JPWO2011074578A1 - 脂質膜構造体に細胞透過能を付与および／または脂質膜構造体の細胞透過能を増強するペプチド、ならびにそれらペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む、細胞透過能を有するまたは細胞透過能が増強された脂質膜構造体 - Google Patents

Abstract

【課題】 脂質膜構造体に細胞透過能を付与および／または脂質膜構造体の細胞透過能を増強するペプチド、ならびにそれらペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む、細胞透過能を有するまたは細胞透過能が増強された脂質膜構造体を提供する。【解決手段】 脂質膜構造体に細胞透過能を付与および／または脂質膜構造体の細胞透過能を増強するペプチドのアミノ酸配列が下記ＬＸ１Ｘ２Ｘ１Ｘ１Ｘ１Ｌ、ＬＬＸ２Ｘ１Ｘ１Ｘ１ＬまたはＬＸ１Ｘ２Ｘ１Ｘ１Ｌ（式中、Ｌはロイシン残基を、Ｘ１は極性アミノ酸残基を、Ｘ２は極性無電荷側鎖アミノ酸残基を、それぞれ表す。）である。

Description

本発明は、脂質膜構造体に細胞透過能を付与および／または脂質膜構造体の細胞透過能を増強するペプチド、ならびにそれらペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む、細胞透過能を有するまたは細胞透過能が増強された脂質膜構造体に関する。

タンパク質、薬剤、あるいは核酸などの物質を、生物個体の標的部位に確実に送達するためのベクターやキャリアーの開発が盛んに行われている。例えば、目的の遺伝子を標的細胞へ導入するためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスなどのウイルスベクターが開発されている。しかしながら、ウイルスベクターは、大量生産の困難性、抗原性、毒性などの問題があるため、このような問題点が少ないリポソームベクターに代表される脂質膜構造体やペプチドキャリアーが注目を集めている。

リポソームベクターは、人工的に調製される脂質二重膜を基本構成とする脂質膜構造体であり、様々な物質を内包して標的細胞内に送り込む能力を有している。リポソームベクターは、その表面に抗体、タンパク質、糖鎖などの機能性分子を導入することにより、標的部位に対する指向性を向上させることができるという利点の他、物質が内包されるために生体内の分解作用や代謝作用から保護されるという利点や、標的以外の部位で物質が作用を奏すること（副作用）を防止するという利点を有している。

一方、タンパク質や薬剤、核酸などの物質を内包した脂質膜構造体、あるいはタンパク質や薬剤、核酸などと結合したペプチドキャリアーなどの高分子化合物を血中に投与する場合、血中から標的部位への到達が大きな課題となる。血管内皮細胞は多くの組織において細胞間に密着結合を形成しており、血管内皮細胞間の間隙は約０．４ｎｍから約４ｎｍと極めて狭いため、血中に投与された高分子化合物が、この間隙を通過して標的部位へ到達することは困難である。

そこで、密着結合を形成した血管内皮細胞層を超えて標的部位へ到達する脂質膜構造体やペプチドキャリアーが研究開発されており、例えば、アルブミン、アルブミン結合タンパク質であるＧＰ６０あるいは抗ＧＰ６０抗体から選択される、上皮細胞におけるトランスサイトーシスを促進するペプチド（特許文献１）、エンドサイトーシスレセプターであるメガリンの結合部分からなる、血液脳関門におけるトランスサイトーシスを促進するペプチド（特許文献２）、密着結合形成タンパク質であるオクルディンの合成を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドと、脂質膜構造体あるいはペプチドキャリアーとを共投与する方法（特許文献３）などが開発されている。

特表平１１−５１２４５１号公報 特表２００７−５２６２２７号公報 特表２００１−５１７４３６号公報

しかしながら、特許文献１および特許文献２に記載されたトランスサイトーシスを促進するそれぞれのペプチドは、いずれも薬剤に直接結合するペプチドキャリアーであり、細胞透過能を有する脂質膜構造体を提供するものではない。また、特許文献３に記載された方法は、密着結合の崩壊に伴い、目的物質以外の血管内容物が漏出する虞がある。

本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであって、脂質膜構造体に細胞透過能を付与および／または脂質膜構造体の細胞透過能を増強するペプチド、ならびにそれらペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む、細胞透過能を有するまたは細胞透過能が増強された脂質膜構造体を提供することを目的とする。

本発明者らは、鋭意研究の結果、アミノ酸配列が下記ＬＸ_１Ｘ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｘ_１Ｌ、ＬＬＸ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｘ_１ＬまたはＬＸ_１Ｘ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｌ（式中、Ｌはロイシン残基を、Ｘ_１は極性アミノ酸残基を、Ｘ_２は極性無電荷側鎖アミノ酸残基を、それぞれ表す。）であるペプチドが、上皮細胞において脂質膜構造体に細胞透過能を付与することや脂質膜構造体の細胞透過能を増強することを見出し、下記の各発明を完成した。

（１）アミノ酸配列がＬＸ_１Ｘ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｘ_１Ｌ、ＬＬＸ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｘ_１ＬまたはＬＸ_１Ｘ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｌ（式中、Ｌはロイシン残基を、Ｘ_１は極性アミノ酸残基を、Ｘ_２は極性無電荷側鎖アミノ酸残基を、それぞれ表す。）である、脂質膜構造体に細胞透過能を付与および／または脂質膜構造体の細胞透過能を増強するペプチド。

（２）極性無電荷側鎖アミノ酸残基Ｘ_２がＱ（Ｑはグルタミン残基を表す。）である、（１）に記載のペプチド。

（３）極性アミノ酸残基Ｘ_１がＲ、Ｋ、ＳおよびＤ（Ｒはアルギニン残基を、Ｋはリシン残基を、Ｓはセリン残基を、Ｄはアスパラギン酸残基を、それぞれ表す。）からなる群より選択される同じまたは異なるアミノ酸残基である、（１）または（２）に記載のペプチド。

（４）アミノ酸配列がＬＲＱＲＲＲＬ、ＬＬＱＲＲＲＬ、ＬＲＱＲＲＬ、ＬＫＱＫＫＫＬ、ＬＬＱＫＫＫＬ（配列番号３８）、ＬＫＱＫＫＬ（配列番号３９）、ＬＲＱＳＳＳＬ、ＬＬＱＳＳＳＬ（配列番号４０）、ＬＲＱＳＳＬ（配列番号４１）、ＬＲＱＲＤＤＬ、ＬＬＱＲＤＤＬ（配列番号４２）またはＬＲＱＲＤＬ（配列番号４３）（式中、Ｌはロイシン残基を、Ｒはアルギニン残基を、Ｑはグルタミン残基を、Ｋはリシン残基を、Ｓはセリン残基を、Ｄはアスパラギン酸残基を、それぞれ表す。）である、（１）から（３）のいずれかに記載のペプチド。

（５）細胞が上皮細胞である、（１）から（４）のいずれかに記載のペプチド。

（６）脂質ラフトに存在するヘパラン硫酸プロテオグリカンを介して細胞に取り込まれる、（１）から（５）のいずれかに記載のペプチド。

（７）（１）から（６）のいずれかに記載のペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む、細胞透過能を有するまたは細胞透過能が増強された脂質膜構造体。

（８）ペプチドと結合した脂質が、ペプチドのＣ末端にチロシン残基、システイン残基、親水性ポリマーおよび脂質がこの順で結合してなるペプチドと結合した脂質である、（７）に記載の脂質膜構造体。

（９）親水性ポリマーがポリエチレングリコールである、（８）に記載の脂質膜構造体。

（１０）構成脂質総量に占めるペプチドが結合した脂質の割合Ｐが１ｍｏｌ％≦Ｐ≦１０ｍｏｌ％である、（７）から（９）のいずれかに記載の脂質膜構造体。

（１１）細胞が上皮細胞である、（７）から（１０）のいずれかに記載の脂質膜構造体。

（１２）脂質ラフトに存在するヘパラン硫酸プロテオグリカンを介して細胞に取り込まれる、（７）から（１１）のいずれかに記載の脂質膜構造体。

（１３）アミノ酸配列がＬＸ_１Ｘ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｘ_１Ｌ、ＬＬＸ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｘ_１ＬまたはＬＸ_１Ｘ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｌ（式中、Ｌはロイシン残基を、Ｘ_１は極性アミノ酸残基を、Ｘ_２は極性無電荷側鎖アミノ酸残基を、それぞれ表す。）であるペプチドを有効成分とする、脂質膜構造体に対する細胞透過能付与および／または細胞透過能増強剤。

（１４）極性無電荷側鎖アミノ酸残基Ｘ_２がＱ（Ｑはグルタミン残基を表す。）である、（１３）に記載の細胞透過能付与および／または細胞透過能増強剤。

（１５）極性アミノ酸残基Ｘ_１がＲ、Ｋ、ＳおよびＤ（Ｒはアルギニン残基を、Ｋはリシン残基を、Ｓはセリン残基を、Ｄはアスパラギン酸残基を、それぞれ表す。）からなる群より選択される同じまたは異なるアミノ酸残基である、（１３）または（１４）に記載の細胞透過能付与および／または細胞透過能増強剤。

（１６）アミノ酸配列がＬＲＱＲＲＲＬ、ＬＬＱＲＲＲＬ、ＬＲＱＲＲＬ、ＬＫＱＫＫＫＬ、ＬＬＱＫＫＫＬ、ＬＫＱＫＫＬ、ＬＲＱＳＳＳＬ、ＬＬＱＳＳＳＬ、ＬＲＱＳＳＬ、ＬＲＱＲＤＤＬ、ＬＬＱＲＤＤＬまたはＬＲＱＲＤＬ（式中、Ｌはロイシン残基を、Ｒはアルギニン残基を、Ｑはグルタミン残基を、Ｋはリシン残基を、Ｓはセリン残基を、Ｄはアスパラギン酸残基を、それぞれ表す。）である、（１３）から（１５）のいずれかに記載の細胞透過能付与および／または細胞透過能増強剤。

（１７）細胞が上皮細胞である、（１３）から（１６）のいずれかに記載の細胞透過能付与および／または細胞透過能増強剤。

（１８）ペプチドが脂質ラフトに存在するヘパラン硫酸プロテオグリカンを介して細胞に取り込まれるペプチドである、（１３）から（１７）のいずれかに記載の細胞透過能付与および／または細胞透過能増強剤。

（１９）細胞透過能を有するまたは細胞透過能が増強された脂質膜構造体を製造する方法であって、アミノ酸配列がＬＸ_１Ｘ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｘ_１Ｌ、ＬＬＸ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｘ_１ＬまたはＬＸ_１Ｘ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｌ（式中、Ｌはロイシン残基を、Ｘ_１は極性アミノ酸残基を、Ｘ_２は極性無電荷側鎖アミノ酸残基を、それぞれ表す。）であるペプチドで脂質膜構造体を修飾する工程を有する前記方法。

（２０）極性無電荷側鎖アミノ酸残基Ｘ_２がＱ（Ｑはグルタミン残基を表す。）である、（１９）に記載の方法。

（２１）極性アミノ酸残基Ｘ_１がＲ、Ｋ、ＳおよびＤ（Ｒはアルギニン残基を、Ｋはリシン残基を、Ｓはセリン残基を、Ｄはアスパラギン酸残基を、それぞれ表す。）からなる群より選択される同じまたは異なるアミノ酸残基である、（１９）または（２０）に記載の方法。

（２２）アミノ酸配列がＬＲＱＲＲＲＬ、ＬＬＱＲＲＲＬ、ＬＲＱＲＲＬ、ＬＫＱＫＫＫＬ、ＬＬＱＫＫＫＬ、ＬＫＱＫＫＬ、ＬＲＱＳＳＳＬ、ＬＬＱＳＳＳＬ、ＬＲＱＳＳＬ、ＬＲＱＲＤＤＬ、ＬＬＱＲＤＤＬまたはＬＲＱＲＤＬ（式中、Ｌはロイシン残基を、Ｒはアルギニン残基を、Ｑはグルタミン残基を、Ｋはリシン残基を、Ｓはセリン残基を、Ｄはアスパラギン酸残基を、それぞれ表す。）である、（１９）から（２１）のいずれかに記載の方法。

（２３）ペプチドで脂質膜構造体を修飾する工程が、ペプチドのＣ末端にチロシン残基、システイン残基、親水性ポリマーおよび脂質をこの順で結合させることによりペプチドで脂質膜構造体を修飾する工程である、（１９）から（２２）のいずれかに記載の方法。

（２４）細胞が上皮細胞である、（１９）から（２３）のいずれかに記載の方法。

（２５）ペプチドが脂質ラフトに存在するヘパラン硫酸プロテオグリカンを介して細胞に取り込まれるペプチドである、（１９）から（２４）に記載の方法。

本発明のペプチドを結合することにより、あるいは本発明の細胞透過能付与および／または細胞透過能増強剤を用いることにより、脂質膜構造体に対して優れた細胞透過能を付与することや脂質膜構造体の細胞透過能を増強することができる。また、本発明のペプチドを結合した脂質を構成脂質として含む脂質膜構造体は、細胞を透過して標的部位へ到達し、内包物を放出することができることから、標的部位において高い薬効が得られ、かつ安全性が高く、大量生産が容易な優れた薬物ベクターとして利用することができる。

