-23830.

以下、本実施形態を裏付ける実施例が説明される。

（実施例１）
表１、表２、表３、および表４は、実施例１において用いられたプライマーを示す。
表１は、軽鎖可変領域を増幅させるためのフォワードミックスプライマー（プライマー１〜２１、配列番号：０２〜配列番号：２２）を示す。
表２は、重鎖可変領域を増幅させるためのフォワードミックスプライマー（プライマー２２〜４４、配列番号：２３〜配列番号：４５）を示す。
表３は、軽鎖可変領域を増幅させるためのリバースミックスプライマー（プライマー４５〜４９、配列番号：４６〜配列番号：５０）を示す。
表４は、重鎖可変領域を増幅させるためのリバースミックスプライマー（プライマー５０〜５５、配列番号：５１〜配列番号：５６）を示す。

工程（ａ−１）ヒト心筋由来トロポニンＩに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生可能なハイブリドーマ（マウス脾臓由来）の調製
ヒト心筋由来のトロポニンＩに含有されるアミノ酸配列を有するペプチド（配列番号：０１、シグマアルドリッチジャパン株式会社から購入、RPAPAPIRRRSSNYRAYATEPHAKKKSKISASRKLQLKTLLLQIAK）が、sulfo-SMCCクロスリンカー（サーボフィッシャーサイエンティフィック株式会社より購入）を用いて、ヒト血清アルブミン（シグマ・アルドリッチから購入）に連結された。

より具体的には、sulfo-SMCCクロスリンカー（０．５ｍｇ）が、１００マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水に溶解され、第１水溶液を得た。この第１水溶液は、５０℃の温度下で１０分、放置された。

ヒト血清アルブミン（１０ｍｇ）が１ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水に溶解され、第２水溶液を得た。

第１水溶液は第２水溶液と混合され、混合物を得た。混合物は、３０分間、静置された。このようにして、sulfo-SMCCクロスリンカーがヒト血清アルブミンに結合された。

混合物は、カラム（ＧＥヘルスケアより商品名：ＰＤ１０として入手）に通され、未反応のsulfo-SMCCクロスリンカーを除去した。

上記ペプチド（配列番号：０１、１．５ｍｇ）がジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯという）により溶解され、ＤＭＳＯ溶液を得た。２ｍｇ／ｍｌの濃度を有する混合物（１ｍＬ）にＤＭＳＯ溶液（１００マイクロリットル）が添加された。その後、一晩、混合物は放置され、sulfo-SMCCクロスリンカーがペプチド（配列番号：０１）に結合された。

このようにして、トロポニンＩに含まれるアミノ酸配列を有するペプチド（配列番号：０１）により修飾されたヒト血清アルブミンが得られた。以下、このヒト血清アルブミンは「トロポニン修飾ＨＳＡ」という。

完全フロイトアジュバント（和光純薬工業株式会社から購入）およびトロポニン修飾ＨＳＡが混合され、混合物を得た。この混合物をＢＡＬＢ／ｃマウスに注入した。ＢＡＬＢ／ｃマウスとは、アルビノマウスの一種である。

２週間後、リン酸緩衝生理食塩水（以下、「ＰＢＳ」という）およびトロポニン修飾ＨＳＡの混合物がＢＡＬＢ／ｃマウスに注入された。これをもう一度繰り返した。このようにして、１ヶ月かけて、ＢＡＬＢ／ｃマウスはトロポニン修飾ＨＳＡにより免疫された。言い換えれば、上記混合物をＢＡＬＢ／Ｃマウスに与えることによって、ＢＡＬＢ／ｃマウスの体内において、トロポニン修飾ＨＳＡに対する抗体が産生された。

免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓が摘出された。非特許文献４に記載された細胞融合法に従って、ハイブリドーマを得た。その後、ハイブリドーマは培養液中で培養された。培養の後のハイブリドーマ（細胞）の数は、およそ５×１０^６であった。このようにして得られたハイブリドーマは、ヒト心筋由来トロポニンＩに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生可能であった。

