JPWO2013051522A1 - 生体細胞凍結保存用具 - Google Patents

Abstract

生体細胞凍結保存用具１は、本体部２３、生体細胞保持部２１とを備える生体細胞保持部材２と、生体細胞保持部材２を収納可能な一端が閉塞した筒状収納部材３とを備える。生体細胞保持部２１は、細長い生体細胞付着保持部２２を備え、生体細胞付着保持部２２は、生体細胞付着保持部の長手方向に延び、かつ、生体細胞付着保持部の先端より突出する熱伝導性体２５，２６を有する。筒状収納部材は、先端部内に収納された熱伝導性部材３２を備える。生体細胞保持部材を熱伝導性体の先端側より、筒状収納部材に挿入したとき、熱伝導性体の先端部２５ａ，２６ａは、筒状収納部材の熱伝導性部材と接触する。

Description

本発明は、哺乳動物の卵子、胚などの卵、精子、造血幹細胞、多能性幹細胞等の幹細胞などの生体細胞を凍結保存する際に使用する生体細胞凍結保存用具に関する。

哺乳動物胚の凍結保存は、特定の系統や品種の遺伝資源の保存を可能とする。また、絶滅の危機に瀕している動物種の維持にも有効である。さらに、ヒトの不妊治療においても有用である。

哺乳動物胚の凍結保存方法としては、特許文献１（特開２０００−１８９１５５公報）において、哺乳動物胚または卵子を滅菌処理した凍結ストロー、凍結バイアルまたは凍結チューブ等の凍結保存用容器の内面に、これらの胚または卵子を包被するに充分な最少量のガラス化液で貼り付け、この凍結保存用容器を密封し、そしてこの容器を液体窒素に接触させて急速に冷却することが提案されている。そして、融解方法では、前記の方法で保存した凍結保存用容器を前記液体窒素から取り出し、容器の一端部を開口し、この容器内に３３〜３９℃の希釈液を直接注入し、胚または卵子の凍結を融解希釈するものである。この方法によれば、哺乳動物胚または卵子をウイルスや細菌による感染のおそれがなく高い生存率で保存および融解希釈することのできるという優れた効果を備えている。
しかし、凍結ストロー、凍結バイアルまたは凍結チューブ等の凍結保存用容器の内面に、胚または卵子などの卵を包被するに充分な最少量のガラス化液で貼り付ける作業が必ずしも容易ではなかった。

特開２０００−１８９１５５ 特開２００４−３２９２０２（ＵＳ公開２００４−０２５９０７２） 特開２００２−３１５５７３（ＷＯ ０２−０８５１１０ Ａ１）

また、本願発明者は、特許文献２（特開２００４−３２９２０２、ＵＳ公開２００４−０２５９０７２）も提案している。特許文献２の卵凍結保存用具１は、耐液体窒素材料で形成された卵凍結保存用チューブ２と、チューブ２を保護するための金属製筒状保護部材３とを備える。チューブ２は、本体部２１と、内径が０．１ｍｍ〜０．５ｍｍの卵保存用細径部２２とを備えるとともに、細径部の先端側にてヒートシール可能であり、本体部２１にてヒートシール可能である。筒状保護部材３は、チューブ２の細径部２２の先端部を収納する筒状部３１と、細径部２２の筒状部３１に収納されない部分および本体部２１の先端部２１ａを収納する半筒状部３２とを備えている。
上述した特許文献１および特許文献２のものでは、チューブ内に卵を収納する操作が必要であり、そのための作業時間を必要とするものであった。

また、本願発明者は、特許文献３（特開２００２−３１５５７３、ＷＯ ０２−０８５１１０ Ａ１）を提案している。特許文献３の卵凍結保存用具１は、耐寒性材料により形成された本体部２と、本体部２の一端に取り付けられ、可撓性かつ透明性かつ液体窒素耐性材料により形成された卵付着保持用ストリップ３と、卵付着保持用ストリップ３を被包可能に本体部２に着脱自在に取り付けられる一端が封鎖され、かつ耐寒性材料により形成された筒状部材４とからなるものである。この特許文献３の卵凍結保存用具は、ストリップ状への卵の載置を行えばよく、チューブ内への卵の収納操作が不要であり、卵凍結操作が容易であるという利点を有している。

しかし、引用文献３のものでは、卵がガラス化のための冷却媒体（具体的には、液体窒素）に接触させなければならない。液体窒素への卵の接触は、卵自体に影響を与えるものではないが、できれば、液体窒素に直接触させないことが望ましい。

本発明の目的は、生体細胞凍結保存具への生体細胞載置操作が容易であり、かつ、生体細胞を冷却媒体に直接接触させることなく生体細胞を凍結させることが可能な生体細胞凍結保存用具を提供するものである。

上記目的を達成するものは、以下のものである。
耐寒性材料により形成された本体部と、耐寒性材料により形成された生体細胞保持部とを備える生体細胞保持部材と、前記生体細胞保持部材を収納可能かつ耐寒性材料により形成された一端が閉塞した筒状収納部材とを備える生体細胞凍結保存用具であって、前記生体細胞保持部材の前記生体細胞保持部は、細長い生体細胞付着保持部を備え、前記生体細胞付着保持部は、前記生体細胞付着保持部の長手方向に延び、かつ、前記生体細胞付着保持部の先端より突出する熱伝導性体を有し、前記筒状収納部材は、先端部に設けられた熱伝導性部材を備え、前記生体細胞保持部材を前記熱伝導性体の先端側より、前記筒状収納部材に挿入したとき、前記熱伝導性体の先端部は、前記筒状収納部材の前記熱伝導性部材と接触可能なものとなっている生体細胞凍結保存用具。

