JPWO2011132801A1 - 消光性ならびに蛍光性の核酸塩基類似体とその応用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、消光性ならびに蛍光性の核酸塩基類似体とその応用に関する。
具体的には、本発明は、2−ニトロピロールとその1位と4位修飾体、ならびにそれらのヌクレオシド誘導体が消光性の分子あるいは核酸塩基類似体として機能することの発見とその利用に関するものであり、PCR産物の可視化などの幅広い検出・診断に用いることができる。
[態様1]
式Iで示す2−ニトロピロール構造を有する消光剤
リボース、デオキシリボース、
水素、水酸基、SH基、ハロゲン、
置換又は未置換の、炭素数2ないし10のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、
窒素原子または硫黄原子を含む、1又は複数の5員ヘテロ環、1又は複数の6員ヘテロ環、1又は複数の複素環ヘテロ環、1又は複数の芳香族環、
糖、糖鎖、アミノ酸、ペプチド、
リンカーを介して結合した蛍光性分子
からなる群から独立に選択される基である]。
[態様2]
式Iにおいて、R1がリボースまたはデオキシリボースである、態様1に記載の消光剤。
[態様3]
人工塩基対の形成を検出する方法であって、
1)式II
水素、水酸基、SH基、ハロゲン、
置換又は未置換の、炭素数2ないし10のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、
窒素原子または硫黄原子を含む、1又は複数の5員ヘテロ環、1又は複数の6員ヘテロ環、1又は複数の複素環ヘテロ環、1又は複数の芳香族環、
糖、糖鎖、アミノ酸、ペプチド、
リンカーを介して結合した蛍光性分子、
からなる群から選択される基である]
で表される消光性人工塩基を有するヌクレオシドまたはヌクレオチド、あるいは、
2)蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)や静的消光作用(static quenching)などの供与体となりうる自己消光性を有する天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するヌクレオシドまたはヌクレオチド
のいずれか、あるいは双方を用いることを特徴とする、前記方法。
[態様4]
人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、蛍光性人工塩基と式II
水素、水酸基、SH基、ハロゲン、
置換又は未置換の、炭素数2ないし10のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、
窒素原子または硫黄原子を含む、1又は複数の5員ヘテロ環、1又は複数の6員ヘテロ環、1又は複数の複素環ヘテロ環、1又は複数の芳香族環、
糖、糖鎖、アミノ酸、ペプチド、
リンカーを介して結合した蛍光性分子、
からなる群から選択される基である]
で表される消光性人工塩基との塩基対形成により、蛍光性人工塩基の蛍光の低下を観察することにより、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。
[態様5]
蛍光性人工塩基の蛍光の低下により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、以下の、
(i)7−(2,2’−ビチエン−5−イル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Dss);
(ii)7−(2,2’,5’,2’’−ターチエン−5−イル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Dsss);
(iii)2−アミノ−6−(2,2’−ビチエン−5−イル)プリン−9−イル基(ss);
(iv)2−アミノ−6−(2,2’,5’,2’’−ターチエン−5−イル)プリン−9−イル基(sss);
(v)4−(2,2’−ビチエン−5−イル)−ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル基(Dsas);
(vi)4−[2−(2−チアゾリル)チエン−5−イル]ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル基(Dsav);及び
(vii)4−[5−(2−チエニル)チアゾール−2−イル]ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル基(Dvas);
からなる群より選択される蛍光性人工塩基と、
以下の式III,又は式IVの消光性塩基
−H、ヨード、−CH3、
−CH3、−CH2−NH2、及び
から選択される]
との間で塩基対が形成されると、蛍光性人工塩基の蛍光が低下し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。
[態様6]
7−(2,2’−ビチエン−5−イル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Dss)を塩基として有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー;並びに、
以下の式III、又は式IVの消光性塩基
−H、ヨード、−CH3、
−CH3、−CH2−NH2、及び
から選択される]
を塩基として有するポリヌクレオチド
を含む、蛍光性人工塩基の蛍光の低下により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法に使用するためのキット。
[態様7]
人工塩基対を検出する方法であって、
式V
で表される消光性人工塩基中の蛍光性分子の蛍光強度が、式Vの人工塩基が塩基対を形成することによって変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。
[態様8]
蛍光強度の変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、
7−(2−チエニル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン3−イル基(Ds)と、以下の式VIの塩基:
式VIの塩基中の蛍光性分子の蛍光強度が増加し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。
[態様9]
蛍光性分子が、インドカルボシアニン(Cy3)、インドジカルボシアニン(Cy5)、5−カルボキシフルオレセイン(5−FAM)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、5−カルボキシテトラメチルローダミン(5−TAMRA)、6−カルボキシテトラメチルローダミン(6−TAMRA)、5−ジメチルアミノナフタレン−1−スルホン酸(DANSYL)、5−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(5−HEX)、6−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(6−HEX)、5−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(5−TET)、6−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(6−TET)、5−カルボキシ−X−ローダミン(5−ROX)、及び6−カルボキシ−X−ローダミン(6−ROX)からなる群から選択される、態様7又は8に記載の方法。
[態様10]
7−(2−チエニル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン3−イル基(Ds)を塩基として有するポリヌクレオシドを含む、核酸プライマー、並びに、
式VIの塩基:
を含む、蛍光強度の変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法に使用するためのキット。
[態様11]
人工塩基対の形成を検出する方法であって、
蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)や静的消光作用(static quenching)などの供与体となりうる自己消光性を有する天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するポリヌクレオシドを含む核酸を利用し、当該核酸中の人工塩基(第一人工塩基)と蛍光性分子を有する人工塩基(第二人工塩基)との間で人工塩基対が形成されると、前記天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するポリヌクレオシドから、第二人工塩基の有する蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用(static quenching)により、蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。
[態様12]
蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用(static quenching)などによる蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、
7−(2,2’−ビチエン−5−イル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Dss)と、以下の式VIの塩基:
240−410nmの紫外線による励起により、Dssから式VIの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用(static quenching)などが生じて、蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。
[態様13]
蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用(static quenching)などによる蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、
7−(2−チエニル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン3−イル基(Ds)と、以下の式VIの塩基:
240−390nmの紫外線による励起により、少なくとも1つの2−アミノ−6−(2−チエニル)プリン−9−イル基(s)から、式VIの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用(static quenching)などにより、蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、
ここにおいて、Dsを塩基として有するポリヌクレオシドを含む核酸と同一鎖上に、2−アミノ−6−(2−チエニル)プリン−9−イル基(s)を塩基として有するポリヌクレオチドが少なくとも1つ存在する、前記方法。
[態様14]
蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用(static quenching)などによる蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、
7−(2−チエニル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Ds)と、以下の式VIの塩基:
350−390nmの紫外線による励起により、少なくとも1つの2−アミノ−6−(2−チエニル)プリン−9−イル基(s)から、式VIの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用(static quenching)などにより蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、
ここにおいて、Dsを塩基として有するポリヌクレオシドを含む核酸と同一鎖上に、少なくとも1つの2−アミノ−6−(2−チエニル)プリン−9−イル基(s)が天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドが少なくとも1つ存在する、
前記方法。
[態様15]
蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用(static quenching)などによる蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、
7−(2−チエニル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン3−イル基(Ds)と、以下の式VIの塩基:
240−410nmの紫外線による励起により、7−(2,2’−ビチエン−5−イル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Dss)から、式VIの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用(static quenching)などにより蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、
ここにおいて、Dsを塩基として有するポリヌクレオシドを含む核酸と同一鎖上に、少なくとも1つの7−(2,2’−ビチエン−5−イル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Dss)が天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドが存在する、
前記方法。
[態様16]
蛍光性物質が、インドカルボシアニン(Cy3)、インドジカルボシアニン(Cy5)、5−カルボキシフルオレセイン(5−FAM)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、5−カルボキシテトラメチルローダミン(5−TAMRA)、6−カルボキシテトラメチルローダミン(6−TAMRA)、5−ジメチルアミノナフタレン−1−スルホン酸(DANSYL)、5−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(5−HEX)、6−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(6−HEX)、5−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(5−TET)、6−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(6−TET)、5−カルボキシ−X−ローダミン(5−ROX)、及び6−カルボキシ−X−ローダミン(6−ROX)からなる群から選択される、態様11ないし15のいずれか1項に記載の方法。
[態様17]
式VIの塩基中の置換基R6が以下の:
[態様18]
検出スペクトルの変化が、肉眼で判定できる、態様11ないし17のいずれか1項に記載の方法。
[態様19]
