JPWO2011027738A1 - 膵島イメージング用分子プローブ及びその使用 - Google Patents
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Abstract
膵島イメージング用分子プローブの提供。下記式(１)、(５)及び(９)のいずれかで表されるポリペプチド又は前記ポリペプチドと相同性を有するポリペプチドを含む分子プローブ。Z-DLSXQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2(1)Z-DLSKQMEEEAVRLFIEWLXNGGPSSGAPPPS-NH2(5)B-DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2(9)［上記式(１)及び(５)における「X」及び上記式(９)における「B-」は、アミノ基が下記式（I）で表される芳香環を含む基によって標識されていることを示す。］［前記式（I）において、Ａは芳香族炭化水素基又は芳香族複素環基を示し、Ｒ１は放射性ヨウ素を含む置換基を示し、Ｒ２は水素原子又はＲ１とは異なる置換基を示し、Ｒ３は結合手、メチレン基又はオキシメチレン基を示す。］
Description
本発明は、膵島イメージング用分子プローブ及びその使用に関する。
現在、日本における２型糖尿病は推定８２０万人を越えて増加し続けている。この対策として耐糖能検査を基準とした糖尿病発症前の介入が行われているが、充分な成果が得られていない。その原因として、耐糖能検査で機能異常が明らかとなる境界型の段階では膵島の障害はすでに高度に進行しており、介入開始時期としては遅い可能性がある。
すなわち、糖尿病の発症過程では、膵島量（とりわけ、膵β細胞量）が耐糖能異常に先行して減少するため、機能異常が検出・自覚される段階に至ってからでは、糖尿病はすでに治療が難しい段階となっている。一方、膵島量及び／又は膵β細胞量の減少を早期に発見することができれば、糖尿病を予防・治療できる可能性がある。したがって、糖尿病の予防・診断を行うために非侵襲の膵島イメージング技術、とりわけ膵島量及び又は膵β細胞量を測定するための非侵襲の膵島イメージング技術が望まれている。その中でも、膵島、好ましくは、膵β細胞のイメージングや膵β細胞量の測定を非侵襲的に可能とする分子プローブが特に望まれている。
膵島のイメージング用分子プローブの設計において、β細胞に特異的な機能性タンパク質を中心に、膵島細胞における様々な標的分子が検討されている。中でも、標的分子として、膵β細胞に分布し、かつ、７回膜貫通型のＧ−タンパク質共役受容体であるＧＬＰ−１Ｒ（グルカゴン様ペプチド１受容体）が検討されている。
ＧＬＰ−１Ｒを標的分子とする膵島β細胞のイメージング用分子プローブとして、例えば、ＧＬＰ−１ＲアンタゴニストであるＥｘｅｎｄｉｎ−４（９−３９）の誘導体を［18F］フッ素で標識した分子プローブが検討されている（例えば、非特許文献１）。
また、その他にＧＬＰ−１Ｒを標的分子とするイメージング用分子プローブとして、ＧＬＰ−１Ｒ陽性の腫瘍をイメージングするための分子プローブが検討されている。ＧＬＰ−１Ｒ陽性腫瘍のイメージング用分子プローブとしては、例えば、ＧＬＰ−１ＲアゴニストであるＥｘｅｎｄｉｎ−４の誘導体をジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）を介して［111In］インジウムで標識した分子プローブや、ＧＬＰ−１ＲアンタゴニストであるＥｘｅｎｄｉｎ−４（９−３９）の誘導体をＤＴＰＡを介して［111In］インジウムで標識した分子プローブが検討されている（例えば、非特許文献２）。
しかしながら、非侵襲的な膵島の三次元イメージングが可能なさらなる膵島イメージング用分子プローブが求められている。
H. Kimura et al. Development of in vivo imaging agents targeting glucagons-like peptide-1 receptor (GLP-1R) in pancreatic islets. 2009 SNM Annual Meeting, abstract, Oral Presentations No.326
M. Beche et al. Are radiolabeled GLP-1 receptor antagonists useful for scintigraphy? 2009 SNM Annual Meeting, abstract, Oral Presentations No.327
そこで、本発明は、非侵襲的な膵島の三次元イメージングが可能な膵島イメージング用分子プローブを提供する。
本発明は、膵島のイメージングに用いられる分子プローブであって、
下記式(１)〜(１２)のいずれかで表されるポリペプチド、
下記式(１)〜(１２)のポリペプチドから１〜数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換したポリペプチドであって、膵島に結合可能なポリペプチド、又は、
下記式(１)〜(１２)のポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するポリペプチドであって、膵島に結合可能なポリペプチドを含む膵島イメージング用分子プローブに関する。
Z-DLSXQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (1) （配列番号１）
Z-LSXQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (2) （配列番号２）
Z-SXQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (3) （配列番号３）
Z-XQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (4) （配列番号４）
Z-DLSKQMEEEAVRLFIEWLXNGGPSSGAPPPS-NH2 (5) （配列番号５）
Z-LSKQMEEEAVRLFIEWLXNGGPSSGAPPPS-NH2 (6) （配列番号６）
Z-SKQMEEEAVRLFIEWLXNGGPSSGAPPPS-NH2 (7) （配列番号７）
Z-KQMEEEAVRLFIEWLXNGGPSSGAPPPS-NH2 (8) （配列番号８）
B-DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (9) （配列番号９）
B-LSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (10) （配列番号１０）
B-SKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (11) （配列番号１１）
B-KQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (12) （配列番号１２）
［上記式(１)〜(８)において、「Z-」は、Ｎ末端のα−アミノ基が、非修飾であるか、又は、電荷を有さない修飾基により修飾されていることを示し、「X」は、側鎖のアミノ基が、下記式（I）で表される芳香環を含む基によって標識されたリジン残基を示し、
上記式(９)〜(１２)において、「B-」は、Ｎ末端のα−アミノ基が、下記式（I）で表される芳香環を含む基によって標識されていることを示し、
上記式(１)〜(１２)において、「-NH2」は、Ｃ末端のカルボキシル基が、アミド化されていることを示す。］
［前記式（I）において、Ａは、芳香族炭化水素基及び芳香族複素環基のいずれかを示し、Ｒ１は、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ及び１３１Ｉのいずれかを含む置換基を示し、Ｒ２は、水素原子、又は、Ｒ１とは異なる１又は複数の置換基を示し、Ｒ３は、結合手、メチレン基及びオキシメチレン基のいずれかを示す。］
下記式(１)〜(１２)のいずれかで表されるポリペプチド、
下記式(１)〜(１２)のポリペプチドから１〜数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換したポリペプチドであって、膵島に結合可能なポリペプチド、又は、
下記式(１)〜(１２)のポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するポリペプチドであって、膵島に結合可能なポリペプチドを含む膵島イメージング用分子プローブに関する。
Z-DLSXQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (1) （配列番号１）
Z-LSXQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (2) （配列番号２）
Z-SXQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (3) （配列番号３）
Z-XQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (4) （配列番号４）
Z-DLSKQMEEEAVRLFIEWLXNGGPSSGAPPPS-NH2 (5) （配列番号５）
Z-LSKQMEEEAVRLFIEWLXNGGPSSGAPPPS-NH2 (6) （配列番号６）
Z-SKQMEEEAVRLFIEWLXNGGPSSGAPPPS-NH2 (7) （配列番号７）
Z-KQMEEEAVRLFIEWLXNGGPSSGAPPPS-NH2 (8) （配列番号８）
B-DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (9) （配列番号９）
B-LSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (10) （配列番号１０）
B-SKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (11) （配列番号１１）
B-KQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (12) （配列番号１２）
［上記式(１)〜(８)において、「Z-」は、Ｎ末端のα−アミノ基が、非修飾であるか、又は、電荷を有さない修飾基により修飾されていることを示し、「X」は、側鎖のアミノ基が、下記式（I）で表される芳香環を含む基によって標識されたリジン残基を示し、
上記式(９)〜(１２)において、「B-」は、Ｎ末端のα−アミノ基が、下記式（I）で表される芳香環を含む基によって標識されていることを示し、
上記式(１)〜(１２)において、「-NH2」は、Ｃ末端のカルボキシル基が、アミド化されていることを示す。］
本発明によれば、例えば、ポジトロン放射断層撮影法（ＰＥＴ）やシングルフォトン放射線コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）などにより、膵島のイメージング、好ましくは膵島の三次元イメージング、より好ましくは非侵襲の膵島イメージングが可能となる。
膵島の直径は、例えば、ヒトの場合、５０〜５００μｍ程度である。このような膵島を生体内において非侵襲的に画像化又は定量化するためには、例えば、膵島に特異的に集積して周囲臓器とのコントラストを生じさせることが可能な分子プローブが必要であると考えられている。このため、様々な分子プローブの研究・開発が行われている。
例えば、非特許文献２（M. Beche et al.）では、ＧＬＰ−１Ｒ陽性腫瘍及び膵島細胞における、Ｌｙｓ４０（Ａｈｘ−ＤＴＰＡ−１１１Ｉｎ）Ｅｘｅｎｄｉｎ（９−３９）のＧＬＰ−１Ｒ親和性の研究が行われている。そして、Ｌｙｓ４０（Ａｈｘ−ＤＴＰＡ−１１１Ｉｎ）Ｅｘｅｎｄｉｎ（９−３９）の膵島への集積は０．４％程度であり、ＧＬＰ−１Ｒ陽性腫瘍細胞への集積でも７．５％程度であり、すなわち、Ｌｙｓ４０（Ａｈｘ−ＤＴＰＡ−１１１Ｉｎ）Ｅｘｅｎｄｉｎ（９−３９）はＧＬＰ−１Ｒへの親和性が低いという結果が得られている。
また、その他に、市販の［125I］Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ標識Ｅｘｅｎｄｉｎ（９−３９）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用い、ＧＬＰ−１Ｒを標的分子として膵β細胞を検出することが試みられている（E. Mukai et al. Non-invasive imaging of pancreatic islets targeting glucagon-like peptide-1 receptors, 44thEASD Annual Meeting Rome 2008, abstract, Presentation No.359（以下、「非特許文献３」という））。［125I］Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ標識Ｅｘｅｎｄｉｎ（９−３９）（以下、「ＢＨ標識プローブ」ともいう）をマウスに尾静脈より投与すると、投与後６０分及び１２０分でのＢＨ標識プローブの膵臓への集積が、肺以外のその他の臓器と比較して最も高いという結果が得られている。一方で、我々の実験によると、［125I］Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ標識Ｅｘｅｎｄｉｎ（９−３９）を投与後、時間の経過とともにＢＨ標識プローブの首（甲状腺）への集積が増加するという結果が得られている（例えば、本明細書の図２参照）。首（甲状腺）への集積の増加は、投与したＢＨ標識プローブから放射性ヨウ素が生体内で脱離し、脱離した放射性ヨウ素が甲状腺に蓄積したことを意味する。１２５Ｉ等の放射性ヨウ素は、甲状腺に蓄積しやすく、また、甲状腺に蓄積すると、例えば、甲状腺ガン等の原因となることが知られている。このため、放射性ヨウ素を放射性核種として用いたイメージング用分子プローブにおいて、脱離した放射性ヨウ素の首（甲状腺）への集積が低いこと、つまり、生体内における放射性ヨウ素の脱離が低く、生体安定性に優れる分子プローブが好ましい。
したがって、例えば、膵島に特異的に集積して周囲臓器とのコントラストを生じさせることが可能な新たな分子プローブであって、生体内における放射性ヨウ素の脱離が抑制された分子プローブが求められていることが現状である。
本発明は、上記式（I）で表される基によって標識されたイメージング用分子プローブによれば、例えば、ＰＥＴやＳＰＥＣＴ等により非侵襲の膵島三次元イメージングが可能になり、かつ、プローブからの放射性ヨウ素の脱離が抑制される、という知見に基づく。すなわち、本発明は、膵島の非侵襲的な三次元イメージングを可能にするという効果を好ましくは奏する。また、本発明は、好ましくは、非特許文献１、２及び３に記載されている分子プローブと比較して膵島により特異的に集積させることができるため、膵島の定量用イメージングを行うことができるという効果を奏しうる。