図１は、生体細胞保持部材が筒状収納部材に収納された状態の本発明の実施例の生体細胞凍結保存用具の正面図である。 図１は、生体細胞保持部材が筒状収納部材に収納されていない状態の本発明の実施例の生体細胞凍結保存用具の正面図である。 図３は、図２に示した筒状収納部材の縦断面図である。 図４は、図２に示した生体細胞凍結保持部材の先端側部分の拡大正面図である。 図５は、図４に示した生体細胞凍結保持部材の右側面図である。 図６は、図４のＡ−Ａ線断面図である。 図７は、図４のＢ−Ｂ線断面図である。 図８は、図４に示した生体細胞凍結保持部材の拡大底面図である。 図９は、図４のＣ−Ｃ線にて切断した断面を説明するための説明図である。 図１０は、図２に示した生体細胞凍結保持部材の先端部の拡大正面図である。 図１１は、図１０のＤ−Ｄ線断面図である。 図１２は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存用具に用いられる生体細胞保持部材の先端部の拡大正面図である。 図１３は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存用具に用いられる生体細胞保持部材の先端部の拡大側面図である。 図１４は、図１３に示した生体細胞保持部材の先端部の拡大底面図である。 図１５は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存用具に用いられる生体細胞保持部材の先端部の拡大底面図である。 図１６は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存用具に用いられる生体細胞保持部材の先端側部分の拡大正面図である。 図１７は、図１６に示した生体細胞保持部材の拡大底面図である。 図１８は、図１６のＥ−Ｅ線拡大断面図である。 図１９は、図１６に示した生体細胞保持部材に用いられる平板状の熱伝導性体の正面図である。 図２０は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存用具に用いられる筒状収納部材を説明するための説明図である。 図２１は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存用具の先端部の拡大縦断面図である。 図２２は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存用具の先端部の拡大縦断面図である。 図２３は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存用具に用いられる筒状収納部材の部分省略拡大縦断面図である。 図２４は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存用具に用いられる筒状収納部材の部分省略拡大正面図である。 図２５は、本発明の生体細胞凍結保存用具の作用を説明するための説明図である。

本発明の生体細胞凍結保存用具を図面に示す実施例を用いて説明する。
本発明の生体細胞凍結保存用具１は、耐寒性材料により形成された本体部２３と、耐寒性材料により形成された生体細胞保持部２１とを備える生体細胞保持部材２と、生体細胞保持部材２を収納可能かつ耐寒性材料により形成された一端が閉塞した筒状収納部材３とを備える。生体細胞保持部材２の生体細胞保持部２１は、細長い生体細胞付着保持部２２を備え、生体細胞付着保持部２２は、生体細胞付着保持部の長手方向に延び、かつ、生体細胞付着保持部２２の先端より突出する熱伝導性体２５，２６を有する。筒状収納部材３は、先端部内に収納された熱伝導性部材３２を備える。そして、生体細胞保持部材２１を熱伝導性体２５，２６の先端側より、筒状収納部材３に挿入したとき、熱伝導性体２５，２６の先端部は、筒状収納部材３の熱伝導性部材３２と接触可能なものとなっている。

本発明の生体細胞凍結保存用具１は、生体細胞保持部材２と、生体細胞保持部材２を収納するための筒状収納部材３とからなる。特に、この実施例の細胞凍結保存用具１は、卵凍結保存用具であり、細胞保持部材２は、卵保持部材となっている。なお、本発明の細胞凍結保存用具１は、胚などの卵、卵子、精子、造血幹細胞、多能性幹細胞等の幹細胞などの生体細胞を凍結保存するために用いることができる。

生体細胞保持部材２は、図１、図２、図４ないし図１１に示すように、耐寒性材料により形成された本体部２３と、耐寒性材料により形成された生体細胞保持部２１とを備える。この実施例のものでは、図４ないし図６（特に、図６）に示すように、生体細胞保持部２１の基端部には、先端方向に所定長延びる穴部２１ａが形成されており、本体部２３の先端部には、上記穴部２１ａ内に進入可能な所定長延びる突出部２４が設けられている。そして、本体部２３の突出部２４が、生体細胞保持部２１の穴部２１ａ内に挿入され、両者は、固定されている。

生体細胞保持部２１は、断面が略矩形状であり、上述したように、本体部２３と接続された基端部と、この基端部より先端側に突出する生体細胞付着保持部２２を備えている。そして、この実施例のものでは、生体細胞付着保持部２２は、細長い幅の狭い帯状のものとなっている。そして、その表面が、生体細胞付着保持面を形成している。
特に、この実施例の生体細胞保持部材２では、図４ないし図１１に示すように、生体細胞付着保持部２２の表面には、長手方向に複数設けられた生体細胞収納用凹部２８ａ，２８ｂ，２８ｃ，２８ｄ，２８ｅが設けられている。生体細胞収納用凹部２８ａ，２８ｂ，２８ｃ，２８ｄ，２８ｅは、図９、図１１に示すように、略半球状の凹部となっている。また、複数の凹部２８ａ，２８ｂ，２８ｃ，２８ｄ，２８ｅは、生体細胞保持部材２の先端より所定長基端側の位置より、基端側に直線状に並ぶものとなっており、また、各凹部は、ほぼ等間隔離間している。この実施例では、凹部は、複数設けられているが、１つでもよい。また、複数設ける場合には、２〜８が好ましい。凹部の深さは、０．０５〜０．５ｍｍが好ましく、凹部の上面の開口径は、０．１〜０．５ｍｍが好ましい。また、凹部間の離間距離は、１〜３ｍｍが好ましい。さらに、この実施例のものでは、生体細胞収納用凹部２８ａ，２８ｂ，２８ｃ，２８ｄ，２８ｅが形成されている部分の裏面側部分は、図８、図９および図１１に示すように、膨出部３８ａ、３８ｂ、３８ｃ、３８ｄ，３８ｅとなっており、生体細胞収納用凹部を形成する部分が薄肉ではなく、十分な強度を有するものとなっている。なお、生体細胞収納用凹部を設けず、生体細胞保持部材２の表面を平坦に形成し、その平坦面を生体細胞付着保持部としてもよい。また、生体細胞付着保持部２２の幅は、０．４〜１．０ｍｍが好ましく、長さは、５〜３０ｍｍが好ましく、全体の厚さおよび凹部部分での厚さは、０．０８〜１．０ｍｍが好ましい。また、生体細胞保持部２１の肉厚な基端部の長さは、５〜３０ｍｍが好ましく、本体部の長さは、２０〜１００ｍｍが好ましい。