核酸の塩基対が、転写、逆転写、複製又は翻訳の工程で形成される、態様11ないし18のいずれか1項に記載の方法。
[態様20]
以下のi)−iii)からなる群から選択される、1つの核酸プライマー;
i)7−(2,2’−ビチエン−5−イル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Dss)を塩基として有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー;
ii)7−(2−チエニル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン3−イル基(Ds)を塩基として有するポリヌクレオシド、及び、少なくとも1つの、2−アミノ−6−(2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基(s)を塩基として有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー;
iii)7−(2−チエニル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Ds)を塩基として有するポリヌクレオシド、及び、少なくとも1つの、2−アミノ−6−(2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基(s)が天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー;及び
iv)7−(2−チエニル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン3−イル基(Ds)を塩基として有するポリヌクレオシド、及び、7−(2,2’−ビチエン−5−イル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Dss)が天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー、
並びに、式VIの塩基:
を塩基として有するポリヌクレオチド
を含む、蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用(static quenching)などによる蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法に使用するためのキット。
1. 消光剤の構造
本発明は、新規な消光剤を提供する。本発明の消光剤は、式Iで示す2−ニトロピロール構造を有する
リボース、デオキシリボース、
水素、水酸基、SH基、ハロゲン、
置換又は未置換の、炭素数2ないし10のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、
窒素原子または硫黄原子を含む、1又は複数の5員ヘテロ環、1又は複数の6員ヘテロ環、1又は複数の複素環ヘテロ環、1又は複数の芳香族環、
糖、糖鎖、アミノ酸、ペプチド、
リンカーを介して結合した蛍光性分子
からなる群から独立に選択される基である]
ことを特徴とする。
R1及び/又はR2は、好ましくは、リボース、デオキシリボースである。好ましくは、R1はリボース、デオキシリボースである。
「デオキシリボース」とは、アルデヒド基を含む五炭糖の単糖の1種で、IUPAC名は「(2R,4S,5R)−5−(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン−2,4−ジオール」である。
ハロゲンの種類は特に限定されない。好ましくは、フッ素、臭素、ヨウ素等からなる群から選択される。
炭素数2ないし10のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基は、直鎖状でも枝分かれしていてもよく、特に限定されない。好ましくは、メチル基、エチル基、プロピニル基、エチレン基、 エチニル基などが含まれる。これらの基は、置換されていてもよい。置換基は、特に限定されないが、好ましくは、アミノ基、水酸基、SH基、ハロゲン、カルボキシル基、ニトロ基等からなる群から選択される。
R1及び/又はR2は、1又は複数のヘテロ環であってもよい。ヘテロ環は、チエニル基、チアゾリル基、イミダゾリル基、フラニル基、あるいはこれらの誘導体等から選択される、5員のヘテロ環である。好ましくは、2−チエニル基、2−チアゾリル基、2−イミダゾリル基、2,2’−ビチエン−5−イル基、2−(2−チアゾリル)チエン−5−イル基、5−(2−チエニル)チアゾール−2−イル基、及び2,2’,5’,2’’−ターチエン−5−イル基からなる群より選択される基である。
芳香族環の例としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。
v)糖、糖鎖、アミノ酸、ペプチド
糖は、特に限定されない。例えば、グルコース、アラビノース、フラノース等が含まれる。リボースまたはデオキシリボースも糖の一種である。
アミノ酸も、特に限定されない。例えば、グリシン、アラニン、フェニルアラニン等が含まれる。
リンカーの種類は特に限定されず、当業者は適宜採用可能である。リンカーは限定されるわけではないが、好ましくは、下記の化学式VIIおよびVIII:
及び
からなる群より選択される。
式VII及びVIIIにおいて、n、m、lは各々好ましくは1−7、より好ましくは5である。
本発明の式Iで示す2−ニトロピロール構造を有する消光剤の消光作用によって消光される蛍光を有する物質の種類は特に限定されない。
式Iで示す2−ニトロピロール構造は、好ましくは以下の塩基と対合を形成する(特願2009−232851)。
7−(2,2’−ビチエン−5−イル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Dss);
7−(2,2’,5’,2’’−ターチエン−5−イル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Dsss);
2−アミノ−6−(2−チエニル)プリン−9−イル基(s);
2−アミノ−6−(2,2’−ビチエン−5−イル)プリン−9−イル基(ss);
2−アミノ−6−(2,2’,5’,2’’−ターチエン−5−イル)プリン−9−イル基(sss);
4−(2−チエニル)−ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル基(dDsa);
4−(2,2’−ビチエン−5−イル)−ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル基(Dsas);
4−[2−(2−チアゾリル)チエン−5−イル]ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル基(Dsav);
4−(2−チアゾリル)−ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル基(dDva);
4−[5−(2−チエニル)チアゾール−2−イル]ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル基(Dvas);及び
4−(2−イミダゾリル)−ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル基(dDia)。
II.人工塩基対の形成を検出する方法
本発明はまた、人工塩基対を検出する方法を提供する。本発明の方法は、
1. 式II
水素、水酸基、SH基、ハロゲン、
置換又は未置換の、炭素数2ないし10のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、
窒素原子または硫黄原子を含む、1又は複数の5員ヘテロ環、1又は複数の6員ヘテロ環、1又は複数の複素環ヘテロ環、1又は複数の芳香族環、
糖、糖鎖、アミノ酸、ペプチド、
リンカーを介して結合した蛍光性分子、
からなる群から選択される基である]
で表される消光性人工塩基を有するヌクレオシドまたはヌクレオチド、あるいは、
2)蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)や静的消光作用(static quenching)などの供与体となりうる自己消光性を有する天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するヌクレオシドまたはヌクレオチド
のいずれか、あるいは双方を用いることを特徴とする。
本発明の式IIの消光性人工塩基のピロール環の窒素原子は、リボースまたはデオキシリボースに結合して、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを構成する。本発明の式IIの人工塩基は、Ds、Dss、Dsss、s、ss、sss、dDsa、Dsas、Dsav、dDva、Dvas、及び、dDia等の人工塩基と人工塩基対を形成する(特願2009−232851)。式IIの消光性人工塩基とこれらの人工塩基との塩基対の形成により、塩基対を形成した蛍光性人工塩基、あるいは、付近に存在する蛍光性塩基若しくは蛍光性分子の蛍光強度が変化、あるいは消光する。本発明の方法はその変化を利用して人工塩基対の形成を検出する。
本発明は、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)や静的消光作用(static quenching)などの供与体となりうる自己消光性を有する天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するヌクレオシドまたはヌクレオチドを利用して、人工塩基対を検出する方法も含む。
[図2]図2は、本発明の実施例に使用した、消光性人工塩基Pnとその4’誘導体の構造を示す。
[図3]図3は、本発明の実施例に使用した、消光性人工塩基Pxとその誘導体の構造を示す。
[図4]図4は、本発明の方法に使用する、Pn又はPxと相補性を有する人工塩基の例として、Ds、並びに、蛍光性人工塩基Dss、Dsss、Dsavの構造を示す。
[図5]図5は、NH2−hx−dPxTPからCy3−hx−dPxTPの合成を示す。反応条件は、以下の通りである。100mM NaHCO3中、NH2−hx−dPxTP(8.4μmol)、Na2CO3緩衝液(pH8.5)(500μl)、DMF(300μl)中、Cy3(7.63μmol) N−ヒドロキシスクシニミジルエステル、室温12時間
[図6]図6は、蛍光性人工塩基Dssまたはsを結合した天然型塩基のアミダイト試薬の構造を示す。
図6中の化合物は、左からDss−hx−dUアミダイト、s−hx−dUアミダイト、そして、s2−hx−dCアミダイトである。
[図7]図7は、人工塩基Pnによる相補鎖中の蛍光性人工塩基Dssの消光を示す。10mM リン酸ナトリウム(pH7.0)、100mM NaCl、0.1mM EDAT中の各DNA溶液(5μM)を365nmの照射により撮影した。蛍光性人工塩基(Dss)を含む一本鎖のオリゴヌクレオチド(12−mer)を消光性人工塩基(Pn)を含む相補鎖のオリゴヌクレオチド(12−mer)と二本鎖を形成させると、Dssの蛍光がPnにより消光される(図7、左から2番目)。天然型塩基(Tなど)や人工塩基(DssやDs)と塩基対を形成してもDssの蛍光は消光されない(図7、左から3番目−5番目)。
[図8]図8は、図7の実験の各DNA断片の蛍光スペクトルを示す。Dssを含む一本鎖DNA(5’−GGTAACDssATGCG−3’)、Dss−Pn,Dss−Dss,Dss−Ds,Dss−T塩基対のそれぞれを含む二本鎖DNA(5’−GGTAACNATGCG−3’(N=Dss)及び5’−CGCATN’GTTACC−3’(N’=Dss,Ds,Pn又はT)の5μM DNA溶液の蛍光スペクトル(励起波長:385nm、25℃)の結果である。図8に示されるようにDssの蛍光はPnにより5分の1程度に消光された。
[図9]図9は、Pnの消光作用を調べた結果を示す。具体的には、蛍光性人工塩基Dssの2’−デオキシリボヌクレオシド 5’‐三リン酸誘導体(dDssTP)の水溶液での消光をdPnTPの濃度依存性として調べた。A: Pnのデオキシリボヌクレオシド三リン酸(dPnTP)の濃度依存による蛍光性人工塩基Dssのデオキシリボヌクレオシド三リン酸(dDssTP,5μM)の蛍光強度の変化。B: dPnTPと天然型塩基の三リン酸とのDssに対する消光性を比較した結果を示す。Pnならびに天然型塩基のデオキシリボヌクレオシド三リン酸による、蛍光性塩基dDssTP(5μM)の消光のSteady−state Stern−Volmer plot。100mM NaCl、10mM リン酸ナトリウム(pH7.0)、0.1mM EDTAの溶液中、20℃で、370nmの励起による蛍光を測定し、以下の式よりStern−Volmer定数(Ksv)を算出した。
Stern−Volmer equation : F0/F1=1+KSV[Q]
[F0及びF1、: 各々消光剤を伴う(F1)又は伴わない(F0)場合の蛍光強度 [Q]: 消光剤の濃度]グアニン塩基は消光性を有することが知られているが、Pnはさらに強い消光性を示す(図9B)。
[図10]図10は、Pnとその各種誘導体(図2、図3)、ならびにPxによるDssの蛍光の消光特性を示す。具体的には、エタノール、25℃で、385nmの励起による蛍光を測定し、Pnの各種誘導体とPxのデオキシリボヌクレオシド(A:2.5mM、B:5mM)共存下での、dDss(5μM)の蛍光強度の変化を調べた。いずれの誘導体もPnよりもさらに強い消光特性を示した。
[図11]図11は、大腸菌由来のDNAポリメラーゼIのクレノウ断片による、Pnを含む鋳型DNAとdDssTPを用いたプライマー伸長反応を調べた結果を示す。200nMの鋳型DNA、10μMのdCTPとdTTP、0.1U/μlのクレノウ断片に、各濃度のdDssTPを加えて、37℃、3分反応を行い、変性ゲル電気泳動で解析した。dATPとdGTPを加えていないので、伸長反応が進んだ際の生成物は鋳型のCの手前で止まった33−merになる。図11は、dDssTPが鋳型中のPnに相補して、相補鎖DNAに取り込まれることを示している。既にdDssTPは鋳型中のPaに対しても取り込まれることを明らかにしているが(J.Am.Chem.Soc.,132:4988−4989,2010)、Pnの方がDssの取り込み効率が高くなることが分かった。また、dDssTPの濃度を高くするとPnやPaに対してDssが取り込まれた後の伸長反応が阻害されるが、dDssTPの濃度を下げることにより、プライマー伸長反応が効率よく進行した。
[図12]図12は、Dss−Px塩基対を用いたDsを含むDNAのPCR増幅を調べた結果を示す。Dsを含むDNA(55−mer)をdDssTPとNH2−hx−dPxTP、ならびに天然型塩基の基質を用いて20サイクルのPCR増幅を行い、変性ゲル電気泳動後、SYBR Green IIで染色後に生成物を解析した。Dsを含む鋳型DNA(55−mer、S2)を用いて、天然型塩基の基質(dNTPs)にdDssTPとNH2−hx−dPxTPを加えて、PCRを行った結果である。天然型塩基のみの鋳型DNAと同様に人工塩基を含む鋳型DNA−S2も増幅されることが分かった。Dss−PnならびにDss−Px塩基対は、PCRにおいても効率よく機能する。