ＰＥＧを介してペプチドを修飾したリポソーム（ＲＩ／１−ＰＥＧ、ＲＩ／２−ＰＥＧ、ＲＩ／３−ＰＥＧ、ＲＩ／４−ＰＥＧ、ＲＩ／５−ＰＥＧ、ＲＩ／６−ＰＥＧ）、ＰＥＧを修飾したリポソーム（ＲＩ／ＰＥＧ、ＲＩ／８００ＰＥＧ）およびペプチドを修飾したリポソーム（ＲＩ／１、ＲＩ／７）の細胞透過比を示す図である。図中、白抜きで示されたＲＩ／６−ＰＥＧ、ＲＩ−ＰＥＧ、ＲＩ／８００ＰＥＧおよびＲＩ／７は比較例であることを示す。 ＰＥＧを介してペプチド１を修飾したリポソーム（ＲＩ／１−ＰＥＧ）および、ＰＥＧを介さずにペプチド１を修飾したリポソーム（ＲＩ／１）の細胞内取り込み比を示す図である。 Ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩを添加しない場合と比較した、Ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩを添加することにより脂質ラフトの機能を阻害した場合の、ＲＩ／１−ＰＥＧの細胞透過比割合を示す図である。 Ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩを添加しない場合と比較した、Ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩを添加することにより脂質ラフトの機能を阻害した場合の、ＲＩ／１−ＰＥＧおよびＲＩ／１の細胞内取り込み比割合を示す図である。 ＲＩ／１−ＰＥＧの細胞透過比を１００（％）とした場合の、ＲＩ／８−ＰＥＧ、ＲＩ／９−ＰＥＧ、ＲＩ／１０−ＰＥＧ、ＲＩ／１１−ＰＥＧ、ＲＩ／１２−ＰＥＧおよびＲＩ／１３−ＰＥＧの細胞透過比割合を示す図である。 ＲＩ／１−ＰＥＧの細胞透過比を１００（％）とした場合の、ＲＩ／１４−ＰＥＧ、ＲＩ／１５−ＰＥＧ、ＲＩ／１６−ＰＥＧおよびＲＩ／１７−ＰＥＧの細胞透過比割合を示す図である。 ＲＩ／１−ＰＥＧの細胞透過比を１００（％）とした場合の、ＲＩ／１８−ＰＥＧおよびＲＩ／１９−ＰＥＧの細胞透過比割合を示す図である。 ＲＩ／１−ＰＥＧの細胞透過比を１００（％）とした場合の、ＲＩ／２０−ＰＥＧおよびＲＩ／２１−ＰＥＧの細胞透過比割合を示す図である。 ＲＩ／１−ＰＥＧの細胞透過比を１００（％）とした場合の、ＲＩ／２２−ＰＥＧおよびＲＩ／２３−ＰＥＧの細胞透過比割合を示す図である。 ＲＩ／１−ＰＥＧの細胞透過比を１００（％）とした場合の、ＲＩ／２４−ＰＥＧおよびＲＩ／２５−ＰＥＧの細胞透過比割合を示す図である。 ＲＩ／１−ＰＥＧの細胞透過比を１００（％）とした場合の、ＲＩ／２６−ＰＥＧおよびＲＩ／２７−ＰＥＧの細胞透過比割合を示す図である。 ＲＩ／１−ＰＥＧの細胞透過比を１００（％）とした場合の、ＲＩ／２８−ＰＥＧ、ＲＩ／２９−ＰＥＧ、ＲＩ／３０−ＰＥＧ、ＲＩ／３１−ＰＥＧおよびＲＩ／３２−ＰＥＧの細胞透過比割合を示す図である。 ＲＩ／１−ＰＥＧの細胞透過比を１００（％）とした場合の、ＲＩ／３３−ＰＥＧ、ＲＩ／３４−ＰＥＧ、ＲＩ／３５−ＰＥＧ、ＲＩ／３６−ＰＥＧおよびＲＩ／３７−ＰＥＧの細胞透過比割合を示す図である。 修飾脂質１の割合を１％、５％または１０％としたＲＩ／１−ＰＥＧの細胞透過比を示す図である。 ヘパリン処理を行わないＲＩ／１−ＰＥＧ、ＲＩ／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥおよびＲＩ／７のそれぞれの細胞内取り込み比を１００（％）とした場合の、ヘパリン処理を行ったＲＩ／１−ＰＥＧ、ＲＩ／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥおよびＲＩ／７の細胞内取り込み比割合を示す図である。 ヘパリン処理を行ったＲｈｏ／１−ＰＥＧおよびＲｈｏ／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥと、ヘパリン処理を行わないＲｈｏ／１−ＰＥＧおよびＲｈｏ／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥとの、細胞内取り込み状態を蛍光観察した結果を示す図である。 ＭＢＥＣ４細胞における、Ｒｈｏ／１−ＰＥＧ、初期エンドソーム、後期エンドソームおよびリソソームの細胞内局在を蛍光観察した結果を示す図である。 ＣＨＯ−Ｋ１細胞における、Ｒｈｏ／１−ＰＥＧ、初期エンドソーム、後期エンドソームおよびリソソームの細胞内局在を蛍光観察した結果を示す図である。

以下、本発明に係る脂質膜構造体に細胞透過能を付与および／または脂質膜構造体の細胞透過能を増強するペプチド、ならびにそれらペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む、細胞透過能を有するまたは細胞透過能が増強された脂質膜構造体について詳細に説明する。

本発明に係る脂質膜構造体に細胞透過能を付与および／または脂質膜構造体の細胞透過能を増強するペプチドは、リポソームに代表される脂質膜構造体に細胞を透過することができる機能（細胞透過能）を付与し、あるいはリポソームに代表される脂質膜構造体の細胞透過能を増強する。すなわち、本発明に係る脂質膜構造体に細胞透過能を付与および／または脂質膜構造体の細胞透過能を増強するペプチドは、細胞透過能を有さない脂質膜構造体に対しては細胞透過能を付与し、あるいは細胞透過能を付与するとともにその細胞透過能を増強し、細胞透過能を有する脂質膜構造体に対しては細胞透過能を増強する。

ここで、本発明において「細胞透過」とは、細胞膜のある特定の区域から細胞内に取り込まれた物質が、その区域とは異なる、細胞膜のある特定の区域から細胞外へ放出されることをいい、例えば、トランスサイトーシスを代表的な例として挙げることができる。トランスサイトーシスは、血管内皮細胞や胎児小腸上皮細胞などの上皮細胞において、主として行われており、例えば、血管内皮細胞では、細胞外受容体に結合したアルブミンなどの特定の物質がエンドサイトーシスによって管内腔（血液側）から取り込まれた後、エキソサイトーシスによって管外腔（血管周囲の組織）へ放出される。また、胎児小腸上皮細胞では、母体由来のＩｇＧがエンドサイトーシスによって母体の血液から取り込まれた後、エキソサイトーシスによって胎児血液へ放出される。

本発明に係る脂質膜構造体に細胞透過能を付与および／または脂質膜構造体の細胞透過能を増強するペプチドは、アミノ酸配列がＬＸ_１Ｘ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｘ_１Ｌ、ＬＬＸ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｘ_１ＬまたはＬＸ_１Ｘ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｌ（式中、Ｌはロイシン残基を、Ｘ_１は極性アミノ酸残基を、Ｘ_２は極性無電荷側鎖アミノ酸残基を、それぞれ表す。）である。

本発明に係る脂質膜構造体に細胞透過能を付与および／または脂質膜構造体の細胞透過能を増強するペプチドのアミノ酸配列ＬＸ_１Ｘ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｘ_１Ｌ、ＬＬＸ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｘ_１ＬまたはＬＸ_１Ｘ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｌにおいて、Ｘ_１は極性アミノ酸残基を表す。極性アミノ酸は、グリシン（Ｇ）、アスパラギン（Ｎ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）およびリシン（Ｋ）のいずれでもよいが、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、セリン（Ｓ）およびアスパラギン酸（Ｄ）が好ましい。Ｘ_１で示される４アミノ酸残基または３アミノ酸残基は、これらの群から選択される、異なる２〜４種類または２、３種類のアミノ酸残基であってもよく、また、同じアミノ酸残基であってもよい。

また、本発明に係る脂質膜構造体に細胞透過能を付与および／または脂質膜構造体の細胞透過能を増強するペプチドのアミノ酸配列ＬＸ_１Ｘ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｘ_１Ｌ、ＬＬＸ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｘ_１ＬまたはＬＸ_１Ｘ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｌにおいて、Ｘ_２は極性無電荷側鎖アミノ酸残基を表す。極性無電荷側鎖アミノ酸は、グリシン（Ｇ）、アスパラギン（Ｎ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）およびチロシン（Ｙ）のいずれでもよいが、グルタミン（Ｑ）が好ましい。

本発明に係る脂質膜構造体に細胞透過能を付与および／または脂質膜構造体の細胞透過能を増強するペプチドの、より好ましいアミノ酸配列は、ＬＲＱＲＲＲＬ（配列番号１）、ＬＬＱＲＲＲＬ（配列番号１４）、ＬＲＱＲＲＬ（配列番号２６）、ＬＫＱＫＫＫＬ（配列番号１５）、ＬＬＱＫＫＫＬ（配列番号３８）、ＬＫＱＫＫＬ（配列番号３９）、ＬＲＱＳＳＳＬ（配列番号３５）、ＬＬＱＳＳＳＬ（配列番号４０）、ＬＲＱＳＳＬ（配列番号４１）、ＬＲＱＲＤＤＬ（配列番号３７）、ＬＬＱＲＤＤＬ（配列番号４２）またはＬＲＱＲＤＬ（配列番号４３）（式中、Ｌはロイシン残基を、Ｒはアルギニン残基を、Ｑはグルタミン残基を、Ｋはリシン残基を、Ｓはセリン残基を、Ｄはアスパラギン酸残基を、それぞれ表す。）である。

なお、本発明に係る脂質膜構造体に細胞透過能を付与および／または脂質膜構造体の細胞透過能を増強するペプチドは、ＬＸ_１Ｘ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｘ_１Ｌ、ＬＬＸ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｘ_１ＬまたはＬＸ_１Ｘ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｌ（式中、Ｌはロイシン残基を、Ｘ_１は極性アミノ酸残基を、Ｘ_２は極性無電荷側鎖アミノ酸残基を、それぞれ表す。）のアミノ酸配列からなるが、本発明に係る脂質膜構造体に細胞透過能を付与および／または脂質膜構造体の細胞透過能を増強するペプチドには、脂質膜構造体に細胞透過能を付与、脂質膜構造体の細胞透過能を増強、もしくは脂質膜構造体に細胞透過能を付与するとともにその細胞透過能を増強する機能を有する限り、これらアミノ酸配列の１または複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなるペプチドが包含される。

本発明において、保存的アミノ酸置換とは、生じる分子の生理学的活性を変化させることなく一般的になされ得る範囲、すなわち保存的置換の範囲で認められるもの（Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｇｅｎｅなど）であり、例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸の酸性アミノ酸；リシン、アルギニンおよびヒスチジンの塩基性アミノ酸；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファンの非極性アミノ酸；グリシン、アスパラギン、システイン、グルタミン、セリン、トレオニンおよびチロシンの極性無電荷側鎖アミノ酸；フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンの芳香族アミノ酸といった側鎖に類似性のあるアミノ酸同士（アミノ酸のファミリー内部）で起こる置換を挙げることができる。同様に、アスパラギン酸およびグルタミン酸の酸性アミノ酸；リシン、アルギニンおよびヒスチジンの塩基性アミノ酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンおよびトレオニンの脂肪族アミノ酸（セリンおよびトレオニンの脂肪族−ヒドロキシアミノ酸と分類することもできる）；フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンの芳香族アミノ酸；アスパラギンおよびグルタミンのアミド）；システインおよびメチオニンの含硫アミノ酸といった分類をすることができる。

また、本発明に係る脂質膜構造体に細胞透過能を付与および／または脂質膜構造体の細胞透過能を増強するペプチドには、脂質膜構造体に細胞透過能を付与、脂質膜構造体の細胞透過能を増強、もしくは脂質膜構造体に細胞透過能を付与するとともにその細胞透過能を増強する機能を有する限り、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、上述した保存的アミノ酸置換を除く置換、挿入および／または付加されたペプチドが包含される。欠失に関する具体的範囲は、通常１〜３個、好ましくは１〜２個、より好ましくは１個であり、保存的アミノ酸置換を除く置換に関する具体的範囲は、通常１〜３個、好ましくは１〜２個、より好ましくは１個であり、挿入に関する具体的範囲は、通常１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個であり、付加に関する具体的範囲は、通常１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個である。

例えば、後述するように、本発明に係る脂質膜構造体に細胞透過能を付与および／または脂質膜構造体の細胞透過能を増強するペプチドを脂質膜構造体に結合させる際に、ＬＸ_１Ｘ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｘ_１Ｌ、ＬＬＸ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｘ_１ＬまたはＬＸ_１Ｘ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｌ（式中、Ｌはロイシン残基を、Ｘ_１は極性アミノ酸残基を、Ｘ_２は極性無電荷側鎖アミノ酸残基を、それぞれ表す。）のアミノ酸配列のＣ末端側にチロシン残基およびシステイン残基を付加するなど、脂質膜構造体に細胞透過能を付与する機能、脂質膜構造体の細胞透過能を増強する機能、もしくは脂質膜構造体に細胞透過能を付与するとともにその細胞透過能を増強する機能を保持しつつ、脂質膜構造体に結合させるために１個もしくは数個のアミノ酸を付加する場合があるが、係るペプチドも依然として本発明のペプチドに含まれる。