そして、本発明の生体細胞保持部材２では、生体細胞付着保持部２２は、生体細胞付着保持部２２の長手方向に延び、かつ、生体細胞付着保持部２２の先端より突出する熱伝導性体２５，２６を有している。特に、この実施例の生体細胞保持部材２では、熱伝導性体２５，２６は、線状熱伝導性体となっており、生体細胞付着保持部２２の両方の側部に設けられている。なお、熱伝導体は、生体細胞付着保持部２２の一方の側部のみに設けてもよい。そして、熱伝導性体２５，２６は、生体細胞収納用凹部２８ａ，２８ｂ，２８ｃ，２８ｄ，２８ｅが形成された部分の生体細胞付着保持部２２の一方もしくは両方（この実施例での両方）の側部に少なくとも位置し、かつ、生体細胞付着保持部２２の先端より突出しているものである。さらに、この実施例のものでは、熱伝導性体２５，２６は、その基端が、生体細胞収納用凹部形成部分を越えて、基端側に延び、生体細胞保持部２１の基端もしくはその付近に到達するものとなっている。よって、複数の生体細胞収納用凹部２８ａ，２８ｂ，２８ｃ，２８ｄ，２８ｅは、２本の熱伝導性体２５，２６間に位置するものとなっている。また、熱伝導性体２５，２６は、先端部２５ａ，２６ａを除き、側部膨出部３５，３６内に埋設されている。言い換えれば、先端部２５ａ，２６ａは、生体細胞付着保持部２２の先端より突出し、外面が露出した状態となっている。

また、この実施例では、熱伝導性体２５，２６は、線状部材もしくは細い棒状部材により形成されている。そして、先端部は、その形状のまま突出するものとなっている。なお、熱伝導性体２５，２６の先端部の形状としては、図１０，図１１に示すような円柱状のものに限定されるものではなく、図１２に示す実施例の生体細胞保持部材２ａのように、熱伝導性体２５，２６の先端部の先端は、膨出する略球部２５ｂ，２６ｂとなっているものであってもよい。さらに、図１３および図１４に示す実施例の生体細胞保持部材２ｂのように、熱伝導性体２５，２６の先端部の形状は、基端側に向かって湾曲する湾曲先端部２５ｃ、２６ｃとなっているものであってもよい。この場合、湾曲先端部２５ｃ，２６ｃは、図１３に示すように、後述する生体細胞保持部材２の先端部２７の前方に突出し、かつ、先端部２７を保護するものであることが好ましい。特に、図１３のものでは、湾曲先端部２５ｃ，２６ｃに基端側に向かう衝撃が付与された時、湾曲先端部２５ｃ，２６ｃは、先端部２７に当接しないものとなっている。また、図１５に示す実施例の生体細胞保持部材２ｃのように、熱伝導性体２５，２６の生体細胞付着保持部２２より突出する先端部の先端には、平板部材３８が設けられていてもよい。このような平板部材を設けることにより、後述する筒状収納部材３の熱伝導性部材３２との接触面積が増加するため、より迅速に生体細胞を凍結させることができる。

さらに、この実施例の生体細胞保持部材２では、図８および図９に示すように、生体細胞収納用凹部２８ａ，２８ｂ，２８ｃ，２８ｄ，２８ｅが形成された部分の生体細胞付着保持部２２の両側部に設けられかつ生体細胞付着保持部２２の長手方向に延びる２つの側部膨出部３５，３６を有している。このため、生体細胞保持部材２は、生体細胞収納用凹部の両側部に膨出部を有するため、生体細胞載置時における生体細胞の側部方向への移動を確実に抑制でき、かつ、載置された生体細胞の生体細胞収納凹部からの離出も防止する。
そして、この実施例の生体細胞保持部材２では、図８および図９に示すように、熱伝導性体２５，２６は、先端部を除き、側部膨出部３５，３６内に埋設されており、生体細胞保持部材２からの離脱、変形が抑制されている。よって、この実施例では、２つの膨出部３５，３６間を帯状部が連結する形態となっており、その帯状部に上述した生体細胞収納用凹部２８ａ，２８ｂ，２８ｃ，２８ｄ，２８ｅが形成されたものとなっている。

さらに、このこの実施例の生体細胞保持部材２では、図４ないし図１１（特に、図１１）に示すように、生体細胞付着保持部２２は、生体細胞収納用凹部２８ａ，２８ｂ，２８ｃ，２８ｄ，２８ｅより生体細胞付着保持部２２の先端側に設けられた突出部２７を備えている。突出部２７は、生体細胞付着保持部２２の先端より、上面側（生体細胞収納用凹部形成側）に突出するものとなっている。また、突出部２７は、図１１に示すように、先端面は、若干基端側に傾斜する傾斜面となっている。このような突出部２７を形成することにより、もし、生体細胞収納部より生体細胞が離脱して、先端側に移動したとき、生体細胞保持部材２、言い換えれば、生体細胞付着保持部２２からの落下を防止することができる。特に、この実施例の生体細胞保持部材２では、上述したように、生体細胞付着保持部２２の両側部に設けられた膨出部３５，３６と協同することにより、生体細胞の落下を防止する。