[図13]図13は、Dss−Px塩基対を用いたPCR増幅後のDNAの配列決定を行った結果を示す。Dsを含むDNA(55−mer)をdDssTPとNH2−hx−dPxTP、ならびに天然型塩基の基質を用いて15サイクルのPCR増幅を行い、従来法で増幅産物の配列決定を行った。増幅されたDNA中にはDssとNH2−hx−Pxが99%以上保持されていることが分かった。本配列決定はこれまでに本願発明者らが開発した方法を用いている(An unnatural hydrophobic base pair system:site−specific incorporation of nucleotide analogs into DNA and RNA.I.Hirao,M.Kimoto,T.Mitsui,T.Fujiwara,R.Kawai,A.Sato,Y.Harada,S.Yokoyama,Nature Methods,3,729−735(2006);An Unnatural base pair system for efficient PCR amplification and functionalization of DNA molecules.M.Kimoto,R.Kawai,T.Mitsui,S.Yokoyama,and I.Hirao,Nucleic Acids Res.,37,e14(2009))
[図14]図14は、Dss−Px塩基対を用いたリアルタイムPCRの原理を示した模式図である。DssをPCRのプライマー中に導入し、dPnTPあるいはdPxTPを用いてPCRを行うと、Dssに相補してPnやPxが相補鎖中に取り込まれ、Dssの蛍光が消光される。これを検出することによりリアルタイムPCRが可能になる。
[図15]図15は、Dss−Px塩基対を用いたリアルタイムPCRを行った結果を示す。図14で示したDssを含むプライマーを用いると、その相補鎖にdPxTPが取り込まれ、Dssの蛍光が消光される。これはPCRの際にDss−Px塩基対が形成されて、Dssの蛍光が消光され、リアルタイムPCRへの応用が可能になる。
反応混合液(25μLスケール)
1×Titanium Taq PCR buffer
1μM 080731−5’プライマー3 (配列番号15)
1μM 090914a−Plexor−Dss1 (配列番号16)
2μM dPxTP
2mM dNTPs
1×Titanium TaqDNA polymerase
2aM(3コピー)−2fM(30000コピー) 鋳型DNA適用
滅菌水で全量25μLとした。
PCR条件
94℃、2分→[94℃、5秒−68℃、40秒]×55サイクル
[図16]図16は、Dss−Pn塩基対を含むDNAヘアピンの蛍光特性を調べた結果を示す。Dss−Pn塩基対を含むDNAヘアピン(34−mer)とDssを含む一本鎖DNA(12−mer)のそれぞれのDssの蛍光強度の温度依存性を測定した。それぞれのDNAを1μM、2mM塩化マグネシウムを含む緩衝溶液中で測定した。DssとPnを塩基対としてヘアピン核酸のステム領域に導入することにより、ヘアピン構造を形成しているとDssの蛍光がPnにより消光され、このヘアピンDNAを熱変性させると、その過程でDssの蛍光強度が増加した。このDss−Pn(あるいはDss−Px)塩基対の性質は、モレキュラービーコンに応用することが出来る。
[図17]図17は、Dss−Pn塩基対を含むモレキュラービーコンの可視化が可能になったことを示す。Dss−Pn塩基対を含むヘアピン型ビーコン(26−mer)の蛍光をターゲットの一本鎖DNA(71−mer)の存在下、非存在下で観測した。それぞれのDNAを1μM、10mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)・100mM NaCl ・0.1mM EDTA中で測定した。その結果、Dss−Pn塩基対を含むモレキュラービーコンのループ部分に相補するDNAを認識して二本鎖を形成するとPnによるDssの蛍光消光が解消され、紫外線を照射することにより、Dssの蛍光を裸眼で確認することが出来た。
[図18]図18は、Dss−Pn塩基対を含むモレキュラービーコンによる一塩基変異を検出した結果を示す。Dss−Pn塩基対を含む2種類のヘアピン型ビーコン(26−mer)のそれぞれの蛍光を1塩基変異の2種類の標的配列のそれぞれの一本鎖DNA(71−mer)に加えて観測した。それぞれのDNAを1μM、10mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)・100mM NaCl・0.1mM EDTA中で測定した。2種類の標的配列について各標的DNAに相補する配列をループ部分に有するモレキュラービーコンを作成することにより、1塩基の違いを、ハイブリダイゼーションによりDssの発光強度の違いとして、識別することが出来た。
[図19]図19は、蛍光色素Cy3をPxに結合させた基質として、Cy3−Px/Dss塩基対を用いた可視化PCRの原理を示す。
[図20]図20は、図19に記載の原理に基づき、Cy3−Px/Dss塩基対を用いた可視化リアルタイムPCRを行った例を示す。
反応混合液(25μLスケール)
1×Titanium Taq PCR buffer
1μM 080731−5’プライマー3 (配列番号15)
1μM 090914a−Plexor−Dss1 (配列番号16)
2μM Cy3−hx−dPxTP
2mM dNTPs
1×Titanium TaqDNA polymerase
2aM(3コピー)−200fM(3000000コピー) 鋳型DNA適用
滅菌水で全量25μLとした。
PCR条件
94℃、2分→[94℃、5秒−68℃、40秒]×55サイクル
Cy3は350nm近辺の励起波長では発光しないので、Cy3を結合したPxの基質(Cy3−hx−dPxTP)は350nmのUV照射では発光しない。Dss−Pxの塩基対形成によりCy3−hx−dPxTPがDssの相補鎖に取り込まれると、350−390nmのUV照射によりDssからCy3への蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)が生じ発光する。これにより、Cy3の発光をオレンジフィルターを通して観察することにより、PCR増幅されたDNAを裸眼で検出することが出来る。
[図21]図21は、蛍光性分子(Cy3)を結合した消光性Px塩基によるリアルタイムPCR法の原理を示した模式図である。蛍光性分子(例えばCy3など)を消光性のPx塩基に結合させると、蛍光性分子の蛍光が30%程度消光する。これを基質(Cy3−hx−dPxTP)にして、Ds塩基を導入したプライマーを用いてPCRを行うとCy3−hx−dPxがDNA中に取り込まれることで、Cy3の蛍光強度が増大する。この方法はリアルタイムPCRに用いることができる(図22)。
[図22]図22は、蛍光性分子(Cy3)を結合した消光性のPx塩基を用いてリアルタイムPCRを行った結果を示す。リアルタイムPCR装置(ストラタジーン、Mx3005P)を用いて、Cy3−hx−dPxTPを基質として用いたリアルタイムPCR検出を行った。PCR反応は、プライマー:各1μM、天然型塩基基質dNTP:各0.2mM、人工塩基基質Cy3−hx−dPxTP:2μMで実施し、励起波長545nmで568nmの蛍光変化を検出した。545nmの照射で直接、Cy3を励起するため図19と図20の応用例と異なり、この場合には遊離の基質のCy3−hx−dPxTPも発光する。よってこの方法の場合は、図20のように裸眼では識別できない。そこで、DNA中にCy3−hx−dPxTPが取り込まれた際の蛍光強度の増加の測定に、リアルタイムPCR装置を用いた。
[図23]図23は、蛍光性分子(Cy3)を結合した消光性のPx塩基によるリアルタイムPCR産物をゲル電気泳動により検出した結果を示す。図22で示したPCR産物は、Cy3が取り込まれているので、この産物をアガロースゲルで電気泳動すると、従来のEtBrやSYBR GreenなどのDNA染色用の色素を用いることなく、ゲル上でPCR産物をCy3の蛍光で検出することができる。
検出条件
FLA7000バイオイメージングアナライザー
(Cy3 mode)
532nm レーザー/O580 蛍光フィルター
PMT: 500V
[図24]図24は、蛍光性分子(Cy3)ならびに蛍光性人工塩基sを含むDNAの蛍光特性を調べた結果である。測定条件:100mM NaCl、0.1mM EDTAを含む10mM リン酸ナトリウム(pH7.0)に、各種DNA断片が5μMとなるように調製し、254−365nmの照射で発光を観察した。 レーン2は蛍光性人工塩基sを1つ含むDNA断の場合であり、sのみをDNA中に導入すると254‐365nmの照射でsの発光が起こる。しかし、sを2つ隣接してDNA中に導入するとその蛍光が消光する(レーン3)。天然型塩基だけからなるDNA断片にCy3を結合させた場合、365nmの照射では発光しない(レーン4)。しかしながら、DNA中のCy3近傍にsを1つあるいは2つを導入すると、sとCy3間でFRETが起こり、Cy3の蛍光が観測されるようになる(レーン5−7)。具体的には、365nmでsを励起するとCy3のオレンジ色の発光が観測される(レーン5,6)。さらに2つのsを隣接してDNA断片中に導入すると、s同士の消光により254‐365nmで励起してもsの発光はほとんど観測されないが(レーン3)、このDNA断片にCy3を結合させるとFRETが起こり、Cy3の発光が観測される(レーン7)。この現象を利用して、複製や転写によるDNAの増幅の検出を裸眼で行うことができる。
[図25]図25は、蛍光性分子(Cy3)を結合した消光性のPx塩基と蛍光性人工塩基sを組み合わせた可視化PCR法の原理を示す。蛍光性人工塩基sを隣接して2つ導入するとsの蛍光は完全に消光し、350nmの照射で発光しない。それに近接するDsも350nmで発光しない。2つの隣接するs及びその近傍にDsを含むプライマーとCy3−hx−dPxTPを用いてPCRを行うと、その相補鎖にCy3−hx−Pxが取り込まれる。2つのsとDsが近い位置にあるため、sの励起波長である365nmの照射でFRETが起こり、近傍のCy3などの蛍光色素が蛍光発光する(図26)。これを用いてPCRで増幅されたDNAを裸眼で検出することができる(図26、27)。
[図26]図26は、蛍光性分子(Cy3)を結合した消光性のPx塩基と蛍光性人工塩基sを組み合わせた可視化PCR法の結果を示す。図26にはPCRを行い、PCRチューブを350nmで照射し、裸眼であるいはオレンジ色のフィルターを通してCy3の発光を調べた結果を示す。従来法では、PCRによるDNA増幅を裸眼で確認することは難しかった。即ち、従来の例えばSYBR Greenを用いる方法は、リアルタイムPCRで最も用いられる検出法であるが、図中右側のように裸眼での検出は難しい。これに対し、本発明の方法は、リアルタイムPCRのみならず裸眼でもPCRの検出が可能であった(図26左側)。
[図27a]図27aは、蛍光性分子(Cy3)を結合した消光性のPx塩基と蛍光性人工塩基sを組み合わせた可視化PCR法を行った結果を示す。標的DNAを3コピーから300万コピー用いて、55サイクルのPCRを行い、PCR産物を電気泳動により解析した結果は図28に示している。本検出系では、電気泳動することなく、365nmのUV励起によるCy3の蛍光の有無を反応チューブレベルで観察するだけで、3コピーのDNAでも55サイクルのPCR後、その増幅産物を裸眼で検出が可能であることを示している。
[図27b]図27bは、蛍光性分子(Cy3)を結合した消光性Px塩基と蛍光性人工塩基sを組み合わせた可視化PCRをリアルタイム定量PCR装置により検出した結果を示す。
反応混合物(25μスケール)
1μM 080731 5’primer 3
1μM Primer 2d−Ds−ss3 3’primer
2μM Cy3−hx−dPxTP
200μM dNTPs
1×Titanium Taq Buffer
1×Titanium Taq DNAポリメラーゼ
2aM(3copies)〜200fM(3000000copies)98G template
PCR条件: 94℃−2分 → [94℃−5秒→68℃−40秒]×30−55サイクル
本法はDNA中に取り込まれたCy3‐hx−PxのCy3の蛍光強度の増加によりリアルタイムPCRも可能である。
[図27c]図27cは、図27bの各PCRサイクルのDNA増幅産物を可視化した結果を示す。
[図27d]図27dは、図27cの各PCRチューブの蛍光強度を定量化した結果を示す。図27d1は、0、3−30000コピーのそれぞれのDNAをPCRで増幅した時の各PCRサイクルにおける蛍光強度をプロットしたものである。図27d2は、3−3000000コピーのそれぞれのDNAを各PCRサイクルで増幅した時の蛍光強度をプロットした図である。
[図28]図28は、蛍光性分子(Cy3)を結合した消光性のPx塩基と蛍光性人工塩基sを組み合わせたプライマーを用いたPCR(55サイクル)による産物のゲル電気泳動上での検出を行った結果を示す。本発明の方法により図27aの可視化PCR産物をアガロースゲル電気泳動することにより、312nmあるいは532nmの照射でPCR産物を検出することができた。312nmの照射の場合にはsからCy3へのFRETを検出しており、532nmの照射の場合には、DNA中に取り込まれたCy3を直接励起した結果を示している。PCR産物はCy3で標識されているため、312nmでsを励起してFRETにより、あるいは、532nmで直接Cy3を励起することにより、PCR産物をゲル上で観察することが出来た。
[図29a]図29aは、蛍光性分子(s塩基)を天然型塩基にリンカーを介して結合したヌクレオシド誘導体(図6、s−hx−dU、(Us))とDs−Px塩基対を用いたPCR産物の検出法を示した模式図である。図25の可視化PCR法では、隣接する2つの蛍光性人工塩基sを用いているが、代わりにこの蛍光性のsを天然型塩基にリンカーを介して結合し、PCR用のプライマー中にこの塩基を2つ隣接させたものが、図29aの態様である。
[図29b]図29bは、蛍光性分子(s塩基)を天然型塩基にリンカーを介して結合したヌクレオシド誘導体(図6、s−hx−dU、(Us))とDs−Px塩基対を用いたPCRについて、使用する各プライマー、鋳型の配列、並びにPCRの条件を示した図である。
[図29c]図29cは、蛍光性分子(Cy3)を結合した消光性のPx塩基と蛍光性人工塩基s−hx−dUを組み合わせた可視化PCRを行った結果を示す。DNA中に取り込まれたCy−hx−PxのCy3の蛍光強度の増加によりリアルタイムPCRも可能となった。
[図29d]図29dは、図29cの各PCRサイクルのDNA増幅産物を可視化したものである。
[図30]図30は、s−hx−dUアミダイト試薬の化学合成である。
条件:(a)CBr4,PPh3,CH2Cl2;
1. (b)K2CO3,DMF;
2. (c)Pac−Cl,HOBT,ピリジン,CH3CN;
3. (d)DMTr−デオキシ−5−ヨードウリジン,Pd(PPh3)4,CuI,TEA,DMF;
4. (e)NC(CH2)2O−P(Cl)N(iPr)2,DIEA,THF
[図31]図31は、2分子の蛍光性塩基(s)を天然型塩基にリンカーを介して結合したヌクレオシド誘導体(図6、s2−hx−dC、(Css))とDs−Px塩基対を用いたPCR産物の検出方法を示した模式図である。
[図32]図32は、蛍光性分子(Dss塩基)を天然型塩基にリンカーを介して結合したヌクレオチド誘導体(図6、Dss−hx−dU(UDss))とDs−Px塩基対を用いたPCR産物の検出方法を示した模式図である。
