CN117343881B - 一株枯草芽孢杆菌ds5及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株枯草芽孢杆菌DS5及其应用，属于微生物技术领域。所述枯草芽孢杆菌DS5分离自烟台长岛网箱养殖区底泥，具有降解硫代硫酸钠、氮盐、磷盐和高锰酸盐的能力，对海水鱼类和底栖生物相对安全，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏编号为CGMCC NO.27267，保藏日期为2023年05月05日，保藏地址为中国北京。该菌可用于网箱养殖区底泥中硫化物和养殖水体中总氮、总磷、高锰酸盐的去除。
Description
技术领域
本发明涉及一株枯草芽孢杆菌及其应用，具体涉及一株具有降解硫代硫酸钠、氮盐、磷盐和高锰酸盐能力的枯草芽孢杆菌DS5及其在去除网箱养殖区底泥中硫化物和养殖水体中总氮、总磷、高锰酸盐中的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
枯草芽孢杆菌是一类能产芽孢的好养型细菌，具有耐高温、耐酸碱、耐胆盐等优点，能够提高水生生物的生长、消化和免疫性能，改善水生生物肠道菌群结构，降低养殖水体氨氮、亚硝酸盐等有益作用，在医药、畜牧、环境、农作物及水产养殖等领域被广泛应用，成为一种公认的绿色添加剂。
目前，已有开发枯草芽孢杆菌开展重金属污染土壤修复、养殖生态池塘修复等方面的报道，但在深海养殖海域开展养殖底泥污染修复方面仍为空白。
上述有益菌多用于养殖生产中生物肠道稳态和养殖水体稳态；在环境修复方面，也有使用上述微生物开展重金属污染修复、石油泄漏修复方面的相关报道。但目前网箱养殖海域养殖底泥污染修复技术仍为空白。
发明内容
为解决现有技术的不足，鉴于微生物修复菌株的土著特异性，本发明的目的在于：提供一株具有降解硫代硫酸钠、氮盐、磷盐和高锰酸盐能力的有益微生物——枯草芽孢杆菌DS5，该菌可用于网箱养殖区底泥中硫化物和养殖水体中总氮、总磷、高锰酸盐的去除。
为了实现上述目标，本发明采用如下技术方案：
一株枯草芽孢杆菌DS5，所述枯草芽孢杆菌DS5分离自烟台长岛网箱养殖区底泥，具有降解硫代硫酸钠、氮盐、磷盐和高锰酸盐的能力，对海水鱼类和底栖生物相对安全，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏编号为CGMCC No.27267，保藏日期为2023年05月05日，保藏地址为中国北京。该菌可用于网箱养殖区底泥中硫化物和养殖水体中总氮、总磷、高锰酸盐的去除。
本发明的有益之处在于：
（1）本发明筛选得到的枯草芽孢杆菌DS5，具有降解硫代硫酸钠、氮盐、磷盐和高锰酸盐的能力；
（2）本发明筛选得到的枯草芽孢杆菌DS5，分离自网箱养殖区底泥，耐压力和耐盐程度高，取自养殖海区，应用于底泥污染指标降解效果更佳；
（3）本发明筛选得到的枯草芽孢杆菌DS5，对许氏平鲉等海水鱼类和刺参等底栖生物是相对安全的，为养殖海区底泥修复应用提供了可能性；
（4）本发明筛选得到的枯草芽孢杆菌DS5，能够用于网箱养殖区底泥中硫化物和养殖水体中总氮、总磷、高锰酸盐的去除，实现养殖环境的优化和改善，提高养殖效率，降低养殖对象疾病的发生，促进养殖产业绿色健康发展。
附图说明
图1是枯草芽孢杆菌DS5在LB固体培养基上的菌落形态图；
图2是枯草芽孢杆菌DS5的革兰氏染色镜检图；
图3是枯草芽孢杆菌DS5的系统发育树分析图；
图4是枯草芽孢杆菌DS5对底泥中硫代硫酸钠的降解效果图；
图5是枯草芽孢杆菌DS5对水体中总氮、总磷和高锰酸盐的降解效果图；
图6是枯草芽孢杆菌DS5生长的温度耐受性测试结果图；
图7是枯草芽孢杆菌DS5生长的pH耐受性测试结果图；
图8是枯草芽孢杆菌DS5生长的盐度耐受性测试结果图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一、菌株的获取
2021年10月，取烟台长岛海域网箱养殖区（水深20m）底泥，在无菌条件下去除底泥中的贝类碎片以及底栖生物并震荡破碎大型结块，之后按照20%的接种量将处理过的混匀的底泥接种至富集培养基中，30℃、120r/min培养，每24h监测培养基在600nm处的光密度值（OD600nm）与pH值，当OD600nm高于1.0或pH值低于3.0时，将培养基以20%的接种量转接到新配制的富集培养基中。培养液转接6次后，将富集培养液按10-2、10-3、10-4、10-5倍浓度稀释，分别取200μL菌液均匀涂布至分离纯化固体培养基上，30℃条件下培养。待分离纯化固体培养基上长出菌落后，挑取生长情况理想的单菌落重复划线培养3次，挑取单菌落30℃扩繁后保种于终浓度为15%的甘油中，置于-80℃超低温冰箱中保存。通过分离纯化共获得19株细菌。