また、上記したとおり、糖尿病の発症過程では、耐糖能異常に先行して膵島量が減少することが知られている。このため、膵島イメージング及び又は膵島量の測定を行うことにより、例えば、糖尿病の発症前や初期の状態で、膵島の微小な変化を見つけることができることから、本発明のイメージング用分子プローブによれば、糖尿病の超早期発見・診断が可能になる。このため、本発明のイメージング用分子プローブは、糖尿病の予防・早期発見・診断、好ましくは糖尿病の超早期発見・診断に有用である。
すなわち、本発明は、
[１] 膵島のイメージングに用いられる分子プローブであって、下記式(１)〜(１２)のいずれかで表されるポリペプチド、下記式(１)〜(１２)のポリペプチドから１〜数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換したポリペプチドであって、膵島に結合可能なポリペプチド、又は、下記式(１)〜(１２)のポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するポリペプチドであって、膵島に結合可能なポリペプチドを含む膵島イメージング用分子プローブ、
Z-DLSXQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (1) （配列番号１）
Z-LSXQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (2) （配列番号２）
Z-SXQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (3) （配列番号３）
Z-XQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (4) （配列番号４）
Z-DLSKQMEEEAVRLFIEWLXNGGPSSGAPPPS-NH2 (5) （配列番号５）
Z-LSKQMEEEAVRLFIEWLXNGGPSSGAPPPS-NH2 (6) （配列番号６）
Z-SKQMEEEAVRLFIEWLXNGGPSSGAPPPS-NH2 (7) （配列番号７）
Z-KQMEEEAVRLFIEWLXNGGPSSGAPPPS-NH2 (8) （配列番号８）
B-DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (9) （配列番号９）
B-LSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (10) （配列番号１０）
B-SKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (11) （配列番号１１）
B-KQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (12) （配列番号１２）
［上記式(１)〜(８)において、「Z-」はＮ末端のα−アミノ基が非修飾であるか又は電荷を有さない修飾基により修飾されていることを示し、「X」は側鎖のアミノ基が下記式（I）で表される芳香環を含む基によって標識されたリジン残基を示し、上記式(９)〜(１２)において、「B-」はＮ末端のα−アミノ基が下記式（I）で表される芳香環を含む基によって標識されていることを示し、上記式(１)〜(１２)において、「-NH2」はＣ末端のカルボキシル基がアミド化されていることを示す。］
［前記式（I）において、Ａは芳香族炭化水素基及び芳香族複素環基のいずれかを示し、Ｒ１は１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ及び１３１Ｉのいずれかを含む置換基を示し、Ｒ２は水素原子又はＲ１とは異なる１又は複数の置換基を示し、Ｒ３は結合手、メチレン基及びオキシメチレン基のいずれかを示す。］；
[２] 前記芳香環を含む基は、下記式（II）で表される基である[１]記載の膵島イメージング用プローブ、
［前記式（II）において、Ｒ１は、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ及び１３１Ｉのいずれかを含む置換基を示す。］；
[３] 膵島のイメージングを行うためのキットであって、[１]又は[２]に記載の膵島イメージング用分子プローブを含むキット；
[４] 前記膵島イメージング用分子プローブを注射液の形態で含有する[３]記載のキット；
[５] 膵島のイメージングを行うための試薬であって、[１]又は[２]に記載の膵島イメージング用分子プローブを含む、膵島イメージング用試薬；
[６] 膵島のイメージング方法であって、[１]又は[２]に記載の膵島イメージング用分子プローブを投与された被検体から前記膵島イメージング用分子プローブのシグナルを検出することを含む膵島のイメージング方法；
[７] さらに、前記膵島イメージング用分子プローブを用いた膵島イメージングの結果から膵島の状態を判定することを含む[６]記載の膵島のイメージング方法；
[８] [１]又は[２]に記載の膵島イメージング用分子プローブを投与された被検体から前記膵島イメージング用分子プローブのシグナルを検出すること、及び、検出した膵島イメージング用分子プローブのシグナルから膵島量を算出することを含む膵島量の測定方法；
[９] さらに、算出した膵島量を提示することを含む[８]記載の膵島量の測定方法;
[１０] [１]又は[２]に記載の膵島イメージング用分子プローブの製造方法であって、膵島イメージング用分子プローブ前駆体を標識化及び脱保護することを含み、前記膵島イメージング用分子プローブ前駆体が、下記式(１３)〜(２４)のいずれかで表されるポリペプチド、下記式(１３)〜(２４)のポリペプチドから１〜数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換したポリペプチドであって標識化及び脱保護後に膵島に結合可能なポリペプチド、又は、下記式(１３)〜(２４)のポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するポリペプチドであって標識化及び脱保護後に膵島に結合可能なポリペプチドを含む膵島イメージング用分子プローブ前駆体である、膵島イメージング用分子プローブの製造方法、
*-DLSKQMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (13) （配列番号１３）
*-LSKQMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (14) （配列番号１４）
*-SKQMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (15) （配列番号１５）
*-KQMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (16) （配列番号１６）
*-DLSK* QMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (17) （配列番号１７）
*-LSK* QMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (18) （配列番号１８）
*-SK* QMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (19) （配列番号１９）
*-K* QMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (20) （配列番号２０）
DLSK* QMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (21) （配列番号２１）
LSK* QMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (22) （配列番号２２）
SK* QMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (23) （配列番号２３）
K* QMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (24) （配列番号２４）
［上記式(１３)〜(２０)において、「*-」はＮ末端のα−アミノ基が保護基により保護されているか又は電荷を有さない修飾基により修飾されていることを示し、上記式(１３)〜(２４)において、「K*」はリジンの側鎖のアミノ基が保護基により保護されていることを示し、「-NH2」はＣ末端のカルボキシル基がアミド化されていることを示す。］；
[１１] 前記膵島イメージング用分子プローブ前駆体の標識化が、下記式（I）で表される芳香環を含む基を有する標識化合物により標識化することを含む、[１０]記載の膵島イメージング用分子プローブの製造方法、
［前記式（I）において、Ａは、芳香族炭化水素基及び芳香族複素環基のいずれかを示し、Ｒ１は、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ及び１３１Ｉのいずれかを含む置換基を示し、Ｒ２は、水素原子、又は、Ｒ１とは異なる１又は複数の置換基を示し、Ｒ３は、結合手、メチレン基及びオキシメチレン基のいずれかを示す。］;
[１２] 放射性標識可能な官能基を側鎖に有するアミノ酸を複数個有するペプチドを放射性標識する方法であって、Ｎ末端のα−アミノ基及び側鎖の官能基が保護基によって保護された保護アミノ酸を用いてペプチドの合成を行うこと、合成したペプチドの放射性標識可能なアミノ酸の側鎖の官能基のうち放射性標識を行わない官能基の保護基を脱保護すること、脱保護したアミノ酸の側鎖の官能基を、脱保護前の保護基とは異なる保護基によって再度の保護を行うこと、前記再度の保護を行ったアミノ酸の側鎖の官能基以外の官能基の保護基を脱保護して放射性標識を行うペプチドを得ること、得られたペプチドを標識化合物を用いて放射性標識すること、及び放射性標識したペプチドの保護基を脱保護することを含む標識方法；
[１３] 放射性標識されたペプチドを製造する方法であって、前記ペプチドは、放射性標識可能な官能基を側鎖に有するアミノ酸を複数個有し、前記方法は、Ｎ末端のα−アミノ基及び側鎖の官能基が保護基によって保護された保護アミノ酸を用いて放射性標識するペプチドを合成すること、合成したペプチドの放射性標識可能なアミノ酸の側鎖の官能基のうち放射性標識を行わない官能基の保護基を脱保護すること、脱保護したアミノ酸の側鎖の官能基を、脱保護前の保護基とは異なる保護基によって再度の保護を行うこと、前記再度の保護を行ったアミノ酸の側鎖の官能基以外の官能基の保護基を脱保護して放射性標識を行うペプチドを得ること、得られたペプチドを標識化合物を用いて放射性標識すること、及び放射性標識したペプチドの保護基を脱保護することを含む製造方法；
に関する。
[１] 膵島のイメージングに用いられる分子プローブであって、下記式(１)〜(１２)のいずれかで表されるポリペプチド、下記式(１)〜(１２)のポリペプチドから１〜数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換したポリペプチドであって、膵島に結合可能なポリペプチド、又は、下記式(１)〜(１２)のポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するポリペプチドであって、膵島に結合可能なポリペプチドを含む膵島イメージング用分子プローブ、
Z-DLSXQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (1) （配列番号１）
Z-LSXQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (2) （配列番号２）
Z-SXQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (3) （配列番号３）
Z-XQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (4) （配列番号４）
Z-DLSKQMEEEAVRLFIEWLXNGGPSSGAPPPS-NH2 (5) （配列番号５）
Z-LSKQMEEEAVRLFIEWLXNGGPSSGAPPPS-NH2 (6) （配列番号６）
Z-SKQMEEEAVRLFIEWLXNGGPSSGAPPPS-NH2 (7) （配列番号７）
Z-KQMEEEAVRLFIEWLXNGGPSSGAPPPS-NH2 (8) （配列番号８）
B-DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (9) （配列番号９）
B-LSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (10) （配列番号１０）
B-SKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (11) （配列番号１１）
B-KQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (12) （配列番号１２）
［上記式(１)〜(８)において、「Z-」はＮ末端のα−アミノ基が非修飾であるか又は電荷を有さない修飾基により修飾されていることを示し、「X」は側鎖のアミノ基が下記式（I）で表される芳香環を含む基によって標識されたリジン残基を示し、上記式(９)〜(１２)において、「B-」はＮ末端のα−アミノ基が下記式（I）で表される芳香環を含む基によって標識されていることを示し、上記式(１)〜(１２)において、「-NH2」はＣ末端のカルボキシル基がアミド化されていることを示す。］
[２] 前記芳香環を含む基は、下記式（II）で表される基である[１]記載の膵島イメージング用プローブ、
[３] 膵島のイメージングを行うためのキットであって、[１]又は[２]に記載の膵島イメージング用分子プローブを含むキット；
[４] 前記膵島イメージング用分子プローブを注射液の形態で含有する[３]記載のキット；
[５] 膵島のイメージングを行うための試薬であって、[１]又は[２]に記載の膵島イメージング用分子プローブを含む、膵島イメージング用試薬；
[６] 膵島のイメージング方法であって、[１]又は[２]に記載の膵島イメージング用分子プローブを投与された被検体から前記膵島イメージング用分子プローブのシグナルを検出することを含む膵島のイメージング方法；
[７] さらに、前記膵島イメージング用分子プローブを用いた膵島イメージングの結果から膵島の状態を判定することを含む[６]記載の膵島のイメージング方法；