［非特許文献４］
G.Kohler et al., Nature, 256, 495(1975)

工程（ａ−２）ハイブリドーマ細胞からの全マウスＲＮＡの抽出
培養されたハイブリドーマの細胞膜を破壊するために、１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン株式会社より入手）が、ハイブリドーマを含有する培養液に添加され、そして充分に培養液は攪拌された。

次に、０．２ｍＬの体積を有するクロロホルム液（純度：９９．９％）が培養液に添加され、そして再度、充分に培養液は攪拌された。

培養液は、１１７６００ｍ／ｓ^２の重力加速度で、４℃の温度下、１５分間、遠心分離に供された。上清（５００μＬ）が取得された。得られた上清にイソプロパノール（５００μＬ）を添加し、室温下で１０分間、静置された。

培養液は、再度、上記の条件と同一の条件を有する遠心分離に供され、沈殿物を得た。得られた沈殿物に７５％エタノール水溶液（１ｍＬ）を添加し、エタノール溶液を得た。

エタノール溶液は、７３５００ｍ／ｓ^２の重力加速度で、５分間、遠心分離に供された。沈殿物は、乾燥された。このようにして、全マウスＲＮＡが得られた。

工程（ｂ−１）全マウスＲＮＡからのｍＲＮＡの抽出
Ｏｌｉｇｏｔｅｘ^ＴＭ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ（タカラバイオ株式会社から購入）を用いて、工程（ａ−２）において得られた全マウスＲＮＡからｍＲＮＡが抽出された。

ＲＮａｓｅフリーの水（１００μＬ）が１本のマイクロチューブに注入された。このマイクロチューブは、ブロックインキュベーター（アステック株式会社より入手）にセットされ、１時間、７０℃に加温された。

全マウスＲＮＡが、ＲＮａｓｅフリーの水（１００μＬ）に溶解された。

キットに含まれている２×バインディング緩衝液（１００μＬ）およびキットに含まれているオリゴテックス（１０μＬ）がＲＮａｓｅフリーの水（１００μＬ）に混合された。その後、混合物は７０℃の温度下で３分間、静置された。さらに室温で１０分間、混合物は静置された。

混合物は、１４７０００ｍ／ｓ^２の重力加速度で、５分間、遠心分離に供された。上清が除去され、キットに含まれているウォッシュ緩衝液（３５０μＬ）に沈殿物が懸濁された。懸濁液は、キットに含まれているカラムに供給された。カラムは、１４７０００ｍ／ｓ^２の重力加速度で、３０秒間、遠心分離に供された。

カラムを洗浄するために、カラムにウォッシュ緩衝液（３５０μＬ）が供給された。再度、カラムは、１４７０００ｍ／ｓ^２の重力加速度で、３０秒間、遠心分離に供された。

カラムの底部にサンプル採取用のマイクロチューブが装着された。

カラムに含有されているｍＲＮＡを抽出するために、マイクロチューブに含有されているＲＮａｓｅフリーの水（２０μＬ）がカラムに供給された。その後、カラムは、１４７０００ｍ／ｓ^２の重力加速度で、３分間、遠心分離に供された。再度、ＲＮａｓｅフリーの水（２０μＬ）がカラムに供給され、カラムは、１４７０００ｍ／ｓ^２の重力加速度で、３分間、遠心分離に供された。

このようにして、ｍＲＮＡを含有する抽出液がマイクロチューブ内に得られた。

工程（ｂ−２）ｍＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写
得られた抽出液に含まれるｍＲＮＡが、逆転写酵素（商品名：Ｐｒｉｍｅｒｓｒｉｐｔ、タカラバイオ株式会社から購入）を用いて逆転写され、ｃＤＮＡを含む溶液を得た。