本発明に係る脂質膜構造体に細胞透過能を付与および／または脂質膜構造体の細胞透過能を増強するペプチドは、その配列を基にして、当業者によって適宜選択可能な方法を用いて合成することができる。そのような方法としては、例えば、アミノ酸１つ１つを化学的に重合してポリペプチドを合成するペプチド合成法の他、本発明におけるペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを作製し、作製したベクターを適切な宿主細胞中に導入して得られる形質転換体を培地にて培養し、得られた培養物から採取する方法や、本発明におけるペプチドをコードするＤＮＡを無細胞タンパク質合成系で発現させて得る方法などを挙げることができる。なお、いずれの合成法も、当業者により広く知られている一般的な方法の他、あらゆる方法を利用することができる。

本発明に係る脂質膜構造体に細胞透過能を付与および／または脂質膜構造体の細胞透過能を増強するペプチドは、特に、上皮細胞において、細胞透過能を脂質膜構造体に付与、脂質膜構造体の細胞透過能を増強、もしくは上皮細胞における細胞透過能を脂質膜構造体に付与するとともにその細胞透過能を増強する。ここで、上皮細胞とは、組織の表面において二次元的な層状構造を採ることにより上皮を形成する細胞であり、細胞間において密着結合を形成し、拡散や浸透による物質の通過を抑制する傍ら、トランスサイトーシスなどにより選択的に物質を細胞透過させる機能を有する。上皮細胞としては、例えば、上述した血管内皮細胞や胎児小腸上皮細胞の他、リンパ管内皮細胞、漿膜中皮細胞、尿管上皮細胞、腎盂上皮細胞、気道上皮細胞、気管上皮細胞、気管枝上皮細胞、消化管上皮細胞、表皮細胞、鼻腔上皮細胞、咽頭上皮細胞などを挙げることができる。なお、本実施例においては、血管内皮細胞が好適な上皮細胞として用いられている。

本発明に係る脂質膜構造体に細胞透過能を付与および／または脂質膜構造体の細胞透過能を増強するペプチドが結合することにより、細胞透過能が付与および／または増強された脂質膜構造体は、透過しない細胞においてはリソソームに移行して分解される。すなわち、本発明に係る脂質膜構造体に細胞透過能を付与および／または脂質膜構造体の細胞透過能を増強するペプチドが結合することにより細胞透過能が付与および／または増強された脂質膜構造体に、薬剤やタンパク質、核酸などを内包させて血中投与することにより、その脂質膜構造体は、血管内皮細胞を透過して標的部位の細胞に到達した後、標的部位の細胞内で内包した物質を放出することから、薬剤送達ベクターとしての機能を適切に発揮することができる。

本発明のペプチドが結合して細胞透過能が付与および／または増強された脂質膜構造体は、主として、脂質ラフトに存在するヘパラン硫酸プロテオグリカンを介して細胞内に取り込まれ、細胞を透過する。脂質ラフトは細胞膜上のミクロドメインの一つであり、スフィンゴ脂質、糖脂質、コレステロール、受容体タンパク質、あるいは糖タンパク質（例えばヘパラン硫酸プロテオグリカンなど）などの分子が集合している、直径約１００ｎｍ程度の領域である。これら集合した特有の分子の働きにより、脂質ラフトはシグナル伝達や物質輸送の窓口として機能している。

本発明に係る細胞透過能を有するまたは細胞透過能が増強された脂質膜構造体は、上述した本発明に係るペプチドと結合した脂質を構成脂質として含んでいる。脂質膜構造体の細胞透過能を確認する方法としては、例えば、細胞に密着結合を形成させ、これに脂質膜構造体を添加し、その透過率を算出する方法を挙げることができる。また、例えば、細胞透過性評価装置（特願２００９−２７５８７７号）を用いる場合は、細胞が培養されていない場合の透過率（無細胞リポソーム透過率）と、密着結合を形成した細胞が培養されている場合の透過率（有細胞リポソーム透過率）とを算出し、その比（細胞透過比）を算出することにより、脂質膜構造体の細胞透過能を確認することができる。

本発明において、脂質膜構造体の好ましい形態は、脂質二重層膜構造を有する閉鎖小胞であり、そのような脂質膜構造体としては、例えば、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）の他、ＳＵＶ（ｓｍａｌｌ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａ ｖｅｓｉｃｌｅ）、ＬＵＶ（ｌａｒｇｅ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａ ｖｅｓｉｃｌｅ）、ＧＵＶ（ｇｉａｎｔ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａ ｖｅｓｉｃｌｅ）などの一枚膜リポソームを挙げることができる。また、本発明において脂質膜構造体のサイズは特に限定されるものではないが、直径５０ｎｍ〜８００ｎｍであることが好ましく、直径８０〜１５０ｎｍであることがより好ましい。

本発明における脂質膜構造体を構成する脂質の種類は特に限定されるものではないが、リン脂質、糖脂質、ステロール、長鎖脂肪族アルコールあるいはグリセリン脂肪酸エステルが好ましく、カチオン性脂質、中性脂質、アニオン性脂質のいずれであるかも問わない。

リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリンなど）、ホスファチジルグリセロール（例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロールなど）、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジオレオイルグリセロフォスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）など）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、またはこれらの水素添加物、卵黄、大豆その他の動植物に由来する天然脂質（例えば、卵黄レシチン、大豆レシチンなど）などを挙げることができ、これらのうちの１種または２種以上を用いることができる。前記リン脂質は、脂質膜構造体の主要な構成成分として用いられる。その使用量は、脂質膜構造体の総脂質に対する量として１０〜１００％（モル比）であることが好ましく、５０〜８０％（モル比）であることがさらに好ましいが、これらの値に特に限定されるものではない。

糖脂質としては、スフィンゴミエリン、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリドなどのグリセロ糖脂質、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシドなどのスフィンゴ糖脂質などを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。

ステロールとしては、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロールなどの動物由来のステロール、スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロールなどの植物由来のステロール（フィトステロール）、チモステロール、エルゴステロールなどの微生物由来のステロールなどを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。これらのステロールは、一般には脂質二重層を物理的または化学的に安定させたり、膜の流動性を調節したりするために用いることができる。その使用量は、脂質膜構造体の総脂質に対する量として５〜４０％（モル比）であることが好ましく、１０〜３０％（モル比）であることがさらに好ましいが、これらの値に特に限定されるものでない。

長鎖脂肪酸または長鎖脂肪族アルコールとしては、炭素数１０〜２０の脂肪酸またはそのアルコールを使用することができる。そのような長鎖脂肪酸または長鎖脂肪族アルコールとしては、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、アラキジン酸、マルガリン酸、ツベルクロステアリン酸などの飽和脂肪酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、アラキドン酸、バクセン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エレオステアリン酸などの不飽和脂肪酸、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、リノリルアルコールなどを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。その使用量は、脂質膜構造体の総脂質に対する量として５〜４０％（モル比）であることが好ましく、１０〜３０％（モル比）であることがさらに好ましいが、これらの値に特に限定されるものでない。

グリセリン脂肪酸エステルとしては、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、トリアシルグリセリドを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。その使用量は、脂質膜構造体の総脂質に対する量として５〜４０％（モル比）であることが好ましく、１０〜３０％（モル比）であることがさらに好ましいが、これらの値に特に限定されるものでない。

カチオン性脂質としては、上述した脂質の他、例えば、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロライド（ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＤＯＤＡＣ）、Ｎ−（２，３−オレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（Ｎ−（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ、ＤＯＴＭＡ）、ジドデシルアンモニウムブロミド（ｄｉｄｏｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、ＤＤＡＢ）、１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ ｐｒｏｐａｎｅ、ＤＯＴＡＰ）、３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモールコレステロール（３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ）−ｃａｒｂａｍｏｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、１，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ、ＤＭＲＩＥ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ−Ｎ−［２（ｓｐｅｒｍｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｒｏｐａｎａｍｉｎｕｍ ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ、ＤＯＳＰＡ）などを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。なお、カチオン性脂質は細胞毒性を有するので、本発明のリポソームの細胞毒性を低減させる点からは、脂質二重層に含まれるカチオン性脂質の量を出来る限り少なくすることが好ましく、脂質二重層を構成する総脂質に対するカチオン性脂質の割合は０〜４０％（モル比）であることが好ましく、０〜２０％（モル比）であることがさらに好ましい。

また、中性脂質としては、上述した脂質の他、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミドなどを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。また、アニオン性脂質としては、上述した脂質の他、例えば、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン（Ｎ−スクシニルＰＥ）、ホスファチジルエチレングリコールなどを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。

本発明に係る細胞透過能を有するまたは細胞透過能が増強された脂質膜構造体を構成する脂質膜は、本発明に係るペプチドと結合した脂質を複数種類含んでいてもよい。例えば、本発明に係るペプチドと結合したリン脂質と本発明に係るペプチドと結合した別のリン脂質、本発明に係るペプチドと結合したリン脂質と本発明に係るペプチドと結合したステロール、本発明に係るペプチドと結合したリン脂質と本発明に係るペプチドと結合した糖脂質など、任意に選択することができる。

本発明において、脂質膜構造体の脂質膜には、上述した脂質の他に、トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシトルエンなどの抗酸化剤、ステアリルアミン、オレイルアミンなどの正荷電を付与する荷電物質、ジセチルホスフェートなどの負電荷を付与する荷電物質、膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質などの膜タンパク質を含有させることができ、その含有量は適宜調節することができる。

また、本発明に係る細胞透過能を有するまたは細胞透過能が増強された脂質膜構造体の好ましい態様は、本発明に係るペプチドのＣ末端に、チロシン残基、システイン残基および親水性ポリマーおよび脂質がこの順で結合してなるペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む脂質膜構造体である。具体的には、本発明に係るペプチドが、そのＣ末端側に付加したシステイン残基を介してマレイミド化された親水性ポリマーの一部に結合し、さらにこの親水性ポリマーがリポソームの構成成分、特に脂質と結合した構造を有する脂質膜構造体である。

なお、本発明において「ペプチドと結合した脂質」という場合は、ペプチドが脂質に直接結合したもののみならず、ペプチドが、他のアミノ酸残基や親水性ポリマーなどの何らかのリンカーを介して脂質に結合したものも包含する。本発明において、好ましいリンカーとしては、例えば、チロシン残基、システイン残基および親水性ポリマーがこの順に結合してなる高分子化合物や親水性ポリマーを挙げることができる。

親水性ポリマーと本発明に係るペプチドとは、親水性ポリマーが有する官能基と、本発明に係るペプチドが有する官能基との間に共有結合を形成させて結合させることができる。一般的に、共有結合を形成できる官能基の組み合わせとしては、例えば、アミノ基／カルボキシル基、アミノ基／ハロゲン化アシル基、アミノ基／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、アミノ基／ベンゾトリアゾールカーボネート基、アミノ基／アルデヒド基、チオール基／マレイミド基、チオール基／ビニルスルホン基などを挙げることができるが、本発明に係るペプチドの場合には、３以上の極性アミノ酸残基（極性無電荷側鎖アミノ酸残基を含む）を含むペプチドであることから、本発明に係るペプチドにチオール基を有するアミノ酸残基を新たに付加させ、このチオール基を用いて親水性ポリマーと結合させることが好ましい。

チオール基を有するペプチド、あるいはシステインなどのチオール基を有するアミノ酸残基を付加させたペプチドを、チオール基を介して親水性ポリマーに結合させる方法、ならびにこの様な親水性ポリマーと脂質との結合は、Ｌｕら（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ、２００６年、第１１０巻、第５０５−５１３頁）によって報告されている。本発明のリポソームは、このＬｕらの方法を利用して調製することができるが、かかる方法には限定されない。チオール基を有するアミノ酸残基の付加は、本発明に係るペプチドのＮ末端側、Ｃ末端側のいずれでもよい。また、本発明に係るペプチドのＮ末端あるいはＣ末端以外の部分にチオール基を有するアミノ酸残基を挿入してもよい。

脂質は一般にカルボニル基、アミノ基または水酸基などの化学的に活性化可能な官能基を有しており、これらの適当な官能基と本発明に係るペプチドが有する官能基、本発明に係るペプチドに付加されたアミノ酸が有する官能基、あるいは前記ペプチドと結合した親水性ポリマーの有する官能基との間の化学反応によって、上述した調製法の他、本発明に係るペプチドと結合した脂質を調製することができる。例えば、脂質がホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）であり、これに前記高分子化合物を介して本発明に係るペプチドを結合させる場合には、Ｍａｒｔｉｎらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９２年、第１１１３巻、第１７１−１９９頁）が知られている。すなわち、前記ペプチドと結合した親水性ポリマーの水酸基をカルボン酸に変換し、そのカルボキシル基とＰＥのアミノ基との間で縮合反応を行うことで、本発明に係るペプチドと結合したＰＥを調製することができる。

上述した高分子化合物を介して本発明に係るペプチドと結合したステロール類を作製する方法としては、Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａらの報告(Ｌａｎｇｍｕｉｒ、２００１年、第１７巻、第２０６７−２０７５頁) が知られている。すなわち、ステロール類が有する水酸基をトシル基などで活性化し、上述のペプチドと結合した親水性ポリマーの水酸基によるＳＮ２反応を有機溶媒中で用いることで、本発明に係るペプチドと結合したステロール類を調製することができる。

さらに、上述した高分子化合物を介して本発明に係るペプチドと結合した長鎖脂肪酸を調製する方法としては、上述のペプチドと結合した親水性ポリマーにアミノ基を導入し、このアミノ基と長鎖脂肪酸のカルボキシル基との間で縮合反応を行うことで、本発明に係るペプチドと結合した長鎖脂肪酸を調製することができる。