[８] [１]又は[２]に記載の膵島イメージング用分子プローブを投与された被検体から前記膵島イメージング用分子プローブのシグナルを検出すること、及び、検出した膵島イメージング用分子プローブのシグナルから膵島量を算出することを含む膵島量の測定方法；
[９] さらに、算出した膵島量を提示することを含む[８]記載の膵島量の測定方法;
[１０] [１]又は[２]に記載の膵島イメージング用分子プローブの製造方法であって、膵島イメージング用分子プローブ前駆体を標識化及び脱保護することを含み、前記膵島イメージング用分子プローブ前駆体が、下記式(１３)〜(２４)のいずれかで表されるポリペプチド、下記式(１３)〜(２４)のポリペプチドから１〜数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換したポリペプチドであって標識化及び脱保護後に膵島に結合可能なポリペプチド、又は、下記式(１３)〜(２４)のポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するポリペプチドであって標識化及び脱保護後に膵島に結合可能なポリペプチドを含む膵島イメージング用分子プローブ前駆体である、膵島イメージング用分子プローブの製造方法、
*-DLSKQMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (13) （配列番号１３）
*-LSKQMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (14) （配列番号１４）
*-SKQMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (15) （配列番号１５）
*-KQMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (16) （配列番号１６）
*-DLSK* QMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (17) （配列番号１７）
*-LSK* QMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (18) （配列番号１８）
*-SK* QMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (19) （配列番号１９）
*-K* QMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (20) （配列番号２０）
DLSK* QMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (21) （配列番号２１）
LSK* QMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (22) （配列番号２２）
SK* QMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (23) （配列番号２３）
K* QMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (24) （配列番号２４）
［上記式(１３)〜(２０)において、「*-」はＮ末端のα−アミノ基が保護基により保護されているか又は電荷を有さない修飾基により修飾されていることを示し、上記式(１３)〜(２４)において、「K*」はリジンの側鎖のアミノ基が保護基により保護されていることを示し、「-NH2」はＣ末端のカルボキシル基がアミド化されていることを示す。］；
[１１] 前記膵島イメージング用分子プローブ前駆体の標識化が、下記式（I）で表される芳香環を含む基を有する標識化合物により標識化することを含む、[１０]記載の膵島イメージング用分子プローブの製造方法、
[１２] 放射性標識可能な官能基を側鎖に有するアミノ酸を複数個有するペプチドを放射性標識する方法であって、Ｎ末端のα−アミノ基及び側鎖の官能基が保護基によって保護された保護アミノ酸を用いてペプチドの合成を行うこと、合成したペプチドの放射性標識可能なアミノ酸の側鎖の官能基のうち放射性標識を行わない官能基の保護基を脱保護すること、脱保護したアミノ酸の側鎖の官能基を、脱保護前の保護基とは異なる保護基によって再度の保護を行うこと、前記再度の保護を行ったアミノ酸の側鎖の官能基以外の官能基の保護基を脱保護して放射性標識を行うペプチドを得ること、得られたペプチドを標識化合物を用いて放射性標識すること、及び放射性標識したペプチドの保護基を脱保護することを含む標識方法；
[１３] 放射性標識されたペプチドを製造する方法であって、前記ペプチドは、放射性標識可能な官能基を側鎖に有するアミノ酸を複数個有し、前記方法は、Ｎ末端のα−アミノ基及び側鎖の官能基が保護基によって保護された保護アミノ酸を用いて放射性標識するペプチドを合成すること、合成したペプチドの放射性標識可能なアミノ酸の側鎖の官能基のうち放射性標識を行わない官能基の保護基を脱保護すること、脱保護したアミノ酸の側鎖の官能基を、脱保護前の保護基とは異なる保護基によって再度の保護を行うこと、前記再度の保護を行ったアミノ酸の側鎖の官能基以外の官能基の保護基を脱保護して放射性標識を行うペプチドを得ること、得られたペプチドを標識化合物を用いて放射性標識すること、及び放射性標識したペプチドの保護基を脱保護することを含む製造方法；
に関する。
［膵島イメージング］
本明細書において「膵島イメージング」とは、膵島の分子イメージング（molecular imaging）であって、in vivoの膵島の空間的及び／又は時間的分布を画像化することを含む。また、本発明において、膵島イメージングは、糖尿病に関する予防・治療・診断の観点から、膵β細胞を標的分子とすることが好ましく、より好ましくは膵島のＧＬＰ−１受容体を標的分子とすることである。さらに、本発明において、膵島イメージングは、膵島量の定量性及びヒトに適用するという観点から、非侵襲での三次元のイメージングであることが好ましい。イメージングの方法としては、非侵襲の膵島イメージングが可能な方法であれば特に制限されず、例えば、ポジトロン放射断層撮影法（ＰＥＴ）、シングルフォトン放射線コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）などを利用する方法が挙げられる。これらの中でも、本発明の分子プローブを利用し、膵島量の定量を行う観点からはＰＥＴ及びＳＰＥＣＴが好ましい。
本明細書において「膵島イメージング」とは、膵島の分子イメージング（molecular imaging）であって、in vivoの膵島の空間的及び／又は時間的分布を画像化することを含む。また、本発明において、膵島イメージングは、糖尿病に関する予防・治療・診断の観点から、膵β細胞を標的分子とすることが好ましく、より好ましくは膵島のＧＬＰ−１受容体を標的分子とすることである。さらに、本発明において、膵島イメージングは、膵島量の定量性及びヒトに適用するという観点から、非侵襲での三次元のイメージングであることが好ましい。イメージングの方法としては、非侵襲の膵島イメージングが可能な方法であれば特に制限されず、例えば、ポジトロン放射断層撮影法（ＰＥＴ）、シングルフォトン放射線コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）などを利用する方法が挙げられる。これらの中でも、本発明の分子プローブを利用し、膵島量の定量を行う観点からはＰＥＴ及びＳＰＥＣＴが好ましい。
［本発明のイメージング用分子プローブ］
本発明のイメージング用分子プローブは、膵島イメージングに用いるポリペプチドであって、上記式(１)〜(１２)のいずれかで表されるポリペプチドを含む膵島イメージング用分子プローブであり、好ましくは、上記式(１)〜(１２)のいずれかで表されるポリペプチド、上記式(１)〜(１２)のポリペプチドから１〜数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換したポリペプチドであって膵島に結合可能なポリペプチド、又は、上記式(１)〜(１２)のポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するポリペプチドであって膵島に結合可能なポリペプチドからなる膵島イメージング用分子プローブである。
本発明のイメージング用分子プローブは、膵島イメージングに用いるポリペプチドであって、上記式(１)〜(１２)のいずれかで表されるポリペプチドを含む膵島イメージング用分子プローブであり、好ましくは、上記式(１)〜(１２)のいずれかで表されるポリペプチド、上記式(１)〜(１２)のポリペプチドから１〜数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換したポリペプチドであって膵島に結合可能なポリペプチド、又は、上記式(１)〜(１２)のポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するポリペプチドであって膵島に結合可能なポリペプチドからなる膵島イメージング用分子プローブである。
上記式(１)〜(１２)のポリペプチドのアミノ酸配列は、それぞれ、配列表の配列番号１〜１２に記載のアミノ酸配列である。上記式(１)のポリペプチドの第４番目のリジンの側鎖のアミノ基、上記式(２)のポリペプチドの第３番目のリジンの側鎖のアミノ基、上記式(３)のポリペプチドの第２番目のリジンの側鎖のアミノ基、及び上記式(４)のポリペプチドの第１番目のリジンの側鎖のアミノ基は、上記式（I）で表される芳香環を含む基で標識されている。上記式(５)のポリペプチドの第１９番目のリジンの側鎖のアミノ基、上記式(６)のポリペプチドの第１８番目のリジンの側鎖のアミノ基、上記式(７)のポリペプチドの第１７番目のリジンの側鎖のアミノ基、及び上記式(８)のポリペプチドの第１６番目のリジンの側鎖のアミノ基は、上記式（I）で表される芳香環を含む基で標識されている。上記式(９)〜(１２)のポリペプチドのＮ末端のα−アミノ基は、上記式（I）で表される芳香環を含む基で標識されている。また、上記式(１)〜(８)のポリペプチドのＮ末端のα−アミノ基は、非修飾であるか又は電荷を有さない修飾基により修飾されている。上記式(１)〜(１２)のポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基は、膵β細胞との結合性の向上の観点から、アミノ基によりアミド化されている。
ここで、上記式(１)（配列表の配列番号１）及び上記式(５)（配列表の配列番号５）のアミノ酸配列は、リジンの側鎖のアミノ基に結合する上記式（I）で表される芳香環を含む基及びＮ末端のα−アミノ基に結合しうる修飾基を除けば、エキセンジン（９−３９）のアミノ酸配列と一致する。また、上記式(９)（配列表の配列番号９）のアミノ酸配列は、Ｎ末端のα−アミノ基に結合する上記式（I）で表される芳香環を含む基を除けば、エキセンジン（９−３９）のアミノ酸配列と一致する。エキセンジン（９−３９）は、膵β細胞上に発現するＧＬＰ−１Ｒ（グルカゴン様ペプチド−１の受容体）に結合することが知られている。このため、本発明のイメージング用分子プローブも、膵島、好ましくは膵β細胞に結合可能である。
本明細書において「膵島に結合可能」とは、膵島量の定量性及び検査・診断の用途の観点から、本発明のイメージング用分子プローブが膵β細胞に結合可能であることが好ましく、少なくとも膵臓において膵β細胞に特異的であることがより好ましく、少なくともヒトに対する非侵襲的なイメージングにおけるシグナル検出において他の器官・組織とシグナルが重ならない程度に特異的であることがさらに好ましい。
本発明のイメージング用分子プローブは、その他の実施形態として、膵島イメージングに用いるポリペプチドであって、上記式(１)〜(１２)のポリペプチドから１〜数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換したポリペプチドであって、膵島に結合可能なポリペプチドを含み得る。ここで、前記１〜数個とは、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、及び１個を含みうる。この実施形態の本発明のイメージング用分子プローブにおいて、上記式(１)〜(８)のポリペプチドから１〜数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換したポリペプチドである場合は、上記式（I）で表される芳香環を含む基で標識化されるリジンを１つ含み、かつ、Ｃ末端のカルボキシル基のアミド化を含むことが好ましい。また、Ｎ末端のα−アミノ基が、非修飾であってもよいし、電荷を有さない修飾基により修飾されていてもよい。上記式(９)〜(１２)のポリペプチドから１〜数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換したポリペプチドである場合は、Ｎ末端のα−アミノ基が上記式（I）で表される芳香環を含む基で標識化され、かつ、その他の標識基を含まないことが好ましい。また、Ｃ末端のカルボキシル基のアミド化を含むことが好ましい。上記式(１)〜(１２)のポリペプチドから１〜数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換したポリペプチドは、上記式(１)〜(１２)のポリペプチドと同様の作用効果を有することが好ましく、より好ましくは上記式(１)のポリペプチド又は上記式(９)のポリペプチドと同様の作用効果を有することである。
また、本発明のイメージング用分子プローブは、さらにその他の実施形態として、膵島イメージングに用いるポリペプチドであって、上記式(１)〜(１２)のポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するポリペプチドであって、膵島に結合可能なポリペプチドを含み得る。ここで、前記相同性とは、当業者が通常用いるアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどで算出されるものでよく、あるいは、比較する２つのポリペプチドの同一アミノ酸残基の数を一方のポリペプチド全長で除して得られる数に基づいてもよい。前記相同性は、８５％以上、９０％以上、９５％以上を含みうる。この実施形態の本発明のイメージング用分子プローブにおいても、上記式(１)〜(８)のポリペプチドと８０％以上の相同性を有するポリペプチドである場合は、上記式（I）で表される芳香環を含む基で標識化されるリジンを１つ含み、かつ、Ｃ末端のカルボキシル基のアミド化を含むことが好ましい。また、Ｎ末端のα−アミノ基は、非修飾であってもよいし、電荷を有さない修飾基により修飾されていてもよい。上記式(９)〜(１２)のポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するポリペプチドである場合は、Ｎ末端のα−アミノ基が上記式（I）で表される芳香環を含む基で標識化され、かつ、その他の標識基を含まないことが好ましい。また、Ｃ末端のカルボキシル基のアミド化を含むことが好ましい。上記式(１)〜(１２)のポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するポリペプチドは、上記式(１)〜(１２)のポリペプチドと同様の作用効果を有することが好ましく、より好ましくは上記式(１)のポリペプチド又は上記式(９)のポリペプチドと同様の作用効果を有することである。