さらに、この実施例の生体細胞保持部材２では、図４ないし図１１（特に、図９および図１１）に示すように、生体細胞付着保持部２２は、生体細胞収納用凹部２８ａ，２８ｂ，２８ｃ，２８ｄ，２８ｅと連通し、生体細胞付着保持部２２の長手方向に延びる溝部２９ａ，２９ｂ，２９ｃ，２９ｄ，２９ｅ，２９ｆを有する。特に、この実施例のものでは、溝部２９ｂ，２９ｃ，２９ｄ，２９ｅは、隣り合う生体細胞収納用凹部を連結している。具体的には、溝部２９ｂは、凹部２８ａと凹部２８ｂを連通し、溝部２９ｃは、凹部２８ｂと凹部２８ｃを連通し、溝部２９ｄは、凹部２８ｃと凹部２８ｄを連通し、溝部２９ｅは、凹部２８ｄと凹部２８ｅを連通している。
さらに、この実施例では、図１０に示すように、生体細胞付着保持部２２は、生体細胞付着保持部２２の最も先端側に位置する生体細胞収納用凹部２８ａより、先端側に延びる溝部２９ａを備えており、その端部は、上述した突出部に到達もしくはその付近まで延びるものとなっている。さらに、この実施例のものでは、生体細胞付着保持部２２は、生体細胞付着保持部２２の最も基端側に位置する生体細胞収納用凹部２８ｅより、基端側に延びる溝部２９ｆを備えている。

このような生体細胞収納用凹部と連通する溝部を設けることにより、生体細胞収納用凹部に生体細胞とともに収納された凍結保存液の余剰分が、この溝部内に流入するため、生体細胞が過剰な凍結保存液により被覆されることを抑制し、凍結を迅速に行うことができる。さらに、隣り合う生体細胞収納用凹部が、溝部により連通しているので、生体細胞収納用凹部からの凍結保存液の移動が容易となり、また、複数の生体細胞収納用凹部に残る凍結保存液量も均一化する。溝部の幅としては、１００μｍ〜５００μｍが好ましく、また、溝部の深さとしては、５０μｍ〜５００μｍが好ましい。

また、熱伝導性体としては、上述したような線状体もしくは棒状体のものに限定されるものではなく、板状のものであってもよい。板状のものを２本、上述した熱伝導性体２５，２６のように配置してもよい。さらには、図１６ないし図１９に示す生体細胞保持部材２ｄのようなものであってもよい。
この実施例の生体細胞保持部材２ｄでは、細長い平板状の熱伝導性体３７が用いられている。そして、この平板状の熱伝導性体３７は、生体細胞収納用凹部２８ａ，２８ｂ，２８ｃ，２８ｄ，２８ｅより底面側となるように配置されている。なお、この実施例では、熱伝導性体３７は、生体細胞収納用凹部２８ａ，２８ｂ，２８ｃ，２８ｄ，２８ｅに対応する複数の開口３９ａ，３９ｂ，３９ｃ，３９ｄ，３９ｅを備えており、各凹部の下部には、熱伝導性体３７の開口が位置するものとなっている。また、熱伝導性体３７の両側部は、図１７および図１８に示すように、生体細胞付着保持部２２の両側部内に埋設されている。また、熱伝導性体３７の長手方向中央部は、生体細胞付着保持部２２により被覆されていない非被覆部３７ｂとなっており、露出している。また、この実施例の生体細胞保持部材２ｄにおいても熱伝導性体３７の先端部３７ａは、生体細胞付着保持部２２より突出している。

本体部２３および生体細胞保持部２１は、耐寒性材料により形成されている。特に、本体部２３および生体細胞保持部２１は、液体窒素耐性材料、言い換えれば、液体窒素に接触しても脆化しないものが好ましい。また、生体細胞保持部２１は、透明もしくは半透明体であることが好ましく、また、多少の可撓性を有するものであることが好ましい。本体部２３および生体細胞保持部２１の形成材料としては、例えば、３−フッ化ポリエチレン、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、ポリカーボネート、ナイロン、ポリスルホン、ポリエステル、ポリスチレン、ポリイミド、超高分子量ポリエチレン、エチレン−酢酸ビニル共重合体などの合成樹脂、また、それら合成樹脂により形成されたフィルムの積層体が好適に使用される。
熱伝導性体２５，２６、３７は、熱伝導性材料により形成されている。熱伝導性材料としては、銀、銅、アルミニウム、ステンレス鋼などの金属類、窒化アルミニウム、窒化ケイ素、アルミナなどの熱伝導性セラミックスなどが好適に使用できる。

筒状収納部材３は、図１ないし図３に示すように、生体細胞保持部材２を収納可能かつ耐寒性材料により形成された一端が閉塞した筒状体である。筒状収納部材３は、内部に生体細胞保持部材収納部３１を有する筒状体３０と、筒状体３０の先端に設けられた熱伝導性部材３２とにより構成されている。また、この実施例では、筒状収納部材３は、先端閉塞部３３と、基端開口部３４と、内部に生体細胞保持部材収納部３１を有する筒状体３０と、筒状体３０の先端部内に収納された熱伝導性部材３２とにより構成されている。熱伝導性部材３２は、筒状体３０の内部に移動不能に収納されており、特に、図示する実施例では、先端閉塞部３３の内面に当接するように収納されている。また、熱伝導性部材３２は、金属製の円柱状のものが用いられている。熱伝導性部材３２の上面、すなわち、後述する生体細胞保持部材３２の熱伝導性体２５，２６の先端部２５ａ，２６ａと接触する面は、平坦面となっている。なお、熱伝導性部材３２ａとしては、図２０に示す筒状収納部材３ａのように、上面に生体細胞保持部材２の熱伝導性体２５，２６の先端部２５ａ，２６ａの先端側部分もしくはほぼ全体を収納可能な凹部３２ｂを備えるものであってもよい。また、凹部３２ｂは、図２０に示すように、開口端に向かって拡径する開口部（言い換えれば、テーパー状の開口部）を有することが好ましい。

