JPWO2012039483A1 - バチルス属微生物及び血栓溶解酵素、並びに、廃棄物の処理方法 - Google Patents
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Abstract
Description
しかし、この取水口が廃棄物によって閉塞し、取水が制限乃至停止され、その運転に支障をきたすという被害が問題となってきている。
しかし、この場合、前記クラゲ類の分解に一日程度を要し、迅速な分解処理ができない上、分解が不完全であるという問題がある。
更に魚類を捕獲する際に同時に、例えば、エチゼンクラゲや、電気クラゲとも呼ばれるアンドングラゲ等の毒素を有するクラゲが網にかかると、該クラゲ類の毒素は魚類を白化させてしまい、魚類の商品価値を下げてしまう点で問題である。
しかし、このような廃液の安全性を確保する方法は知られていない。
<1> Bacillus subtilis(バチルス・サチルス) 104−1−3−1株(受託番号:NITE P−680)及びその誘導菌株のいずれかであり、廃棄物を分解する血栓溶解酵素を産生することを特徴とするバチルス属微生物である。
<2> 前記<1>に記載のバチルス属微生物により産生されることを特徴とする血栓溶解酵素である。
<3> 至適pHが6〜12である前記<2>に記載の血栓溶解酵素である。
<4> 至適温度が20℃〜70℃である前記<2>から<3>のいずれかに記載の血栓溶解酵素である。
<5> ナットウキナーゼである前記<2>から<4>のいずれかに記載の血栓溶解酵素である。
<6> 前記<2>から<5>のいずれかに記載の血栓溶解酵素により廃棄物を分解する分解工程を含むことを特徴とする廃棄物の処理方法である。
<7> 血栓溶解酵素が、前記<1>に記載のバチルス属微生物とタンパク質性原料とを混合し、前記タンパク質性原料を前記バチルス属微生物により発酵させた発酵物から分離して得られた血栓溶解酵素である前記<6>に記載の廃棄物の処理方法である。
<8> 分解工程が、前記<1>に記載のバチルス属微生物と廃棄物とを混合した混合物中で行なわれる前記<6>に記載の廃棄物の処理方法である。
<9> 廃棄物が、クラゲ類、魚類、プランクトン、及び毒素の少なくともいずれかである前記<6>から<8>のいずれかに記載の廃棄物の処理方法である。
本発明のバチルス属微生物は、Bacillus subtilis(「バチルス・サチルス」、「バチルス・スブチリス」、「バチルス・ズブチリス」などとも称する)104−1−3−1株及びその誘導菌株のいずれかであり、廃棄物を分解する血栓溶解酵素を産生する微生物である。
グラム陽性桿菌で、細胞は連鎖を示し、芽胞を形成する。芽胞による菌体の膨張は認められない。コロニー形態であり、直径は2.0mm〜3.0mm、色調はクリーム色、形は円形、隆起状態はレンズ状、周縁は波状、表面の形状などはラフ、透明度は不透明、粘稠度はバター様、カタラーゼ反応は陽性、オキシダーゼ反応は陰性である。API試験では、L−アラビノース、リボース、及びグルコース等を酸化し、エリスリトール、D−アラビノース、及びL−キシロース等を酸化しない。嫌気条件下では生育せず、50質量%及び10質量%塩化ナトリウム含有培地で生育する。カゼインを加水分解し、でんぷんを加水分解しない。16S rRNA遺伝子の塩基配列に基づく検索の結果、Bacillus subtilisと相同であると考えられるが、一般的なBacillus subtilisとは生理学性状の一部が異なっているため、Bacillus subtilisの中の新たな株であることが推定された。
Bacillus sp.
(1)培地名:ニュートリエントアガー
(2)培地の組成:ペプトン0.5質量%、牛肉エキス0.3質量%、寒天1.5質量%
(3)培地のpH:7.0
(4)培地の殺菌条件:121℃、20分間
(5)培養温度:30℃
(6)培養期間:7日間
(7)酸素要求性:好気
(1)凍結条件:L−乾燥
(2)保護剤:20体積%グリセロール
(3)凍結後の復元率:100%
前記104−1−3−1株は、平成20年11月21日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構に受託番号:NITE P−680として受託されている。
前記104−1−3−1株の誘導菌株としては、廃棄物を分解する血栓溶解酵素を産生できれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記104−1−3−1株が、突然変異(自然発生又は誘発性)、形質転換、接合、遺伝子組換、紫外線、放射線、薬品等により性状などが変異したバチルス属微生物などが挙げられる。
前記バチルス属微生物が血栓溶解酵素活性を有するか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、以下の希釈法などが挙げられる。
前記バチルス属微生物は、前記培養条件以外でも公知の培地で生育することができ、液体培養であっても、固体培養であってもよい。
前記培地の組成としては、前記バチルス属微生物が増殖し前記血栓溶解酵素を産生させることができる培地であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、炭素源、窒素源、無機塩類等の公知の培地成分を含む培地などが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
前記窒素源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、市販されている大豆粉、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、硫酸アンモニウムなどが挙げられる。
前記炭素源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トマトペースト、グリセリン、でん粉、グルコース、ガラクトース、デキストリンなどの炭水化物、脂肪などが挙げられる。
前記無機塩類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、食塩、炭酸カルシウムなどが挙げられる。
また、必要に応じて微量の金属塩や、前記血栓溶解酵素の産生量を高めるような公知の成分を添加してもよい。
これらの材料は、前記バチルス属微生物が利用し、前記血栓溶解酵素の産生に役立つものであればよく、公知の培養材料は全て用いることができる。