[図33]図33は、Dss−hx−dUアミダイト試薬の化学合成を示した結果である。
条件:(a)K2CO3,DMF;
5. (b)Pd(PPh3)4,CuI,TEA,DMF;
6. (c) DMTrCl,ピリジン;
7. (d)NC(CH2)2O−P(Cl)N(iPr)2,DIEA,THF
A.蛍光性人工塩基と本発明の消光性人工性塩基の塩基対形成による蛍光の低下を利用する方法
本発明の方法は、一態様において、蛍光性人工塩基と式II
水素、水酸基、SH基、ハロゲン、
置換又は未置換の、炭素数2ないし10のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、
窒素原子または硫黄原子を含む、1又は複数の5員ヘテロ環、1又は複数の6員ヘテロ環、1又は複数の複素環ヘテロ環、1又は複数の芳香族環、
糖、糖鎖、アミノ酸、ペプチド、
リンカーを介して結合した蛍光性分子、
からなる群から選択される基である]
で表される消光性人工塩基との塩基対形成により、蛍光性人工塩基の蛍光の低下を観察することにより、人工塩基対が形成されたことを検出する。
(i)7−(2,2’−ビチエン−5−イル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Dss);
(ii)7−(2,2’,5’,2’’−ターチエン−5−イル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Dsss);
(iii)2−アミノ−6−(2,2’−ビチエン−5−イル)プリン−9−イル基(ss);
(iv)2−アミノ−6−(2,2’,5’,2’’−ターチエン−5−イル)プリン−9−イル基(sss);
(v)4−(2,2’−ビチエン−5−イル)−ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル基(Dsas);
(vi)4−[2−(2−チアゾリル)チエン−5−イル]ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル基(Dsav);及び
(vii)4−[5−(2−チエニル)チアゾール−2−イル]ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル基(Dvas);
からなる群より選択される。
好ましくは、本発明の消光性塩基は以下の式II1又は式IVである。
−H、ヨード、−CH3、
−CH3、−CH2−NH2、及び
から選択される]
式IVにおいて、nは好ましくは3−7、より好ましくは5である。
7−(2,2’−ビチエン−5−イル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Dss)を塩基として有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー;並びに、
式III又は式IVの消光性塩基を塩基として有するポリヌクレオチドを含む、蛍光性人工塩基の蛍光の低下により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法に使用するためのキットを提供する。
本発明は、一態様において、人工塩基対の形成を検出する方法であって、
式V
で表される消光性人工塩基中の蛍光性分子の蛍光強度が、式Vの人工塩基が塩基対を形成することによって変化し、人工塩基対が形成されたことを検出する、前記方法を提供する。
リンカーは、式Iの消光剤について上述したものと同様のものを使用可能である。
本発明はまた、Ds
7−(2−チエニル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン3−イル基(Ds)を塩基とし
て有するポリヌクレオシドを含む、核酸プライマー、並びに、
式VIの塩基を有するポリヌクレオチド
を含む、蛍光強度の変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法に使用するためのキットを提供する。
本発明は、一態様において、
人工塩基対の形成を検出する方法であって、
蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)ならびに静的消光作用(static quenching)などの供与体となりうる自己消光性を有する天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するポリヌクレオシドを含む核酸を利用し、当該核酸中の人工塩基(第一人工塩基)と蛍光性分子を有する人工塩基(第二人工塩基)との間で人工塩基対が形成されると、前記天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するポリヌクレオシドから、第二人工塩基の有する蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用(static quenching)などが生じて、蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法、を提供する。
本発明は、Cの方法の一態様として以下の態様を提供する。
本発明の蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用(static quenching)などによる蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法は、7−(2,2’−ビチエン−5−イル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Dss)と、以下の式VIの塩基:
240−410nmの紫外線による励起により、Dssから式VIの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用(static quenching)などが生じて、蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法である。
240−410nmの紫外線はDssが励起される波長である。式VIの塩基中の蛍光性分子は通常、この波長では蛍光を生じずFRETは生じて始めて蛍光が観察されることが望ましい。
本発明は、Cの方法の一態様として以下の態様を提供する。
本発明の蛍光共鳴エネルギー転移ならびに静的消光作用(static quenching)などによる蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法は、
7−(2−チエニル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン3−イル基(Ds)と、式VIの塩基との間で塩基対が形成されると、
240−390nmの紫外線による励起により、少なくとも1つの2−アミノ−6−(2−チエニル)プリン−9−イル基(s)から、式VIの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用(static quenching)などが生じ、蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、
ここにおいて、Dsを塩基として有するポリヌクレオシドを含む核酸と同一鎖上に、2−アミノ−6−(2−チエニル)プリン−9−イル基(s)を塩基として有するポリヌクレオチドが少なくとも1つ存在する、前記方法である。
ここにおいて、Dsを塩基として有するポリヌクレオシドを含む核酸と同一鎖上存在するsの数は限定されないが、好ましくは1−3、より好ましくは1又は2である。最も好ましくは2である。図24、レーン3で示したようにsが2個の場合には、sの自己消光性によりsの蛍光強度が低下あるいは消光されており(自家消光)、FRETによる蛍光スペクトルの変化がよりはっきりと観察される(図24、レーン7)。sが1個の場合はsの蛍光が観察される(図24、レーン2)。この場合も、FRETによりsの蛍光から蛍光性分子の蛍光が観察されるようになる(図24、レーン5、6)。
本発明は、Cの方法の一態様として以下の態様を提供する。
本発明の蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用(static quenching)などによる蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法は、
Dsと、式VI塩基との間で塩基対が形成されると、
350−390nmの紫外線による励起により、少なくとも1つの2−アミノ−6−(2−チエニル)プリン−9−イル基(s)から、式VIの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用(static quenching)などが生じて蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、
ここにおいて、Dsを塩基として有するポリヌクレオシドを含む核酸と同一鎖上に、少なくとも1つの2−アミノ−6−(2−チエニル)プリン−9−イル基(s)が天然型塩基に結合した少なくとも1の塩基を有するポリヌクレオチドが少なくとも1つ存在する、前記方法である。
sが結合する天然塩基の種類は限定されず、A、T、G、C、Uのいずれでも可能である。また、sが結合する天然塩基が2以上隣接して存在する場合、隣接天然塩基は同じであっても、異なっていてもよい。好ましくは同じものが2以上隣接する。sが結合する天然塩基が同一核酸中に隣接する数も、sが核酸中に存在するC−2の態様と同様に、特に限定されないが、好ましくは1−3、より好ましくは1又は2である。最も好ましくは2である。
本発明は、Cの方法の一態様として以下の態様を提供する。
本発明の蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用(static quenching)などによる蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法は、
Dsと、式VIの塩基との間で塩基対が形成されると、
240−410nmの紫外線による励起により、7−(2,2’−ビチエン−5−イル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Dss)から、式VIの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用(static quenching)などが生じて蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、
ここにおいて、Dsを塩基として有するポリヌクレオシドを含む核酸と同一鎖上に、少なくとも1つの7−(2,2’−ビチエン−5−イル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Dss)が天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドが存在する、
前記方法、である。
本発明のC−1ないしC−4を含むCの態様において、蛍光性分子は特に限定されない。好ましくは、式Iの消光剤について上述したのと同様である。より好ましくはインドカルボシアニン(Cy3)である。
本発明はまた、
以下のi)−iii)からなる群から選択される、1つの核酸プライマー;
i)Dssを塩基として有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー;
ii)Dsを塩基として有するポリヌクレオシド、及び、少なくとも1つのsを塩基として有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー;
iii)Dsを塩基として有するポリヌクレオシド、及び、少なくとも1つのsが天然型塩基に結合した少なくとも1の塩基を有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー;及び
iv)Dsを塩基として有するポリヌクレオシド、及び、Dssが天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー、
並びに、式VIの塩基
を塩基として有するポリヌクレオチド
を含む、蛍光共鳴エネルギー転移ならびに静的消光作用(static quenching)などによる蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法に使用するためのキットを提供する。
また、本発明の人工塩基対の検出方法を利用して核酸の増幅を行った場合、増幅された核酸をそのまま電気泳動し、簡便に検出することが可能である(図23等)。さらに、電気泳動のバンドの濃さにより定量化も可能である。
1)試薬、溶媒等
試薬及び溶媒は、標準的な供給業者から購入し、さらに精製することなく使用した。1H−NMR(300MHz)および31P−NMR(121MHz)スペクトルは、BRUKER AV300核磁気共鳴スペクトロメーター上に記録した。合成したヌクレオシド5’−三リン酸は、Gilson HPLCシステムで最終精製を行った。エレクトロスプレイ−イオン化マススペクトル(ESI−MS) は、Waters 2690 LCシステムを伴ったWaters ZMD 4000マスシステム上に記録した。
1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−[3−(6−アミノヘキサナミド)−1−プロピニル]−2−ニトロピロール 5’−三リン酸(NH2−hx−dPxTP)(8.4μmol)の100mMM NaHCO3−Na2CO3バッファー溶液(pH8.6,500μl)にCy3 N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル(Cy3−SE,6.0mg,7.63μmol)のDMF(300μl)溶液を加えて室温で12時間静置した。50mM TEAA(3.0ml)を反応溶液に加えてDEAE Sephadex A−25ならびにHPLCで精製してCy3−hx−dPxTP(2.7μmol,35%)を得た。
1H NMR(300MHz,D2O) δ 8.55(t,1H,J=13.6Hz),7.90(t,2H,J=1.7Hz),7.85(dd,2H,J=1.2,8.4Hz),7.78(d,1H,J=2.1Hz),7.39(dd,2H,J=1.9,8.5Hz),7.19(d,1H,J=2.1Hz),6.64(t,1H,J=5.9Hz),6.39(dd,2H,J=2.8,13.5Hz),4.59(m,1H),4.22−4.08(m,9H),3.20(q,32H,J=7.3Hz),3.07(t,2H,J=6.5Hz),2.59(dt,1H,J=6.1,13.3Hz),2.38(dt,1H,J=6.2,13.8Hz),2.27−2.17(m,2H),1.86(m,2H),1.77(s,12H),1.67−1.54(m,4H),1.42−1.25(m,56H).
31P NMR(121MHz,D2O) δ −8.65(bs,1P),−10.72(d,1P,J=19.7Hz),−22.32(t,1P,J=20.4Hz).
MS(ESI) for C49H65N6O22P3S2 計算値:1247.28(M+H)+, 実測値:1247.43(M+H)+, 計算値: 1245.28(M−H)−, 実測値:1244.91(M−H)−.