本発明のイメージング用分子プローブは、上記のとおり、膵島イメージングに用いられるものであって、ヒトの検査・診断の用途の観点から非侵襲性の膵島イメージングに用いられることが好ましく、より好ましくは非侵襲性の膵β細胞イメージングに用いられることであり、さらに好ましくは膵β細胞のＧＬＰ−１受容体イメージングに用いられることである。また、本発明のイメージング用分子プローブは、同様の観点から膵島量を定量するための膵島イメージングに用いられることが好ましく、より好ましくは膵島量を定量するための膵β細胞イメージングに用いられることであり、さらに好ましくは膵島量を定量するための膵β細胞のＧＬＰ−１受容体イメージングに用いられることである。さらに、本発明のイメージング用分子プローブは、糖尿病の予防、治療又は診断のための膵島イメージングに用いられることが好ましい。これらの膵島イメージングは、例えば、ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴにより行われてもよい。
［リジン残基の側鎖のアミノ基又はＮ末端のα−アミノ基を標識する基］
本発明のイメージング用分子プローブにおいて、上記式(１)〜(８)のポリペプチドのアミノ酸配列においてＸで表されるリジン残基の側鎖のアミノ基、及び上記(９)〜(１２)のポリペプチドにおけるＮ末端のα−アミノ基は、下記式（I）で表される芳香環を含む基によって標識されている。
本発明のイメージング用分子プローブにおいて、上記式(１)〜(８)のポリペプチドのアミノ酸配列においてＸで表されるリジン残基の側鎖のアミノ基、及び上記(９)〜(１２)のポリペプチドにおけるＮ末端のα−アミノ基は、下記式（I）で表される芳香環を含む基によって標識されている。
上記式（I）において、Ａは、芳香族炭化水素基及び芳香族複素環基のいずれかを示す。芳香族炭化水素基は、炭素数６〜１８の芳香族炭化水素基が好ましく、例えば、フェニル基、ｏ−トリル基、ｍ−トリル基、ｐ−トリル基、２，４−キシリル基、ｐ−クメニル基、メシチル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、１−アンスリル基、２−アンスリル基、９−アンスリル基、１−フェナンスリル基、９−フェナンスリル基、１−アセナフチル基、２−アズレニル基、１−ピレニル基、２−トリフェニレニル基、ｏ−ビフェニリル基、ｍ−ビフェニリル基、ｐ−ビフェニリル基、ターフェニル基等が挙げられる。芳香族複素環基は、窒素原子、酸素原子又は硫黄原子を１又は２個有し、かつ、５〜１０員の複素環基が好ましく、例えば、トリアゾリル基、３−オキサジアゾリル基、２−フリル基、３−フリル基、２−チエニル基、３−チエニル基、１−ピローリル基、２−ピローリル基、３−ピローリル基、２−ピリジル基、３−ピリジル基、４−ピリジル基、２−ピラジル基、２−オキサゾリル基、３−イソオキサゾリル基、２−チアゾリル基、３−イソチアゾリル基、２−イミダゾリル基、３−ピラゾリル基、２−キノリル基、３−キノリル基、４−キノリル基、５−キノリル基、６−キノリル基、７−キノリル基、８−キノリル基、１−イソキノリル基、２−キノキサリニル基、２−ベンゾフリル基、２−ベンゾチエニル基、Ｎ−インドリル基、Ｎ−カルバゾリル基等が挙げられる。これらの中でも、Ａは、フェニル基、トリアゾリル基、ピリジル基が好ましく、フェニル基がより好ましい。
上記式（I）において、Ｒ１は、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ及び１３１Ｉのいずれかを含む置換基を示す。Ｒ１としては、例えば、［123I］ヨウ素原子、［124I］ヨウ素原子、［125I］ヨウ素原子、［131I］ヨウ素原子、［123I］ヨウ素で置換されたＣ１−Ｃ３アルキル基、［124I］ヨウ素で置換されたＣ１−Ｃ３アルキル基、［125I］ヨウ素で置換されたＣ１−Ｃ３アルキル基、［131I］ヨウ素で置換されたＣ１−Ｃ３アルキル基、［123I］ヨウ素で置換されたＣ１−Ｃ３アルコキシ基、［124I］ヨウ素で置換されたＣ１−Ｃ３アルコキシ基、［125I］ヨウ素で置換されたＣ１−Ｃ３アルコキシ基、及び［131I］ヨウ素で置換されたＣ１−Ｃ３アルコキシ基等が挙げられる。本明細書において「Ｃ１−Ｃ３アルキル基」とは、１〜３個の炭素原子を有するアルキル基のことをいい、メチル基、エチル基、プロピル基等が挙げられる。本明細書において「［123I］ヨウ素、［124I］ヨウ素、［125I］ヨウ素又は［131I］ヨウ素で置換されたＣ１−Ｃ３アルキル基」とは、１〜３個の炭素原子を有し、かつ、１個の水素原子が［123I］ヨウ素原子、［124I］ヨウ素原子、［125I］ヨウ素原子又は［131I］ヨウ素原子によって置換されたアルキル基のことをいう。本明細書において「Ｃ１−Ｃ３アルコキシ基」とは、１〜３個の炭素原子を有するアルコキシ基のことをいい、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等が挙げられる。本明細書において「［123I］ヨウ素、［124I］ヨウ素、［125I］ヨウ素又は［131I］ヨウ素で置換されたＣ１−Ｃ３アルコキシ基」とは、１〜３個の炭素原子を有し、かつ、１個の水素原子が［123I］ヨウ素原子、［124I］ヨウ素原子、［125I］ヨウ素原子又は［131I］ヨウ素原子によって置換されたアルコキシ基のことをいう。Ｒ１は、ＰＥＴを行う観点からは、ポジトロンを放出する１２４Ｉを含む置換基が好ましい。また、ＳＰＥＣＴを行う観点からは、Ｒ１は、γ線を放出する１２３Ｉ又は１２５Ｉを含む置換基が好ましく、放出するエネルギー量の点からは、１２３Iを含む置換基がより好ましい。Ｒ１は、［123I］ヨウ素原子、［124I］ヨウ素原子、［123I］ヨウ化メチル基、［124I］ヨウ化メチル基、［123I］ヨウ化メトキシ基及び［124I］ヨウ化メトキシ基が好ましく、より好ましくは［123I］ヨウ素原子及び［124I］ヨウ素原子である。上記式（I）において、Ｒ１は、定量性の観点からは、オルト位、メタ位、パラ位のいずれかで置換されていることが好ましく、より好ましくはメタ位又はパラ位のいずれかである。
上記式（I）において、Ｒ２は、水素原子若しくはＲ１とは異なる１又は複数の置換基を示す。Ｒ２は、水素原子であっても、置換基であってもよいが、水素原子であることが好ましい。つまり、上記式（I）において、Ａは、Ｒ１以外の置換基で置換されていないことが好ましい。Ｒ２が複数の置換基である場合、それらは、同一であっても良いし、異なっていてもよい。置換基としては、例えば、水酸基、電子求引性基、電子供与性基、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ２−Ｃ６アルケニル基、Ｃ２−Ｃ６アルキニル基等が挙げられる。電子求引性基としては、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン原子、カルボニル基、スルホニル基、アセチル基、フェニル基等が挙げられる。ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。本明細書において「Ｃ１−Ｃ６アルキル基」とは、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基のことをいい、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基が挙げられる。本明細書において「Ｃ２−Ｃ６アルケニル基」とは、２〜６個の炭素原子を有するアルケニル基のことをいい、例えば、ビニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、イソプロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、３−ブテニル基が挙げられる。本明細書において「Ｃ２−Ｃ６アルキニル基」とは、２〜６個の炭素原子を有するアルキニル基のことをいい、例えば、エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基、１−ブチニル基、２−ブチニル基、３−ブチニル基が挙げられる。これらの中でも、置換基は、水酸基及び電子求引性基が好ましい。
上記式（I）において、Ｒ３は、結合手、メチレン基及びオキシメチレン基のいずれかを示し、中でも結合手及びメチレン基が好ましく、より好ましくは結合手である。
本発明のイメージング用分子プローブにおいて、上記式（I）で表される芳香環を含む基は、下記式（II）で表される基が好ましい。下記式（II）において、Ｒ１は上記のとおりである。
［修飾基］
本発明のイメージング用分子プローブにおいて、上記式(１)〜(８)のポリペプチドにおけるＮ末端のα−アミノ基は、Ｎ末端のα−アミノ基の正電荷を打ち消して、本発明のイメージング用分子プローブの腎臓への集積を抑制する点から、電荷を有さない修飾基で修飾されていてもよい。電荷を有さない修飾基としては、例えば、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ-ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、２，２，２-トリクロロエトキシカルボニル基（Ｔｒｏｃ）、アリルオキシカルボニル基（Ａｌｌｏｃ）、４−メトキシトリチル基（Ｍｍｔ）、アミノ基、３から２０個の炭素原子を有するアルキル基、９−フルオレンアセチル基、１−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレノン−１−カルボン酸基、ベンジルオキシカルボニル基、キサンチル基（Ｘａｎ）、トリチル基（Ｔｒｔ）、４−メチルトリチル基（Ｍｔｔ）、４−メトキシ２，３，６−トリメチル−ベンゼンスルホニル基（Ｍｔｒ）、メシチレン−２−スルホニル基（Ｍｔｓ）、４，４−ジメトキシベンゾヒドリル基（Ｍｂｈ）、トシル基（Ｔｏｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル基（Ｐｍｃ）、４−メチルベンジル基（ＭｅＢｚｌ）、４−メトキシベンジル基（ＭｅＯＢｚｌ）、ベンジルオキシ基（ＢｚｌＯ）、ベンジル基（Ｂｚｌ）、ベンゾイル基（Ｂｚ）、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル基（Ｎｐｙｓ）、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジアキソシクロヘキシリデン）エチル基（Ｄｄｅ）、２，６−ジクロロベンジル基（２，６−ＤｉＣｌ−Ｂｚｌ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル基（２−Ｃｌ−Ｚ）、２−ブロモベンジルオキシカルボニル基（２−Ｂｒ−Ｚ）、ベンジルオキシメチル基（Ｂｏｍ）、シクロヘキシルオキシ基（ｃＨｘＯ）、ｔ−ブトキシメチル基（Ｂｕｍ）、ｔ−ブトキシ基（ｔＢｕＯ）、ｔ−ブチル基（ｔＢｕ）、アセチル基（Ａｃ）、トリフルオロアセチル基（ＴＦＡ）ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、２−クロロベンジル（Ｃｌ−ｚ）基、シクロヘキシル基、シクロペンチル基、イソプロピル基、ピバリル基、テトラヒドロピラン−２−イル基、トリメチルシリル基等が挙げられる。中でも、修飾基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシメチル基、ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブチル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、２−クロロベンジル基、２，６−ジクロロベンジル基、シクロヘキシル基、シクロペンチル基、イソプロピル基、ピバリル基、テトラヒドロピラン−２−イル基、トシル基、トリメチルシリル基及びトリチル基が好ましく、より好ましくはアセチル基である。
本発明のイメージング用分子プローブにおいて、上記式(１)〜(８)のポリペプチドにおけるＮ末端のα−アミノ基は、Ｎ末端のα−アミノ基の正電荷を打ち消して、本発明のイメージング用分子プローブの腎臓への集積を抑制する点から、電荷を有さない修飾基で修飾されていてもよい。電荷を有さない修飾基としては、例えば、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ-ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、２，２，２-トリクロロエトキシカルボニル基（Ｔｒｏｃ）、アリルオキシカルボニル基（Ａｌｌｏｃ）、４−メトキシトリチル基（Ｍｍｔ）、アミノ基、３から２０個の炭素原子を有するアルキル基、９−フルオレンアセチル基、１−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレノン−１−カルボン酸基、ベンジルオキシカルボニル基、キサンチル基（Ｘａｎ）、トリチル基（Ｔｒｔ）、４−メチルトリチル基（Ｍｔｔ）、４−メトキシ２，３，６−トリメチル−ベンゼンスルホニル基（Ｍｔｒ）、メシチレン−２−スルホニル基（Ｍｔｓ）、４，４−ジメトキシベンゾヒドリル基（Ｍｂｈ）、トシル基（Ｔｏｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル基（Ｐｍｃ）、４−メチルベンジル基（ＭｅＢｚｌ）、４−メトキシベンジル基（ＭｅＯＢｚｌ）、ベンジルオキシ基（ＢｚｌＯ）、ベンジル基（Ｂｚｌ）、ベンゾイル基（Ｂｚ）、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル基（Ｎｐｙｓ）、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジアキソシクロヘキシリデン）エチル基（Ｄｄｅ）、２，６−ジクロロベンジル基（２，６−ＤｉＣｌ−Ｂｚｌ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル基（２−Ｃｌ−Ｚ）、２−ブロモベンジルオキシカルボニル基（２−Ｂｒ−Ｚ）、ベンジルオキシメチル基（Ｂｏｍ）、シクロヘキシルオキシ基（ｃＨｘＯ）、ｔ−ブトキシメチル基（Ｂｕｍ）、ｔ−ブトキシ基（ｔＢｕＯ）、ｔ−ブチル基（ｔＢｕ）、アセチル基（Ａｃ）、トリフルオロアセチル基（ＴＦＡ）ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、２−クロロベンジル（Ｃｌ−ｚ）基、シクロヘキシル基、シクロペンチル基、イソプロピル基、ピバリル基、テトラヒドロピラン−２−イル基、トリメチルシリル基等が挙げられる。中でも、修飾基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシメチル基、ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブチル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、２−クロロベンジル基、２，６−ジクロロベンジル基、シクロヘキシル基、シクロペンチル基、イソプロピル基、ピバリル基、テトラヒドロピラン−２−イル基、トシル基、トリメチルシリル基及びトリチル基が好ましく、より好ましくはアセチル基である。