工程（ｂ−３−１）ｃＤＮＡを用いた、軽鎖可変領域をコードする遺伝子の増幅
溶液に含まれるｃＤＮＡ、フォワードプライマー１〜２１（配列番号：０２〜２２）、およびリバースプライマー１〜５（配列番号：２３〜２７）を用いるＰＣＲ法により、上記モノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子断片（配列番号：５８、以下、「ＶＬ遺伝子断片」という）が増幅された。このＰＣＲ法において用いられるポリメラーゼは、商品名：ＴａＫａＲａＥｘＴａｑＨｏｔｓｔａｒｔＶｅｒｓｉｏｎとしてタカラバイオ株式会社から購入された。

このＰＣＲ法のプロトコールは表５の通り。

サイクル回数：３５回。

最後に溶液は６８℃で４分間放置された。このようにして、ＰＣＲ溶液が得られた。このＰＣＲ溶液は、増幅されたＶＬ遺伝子断片（配列番号：５８）を含有していた。

増幅されたＶＬ遺伝子断片の確認および精製のために、得られたＰＣＲ溶液は、２重量％の濃度を有するアガロースを含有するゲルを用いた電気泳動に供された。

工程（ｂ−３−２）ｃＤＮＡを用いた、重鎖可変領域をコードする遺伝子の増幅
溶液に含まれるｃＤＮＡ、フォワードプライマー２２〜４４（配列番号：２８〜５０）、およびリバースプライマー６〜１１（配列番号：５１〜５６）を用いるＰＣＲ法により、上記モノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子断片（配列番号：５７、以下、「ＶＨ遺伝子断片」という）が増幅された。このＰＣＲ法において用いられるポリメラーゼは、商品名：ＴａＫａＲａＥｘＴａｑＨｏｔｓｔａｒｔＶｅｒｓｉｏｎとしてタカラバイオ株式会社から購入された。

このＰＣＲ法のプロトコールは、ＶＬ遺伝子断片のプロトコールと同一であった。

最後に溶液は６８℃で４分間放置された。このようにして、ＰＣＲ溶液が得られた。このＰＣＲ溶液は、増幅されたＶＨ遺伝子断片（配列番号：５７）を含有していた。

ＶＨ遺伝子断片の生成の確認およびＶＨ遺伝子断片の精製のために、得られたＰＣＲ溶液は、２重量％の濃度を有するアガロースを含有するゲルを用いた電気泳動に供された。

工程（ｂ−４）ＶＬ遺伝子断片およびＶＨ遺伝子断片の連結
精製されたＶＨ遺伝子断片（配列番号：５７）は、精製されたＶＬ遺伝子断片（配列番号：５８）にオーバーラップエクステンションＰＣＲ法によって連結された。このようにして、上記モノクローナル抗体のｓｃＦｖ抗体フラグメントをコードする遺伝子断片（配列番号：５９、以下、「ｓｃＦｖ遺伝子断片」という）を得た。得られた遺伝子断片（配列番号：５９）の５’末端および３’末端は、制限酵素サイトＮｃｏ１およびＮｏｔ１によってそれぞれ修飾されていた。

工程（ｃ−１）遺伝子のベクターへの導入
ｓｃＦｖ遺伝子断片は、タンパク質発現用ベクター（商品名：ｐＥＴ２２ｂ（＋）、タカラバイオ株式会社より購入）にライゲーションされた。ライゲーションの詳細は以下に記述される。

最初に、ｓｃＦｖ遺伝子断片は、制限酵素Ｎｃｏ１およびＮｏｔ１（いずれもタカラバイオ株式会社より購入）によって処理された。ｓｃＦｖ遺伝子断片は、電気泳動法により精製され、ｓｃＦｖ遺伝子断片を含有する水溶液を得た。

タンパク質発現用ベクターもまた、制限酵素Ｎｃｏ１およびＮｏｔ１（いずれもタカラバイオ株式会社より購入）によって処理された。タンパク質発現用ベクターも、電気泳動により精製され、タンパク質発現用ベクターを含有する水溶液を得た。