実施例2 人工塩基Pnによる相補鎖中の蛍光性人工塩基Dssの消光(図7)
蛍光性人工塩基Dssを含むDNA断片 (12−mer、5’−GGTAACN1ATGCG−3’、N1=Dss)(配列番号1)のみ、もしくは相補鎖のDNA断片(12−mer、5’−CGCATN2GTTACC−3’、N2=Pn、Dss、Ds、もしくはT)(配列番号2)と二本鎖を形成させた場合の蛍光変化を調べるために、10mM リン酸ナトリウム(pH7.0),100mM NaCl,0.1mM EDTA溶液中で一本鎖DNA(ssDNA)および二本鎖DNA(dsDNA)が5μMとなるように溶液を調製し、アニーリング後、365nmでのUVトランスイルミネーター照射により蛍光を撮影した結果を図7に示した。
図8に、ETC−273T温度コントローラーを装備したJASCO FP−6500スペクトロメーターを用いて測定した各DNA断片の蛍光スペクトルを示した。Dssを含む一本鎖DNA断片(12−mer、5’−GGTAACN1ATGCG−3’、N1=Dss)(配列番号1)及びその相補鎖(12−mer、5’−CGCATN2GTTACC−3’、N2=Pn、Dss、Ds、もしくはT)(配列番号2)を含む二本鎖DNAを、10mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)、100mM NaCl、0.1mM EDTA溶液中で5μMとなるように調製し、アニーリング後、385nmでの励起による発光スペクトルを25℃で測定した。
A.Pnのデオキシリボヌクレオシド三リン酸(dPnTP)の濃度依存による蛍光性人工塩基Dssのデオキシリボヌクレオシド三リン酸(dDssTP,5μM)の蛍光強度の変化
ETC−273T温度コントローラーを装備したJASCO FP−6500スペクトロメーターを用いて、2mM、1mM、0.5mM、0.2mM、0.1mM、0.05mMのデオキシリボヌクレオシド三リン酸(dPnTP)を含む10mM リン酸ナトリウム(pH7.0),100mM NaCl,0.1mM EDTA溶液(100μl)に、デオキシリボヌクレオシド三リン酸(dDssTP、105μM)を5μl加えて、370nmでの励起によるdDssTPの発光スペクトルを20℃で測定した。
Pnならびに天然型塩基のデオキシリボヌクレオシド三リン酸による、蛍光性人工塩基のヌクレオシド三リン酸、dDssTP(5μM)の消光性をSteady−state Stern−Volmer plotにより解析した。
ここで、F0は、クエンチャーの存在しない場合の蛍光強度、F1はクエンチャーの存在する場合の蛍光強度を示し、[Q]はクエンチャーの濃度である。具体的には、クエンチャーの濃度[Q]を横軸に、そのクエンチャー濃度に対するF0/F1を縦軸にプロットし、最小二乗法により得られた直線からKSVを求めた。ここで、KSVの値が大きいほど消光能が強いクエンチャーであることを示す。グアニン塩基は消光性を有することが知られているが、Pnはさらに強い消光性を示すことがわかった。
5mMまたは5mM dPnまたはその各種誘導体存在下での終濃度5μM dDssの蛍光を、励起波長385nm、測定温度25℃で測定した結果を図10に示した。具体的には、各ヌクレオシド溶液(20μM dDss、20mM dPnおよびその各種誘導体)を以下の手順で調製した。
クレノウ断片による一塩基取り込み実験を、文献に従っておこなった(Kimoto,M.;Yokoyama,S.;Hirao,I.Biotechnol.Lett.2004,26,999−1005、Petruska,J.;Goodman,M.F.;Boosalis,M.S.;Sowers,L.C.;Cheong,C.;Tinoco,I.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1988,85,6252−6256、Goodman,M.F.;Creighton,S.;Bloom,L.B.;Petruska,J.Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.1993,28,83−126、Morales,J.C.;Kool,E.T.Nat.Struct.Biol.1998,5,950−954)。
5’末端を32Pで標識したプライマー(23−mer)(配列番号8)とPnもしくはPaを含む鋳型DNA(35−mer)(配列番号9)を、14mM MgCl2、0.2mM DTTを含有する20mM Tris−HCl(pH7.5)緩衝液中で、95℃で加温後、4℃へ緩やかに冷却することによりアニーリングし、鋳型鎖とプライマーの二本鎖を形成させた。このプライマー―鋳型二本鎖DNA溶液(400nM)を5μlずつ分注した後、2.5μlの各基質、即ちヌクレオシド三リン酸溶液(40μM dCTP、40μM dTTP、0−40μM dDssTP)を氷上で加えた。この溶液に、エキソヌクレアーゼ活性をもつクレノウ断片(KF exo+、TaKaRa)を滅菌水で希釈した酵素溶液(2.5μl、1ユニット)を加えることで反応を開始し、37℃で3分間保温後、10μlの10M尿素を含む1×TBE溶液(停止溶液)を加えて75℃で3分加温することで反応を止めた。反応産物を15%ポリアクリルアミド―7 M 尿素ゲルで電気泳動し、バンドパターンをバイオイメージングアナライザー(FLA7000、富士フィルム)によるオートラジグラフィーにより解析した。
所定濃度の人工塩基基質、NH2−hx−dPxTPおよびdDssTP、の存在下で、Dsを含む鋳型DNA(S2、55−mer)もしくは天然型塩基だけからなるDNA(対照、55−mer)を用いてPCRを行い、その産物を電気泳動により解析した結果を図12に示した。
DNA S2 (55−mer、下線部はプライマーのアニーリング部位)
5’−TTTCACACAGGAAACAGCTATGACGGCCCDsTTGCCCTATAGTGAGTCGTATTATC−3’(配列番号10)
DNA 対照 (55−mer、下線部はプライマーのアニーリング部位)
5’−TTTCACACAGGAAACAGCTATGACGGATCCATTCCCTATAGTGAGTCGTATTATC−3’(配列番号11)
5’側プライマー:
5’−CGTTGTAAAACGACGGCCAGGATAATACGACTCACTATAG−3’(配列番号12)
3’側プライマー:
5’−TTTCACACAGGAAACAGCTATGAC−3’(配列番号13)
PCR(反応スケール:40μl)は鋳型として最終濃度0.4nMのDNA断片を用いて実施し、94℃−30秒、45℃−30秒、65℃−4分を1サイクルとして20サイクル行った。反応液の最終組成は20mM Tris−HCl(pH8.8)、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1% TritonX−100、DeepVent DNAポリメラーゼ(0.02ユニット/μl、NEB)、1μM 5’側プライマー、1μM 3’側プライマー、0.3mM 各天然型塩基基質dNTP、10−25μM dDssTP、および25μM NH2−hx−dPxTPである。20サイクル後のPCR産物を15%ポリアクリルアミド―7M 尿素ゲルで電気泳動した。
所定濃度の人工塩基基質、NH2−hx−dPxTPおよびdDssTP、の存在下で、Dsを含む鋳型DNA(S2、55−mer)を用いてPCRを行い、その産物中に人工塩基Dssが保持されているかを、人工塩基基質dPa’TPもしくはddPa’TPを利用したDNAシーケンシングにより解析した結果を図13に示した。
DNA S2 (55−mer、下線部はプライマーのアニーリング部位)
5’−TTTCACACAGGAAACAGCTATGACGGCCCDsTTGCCCTATAGTGAGTCGTATTATC−3’(配列番号10)
PCR用プライマー
5’側プライマー:5’−CGTTGTAAAACGACGGCCAGGATAATACGACTCACTATAG−3’(配列番号12)
3’側プライマー:5’−TTTCACACAGGAAACAGCTATGAC−3’(配列番号13)
シーケンシング用プライマー:
5’−CGTTGTAAAACGACGGCCAG−3’(配列番号14)
PCR(反応スケール:25μl)は鋳型として最終濃度0.6nMのDNA断片を用いて実施し、94℃−30秒、45℃−30秒、65℃−4分を1サイクルとして15サイクル行った。反応液の最終組成は20mM Tris−HCl(pH8.8)、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1% TritonX−100、DeepVent DNAポリメラーゼ(0.02ユニット/μl、NEB)、1μM 5’側プライマー、1μM 3’側プライマー、0.3mM 各天然型塩基基質dNTP、2−10μM dDssTP、および2−50μM NH2−hx−dPxTPである。15サイクル後のPCR産物全長を変性ゲルで精製した後、DNAシーケンスの鋳型とし、シーケンシング解析をおこなった。
人工塩基Dssを含むプライマーを用いて、dPxTPの基質存在下でPCRを行った場合のリアルタイムPCRの原理を図14に示した。
5’−プライマー配列:5’−CATGTAGATGCCATCAAAGAAGCTC−3’(配列番号15)
3’−プライマー配列:5’−AATAATGCDssTCCTCAAAGGTGGTGACTTC−3’(配列番号16)
二本鎖鋳型DNA(98bp;片方の鎖のみ記載):
5’−CATGTAGATGCCATCAAAGAAGCTCTGAGCCTCCTAAATGACATGCGTGCTCTGGAGAACGAAAAGAACGAAGACGTAGAAGTCACCACCTTTGAGGA−3’(配列番号17)
具体的には、リアルタイムPCR装置(ストラタジーン、Mx3005P)を用いて、プライマー各1μM、天然型塩基基質dNTP 各0.2mM、人工塩基基質dPxTP 2μMの存在下、94℃−2分の後に、94℃−5秒、68℃−40秒を1サイクルとする2ステップPCRの条件で55サイクルのPCRを行った。PCRの反応スケールは25μlで、反応液の組成は40mM Tricine−KOH(pH8.0)、16mM KCl、3.5mM MgSO4、3.75μg/ml BSA、1×TitaniumTaq DNAポリメラーゼである。鋳型に用いたDNA断片は、反応液中にそれぞれ、0、3、15、30、150、300、1500、3000、15000、30000コピーになるように希釈し、それぞれの濃度につき、PCRを実施した。
Dssを含む2種類のDNA、hairpin ssDNA(34−mer)(配列番号18)とssDNA(12−mer)(配列番号19)を1×ExTaq Buffer(TaKaRa、2mM MgCl2含有)中で1μMとなるように調製し、Reference DyeあるROX(Invitrogen)存在下(最終濃度1000倍希釈)、温度変化による蛍光強度の変化をMx3005Pのdissociationモードで検出した。ROXのシグナル強度で補正したのち、35℃での値を基準として規格化したときのグラフを図16に示した。
各種DNA断片、モレキュラービーコン(MB−C、26−mer)(配列番号20)とTarget DNA(71G、71−mer)(配列番号21)をそれぞれ2μMとなるように調製し、等量(50μlずつ)混合した。ネガティブコントロールとして、Target DNAを含まない溶液を、MB−C溶液と混合した。最終的な溶液組成はDNA濃度各1μM、10mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)、100mM NaCl、0.1mM EDTAである。この溶液をPCRマシンにて90℃で10秒間加熱後、25℃まで徐冷した。励起波長375nmのUV−LEDランプによる照射下もしくは自然光下にて、デジタルカメラにより撮影した写真を図17の右に示した。
500nMに希釈したモレキュラービーコン(26−mer、MB−C(配列番号20)またはMB−T(配列番号23))の溶液を50μlずつ分注し、最終溶液の5倍濃度のTarget DNA断片(71−mer、71G(配列番号21)または71A(配列番号22)、12.5μl)と混合したサンプルをインキュベーターにて45℃で5分以上保温して平衡状態とした。蛍光測定はJASCO FP−6500 スペクトロメーターを用いて行い、セルに溶液を移したのち装置中(45℃設定)で2分放置後に、自動シャッター制御を使用して390nmで励起し430−470nmの蛍光スペクトルを測定した。最終溶液中の組成は、モレキュラービーコン 400nM、Target DNA 0−3200nM、10mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)、100mM NaCl、0.1mM EDTAである。
人工塩基Dssを含むプライマーを用いて、Cy3−hx−dPxTPの基質存在下でPCRを行った場合のリアルタイムPCRの原理を図19に示した。Dssに対してCy3−hx−dPxが相補鎖に取り込まれると、350nm付近の照射でDssとCy3間にFRETが起こるため、PCR増幅された二本鎖DNAを特異的に光らせることができる。また、このFRETによる蛍光は目視検出が可能なこともわかった(図20)。
実験に使用した配列 (下線部はプライマーアニーリング部位に相当)
5’−プライマー配列 :5’−CATGTAGATGCCATCAAAGAAGCTC−3’(配列番号15)
3’−プライマー配列 :5’−AATAATGCDssTCCTCAAAGGTGGTGACTTC−3’(配列番号16)
二本鎖鋳型DNA (98 bp;片方の鎖のみ記載):
5’−CATGTAGATGCCATCAAAGAAGCTCTGAGCCTCCTAAATGACATGCGTGCTCTGGAGAACGAAAAGAACGAAGACGTAGAAGTCACCACCTTTGAGGA−3’(配列番号17)
具体的には、リアルタイムPCR装置(ストラタジーン、Mx3005P)を用いて、プライマー各1μM、天然型塩基基質dNTP各0.2mM、人工塩基基質Cy3−hx−dPxTP 2μMの存在下、94℃−2分の後、94℃−5秒、68℃−40秒を1サイクルとする2ステップPCRの条件で55サイクルのPCRを行った。PCRの反応スケールは25μlで、反応液の組成は40mM Tricine−KOH(pH8.0)、16mM KCl、3.5mM MgSO4、3.75μg/ml BSA、1×TitaniumTaq DNAポリメラーゼである。鋳型に用いたDNA断片は、反応液中にそれぞれ、0、3、30、300、3000、30000、300000、3000000コピーになるように希釈し、それぞれの濃度につき、PCRを実施した。その反応チューブを直接、365nmのUVで照射し、オレンジフィルターを通して目視で蛍光を検出した。
人工塩基Dsを含むプライマーを用いて、蛍光性分子(Cy3など)を結合したdPxTP誘導体の基質存在下でPCRを行った場合のリアルタイムPCRの原理を図21に示した。蛍光性分子を、消光性のPx塩基に結合させると、蛍光性分子の蛍光が30%程度消光する。これを基質(Cy3−hx−dPxTP) にして、Ds塩基を導入したプライマーを用いたPCRを行うと、Cy3−hx−PxがDNA中に取り込まれることで、Cy3の蛍光強度が増大する。図22は、実際に下記のDNA断片を用いて、リアルタイムPCRを実施した結果であり、定量的な増幅プロットが得られ、反応液中(25μl)に3コピーのDNAでも検出可能であることがわかった。