本発明において用いることができる親水性ポリマーは、上述した高分子化合物を構成でき、この高分子化合物を介して、本発明に係るペプチドと脂質とが結合でき、細胞透過能を有するまたは細胞透過能が増強された脂質膜構造体を構成することができるものであれば特に限定されない。そのような親水性ポリマーとしては、例えば、ヒドロキシ基、カルボキシル基、カルボキシレート基、ヒドロキシエチル基、ポリオキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ポリオキシプロピル基、アミノ基、アミノエチル基、アミノプロピル基、アンモニウム基、アミド基、カルボキシメチル基、スルホン酸基、リン酸基などの親水性基を有するものを挙げることができ、具体的には、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、デンプン誘導体、カルボキシメチルセルロースおよびそのナトリウム塩、セルロースアセテート、アルギン酸ナトリウム、酢酸ビニル−マレイン酸コポリマー類、スチレン−マレイン酸コポリマー類、ポリアクリル酸類およびそれらの塩、ポリメタクリル酸類およびそれらの塩、ヒドロキシエチルメタクリレートのホモポリマーおよびコポリマー、ヒドロキシエチルアクリレートのホモポリマーおよびコポリマー、ヒドロキシピロピルメタクリレートのホモポリマーおよびコポリマー、ヒドロキシプロピルアクリレートのホモポリマーおよびコポリマー、ヒドロキシブチルメタクリレートのホモポリマーおよびコポリマー、ヒドロキシブチルアクリレートのホモポリマーおよびコポリマー、ポリエチレングリコール類、ヒドロキシプロピレンポリマー類、ポリビニルアルコール類、加水分解度が６０モル％以上、好ましくは８０モル％以上である加水分解ポリビニルアセテート、ポリビニルホルマール、ポリビニルブチラール、ポリビニルピロリドン、アクリルアミドのホモポリマーおよびコポリマー、メタクリルアミドのホモポリマーおよびポリマー、Ｎ−メチロールアクリルアミドのホモポリマーおよびコポリマー、アルコール可溶性ナイロン、２，２−ビス−（４−ヒドロキシフェニル）−プロパンとエピクロロヒドリンとのポリエーテルなどを挙げることができるが、ポリエチレングリコールが好ましい。

また、本発明に係る細胞透過能を有するまたは細胞透過能が増強された脂質膜構造体における、本発明に係るペプチドと結合した脂質の占める割合Ｐは、脂質膜を構成する脂質の総量を１００（％）とした場合、１ｍｏｌ％≦Ｐ≦１０ｍｏｌ％が好ましい。

本発明において、脂質膜構造体は、例えば、水和法、超音波処理法、エタノール注入法、エーテル注入法、逆相蒸発法、界面活性剤法、凍結・融解法などの公知の方法を用いて作製することができる。例えば水和法の場合、本発明に係るペプチドと結合した脂質、さらにはその他の脂質や先に記載した脂質膜に含まれる任意成分を有機溶剤に溶解した後、有機溶剤を蒸発除去することにより脂質膜を得た後、脂質膜を水和させ、攪拌または超音波処理することにより、本発明に係るペプチドと結合した脂質を膜の構成成分として含む脂質膜構造体を製造することができる。

なお、本発明に係る細胞透過能を有するまたは細胞透過能が増強された脂質膜構造体は、上述した脂質やその他の脂質を有機溶剤に溶解した後、有機溶剤を蒸発除去することにより脂質膜を得、この脂質膜を水和させ、攪拌または超音波処理することによりリポソームを製造し、次いで、このリポソームの外液に本発明に係るペプチドを添加することにより、リポソームの表面にこれらのペプチドを導入することもできる。

上述した方法において、有機溶媒として、例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサンなどの炭化水素類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素類、メタノール、エタノールなどの低級アルコール類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類などを、単独でまたは２種以上を組み合わせて使用することができる。

また、所定のポアサイズのフィルターを通過させることにより、一定の粒度分布を持った脂質膜構造体を得ることができる。

本発明の脂質膜構造体には、薬剤、核酸、ペプチド、タンパク質、糖またはこれらの複合体などの種々の生理活性物質を封入することができ、診断、治療などの目的に応じて適宜選択することができる。生理活性物質が水溶性である場合には、脂質膜構造体の製造にあたり脂質膜を水和する際に使用される水性溶媒に生理活性物質を添加することにより、脂質膜構造体内部の水相に生理活性物質を封入することができる。また、生理活性物質が脂溶性である場合には、脂質膜構造体の製造にあたり使用される有機溶剤に生理活性物質を添加することにより、脂質膜構造体の膜に生理活性物質を封入することができる。

本発明において、脂質膜構造体は、生理食塩水、リン酸緩衝液，クエン緩衝液，酢酸緩衝液などの適当な水性溶媒に分散させて使用することができる。分散液には、糖類、多価アルコール、水溶性高分子、非イオン界面活性剤、抗酸化剤、ｐＨ調節剤、水和促進剤などの添加剤を適宜添加してもよい。また、本発明において脂質膜構造体は、前記の分散液を乾燥させた状態で保存することができる。さらに、本発明において、脂質膜構造体は、経口投与することができる他、静脈、腹腔内、皮下、経鼻などへの非経口投与も可能である。

次に、本発明は、脂質膜構造体に対する細胞透過能付与および／または細胞透過能増強剤を提供する。本発明に係る脂質膜構造体に対する細胞透過能付与および／または細胞透過能増強剤は、アミノ酸配列がＬＸ１Ｘ２Ｘ１Ｘ１Ｘ１Ｌ、ＬＬＸ２Ｘ１Ｘ１Ｘ１ＬまたはＬＸ１Ｘ２Ｘ１Ｘ１Ｌ（式中、Ｌはロイシン残基を、Ｘ１は極性アミノ酸残基を、Ｘ２は極性無電荷側鎖アミノ酸残基を、それぞれ表す。）であるペプチドを有効成分とする。すなわち、本発明に係る脂質膜構造体に対する細胞透過能付与および／または細胞透過能増強剤は、本発明に係る脂質膜構造体に細胞透過能を付与および／または脂質膜構造体の細胞透過能を増強するペプチドを有効成分とする。

また、本発明は、細胞透過能を有するまたは細胞透過能が増強された脂質膜構造体を製造する方法を提供する。本発明に係る細胞透過能を有するまたは細胞透過能が増強された脂質膜構造体を製造する方法は、下記（ａ）の工程を有する；
（ａ）アミノ酸配列がＬＸ１Ｘ２Ｘ１Ｘ１Ｘ１Ｌ、ＬＬＸ２Ｘ１Ｘ１Ｘ１ＬまたはＬＸ１Ｘ２Ｘ１Ｘ１Ｌ（式中、Ｌはロイシン残基を、Ｘ１は極性アミノ酸残基を、Ｘ２は極性無電荷側鎖アミノ酸残基を、それぞれ表す。）であるペプチドで脂質膜構造体を修飾する工程。

工程（ａ）において、アミノ酸配列がＬＸ１Ｘ２Ｘ１Ｘ１Ｘ１Ｌ、ＬＬＸ２Ｘ１Ｘ１Ｘ１ＬまたはＬＸ１Ｘ２Ｘ１Ｘ１Ｌ（式中、Ｌはロイシン残基を、Ｘ１は極性アミノ酸残基を、Ｘ２は極性無電荷側鎖アミノ酸残基を、それぞれ表す。）であるペプチドは、上述の本発明に係る脂質膜構造体に細胞透過能を付与および／または脂質膜構造体の細胞透過能を増強するペプチドと同様のものを用いることができる。また、工程（ａ）において、脂質膜構造体は、本発明に係る細胞透過能を有するまたは細胞透過能が増強された脂質膜構造体に用いることのできる脂質膜構造体と同様のものを用いることができる。

工程（ａ）において、ペプチドで脂質膜構造体を修飾する方法は特に限定されず、当業者が適宜選択可能な手法を用いて行うことができる。そのような方法としては、例えば、脂質膜構造体を調製した後にペプチドを添加し、その脂質膜構造体の構成脂質にペプチドを結合させる方法の他、ペプチドを先ず脂質分子に結合させた後、このペプチド結合脂質分子を構成脂質とする脂質膜構造体を調製する方法を挙げることができる。さらに、ペプチドと脂質膜構造体の構成脂質とは、直接結合させてもよく、上述したリンカーを介して結合させてもよい。なお、ペプチドを脂質分子に結合する方法、脂質膜構造体を調製する方法、脂質膜にペプチドを添加してその脂質膜構造体の構成脂質にペプチドを結合させる方法については、上述の通りである。

ペプチドと脂質膜構造体との結合様式としては、例えば、水素結合、イオン結合、疎水結合、ファンデルワールス結合などの非共有結合や、ジスルフィド結合、ペプチド結合などの共有結合を挙げることができる。

以下、本発明に係る脂質膜構造体に細胞透過能を付与および／または脂質膜構造体の細胞透過能を増強するペプチド、ならびにそれらペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む、細胞透過能を有するまたは細胞透過能が増強された脂質膜構造体について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。

＜実施例１＞実験材料の調製
（１）Ｋｒｅｂｓ緩衝液の調製
滅菌水を溶媒として、以下の組成のＫｒｅｂｓ緩衝液（ｐＨ７．３）を調製した。

Ｋｒｅｂｓ緩衝液の組成
ＫＣｌ（和光純薬工業社） ４．８ｍｍｏｌ／Ｌ
ＫＨ_２ＰＯ_４（和光純薬工業社） １．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＭｇＳＯ_４（和光純薬工業社） １．２ｍｍｏｌ／Ｌ
２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ
（ＨＥＰＥＳ）（和光純薬工業社） １２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
ＣａＣｌ_２（和光純薬工業社） １．５ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ（ナカライテスク社） １２０．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＨＣＯ_３（和光純薬工業社） ２３．８ｍｍｏｌ／Ｌ
グルコース（和光純薬工業社） ５．０ｍｍｏｌ／Ｌ

（２）ｉｎ ｖｉｖｏファージディスプレイによるペプチドの選択
特開２００８−３１１４２号に記載の方法に従って、ｉｎ ｖｉｖｏファージディスプレイを行って筋肉組織に集積するペプチドとして得られた中から、細胞透過能を付与する、あるいは細胞透過能を増強させるペプチドの候補として下記のペプチドを選択した。

ペプチド１；ＬＲＱＲＲＲＬ（配列番号１）
ペプチド２；ＲＫＲＩＲＭＲ（配列番号２）
ペプチド３；ＲＲＲＲＱＮＩ（配列番号３）
ペプチド４；ＲＫＲＳＲＭＲ（配列番号４）
ペプチド５；ＩＲＱＲＲＲＲ（配列番号５）
（式中、向かって左端がＮ末端を、向かって右端がＣ末端を、Ｌはロイシン残基を、Ｒはアルギニン残基を、Ｑはグルタミン残基を、Ｋはリシン残基を、Ｉはイソロイシン残基を、Ｍはメチオニン残基を、Ｎはアスパラギン残基を、Ｓはセリン残基を、それぞれ表す。以下同じ。）

（３）ペプチド−ＰＥＧ修飾脂質の調製
本実施例（１）で選択したペプチド、およびリポソームに一定の細胞内移行能を付与することが知られているペプチドであるＲ８（ＲＲＲＲＲＲＲＲ；配列番号６）（小暮健太郎、ＹＡＫＵＧＡＫＵ ＺＡＳＳＨＩ、第１２７巻、第１０号、第１６８５−１６９１頁、２００７年）のＣ末にチロシン（Ｙ）およびシステイン（Ｃ）を付加したアミノ酸配列からなるペプチドを、北海道システムサイエンス社に化学合成を委託することにより作製した。これらのペプチドと、ｍａｌｅｉｍｉｄｅ基が付加された分子量２０００のポリエチレングリコール（以下、単に「ＰＥＧ」という場合がある。）およびＬ−α−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ(ＤＳＰＥ)の結合体であるＭａｌ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ(製品名：ＤＳＰＥ−０２０ＭＡ、日本油脂社）とを、それぞれ２ｍｍｏｌ／Ｌとなるように純水中に溶かし、スターラーで撹拌しながら室温で２４時間インキュベートし、以下のペプチド−ＰＥＧ修飾脂質を調製した。

修飾脂質１；ＬＲＱＲＲＲＬ（配列番号１）−ＹＣ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ
修飾脂質２；ＲＫＲＩＲＭＲ（配列番号２）−ＹＣ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ
修飾脂質３；ＲＲＲＲＱＮＩ（配列番号３）−ＹＣ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ
修飾脂質４；ＲＫＲＳＲＭＲ（配列番号４）−ＹＣ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ
修飾脂質５；ＩＲＱＲＲＲＲ（配列番号５）−ＹＣ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ
修飾脂質６；ＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号６）−ＹＣ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ
（式中、Ｙはチロシン残基を、Ｃはシステイン残基を、それぞれ表す。以下同じ。）