これら２つの水溶液が混合され、混合液を得た。

混合液に、酵素（東洋紡株式会社より商品名：ＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈｖｅｒ．２として購入）が添加され、そして混合液は１６℃の温度下で２時間放置された。このようにして、ｓｃＦｖ遺伝子断片がタンパク質発現用ベクターにライゲーションされた。

このようにしてｓｃＦｖ遺伝子断片がライゲーションされたタンパク質発現用ベクターを用いて、大腸菌（商品名：ＤＨ５αコンピテントセル、タカラバイオ株式会社より入手）が形質転換された。

その後、大腸菌は、１００μｇ／ｍＬの濃度を有するアンピシリンを含有するＬＢプレート培地上で１６時間、インキュベートされた。インキュベートの後、ＬＢプレート培地上に形成されたシングルコロニーがピックアップされた。シングルコロニーは、１００μｇ／ｍＬの濃度を有するアンピシリンを含有するＬＢ液体培地（５ｍＬ）に供給され、そして１６時間インキュベートされた。

タンパク質発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）に含まれる不要な遺伝子配列を除去するために、このＬＢ液体培地からタンパク質発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）がキット（株式会社キアゲンより商品名：ＱＩＡｐｒｅｐｓｐｉｎｍｉｎｉｐｒｅｐｋｉｔとして入手）を用いて抽出された。抽出されたタンパク質発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）、プライマー５６（配列番号：６７）、およびプライマー５７（配列番号：６８）を用いたＰＣＲ法により、タンパク質発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）のシグナル配列（ＤＮＡ配列、配列番号：６０）が除去された。このようにして、野生型ｓｃＦｖ抗体フラグメントをコードする発現ベクターを得た。

工程（ｃ−２）ベクターへの変異の導入
工程（ｃ−１）において得られた発現ベクターは、ｓｃＦｖ遺伝子断片（配列番号：５９）を含む。この発現ベクターに含まれるｓｃＦｖ遺伝子断片（配列番号：５９）からなる７２９塩基のうち、９個の塩基が置換された。より詳細には、１８１番目のチミン（Ｔ）、１８２番目のシトシン（Ｃ）、２０２番目のアデニン（Ａ）、２０３番目のシトシン（Ｃ）、２０８番目のアデニン（Ａ）、２０９番目のグアニン（Ｇ）、２１４番目のチミン（Ｔ）、２１５番目のシトシン（Ｃ）、および２１６番目のアデニン（Ａ）が、それぞれ、Ｇ（グアニン）、Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ａ（アデニン）、およびＴ（チミン）に置換された。

より具体的には、図２に示されるように、プライマー５８（配列番号：６９）、プライマー５９（配列番号：７０）、および工程（ｃ−１）において得られた発現ベクターを用いるＰＣＲ法が実施された。プライマー５８（配列番号：６９）は、置換される９塩基を除き、ｓｃＦｖ遺伝子断片（配列番号：５９）に含まれる１５９番目の塩基から２３４番目の塩基までの遺伝子配列に相補的であった。プライマー５９（配列番号：７０）は、置換される９塩基を除き、ｓｃＦｖ遺伝子断片（配列番号：５９）に相補的な遺伝子断片に含まれる１５９番目の塩基から２３４番目の塩基までの遺伝子配列に相補的であった。図２に示されるＰＣＲ法により、野生型ｓｃＦｖ抗体フラグメントをコードする発現ベクターに含まれる９塩基（ＴＣ、ＡＣ、ＡＧ、ＴＣＡ）が、他の９塩基（ＧＡ、ＧＡ、ＧＡ、ＧＡＴ）に置換された。このようにして、変異型ｓｃＦｖをコードする遺伝子配列（配列番号：７１）を含有する発現ベクターが得られた。