5’−プライマー配列:5’−CATGTAGATGCCATCAAAGAAGCTC−3’(配列番号15)
3’−プライマー配列:5’−AATAATGCDsTCCTCAAAGGTGGTGACTTC−3’(配列番号24)
二本鎖鋳型DNA(98bp;片方の鎖のみ記載):
5’−CATGTAGATGCCATCAAAGAAGCTCTGAGCCTCCTAAATGACATGCGTGCTCTGGAGAACGAAAAGAACGAAGACGTAGAAGTCACCACCTTTGAGGA−3’(配列番号17)
具体的には、リアルタイムPCR装置 (ストラタジーン、Mx3005P)を用いて、プライマー各1μM、天然型塩基基質dNTP各0.2mM、人工塩基基質Cy3−hx−dPxTP 2μMの存在下、94℃−2分の後、94℃−5秒、68℃−40秒を1サイクルとする2ステップPCRの条件で55サイクルのPCRを行った。PCRの反応スケールは25μlで、反応液の組成は40mM Tricine−KOH(pH8.0)、16mM KCl、3.5mM MgSO4、3.75μg/ml BSA、1×TitaniumTaqDNAポリメラーゼである。鋳型に用いたDNA断片は、反応液中にそれぞれ、0、3、30、300、3000、30000、300000、3000000コピーになるように希釈し、それぞれの濃度につき、PCRを実施した。検出に用いたフィルターセットは、励起545nm−蛍光568nm(CY3用)である。データ解析には、付属の解析ソフトMxPro version 4.10を用いた。
図22に示したPCR産物は、Cy3が取り込まれているため、この産物をアガロースゲルで電気泳動した場合、従来のEtBrやSYBR GreenなどのDNA染色色素を用いることなく、ゲル上でPCR産物をCy3の蛍光で検出可能である。図23では、図22に示したPCR産物12μlを、4%アガロースゲルで電気泳動し、バイオイメージングアナライザー、FLA7000(富士フィルム)のCy3検出モード(励起レーザー:532nm、検出フィルター:O580)でバンドパターンを検出した結果を示した。
化学合成後HPLC精製したDNA断片を最終濃度が5μMとなるように、100mM NaCl、0.1mM EDTAを含む10mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7)で調製し、これらの溶液の蛍光特性を目視ならびに蛍光スペクトルで調べた結果を図24に示した。
人工塩基Dsおよび蛍光性人工塩基sを隣接して2つ含むプライマーを用いて、Cy3−hx−dPxTP基質存在下でPCRを行った場合のリアルタイムPCRの原理を図25に示した。sを隣接して2つ導入するとsの蛍光は完全に消光する。しかし、Sの近傍にDsを配置し、そのDsにCy3−hxが相補して特異的に組み込まれると、365nm付近の照射でSとCy3間にFRETが起こり、PCR増幅された二本鎖DNAのみを特異的に光らせることができる。
また、図28は図27aの可視化PCR産物をアガロースゲルで電気泳動した場合で、312nm照射でsからCy3へのFRETにより産物検出ができること、また532nm照射でDNA中に直接取り込まれたCy3の蛍光により産物検出ができることが確認できた。
5’−プライマー配列:5’−CATGTAGATGCCATCAAAGAAGCTC−3’(配列番号15)
3’−プライマー配列:5’−AATAASSGCDsTCCTCAAAGGTGGTGACTTC−3’(配列番号25)
二本鎖鋳型DNA (98 bp;片方の鎖のみ記載):
5’−CATGTAGATGCCATCAAAGAAGCTCTGAGCCTCCTAAATGACATGCGTGCTCTGGAGAACGAAAAGAACGAAGAC
GTAGAAGTCACCACCTTTGAGGA−3’(配列番号17)
図28では、図27aに示したPCR産物12μlを、4%アガロースゲルで電気泳動し、バイオイメージングアナライザー、LAS4000 (富士フィルム)のEtBr検出モード(励起:312nm透過UV、検出フィルター 605DF40)を用いてsとCy3間のFRETにより産物を検出した結果、およびFLA7000 (富士フィルム)
のCy3検出モード(励起レーザー:532nm、検出フィルター:O580)でCy3の蛍光から直接産物を検出した結果を示した。
本実施例は、図27aの実験の追実施例である。
5’−プライマー配列 :5’−CATGTAGATGCCATCAAAGAAGCTC−3’(配列番号15)
3’−プライマー配列:5’− AATAAssGCDsTCCTCAAAGGTGGTGACTTC−3’(配列番号26)
二本鎖鋳型DNA(98bp;片方の鎖のみ記載):
5’−CATGTAGATGCCATCAAAGAAGCTCTGAGCCTCCTAAATGACATGCGTGCTCTGGAGAACGAAAAGAACGAAGACGTAGAAGTCACCACCTTTGAGGA−3’(配列番号17)
PCR反応は、リアルタイムPCR装置(ストラタジーン、Mx3005P)を用いて、プライマー 各1μM、天然型塩基基質dNTP 各0.2mM、人工塩基基質Cy3−hx−dPxTP 2μMの存在下、94℃−2分の後、94℃−5秒、68℃−40秒を1サイクルとする2ステップPCRの条件で30、35、40、45、55サイクルのPCRを行った。
実施例20 蛍光性分子(s塩基)を天然型塩基にリンカーを介して結合したヌクレオシド誘導体(s−hx−dU)とDs−Px塩基対を用いたPCR産物の検出法(図29b−図29d)
本実施例は図29aの対実施例である。
5’−プライマー配列 :5’−CATGTAGATGCCATCAAAGAAGCTC−3’(配列番号15)
3’−プライマー配列 :5’− AATAAUsUsGCDsTCCTCAAAGGTGGTGACTTC−3’(配列番号27)
二本鎖鋳型DNA (98 bp;片方の鎖のみ記載):
5’−CATGTAGATGCCATCAAAGAAGCTCTGAGCCTCCTAAATGACATGCGTGCTCTGGAGAACGAAAAGAACGAAGACGTAGAAGTCACCACCTTTGAGGA−3’(配列番号17)
具体的には、リアルタイムPCR装置(ストラタジーン、Mx3005P)を用いて、プライマー各1μM、天然型塩基基質dNTP各0.2mM、人工塩基基質Cy3−hx−dPxTP 2μMの存在下、94℃−2分の後、94℃−5秒、68℃−40秒を1サイクルとする2ステップPCRの条件で55サイクルのPCRを行った。PCRの反応スケールは25μlで、反応液の組成は40mM Tricine−KOH(pH8.0)、16mM KCl、3.5mM MgSO4、3.75μg/ml BSA、1×TitaniumTaq DNAポリメラーゼである。鋳型に用いたDNA断片は、反応液中にそれぞれ、0、3、30、300、3000、30000、300000、3000000コピーになるように希釈し、それぞれの濃度につき、PCRを実施した。その反応チューブを直接、365nmのUVで照射し、オレンジフィルターを通して目視で蛍光を検出した。
8−ブロモ−1−オクチンの合成(図30の工程(a))
8−ヒドロキシ−1−オクチン(1.95g,15mmol)に脱水ジクロロメタン(20ml)、トリフェニルホスフィン(5.91g,22.5mmol)を加え、0℃に冷却後、脱水ジクロロメタン(10ml)に溶解させた四臭化炭素(7.46g,22.5mmol)を滴下し、室温で2時間攪拌した。ジクロロメタン(100ml)、5% 炭酸水素ナトリウム(150ml)で分液、有機層を飽和食塩水(150ml)で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン:メタノール=100:0→99:1)で精製し、8−ブロモ−1−オクチン(crude)を得た。
1H NMR(300MHz,DMSO−d6) δ 3.51(t,2H,J=6.7Hz),2.71(t,1H,J=2.7Hz),2.12−2.17(m,2H),1.75−1.84(m,2H),1.24−1.54(m,6H).
2) 6−(チエン−2−イル)−9−(7−オクチニル)−2−アミノプリンの合成(図30の工程(b))
6−(チエン−2−イル)−2−アミノプリン(1.2g,5.5mmol)と炭酸カリウム(2.3g,16.5mmol)の脱水ジメチルホルムアミド(25ml)溶液に、1)で得られた8−ブロモ−1−オクチン(2.0g,10.6mmol)を加えて、室温で15時間撹拌した。反応溶液を濃縮し、酢酸エチルと水で分液し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し中圧分取カラムクロマトグラムにより精製して6−(チエン−2−イル)−9−(7−オクチニル)−2−アミノプリン(1.6g,4.9mmol,87%)を得た。
1H NMR(300MHz,DMSO−d6) δ 8.53(dd,1H,J=1.2,3.7Hz),8.14(s,1H),7.79(dd,1H,J=1.2,5.0Hz),7.26(dd,1H,J=3.7,5.0Hz),6.48(brs,2H),4.05(t,2H,J=7.2Hz),2.72(t,1H,J=2.6Hz),2.12(m,2H),1.78(m,2H),1.23−1.46(m,6H).
3) 6−(チエン−2−イル)−9−(7−オクチニル)−2−フェノキシアセタミドプリンの合成(図30の工程(c))
1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(1.19g,8.84mmol)を脱水ピリジンで3回共沸乾燥し、脱水ピリジン(2.5ml)、脱水アセトニトリル(2.5ml)、フェノキシアセチルクロリド(1.08ml,7.85mmol)を加え、室温で5分間攪拌後、0℃に冷却し、これに脱水ピリジン(25mL)に溶解した。2)で得られた6−(チエン−2−イル)−9−(7−オクチニル)−2−アミノプリン(1.60g,4.91mmol)を加え、室温で一晩攪拌した。酢酸エチル(150ml)、飽和食塩水(150ml×2回)で分液し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン:メタノール=100:0→99:1)で精製し、6−(チエン−2−イル)−9−(7−オクチニル)−2−フェノキシアセタミドプリン(1.44g,3.13mmol,64%)を得た。
1H NMR(300MHz,DMSO−d6) δ 10.71(s,1H),8
.62(d,1H,J=2.6Hz),8.54(s,1H),7.92(dd,1H,J=1.1,5.0Hz),7.31(m,3H),6.92−6.93(m,3H),5.15(brs,2H),4.20(t,2H,J=7.1Hz),2.71(t,1H,J=2.6Hz),2.09−2.13(m,2H),1.82−1.92(m,2H),1.27−1.41(m,6H).
4) 5−[6−(チエン−2−イル)−9−(7−オクチニル)−2−フェノキシアセタミドプリン]−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシウリジンの合成(図30の工程(d))
5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−5−ヨード−2’−デオキシウリジン(1.64g,2.5mmol)、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(145mg,0.125mmol)、ヨウ化銅(76mg,0.4mmol)、脱水ジメチルホルムアミド(7.5ml)を加え、アルゴンガスで置換し、脱水トリエチルアミン(523μl,3.75mmol)を加えた後、脱水ジメチルホルムアミド(5ml)、脱水ピリジン(10ml)に溶解した、3)で得られた6−(チエン−2−イル)−9−(7−オクチニル)−2−フェノキシアセタミドプリン(1.38g,3.00mmol)を加え、マイクロウェーブ装置(スタンダードモード)で60℃,3時間攪拌した。酢酸エチル(100ml)、水(100ml)で分液、有機層を飽和食塩水(100ml)で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン:メタノール=100:0→97:3)で精製し、5−[6−(チエン−2−イル)−9−(7−オクチニル)−2−フェノキシアセタミドプリン]−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシウリジン(931mg,0.94mmol,38%)を得た。
1H NMR(300MHz,DMSO−d6) δ 11.59(brs,1H),
10.70(brs,1H),8.61(dd,1H,J=0.9,3.8Hz),8.51(s,1H),7.92(dd,1H,J=0.9,5.0Hz),7.87(s,1H),7.17−7.37(m,12H),6.82−6.96(m,7H),6.11(t,1H,J=6.6Hz),5.31(d,1H,J=4.4Hz),5.14(brs,2H),4.02−4.28(m,3H),3.70−3.91(m,1H),3.12−3.16(m,2H),2.04−2.24(m,4H),1.76−1.99(m,2H),1.15−1.20(m,6H).
5) 5−[6−(チエン−2−イル)−9−(7−オクチニル)−2−フェノキシアセタミドプリン]−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシウリジン−3’−O−(2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピル)ホスホロアミダイトの合成(図30の工程(e))
4)で得られた5−[6−(チエン−2−イル)−9−(7−オクチニル)−2−フェノキシアセタミドプリン]−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシウリジン(890mg,0.9mmol)を脱水ピリジンで3回、脱水テトラヒドロフランで3回共沸乾燥した。次いで、脱水テトラヒドロフラン(4.5ml)、脱水ジイソプロピルエチルアミン(235μl,1.35mmol)、2−シアノエチル N,N’−ジイソプロピルクロロホスホルアミジド(241μl,1.08mmol)を加え、室温で1時間攪拌した。脱水メタノール(50μl)を加え、酢酸エチル:トリエチルアミン(20:1,50ml)、5% 炭酸水素ナトリウム(50ml)で分液、有機層を飽和食塩水(100ml)で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル:トリエチルアミン=98:0:2→78:20:2)で精製し、5−[6−(チエン−2−イル)−9−(7−オクチニル)−2−フェノキシアセタミドプリン]−5’−O−(4,4’−ジメトキシ
トリチル)−2’−デオキシウリジン−3’−O−(2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト(867mg,0.73mmol,81%)を得た。
31P NMR(121MHz,DMSO−d6) δ 148.67,148.32.