さらに、筒状収納部材としては、図２１に示す実施例の生体細胞凍結保存用具１ａにて用いられている筒状収納部材３ｂのようなタイプのものであってもよい。この実施例の筒状収納部材３ｂは、内部に生体細胞保持部材収納部３１を有する先端および後端が開口した筒状体３０ａと、その先端開口部に固定された熱伝導性部材４２とにより構成されている。このため、筒状体３０ａは、熱伝導性部材４２により、閉塞されており、また、熱伝導性部材４２は、外面が露出するものとなっており、冷却作業時に、冷却媒体（例えば、液体窒素）に直接接触するものとなっている。また、この実施例の熱伝導性部材４２は、先端部３２ｃが半球状もしくは弾丸状となっており、さらに、後端部には、筒状体３０ａの先端部を収納保持するためにの環状溝部３２ｄが形成されている。筒状体３０ａの先端部が、 熱伝導性部材４２の環状溝部３２ｄに挿入された状態にて、熱伝導性部材４２の環状溝部３２ｄの形成部分がカシメられることにより、熱伝導性部材４２は、筒状体３０ａの先端部に固定されている。
さらに、上記のタイプの筒状収納部材においても、図２２に示す実施例の生体細胞凍結保存用具１ｂの筒状収納部材３ｃのように、上面に生体細胞保持部材２の熱伝導性体２５，２６の先端部２５ａ，２６ａの先端側部分もしくはほぼ全体を収納可能な凹部３２ｂを備えるものであってもよい。また、凹部３２ｂは、図２２に示すように、開口端に向かって拡径する開口部（言い換えれば、テーパー状の開口部）を有することが好ましい。
そして、上述したすべての筒状収納部材において、図２３に示す筒状収納部材３ｄのように、筒状体３０ｂは、基端開口部が、基端に向かって拡径する拡径基端開口部３４ａとなってるものであってもよい。また、筒状収納部材としては、図２３に示す筒状収納部材３ｅのように、筒状体３０ｃは、基端開口部３４に、切欠部３４ｂを有するものであってもよい。このような拡径部、切欠部を設けることにより、生体細胞保持部材２の筒状収納部材への挿入が容易となる。

筒状体３０は、耐寒性材料により形成されている。特に、筒状体３０は、液体窒素耐性材料、言い換えれば、液体窒素に接触しても脆化しないものが好ましい。また、筒状体３０は、内部が視認可能な透明もしくは半透明体であることが好ましい。筒状体３０の形成材料としては、例えば、３−フッ化ポリエチレン、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、ポリカーボネート、ナイロン、ポリスルホン、ポリエステル、ポリスチレン、ポリイミド、超高分子量ポリエチレン、エチレン−酢酸ビニル共重合体などの合成樹脂、また、それら合成樹脂により形成されたフィルムの積層体が好適に使用される。
また、筒状収納部材３の生体細胞保持部材収納部３１の長さは、生体細胞保持部材２の全長より、１０〜５０ｍｍ長いものであることが好ましい。また、筒状収納部材３（筒状体３０）の全長は、５０〜１００ｍｍが好ましく、内径は、２〜５ｍｍが好ましい。
熱伝導性部材３２は、熱伝導性材料により形成されている。熱伝導性材料としては、銀、銅、アルミニウム、ステンレス鋼などの金属類、窒化アルミニウム、窒化ケイ素、アルミナなどの熱伝導性セラミックス、金属粉末、窒化アルミニウムなどの熱伝導性セラミックス粉末、カーボンファイバーなどの高熱伝導性物質を含有する熱伝導性樹脂などが好適に使用できる。また、熱伝導性部材としては、生体細胞保持部材２の熱伝導性体２５，２６の先端部２５ａ，２６ａの先端面が同時に接触可能なものとなっている。具体的には、熱伝導性部材は、その直径が、生体細胞保持部材２の熱伝導性体２５，２６の先端部２５ａ，２６ａ間の距離より長いものが用いられている。

次に、本発明の生体細胞凍結保存用具１の使用方法について説明する。
この説明では、生体細胞子である卵子を凍結保存する場合を例に取り説明する。
まず、複数の卵子を採取し、卵子の細胞内液を平衡液に置換する作業を行い、さらに、細胞外液をガラス化液に置換する作業を行う。そして、顕微鏡下において、生体細胞保持部材２の生体細胞付着保持部２２に設けられたそれぞれの生体細胞収納用凹部２８ａ，２８ｂ，２８ｃ，２８ｄ，２８ｅに卵子を少量のガラス化液とともに配置させ、付着させる。卵子が付着した生体細胞保持部材２を生体細胞付着保持部２２側より、筒状収納部材３内に挿入し、図２５に示すように、生体細胞保持部材２の生体細胞付着保持部２２の先端より突出する熱伝導性体２５，２６の先端部２５ａ，２６ｂが、筒状収納部材３内の熱伝導性部材３２と接触する状態とする。そして、生体細胞保持部材２を収納した筒状収納部材３を先端側（伝導性部材３２側）より、あらかじめ準備しておいた液体窒素に浸漬し凍結（ガラス化）させる。筒状収納部材３の液体窒素との接触により、筒状収納部材３内の熱伝導性部材３２は急激冷却され、その冷却は、熱伝導性部材３２と接触する生体細胞保持部材２の生体細胞付着保持部２２の熱伝導性体２５，２６より温度を急激に奪うものとなり、生体細胞付着保持部２２に保持されてる卵子も急激に冷却される。収納容器（ケーン）に、ガラス化した卵子を付着保持する生体細胞保持部材２を筒状収納部材３ごと収納した後、収納容器を液体窒素タンク内に入れ保存する。