工程（ｃ−３）ベクターを用いた蛋白質の取得
工程（ｃ−２）において得られたベクターを用いて、大腸菌（タカラバイオ株式会社より購入、商品名：ＢＬ２１（ＤＥ３））が形質転換された。その後、この大腸菌は、１００μｇ／ｍＬの濃度を有するアンピシリンを含有するＬＢプレート培地上で３７℃の温度下、１６時間インキュベートされた。

インキュベートの後、ＬＢプレート培地上に形成されたシングルコロニーがピックアップされた。シングルコロニーは、１００μｇ／ｍＬの濃度を有するアンピシリンを含有するＬＢ液体培地（５００ｍＬ）に供給された。その後、６００ナノメートルの波長でのＬＢ液体培地の吸光度が０．５に調整されるように、シングルコロニーに含有される大腸菌が増殖された。

さらに、１Ｍの濃度を有するイソプロピルーβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドの水溶液（０．５ｍＬ）がＬＢ液体培地に添加された。その後、３７℃の温度下で５時間、振盪しながら、大腸菌がインキュベートされた。このようにして、培養液が得られた。

得られた培養液は、４９０００ｍ／ｓ^２の重力加速度、４℃の温度下、５分間、遠心分離に供された。大腸菌を含有する沈殿は、リン酸緩衝生理食塩水（５０ｍＬ）に再度、懸濁された。

懸濁液は超音波処理に供され、大腸菌を破砕した。破砕された大腸菌を含有する溶液は、９８０００ｍ／ｓ^２の重力加速度、４℃の温度下、３０分間、遠心分離に供された。このようにして、沈殿物が得られた。

この沈殿物は、４％の濃度を有する界面活性剤（TritonX-100、和光純薬工業株式会社より入手）を含有するリン酸緩衝生理食塩水を用いて２回、洗浄された。さらに、沈殿物は界面活性剤を含有しないリン酸緩衝生理食塩水を用いて洗浄された。

沈殿物に、表６に示される試薬を含有する水溶液Ａ（１０ｍＬ）が添加された。

水溶液Ａは６のｐＨを有していた。

その後、水溶液Ａは４℃の温度下で１８時間放置された。このようにして、沈殿物は溶解された。

水溶液Ａは、０．４５μｍのメッシュサイズを有するフィルター（Sartoriusより入手、商品名：Minisart）に通され、残渣を除去した。このようにして、濾液を得た。

濾液（１ｍＬ）に、表７に示される試薬を含有する水溶液Ｂ（２ｍＬ）が滴下により添加された。

水溶液Ｂは８．０のｐＨを有していた。このようにして、３ｍＬの容積を有する水溶液を得た。

水溶液（３ｍＬ）は、１リットルの容積を有する水溶液Ｂに滴下により添加された。その後、得られた水溶液は、４℃の温度下で９６時間、攪拌された。このようにして、変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメント（配列番号：６１）が得られた。

その後、濾過ユニット（VIVAFLOW50、Sartoriusより入手）を用いて、溶液は１０ｍＬまで濃縮された。カラム（商品名：HiLoad 26/60 Superdex 75 pg、ＧＥヘルスケア社製）を用いて、溶液に含まれる変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメントが精製された。

変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメントのアミノ酸配列（配列番号：６１）の詳細は以下に記述される。

軽鎖可変領域（配列番号：６３）：
DVVLTQSPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDDGVPDRFDGDGDGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPLTFGAGTKLEIKR
軽鎖可変領域のN末端に修飾されたアミノ酸配列：なし
軽鎖可変領域のＣ末端に修飾されたアミノ酸配列：なし

リンカ（配列番号：６４）：
GGGGSGGGGSGGGGS

重鎖可変領域（配列番号：６５）：
QLQLQQSGAELVRSGASVKLSCTASGFNIKDYYMNWVKQRPEQGLEWIGWIDPANGDTAYAPRFQVKATMTADKSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCNADLPMDQWGQGTSVTVSS
重鎖可変領域のＮ末端に修飾されたアミノ酸配列：なし
重鎖可変領域のＣ末端に修飾されたアミノ酸配列：AAALEHHHHHH（配列番号：６６）