前記液体培地による培養の条件としては、前記バチルス属微生物が死滅することなく、前記血栓溶解酵素を産生させることができる条件であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記培養の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、10℃〜45℃が好ましく、27℃〜40℃がより好ましく、27℃〜30℃が特に好ましい。前記特に好ましい範囲であると、血栓溶解酵素の産生量が多い点で有利である。
前記培養の時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、12時間〜120時間が好ましく、48時間〜96時間がより好ましい。
前記培養は、好気培養であってもよく、嫌気培養であってもよいが、好気培養で行われることが、前記バチルス属微生物が効率よく増殖する点で好ましい。また、振盪培養であってもよく、静置培養であってもよい。
前記バチルス属微生物は、血栓溶解酵素を効率よく産生することができることから、本発明の廃棄物の処理方法に好適に利用可能である。
本発明の血栓溶解酵素は、本発明の前記バチルス属微生物により産生される酵素であり、血栓を形成するフィブリンと呼ばれるタンパク質を溶解する酵素である。
前記バチルス属微生物が産生する血栓溶解酵素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ナットウキナーゼ(nattokinase)、プラスミン、トリプシンなどが挙げられる。
ナットウキナーゼの全アミノ酸配列は決定されている(特開平6−153977号公報、特開2006−325538号公報、特許文献9〜10参照、T.Nakamura et al(1992) Biosci. Biotech. Biochem., 56, 1869−1871、及びT. Urano et al (2001) J. Biol. Chem., 27, 24690−24696参照)。
本発明の前記バチルス属微生物により産生されるナットウキナーゼは、配列番号:3で表されるアミノ酸配列を有し、該アミノ酸配列は、GenBank内に登録されているナットウキナーゼ遺伝子(アクセッション番号:P35835)のアミノ酸配列と100%の同一性を示す。
本発明の処理方法は、本発明の前記血栓溶解酵素により廃棄物を分解する分解工程を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の工程を含む。
前記分解工程は、前記血栓溶解酵素により廃棄物を分解する工程である。
前記廃棄物としては、前記血栓溶解酵素で分解できる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、有機廃棄物が好ましく、アミノ酸やタンパク質を含む廃棄物がより好ましい。前記タンパク質は、プロテイナーゼKを0.1質量%、30℃、120分間の条件で作用させた場合にも溶解しないような難分解性タンパク質であってもよい。これらの中でも、前記廃棄物の処理方法は、海洋生物や淡水生物からなる水産廃棄物に好ましく適用される。また、前記廃棄物の処理方法は、これらの廃棄物中又は該廃棄物から産生される毒素の分解にも好適に適用できる点で有利である。これらの廃棄物は、1種単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
前記水産廃棄物(海洋生物、淡水生物)としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、魚介類、浮遊生物類、海綿類、ヒドロ虫類、管棲多毛類、苔虫類、ヨコエビ類、ワレカラ類、ホヤ類、甲殻類、扁形動物類などが挙げられる。
前記魚介類は、水産食品加工で廃棄物となることや、発電所の取水管などに付着することで問題となっている廃棄物である。また、前記フグは猛毒を有する魚類であるため、非可食部は廃棄物である。これらの魚類は、1種単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
前記血栓溶解酵素は、クラゲ類体成分を構成するコラーゲンを好適に分解することができる。
前記クラゲ類の毒素としては、特に制限はなく、クラゲの種類などに応じて適宜選択することができ、例えば、アンドンクラゲ毒素のCrTXs、ハブクラゲ毒素のCqTX−A、ハコクラゲ(Carybdea alata)毒素のCaTX−Aなどが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
前記廃棄物がクラゲ類である場合、個体全体をそのまま使用してもよいが、その種類によっては適宜物理的破砕処理することが、処理時間が短く、処理効率が向上する点で好ましい。前記クラゲ類に物理的破砕処理を施す場合、その大きさとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、20cm角以下が好ましく、10cm角以下がより好ましく、3cm角以下が特に好ましい。
前記水分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、精製水、水道水、海水などが挙げられる。
前記廃棄物の処理方法は、塩分を含む海水中であっても前記廃棄物をそのまま処理することができ、広大な場所を要することなく、簡便に処理できる点で有利である。
前記分解工程において、前記血栓溶解酵素は、その他の酵素と併用されてもよい。
前記その他の酵素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
本発明の分解工程に用いられる酵素は、前記104−1−3−1株により産生された血栓溶解酵素であるが、公知の血栓溶解酵素を併用してもよい。
前記担体としては、特に制限はなく、目的等に応じて適宜、その形状、構造、大きさ、材質等について選択することができる。
前記担体の形状としては、例えば、球状、粒状、塊状(ペレット状)、シート状、柱状、網状、カプセル状などが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
前記担体の構造としては、1種単独の部材で形成されていてもよいし、2以上の部材で形成されていてもよく、また、単層構造であってもよいし、積層構造であってもよい。これらは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
また、前記担体の微細構造としては、例えば、前記バチルス属微生物が前記廃棄物と接触可能な構造であれば特に制限はないが、例えば、多孔質構造、網状構造などが好ましい。前記担体がこれらの構造を有すると、該担体に固定化された前記バチルス属微生物と、前記廃棄物との接触面積を大きくすることができるため、前記廃棄物の分解処理効率に優れる点で有利である。