［イメージング方法］
本発明は、その他の態様として、本発明のイメージング用分子プローブを用いて膵島をイメージングすることを含む膵島のイメージング方法に関する。また、本発明は、さらにその他の態様として、予め被検体に投与された本発明のイメージング用分子プローブのシグナル又は予め膵島に結合させた本発明のイメージング用分子プローブのシグナルを検出することを含む膵島のイメージング方法に関する。イメージング方法において、イメージングするために十分な量の本発明の分子プローブを投与された被検体から本発明の分子プローブのシグナル、又は、イメージングするために十分な量を予め膵島に結合させた本発明のイメージング用分子プローブのシグナルを検出することが好ましい。膵島イメージングについては上記のとおりである。本発明のイメージング方法は、検査・診断の用途の観点から、膵β細胞のイメージング方法であることが好ましい。
本発明は、その他の態様として、本発明のイメージング用分子プローブを用いて膵島をイメージングすることを含む膵島のイメージング方法に関する。また、本発明は、さらにその他の態様として、予め被検体に投与された本発明のイメージング用分子プローブのシグナル又は予め膵島に結合させた本発明のイメージング用分子プローブのシグナルを検出することを含む膵島のイメージング方法に関する。イメージング方法において、イメージングするために十分な量の本発明の分子プローブを投与された被検体から本発明の分子プローブのシグナル、又は、イメージングするために十分な量を予め膵島に結合させた本発明のイメージング用分子プローブのシグナルを検出することが好ましい。膵島イメージングについては上記のとおりである。本発明のイメージング方法は、検査・診断の用途の観点から、膵β細胞のイメージング方法であることが好ましい。
本発明のイメージング用分子プローブのシグナルの検出は、例えば、ＰＥＴを用いた測定及び／又はＳＰＥＣＴを用いた測定等により行うことができる。ＰＥＴを用いた測定及びＳＰＥＣＴを用いた測定には、例えば、イメージの撮影、膵島量の測定等を含む。本発明のイメージング方法において、検出されたシグナルを再構成処理して画像データに変換し表示する工程を含んでいてもよい。
ＳＰＥＣＴを用いた測定は、例えば、本発明のイメージング用分子プローブを予め膵島に結合させた対象／本発明のイメージング用分子プローブが予め投与された被検体から放出されるγ線をガンマカメラにより測定することを含む。ガンマカメラによる測定は、例えば、本発明のイメージング用分子プローブの標識に使用した上記放射性ヨウ素から放出される放射線（γ線）を一定時間単位で測定することを含み、好ましくは放射線が放出される方向及び放射線数量を一定時間単位で測定することを含む。本発明のイメージング方法は、さらに、放射線の測定により得られた測定された本発明のイメージング用分子プローブの分布を断面画像として表すこと、及び、得られた断面画像を再構成することを含んでいてもよい。対象（被検体）としては、ヒト及び又はヒト以外の哺乳類が挙げられる。
ＰＥＴを用いた測定は、例えば、本発明のイメージング用分子プローブを予め膵島に結合させた対象／本発明のイメージング用分子プローブが予め投与された被検体から、ポジトロンと電子との結合により生成する１対の消滅放射線をＰＥＴ用検出器で同時計数することを含み、さらに、計測した結果に基づきポジトロンを放出する放射性ヨウ素の位置の三次元分布を描写することを含んでいてもよい。
本発明のイメージング方法において、ＳＰＥＣＴの測定又はＰＥＴの測定とあわせて、Ｘ線ＣＴやＭＲＩの測定を行ってもよい。これにより、例えば、ＳＰＥＣＴにより得られた画像又はＰＥＴにより得られた画像（機能画像）と、ＣＴにより得られた画像又はＭＲＩにより得られた画像（形態画像）とを融合させた融合画像を得ることができる。
本発明のイメージング方法は、さらに、本発明のイメージング用分子プローブを用いた膵島イメージングの結果から膵島の状態を判定することを含んでもよい。分子プローブを用いた膵島イメージングの結果から膵島の状態を判定することは、例えば、膵島イメージングの画像を解析することにより膵島の有無を判断すること、膵島量の増減を判断すること等を含む。
本発明のイメージング方法は、本発明のイメージング用分子プローブを対象に投与することを含んでいてもよく、画像化のために所望のコントラストを得るために十分な量の本発明のイメージング用分子プローブを投与することが好ましい。本発明のイメージング用分子プローブのシグナル検出は、分子プローブの投与から一定時間経過後行うことが好ましい。投与対象としては、ヒト及び又はヒト以外の哺乳類が挙げられる。対象への投与は、局所的であってもよく、全身的であってもよい。投与経路は、対象の状態等に応じて適宜決定できるが、例えば、静脈、動脈、皮内、腹腔内への注射又は輸液等が挙げられる。本発明のイメージング用分子プローブは、担体とともに投与することが好ましい。担体としては、例えば、水性溶媒及び非水性溶媒が使用できる。水性溶媒としては、例えば、リン酸カリウム緩衝液、生理食塩水、リンゲル液、蒸留水等が挙げられる。非水性溶媒としては、例えば、ポリエチレングリコール、植物性油脂、エタノール、グリセリン、ジメチルスルホキサイド、プロピレングリコール等が挙げられる。膵島のイメージング又は膵島量の測定のための本発明のイメージング用分子プローブの用量は、例えば、１μｇ以下とすることができる。投与から測定までの時間は、例えば、分子プローブの膵島への結合時間、分子プローブの種類及び分子プローブの分解時間等に応じて適宜決定できる。
［膵島量の測定方法］
本発明は、さらにその他の態様として、膵島量の測定方法であって、予め膵島に結合させた本発明のイメージング用分子プローブのシグナルを検出すること、及び、検出した分子プローブのシグナルから膵島量を算出することを含む膵島量の測定方法に関する。本発明の膵島量の測定方法は、本発明のイメージング用分子プローブを用いて膵島イメージングを行うことを含んでもよい。膵島イメージングは上記のとおりである。分子プローブを用いた膵島イメージングの結果からの膵島量の算出は、例えば、膵島イメージングの画像を解析すること等により行うことができる。また、イメージングの結果からイメージングの対象物の定量を行うことは、当業者であれば、例えば、検量線や適当なプログラムを用いて容易に行うことができる。本発明の膵島量の測定方法は、検査・診断の用途の観点から、膵β細胞量の測定方法であることが好ましい。
本発明は、さらにその他の態様として、膵島量の測定方法であって、予め膵島に結合させた本発明のイメージング用分子プローブのシグナルを検出すること、及び、検出した分子プローブのシグナルから膵島量を算出することを含む膵島量の測定方法に関する。本発明の膵島量の測定方法は、本発明のイメージング用分子プローブを用いて膵島イメージングを行うことを含んでもよい。膵島イメージングは上記のとおりである。分子プローブを用いた膵島イメージングの結果からの膵島量の算出は、例えば、膵島イメージングの画像を解析すること等により行うことができる。また、イメージングの結果からイメージングの対象物の定量を行うことは、当業者であれば、例えば、検量線や適当なプログラムを用いて容易に行うことができる。本発明の膵島量の測定方法は、検査・診断の用途の観点から、膵β細胞量の測定方法であることが好ましい。
本発明は、さらにその他の態様として、膵島量の測定方法であって、予め被検体に投与された本発明のイメージング用分子プローブのシグナル及び又は予め膵島に結合させた本発明のイメージング用分子プローブのシグナルを検出すること、及び、検出したイメージング用分子プローブのシグナルから膵島量を算出することを含む膵島量の測定方法に関する。
本発明の膵島量の測定方法は、さらに、算出した膵島量を提示することを含んでいてもよい。算出した膵島量を提示することは、例えば、算出した膵島量を保存又は外部に出力することを含む。外部に出力することは、例えば、モニタに表示すること、及び、印字すること等を含む。
［糖尿病の予防、治療、診断方法］
本発明は、さらにその他の態様として、糖尿病の予防又は治療又は診断方法に関する。上述したとおり、糖尿病の発症過程では、膵島量（とりわけ、膵β細胞量）が耐糖能異常に先行して減少するが、機能異常が検出・自覚される段階に至ってからでは、糖尿病はすでに治療が難しい段階となっている。しかし、本発明のイメージング用分子プローブを用いたイメージング方法及び又は膵島量の測定方法によれば、膵島量及び又は膵β細胞量の減少を早期に発見することができ、ひいては、新たな糖尿病の予防・治療・診断法が構築できる。糖尿病の予防・治療・診断の対象としては、ヒト及び又はヒト以外の哺乳類が挙げられる。
本発明は、さらにその他の態様として、糖尿病の予防又は治療又は診断方法に関する。上述したとおり、糖尿病の発症過程では、膵島量（とりわけ、膵β細胞量）が耐糖能異常に先行して減少するが、機能異常が検出・自覚される段階に至ってからでは、糖尿病はすでに治療が難しい段階となっている。しかし、本発明のイメージング用分子プローブを用いたイメージング方法及び又は膵島量の測定方法によれば、膵島量及び又は膵β細胞量の減少を早期に発見することができ、ひいては、新たな糖尿病の予防・治療・診断法が構築できる。糖尿病の予防・治療・診断の対象としては、ヒト及び又はヒト以外の哺乳類が挙げられる。
本発明の糖尿病の診断方法は、本発明のイメージング用分子プローブを用いて膵島のイメージングを行うこと、及び、得られた膵島の画像及び又は膵島量に基づき膵島の状態を判定することを含み、さらに、判定結果に基づき糖尿病の診断を行うことを含んでいてもよい。膵島の状態の判定は、例えば、得られた膵島の画像と基準となる膵島の画像とを比較すること、得られた膵島量と基準となる膵島量とを比較すること等により、膵島量の増減又は変化を判定することを含む。また、膵島の状態の判定は、情報処理装置を用いて行ってもよく、膵島量が減少していると判定したときには、その情報を提示し、膵島量が増加又は維持されていると判定したときには、その情報を提示することが好ましい。判定結果に基づく糖尿病の診断は、例えば、糖尿病発症のリスクを判定すること、糖尿病と判断すること、糖尿病の進行度合いを判断することを含む。
本発明の糖尿病の治療方法は、本発明のイメージング用分子プローブを用いて膵島のイメージングを行うこと、及び、得られた膵島の画像及び又は膵島量に基づき膵島の状態を判定して糖尿病の診断を行うこと、前記診断に基づき糖尿病の治療することを含む。膵島の状態の判定及び糖尿病の診断は、本発明の糖尿病の診断方法と同様に行うことができる。本発明の糖尿病の治療方法は、対象に対して行われる投薬や食事療法を含む治療効果を膵島量の変化に着目して評価することを含むことができる。
本発明の糖尿病の予防方法は、本発明のイメージング用分子プローブを用いて膵島のイメージングを行うこと、及び、得られた膵島の画像及び又は膵島量に基づき膵島の状態を判定して糖尿病発症のリスクを判定することを含む。本発明の糖尿病の予防方法は、例えば、定期的に膵島量の測定を行い、膵島量の減少傾向の有無をチェックすることが含むことができる。
本発明は、好ましいその他の態様として、糖尿病の超早期診断方法に関する。本発明の糖尿病の超早期診断方法は、例えば、人間ドック、健康診断において本発明の方法により膵島のイメージング及び又は膵島量の測定を行うこと、及び、得られた膵島の画像及び又は膵島量に基づき膵島の状態を判定することを含むことができる。また、本発明の糖尿病の治療方法は、本発明の方法により膵島のイメージング及び又は膵島量の測定を行うこと、及び、得られた膵島の画像及び又は膵島量に基づき膵島の機能回復を評価することを含むことができる。
［本発明のキット］
本発明は、さらにその他の態様として、本発明のイメージング用分子プローブを含むキットに関する。本形態のキットの実施形態としては、本発明のイメージング方法を行うためのキット、本発明の膵島量の測定方法を行うためのキット、本発明の糖尿病の予防又は治療又は診断のキットなどが挙げられる。これらの各実施形態において、それぞれの形態に応じた取扱い説明書を含むことが好ましい。
本発明は、さらにその他の態様として、本発明のイメージング用分子プローブを含むキットに関する。本形態のキットの実施形態としては、本発明のイメージング方法を行うためのキット、本発明の膵島量の測定方法を行うためのキット、本発明の糖尿病の予防又は治療又は診断のキットなどが挙げられる。これらの各実施形態において、それぞれの形態に応じた取扱い説明書を含むことが好ましい。
本発明のキットにおいて、本発明のイメージング用分子プローブは、注射液の形態で含むことが好ましい。したがって、本発明のキットは、本発明のイメージング用分子プローブを含有する注射液を含むことが好ましい。注射液は、有効成分とする本発明のイメージング用分子プローブを含み、さらに、例えば、担体等の医薬品添加物を含んでいてもよい。本明細書において医薬品添加物は、日本薬局方、アメリカ薬局方、ヨーロッパ薬局方等で医薬品添加物として許認可を受けている化合物のことをいう。担体としては、例えば、水性溶媒及び非水性溶媒が挙げられる。水性溶媒としては、例えば、リン酸カリウム緩衝液、生理食塩水、リンゲル液、蒸留水等が挙げられる。非水性溶媒としては、例えば、ポリエチレングリコール、植物性油脂、エタノール、グリセリン、ジメチルスルホキサイド、プロピレングリコール等が挙げられる。また、本発明のキットは、本発明のイメージング用分子プローブを入れるための容器をさらに含んでいてもよく、本発明のイメージング用分子プローブ及び又は本発明のイメージング用分子プローブを含有する注射液が容器に充填されていてもよい。容器としては、例えば、シリンジやバイアル瓶等が挙げられる。
本発明のキットは、例えば、バッファー、浸透圧調整剤等の分子プローブを調製するための成分や、注射器等の分子プローブの投与に使用する器具等をさらに含むことができる。
［本発明のイメージング用試薬］
本発明は、さらにその他の態様として、本発明のイメージング用分子プローブを含むイメージング用試薬に関する。本発明のイメージング用試薬は、有効成分として本発明のイメージング用分子プローブを含み、さらに、例えば、例えば、担体等の医薬品添加物を含んでいてもよい。担体は、上述のとおりである。