（４）リポソームの調製
［４−１］ＲＩ標識ペプチド−ＰＥＧ修飾リポソームの調製
卵黄ホスファチジルコリン｛Ｌ−α−Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ， Ｅｇｇ（Ｐｏｗｄｅｒ）；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社｝とコレステロール｛Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（Ｐｏｗｄｅｒ）；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社｝とを、（卵黄ホスファチジルコリン）：（コレステロール）＝７：３となるように混合することにより混合脂質粉末を調製した。続いて、この調製した混合脂質粉末を、１ｎｍｏｌ／μＬとなるようにエタノールに溶解し、混合脂質エタノール溶液を調製した。（混合脂質）：（本実施例（３）で調製した修飾脂質）のｍｏｌ％の比が９５：５となり、かつ、液の総体積が１３７．５μＬとなるよう、混合脂質エタノール溶液および本実施例（３）で調製した修飾脂質の水溶液をガラス製試験管に注入した。これに、放射性同位体（ＲＩ）である^３Ｈ−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ ｈｅｘａｄｅｃｙｌ ｅｔｈｅｒ（ＣＨＥ）２５０万ｄｐｍ〜５００万ｄｐｍおよびクロロホルム１１２．５μＬを添加して、短時間ボルテックス処理をした後、常法に従い、窒素ガス気流を用いてエタノール溶媒を除去した。続いて、２５０ｍＬのエタノールを添加して脂質を溶解し、前記常法に従ってエタノール溶媒の除去を再度行うことにより、ＲＩで標識した脂質膜を調製した。常法に従い、ＨＥＰＥＳ（和光純薬工業社）を用いて調製した１０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を、この脂質膜に２５０μＬ添加し、室温で１５分間置いて水和させた後、ソニケーターを用いて３０秒間ソニケーションを行うことにより、以下のＲＩ標識ペプチド−ＰＥＧ修飾リポソームを調製した。

修飾脂質１を５％含むリポソーム；ＲＩ／１−ＰＥＧ
修飾脂質２を５％含むリポソーム；ＲＩ／２−ＰＥＧ
修飾脂質３を５％含むリポソーム；ＲＩ／３−ＰＥＧ
修飾脂質４を５％含むリポソーム；ＲＩ／４−ＰＥＧ
修飾脂質５を５％含むリポソーム；ＲＩ／５−ＰＥＧ
修飾脂質６を５％含むリポソーム；ＲＩ／６−ＰＥＧ（比較例）

［４−２］ＲＩ標識ペプチド−ＰＥＧ修飾リポソームのサイズの確認
本実施例（４）［４−１］に記載の方法に従って、ＲＩを添加しないＲＩ非標識ペプチド−ＰＥＧ修飾リポソームを調製し、動的光散乱測定装置（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ；Ｍａｌｖｅｒｎ社）によりサイズを測定したところ、リポソームの直径は約１００ｎｍであった。このことから、本実施例（４）［４−１］で調製したＲＩ標識ペプチド−ＰＥＧ修飾リポソームのサイズは、直径約１００ｎｍであることが明らかになった。

［４−３］ＲＩ標識ＰＥＧ修飾リポソームの調製
ペプチド−ＰＥＧ修飾脂質を、ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ｛製品名：１，２−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎＧｌｙｃｅｒｏ−３−Ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ｎ−［Ｃａｒｂｏｘｙ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ）２０００］（Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓａｌｔ）、社名：Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社｝に代えて、本実施例（４）［４−１］に記載の方法に従って、ＲＩ標識ＰＥＧ修飾リポソームであるＲＩ／ＰＥＧ（比較例）を調製した。また、本実施例（４）［４−１］に記載の方法に従ってＲＩで標識した脂質膜を調製した後、ＨＥＰＥＳ（和光純薬工業社）を用いて常法に従い調製した１０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）をこの脂質膜に２５０μＬ添加し、室温で１５分間置いて水和させ、さらに数回手で振ることにより混和させて、直径約８００ｎｍのマイクロサイズのＲＩ標識ＰＥＧ修飾リポソームであるＲＩ／８００ＰＥＧ（比較例）を調製した。

［４−４］ＲＩ標識ペプチド修飾リポソームの調製
プロテオグリカンを介しての物質の細胞内取り込みを誘起するカチオン性ペプチドであるＫ８（細胞内取り込みを誘起することについて「Ａｙｍａｎ Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２８３巻、第３４号、第２３４５０−２３４６１頁」を、カチオン性物質がプロテオグリカンを介して細胞内に取り込まれることについて「Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｋ．Ｐａｙｎｅら、Ｔｒａｆｆｉｃ、第８巻、第３８９−４０１頁」を、それぞれ参照のこと）（ＫＫＫＫＫＫＫＫ；配列番号７）および本実施例（２）で選択したペプチド１の、それぞれＣ末にステアリン酸（ＳＴＲ）が付加された、以下のペプチド修飾脂肪酸をＫＵＲＯＢＯ社より購入した。

修飾脂肪酸１；ＬＲＱＲＲＲＬ（配列番号１）−ＳＴＲ
修飾脂肪酸７；ＫＫＫＫＫＫＫＫ（配列番号７）−ＳＴＲ

調製した修飾脂肪酸１および修飾脂肪酸７を用いて、本実施例（４）［４−１］に記載の方法に従い、ＰＥＧを介さずにペプチドを修飾した以下のリポソームを調製した。

修飾脂肪酸１を５％含むリポソーム；ＲＩ／１
修飾脂肪酸７を５％含むリポソーム；ＲＩ／７（比較例）

［４−５］ＲＩ標識カチオン性リポソームの調製
カチオン性脂質である１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ（ＤＯＴＡＰ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社）と１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＯＰＥ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社）とを、ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ＝３：７となるように混合することにより混合脂質粉末を調製した。続いて、調製した混合脂質粉末を、１ｎｍｏｌ／μＬとなるようにエタノールに溶解し、これをガラス製試験管に１３７．５μＬ入れ、以下、本実施例（４）［４−１］に記載の方法により、ＲＩ標識カチオン性リポソームであるＲＩ／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥを調製した。

［４−６］蛍光標識ペプチド１修飾リポソームの調製
混合脂質：本実施例（３）で調製した修飾脂質のｍｏｌ％の比を９５：５とすることに代えて、混合脂質：本実施例（３）で調製した修飾脂質１：ローダミンがＤＯＰＥに結合したローダミン結合脂質（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−ＤＯＰＥ；Ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ｎ−Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ Ｓｕｌｆｏｎｙｌ，［１，２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−Ｇｌｙｃｅｒｏ−３−］，Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓａｌｔ（Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社）のｍｏｌ％の比を９０：５：５として、本実施例（４）［４−１］に記載の方法により、ＲＩ標識のない蛍光標識ペプチド１修飾リポソームであるＲｈｏ／１−ＰＥＧを調製した。

［４−７］蛍光標識ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥリポソームの調製
ＤＯＴＡＰ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社）、ＤＯＰＥ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社）およびＲｈｏｄａｍｉｎｅ−ＤＯＰＥ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社）を、ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ：Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−ＤＯＰＥ＝３０：６５：５となるように混合することにより混合脂質粉末を調製した。続いて、調製した混合脂質粉末を、１ｎｍｏｌ／μＬとなるようにエタノールに溶解し、これをガラス製試験管に１３７．５μＬ入れ、ＲＩを添加せずに、以下、本実施例（４）［４−１］に記載の方法により、蛍光標識ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥリポソームであるＲｈｏ／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥを調製した。

＜実施例２＞ＲＩ標識修飾リポソームの細胞透過比の検討
（１）無細胞リポソーム透過率の算出
細胞透過性評価装置（特願２００９−２７５８７７号）の上層側の領域に、実施例１（１）で調製したＫｒｅｂｓ緩衝液を１００μＬ／ウェル入れ、さらに、実施例１（４）［４−１］で調製したＲＩ／１−ＰＥＧ、ＲＩ／２−ＰＥＧ、ＲＩ／３−ＰＥＧ、ＲＩ／４−ＰＥＧ、ＲＩ／５−ＰＥＧ、ＲＩ／６−ＰＥＧ、実施例１（４）［４−３］で調製したＲＩ／ＰＥＧ、ＲＩ／８００ＰＥＧ、実施例１（４）［４−４］で調製したＲＩ／１およびＲＩ／７を、それぞれ１００μＬ（約１００万〜２００万ｄｐｍ）／ウェル添加した。２時間後に下層側の領域からＫｒｅｂｓ緩衝液を回収し、液体シンチレーションカウンターＴＲＩ／ＣＡＲＢ １６００ＴＲ（ＰＡＣＫＡＲＤ社）を用いて、回収したＫｒｅｂｓ緩衝液に含まれるＲＩ量を測定した。測定したＲＩ量の割合を、上層側の領域に添加したリポソームのＲＩ量に対して百分率で算出することにより、細胞透過性評価装置（特願２００９−２７５８７７号）において細胞が培養されていない場合のリポソーム透過率（無細胞リポソーム透過率）とした。

（２）有細胞リポソーム透過率の算出
［２−１］ＭＢＥＣ４細胞の培養
国立大学法人東京大学分子細胞生物学研究所の鶴尾隆氏および内藤幹彦氏より供与されたマウス脳毛細血管内皮細胞由来のＭＢＥＣ４細胞をＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ (ＤＭＥＭ培地) に、３０００００ｃｅｌｌ／ｍＬとなるよう懸濁した。細胞透過性評価装置（特願２００９−２７５８７７号）の上層側の領域に、この懸濁液を４００μＬ／ウェルとなるように入れ、５％ＣＯ_２雰囲気下、３７℃で３日間〜５日間、培養した細胞が密着結合を形成するまで静置培養した。細胞が密着結合を形成したか否かの確認は、ＭＩＬＬＩＣＥＬＬ−ＥＲＳ（ミリポア社）を用いて、膜間電気抵抗（ＴＥＲ）を測定することにより行った。

［２−２］有細胞リポソーム透過率の算出
本実施例（２）［２−１］で培養した細胞の培養液を除去し、実施例１（１）で調製したＫｒｅｂｓ緩衝液で１回洗浄した後、除去した培養液と等量のＫｒｅｂｓ緩衝液を加え、さらに、実施例１（４）［４−１］で調製したＲＩ／１−ＰＥＧ、ＲＩ／２−ＰＥＧ、ＲＩ／３−ＰＥＧ、ＲＩ／４−ＰＥＧ、ＲＩ／５−ＰＥＧ、ＲＩ／６−ＰＥＧ、実施例１（４）［４−３］で調製したＲＩ／ＰＥＧ、ＲＩ／８００ＰＥＧ、実施例１（４）［４−４］で調製したＲＩ／１およびＲＩ／７をそれぞれ１００μＬ（約１００万〜２００万ｄｐｍ）／ウェル添加した。以下、本実施例（１）に記載の方法により、細胞透過性評価装置において細胞が培養されている場合のリポソーム透過率（有細胞リポソーム透過率）を算出した。

（３）ＲＩ標識修飾リポソームの細胞透過比の算出
実施例１（４）［４−１］で調製したＲＩ／１−ＰＥＧ、ＲＩ／２−ＰＥＧ、ＲＩ／３−ＰＥＧ、ＲＩ／４−ＰＥＧ、ＲＩ／５−ＰＥＧ、ＲＩ／６−ＰＥＧ、実施例１（４）［４−３］で調製したＲＩ／ＰＥＧ、ＲＩ／８００ＰＥＧ、実施例１（４）［４−４］で調製したＲＩ／１およびＲＩ／７の細胞透過比を、次式により算出した。また、算出の結果、最も高い細胞透過比が確認されたＲＩ／１−ＰＥＧに対するｔ検定を行った。その結果を図１に示す。
細胞透過比＝本実施例（２）で算出した有細胞リポソーム透過率／本実施例（１）で算出した無細胞リポソーム透過率

図１に示すように、ＲＩ／１−ＰＥＧの細胞透過比が約０．７２で最も高く、ＲＩ／１の細胞透過比が、ＲＩ／１−ＰＥＧと有意差はないものの、約０．４９で次に高いことが明らかになった。また、ＲＩ／１−ＰＥＧおよびＲＩ／１の細胞透過比は、リポソームに一定の細胞内移行能を付与することが知られているＲ８およびＫ８で修飾したＲＩ／６−ＰＥＧおよびＲＩ／７の細胞透過比よりも高いことが明らかになった。一方、ＲＩ／３−ＰＥＧおよびＲＩ／５−ＰＥＧの細胞透過比は、ＲＩ／６−ＰＥＧおよびＲＩ／７の細胞透過比とほぼ同じであり、ＲＩ／２−ＰＥＧの細胞透過比は最も低い結果となった。また、ＲＩ／４−ＰＥＧの細胞透過比は、ＲＩ／１−ＰＥＧと有意差はないものの、ペプチドを修飾していないＲＩ／ＰＥＧおよびサイズが大きいＲＩ／８００ＰＥＧと同程度の低い細胞透過比であった。

これらの結果から、実施例１（２）で選択したペプチド１がリポソームへの細胞透過能の付与やリポソームにおける細胞透過能の増強に優れていることが確認された。

＜実施例３＞ＲＩ／１−ＰＥＧの細胞内取り込みにおけるＰＥＧの必要性の検討
実施例２（２）［２−１］に記載の方法により、シャーレ上でＭＢＥＣ４細胞を培養した後、培養液を除去し、実施例１（１）で調製したＫｒｅｂｓ緩衝液を用いて１回洗浄した。続いて、除去した培養液と等量のＫｒｅｂｓ緩衝液を加え、実施例１（４）［４−１］で調製したＲＩ／１−ＰＥＧおよび実施例１（４）［４−４］で調製したＲＩ／１をそれぞれ１００μＬ（約１００万〜２００万ｄｐｍ）／ウェル添加した。２時間後、リポソームを含むＫｒｅｂｓ緩衝液を除去し、４０ｕｎｉｔ／ｍＬのヘパリン（和光純薬工業社）を含むＰＢＳ（日水製薬社）１ｍＬを用いて３回洗浄した。続いて３ＮのＮａＯＨ水溶液に一晩浸漬することにより細胞を溶解し、液体シンチレーションカウンターＴＲＩ／ＣＡＲＢ １６００ＴＲ（ＰＡＣＫＡＲＤ社）を用いて、この細胞溶解液中のＲＩ量を測定した。添加したＲＩ量に対する、前記測定したＲＩ量の割合を、リポソームの細胞内取り込み比として百分率で算出した。その結果を図２に示す。