前記担体の大きさとしては、該担体を収容する容器等の大きさ等に応じて適宜選択することができる。前記担体の大きさとしては、均一(一定)であってもよいし、互いに異なっていてもよい。
前記多糖類としては、例えば、セルロース、デキストラン、アガロース、アルギン酸ナトリウム、寒天、カラギーナンなどが挙げられ、これらの中でも、前記バチルス属微生物を高濃度に保持可能であるとともに廃液中の成分の透過性に優れ、造粒操作が容易であり、毒性が少なく、処理や処分が容易であるという点で、寒天が好ましい。
前記タンパク質としては、例えば、不活性化されたものが好ましく、その中でも、ゼラチン、アルブミン、コラーゲンなどが挙げられる。
前記合成高分子としては、例えば、アクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルクロリド、ポリスチレン、ポリウレタン、光硬化性樹脂などが挙げられる。
前記無機物としては、例えば、シリカゲル、活性炭、砂、ゼオライト、多孔性ガラス、アンスラサイト、ゼオライト、発泡煉石、溶融スラグなどが挙げられ、これらの中でも多孔質材であるシリカゲル、活性炭が好ましい。
前記付着法(担体結合法)は、水に不溶性の前記担体の表面に前記バチルス属微生物を固定化させる方法である。前記架橋法は、2個以上の官能基を持つ試薬と架橋させる方法である。前記包括法は、前記バチルス属微生物をゲルの格子内に包み込むか(格子型)又はポリマーの皮膜によって被覆する方法(マイクロカプセル)である。
前記寒天は、例えば、固定化した前記バチルス属微生物の漏出や、内部への侵入が少なく、耐久性に優れ、寿命が長く、安定性が高い濃度である3質量%で担体の造粒を行なうのが好ましい。
前記寒天を3質量%になるように水を混合し、60℃以上で撹拌しながら寒天を溶解する。その後、熱耐性のない前記バチルス属微生物群を安定に固定化するために、固化しない範囲で可能な限り低温(例えば55℃以下)で前記バチルス属微生物と混合することが好ましい。
前記バチルス属微生物は、例えば、遠心分離などの操作によって集菌されたものを用いることができる。
前記バチルス属微生物を混合した前記寒天を、室温まで冷却させ固化させた後、成型容器に入れ所望の形状に切断することにより、前記バチルス属微生物固定化担体が得られる。
前記容器としては、特に制限はなく、その形状、構造、大きさ、材質等について目的に応じて適宜選択することができる。
前記容器の形状としては、例えば、円筒状などが好適に挙げられる。
また、前記容器の材質としては、耐塩性材料で形成されているのが好ましく、ガラス、樹脂、ステンレスなどで形成されているのがより好ましく、これらの中でも、該容器の内部を視認可能であるものが好ましい。
前記容器内における前記バチルス属微生物固定化担体の充填率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、100%であってもよく、100%未満であってもよい。
また、前記容器は、廃棄物の負荷に応じて、複数を並列又は直列に接続しても良い。
前記廃棄物は、前記血栓溶解酵素と接触させることにより分解することができる。
前記血清溶解酵素として、前記バチルス属微生物を含む培養液をそのまま用いる場合は、前記分解工程は、前記バチルス属微生物と、前記廃棄物と、好ましくは前記バチルス属微生物の培養に適した培地とを混合した混合液中で、前記バチルス属微生物から前記血栓溶解酵素を産生させるのと同時に、前記廃棄物を分解してもよい。この方法によれば、操作が簡便であり、短時間で前記廃棄物を処理できる点で好ましい。
また、前記分解工程は、装置を用いて行なわれてもよい。前記装置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、特開2005−262105公報に記載の湿式処理装置などが挙げられる。
前記血栓溶解酵素は、前記分解処理時に、必要に応じて、前記廃棄物の分解に必要な量を適宜追加し、処理液中の酵素濃度を一定にすることが好ましい。
なお、前記廃棄物が易分解性であり、短時間の反応で分解できる場合、前記温度は、前記血栓溶解酵素の初期酵素活性が高い点で、45℃〜70℃が好ましく、50℃〜60℃がより好ましい。
一方、前記廃棄物が難分解性であり、長時間の反応を要する場合、前記温度は、前記血栓溶解酵素が安定である点で、30℃〜50℃が好ましく、40℃〜47℃がより好ましい。
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、精製工程、発酵物調製工程、乾燥工程などが挙げられる。
前記精製工程は、前記血栓溶解酵素を精製する工程である。
前記血栓溶解酵素を精製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記血栓溶解酵素を含有するバチルス属微生物の培養上清などを、疎水性相互作用クロマトグラフィーで分画した後、ゲル濾過クロマトグラフィーで脱塩を行い、密度勾配等電点電気泳動で精製する方法などが挙げられる。
前記発酵物調製工程は、前記血栓溶解酵素を産生するバチルス属微生物と、タンパク質性原料とを混合し、該タンパク質性原料を発酵させた発酵物を得る工程である。前記分解工程において、前記血清溶解酵素は、該発酵物から分離したものを用いてもよい。
前記発酵物を調製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、タンパク質性原料と、前記バチルス属微生物とを混合し、公知の方法で発酵させる方法などが挙げられる。
前記タンパク質性原料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、大豆、小豆、インゲン豆、エンドウ豆、空豆、ウズラ豆、金時豆、落花生等の植物性原料;獣肉、魚肉、鳥肉等の動物性原料などが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
前記発酵の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、10℃〜50℃が好ましく、27℃〜40℃がより好ましい。
前記発酵の時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、20時間〜72時間が好ましく、48時間〜72時間がより好ましい。
前記発酵物を分離する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩析や各種クロマトグラフィーによって分離する方法などが挙げられる。
前記乾燥工程は、前記血栓溶解酵素を乾燥させる工程である。これにより、前記分解工程に用いる血栓溶解酵素を長期間保存することができ、使用時に適当量を適宜使用しやすい点で好ましい。