実施例22 Dss−hx−dUアミダイト試薬(図6の化合物)の化学合成(図33)
1)7−(2,2’−ビチエン−5−イル)−3−(7−オクチニル)−イミダゾ[4,5−b]ピリジンの合成(図33の工程(a))
7−(2,2’−ビチエン−5−イル)−イミダゾ[4,5−b]ピリジン(850mg,3.0mmol)と炭酸カリウム(1.3g,9.0mmol)のDMF(15ml)溶液を60℃で1時間撹拌した。次いで、8−ブロモ−1−オクチン(850mg,4.5mmol)を加えて、60℃で6時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと水で分液し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し中圧分取カラムクロマトグラムにより精製して7−(2,2’−ビチエン−5−イル)−3−(7−オクチニル)−イミダゾ[4,5−b]ピリジン(520mg,1.3mmol,44%)を得た。
1H NMR(300MHz,DMSO−d6) δ 8.56(s,1H),8.34(d,1H,J=5.2Hz),8.21(d,1H,J=3.9Hz),7.63(d,1H,J=5.2Hz),7.58(dd,1H,J=1.1,5.1Hz),7.46(dd,1H,J=1.1,3.6Hz),7.44(d,1H,J=4.0Hz),7.14(dd,1H,J=3.6,5.1Hz),4.29(t,2H,J=7.4Hz),2.72(t,1H,J=2.7Hz),2.12(m,2H),1.87(m,2H),1.43−1.31(m,6H).
2) 5−[7−(2,2’−ビチエン−5−イル)−3−(7−オクチニル)−イミダゾ[4,5−b]ピリジン]−2’−デオキシウリジンの合成(図33の工程(b))
5−ヨード−2’−デオキシウリジン(294mg,0.83mmol)、7−(2,2’−ビチエニル)−3−(7−オクチニル)−イミダゾ[4,5−b]ピリジン(270mg,0.69mmol)、CuI(25mg)、テトラキストリフェニルホスフィン(48mg)、トリエチルアミン(173μl)のDMF(4.2ml)溶液を室温で17時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと水で分液し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥しカラムクロマトグラム(3%メタノールの塩化メチレン溶液で溶出)により精製して5−[7−(2,2’−ビチエン−5−イル)−3−(7−オクチニル)−イミダゾ[4,5−b]ピリジン]−2’−デオキシウリジン(155mg,0.25mmol,36%)を得た。
1H NMR(300MHz,DMSO−d6) δ 11.54(s,1H),8.56(s,1H),8.34(d,1H,J=5.2Hz),8.21(d,1H,J=3.9Hz),8.09(s,1H),7.63(d,1H,J=5.2Hz),7.58(dd,1H,J=1.1,5.1Hz),7.46(dd,1H,J=1.1,3.6Hz),7.44(d,1H,J=4.1Hz),7.14(dd,1H,J=3.6,5.1Hz),6.10(t,1H,J=6.9Hz),5.21(d,1H,J=4.3Hz),5.06(t,1H,J=5.0Hz),4.30(t,2H,J=7.2Hz),4.21(m,1H),3.77(m,1H),3.56(m,2H),2.33(m,2H),2.09(m,2H),1.88(m,2H),1.45(m,4H),1.29(m,2H).
3) 5−[7−(2,2’−ビチエン−5−イル)−3−(7−オクチニル)−イミダゾ[4,5−b]ピリジン]−5’−O−(4,4−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシウリジンの合成(図33の工程(c))
5−[7−(2,2’−ビチエン−5−イル)−3−(7−オクチニル)−イミダゾ[4,5−b]ピリジン]−2’−デオキシウリジン(150mg,0.24mmol)、4,4’−ジメトキシトリチルクロリド(91mg,0.27mmol)のピリジン(2.4ml)溶液を室温で1時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと5%炭酸水素ナトリウム水溶液で分液し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥しカラムクロマトグラム(2%メタノールの塩化メチレン溶液で溶出)により精製して5−[7−(2,2’−ビチエニル)−3−(7−オクチニル)−イミダゾ[4,5−b]ピリジン]−5’−O−(4,4−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシウリジン(183mg,0.2mmol,82%)を得た。
1H NMR(300MHz,DMSO−d6) δ 11.58(s,1H),8.53(s,1H),8.32(d,1H,J=5.2Hz),8.20(d,1H,J=3.9Hz),7.87(s,1H),7.60−7.57(m,2H),7.46−7.43(m,2H),7.35−7.32(m,2H),7.26−7.13(m,8H),6.81(d,4H,J=9.0Hz),6.10(t,1H,J=7.0Hz),5.30(d,1H,J=4.4Hz),4.26(m,3H),3.89(m,1H),3.69(s,6H),3.15(m,2H),2.18(m,2H),2.05(m,2H),1.78(m,2H),1.22−1.13(m,6H).
4) 5−[7−(2,2’−ビチエン−5−イル)−3−(7−オクチニル)−イミダゾ[4,5−b]ピリジン]−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシウリジン−3’−O−(2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピル)ホスホロアミダイトの合成(図33の工程(d))
5−[7−(2,2’−ビチエン−5−イル)−3−(7−オクチニル)−イミダゾ[4,5−b]ピリジン]−5’−O−(4,4−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシウリジン (180mg,0.2mmol)をピリジンで3回、THFで3回共沸乾燥した後、THF(1.0ml)とジイソプロピルエチルアミン(52μl)を加えて撹拌した。この溶液に、2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト(54μl,0.24mmol)を加えて室温で1時間撹拌した。反応溶液に脱水メタノール(50μl)を加えた後、酢酸エチル/トリエチルアミン(20:1,v/v)と5%炭酸水素ナトリウム水溶液で分液した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して濃縮した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラム(酢酸エチル:塩化メチレン:トリエチルアミン、45:45:10、v/v/vで溶出)で精製して5−[7−(2,2’−ビチエン−5−イル)−3−(7−オクチニル)−イミダゾ[4,5−b]ピリジン]−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシウリジン−3’−O−(2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト(220mg,99%)を得た。
1H NMR(300MHz,DMSO−d6) δ 11.59(s,1H),8.53(s,s,1H,1H),8.32(d,1H,J=5.2Hz),8.20(d,1H,J=3.9Hz),7.89(d,1H,J=2.1Hz),7.60−7.57(m,2H),7.46−7.43(m,2H),7.34(m,2H),7.26−7.13(m,8H),6.81(m,4H),6.98(dt,1H,J=6.3,6.5Hz),4.47(m,1H),4.25(t,2H,J=6.9Hz),4.05−3.98(m,1H),3.71(m,1H),3.69(s,6H),3.60−3.42(m,2H),3.20(m,2H),2.73(t,1H,J=5.9Hz),2.61(t,1H,J=5.9Hz),2.44−2.25(m,2H),2.07(m,2H),1.77(m,2H),1.09(m,18H).
31P NMR(121MHz,DMSO−d6) δ 148.68,148.32.
実施例23 図2及び図3の化合物の合成
1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−2−ニトロピロール(456mg,2mmol)のアセトニトリル(8ml)溶液にN−ヨードスクシンイミド(900mg,4mmol)を加えた。室温で一晩反応後、酢酸エチル(200ml)、水(200ml)で分液し、有機層を濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーおよびHPLC精製し、1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−ヨード−2−ニトロピロール(587mg,1.66mmol,83%)を得た。
1H NMR(270MHz,DMSO−d6) δ 7.90(d,1H,J=2.0Hz),7.40(d,1H,J=2.0Hz),6.54(t,1H,J=5.6Hz),5.27(d,1H,J=4.3Hz),5.10(t,1H,J=4.9Hz),4.23(m,1H),3.83(m,1H),3.53−3.85(m,2H),2.18−2.45(m,2H).
2) 1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−(チエン−2−イル)−2−ニトロピロールの合成
1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−ヨード−2−ニトロピロール(177mg,0.5mmol)、二塩化ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)(18mg,0.025mmol)のDMF(2.5ml)溶液に2−(トリブチルスタニル)チオフェン(476μl,1.5mmol)を加えた。マイクロウェーブ装置(スタンダードモード)で100℃,30分間反応後、酢酸エチル(50ml)、水(50ml)で分液し、有機層を濃縮した。これをHPLC精製し、1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−(チエン−2−イル)−2−ニトロピロール(97mg,0.32mmol,63%)を得た。
1H NMR(300MHz,DMSO−d6) δ 8.13(d,1H,J=2.3Hz),7.52(d,1H,J=2.3Hz),7.42(dd,1H,J=1.1,5.1Hz),7.33(dd,1H,J=1.1,3.5Hz),7.06(dd,1H,J=3.6,5.1Hz),6.59(t,1H,J=5.7Hz),5.30(d,1H,J=4.6Hz),5.17(t,1H,J=5.1Hz),4.28(m,H),3.86(m,1H),3.70−3.74(m,1H),3.58−3.69(m,1H),2.41−2.45(m,1H),2.25−2.33(m,1H).
3) 1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−(フラン−2−イル)−2−ニトロピロールの合成
1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−ヨード−2−ニトロピロール(177mg,0.5mmol)、二塩化ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)(18mg,0.025mmol)のDMF(2.5ml)溶液に2−(トリブチルスタニル)フラン(472μl,1.5mmol)を加えた。マイクロウェーブ装置(スタンダードモード)で100℃,30分間反応後、酢酸エチル(50ml)、水(50ml)で分液し、有機層を濃縮した。これをHPLC精製し、1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−(フラン−2−イル)−2−ニトロピロール(111mg,0.38mmol,76%)を得た。
1H NMR(300MHz,DMSO−d6) δ 8.08(d,1H,J=2.3Hz),7.63(dd,1H,J=0.7,1.8Hz),7.50(d,1H,J=2.3Hz),6.69(dd,1H,J=0.7,3.3Hz),6.61(t,1H,J=5.7Hz),6.53(dd,1H,J=1.8,3.3Hz),5.29(d,1H,J=4.4Hz),5.12(t,1H,J=5.1Hz),4.27(m,1H),3.87(m,1H),3.65−3.72(m,1H),3.56−3.63(m,1H),2.41−2.46(m,1H),2.23−2.31(m,1H).
4) 1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−(2,2’−ビチエン−5−イル)−2−ニトロピロールの合成
1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−ヨード−2−ニトロピロール(177mg,0.5mmol)、二塩化ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)(18mg,0.025mmol)のDMF(2.5ml)溶液に2−(トリブチルスタニル)ジチオフェン(341mg,0.75mmol)を加えた。マイクロウェーブ装置(スタンダードモード)で100℃,30分間反応後、酢酸エチル(50ml)、水(50ml)で分液し、有機層を濃縮した。これをHPLC精製し、1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−(2,2’−ビチエン−5−イル)−2−ニトロピロール(90mg,0.23mmol,46%)を得た。
1H NMR(300MHz,DMSO−d6) δ 8.15(d,1H,J=2.3Hz),7.57(d,1H,J=2.3Hz),7.50(dd,1H,J=1.1,5.1Hz),7.24−7.31(m,3H),7.08(dd,1H,J=3.6,5.1Hz),6.60(t,1H,J=5.7Hz),5.28(d,1H,J=3.6Hz),5.17(t,1H,J=5.2Hz),4.29(m,1H),3.87(m,1H),3.68−3.75(m,1H),3.57−3.65(m,1H),2.41−2.46(m,1H),2.26−2.34(m,1H).
5) 1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−メチル−2−ニトロピロールの合成
1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−ヨード−2−ニトロピロール(142mg,0.4mmol)、二塩化ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)(14mg,0.02mmol)、トリフェニルアルシン(12mg,0.04mmol)のDMF(2ml)溶液にテトラメチルスズ(287μl,2mmol)を加えた。60℃,2日間反応後、酢酸エチル(50ml)、水(50ml)で分液し、有機層を濃縮した。これをHPLC精製し、1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−メチル−2−ニトロピロール(15mg,0.06mmol,15%)を得た。
1H NMR(300MHz,DMSO−d6) δ 7.55(d,1H,J=2.8Hz),7.09(d,1H,J=2.2Hz),6.55(t,1H,J=5.9Hz),5.27(d,1H,J=4.3Hz),5.00(t,1H,J=5.3Hz),4.22(m,1H),3.82(m,1H),3.52−3.64(m,2H),2.34−2.42(m,1H),2.11−2.19(m,1H),2.02(s,3H).