図２に示すように、ＲＩ／１−ＰＥＧの細胞内取り込み比は、ＲＩ／１の細胞内取り込み比に比べて大きいことが明らかになった。この結果から、ＰＥＧを介してペプチド１を修飾したリポソームの方が、ＰＥＧを介さずにペプチド１を修飾したリポソームと比べて、より多くＭＢＥＣ４細胞に取り込まれることが確認された。

＜実施例４＞ＲＩ／１−ＰＥＧの細胞透過および細胞内取り込みにおける脂質ラフト関与の検討
（１）細胞透過における脂質ラフト関与の検討
実施例１（４）［４−１］で調製したＲＩ／１−ＰＥＧについて、実施例２に記載の方法に従い、細胞透過比を算出した。なお、無細胞リポソーム透過率および有細胞リポソーム透過率の算出時においては、ウェルに実施例１（１）で調製したＫｒｅｂｓ緩衝液を入れると同時に、コレステロールに特異的に結合して脂質ラフトの機能を阻害する試薬であるＦｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩ（ＳＩＧＭＡ社）を５μｍｏｌ／Ｌおよび１５μｍｏｌ／Ｌとなるよう添加し、１時間インキュベートした後、ＲＩ／１−ＰＥＧを添加した。

続いて、実施例２（３）で算出したＲＩ／１−ＰＥＧの細胞透過比（Ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩを添加しない場合のＲＩ／１−ＰＥＧの細胞透過比）に対する、Ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩを５μｍｏｌ／Ｌあるいは１５μｍｏｌ／Ｌとなるよう添加して算出したＲＩ／１−ＰＥＧの細胞透過比の割合を百分率で算出した。また、算出した値について、実施例２（３）で算出したＲＩ／１−ＰＥＧの細胞透過比（Ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩを添加しない場合のＲＩ／１−ＰＥＧの細胞透過比）に対するｔ検定を行った。その結果を図３に示す。

図３に示すように、Ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩを５μｍｏｌ／Ｌ添加した場合は、無添加の場合に比べて有意差はないものの、細胞透過比割合は約６０％に低下し、１５μｍｏｌ／Ｌ添加した場合の細胞透過比割合は約３５％に低下した。すなわちＦｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩの添加量に比例して細胞透過比および細胞透過比割合は低下することが明らかになった。

これらの結果から、ＲＩ／１−ＰＥＧは、主として、脂質ラフトを介して細胞透過されることが確認された。

（２）細胞内取り込みにおける脂質ラフト関与の検討
実施例１（４）［４−１］で調製したＲＩ／１−ＰＥＧおよび実施例１（４）［４−４］で調製したＲＩ／１について、実施例３に記載の方法に従い、細胞内取り込み比を算出した。なお、実施例１（１）で調製したＫｒｅｂｓ緩衝液をシャーレに入れる際、脂質ラフトを阻害する試薬であるＦｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩ（ＳＩＧＭＡ社）を５μｍｏｌ／Ｌあるいは１５μｍｏｌ／Ｌとなるよう同時に添加し、１時間インキュベートした後、ＲＩ／１−ＰＥＧおよびＲＩ／１をそれぞれ添加した。

続いて、実施例３で算出したＲＩ／１−ＰＥＧの細胞内取り込み比（Ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩを添加しない場合のＲＩ／１−ＰＥＧの細胞内取り込み比）に対する、Ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩを添加して算出したＲＩ／１−ＰＥＧの細胞内取り込み比の割合を百分率で算出した。また、算出した値について、実施例３で算出したＲＩ／１−ＰＥＧの細胞内取り込み比（Ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩを添加しない場合のＲＩ／１−ＰＥＧの細胞内取り込み比）に対するｔ検定を行った。同様に、実施例３で算出したＲＩ／１の細胞内取り込み比（Ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩを添加しない場合のＲＩ／１−ＰＥＧの細胞内取り込み比）に対する、Ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩを添加して算出したＲＩ／１の細胞内取り込み比の割合を百分率で算出し、算出した値について、実施例３で算出したＲＩ／１の細胞内取り込み比（Ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩを添加しない場合のＲＩ／１−ＰＥＧの細胞内取り込み比）に対するｔ検定を行った。それらの結果を図４に示す。

図４に示すように、Ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩを５μｍｏｌ／Ｌ添加した場合のＲＩ／１−ＰＥＧでは、Ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩ無添加の場合と比較して、細胞内取り込み比割合は約７３％に低下し、１５μｍｏｌ／Ｌ添加した場合のＲＩ／１−ＰＥＧでは、Ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩ無添加の場合と比較して、細胞内取り込み比割合は約５０％に低下した。すなわちＦｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩの添加量に比例して細胞内取り込み比および細胞内取り込み比割合は低下することが明らかになった。一方、Ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩを５μｍｏｌ／Ｌ添加した場合のＲＩ／１では、有意差はないものの、Ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩ無添加の場合と比較して、細胞内取り込み比割合は約１４２％に増加し、１５μｍｏｌ／Ｌ添加した場合のＲＩ／１−ＰＥＧでは、有意差はないものの、Ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩ無添加の場合と比較して、細胞内取り込み比割合は約１８０％に増加した。

これらの結果から、ＲＩ／１−ＰＥＧは主として脂質ラフトを介して細胞内に取り込まれることが確認され、ＲＩ／１は主として脂質ラフトを介さない経路で細胞内に取り込まれることが確認された。

＜実施例５＞ペプチド１における重要なアミノ酸配列の検討
ペプチド１のアミノ酸配列を変化させた以下のペプチドを、北海道システムサイエンス社に化学合成を委託することにより作製した。ペプチド１のアミノ酸配列を変化させた部分を下線で示す。なお、ペプチド８〜１３はペプチド１のアミノ酸配列のＮ末端およびＣ末端アミノ酸の少なくともいずれかを変化させたペプチドであり、ペプチド１４はペプチド１のアミノ酸配列のＮ末端から２番目のＲをＬに変化させたペプチドであり、ペプチド１５はペプチド１のアミノ酸配列の全てのＲをＫに変化させたペプチドであり、ペプチド１６および１７はペプチド１のアミノ酸配列のＮ末端から２番目のＲの数を増加させたペプチドであり、ペプチド１８および１９はペプチド１のアミノ酸配列のＮ末端から３番目のＱをＲまたはＡに変化させたペプチドであり、ペプチド２０および２１はペプチド１のアミノ酸配列のＮ末端およびＣ末端のＬを固定したままでＮ末端から３番目のＱの位置を変化させたペプチドであり、ペプチド２２および２３はペプチド１のアミノ酸配列の両末端にＬまたはＲを付加してペプチドの長さを変化させたペプチドであり、ペプチド２４および２５はペプチド１のアミノ酸配列の並びを変化させたペプチドであり、ペプチド２６〜２９はペプチド１のアミノ酸配列のＮ末端から４番目〜６番目のＲの数を減少または増加させたペプチドであり、ペプチド３０〜３２はペプチド１のアミノ酸配列のＮ末端から６番目のＲのＣ末端側にＬまたはＡを付加したペプチドであり、ペプチド３３〜３７はペプチド１のアミノ酸配列のＮ末端から４番目〜６番目のＲを変化させたペプチドである。

ペプチド８；ＲＲＱＲＲＲＬ（配列番号８）
ペプチド９；ＬＲＱＲＲＲＲ（配列番号９）
ペプチド１０；ＲＲＱＲＲＲＲ（配列番号１０）
ペプチド１１；ＳＲＱＲＲＲＳ（配列番号１１）
ペプチド１２；ＩＲＱＲＲＲＩ（配列番号１２）
ペプチド１３；ＶＲＱＲＲＲＶ（配列番号１３）
ペプチド１４；ＬＬＱＲＲＲＬ（配列番号１４）
ペプチド１５；ＬＫＱＫＫＫＬ（配列番号１５）
ペプチド１６；ＬＲＲＱＲＲＲＬ（配列番号１６）
ペプチド１７；ＬＲＲＲＱＲＲＲＬ（配列番号１７）
ペプチド１８；ＬＲＲＲＲＲＬ（配列番号１８）
ペプチド１９；ＬＲＡＲＲＲＬ（配列番号１９）
ペプチド２０；ＬＲＲＱＲＲＬ（配列番号２０）
ペプチド２１；ＬＲＲＲＱＲＬ（配列番号２１）
ペプチド２２；ＬＬＲＱＲＲＲＬＬ（配列番号２２）
ペプチド２３；ＲＬＲＱＲＲＲＬＲ（配列番号２３）
ペプチド２４；ＱＲＲＬＬＲＲ（配列番号２４）
ペプチド２５；ＲＲＬＬＱＲＲ（配列番号２５）
ペプチド２６；ＬＲＱＲＲＬ（配列番号２６）
ペプチド２７；ＬＲＱＲＬ（配列番号２７）
ペプチド２８；ＬＲＱＲＲＲＲＬ（配列番号２８）
ペプチド２９；ＬＲＱＲＲＲＲＲＬ（配列番号２９）
ペプチド３０；ＬＲＱＲＲＲＬＬ（配列番号３０）
ペプチド３１；ＬＲＱＲＲＲＡＬ（配列番号３１）
ペプチド３２；ＬＲＱＲＲＲＡＡＬ（配列番号３２）
ペプチド３３；ＬＲＱＲＬＲＬ（配列番号３３）
ペプチド３４；ＬＲＱＬＲＲＬ（配列番号３４）
ペプチド３５；ＬＲＱＳＳＳＬ（配列番号３５）
ペプチド３６；ＬＲＱＲＲＤＬ（配列番号３６）
ペプチド３７；ＬＲＱＲＤＤＬ（配列番号３７）

これらのペプチド８〜３７について、実施例１（３）に記載の方法に従い、ペプチド−ＰＥＧ修飾脂質を調製した後、実施例１（４）［４−１］に記載の方法に従って、以下のＲＩ標識ペプチド−ＰＥＧ修飾リポソームを調製した。

ペプチド８のＰＥＧ修飾脂質を５％含むリポソーム；ＲＩ／８−ＰＥＧ
ペプチド９のＰＥＧ修飾脂質を５％含むリポソーム；ＲＩ／９−ＰＥＧ
ペプチド１０のＰＥＧ修飾脂質を５％含むリポソーム；ＲＩ／１０−ＰＥＧ
ペプチド１１のＰＥＧ修飾脂質を５％含むリポソーム；ＲＩ／１１−ＰＥＧ
ペプチド１２のＰＥＧ修飾脂質を５％含むリポソーム；ＲＩ／１２−ＰＥＧ
ペプチド１３のＰＥＧ修飾脂質を５％含むリポソーム；ＲＩ／１３−ＰＥＧ
ペプチド１４のＰＥＧ修飾脂質を５％含むリポソーム；ＲＩ／１４−ＰＥＧ
ペプチド１５のＰＥＧ修飾脂質を５％含むリポソーム；ＲＩ／１５−ＰＥＧ
ペプチド１６のＰＥＧ修飾脂質を５％含むリポソーム；ＲＩ／１６−ＰＥＧ
ペプチド１７のＰＥＧ修飾脂質を５％含むリポソーム；ＲＩ／１７−ＰＥＧ
ペプチド１８のＰＥＧ修飾脂質を５％含むリポソーム；ＲＩ／１８−ＰＥＧ
ペプチド１９のＰＥＧ修飾脂質を５％含むリポソーム；ＲＩ／１９−ＰＥＧ
ペプチド２０のＰＥＧ修飾脂質を５％含むリポソーム；ＲＩ／２０−ＰＥＧ
ペプチド２１のＰＥＧ修飾脂質を５％含むリポソーム；ＲＩ／２１−ＰＥＧ
ペプチド２２のＰＥＧ修飾脂質を５％含むリポソーム；ＲＩ／２２−ＰＥＧ
ペプチド２３のＰＥＧ修飾脂質を５％含むリポソーム；ＲＩ／２３−ＰＥＧ
ペプチド２４のＰＥＧ修飾脂質を５％含むリポソーム；ＲＩ／２４−ＰＥＧ
ペプチド２５のＰＥＧ修飾脂質を５％含むリポソーム；ＲＩ／２５−ＰＥＧ
ペプチド２６のＰＥＧ修飾脂質を５％含むリポソーム；ＲＩ／２６−ＰＥＧ
ペプチド２７のＰＥＧ修飾脂質を５％含むリポソーム；ＲＩ／２７−ＰＥＧ
ペプチド２８のＰＥＧ修飾脂質を５％含むリポソーム；ＲＩ／２８−ＰＥＧ
ペプチド２９のＰＥＧ修飾脂質を５％含むリポソーム；ＲＩ／２９−ＰＥＧ
ペプチド３０のＰＥＧ修飾脂質を５％含むリポソーム；ＲＩ／３０−ＰＥＧ
ペプチド３１のＰＥＧ修飾脂質を５％含むリポソーム；ＲＩ／３１−ＰＥＧ
ペプチド３２のＰＥＧ修飾脂質を５％含むリポソーム；ＲＩ／３２−ＰＥＧ
ペプチド３３のＰＥＧ修飾脂質を５％含むリポソーム；ＲＩ／３３−ＰＥＧ
ペプチド３４のＰＥＧ修飾脂質を５％含むリポソーム；ＲＩ／３４−ＰＥＧ
ペプチド３５のＰＥＧ修飾脂質を５％含むリポソーム；ＲＩ／３５−ＰＥＧ
ペプチド３６のＰＥＧ修飾脂質を５％含むリポソーム；ＲＩ／３６−ＰＥＧ
ペプチド３７のＰＥＧ修飾脂質を５％含むリポソーム；ＲＩ／３７−ＰＥＧ