工程（ｄ）結合速度定数および解離速度定数の算出
分子間相互作用解析装置Biacore T100（ＧＥヘルスケア社より購入）を用いて、変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメントの結合速度定数および解離速度定数が、分子間相互作用解析装置Biacore T100に添付されているマニュアルに従って算出された。

およそ５００のＲＵ（Resonance Unit）を有するヒト心筋由来トロポニンＩ（フナコシより購入）がＣＭ５チップ（ＧＥヘルスケア社より購入）上に固定された。このＣＭ５チップはBiacore T100内にセットされた。次に、変異体ｓｃＦｖ抗体フラグメントを含有する水溶液（濃度：１００ｎＭ，５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、および６．２５ｎＭ、容量：１５０マイクロリットル）をBiacore T100内に流した。分子間相互作用解析装置Biacore T100によって測定された結合速度定数および解離速度定数は、表９に示される。

（比較例１）
比較例１では、工程（ｃ−２）が行われなかったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。このようにして、配列番号：６２によって表されるアミノ酸配列からなる野生型ｓｃＦｖ抗体フラグメントを得た。実施例１と同様に、野生型ｓｃＦｖ抗体フラグメントの結合速度定数および解離速度定数が測定された。結果は、表９に示される。

野生型scFv抗体フラグメント（配列番号：６２）および変異型scFv抗体フラグメント（配列番号：６１）の間の相違点は表８に記載される。

表９から明らかなように、実施例１による変異型ｓｃＦｖ抗体フラグメントは、比較例１による野生型ｓｃＦｖ抗体フラグメントよりも高い結合速度定数を有する。これは、変異型ｓｃＦｖ抗体フラグメントは、野生型ｓｃＦｖ抗体フラグメントよりも速やかにヒト心筋由来トロポニンＩに特異的に結合することを意味する。

本発明による方法は、急性心筋梗塞を検出するためのセンサに用いられ得る。

１：抗体
２：重鎖
２１：重鎖可変領域
３：軽鎖
３１：軽鎖可変領域
４：リンカ

Claims

以下を含む、ヒト心筋由来のトロポニンＩに特異的に結合する組み換えタンパク質：
配列番号：６３によって表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、および
配列番号：６５によって表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域。
前記組み換えタンパク質が抗体である、請求項１に記載の組み換えタンパク質。
前記組み換えタンパク質が抗体フラグメントである、請求項１に記載の組み換えタンパク質。
前記抗体フラグメントがＦａｂ抗体フラグメントである、請求項３に記載の組み換えタンパク質。
前記抗体フラグメントがＦ（ａｂ’）_２抗体フラグメントである、請求項３に記載の組み換えタンパク質。
前記抗体フラグメントがｓｃＦｖ抗体フラグメントである、請求項３に記載の組み換えタンパク質。
以下の工程を含む、組み換えタンパク質をヒト心筋由来のトロポニンＩに特異的に結合させる方法：
前記組み換えタンパク質を用意する工程（ａ）、ここで
前記組み換えタンパク質は以下を含む：
配列番号：６３によって表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、および
配列番号：６５によって表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
前記組み換えタンパク質に前記ヒト心筋由来のトロポニンＩを接触させ、前記組み換えタンパク質を前記ヒト心筋由来のトロポニンＩに特異的に結合させる工程（ｂ）。
前記組み換えタンパク質が抗体である、請求項７に記載の方法。
前記組み換えタンパク質が抗体フラグメントである、請求項７に記載の方法。
前記抗体フラグメントがＦａｂ抗体フラグメントである、請求項９に記載の方法。
前記抗体フラグメントがＦ（ａｂ’）_２抗体フラグメントである、請求項９に記載の方法。
前記抗体フラグメントがｓｃＦｖ抗体フラグメントである、請求項９に記載の方法。