前記乾燥する方法としては、特に制限はなく、公知の手法により行うことができ、例えば、凍結乾燥、通風乾燥、加熱乾燥、減圧乾燥など通常の方法が利用できる。
また、前記血栓溶解酵素は、凍結乾燥後、目的に応じた溶媒に再融解させたものであってもよい。前記血栓溶解酵素は、凍結乾燥後においても、その酵素活性は安定であり、保存安定性が高い点で有利である。
ここで、乾燥させた血栓溶解酵素としては、例えば、前記バチルス属微生物を含む培養液、前記バチルス属微生物の培養上清、前記精製工程で精製した血栓溶解酵素、前記発酵物調製工程で分離したものなどを乾燥させたものなどが挙げられる。
前記廃棄物の処理方法は、前記廃棄物を、広大な場所を要することなく、簡便で迅速に、かつ完全に処理でき、該処理のための多大な熱エネルギーや電気エネルギーを要することがなく、安価に該廃棄物を減容化できると同時に、処理時の腐敗臭の発生を抑制でき、更に処理後の廃棄物の安全性が高いことから、種々のタンパク質を含む廃棄物の処理に好適に利用可能であり、特に発電所などの臨海産業、漁業分野等で混獲された海産廃棄物の処理、淡水系生物の廃棄物等の水産廃棄物の処理に好適に利用可能である。
前記血栓溶解酵素により減容化された廃棄物は、例えば、排水処理等の公知の処理方法により海洋、河川などにに排出できるレベルにまで処理される。
神奈川県三浦市沖の海洋底泥から、土壌試料を採取し、該土壌試料中の微生物から希釈液列を作製し、該希釈液からプロテアーゼ産生能を有する微生物を選抜した。なお、海底汚泥は、バクテリアコアーサンプラー(株式会社離合社製)を用いて採取した。
採取した前記土壌試料各1gを、滅菌生理的食塩水9mLにそれぞれ添加し、懸濁後、室温で約1時間放置した。次に、固形物が沈澱した上記土壌懸濁生理的食塩水の上清を分取し、新たな前記滅菌生理的食塩水9mLに添加した。これを繰り返して希釈液列を調製した。
調製した希釈液列をそれぞれ100μL用い、下記タンパク質含有寒天培地に塗抹し、30℃にて3日間、静置培養することにより微生物を育成した。前記微生物がプロテアーゼを産生する場合に、該微生物が生育した周囲はタンパク質が溶解し透明な消化円を与える。これにより、該微生物がプロテアーゼ産生能を有すると判断された微生物コロニーを釣菌した。
−タンパク質含有寒天培地の組成(pH8.0)−
[1.5質量%寒天溶液(下層)]
・ディフコ マリンアガー 5.51質量%
[0.8質量%寒天と1.5質量%スキムミルク溶液(上層)]
・ディフコ マリンアガー 0.8質量%
・スキムミルク 1.5質量%
<16S rDNA−Full解析及び分子系統解析>
104−1−3−1株を培地(Nutrient agar、英国ハンプシャー州、Oxoid製)にて、30℃で24時間、好気培養した。
培養した104−1−3−1株らDNA抽出キット(InstaGene Matrix、BIO RAD社製)を用いてDANを抽出し、Prime STAR HS DNA Polymerase(タカラバイオ株式会社製)を用いてPCRを行った。次いで、PCR産物を鋳型とし、プライマーとして、9F、339F、785F、1099F、536R、802R、1242R、及び1510R(BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit、Applied Biosystems社製)を用いて、シークエンス(ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer System、Applied Biosystems社製)を行った。
解析は、解析ソフトウェア(Auto Assembler、Applied Biosystems社製、及び、DNASIS Pro、日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社製)を用いて行った。
また、相同性検索を、細菌基準株データベース(テクノスルガ・ラボ)及び国際塩基配列データベース(GenBank/DDBJ/EMBL)を用いて行った。
また国際塩基配列データベースに対する相同性検索の結果においても、下記表2に示すように104−1−3−1株の16S rDNA塩基配列は、Bacillus subtilis由来の16S rDNAに対し高い相同性を示した。
その結果、図2に示すように、104−1−3−1株の16S rDNAはBacillus subtilisの16S rDNAと系統枝を形成し、Bacillus subtilisに属することが推定された。
104−1−3−1株を培地(ニュートリエントアガー、ベクトンデッキンソン社製)にて30℃で24時間培養した。
培養した104−1−3−1株をグラム染色(フェイバーG、日水製薬株式会社製)し、光学顕微鏡(BX50F4、オリンパス株式会社製)で形態観察及びグラム染色観察を行った。
また、カタラーゼ反応、オキシダーゼ反応、ブドウ糖からの酸/ガス産生、ブドウ糖の酸化/発酵(O/F)等の生理・生化学試験を、API50CH(bioMerieux製)を用いて行った。
下記表4に示すように、104−1−3−1株は好気条件下で生育するグラム陽性桿菌で、細胞は連鎖を示し、芽胞を形成した。芽胞による菌体の膨張は認められなかった。カタラーゼ反応は陽性、オキシダーゼ反応は陰性を示した。
また、下記表5〜6に示すようにAPI試験では、L−アラビノース、リボース、及びグルコース等を酸化し、エリスリトール、D−アラビノース及びL−キシロース等を酸化しなかった。更に、下記表4に示すように、嫌気条件下では生育せず、50℃及び10%NaCl含有培地で生育した。カゼインを加水分解し、でんぷんを加水分解しなかった。
104−1−3−1株を2.5質量%大豆脱脂成分(製品名:トーストソーヤ、日清オイリオ株式会社製)、6.0質量%スクロース(和光純薬工業株式会社製)、0.1質量%リン酸水素カリウム(和光純薬工業株式会社製)、及び0.2%炭酸カルシウム(和光純薬工業株式会社製)を含むpH6.2の液体培地に添加し、27℃、30℃、35℃、及び40℃でそれぞれ振盪培養した。培養開始から、0時間、24時間、41時間、及び65時間経過後に104−1−3−1株の菌体を遠心分離して除去し、菌体外に産生されたプロテアーゼ含有培養上清のプロテアーゼ活性を、C.E.McDonald and Lora L.Chen, “The Lowry Modification of the Folin Reagent for Determination of Proteinase Activity”, Analytical Biochemistry, (1965), 10, 175−177.に記載の方法を改変した方法、即ち、下記の方法により定量した。