本発明の生体細胞凍結保存用具は、以下のものである。
（１） 耐寒性材料により形成された本体部と、耐寒性材料により形成された生体細胞保持部とを備える生体細胞保持部材と、前記生体細胞保持部材を収納可能かつ耐寒性材料により形成された一端が閉塞した筒状収納部材とを備える生体細胞凍結保存用具であって、前記生体細胞保持部材の前記生体細胞保持部は、細長い生体細胞付着保持部を備え、前記生体細胞付着保持部は、前記生体細胞付着保持部の長手方向に延び、かつ、前記生体細胞付着保持部の先端より突出する熱伝導性体を有し、前記筒状収納部材は、先端部に設けられた熱伝導性部材を備え、前記生体細胞保持部材を前記熱伝導性体の先端側より、前記筒状収納部材に挿入したとき、前記熱伝導性体の先端部は、前記筒状収納部材の前記熱伝導性部材と接触可能なものとなっている生体細胞凍結保存用具。

本発明の生体細胞凍結保存用具では、凍結保存液にて処理した生体細胞（例えば、卵子）を吸引し、生体細胞保持部材の生体細胞付着保持部上に配置した後、生体細胞を保持した生体細胞保持部材を筒状収納部材に挿入することにより、生体細胞保持部材に保持された生体細胞は、筒状収納部材により保護されるとともに、外部に露出しないものとなる。そして、生体細胞保持部材を収納した筒状収納部材の先端側を下方となるように、冷却媒体（例えば、液体窒素）に接触させ、かつ、内部に液体窒素が流入しないように操作することにより、筒状収納部材は冷却され、かつ、筒状収納部材が備える熱伝導性部材も瞬時に冷却され、熱伝導性部材と接触する生体細胞保持部材の熱伝導性体も冷却され、迅速に生体細胞保持部材およびそれに付着した生体細胞も冷却される。よって、本発明の生体細胞凍結保存用具によれば、生体細胞凍結保存具への生体細胞載置操作が容易であり、かつ、生体細胞を冷却媒体に直接接触させることなく生体細胞を凍結させることが可能である。

そして、本発明の実施態様は、以下のものであってもよい。
（２） 前記熱伝導性部材は、前記筒状収納部材の先端部内に収納もしくは先端部に固定されている上記（１）に記載の生体細胞凍結保存用具。
（３） 前記熱伝導性体は、前記生体細胞付着保持部の一方もしくは両方の側部に設けられ、前記生体細胞付着保持部の長手方向に延び、かつ、前記生体細胞付着保持部の先端より突出しているものである上記（１）または（２）に記載の生体細胞凍結保存用具。
（４） 前記生体細胞付着保持部は、薄板状のものであり、かつ、前記生体細胞付着保持部の長手方向に複数設けられた生体細胞収納用凹部を有し、前記熱伝導性体は、前記生体細胞収納用凹部が形成された部分の前記生体細胞付着保持部の一方もしくは両方の側部に少なくとも位置し、かつ、前記生体細胞付着保持部の先端より突出しているものである上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の生体細胞凍結保存用具。

（５） 前記生体細胞付着保持部は、前記生体細胞収納用凹部と連通し、前記生体細胞付着保持部の長手方向に延びる溝部を有する上記（４）に記載の生体細胞凍結保存用具。
（６） 前記溝部は、隣り合う前記生体細胞収納用凹部を接続している上記（５）に記載の生体細胞凍結保存用具。
（７） 前記生体細胞付着保持部は、前記生体細胞収納用凹部より前記生体細胞付着保持部の先端側に設けられた突出部を有する上記（４）ないし（６）のいずれかに記載の生体細胞凍結保存用具。
（８） 前記生体細胞付着保持部は、前記生体細胞付着保持部の長手方向に複数設けられた生体細胞収納用凹部と、前記生体細胞収納用凹部が形成された部分の前記生体細胞付着保持部の両側部に設けられかつ前記生体細胞付着保持部の長手方向に延びる２つの側部膨出部を有している上記（４）ないし（７）のいずれかに記載の生体細胞凍結保存用具。

（９） 前記熱伝導性体は、先端部を除き、前記生体細胞付着保持部内に埋設されている上記（１）ないし（８）のいずれかに記載の生体細胞凍結保存用具。
（１０） 前記熱伝導性体は、先端部を除き、前記側部膨出部内に埋設されている上記（８）に記載の生体細胞凍結保存用具。
（１１） 前記生体細胞付着保持部は、前記生体細胞付着保持部の最も先端側に位置する前記生体細胞収納用凹部より、先端側に延びる溝部を備えている上記（４）ないし（１０）のいずれかに記載の生体細胞凍結保存用具。
（１２） 前記生体細胞付着保持部は、前記生体細胞付着保持部の最も基端側に位置する前記生体細胞収納用凹部より、基端側に延びる溝部を備えている上記（４）ないし（１１）のいずれかに記載の生体細胞凍結保存用具。
（１３） 前記耐寒性材料は、液体窒素耐性材料である上記（１）ないし（１２）のいずれかに記載の生体細胞凍結保存用具。
（１４） 前記熱伝導性体および前記熱伝導性部材は、金属もしくは熱伝導性セラミックスにより形成されている上記（１）ないし（１３）のいずれかに記載の生体細胞凍結保存用具。