本発明は、さらにその他の態様として、本発明のイメージング用分子プローブを含むイメージング用試薬に関する。本発明のイメージング用試薬は、有効成分として本発明のイメージング用分子プローブを含み、さらに、例えば、例えば、担体等の医薬品添加物を含んでいてもよい。担体は、上述のとおりである。
［本発明のイメージング用分子プローブの調製方法］
本発明のイメージング用分子プローブは、下記式(１３)〜(２４)のいずれかで表されるポリペプチドを含む分子プローブ前駆体を、上記式（I）で表される芳香環を含む基を有する標識化合物を用いて標識化を行い、その後、保護基の脱保護をすることで調製することができる。標識化することにより、保護基が結合していないリジンの側鎖のアミノ基、又は、保護基及び修飾基が結合していないＮ末端のα−アミノ基が標識化されうる。
*-DLSKQMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (13) （配列番号１３）
*-LSKQMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (14) （配列番号１４）
*-SKQMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (15) （配列番号１５）
*-KQMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (16) （配列番号１６）
*-DLSK* QMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (17) （配列番号１７）
*-LSK* QMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (18) （配列番号１８）
*-SK* QMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (19) （配列番号１９）
*-K* QMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (20) （配列番号２０）
DLSK* QMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (21) （配列番号２１）
LSK* QMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (22) （配列番号２２）
SK* QMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (23) （配列番号２３）
K* QMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (24) （配列番号２４）
［上記式(１３)〜(２０)において、「*-」は、Ｎ末端のα−アミノ基が保護基により保護されているか又は電荷を有さない修飾基により修飾されていることを示し、上記式(１３)〜(２４)において、「K*」は、リジンの側鎖のアミノ基が保護基により保護されていることを示し、「-NH2」は、Ｃ末端のカルボキシル基がアミド化されていることを示す。］
本発明のイメージング用分子プローブは、下記式(１３)〜(２４)のいずれかで表されるポリペプチドを含む分子プローブ前駆体を、上記式（I）で表される芳香環を含む基を有する標識化合物を用いて標識化を行い、その後、保護基の脱保護をすることで調製することができる。標識化することにより、保護基が結合していないリジンの側鎖のアミノ基、又は、保護基及び修飾基が結合していないＮ末端のα−アミノ基が標識化されうる。
*-DLSKQMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (13) （配列番号１３）
*-LSKQMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (14) （配列番号１４）
*-SKQMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (15) （配列番号１５）
*-KQMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (16) （配列番号１６）
*-DLSK* QMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (17) （配列番号１７）
*-LSK* QMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (18) （配列番号１８）
*-SK* QMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (19) （配列番号１９）
*-K* QMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (20) （配列番号２０）
DLSK* QMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (21) （配列番号２１）
LSK* QMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (22) （配列番号２２）
SK* QMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (23) （配列番号２３）
K* QMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (24) （配列番号２４）
［上記式(１３)〜(２０)において、「*-」は、Ｎ末端のα−アミノ基が保護基により保護されているか又は電荷を有さない修飾基により修飾されていることを示し、上記式(１３)〜(２４)において、「K*」は、リジンの側鎖のアミノ基が保護基により保護されていることを示し、「-NH2」は、Ｃ末端のカルボキシル基がアミド化されていることを示す。］
上記分子プローブ前駆体の合成は、例えば、Ｆｍｏｃ法等の定法に従ったペプチド合成により行うことができ、そのペプチド合成方法は特に制限されない。
［保護基］
保護基は、本発明のイメージング用分子プローブの特定のアミノ基を標識化する間に、分子プローブ前駆体のその他のアミノ基を保護するものであって、そのような機能を果たせる公知の保護基を使用できる。保護基としては、特に制限されず、例えば、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ-ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、２，２，２-トリクロロエトキシカルボニル基（Ｔｒｏｃ）、アリルオキシカルボニル基（Ａｌｌｏｃ）、４−メトキシトリチル基（Ｍｍｔ）、アミノ基、３から２０個の炭素原子を有するアルキル基、９−フルオレンアセチル基、１−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレノン−１−カルボン酸基、ベンジルオキシカルボニル基、キサンチル基（Ｘａｎ）、トリチル基（Ｔｒｔ）、４−メチルトリチル基（Ｍｔｔ）、４−メトキシ２，３，６−トリメチル−ベンゼンスルホニル基（Ｍｔｒ）、メシチレン−２−スルホニル基（Ｍｔｓ）、４，４−ジメトキシベンゾヒドリル基（Ｍｂｈ）、トシル基（Ｔｏｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル基（Ｐｍｃ）、４−メチルベンジル基（ＭｅＢｚｌ）、４−メトキシベンジル基（ＭｅＯＢｚｌ）、ベンジルオキシ基（ＢｚｌＯ）、ベンジル基（Ｂｚｌ）、ベンゾイル基（Ｂｚ）、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル基（Ｎｐｙｓ）、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジアキソシクロヘキシリデン）エチル基（Ｄｄｅ）、２，６−ジクロロベンジル基（２，６−ＤｉＣｌ−Ｂｚｌ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル基（２−Ｃｌ−Ｚ）、２−ブロモベンジルオキシカルボニル基（２−Ｂｒ−Ｚ）、ベンジルオキシメチル基（Ｂｏｍ）、シクロヘキシルオキシ基（ｃＨｘＯ）、ｔ−ブトキシメチル基（Ｂｕｍ）、ｔ−ブトキシ基（ｔＢｕＯ）、ｔ−ブチル基（ｔＢｕ）、アセチル基（Ａｃ）及びトリフルオロアセチル基（ＴＦＡ）などが挙げられ、取扱いの点から、Ｆｍｏｃ及びＢｏｃが好ましい。これらの保護基の脱保護の方法は、それぞれ公知であって、当業者であれば適宜脱保護できる。
保護基は、本発明のイメージング用分子プローブの特定のアミノ基を標識化する間に、分子プローブ前駆体のその他のアミノ基を保護するものであって、そのような機能を果たせる公知の保護基を使用できる。保護基としては、特に制限されず、例えば、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ-ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、２，２，２-トリクロロエトキシカルボニル基（Ｔｒｏｃ）、アリルオキシカルボニル基（Ａｌｌｏｃ）、４−メトキシトリチル基（Ｍｍｔ）、アミノ基、３から２０個の炭素原子を有するアルキル基、９−フルオレンアセチル基、１−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレノン−１−カルボン酸基、ベンジルオキシカルボニル基、キサンチル基（Ｘａｎ）、トリチル基（Ｔｒｔ）、４−メチルトリチル基（Ｍｔｔ）、４−メトキシ２，３，６−トリメチル−ベンゼンスルホニル基（Ｍｔｒ）、メシチレン−２−スルホニル基（Ｍｔｓ）、４，４−ジメトキシベンゾヒドリル基（Ｍｂｈ）、トシル基（Ｔｏｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル基（Ｐｍｃ）、４−メチルベンジル基（ＭｅＢｚｌ）、４−メトキシベンジル基（ＭｅＯＢｚｌ）、ベンジルオキシ基（ＢｚｌＯ）、ベンジル基（Ｂｚｌ）、ベンゾイル基（Ｂｚ）、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル基（Ｎｐｙｓ）、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジアキソシクロヘキシリデン）エチル基（Ｄｄｅ）、２，６−ジクロロベンジル基（２，６−ＤｉＣｌ−Ｂｚｌ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル基（２−Ｃｌ−Ｚ）、２−ブロモベンジルオキシカルボニル基（２−Ｂｒ−Ｚ）、ベンジルオキシメチル基（Ｂｏｍ）、シクロヘキシルオキシ基（ｃＨｘＯ）、ｔ−ブトキシメチル基（Ｂｕｍ）、ｔ−ブトキシ基（ｔＢｕＯ）、ｔ−ブチル基（ｔＢｕ）、アセチル基（Ａｃ）及びトリフルオロアセチル基（ＴＦＡ）などが挙げられ、取扱いの点から、Ｆｍｏｃ及びＢｏｃが好ましい。これらの保護基の脱保護の方法は、それぞれ公知であって、当業者であれば適宜脱保護できる。
標識化は、上記式（I）で表される芳香環を含む基を有する標識化合物を用いて行うことができる。標識化に用いる標識化合物は、上記式（I）で表される基が、エステル結合を介してスクシンイミドと結合したスクシンイミジルエステル化合物であることが好ましく、より好ましくは下記式（III）で表されるスクシンイミジルエステル化合物であり、さらに好ましくは下記式（IV）で表されるスクシンイミジルエステル化合物である。下記式（III）において、Ａ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は上記式（I）と同様である。下記式（IV）において、Ｒ１は上記式（I）と同様である。
標識化に用いる標識化合物は、中でも、上記式（IV）においてＲ１が[123I]ヨウ素原子、[124I]ヨウ素原子又は[131I]ヨウ素原子である、[123I]N-succinimidyl 3-iodobenzoate、[124I]N-succinimidyl 3-iodobenzoate、[131I]N-succinimidyl 3-iodobenzoateが好ましい。
本発明は、その他の態様として、本発明のイメージング用分子プローブの製造方法であって、上記イメージング用分子プローブ前駆体を標識化及び脱保護することを含む製造方法に関する。本発明のイメージング用分子プローブの製造方法において、上記イメージング用分子プローブ前駆体は、上記式(１３)〜(２４)のいずれかで表されるポリペプチド、上記式(１３)〜(２４)のポリペプチドから１〜数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換したポリペプチドであって標識化及び脱保護後に膵島に結合可能なポリペプチド、又は、上記式(１３)〜(２４)のポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するポリペプチドであって標識化及び脱保護後に膵島に結合可能なポリペプチドからなることが好ましい。
本発明のイメージング用分子プローブの製造方法において、イメージング用分子プローブ前駆体の標識化が、下記式（I）で表される芳香環を含む基を有する標識化合物により標識化することを含むことが好ましい。
上記式（I）において、Ａ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は上述のとおりである。上記式（I）で表される芳香環を含む基を有する標識化合物は、上記式（I）で表される基が、エステル結合を介してスクシンイミドと結合したスクシンイミジルエステル化合物であることが好ましく、より好ましくは上記式（III）で表されるスクシンイミジルエステル化合物であり、さらに好ましくは上記式（IV）で表されるスクシンイミジルエステル化合物である。
本発明のイメージング用分子プローブの製造方法において、上記式（I）で表される芳香環を含む基を有する標識化合物の合成は、自動合成装置を用いて行ってもよく、また、上記式（I）で表される芳香環を含む基を有する標識化合物の合成、及び、該標識化合物を用いたイメージング用分子プローブ前駆体の標識化及び脱保護を、１つの自動合成装置によって行ってもよい。
上記分子プローブ前駆体は、上記式(１３)〜(２４)のポリペプチドから１〜数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換したポリペプチドであって標識化及び脱保護後に膵島に結合可能なポリペプチド、又は、上記式(１３)〜(２４)のポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するポリペプチドであって標識化及び脱保護後に膵島に結合可能なポリペプチドからなり、本発明のイメージング用分子プローブの前駆体となりうるイメージング用分子プローブ前駆体を含む。