また、盲検値(ブランク)は、前記104−1−3−1株の培養上清のプロテアーゼ活性測定において、前記104−1−3−1株の培養上清を添加せず、40℃に保温した2質量%ミルクカゼイン溶液5mLに前記タンパク質沈澱剤5mLを添加して充分に混合した後、前記液体培地(pH6.2)を1mL添加したこと以外は、前記104−1−3−1株の培養上清のプロテアーゼ活性測定と同様の操作を行い、吸光値を測定した。この盲検値をBとした。
前記104−1−3−1株の培養上清の吸光値(T)と盲検値(B)とから、下記式1によりプロテアーゼ活性を算出した。このように算出される活性の単位を「FLV」とする(C.E.McDonald and Lora L.Chen, “The Lowry Modification of the Folin Reagent for Determination of Proteinase Activity”, Analytical Biochemistry, (1965), 10, 175−177.参照)。
プロテアーゼ活性(FLV)=[(T−B)×66.7+2]×培養上清希釈倍率 ・・・(式1)
図3の結果から、104−1−3−1株は30℃で培養したときに、最もプロテアーゼが多く産生され、したがって、最も高いプロテアーゼ活性を示すことが観察された。また、培養時間が長いほど高いプロテアーゼ活性が認められた。
104−1−3−1株を試験例3と同じ液体培地(pH6.2)に添加し、30℃で72時間培養後、菌体を遠心分離して、プロテアーゼ含有培養上清を得た。この104−1−3−1株の培養上清を、40℃、43℃、47℃、50℃、及び53℃で、0時間、1時間、2時間、及び3時間それぞれ加熱し、急冷した。
試験例3において、104−1−3−1株の培養上清を、試験例3で調製したものに代えて、試験例4で調製した各培養上清を用い、ミルクカゼインと培養上清との反応温度を40℃に変えて、前記培養上清の加熱温度に対応した温度(40℃、43℃、47℃、50℃、及び53℃)にしたこと以外は、実施例2と同様の方法でプロテアーゼ活性を測定した。
104−1−3−1株を試験例3と同じ液体培地(pH6.2)に添加し、30℃で72時間培養後、菌体を遠心分離して、プロテアーゼ含有培養上清を得た。この前記104−1−3−1株の培養上清に、等量の緩衝液を混合してpHを3、4、5、6、7、8、9、10、11、及び12にそれぞれ調整(pH3〜6は、50mM クエン酸−リン酸緩衝液、pH7〜9は、50mM トリス塩酸緩衝液、pH10〜12は、50mM グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液で調整)した後、10℃で24時間保温した後、溶液のpHを7に調整した。
試験例3において、104−1−3−1株の培養上清を、試験例3で調製したものに代えて、試験例5で調製した各培養上清を用いたこと以外は、実施例2と同様の方法でプロテアーゼ活性を測定した。
104−1−3−1株を試験例3と同じ液体培地(pH6.2)に添加し、30℃で72時間培養後、菌体を遠心分離して、プロテアーゼ含有培養上清を得た。この104−1−3−1株の培養上清8Lを用い、バーチス社製の凍結乾燥機を用いて凍結乾燥した。凍結乾燥粉末を粉砕後、0.1mgの粉末を5mLのリン酸緩衝液(50mM、pH7)に溶解して一昼夜4℃で保存した。この粉末溶解液のプロテアーゼ活性を、試験例3と同様の方法で測定し、凍結乾燥前のプロテアーゼ活性と比較した。プロテアーゼ活性は、培養上清10Lあたりの活性として換算した。
また、セリン血栓溶解酵素であるサチライシンA(EC3.4.21.14、エムピーバイオメディカル社製(USA))、セリン血栓溶解酵素であるトリプシン(EC3.4.21.4、和光純薬工業株式会社製)、システイン血栓溶解酵素であるフィチン(EC3.4.22.3、エムピーバイオメディカル社製(USA))、及びメタロ血栓溶解酵素であるV型コラゲナーゼ(EC3.4.24.3、和光純薬工業株式会社製)を用いた。なお、これらの血栓溶解酵素無添加を対照区として用いた。
前記粗精製プロテアーゼ溶液の酵素活性(FLV)を試験例3と同様の方法を測定したところ、酵素活性(FLV)は111であった。
前記粗精製プロテアーゼ溶液の酵素活性(FLV=111)と、前記各種プロテアーゼの酵素活性とが同一の条件となるようにするため、カゼインに対する各種プロテアーゼの酵素活性を比較検討した。
試験例3において、プロテアーゼとして前記各種プロテアーゼを下記に示す濃度で用い、試験例3と同様の方法で、酵素活性の測定及び評価を行った。下記に示すように、各種プロテアーゼの段階希釈液を調製し、それぞれのプロテアーゼ濃度における酵素活性の検量線を作成した。これによりそれぞれの濃度におけるカゼインを基質とした酵素活性を測定した検量線から、任意の酵素活性を示すときの各種プロテアーゼ濃度が計算によって求められる。検量線を図7A〜Dに示す。
[酵素の種類及び濃度]
・サチライシンA:0.005mg/mL、0.01mg/mL、0.015mg/mL、0.02mg/mL、0.025mg/mL、0.03mg/mL
・トリプシン:0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL
・V型コラゲナーゼ:0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL
・フィチン:0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.2mg/mL
フィブリン含有固形培地は下記組成に従い、以下の方法で調製した。下層を9cmプレートに分注し、固化した。次いで、10ユニットのトロンビン(伊藤ライフサイエンス株式会社製)、0.02M塩化カルシウム、0.05Mホウ砂緩衝液(pH8.5)1mLを前記プレートに分注し、更に溶解したアガロース溶液、及びフィブリノゲン溶液を同時に分注して、前記固形培地を調製した。
−フィブリン含有固形培地の組成−
[1.5質量%寒天(下層)]
・ディフコ 寒天(ディフコ社製) 1.5質量%
[2質量%アガロース、及び0.6質量%フィブリン(上層)]
・アガロース(蒸留水に溶解) 2.0質量%
・フィブリノゲン(0.05Mホウ砂緩衝液(pH8.5)に溶解、伊藤ライフサイエンス株式会社製) 0.6質量%
前記フィブリン含有固形培地の上層の上に直径8mm(8mm厚、ペーパーディスク抗生物質検定用、東洋濾紙株式会社製)を置き、プロテアーゼ活性(FLV)が111となるように調製した各種プロテアーゼ液80μLを浸含させ、37℃で一昼夜静置後、消化円(繊維素の溶解円)直径を測定した。
なお、対象区のトリプシン(図8の「T」)では消化円が観察されたが、サチライシンA(図8の「S」)、V型コラゲナーゼ(図8の「C」)、フィチン(図8の「F」)では、全く消化円は認められなかった。