6) 1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−プロピニル−2−ニトロピロールの合成(図3、R=−CH3)
1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−ヨード−2−ニトロピロール(180mg,0.5mmol)、二塩化ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)(38mg,0.05mmol)のDMF(5ml)溶液にトリブチル(1−プロピニル)スズ(327μl,1mmol)を加えた。100 ℃, 90分間反応後、濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーおよびHPLC精製し、1−(2−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−4−プロピニル−2−ニトロピロール(76mg,0.28mmol,57%)を得た。
1H NMR(300MHz,DMSO−d6) δ 7.92(d,1H,J=2.2Hz),7.27(d,1H,J=2.2Hz),6.55(t,1H,J=5.7Hz),5.28(d,1H,J=4.5Hz),5.11(t,1H,J=5.2Hz),4.24(m,1H),3.85(m,1H),3.53−3.70(m,2H),2.45(m,1H),2.22(m,1H),1.99(s,3H).
[配列表]
240−410nmの紫外線による励起により、7−(2,2’−ビチエン−5−イル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Dss)から、式VIの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用(static quenching)などにより蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、
ここにおいて、Dsを塩基として有するポリヌクレオシドを含む核酸と同一鎖上に、少なくとも1つの7−(2,2’−ビチエン−5−イル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Dss)が天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドが存在する、
前記方法。
[態様16]
蛍光性分子が、インドカルボシアニン(Cy3)、インドジカルボシアニン(Cy5)、5−カルボキシフルオレセイン(5−FAM)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、5−カルボキシテトラメチルローダミン(5−TAMRA)、6−カルボキシテトラメチルローダミン(6−TAMRA)、5−ジメチルアミノナフタレン−1−スルホン酸(DANSYL)、5−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(5−HEX)、6−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(6−HEX)、5−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(5−TET)、6−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(6−TET)、5−カルボキシ−X−ローダミン(5−ROX)、及び6−カルボキシ−X−ローダミン(6−ROX)からなる群から選択される、態様11ないし15のいずれか1項に記載の方法。
[態様17]
式VIの塩基中の置換基R6が以下の:
[態様18]
蛍光スペクトルの変化が、肉眼で判定できる、態様11ないし17のいずれか1項に記載の方法。
[態様19]
核酸の塩基対が、転写、逆転写、複製又は翻訳の工程で形成される、態様11ないし18のいずれか1項に記載の方法。
[態様20]
以下のi)−iv)からなる群から選択される、1つの核酸プライマー;
i)7−(2,2’−ビチエン−5−イル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Dss)を塩基として有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー;
ii)7−(2−チエニル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン3−イル基(Ds)を塩基として有するポリヌクレオシド、及び、少なくとも1つの、2−アミノ−6−(2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基(s)を塩基として有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー;
iii)7−(2−チエニル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Ds)を塩基として有するポリヌクレオシド、及び、少なくとも1つの、2−アミノ−6−(2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基(s)が天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー;及び
iv)7−(2−チエニル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン3−イル基(Ds)を塩基として有するポリヌクレオシド、及び、7−(2,2’−ビチエン−5−イル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Dss)が天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー、
並びに、式VIの塩基:
本発明はまた、
以下のi)−iv)からなる群から選択される、1つの核酸プライマー;
i)Dssを塩基として有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー;
ii)Dsを塩基として有するポリヌクレオシド、及び、少なくとも1つのsを塩基として有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー;
iii)Dsを塩基として有するポリヌクレオシド、及び、少なくとも1つのsが天然型塩基に結合した少なくとも1の塩基を有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー;及び
iv)Dsを塩基として有するポリヌクレオシド、及び、Dssが天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー、
並びに、式VIの塩基
を塩基として有するポリヌクレオチド
を含む、蛍光共鳴エネルギー転移ならびに静的消光作用(static quenching)などによる蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法に使用するためのキットを提供する。
Claims (20)
- 式Iで示す2−ニトロピロール構造を有する消光剤
リボース、デオキシリボース、
水素、水酸基、SH基、ハロゲン、
置換又は未置換の、炭素数2ないし10のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、
窒素原子または硫黄原子を含む、1又は複数の5員ヘテロ環、1又は複数の6員ヘテロ環、1又は複数の複素環ヘテロ環、1又は複数の芳香族環、
糖、糖鎖、アミノ酸、ペプチド、
リンカーを介して結合した蛍光性分子
からなる群から独立に選択される基である]。 - 式Iにおいて、R1がリボースまたはデオキシリボースである、請求項1に記載の消光剤。
- 人工塩基対の形成を検出する方法であって、
1)式II
水素、水酸基、SH基、ハロゲン、
置換又は未置換の、炭素数2ないし10のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、
窒素原子または硫黄原子を含む、1又は複数の5員ヘテロ環、1又は複数の6員ヘテロ環、1又は複数の複素環ヘテロ環、1又は複数の芳香族環、
糖、糖鎖、アミノ酸、ペプチド、
リンカーを介して結合した蛍光性分子、
からなる群から選択される基である]
で表される消光性人工塩基を有するヌクレオシドまたはヌクレオチド、あるいは、
2)蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)又は静的消光作用の供与体となりうる自己消光性を有する天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するヌクレオシドまたはヌクレオチド
のいずれか、あるいは双方を用いることを特徴とする、前記方法。 - 人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、蛍光性人工塩基と式II
水素、水酸基、SH基、ハロゲン、
置換又は未置換の、炭素数2ないし10のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、
窒素原子または硫黄原子を含む、1又は複数の5員ヘテロ環、1又は複数の6員ヘテロ環、1又は複数の複素環ヘテロ環、1又は複数の芳香族環、
糖、糖鎖、アミノ酸、ペプチド、
リンカーを介して結合した蛍光性分子、
からなる群から選択される基である]
で表される消光性人工塩基との塩基対形成により、蛍光性人工塩基の蛍光の低下を観察することにより、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。 - 蛍光性人工塩基の蛍光の低下により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、以下の
(i)7−(2,2’−ビチエン−5−イル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Dss);
(ii)7−(2,2’,5’,2’’−ターチエン−5−イル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Dsss);
(iii)2−アミノ−6−(2,2’−ビチエン−5−イル)プリン−9−イル基(ss);
(iv)2−アミノ−6−(2,2’,5’,2’’−ターチエン−5−イル)プリン−9−イル基(sss);
(v)4−(2,2’−ビチエン−5−イル)−ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル基(Dsas);
(vi)4−[2−(2−チアゾリル)チエン−5−イル]ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル基(Dsav);及び
(vii)4−[5−(2−チエニル)チアゾール−2−イル]ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル基(Dvas);
からなる群より選択される蛍光性人工塩基と、
以下の式III,又は式IVの消光性塩基
−H、ヨード、−CH3、
−CH3、−CH2−NH2、及び
から選択される]
との間で塩基対が形成されると、蛍光性人工塩基の蛍光が低下し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。 - 7−(2,2’−ビチエン−5−イル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Dss)を塩基として有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー;並びに、
以下の式III,又は式IVの消光性塩基
−H、ヨード、−CH3、
−CH3、−CH2−NH2、及び
から選択される]
を塩基として有するポリヌクレオチド
を含む、蛍光性人工塩基の蛍光の低下により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法に使用するためのキット。 - 人工塩基対を検出する方法であって、
式V
で表される消光性人工塩基中の蛍光性分子の蛍光強度が、式Vの人工塩基が塩基対を形成することによって変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。 - 蛍光強度の変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、
7−(2−チエニル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン3−イル基(Ds)と、以下の式VIの塩基:
式VIの塩基中の蛍光性分子の蛍光強度が増加し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。 - 蛍光性分子が、インドカルボシアニン(Cy3)、インドジカルボシアニン(Cy5)、5−カルボキシフルオレセイン(5−FAM)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、5−カルボキシテトラメチルローダミン(5−TAMRA)、6−カルボキシテトラメチルローダミン(6−TAMRA)、5−ジメチルアミノナフタレン−1−スルホン酸(DANSYL)、5−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(5−HEX)、6−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(6−HEX)、5−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(5−TET)、6−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(6−TET)、5−カルボキシ−X−ローダミン(5−ROX)、及び6−カルボキシ−X−ローダミン(6−ROX)からなる群から選択される、請求項7又は8に記載の方法。
- 7−(2−チエニル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン3−イル基(Ds)を塩基として有するポリヌクレオシドを含む、核酸プライマー、並びに、
式VIの塩基:
を含む、蛍光強度の変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法に使用するためのキット。 - 人工塩基対の形成を検出する方法であって、
蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)又は静的消光作用の供与体となりうる自己消光性を有する天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するポリヌクレオシドを含む核酸を利用し、当該核酸中の人工塩基(第一人工塩基)と蛍光性分子を有する人工塩基(第二人工塩基)との間で人工塩基対が形成されると、前記天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するポリヌクレオシドから、第二人工塩基の有する蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移又は静的消光作用が生じて、蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。 - 蛍光共鳴エネルギー転移又は静的消光作用による蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、
7−(2,2’−ビチエン−5−イル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Dss)と、以下の式VIの塩基:
240−410nmの紫外線による励起により、Dssから式VIの塩基中の蛍光性分子
への蛍光共鳴エネルギー転移又は静的消光作用が生じて、蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。 - 蛍光共鳴エネルギー転移又は静的消光作用による蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、
7−(2−チエニル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン3−イル基(Ds)と、以下の式VIの塩基:
240−390nmの紫外線による励起により、少なくとも1つの2−アミノ−6−(2−チエニル)プリン−9−イル基(s)から、式VIの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移又は静的消光作用が生じ、蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、
ここにおいて、Dsを塩基として有するポリヌクレオシドを含む核酸と同一鎖上に、2−アミノ−6−(2−チエニル)プリン−9−イル基(s)を塩基として有するポリヌクレオチドが少なくとも1つ存在する、前記方法。 - 蛍光共鳴エネルギー転移又は静的消光作用による蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、
7−(2−チエニル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Ds)と、以下の式VIの塩基:
350−390nmの紫外線による励起により、少なくとも1つの2−アミノ−6−(2−チエニル)プリン−9−イル基(s)から、式VIの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移又は静的消光作用が生じて蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、
ここにおいて、Dsを塩基として有するポリヌクレオシドを含む核酸と同一鎖上に、少なくとも1つの2−アミノ−6−(2−チエニル)プリン−9−イル基(s)が天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドが少なくとも1つ存在する、
前記方法 - 蛍光共鳴エネルギー転移又は静的消光作用による蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、
7−(2−チエニル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン3−イル基(Ds)と、以下の式VIの塩基:
240−410nmの紫外線による励起により、7−(2,2’−ビチエン−5−イル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Dss)から、式VIの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移又は静的消光作用が生じて蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、
ここにおいて、Dsを塩基として有するポリヌクレオシドを含む核酸と同一鎖上に、少
なくとも1つの7−(2,2’−ビチエン−5−イル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Dss)が天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドが存在する、
前記方法。 - 蛍光性物質が、インドカルボシアニン(Cy3)、インドジカルボシアニン(Cy5)、5−カルボキシフルオレセイン(5−FAM)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、5−カルボキシテトラメチルローダミン(5−TAMRA)、6−カルボキシテトラメチルローダミン(6−TAMRA)、5−ジメチルアミノナフタレン−1−スルホン酸(DANSYL)、5−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(5−HEX)、6−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(6−HEX)、5−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(5−TET)、6−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(6−TET)、5−カルボキシ−X−ローダミン(5−ROX)、及び6−カルボキシ−X−ローダミン(6−ROX)からなる群から選択される、請求項11ないし15のいずれか1項に記載の方法。
- 式VIの塩基中の置換基R6が以下の:
- 検出スペクトルの変化が、肉眼で判定できる、請求項11ないし17のいずれか1項に記載の方法。
- 核酸の塩基対が、転写、逆転写、複製又は翻訳の工程で形成される、請求項11ないし18のいずれか1項に記載の方法。
- 以下のi)−iii)からなる群から選択される、1つの核酸プライマー;
i)7−(2,2’−ビチエン−5−イル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Dss)を塩基として有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー;
ii)7−(2−チエニル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン3−イル基(Ds)を塩基として有するポリヌクレオシド、及び、少なくとも1つの、2−アミノ−6−(2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基(s)を塩基として有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー;
iii)7−(2−チエニル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Ds)を塩基として有するポリヌクレオシド、及び、少なくとも1つの、2−アミノ−6−(2−チエニル)−9H−プリン−9−イル基(s)が天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー;及び
iv)7−(2−チエニル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン3−イル基(Ds)を塩基として有するポリヌクレオシド、及び、7−(2,2’−ビチエン−5−イル)イミダゾ[4,5−b]ピリジン−3−イル基(Dss)が天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー、
並びに、式VIの塩基:
を塩基として有するポリヌクレオチド
を含む、蛍光共鳴エネルギー転移又は静的消光作用による蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法に使用するためのキット。
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