また、本願発明者は、特許文献３（特開２００２−３１５５７３、ＷＯ ０２−０８５１１０ Ａ１）を提案している。特許文献３の卵凍結保存用具１は、耐寒性材料により形成された本体部２と、本体部２の一端に取り付けられ、可撓性かつ透明性かつ液体窒素耐性材料により形成された卵付着保持用ストリップ３と、卵付着保持用ストリップ３を被包可能に本体部２に着脱自在に取り付けられる一端が封鎖され、かつ耐寒性材料により形成された筒状部材４とからなるものである。この特許文献３の卵凍結保存用具は、ストリップ上への卵の載置を行えばよく、チューブ内への卵の収納操作が不要であり、卵凍結操作が容易であるという利点を有している。

図１は、生体細胞保持部材が筒状収納部材に収納された状態の本発明の実施例の生体細胞凍結保存用具の正面図である。 図２は、生体細胞保持部材が筒状収納部材に収納されていない状態の本発明の実施例の生体細胞凍結保存用具の正面図である。 図３は、図２に示した筒状収納部材の縦断面図である。 図４は、図２に示した生体細胞凍結保持部材の先端側部分の拡大正面図である。 図５は、図４に示した生体細胞凍結保持部材の右側面図である。 図６は、図４のＡ−Ａ線断面図である。 図７は、図４のＢ−Ｂ線断面図である。 図８は、図４に示した生体細胞凍結保持部材の拡大底面図である。 図９は、図４のＣ−Ｃ線にて切断した断面を説明するための説明図である。 図１０は、図２に示した生体細胞凍結保持部材の先端部の拡大正面図である。 図１１は、図１０のＤ−Ｄ線断面図である。 図１２は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存用具に用いられる生体細胞保持部材の先端部の拡大正面図である。 図１３は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存用具に用いられる生体細胞保持部材の先端部の拡大側面図である。 図１４は、図１３に示した生体細胞保持部材の先端部の拡大底面図である。 図１５は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存用具に用いられる生体細胞保持部材の先端部の拡大底面図である。 図１６は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存用具に用いられる生体細胞保持部材の先端側部分の拡大正面図である。 図１７は、図１６に示した生体細胞保持部材の拡大底面図である。 図１８は、図１６のＥ−Ｅ線拡大断面図である。 図１９は、図１６に示した生体細胞保持部材に用いられる平板状の熱伝導性体の正面図である。 図２０は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存用具に用いられる筒状収納部材を説明するための説明図である。 図２１は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存用具の先端部の拡大縦断面図である。 図２２は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存用具の先端部の拡大縦断面図である。 図２３は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存用具に用いられる筒状収納部材の部分省略拡大縦断面図である。 図２４は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存用具に用いられる筒状収納部材の部分省略拡大正面図である。 図２５は、本発明の生体細胞凍結保存用具の作用を説明するための説明図である。

本発明の生体細胞凍結保存用具を図面に示す実施例を用いて説明する。
本発明の生体細胞凍結保存用具１は、耐寒性材料により形成された本体部２３と、耐寒性材料により形成された生体細胞保持部２１とを備える生体細胞保持部材２と、生体細胞保持部材２を収納可能かつ耐寒性材料により形成された一端が閉塞した筒状収納部材３とを備える。生体細胞保持部材２の生体細胞保持部２１は、細長い生体細胞付着保持部２２を備え、生体細胞付着保持部２２は、生体細胞付着保持部の長手方向に延び、かつ、生体細胞付着保持部２２の先端より突出する熱伝導性体２５，２６を有する。筒状収納部材３は、先端部内に収納された熱伝導性部材３２を備える。そして、生体細胞保持部材２を熱伝導性体２５，２６の先端側より、筒状収納部材３に挿入したとき、熱伝導性体２５，２６の先端部は、筒状収納部材３の熱伝導性部材３２と接触可能なものとなっている。

さらに、筒状収納部材としては、図２１に示す実施例の生体細胞凍結保存用具１ａにて用いられている筒状収納部材３ｂのようなタイプのものであってもよい。この実施例の筒状収納部材３ｂは、内部に生体細胞保持部材収納部３１を有する先端および後端が開口した筒状体３０ａと、その先端開口部に固定された熱伝導性部材４２とにより構成されている。このため、筒状体３０ａは、熱伝導性部材４２により、閉塞されており、また、熱伝導性部材４２は、外面が露出するものとなっており、冷却作業時に、冷却媒体（例えば、液体窒素）に直接接触するものとなっている。また、この実施例の熱伝導性部材４２は、先端部３２ｃが半球状もしくは弾丸状となっており、さらに、後端部には、筒状体３０ａの先端部を収納保持するためにの環状溝部３２ｄが形成されている。筒状体３０ａの先端部が、 熱伝導性部材４２の環状溝部３２ｄに挿入された状態にて、熱伝導性部材４２の環状溝部３２ｄの形成部分がカシメられることにより、熱伝導性部材４２は、筒状体３０ａの先端部に固定されている。
さらに、上記のタイプの筒状収納部材においても、図２２に示す実施例の生体細胞凍結保存用具１ｂの筒状収納部材３ｃのように、上面に生体細胞保持部材２の熱伝導性体２５，２６の先端部２５ａ，２６ａの先端側部分もしくはほぼ全体を収納可能な凹部３２ｂを備えるものであってもよい。また、凹部３２ｂは、図２２に示すように、開口端に向かって拡径する開口部（言い換えれば、テーパー状の開口部）を有することが好ましい。
そして、上述したすべての筒状収納部材において、図２３に示す筒状収納部材３ｄのように、筒状体３０ｂは、基端開口部が、基端に向かって拡径する拡径基端開口部３４ａとなってるものであってもよい。また、筒状収納部材としては、図２４に示す筒状収納部材３ｅのように、筒状体３０ｃは、基端開口部３４に、切欠部３４ｂを有するものであってもよい。このような拡径部、切欠部を設けることにより、生体細胞保持部材２の筒状収納部材への挿入が容易となる。