したがって、104−1−3−1株由来の血栓溶解酵素は、フィブリンのような難分解性タンパク質の分解において固有の基質分解性を有することがわかった。
前記104−1−3−1株の培養上清中の血栓溶解酵素は、以下の方法により精製した。最初に、104−1−3−1株を試験例3と同じ液体培地(pH6.2)に添加し、30℃で72時間培養後、菌体を遠心分離して、血栓溶解酵素含有培養上清を得た。この104−1−3−1株の培養上清から血栓溶解酵素含有画分を疎水性相互作用クロマトグラフィーで分画し、次にゲル濾過クロマトグラフィーで脱塩を行った。脱塩した血栓溶解酵素含有画分は密度勾配等電点電気泳動で精製した。
疎水性相互作用クロマトグラフィーは、以下の条件下で行った。
カラム:プレパックカラム(Hi−Trap 16/10 Phenyl FF high、バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社製)
装置:BioLogic DuoFlowシステム(バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社製)
溶媒:A液 30容量% 2−プロパノール+0.05M リン酸緩衝液(pH7) B液 1M 硫酸アンモニウム+0.05M リン酸緩衝液(pH7)
添加量:1mL
流速:2mL/分間
試験例3において、試験例3で調製した104−1−3−1株の培養上清に代えて、前記画分を用いたこと以外は、実施例2と同様の方法で血栓溶解酵素活性を測定した。
その結果、図9中矢印で示すピーク画分(画分39〜画分43)において、血栓溶解酵素活性が確認された。
前記疎水性相互作用クロマトグラフィーで、血栓溶解酵素活性が確認された画分は、PD−10カラム(GEヘルスケア・ジャパン株式会社製)で脱塩し、以下に示す密度勾配等電点電気泳動で精製した。
両性担体(40%濃度)は、Bio−Lyte(3/10及び7/9)(バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社製)を用い、グリセリン密度勾配等電点電気泳動装置(カラム容量90mL、N−1720型、日本エイドー株式会社製)で血栓溶解酵素活性画分の分画を行った。電圧は600Vに設定し、72時間電気泳動を行った。50質量%ショ糖で密度勾配をかけた。
試験例3において、試験例3で調製した104−1−3−1株の培養上清に代えて、前記密度勾配等電点電気泳動の各画分を用いたこと以外は、実施例2と同様の方法で血栓溶解酵素活性を測定した。また、各画分のpHの測定を行った。
前記画分(画分35)のタンパク質成分50ngを、ジチオエリトリトールを含むレムリ緩衝液(0.125M Tris−HCl[pH6.8]、10%グリセロール、2%ドデシル硫酸ナトリウム、0.1Mジチオエリトリトール、0.02%ブロモフェノールブルー)13μLに混和して95℃にて3分間処理した後、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)存在下にてSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ゲルのアクリルアミド濃度は、濃縮に4質量%、分離に10質量%で行い、それぞれ10mA、25mAの定電流条件下で泳動した。泳動後のポリアクリルアミドゲルは、固定液(40容量%エタノール+10容量%酢酸)で固定した後、Flamingoゲルステイン(バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社製)により蛍光染色し、Ultravioletトランスイルミネーター(フナコシ株式会社製)を用いてUV励起下にて観察した。
試験例8における電気泳動後のポリアクリルアミドゲル中の104−1−3−1株由来血栓溶解酵素の単一バンドを切り出し、超純水にて洗浄した。ゲル中の酵素は還元アルキル化処理の後、トリプシンを用いて37℃にて消化し、ペプチド溶液を調製した。
[逆相クロマトグラフィー]
カラム:Magic C18AQ(粒子径3μm、孔径200Å、カラム内径200μm、カラム長さ50mm:ミクローム・バイオリソース社製)
オートサンプラー:CTC−HTS PAL(エーエムアール株式会社製)
ポンプ:Paradigm MS4システム(エーエムアール株式会社製)
溶媒:A液 2容量%アセトニトリル/98容量%超純水(0.1容量%ギ酸を含む) B液 90容量%アセトニトリル/10容量%超純水(0.1容量%ギ酸を含む)
流速:2μL/分間
濃度勾配:95容量%A液+5容量%B液から55容量%A液+45容量%B液の条件で20分間かけて、溶出した。
前記104−1−3−1株からISOPLANTキット(株式会社ニッポンジーン製)を用いて、ゲノムDNAを抽出した。104−1−3−1株由来血栓溶解酵素の遺伝子を増幅させるため、NCBIのGenBank内に登録されている複数の近縁菌種に由来するサチライシン遺伝子(アクセッション番号:NC_000964、S51909、D00264、M64743)の上下流の塩基配列から、以下のPCRプライマーを設計した。即ち、サチライシン遺伝子の上流にある遺伝子内の20bpにハイブリダイズする下記配列番号:1で表されるプライマー配列と、下流にある遺伝子内の20bpにハイブリダイズする下記配列番号:2で表されるプライマー配列とを増幅用プライマーとした。KOD DNAポリメラーゼ(東洋紡績株式会社製)を用いたPCRの条件としては、94℃で2分間、続いて、94℃で15秒間の変性、52℃で30秒間のアニーリング及び68℃で2分間の伸長を30サイクル行った。期待された大きさのPCR産物(〜1,800bp)を、pGEM−T Easyベクター(プロメガ株式会社製)にクローニングした。
5’−AGCCATCCGTCGATCATGGA−3’ (配列番号:1)
5’−TAAAATTCCCGATATTGGTT−3’ (配列番号:2)
104−1−3−1株を試験例3と同じ液体培地(pH6.2)に添加し、30℃で72時間培養後、菌体を遠心分離して、ナットウキナーゼ含有培養上清(pH7.2)を得た。この培養上清中のナットウキナーゼの酵素活性を、試験例3と同様の方法で測定したところ、酵素活性(FLV)は6,500であった。
クラゲは、京都府舞鶴市の定置網で捕獲したエチゼンクラゲ(Nemopilema nomurai Kishinouye)個体を使用した。エチゼンクラゲをドライアイスで凍結し輸送後、−20℃で保管した。分解試験時には流水で解凍し、5cm〜10cm角に切断した。