続いて、これらのリポソームについて、実施例２に記載の方法に従い、細胞透過率を算出し、実施例２（３）で算出したＲＩ／１−ＰＥＧの細胞透過比に対する、算出したそれぞれの細胞透過比の割合を百分率で算出した。ＲＩ／８−ＰＥＧ〜ＲＩ／１３−ＰＥＧの結果を図５に、ＲＩ／１４−ＰＥＧ〜ＲＩ／１７−ＰＥＧの結果を図６に、ＲＩ／１８−ＰＥＧおよびＲＩ／１９−ＰＥＧの結果を図７に、ＲＩ／２０−ＰＥＧおよびＲＩ／２１−ＰＥＧの結果を図８に、ＲＩ／２２−ＰＥＧおよびＲＩ／２３−ＰＥＧの結果を図９に、ＲＩ／２４−ＰＥＧおよびＲＩ／２５−ＰＥＧの結果を図１０に、ＲＩ／２６−ＰＥＧおよびＲＩ／２７−ＰＥＧの結果を図１１に、ＲＩ／２８−ＰＥＧ〜ＲＩ／３２−ＰＥＧの結果を図１２に、ＲＩ／３３−ＰＥＧ〜ＲＩ／３７−ＰＥＧの結果を図１３に、それぞれ示す。

図５および図１０に示すように、ＲＩ／８−ＰＥＧ、ＲＩ／９−ＰＥＧ、ＲＩ／１０−ＰＥＧ、ＲＩ／１１−ＰＥＧ、ＲＩ／１２−ＰＥＧ、ＲＩ／１３−ＰＥＧ、ＲＩ／２４−ＰＥＧおよびＲＩ／２５−ＰＥＧの細胞透過比割合は、それぞれ約３８．５％、約４０％、約６．２％、約３９％、約２１．５％、約２４．６％、約３０％および約２０％であった。これらの結果から、ペプチドがヘプタペプチドの場合、Ｎ末端のアミノ酸残基およびＣ末端のアミノ酸残基はいずれもＬである場合に、リポソームの細胞透過能が向上することが確認された。

また、図６に示すように、ＲＩ／１４−ＰＥＧ、ＲＩ／１６−ＰＥＧおよびＲＩ／１７−ＰＥＧの細胞透過比割合は、それぞれ約６０％、約６％および約４％であった。これらの結果から、ペプチドがヘプタペプチドの場合、さらにＮ末端から２番目のアミノ酸残基がＬまたは極性アミノ酸残基である場合に、リポソームへの細胞透過能が向上することが確認された。

また、図７、図８および図１０に示すように、ＲＩ／１８−ＰＥＧ、ＲＩ／１９−ＰＥＧ、ＲＩ／２０−ＰＥＧ、ＲＩ／２１−ＰＥＧ、ＲＩ／２４−ＰＥＧおよびＲＩ／２５−ＰＥＧの細胞透過比割合は、それぞれ約１０％、約４４．６％、約３３．８％、約１０％、約３０％および約２０％であった。これらの結果から、ペプチドがヘプタペプチドの場合、さらにＮ末端から３番目のアミノ酸残基が極性無電荷側鎖アミノ酸残基である場合に、リポソームの細胞透過能が向上することが確認された。

また、図６、図９および図１２に示すように、ＲＩ／１６−ＰＥＧ、ＲＩ／１７−ＰＥＧ、ＲＩ／２２−ＰＥＧ、ＲＩ／２３−ＰＥＧ、ＲＩ／２８−ＰＥＧ、ＲＩ／２９−ＰＥＧ、ＲＩ／３０−ＰＥＧ、ＲＩ／３１−ＰＥＧおよびＲＩ／３２−ＰＥＧの細胞透過比割合はそれぞれ約６％、約４％、約１２．３％、約２．３％、約１６．７％、約６．７％、約３８．３％、約８．３％および約５％であった。これらの結果から、ペプチドの長さが８アミノ酸残基以上になると、リポソームの細胞透過能が低下することが確認された。

また、図１０に示すように、ＲＩ／２４−ＰＥＧおよびＲＩ／２５−ＰＥＧの細胞透過比割合はそれぞれ約３０％および約２０％であった。これらの結果から、ペプチド１のアミノ酸配列の並びを変更したヘプタペプチドは、リポソームの細胞透過能が低下することが確認された。

また、図１１に示すように、ＲＩ／２６−ＰＥＧおよびＲＩ／２７−ＰＥＧの細胞透過比割合はそれぞれ約６０％および約４７％であった。これらの結果から、Ｎ末端およびＣ末端がＬであり、Ｎ末端から２番目のアミノ酸残基が極性アミノ酸残基であり、かつＮ末端から３番目のアミノ酸が極性無電荷側鎖アミノ酸残基であるヘキサペプチドは、リポソームの細胞透過能が向上することが確認された。

また、図６、図１２および図１３に示すように、ＲＩ／１５−ＰＥＧ、ＲＩ／２８−ＰＥＧ、ＲＩ／２９−ＰＥＧ、ＲＩ／３０−ＰＥＧ、ＲＩ／３１−ＰＥＧ、ＲＩ／３２−ＰＥＧ、ＲＩ／３３−ＰＥＧ、ＲＩ／３４−ＰＥＧ、ＲＩ／３６−ＰＥＧおよびＲＩ／３７−ＰＥＧの細胞透過比割合はそれぞれ約１０９％、約１６．７％、６．７％、約３８．３％、約８．３％、約５％、約１３％、約３６％、約９８％、約４９％および約８０％であったことから、ペプチドがヘキサペプチドまたはヘプタペプチドの場合、さらにＮ末端から３番目の極性無電荷側鎖アミノ酸残基とＣ末端のＬとの間の、それぞれ２または３アミノ酸残基が極性アミノ酸残基である場合に、リポソームの細胞透過能が顕著に向上することが確認された。

また、図１２に示すように、ＲＩ／３０−ＰＥＧ、ＲＩ／３１−ＰＥＧおよびＲＩ／３２−ＰＥＧの細胞透過比割合はそれぞれ約３８．３％、約８．３％および約５％であったことから、ペプチド１のアミノ酸配列のＮ末端から６番目のＲのＣ末端側にＬまたはＡを付加した場合は、リポソームの細胞透過能が低下することが確認された。

＜実施例６＞ペプチド修飾量の検討
ペプチド１について、実施例１（４）［４−１］に記載の方法に従い、ＲＩ標識ペプチド−ＰＥＧ修飾リポソームを調製した。ただし、混合脂質エタノール溶液および実施例１（３）で調製したペプチド−ＰＥＧ修飾脂質水溶液をガラス製試験管に入れる際に、（混合脂質）：（実施例１（３）で調製したペプチド−ＰＥＧ修飾脂質）のｍｏｌ％の比が９９：１となるもの、９５：５となるものおよび９０：１０となるものの３種類を準備した。すなわち、ペプチド１の修飾脂質のｍｏｌ％の比がそれぞれ１％、５％および１０％である３種類のリポソームを調製し、それぞれＲＩ／１−ＰＥＧ（１％）、ＲＩ／１−ＰＥＧ（５％）およびＲＩ／１−ＰＥＧ（１０％）とした。これらのリポソームについて、実施例２に記載の方法により、細胞透過比を算出した。また、算出した値について、ＲＩ／１−ＰＥＧ（５％）の細胞透過比に対するｔ検定を行った。その結果を図１４に示す。

図１４に示すように、ＲＩ／１−ＰＥＧ（１％）、ＲＩ／１−ＰＥＧ（５％）およびＲＩ／１−ＰＥＧ（１０％）の細胞透過比はそれぞれ約０．４２、約０．７３、および約０．５４であり、有意差はないものの、ＲＩ／１−ＰＥＧ（５％）の細胞透過比が最も高かった。これらの結果から、ペプチド１の修飾脂質のｍｏｌ％割合は、５％である場合に最も細胞透過率が高くなることが確認された。

＜実施例７＞ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）が介する細胞内取り込み阻害時におけるリポソームの細胞内取り込み比の検討
（１）リポソームのヘパリン処理
実施例１（４）［４−１］で調製したＲＩ／１−ＰＥＧ、実施例１（４）［４−４］で調製したＲＩ／７および実施例１（４）［４−５］で調製したＲＩ／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥの溶液それぞれ０．０１ｍＬに、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に対して競合阻害効果を有するヘパリン（和光純薬工業社）１００ｕｎｉｔｓを添加し、室温で１５分間インキュベートすることにより、リポソームのヘパリン処理を行った。

（２）ヘパリン処理を行ったリポソームの細胞内取り込み比の測定
本実施例（１）でヘパリン処理を行ったＲＩ／１−ＰＥＧ、ＲＩ／７およびＲＩ／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥについて、実施例３に記載の方法により、細胞内取り込み比を測定した。また同時に、コントロールとして、本実施例（１）のヘパリン処理を行っていない実施例１（４）［４−１］で調製したＲＩ／１−ＰＥＧ、実施例１（４）［４−４］で調製したＲＩ／７および実施例１（４）［４−５］で調製したＲＩ／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥについて、同様の方法により細胞内取り込み比を算出し、コントロールの細胞内取り込み比に対する、ヘパリン処理を行った場合の細胞内取り込み比の割合を百分率で算出した。その結果を図１５に示す。

図１５に示すように、ＲＩ／１−ＰＥＧの細胞内取り込み比割合は約１５．４％であり、ヘパリン処理を行わない場合と比べて顕著に減少したことが明らかになった。一方、ＲＩ／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥの細胞内取り込み比割合は、約９３．８％であり、ヘパリン処理を行わない場合と比べてほとんど変化しないことが明らかになった。また、ＲＩ／７の細胞内取り込み比割合は、約７５．４％であり、ヘパリン処理を行わない場合と比べてわずかに減少したことが明らかになった。

リポソームが、細胞表面のＨＳＰＧを介して細胞に取り込まれる場合、ＨＳＰＧと類似の構造を有するヘパリンでリポソームを処理すると、そのリポソームの細胞内取り込み比は減少する。従って、上述した結果から、ＲＩ／１−ＰＥＧは主としてＨＳＰＧを介して細胞内に取り込まれていることが確認された。また、ＲＩ／１−ＰＥＧと同様にカチオン性を有するＲＩ／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥおよびＲＩ／７は、主としてＨＳＰＧを介さない経路で細胞内に取り込まれていることが確認された。

＜実施例８＞Ｒｈｏ／１−ＰＥＧの細胞内取り込み状態の確認
（１）リポソームのヘパリン処理
実施例１（４）［４−６］で調製したＲｈｏ／１−ＰＥＧおよび実施例１（４）［４−７］で調製したＲｈｏ／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥについて、実施例７（１）に記載の方法によりヘパリン処理を行った。

（２）蛍光顕微鏡観察によるリポソームの細胞内取り込み状態の確認
ガラスベースディッシュ（ＩＷＡＫＩ社）上で、実施例２（２）［２−１］に記載の方法により細胞を培養した後、培養液を除去し、実施例１（１）で調製したＫｒｅｂｓ緩衝液で１回洗浄し、除去した培養液と等量のＫｒｅｂｓ緩衝液を加え、本実施例（１）でヘパリン処理を行ったＲｈｏ／１−ＰＥＧおよびＲｈｏ／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥをそれぞれ１００μＬ（約１００万〜２００万ｄｐｍ）／ウェルを添加した。１時間後、リポソームを含むＫｒｅｂｓ緩衝液を除去し、４０ｕｎｉｔ／ｍＬのヘパリン（和光純薬工業社）を含むＰＢＳ（日水製薬社）１ｍＬを用いて３回洗浄した後、カメラ付き顕微鏡（カメラ：浜松ホトニクス社、顕微鏡：ニコン社）を用いてローダミンの蛍光を観察した。また同時に、コントロールとして本実施例（１）のヘパリン処理を行っていない実施例１（４）［４−６］で調製したＲｈｏ／１−ＰＥＧおよび実施例１（４）［４−７］で調製したＲｈｏ／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥについて、同様の方法により細胞に取り込ませて蛍光観察を行い、コントロールとした。その結果を図１６に示す。

図１６に示すように、Ｒｈｏ／１−ＰＥＧの場合、コントロールでは細胞内にローダミンの蛍光が観察されたのに対し、ヘパリン処理では、細胞内にローダミンの蛍光がほとんど観察されなかった。一方、Ｒｈｏ／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥの場合、ヘパリン処理でもコントロールと同様に細胞内においてローダミンの蛍光が観察された。

これらの結果から、Ｒｈｏ／１−ＰＥＧは主としてＨＳＰＧを介して細胞内に取り込まれていることが確認された。また、Ｒｈｏ／１−ＰＥＧと同様にカチオン性を有するＲｈｏ／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥは、主としてＨＳＰＧを介さない経路で細胞内に取り込まれていることが確認された。

＜実施例９＞血管内皮細胞および非血管内皮細胞におけるＲｈｏ／１−ＰＥＧリポソームの輸送経路の確認
（１）細胞における初期エンドソームの標識
初期エンドソームに局在する低分子量ＧＴＰ結合タンパク質であるＲａｂ５と緑色蛍光タンパク質であるＧＦＰとの融合タンパク質（Ｒａｂ５−ＧＦＰ）をコードする発現プラスミドをあらかじめ作製し、後述の本実施例（４）において蛍光観察を行う２４時間前に、ＭＢＥＣ４細胞およびＨＳＰＧが発現していることが知られている非血管内皮細胞であるＣＨＯ−Ｋ１細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）に、遺伝子導入用カチオン性脂質（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＰＬＵＳ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）遺伝子導入することにより、初期エンドソームを蛍光標識した。