したがって、本発明は、その他の態様として、膵島イメージング用分子プローブの前駆体であって、上記式(１３)〜(２４)のポリペプチド、上記式(１３)〜(２４)のポリペプチドから１〜数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換したポリペプチドであって標識化及び脱保護後に膵島に結合可能なポリペプチド、又は、上記式(１３)〜(２４)のポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するポリペプチドであって標識化及び脱保護後に膵島に結合可能なポリペプチドからなる、膵島イメージング用分子プローブ前駆体を提供しうる。上記式(１３)〜(２４)のポリペプチドを含む本発明のイメージング用分子プローブ前駆体によれば、上記本発明のイメージング用分子プローブを容易に提供できるという効果を奏する。
［本発明のキットのさらなる態様］
本発明は、さらにその他の態様として、上述のイメージング用分子プローブ前駆体を含むキットに関する。本発明のイメージング用分子プローブ前駆体を含むキットの実施形態としては、本発明のイメージング用分子プローブを調製するためのキット、本発明のイメージング方法を行うためのキット、本発明の膵島量の測定方法を行うためのキット、本発明の糖尿病の予防又は治療又は診断のキットなどが挙げられる。本発明のイメージング用分子プローブ前駆体を含むキットは、これらの各実施形態において、それぞれの形態に応じた取扱い説明書を含むことが好ましい。
本発明は、さらにその他の態様として、上述のイメージング用分子プローブ前駆体を含むキットに関する。本発明のイメージング用分子プローブ前駆体を含むキットの実施形態としては、本発明のイメージング用分子プローブを調製するためのキット、本発明のイメージング方法を行うためのキット、本発明の膵島量の測定方法を行うためのキット、本発明の糖尿病の予防又は治療又は診断のキットなどが挙げられる。本発明のイメージング用分子プローブ前駆体を含むキットは、これらの各実施形態において、それぞれの形態に応じた取扱い説明書を含むことが好ましい。
イメージング用分子プローブ前駆体を含むキットは、例えば、イメージング用分子プローブ前駆体の標識化に使用する化合物であって、上記式（I）で表される芳香環を含む基を有する標識化合物を含んでいてもよい。上記式（I）で表される芳香環を含む基を有する標識化合物は、上記式（I）で表される基がエステル結合を介してスクシンイミドと結合したスクシンイミジルエステル化合物であることが好ましく、より好ましくは上記式（III）で表されるスクシンイミジルエステル化合物、さらに好ましくは上記式（IV）で表されるスクシンイミジルエステル化合物である。該実施形態のキットは、中でも、標識化合物として[123I]N-succinimidyl 3-iodobenzoate、[124I]N-succinimidyl 3-iodobenzoate、[131I]N-succinimidyl 3-iodobenzoate等を含むことがより好ましい。該実施形態のキットは、さらに、例えば、上記標識化合物を用いた本発明のイメージング用分子プローブ前駆体の標識化方法が記載された取扱い説明書を含んでもよい。
イメージング用分子プローブ前駆体を含むキットは、さらに、上記標識化合物の出発原料を含むことが好ましい。出発原料としては、例えば、2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 3-(tributylstannyl)benzoate等が挙げられる。
イメージング用分子プローブ前駆体を含むキットは、さらに、例えば、イメージング用分子プローブ前駆体の脱保護に使用する試薬及び／又は標識化に使用する試薬を含んでいてもよい。
イメージング用分子プローブ前駆体を含むキットは、さらに、例えば、標識化合物の自動合成装置、及び、該標識化合物の自動合成装置を用いた上記式（I）で表される芳香環を含む基を有する標識化合物の合成方法が記載された取扱い説明書を含んでいてもよい。該自動合成装置は、標識化合物の合成に加えて、例えば、合成した標識化合物を用いたイメージング用分子プローブ前駆体の標識化及び脱保護が可能な自動合成装置であってもよい。該キットは、さらに、標識化合物の合成に使用する放射性ヨウ素を含む試薬を含んでいてもよい。放射性ヨウ素を含む試薬としては、例えば、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ又は１３１Ｉといった放射性同位元素を含む試薬が挙げられる。
本発明は、さらにその他の態様として、イメージング用分子プローブ前駆体を合成するための自動ペプチド合成装置、及び、上記式（I）で表される芳香環を含む基を有する標識化合物及び／又は標識化合物の自動合成装置を含むキットに関する。該自動合成装置は、標識化合物の合成に加えて、例えば、合成した標識化合物を用いたイメージング用分子プローブ前駆体の標識化及び脱保護が可能な自動合成装置であってもよい。該キットは、イメージング用分子プローブ前駆体の合成方法が記載された取扱い説明書を含んでいてもよい。該取扱い説明書には、さらに、例えば、上記式（I）で表される芳香環を含む基を有する標識化合物の合成方法、それを用いた標識化方法、及び、脱保護方法等が記載されていてもよい。該キットは、さらに、標識化合物の合成に使用する放射性ヨウ素を含む試薬を含んでいてもよい。
本発明は、さらにその他の態様として、イメージング用分子プローブ前駆体の合成、上記標識化合物の合成、上記標識化合物を用いたイメージング用分子プローブ前駆体の標識化及び脱保護を行う自動合成装置、及び、該自動合成装置を用いた本発明のイメージング用分子プローブの製造方法が記載された取扱い説明書を含むキットに関する。取扱い説明書には、例えば、イメージング用分子プローブ前駆体の合成方法、上記標識化合物の合成方法、上記標識化合物を用いたイメージング用分子プローブ前駆体の標識化及び脱保護方法等が記載されていることが好ましい。該キットは、さらに、標識化合物の合成に使用する放射性ヨウ素を含む試薬を含んでいてもよい。
［本発明のペプチドの標識方法］
本発明は、さらにその他の態様として、ペプチドの標識方法に関する。本発明のペプトドの標識方法は、放射性標識可能な官能基を側鎖に有するアミノ酸を複数個有するペプチドを放射性標識する方法であって、Ｎ末端のα−アミノ基及び側鎖の官能基が保護基によって保護された保護アミノ酸を用いてペプチドの合成を行うこと、合成したペプチドの放射性標識可能なアミノ酸の側鎖の官能基のうち放射性標識を行わない官能基の保護基を脱保護すること、脱保護したアミノ酸の側鎖の官能基を、脱保護前の保護基とは異なる保護基によって再度の保護を行うこと、前記再度の保護を行ったアミノ酸の側鎖の官能基以外の官能基の保護基を脱保護して放射性標識を行うペプチドを得ること、得られたペプチドを標識化合物を用いて放射性標識すること、及び放射性標識したペプチドの保護基を脱保護することを含む。
本発明は、さらにその他の態様として、ペプチドの標識方法に関する。本発明のペプトドの標識方法は、放射性標識可能な官能基を側鎖に有するアミノ酸を複数個有するペプチドを放射性標識する方法であって、Ｎ末端のα−アミノ基及び側鎖の官能基が保護基によって保護された保護アミノ酸を用いてペプチドの合成を行うこと、合成したペプチドの放射性標識可能なアミノ酸の側鎖の官能基のうち放射性標識を行わない官能基の保護基を脱保護すること、脱保護したアミノ酸の側鎖の官能基を、脱保護前の保護基とは異なる保護基によって再度の保護を行うこと、前記再度の保護を行ったアミノ酸の側鎖の官能基以外の官能基の保護基を脱保護して放射性標識を行うペプチドを得ること、得られたペプチドを標識化合物を用いて放射性標識すること、及び放射性標識したペプチドの保護基を脱保護することを含む。
本発明のペプチドの標識方法は、その他の態様として、ペプチドの合成工程と、保護基の置換工程と、保護基の脱保護工程と、放射性標識工程とを含むペプチドの標識方法に関する。
ペプチドの合成工程は、保護アミノ酸を用いてペプチドの合成を行うことを含み、保護アミノ酸は、Ｎ末端のα−アミノ基が保護基Ｘによって保護された保護アミノ酸、Ｎ末端のα−アミノ基が保護基Ｘによって保護されかつ側鎖の官能基ａが保護基Ｙ１によって保護された保護アミノ酸、Ｎ末端のα−アミノ基が保護基Ｘによって保護されかつ側鎖の官能基ｂが保護基Ｙ２によって保護された保護アミノ酸、及びＮ末端のα−アミノ基が保護基Ｘによって保護されかつ側鎖の官能基ｃが保護基Ｙ３によって保護された保護アミノ酸からなる群から選択される。官能基ａは、放射性標識するアミノ酸の側鎖の官能基であり、官能基ｂは、放射性標識可能なアミノ酸の側鎖の官能基であって放射性標識を行わない官能基であり、官能基ｃは、官能基ａ及びｂ以外のアミノ酸の側鎖の官能基である。
保護基の置換工程は、官能基ｂの保護基Ｙ２を脱保護した後、保護基Ｙ２とは異なる保護基Ｚで官能基ｂを保護することを含み、好ましくは官能基ａ及び官能基ｃの脱保護を行うことなく官能基ｂの保護基Ｙ２を脱保護した後、保護基Ｙ２とは異なる保護基Ｚで官能基ｂを保護することを含む。
保護基の脱保護工程は、官能基ａの保護基Ｙ１及び官能基ｃの保護基Ｙ３を脱保護することを含み、好ましくは官能基ｂの脱保護を行うことなく官能基ａの保護基Ｙ１及び官能基ｃの保護基Ｙ３を脱保護することを含む。
放射性標識工程は、脱保護工程後のペプチドの官能基ａを放射性標識化合物を用いて放射性標識すること、及び官能基ｂの保護基Ｚ及びＮ末端のα−アミノ基の保護基Ｘを脱保護することを含む。
本発明の標識方法は、放射性標識する官能基（官能基ａ）以外の放射性標識可能なアミノ酸の側鎖の官能基（官能基ｂ）が保護基（保護基Ｚ）によって保護された状態で標識化合物によるペプチドの放射性標識を行う。より具体的には、本発明の標識方法は、官能基ｂが保護基Ｙ２の脱保護後再度保護基Ｚによって保護され、かつ、放射性標識する官能基ａが脱保護された状態で標識化合物によるペプチドの放射性標識を行う。このため、本発明の標識方法によれば、例えば、所望の官能基（官能基ａ）のみを選択的に標識することができる。したがって、本発明の標識方法によれば、例えば、標識効率を向上させることができ、また、放射性標識された所望のペプチドの収率を向上させることができる。
［ペプチドの合成］
ペプチドの合成は、Ｎ末端のα−アミノ基及び／又は側鎖の官能基（官能基ａ、ｂ及びｃ）が保護基によって保護された保護アミノ酸を用いたペプチド合成法を用いて行う。
ペプチドの合成は、Ｎ末端のα−アミノ基及び／又は側鎖の官能基（官能基ａ、ｂ及びｃ）が保護基によって保護された保護アミノ酸を用いたペプチド合成法を用いて行う。
ペプチドの合成は、例えば、公知の有機化学的ペプチド合成法を用いて行うことができ、例えば、社団法人日本生化学会編集『生化学実験講座』、第１巻、「タンパク質ＩＶ」、第２０７〜４９５頁（１９７７年、東京化学同人発行）、及び社団法人日本生化学会編集『新生化学実験講座』、第１巻、「タンパク質ＶＩ」、第３〜７４頁（１９９２年、東京化学同人発行）等の記載に基づき行うことができる。
有機化学的ペプチド合成法としては、例えば、ペプチド固相合成法、及びペプチド液相合成法等が挙げられ、好ましくはペプチド固相合成法である。本明細書において「ペプチド固相合成法」とは、固相担体にアミノ酸又はペプチドのＣ末端をリンカーを介して固定し、Ｎ末端側に順次アミノ酸を伸長していく方法のことをいう。ペプチド固相合成法としては、例えば、Ｆｍｏｃ法及びＢｏｃ法等が挙げられ、好ましくはＦｍｏｃ法である。本明細書において「Ｆｍｏｃ法」とは、Ｎ末端のα−アミノ基がＦｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基）によって保護されたアミノ酸を用い、それらを縮合させることによってペプチドを合成する方法のことをいう。より具体的には、合成する各ペプチドのＣ末端に相当するアミノ酸又はＣ末端に相当するアミノ酸を含むペプチドを樹脂等の固相担体に結合させ、Ｎ末端のα−アミノ基の保護基であるＦｍｏｃ基の脱保護及び洗浄と、保護アミノ酸の縮合及び洗浄とを繰り返し行うことによってペプチド鎖を伸長し、最後に最終的な脱保護反応を行うことによって目的のペプチドを合成することができる。本明細書において「Ｂｏｃ法」とは、Ｎ末端のα−アミノ基がＢｏｃ（ｔｅｒｔ-ブトキシカルボニル基）によって保護されたアミノ酸を用い、それらを縮合させることによってペプチドを合成する方法のことをいう。ペプチド合成は、例えば、ペプチド自動合成装置を使用して行ってもよい。ペプチド自動合成装置としては、例えば、Ａ４４３Ａ型（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＰＳＳＭ８（島津製作所製）等が挙げられる。
保護アミノ酸としては、例えば、Ｎ末端のα−アミノ基が保護基Ｘによって保護された保護アミノ酸、Ｎ末端のα−アミノ基が保護基Ｘによって保護されかつ側鎖の官能基ａが保護基Ｙ１によって保護された保護アミノ酸、Ｎ末端のα−アミノ基が保護基Ｘによって保護されかつ側鎖の官能基ｂが保護基Ｙ２によって保護された保護アミノ酸、及びＮ末端のα−アミノ基が保護基Ｘによって保護されかつ側鎖の官能基ｃが保護基Ｙ３によって保護された保護アミノ酸からなる群から選択される保護アミノ酸が挙げられる。
官能基ａは、放射性標識を行うアミノ酸の側鎖の官能基である。官能基ａとしては、例えば、アミノ基又はアミノ基を有する基が挙げられる。
官能基ｂは、放射性標識可能なアミノ酸の側鎖の官能基のうち放射性標識を行わない官能基である。官能基ｂは、例えば、官能基ａと同じ種類の官能基であり、好ましくは官能基ａのアミノ酸と同じアミノ酸の側鎖の官能基である。
官能基ｃは、官能基ａ及びｂ以外のアミノ酸の側鎖の官能基である。
保護基Ｘは、ペプチド合成に用いるアミノ酸のＮ末端のα−アミノ基の保護基である。保護基Ｘとしては、例えば、上述した保護基が挙げられ、ペプチド合成法に応じて適宜決定することができる。ペプチド合成法がＦｍｏｃ法である場合、保護基Ｘは通常Ｆｍｏｃとなり、ペプチド合成法がＢｏｃ法である場合、保護基Ｘは通常Ｂｏｃとなる。
保護基Ｙ１〜Ｙ３は、ペプチド合成に用いるアミノ酸の側鎖の官能基の保護基であって、官能基Ｙ１は、官能基ａの保護基であり、保護基Ｙ２は、官能基ｂの保護基であり、保護基Ｙ３は、官能基ｃの保護基である。保護基Ｙ１〜Ｙ３としては、上述した保護基が挙げられ、官能基の種類及びペプチド合成法に応じて適宜決定でき、好ましくはＮ末端のα−アミノ基の保護基（保護基Ｘ）とは異なる保護基を用いることである。