ホットスターラー上にビーカーを設置し、ビーカー内に2Lの前記ナットウキナーゼ含有培養上清を入れ、50℃に加温し、エチゼンクラゲ300gを入れた1mmメッシュ籠をビーカー内に入れ、常時低速(80rpm)で攪拌しながら分解試験を行った。エチゼンクラゲを培養上清中に入れてから、5分間、10分間、30分間、及び60分間後に、それぞれエチゼンクラゲの質量を測定し、下記式2により残渣率を求めた。各時間エチゼンクラゲと培養上清とを反応させたサンプルについて、それぞれ4系統で行い、平均と標準偏差を求めた(以下、「試験区」と称することがある。)。
対照区としては、50℃に加温した水道水を用いた。試験区においてエチゼンクラゲ分解に供した培養上清は淡水であるため、対照区も同様に海水を用いず淡水(水道水)を用いた。なお、エチゼンクラゲ分解試験は、それぞれ同一条件で3回行い、再現性を確認した。
残渣率(%)={(分解前クラゲ質量−分解後クラゲ質量)/分解前クラゲ質量}×100 ・・・(式2)
また、エチゼンクラゲ個体の皮の部分は分解されにくく、分解試験開始後30分間からは分解されにくい皮状の部分が残存したため、残渣率は低かった。しかし、その他の部分については、開始後約30分以内に完全に分解され、溶解液となった。
以上の結果から、クラゲをナットウキナーゼにより分解することにより、陸揚げされて産業廃棄物となっているクラゲ個体を最小限のエネルギーで短時間に分解できることがわかった。
−完全個体の分解−
前記ナットウキナーゼ含有培養上清100mLと、リン酸カリウム緩衝液(50mM、pH7)100mLとを300mL容ビーカーに混合し、これに新鮮なミズクラゲ(Aurelia aurita、傘径:約14cm〜17cm)3個体(完全個体)をそれぞれ別のビーカーに入れて30℃で静置し、クラゲ形態の消失を目視観察した。
その結果、いずれの個体も約2時間(105分間±8分間)でクラゲは完全に分解され、液状となった。なお、すべてのミズクラゲ分解試験は、それぞれ同一条件で3回行い、再現性を確認した。
前記ミズクラゲ完全個体の分解において、ミズクラゲの完全個体に代えて、ミズクラゲを約3cm角に裁断したもの100gを使用したこと以外は、前記ミズクラゲ完全個体の分解と同一条件で分解試験を行った。
その結果、裁断したミズクラゲは、約65分間で完全に分解され液状となった。
前記ミズクラゲ完全個体の分解において、前記ナットウキナーゼ含有培養上清とリン酸カリウム緩衝液(50mM、pH7)とを混合した溶液に代えて、前記ナットウキナーゼ含有培養上清とリン酸カリウム緩衝液(50mM、pH7)とを混合した溶液を、121℃、30分間のオートクレーブ処理によりナットウキナーゼを失活させた混合溶液を使用したこと以外は、前記ミズクラゲ完全個体の分解と同一条件で分解試験を行った。
その結果、前記対照区ではミズクラゲの分解は観察されなかった。
104−1−3−1株を試験例3と同じ液体培地(pH6.2)に添加し、30℃で72時間培養後、菌体を遠心分離して、ナットウキナーゼ含有培養上清(pH7.2)を得た。この培養上清中のナットウキナーゼの酵素活性(FLV)を、試験例3と同様の方法で測定したところ5,000であった。
クラゲは、前記エチゼンクラゲと同様に身が厚くて硬い北方性のアカクラゲ(Chrysaora hysocella)を捕獲後、ドライアイスで凍結し輸送後、−20℃で保管した。分解試験時には流水で解凍し、5cm〜10cm角に切断した。
これに対し、培養上清濃度が1.0体積%の場合、試験開始後1時間程でほとんどの北方性アカクラゲが溶解し、2時間後には完全に溶解した。
試験例11に記載した3cm角に切断したミズクラゲ100gを500mL容ビーカーに入れ、50℃に保温した人工海水(ダイゴ人工海水SP、日本製薬株式会社製)を300mL入れた。これに試験例11で調製したナットウキナーゼ含有培養上清の酵素活性(FLV)が100になるように混合し、攪拌しながら分解試験を行った。ミズクラゲの分解時の温度は50℃、pH8とした。所定時間ごとにミズクラゲを取り出してその質量変化を測定し、試験例11の式2より残渣率を算出した(以下、「試験区」と称することがある。)。
また、対照区としては、ナットウキナーゼ含有培養上清に代えて、50℃に保温した人工海水を用いた。なお、ミズクラゲ分解試験は、それぞれ同一条件で3回行い、再現性を確認した。
これに対し、ナットウキナーゼを添加した試験区は、15分間以内で完全にミズクラゲが溶解され液状となった。
試験例11において、ナットウキナーゼ含有培養上清を用いて分解したエチゼンクラゲ分解液の毒性をJIS K0102(2003)「工場排水試験方法」(日本規格協会 2003)魚類を用いた急性毒性試験に従い検討を行った。発電所から排出される排水の排水基準値は、事業所によっても異なるが、COD値(Chemical Oxygen Demand;化学的酸素要求量)として15mg/L以下である。
ナットウキナーゼ含有分解処理後の分解液のCOD値を日本工業規格(JIS)に準拠したポータブル吸光光度計(DR−2400、HACH社製)により測定したところ、1,920mg/Lであった。これを海水で、COD値15mg/L、30mg/L、45mg/L、60mg/L、及び75mg/Lにそれぞれ希釈して試験液とした。供試生物としては、ヒメダカ(Oryzias latipes)を用いた。対照は、エチゼンクラゲ分解処理液を混合しない海水とした。
<酵素溶液の調製> ナットウキナーゼは、試験例6において、凍結乾燥前に、ナットウキナーゼ含有培養上清をリン酸カリウム緩衝液(50mM、pH7)で透析後、試験例6と同様の方法で凍結乾燥し、得られた粉末を粉砕した粗精製ナットウキナーゼ0.1mgを、リン酸緩衝液(50mM、pH7)5mLに溶解したものを用いた。このナットウキナーゼ溶液の酵素活性(FLV)を試験例3と同様の方法を測定したところ、14,952であった。
その他のプロテアーゼとしては、試験例7で使用した、サチライシンA、トリプシン、フィチン、及びV型コラゲナーゼを用いた。なお、これらのプロテアーゼを添加しなかったものを対照区とした。
前記ナットウキナーゼの活性と、前記各種プロテアーゼの活性とが同一の条件となるようにするため、試験例15と同様の方法で、検量線法により前記各種プロテアーゼの活性(FLV)が100となるように調製した。
これらの結果より、ナットウキナーゼは、プロテアーゼの中でも、クラゲの分解に優れた活性を示すことが確認された。
アンドンクラゲ(Carybdea rastoni Haacke)は、神奈川県の海岸で採取し、採取後直ちにビニール袋に入れドライアイスで凍結後持ち帰り、−80℃下で実験に供するまで保管した。アンドンクラゲ毒素はクラゲ触手部分を解凍後、プラスチック容器に入れ、氷冷下で超音波破壊を行い、これをアンドンクラゲ毒素液(以下、「CrTXs」と称することがある。)とした。