次に、本発明の生体細胞凍結保存用具１の使用方法について説明する。
この説明では、生体細胞である卵子を凍結保存する場合を例に取り説明する。
まず、複数の卵子を採取し、卵子の細胞内液を平衡液に置換する作業を行い、さらに、細胞外液をガラス化液に置換する作業を行う。そして、顕微鏡下において、生体細胞保持部材２の生体細胞付着保持部２２に設けられたそれぞれの生体細胞収納用凹部２８ａ，２８ｂ，２８ｃ，２８ｄ，２８ｅに卵子を少量のガラス化液とともに配置させ、付着させる。卵子が付着した生体細胞保持部材２を生体細胞付着保持部２２側より、筒状収納部材３内に挿入し、図２５に示すように、生体細胞保持部材２の生体細胞付着保持部２２の先端より突出する熱伝導性体２５，２６の先端部２５ａ，２６ｂが、筒状収納部材３内の熱伝導性部材３２と接触する状態とする。そして、生体細胞保持部材２を収納した筒状収納部材３を先端側（伝導性部材３２側）より、あらかじめ準備しておいた液体窒素に浸漬し凍結（ガラス化）させる。筒状収納部材３の液体窒素との接触により、筒状収納部材３内の熱伝導性部材３２は急激冷却され、その冷却は、熱伝導性部材３２と接触する生体細胞保持部材２の生体細胞付着保持部２２の熱伝導性体２５，２６より温度を急激に奪うものとなり、生体細胞付着保持部２２に保持されてる卵子も急激に冷却される。収納容器（ケーン）に、ガラス化した卵子を付着保持する生体細胞保持部材２を筒状収納部材３ごと収納した後、収納容器を液体窒素タンク内に入れ保存する。

Claims (14)

1. 耐寒性材料により形成された本体部と、耐寒性材料により形成された生体細胞保持部とを備える生体細胞保持部材と、前記生体細胞保持部材を収納可能かつ耐寒性材料により形成された一端が閉塞した筒状収納部材とを備える生体細胞凍結保存用具であって、
   前記生体細胞保持部材の前記生体細胞保持部は、細長い生体細胞付着保持部を備え、前記生体細胞付着保持部は、前記生体細胞付着保持部の長手方向に延び、かつ、前記生体細胞付着保持部の先端より突出する熱伝導性体を有し、
   前記筒状収納部材は、先端部に設けられた熱伝導性部材を備え、
   前記生体細胞保持部材を前記熱伝導性体の先端側より、前記筒状収納部材に挿入したとき、前記熱伝導性体の先端部は、前記筒状収納部材の前記熱伝導性部材と接触可能なものとなっていることを特徴する生体細胞凍結保存用具。
2. 前記熱伝導性部材は、前記筒状収納部材の先端部内に収納もしくは先端部に固定されている請求項１に記載の生体細胞凍結保存用具。
3. 前記熱伝導性体は、前記生体細胞付着保持部の一方もしくは両方の側部に設けられ、前記生体細胞付着保持部の長手方向に延び、かつ、前記生体細胞付着保持部の先端より突出しているものである請求項１または２に記載の生体細胞凍結保存用具。
4. 前記生体細胞付着保持部は、薄板状のものであり、かつ、前記生体細胞付着保持部の長手方向に複数設けられた生体細胞収納用凹部を有し、前記熱伝導性体は、前記生体細胞収納用凹部が形成された部分の前記生体細胞付着保持部の一方もしくは両方の側部に少なくとも位置し、かつ、前記生体細胞付着保持部の先端より突出しているものである請求項１ないし３のいずれかに記載の生体細胞凍結保存用具。
5. 前記生体細胞付着保持部は、前記生体細胞収納用凹部と連通し、前記生体細胞付着保持部の長手方向に延びる溝部を有する請求項４に記載の生体細胞凍結保存用具。
6. 前記溝部は、隣り合う前記生体細胞収納用凹部を接続している請求項５に記載の生体細胞凍結保存用具。
7. 前記生体細胞付着保持部は、前記生体細胞収納用凹部より前記生体細胞付着保持部の先端側に設けられた突出部を有する請求項４ないし６のいずれかに記載の生体細胞凍結保存用具。
8. 前記生体細胞付着保持部は、前記生体細胞付着保持部の長手方向に複数設けられた生体細胞収納用凹部と、前記生体細胞収納用凹部が形成された部分の前記生体細胞付着保持部の両側部に設けられかつ前記生体細胞付着保持部の長手方向に延びる２つの側部膨出部を有している請求項４ないし７のいずれかに記載の生体細胞凍結保存用具。
9. 前記熱伝導性体は、先端部を除き、前記生体細胞付着保持部内に埋設されている請求項１ないし８のいずれかに記載の生体細胞凍結保存用具。
10. 前記熱伝導性体は、先端部を除き、前記側部膨出部内に埋設されている請求項８に記載の生体細胞凍結保存用具。
11. 前記生体細胞付着保持部は、前記生体細胞付着保持部の最も先端側に位置する前記生体細胞収納用凹部より、先端側に延びる溝部を備えている請求項４ないし１０のいずれかに記載の生体細胞凍結保存用具。
12. 前記生体細胞付着保持部は、前記生体細胞付着保持部の最も基端側に位置する前記生体細胞収納用凹部より、基端側に延びる溝部を備えている請求項４ないし１１のいずれかに記載の生体細胞凍結保存用具。
13. 前記耐寒性材料は、液体窒素耐性材料である請求項１ないし１２のいずれかに記載の生体細胞凍結保存用具。
14. 前記熱伝導性体および前記熱伝導性部材は、金属もしくは熱伝導性セラミックスにより形成されている請求項１ないし１３のいずれかに記載の生体細胞凍結保存用具。

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