富集培养基的配方为：氯化铵1.0g/L，乙酸钠3.0g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，氯化镁0.5g/L，氯化钠30.0g/L，酵母浸粉0.5g/L，硫代硫酸钠16.0g/L，调pH7.0-7.2。
分离纯化固体培养基的配方为：氯化铵1.0g/L，乙酸钠3.0g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，氯化镁0.5g/L，氯化钠30.0g/L，酵母浸粉0.5g/L，硫代硫酸钠16.0g/L，琼脂粉15.0g/L，调pH7.0-7.2。
二、硫氧化菌的筛选及其营养盐降解功能的分析
1、硫氧化菌的筛选
将分离纯化得到的19株细菌按5%的体积比接种到富集培养基中，30℃、120r/min振荡培养48h，培养后依次向培养液中滴入数滴二硫化碳、六氢吡啶（C5H11N），观察是否有红色络合物产生，向平行实验组的培养液中滴入数滴浓度为0.25mol/L的BaCl2溶液，通过观察是否有白色沉淀产生筛选硫氧化菌，最终筛选出2株硫氧化菌，分别记为DS2和DS5。
2、分析硫氧化菌DS5降解营养盐的功能
通过碘量滴定法对菌株DS5的硫代硫酸钠降解效率进行分析，通过联合消化法对菌株DS5降解总氮、总磷的能力进行测定，通过碱性高锰酸钾法对菌株DS5降解高锰酸盐的能力进行分析。
结果发现：菌株DS5对硫代硫酸钠的降解率为11.28%（图4），对总氮的降解率为17.34%（图5），对总磷的降解率为64.73%（图5），对高锰酸盐的降解率为69.51%（图5）。
三、菌株DS5的形态学观察、生理生化特征分析和分子生物学鉴定
1、形态学观察
将菌株DS5接种到LB固体培养基上，30℃培养24h后观察细菌菌落形态、颜色等，并对菌株进行革兰氏染色。
结果显示：菌株DS5在LB固体培养基上形成灰白色、不透明、表面皱褶、边缘锯齿状、中间有乳白色突起的圆形菌落，在光学显微镜下呈杆状（图1）；革兰氏染色为阳性（紫色），产芽孢（图2）。
2、生理生化特征分析
采用HBI芽孢杆菌生化鉴定条对菌株DS5进行生理生化鉴定，具体参照《常见细菌系统鉴定手册》进行。
结果显示：菌株DS5的V-P反应呈阳性；能够分别在7％NaCl、pH5.7环境中生长；可以还原硝酸盐、水解淀粉，不能消解柠檬酸盐、D-木糖、丙酸盐、L-阿拉伯糖、D-甘露醇等；能够使明胶液化，可以厌氧生长。
3、分子生物学鉴定
采用常规细菌总DNA提取方法抽取菌株DS5的DNA并扩增其16S rDNA序列，正向引物为8F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’），反向引物为1492R（5’GGCTACCTTGTTACGACTT-3’）。PCR扩增体系为20μL，其中，正向引物（10μM）1μL，反向引物（10μM）1μL，2×Taq PCR 预混物10μL，细菌DNA 1μL，ddH2O 7μL。取扩增产物2μL经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后送至上海欧易生物医学科技有限公司进行测序。测序结果通过NCBI网站BLAST检索分析，之后与GenBank数据库进行同源性分析，并利用MEGA7.0软件构建系统发育树。
经比对分析，菌株DS5与Bacillus subtilis亲缘关系较近（图3），因此将菌株DS5命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。
四、菌株DS5生长耐受性测试
1、菌株DS5生长的温度耐受性测试
取50μL培养至指数期的DS5菌液接种于 LB液体培养基中，分别置于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃条件下培养24h，使用酶标仪测定实验初始时和终止时培养基在600nm处的光密度值，菌株生长量以实验终止时培养基在600nm处的光密度值与实验初始时培养基在600nm处的光密度值的差值表示，同时设置不接菌的空白对照组，每个实验组设3个平行。
菌株生长量的测定结果见图6，图中不同字母标注表示不同生长温度下菌株生长差异显著（P＜0.05），即a/b/c/d/e/f不同字母标注的实验组相互之间具有显著性差异,同一字母标注的实验组相互之间无显著性差异。结果显示：菌株DS5在10-50℃均能生长，最适温度为25℃。
2、菌株DS5生长的pH耐受性测试
取50μL培养至指数期的DS5菌液分别接种于pH值为3、4、5、6、7、8、9、10、11的LB液体培养基中，30℃培养24h，使用酶标仪测定菌株生长量，同时设置不接菌的空白对照组，每个实验组设3个平行。