なお、以下の試験において使用した容器は、毒素液のガラス容器への不可逆的な吸着を防止するため、全てプラスチック容器を使用した。
ヒツジ赤血球(日本生物材料センター製)8μLを1mLのPBS(+)(カルシウム、マグネシウム含有リン酸緩衝食塩水)に懸濁し、ここへ、任意の量のアンドンクラゲ毒素液(CrTXs)を添加して混合した。これを室温で4時間放置した後、3,000×gで2分間遠心分離した。この上清を550nmの波長で吸光値を測定して「試験値」とした。
また、8μLのヒツジ赤血球を100倍に希釈した溶解緩衝液(6質量%ドデシル硫酸ナトリウム、7質量%トリトンX−100溶液)と混合し、これを室温で4時間放置した後、3,000×gで2分間遠心分離した。この上清を550nmの波長で吸光値を測定したときの吸光値を溶血率100%とし、これを「対照値」とした。
前記方法で測定した試験値と、対照値から、下記式3により溶血率(%)を評価した。
溶血率(%)=(試験値/対照値)×100 ・・・(式3)
ナットウキナーゼとしては、試験例15で調製したナットウキナーゼを用いた。試験例2において、培養上清に代えて、試験例15で調製したナットウキナーゼを用いたこと以外は、試験例3と同様の方法で酵素活性(FLV)を算出したところ5,563であった。このナットウキナーゼを、PBS(+)(カルシウム、マグネシウム含有リン酸緩衝食塩水)で5体積%に希釈して、以下の試験に用いた。
この結果から、5体積%、即ち酵素活性(FLV)が278以下においてはナットウキナーゼが、ヒツジ赤血球の溶血を起こさないということがわかった。
前記溶血率の算出方法と同様の方法で、アンドンクラゲ毒素の赤血球溶血に対する影響について検討した。このとき、アンドンクラゲ毒素液(CrTXs)は、1μL、2μL、5μL、10μL、50μL、及び100μLのいずれかの容量となるように添加した。
また、顕微鏡観察下においても赤血球の形態は認められず、アンドンクラゲ毒素により溶血したものと考えられた。ただし、アンドンクラゲ毒素液(CrTXs)が0.1体積%量(1μL添加)の場合、他の試験区に比べて完全な溶血までに時間を要した。
次に、アンドンクラゲ毒素の熱安定性について前記溶血率の算出方法と同様の方法を用いて検討した。
試験に用いたアンドンクラゲ毒素液としては、前記アンドンクラゲ毒素液(CrTXs)を、室温(25℃)で30分間放置、37℃で30分間、及び100℃で5分間のいずれかの条件においたものを用い、それぞれ0.5体積%(5μL)又は1.0体積%(10μL)となるように添加した。
アンドンクラゲ毒素液(CrTXs)を、室温又は37℃で30分間放置した試験区においては溶血率が90%以上を示し、これらの温度条件下においては30分間の加熱でアンドンクラゲ毒素は失活しないことがわかった。
一方、アンドンクラゲ毒素液(CrTXs)を100℃で5分間加熱した試験区においては、アンドンクラゲ毒素液(CrTXs)をいずれの容量で添加した場合も、その溶血率は11.0%以下を示し、アンドンクラゲ毒素が加熱により変性し失活したことが示唆された。
前記溶血率の算出方法において、アンドンクラゲ毒素液(CrTXs)を0.5体積%(5μL)となるように添加し、更に、前記ナットウキナーゼを0.1体積%(1μL)、0.5体積%(5μL)、1.0体積%(10μL)、及び2.0体積%(20μL)のいずれかの容量で混合し、37℃で30分間反応させた。
対照区としては、アンドンクラゲ毒素液(CrTXs)及びナットウキナーゼを添加しないものを用いた。
試験に用いるプロテアーゼとして、ナットウキナーゼ、サチライシンA、トリプシン、フィチン、及びV型コラゲナーゼを、試験例15と同様の方法で、検量線法によりそれぞれ酵素活性(FLV)が111となるように調製した。
前記溶血率の算出方法において、アンドンクラゲ毒素液(CrTXs)を2.0体積%となるように添加し、更に、前記各種プロテアーゼを、前記検量から、酵素活性(FLV)が111となるように調製し、37℃で30分間反応させた。
対照区としては、アンドンクラゲ毒素液(CrTXs)及びナットウキナーゼを添加しないものを用いた。
このことからナットウキナーゼは、カゼイン分解を指標とした同値の酵素活性の条件下において、よりアンドンクラゲ毒素を分解する能力が高いことがわかった。
前記廃棄物の処理方法は、前記廃棄物を、広大な場所を要することなく、簡便で迅速に、かつ完全に処理でき、該処理のための多大な熱エネルギーや電気エネルギーを要することがなく、安価に該廃棄物を減容化できると同時に、処理時の腐敗臭の発生を抑制でき、更に処理後の廃棄物の安全性が高いことから、種々のタンパク質を含む廃棄物の処理に好適に利用可能であり、特に発電所などの臨海産業、漁業分野等で混獲された海産廃棄物の処理、淡水系生物の廃棄物等の水産廃棄物の処理に好適に利用可能である。
20 仕切槽
30 サイフォン管
40 送液ポンプ
50 循環・加温槽
60 仕切弁
70 仕切弁
80 加温管
90 ヒーター
100 オゾン発生装置
110 仕切弁
120 逆止弁
130 仕切弁
140 仕切弁
150 活性炭処理筒
160 クラゲ分解処理水
170 サイフォン管通過処理液出口
180 活性炭処理筒通過清浄排水
Claims (7)
- Bacillus subtilis(バチルス・サチルス) 104−1−3−1株(受託番号:NITE P−680)及びその誘導菌株のいずれかであり、廃棄物を分解する血栓溶解酵素を産生することを特徴とするバチルス属微生物。
- 請求項1に記載のバチルス属微生物により産生されることを特徴とする血栓溶解酵素。
- ナットウキナーゼである請求項2に記載の血栓溶解酵素。
- 請求項2から3のいずれかに記載の血栓溶解酵素により廃棄物を分解する分解工程を含むことを特徴とする廃棄物の処理方法。
- 血栓溶解酵素が、請求項1に記載のバチルス属微生物とタンパク質性原料とを混合し、前記タンパク質性原料を前記バチルス属微生物により発酵させた発酵物から分離して得られた血栓溶解酵素である請求項4に記載の廃棄物の処理方法。
- 分解工程が、請求項1に記載のバチルス属微生物と廃棄物とを混合した混合物中で行なわれる請求項4に記載の廃棄物の処理方法。
- 廃棄物が、クラゲ類、魚類、プランクトン、及び毒素の少なくともいずれかである請求項4から6のいずれかに記載の廃棄物の処理方法。
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JP2007189906A (ja) * | 2006-01-17 | 2007-08-02 | Ikeda Shokken Kk | ペプチダーゼ及びそれを使用した方法 |
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