（２）細胞における後期エンドソームの標識
後期エンドソームに局在する低分子量ＧＴＰ結合タンパク質であるＲａｂ７とＧＦＰとの融合タンパク質（Ｒａｂ７−ＧＦＰ）をコードする発現プラスミドをあらかじめ作製し、後述の本実施例（４）において蛍光観察を行う２４時間前に、ＭＢＥＣ４細胞およびＣＨＯ−Ｋ１細胞に、遺伝子導入用カチオン性脂質（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＰＬＵＳ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）遺伝子導入することにより、後期エンドソームを蛍光標識した。

（３）細胞におけるリソソームの標識
本実施例（１）で初期エンドソームを蛍光標識したＭＢＥＣ４細胞、本実施例（１）で初期エンドソームを蛍光標識したＣＨＯ−Ｋ１細胞、本実施例（２）で後期エンドソームを蛍光標識したＭＢＥＣ４細胞および本実施例（２）で後期エンドソームを蛍光標識したＣＨＯ−Ｋ１細胞の培地に、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−２２（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を、添付の使用書に従ってそれぞれ添加し、３０分間インキュベートすることによりリソソームを蛍光標識した。

（４）蛍光顕微鏡観察によるリポソームの取り込み経路の確認
本実施例（３）でリソソームを蛍光標識した各細胞に、実施例８（２）に記載の方法により、実施例１（４）［４−６］で調製したＲｈｏ／１−ＰＥＧを取り込ませ、蛍光顕微鏡を用いてローダミン、ＧＦＰおよびＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｂｌｕｅの蛍光を観察した。ＭＢＥＣ４細胞の観察結果を図１７に、ＣＨＯ−Ｋ１細胞の観察結果を図１８にそれぞれ示す。

図１７に示すように、初期エンドソームを蛍光標識したＭＢＥＣ４細胞では、ローダミンの蛍光は、ＧＦＰの蛍光およびＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｂｌｕｅの蛍光のいずれとも異なる場所で観察された。また、後期エンドソームを蛍光標識したＭＢＥＣ４細胞においても同様、ローダミンの蛍光は、ＧＦＰの蛍光およびＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｂｌｕｅの蛍光のいずれとも異なる場所で観察された。これらの結果から、ＭＢＥＣ４細胞内に取り込まれたＲｈｏ／１−ＰＥＧは、初期エンドローム、後期エンドソームおよびリソソームに移行せずに、細胞透過されることが明らかになった。

また、図１８に示すように、初期エンドソームを蛍光標識したＣＨＯ−Ｋ１細胞では、ローダミンの蛍光は、ＧＦＰの蛍光とは異なる場所で観察されるとともに、矢印で示す場所でＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｂｌｕｅの蛍光と同じ場所に観察された。さらに、後期エンドソームを蛍光標識したＣＨＯ−Ｋ１細胞では、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｂｌｕｅの蛍光とは異なる場所で観察されるとともに、矢印で示す場所でＧＦＰの蛍光と同じ場所に観察された。これらの結果から、ＣＨＯ−Ｋ１細胞では、細胞内に取り込まれたＲｈｏ／ＣＩ９５−ＰＥＧは、リソソームおよび後期エンドソームに移行することが明らかになり、細胞透過されずに通常の分解系に入ることが示唆された。

本発明において、保存的アミノ酸置換とは、生じる分子の生理学的活性を変化させることなく一般的になされ得る範囲、すなわち保存的置換の範囲で認められるもの（Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｇｅｎｅなど）であり、例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸の酸性アミノ酸；リシン、アルギニンおよびヒスチジンの塩基性アミノ酸；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファンの非極性アミノ酸；グリシン、アスパラギン、システイン、グルタミン、セリン、トレオニンおよびチロシンの極性無電荷側鎖アミノ酸；フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンの芳香族アミノ酸といった側鎖に類似性のあるアミノ酸同士（アミノ酸のファミリー内部）で起こる置換を挙げることができる。同様に、アスパラギン酸およびグルタミン酸の酸性アミノ酸；リシン、アルギニンおよびヒスチジンの塩基性アミノ酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンおよびトレオニンの脂肪族アミノ酸（セリンおよびトレオニンの脂肪族−ヒドロキシアミノ酸と分類することもできる）；フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンの芳香族アミノ酸；アスパラギンおよびグルタミンのアミド；システインおよびメチオニンの含硫アミノ酸といった分類をすることができる。

続いて、実施例３で算出したＲＩ／１−ＰＥＧの細胞内取り込み比（Ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩを添加しない場合のＲＩ／１−ＰＥＧの細胞内取り込み比）に対する、Ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩを添加して算出したＲＩ／１−ＰＥＧの細胞内取り込み比の割合を百分率で算出した。また、算出した値について、実施例３で算出したＲＩ／１−ＰＥＧの細胞内取り込み比（Ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩを添加しない場合のＲＩ／１−ＰＥＧの細胞内取り込み比）に対するｔ検定を行った。同様に、実施例３で算出したＲＩ／１の細胞内取り込み比（Ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩを添加しない場合のＲＩ／１の細胞内取り込み比）に対する、Ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩを添加して算出したＲＩ／１の細胞内取り込み比の割合を百分率で算出し、算出した値について、実施例３で算出したＲＩ／１の細胞内取り込み比（Ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩを添加しない場合のＲＩ／１の細胞内取り込み比）に対するｔ検定を行った。それらの結果を図４に示す。

Claims (25)

1. アミノ酸配列がＬＸ_１Ｘ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｘ_１Ｌ、ＬＬＸ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｘ_１ＬまたはＬＸ_１Ｘ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｌ（式中、Ｌはロイシン残基を、Ｘ_１は極性アミノ酸残基を、Ｘ_２は極性無電荷側鎖アミノ酸残基を、それぞれ表す。）である、脂質膜構造体に細胞透過能を付与および／または脂質膜構造体の細胞透過能を増強するペプチド。
2. 極性無電荷側鎖アミノ酸残基Ｘ_２がＱ（Ｑはグルタミン残基を表す。）である、請求項１に記載のペプチド。
3. 極性アミノ酸残基Ｘ_１がＲ、Ｋ、ＳおよびＤ（Ｒはアルギニン残基を、Ｋはリシン残基を、Ｓはセリン残基を、Ｄはアスパラギン酸残基を、それぞれ表す。）からなる群より選択される同じまたは異なるアミノ酸残基である、請求項１または請求項２に記載のペプチド。
4. アミノ酸配列がＬＲＱＲＲＲＬ、ＬＬＱＲＲＲＬ、ＬＲＱＲＲＬ、ＬＫＱＫＫＫＬ、ＬＬＱＫＫＫＬ、ＬＫＱＫＫＬ、ＬＲＱＳＳＳＬ、ＬＬＱＳＳＳＬ、ＬＲＱＳＳＬ、ＬＲＱＲＤＤＬ、ＬＬＱＲＤＤＬまたはＬＲＱＲＤＬ（式中、Ｌはロイシン残基を、Ｒはアルギニン残基を、Ｑはグルタミン残基を、Ｋはリシン残基を、Ｓはセリン残基を、Ｄはアスパラギン酸残基を、それぞれ表す。）である、請求項１から請求項３のいずれかに記載のペプチド。
5. 細胞が上皮細胞である、請求項１から請求項４のいずれかに記載のペプチド。
6. 脂質ラフトに存在するヘパラン硫酸プロテオグリカンを介して細胞に取り込まれる、請求項１から請求項５のいずれかに記載のペプチド。
7. 請求項１から請求項６のいずれかに記載のペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む、細胞透過能を有するまたは細胞透過能が増強された脂質膜構造体。
8. ペプチドと結合した脂質が、ペプチドのＣ末端にチロシン残基、システイン残基、親水性ポリマーおよび脂質がこの順で結合してなるペプチドと結合した脂質である、請求項７に記載の脂質膜構造体。
9. 親水性ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項８に記載の脂質膜構造体。
10. 構成脂質総量に占めるペプチドが結合した脂質の割合Ｐが１ｍｏｌ％≦Ｐ≦１０ｍｏｌ％である、請求項７から請求項９のいずれかに記載の脂質膜構造体。
11. 細胞が上皮細胞である、請求項７から請求項１０のいずれかに記載の脂質膜構造体。
12. 脂質ラフトに存在するヘパラン硫酸プロテオグリカンを介して細胞に取り込まれる、請求項７から請求項１１のいずれかに記載の脂質膜構造体。
13. アミノ酸配列がＬＸ_１Ｘ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｘ_１Ｌ、ＬＬＸ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｘ_１ＬまたはＬＸ_１Ｘ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｌ（式中、Ｌはロイシン残基を、Ｘ_１は極性アミノ酸残基を、Ｘ_２は極性無電荷側鎖アミノ酸残基を、それぞれ表す。）であるペプチドを有効成分とする、脂質膜構造体に対する細胞透過能付与および／または細胞透過能増強剤。
14. 極性無電荷側鎖アミノ酸残基Ｘ_２がＱ（Ｑはグルタミン残基を表す。）である、請求項１３に記載の細胞透過能付与および／または細胞透過能増強剤。
15. 極性アミノ酸残基Ｘ_１がＲ、Ｋ、ＳおよびＤ（Ｒはアルギニン残基を、Ｋはリシン残基を、Ｓはセリン残基を、Ｄはアスパラギン酸残基を、それぞれ表す。）からなる群より選択される同じまたは異なるアミノ酸残基である、請求項１３または請求項１４に記載の細胞透過能付与および／または細胞透過能増強剤。
16. アミノ酸配列がＬＲＱＲＲＲＬ、ＬＬＱＲＲＲＬ、ＬＲＱＲＲＬ、ＬＫＱＫＫＫＬ、ＬＬＱＫＫＫＬ、ＬＫＱＫＫＬ、ＬＲＱＳＳＳＬ、ＬＬＱＳＳＳＬ、ＬＲＱＳＳＬ、ＬＲＱＲＤＤＬ、ＬＬＱＲＤＤＬまたはＬＲＱＲＤＬ（式中、Ｌはロイシン残基を、Ｒはアルギニン残基を、Ｑはグルタミン残基を、Ｋはリシン残基を、Ｓはセリン残基を、Ｄはアスパラギン酸残基を、それぞれ表す。）である、請求項１３から請求項１５のいずれかに記載の細胞透過能付与および／または細胞透過能増強剤。
17. 細胞が上皮細胞である、請求項１３から請求項１６のいずれかに記載の細胞透過能付与および／または細胞透過能増強剤。
18. ペプチドが脂質ラフトに存在するヘパラン硫酸プロテオグリカンを介して細胞に取り込まれるペプチドである、請求項１３から請求項１７のいずれかに記載の細胞透過能付与および／または細胞透過能増強剤。
19. 細胞透過能を有するまたは細胞透過能が増強された脂質膜構造体を製造する方法であって、
    アミノ酸配列がＬＸ_１Ｘ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｘ_１Ｌ、ＬＬＸ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｘ_１ＬまたはＬＸ_１Ｘ_２Ｘ_１Ｘ_１Ｌ（式中、Ｌはロイシン残基を、Ｘ_１は極性アミノ酸残基を、Ｘ_２は極性無電荷側鎖アミノ酸残基を、それぞれ表す。）であるペプチドで脂質膜構造体を修飾する工程
    を有する前記方法。
20. 極性無電荷側鎖アミノ酸残基Ｘ_２がＱ（Ｑはグルタミン残基を表す。）である、請求項１９に記載の方法。
21. 極性アミノ酸残基Ｘ_１がＲ、Ｋ、ＳおよびＤ（Ｒはアルギニン残基を、Ｋはリシン残基を、Ｓはセリン残基を、Ｄはアスパラギン酸残基を、それぞれ表す。）からなる群より選択される同じまたは異なるアミノ酸残基である、請求項１９または請求項２０に記載の方法。
22. アミノ酸配列がＬＲＱＲＲＲＬ、ＬＬＱＲＲＲＬ、ＬＲＱＲＲＬ、ＬＫＱＫＫＫＬ、ＬＬＱＫＫＫＬ、ＬＫＱＫＫＬ、ＬＲＱＳＳＳＬ、ＬＬＱＳＳＳＬ、ＬＲＱＳＳＬ、ＬＲＱＲＤＤＬ、ＬＬＱＲＤＤＬまたはＬＲＱＲＤＬ（式中、Ｌはロイシン残基を、Ｒはアルギニン残基を、Ｑはグルタミン残基を、Ｋはリシン残基を、Ｓはセリン残基を、Ｄはアスパラギン酸残基を、それぞれ表す。）である、請求項１９から請求項２１のいずれかに記載の方法。
23. ペプチドで脂質膜構造体を修飾する工程が、ペプチドのＣ末端にチロシン残基、システイン残基、親水性ポリマーおよび脂質をこの順で結合させることによりペプチドで脂質膜構造体を修飾する工程である、請求項１９から請求項２２のいずれかに記載の方法。
24. 細胞が上皮細胞である、請求項１９から請求項２３のいずれかに記載の方法。
25. ペプチドが脂質ラフトに存在するヘパラン硫酸プロテオグリカンを介して細胞に取り込まれるペプチドである、請求項１９から請求項２４に記載の方法。

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