菌株生长量的测定结果见图7，图中不同字母标注表示不同pH下菌株生长差异显著（P＜0.05），即a/b/c/d不同字母标注的实验组相互之间具有显著性差异,同一字母标注的实验组相互之间无显著性差异。结果显示：菌株DS5在pH3-11的LB液体培养基中均能生长。
3、菌株DS5生长的盐度耐受性测试
取50μL培养至指数期的DS5菌液分别接种于NaCl含量（g/L）为0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%的LB液体培养基中，30℃培养24h，使用酶标仪测定菌株生长量，同时设置不接菌的空白对照组，每个实验组设3个平行。
菌株生长量的测定结果见图8，图中不同字母标注表示不同NaCl含量下菌株生长差异显著（P＜0.05），即a/b/c/d不同字母标注的实验组相互之间具有显著性差异,同一字母标注的实验组相互之间无显著性差异。结果显示：菌株DS5在NaCl浓度（g/L）为0-10%的LB液体培养基中均能生长。
综上，在菌株DS5生长耐受性测试中，菌株DS5在10-50℃、pH3-11、NaCl浓度（g/L）0-10%中均能生长，具有适温范围广、耐盐耐pH能力强，耐压性能好等特点，适合在不同海域的养殖环境中使用。
五、菌株DS5的动物安全性检测
1、对海水鱼类的安全性检测
选取健康的许氏平鲉幼鱼60尾，分为2组，包括DS5实验组和对照组，每组设3个平行，每个平行10尾鱼，暂养于70L玻璃缸内，水温21±1℃。日换水量1次，每次换水2/3，连续充气，不投喂食物，及时清理粪便，暂养一周后用于实验。
菌株DS5在30℃、150r/min条件下振荡培养至指数期后，6000r/min离心5min，用无菌PBS缓冲液重悬至108CFU/mL，待用。
采用腹腔注射法对试验用鱼进行注射，DS5实验组许氏平鲉每尾注射1000μL DS5菌悬液，对照组许氏平鲉每尾注射相同剂量的无菌PBS缓冲液。注射后连续观察10d，统计各组许氏平鲉的生长及死亡状况。
结果显示：整个实验过程中，各组实验鱼均未出现死亡现象，活力良好。
这表明：菌株DS5在108CFU/mL及以下浓度对许氏平鲉是相对安全的。
2、对底栖生物的安全性检测
选取健康刺参60只，分为DS5实验组和对照组2组，每组3个平行，每个平行10只，暂养于70L玻璃缸内，水温21±1℃。日换水1次，每次换水1/2，连续充气，暂养一周后用于实验。
菌株DS5在30℃、150r/min条件下振荡培养至指数期后，6000r/min离心5min，收集至无菌PBS缓冲液中待用。
向DS5实验组玻璃缸内添加菌株DS5至终浓度为107CFU/mL，对照组玻璃缸内添加相同剂量的无菌PBS缓冲液。浸浴2h后连续观察10d，观察和统计各组刺参的生存和死亡状况。
结果显示：各组刺参正常存活，未见异常。
这表明：菌株DS5在107CFU/mL及以下浓度对刺参是相对安全的。
综上，本发明筛选得到的枯草芽孢杆菌DS5能够降解硫代硫酸钠、氮盐、磷盐和高锰酸盐，具有适温范围广、耐盐耐pH能力强，耐压性能好等特点，同时对许氏平鲉等海水养殖鱼类和刺参等养殖海区底栖生物相对安全，可用于养殖海区底泥中硫化物和养殖水体中总氮、总磷、高锰酸盐等物质的去除，实现养殖环境的优化和改善，提高养殖效率，降低养殖对象疾病的发生，促进养殖产业绿色健康发展。
该枯草芽孢杆菌DS5已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏编号为CGMCC No.27267，保藏日期为2023年05月05日，保藏地址为中国北京。
需要说明的是，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明技术方案所引申出的显而易见变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (2)
1.一株枯草芽孢杆菌DS5，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌DS5分离自烟台长岛网箱养殖区底泥，具有降解硫代硫酸钠、氮盐、磷盐和高锰酸盐的能力，对海水鱼类和底栖生物相对安全，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏编号为CGMCC No.27267，保藏日期为2023年05月05日，保藏地址为中国北京。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌DS5在去除网箱养殖区底泥中硫代硫酸钠和养殖水体中总氮、总磷、高锰酸盐中的应用。
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