保護基Ｙ２は、選択的な脱保護、すなわち官能基ａを脱保護することなく官能基ｂの保護基Ｙ２のみを脱保護する点から、官能基ａの保護基Ｙ１と異なることが好ましく、官能基ａ及び官能基ｃを脱保護することなく官能基ｂの保護基Ｙ２のみを脱保護する点から、官能基ａの保護基Ｙ１及び官能基ｃの保護基Ｙ３と異なることがより好ましい。官能基ａ及び官能基ｂがアミノ基である場合、選択的な脱保護の点から、官能基ｂの保護基Ｙ２はトリチル型の保護基であることが好ましい。より好ましくは官能基ｂの保護基Ｙ２がトリチル型の保護基であり、官能基ａの保護基Ｙ１がカルバメート系の保護基である。トリチル型の保護基としては、例えば、Ｍｍｔ、Ｔｒｔ、Ｍｔｔ、Ｍｔｒ等が挙げられ、より選択的な脱保護の点から、Ｍｍｔ及びＭｔｔが好ましい。カルバメート系の保護基としては、例えば、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、Ｃｂｚ、Ａｌｌｏｃ、Ｔｒｏｃ等が挙げられ、中でもＢｏｃが好ましい。
［保護基の置換］
保護基の置換は、官能基ｂの保護基を置換することであって、官能基ｂの保護基Ｙ２を脱保護した後、保護基Ｙ２とは異なる保護基Ｚで官能基ｂを保護することを含む。
保護基の置換は、官能基ｂの保護基を置換することであって、官能基ｂの保護基Ｙ２を脱保護した後、保護基Ｙ２とは異なる保護基Ｚで官能基ｂを保護することを含む。
保護基Ｙ２の脱保護は、保護基Ｙ２の種類に応じて適宜決定できる。保護基Ｙ２の脱保護は、選択的な標識の点から、官能基ａ及び官能基ｃの脱保護を行うことなく官能基ｂの保護基Ｙ２を脱保護することが好ましい。保護基Ｚは、官能基ｂの保護基Ｙ２を脱保護した後、官能基ｂを保護する保護基であって、保護基Ｙ２とは異なる保護基である。保護基Ｚは、上述する保護基から適宜選択でき、好ましくはペプチド合成におけるＮ末端のα−アミノ基の保護基（保護基Ｘ）と同じであることが好ましい。ペプチド合成がＦｍｏｃ法を用いて行われた場合は、保護基ＺとしてはＦｍｏｃが好ましい。
［保護基の脱保護］
保護基の脱保護工程は、再度の保護を行ったアミノ酸の側鎖の官能基ｂ以外の官能基の保護基を脱保護して放射性標識を行うペプチドを得ることを含み、具体的には官能基ａの保護基Ｙ１及び官能基ｃの保護基Ｙ３を脱保護することを含む。これにより放射性標識を行うペプチドが得られる。当該ペプチドは、官能基ｂが保護基Ｚによって保護されている。
保護基の脱保護工程は、再度の保護を行ったアミノ酸の側鎖の官能基ｂ以外の官能基の保護基を脱保護して放射性標識を行うペプチドを得ることを含み、具体的には官能基ａの保護基Ｙ１及び官能基ｃの保護基Ｙ３を脱保護することを含む。これにより放射性標識を行うペプチドが得られる。当該ペプチドは、官能基ｂが保護基Ｚによって保護されている。
官能基ａの保護基Ｙ１及び官能基ｃの保護基Ｙ３の脱保護は、官能基ｂを脱保護することなく行うことが好ましい。官能基ａの保護基Ｙ１及び官能基ｃの保護基Ｙ３の脱保護は、保護基の種類に応じて適宜決定できる。また、官能基ａの保護基Ｙ１及び官能基ｃの保護基Ｙ３の脱保護は、ペプチドの固相担体からの切り出しとともに行ってもよい。
保護基の脱保護後、得られたペプチドの洗浄及び／又は単離精製を行う工程を含んでいてもよい。単離精製は、例えば、ペプチド又はタンパク質を精製するための公知の分離操作を用いて行うことができる。分離操作としては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等が挙げられ、必要に応じてこれらを組み合わせて行ってもよい。また、最終形態に応じて、精製したペプチドを、例えば、濃縮及び／又は凍結乾燥して単離してもよい。
［ペプチドの標識］
標識は、官能基ｂが保護基Ｚで保護されかつ官能基ａの保護基Ｙ１が脱保護されたペプチドを用いて行う。標識を行うペプチドは、選択的な標識の点から、官能基ｂが保護基Ｚで保護されかつ官能基ａの保護基Ｙ１及び官能基ｃの保護基Ｙ３が脱保護されたペプチドであることが好ましく、より好ましくは官能基ｂが保護基Ｚで保護され、Ｎ末端のα−アミノ基が保護基Ｘで保護されかつ官能基ａの保護基Ｙ１及び官能基ｃの保護基Ｙ３が脱保護されたペプチドである。これにより、選択的な標識を行うことができる。標識化合物としては、放射性標識に用いられる公知の化合物が使用でき、例えば、上述のものが挙げられる。
標識は、官能基ｂが保護基Ｚで保護されかつ官能基ａの保護基Ｙ１が脱保護されたペプチドを用いて行う。標識を行うペプチドは、選択的な標識の点から、官能基ｂが保護基Ｚで保護されかつ官能基ａの保護基Ｙ１及び官能基ｃの保護基Ｙ３が脱保護されたペプチドであることが好ましく、より好ましくは官能基ｂが保護基Ｚで保護され、Ｎ末端のα−アミノ基が保護基Ｘで保護されかつ官能基ａの保護基Ｙ１及び官能基ｃの保護基Ｙ３が脱保護されたペプチドである。これにより、選択的な標識を行うことができる。標識化合物としては、放射性標識に用いられる公知の化合物が使用でき、例えば、上述のものが挙げられる。
合成するペプチドとしては、例えば、側鎖にアミノ基を有するアミノ酸を２個以上有するペプチドが挙げられる。側鎖にアミノ基を有するアミノ酸としては、例えば、リジン等が挙げられる。合成するペプチドの長さは特に制限されないが、例えば、５アミノ酸残基以上であり、好ましくは１０〜１５０アミノ酸残基、より好ましくは２０〜８０アミノ酸残基である。合成するペプチドは、官能基ａを側鎖に有するアミノ酸を、例えば、１個有しておればよく、例えば、２個、３個以上含んでいてもよい。合成するペプチドは、例えば、ＧＬＰ−１Ｒのイメージング用分子プローブ、好ましくは本発明の分子プローブを得る点から、下記式(２５)〜(２８)のいずれかで表されるポリペプチドであることが好ましい。
DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS (２５) （配列番号２５）
LSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS (２６) （配列番号２６）
SKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS (２７) （配列番号２７）
KQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS (２８) （配列番号２８）
DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS (２５) （配列番号２５）
LSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS (２６) （配列番号２６）
SKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS (２７) （配列番号２７）
KQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS (２８) （配列番号２８）
また、本発明の標識方法は、さらにその他の態様として、標識する官能基がＮ末端のα−アミノ基であるペプチドの放射性標識方法に関する。本態様の放射性標識方法は、ペプチドの合成工程が、Ｎ末端に位置するアミノ酸として、Ｎ末端のα−アミノ基が保護基Ｙ４によって保護された保護アミノ酸、Ｎ末端のα−アミノ基が保護基Ｙ４によって保護されかつ側鎖の官能基ｂが保護基Ｙ２で保護された保護アミノ酸、又はＮ末端のα−アミノ基が保護基Ｙ４によって保護されかつ側鎖の官能基ｃが保護基Ｙ３によって保護された保護アミノ酸を用いて行われ、その他のアミノ酸が、Ｎ末端のα−アミノ基が保護基Ｘによって保護された保護アミノ酸、Ｎ末端のα−アミノ基が保護基Ｘによって保護されかつ側鎖の官能基ｂが保護基Ｙ２によって保護された保護アミノ酸、及びＮ末端のα−アミノ基が保護基Ｘによって保護されかつ側鎖の官能基ｃが保護基Ｙ３によって保護された保護アミノ酸からなる群から選択される保護アミノ酸を用いて行われること、保護基の脱保護工程が、Ｎ末端のα−アミノ基の保護基Ｙ４及び官能基ｃの保護基Ｙ３を脱保護することを含むこと、放射性標識工程が、放射性標識化合物を用いてＮ末端のα−アミノ基を放射性標識し、官能基ｂの保護基Ｚを脱保護することを含む以外は、上記と同様にして行うことができる。保護基Ｙ４は、ペプチドのＮ末端に位置するアミノ酸のα−アミノ基の保護基であって、保護基Ｘ及び保護基Ｙ２と異なることが好ましい。保護基の脱保護工程は、官能基ｂの脱保護を行うことなくＮ末端のα−アミノ基の保護基Ｙ４及び官能基ｃの保護基Ｙ３を脱保護することを含むことが好ましい。
［本発明のペプチド製造方法］
本発明は、さらにその他の態様として、放射性標識されたペプチドを製造する方法であって、前記ペプチドは、放射性標識可能な官能基を側鎖に有するアミノ酸を複数個有し、Ｎ末端のα−アミノ基及び側鎖の官能基が保護基によって保護された保護アミノ酸を用いて放射性標識するペプチドを合成すること、合成したペプチドの放射性標識可能なアミノ酸の側鎖の官能基のうち放射性標識を行わない官能基の保護基を脱保護すること、脱保護したアミノ酸の側鎖の官能基を、脱保護前の保護基とは異なる保護基によって再度の保護を行うこと、前記再度の保護を行ったアミノ酸の側鎖の官能基以外の官能基の保護基を脱保護して放射性標識を行うペプチドを得ること、得られたペプチドを標識化合物を用いて放射性標識すること、及び、放射性標識したペプチドの保護基を脱保護することを含む製造方法に関する。本発明の放射性標識したペプチド製造方法は、その他の態様として、上述の本発明の標識方法を用いてペプチドの合成、保護基の脱保護及び放射性標識を行うことを含む。
本発明は、さらにその他の態様として、放射性標識されたペプチドを製造する方法であって、前記ペプチドは、放射性標識可能な官能基を側鎖に有するアミノ酸を複数個有し、Ｎ末端のα−アミノ基及び側鎖の官能基が保護基によって保護された保護アミノ酸を用いて放射性標識するペプチドを合成すること、合成したペプチドの放射性標識可能なアミノ酸の側鎖の官能基のうち放射性標識を行わない官能基の保護基を脱保護すること、脱保護したアミノ酸の側鎖の官能基を、脱保護前の保護基とは異なる保護基によって再度の保護を行うこと、前記再度の保護を行ったアミノ酸の側鎖の官能基以外の官能基の保護基を脱保護して放射性標識を行うペプチドを得ること、得られたペプチドを標識化合物を用いて放射性標識すること、及び、放射性標識したペプチドの保護基を脱保護することを含む製造方法に関する。本発明の放射性標識したペプチド製造方法は、その他の態様として、上述の本発明の標識方法を用いてペプチドの合成、保護基の脱保護及び放射性標識を行うことを含む。
本発明のペプチドの製造方法によれば、例えば、所望の官能基のみを選択的に標識することができるため、より高い収率で放射性標識された所望のペプチドを製造することができる。さらに、本発明のペプチドの製造方法によれば、例えば、本発明のイメージング用分子プローブを効率よく製造することができ、好ましくは純度の高い本発明のイメージング用分子プローブを製造することができる。
本発明のペプチドの製造方法において、官能基、及び保護基は本発明の標識方法と同様であり、ペプチドの合成、脱保護、放射性標識等は、上述した本発明の標識方法と同様にして行うことができる。
本発明の標識方法及び本発明のペプチドの製造方法について、標識するペプチドが上記式(２５)のポリペプチドであり、ペプチド合成をペプチド固相合成法を用いて行った場合を例にとり説明する。該ペプチドにおいて、官能基ａ及びｂはアミノ基であり、標識する官能基（官能基ａ）を側鎖に備えるアミノ酸は４番目のリジンであり、標識しない官能基（官能基ｂ）を側鎖に備えるアミノ酸は１９番目のリジンであり、官能基ｃを備えるアミノ酸は、アスパラギン酸、セリン、グリシン、グルタミン、アルギニン、アスパラギン、及びトリプトファンである。但し、以下の説明は一例に過ぎず、本発明はこれに限定されないことはいうまでもない。
（１）まず、Ｎ末端のα−アミノ基及び側鎖の官能基が保護基によって保護された保護アミノ酸を用いてペプチドの合成を行う。
ペプチド合成は、例えば、Ｆｍｏｃ法を用いて行うことができる。具体的には、Ｃ末端のアミノ酸であるセリンのカルボキシル基をリンカーを介して樹脂に固定し、Ｃ末端側からＮ末端側へアミノ酸を１個ずつ結合させていくことによって合成できる。
ペプチド合成に用いる保護アミノ酸としては、通常のＦｍｏｃ−ペプチド合成法に用いられるＦｍｏｃ−アミノ酸誘導体が使用できる。具体的には、側鎖に官能基のあるアミノ酸（Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ）については、官能基の種類に応じて保護基によって官能基が保護され、かつＮ末端のα−アミノ基がＦｍｏｃによって保護されたアミノ酸が使用でき、その他のアミノ酸についてはＮ末端のα−アミノ基がＦｍｏｃによって保護されたアミノ酸が使用できる。官能基ａの保護基（保護基Ｙ１）及び官能基ｃの保護基（保護基Ｙ３）としては、同じ条件によって脱保護可能な保護基を選択することが好ましい。
放射性標識を行わない１９番目のリジンとしては、選択的な脱保護の点から、放射性標識部位である４番目のリジンの側鎖のアミノ基（官能基ａ）の保護基Ｙ１とは異なる保護基Ｙ２によって側鎖のアミノ基（官能基ｂ）が保護されたリジンを使用することが好ましい。例えば、４番目のリジンとして側鎖のアミノ基がＦｍｏｃ以外のカルバメート系の保護基によって保護されたリジンを使用し、１９番目のリジンとして側鎖のアミノ基がトリチル型の保護基によって保護されたリジンを使用してもよい。
（２）つぎに、合成したペプチドにおいて１９番目のリジンの側鎖のアミノ基（官能基ｂ）の保護基Ｙ２の脱保護、及び保護基Ｚによる保護を行う。
脱保護は、４番目のリジンの側鎖のアミノ基（官能基ａ）及び官能基ｃを脱保護することなく１９番目のリジンの側鎖のアミノ基（官能基ｂ）の保護基Ｙ２を脱保護することが好ましい。脱保護は、官能基ｂの保護基Ｙ２の種類に応じて適宜行うことができる。保護基がトリチル型の保護基である場合は、例えば、弱酸性の条件下とすることによって脱保護することができる。弱酸性の条件下とする試薬としては、例えば、トリフルオロ酢酸を含む試薬等が挙げられる。
保護基Ｚは、脱保護した１９番目のリジンの側鎖のアミノ基（官能基ｂ）の保護基であって、脱保護前の保護基（保護基Ｙ２）とは異なる保護基である。保護基Ｚとしては、脱保護前の保護基（保護基Ｙ２）とは異なる保護基であれば特に制限されないが、Ｎ末端のα−アミノ基の保護基（保護基Ｘ）であるＦｍｏｃが好ましい。Ｆｍｏｃは、例えば、アミン存在下でＮ−（フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）コハク酸イミド（ＦｍｏｃＯＳｕ）と反応させることによって官能基ｂに導入することができる。
（３）ついで、Ｎ末端のα−アミノ基及び１９番目のリジンの側鎖のアミノ基（官能基ｂ）以外の脱保護、より具体的には４番目のリジンの側鎖のアミノ基（官能基ａ）及び官能基ｃの脱保護を行う。これにより、Ｎ末端のα−アミノ基及び１９番目のリジンの側鎖のアミノ基（官能基ｂ）が保護基で保護され、かつ４番目のリジンの側鎖のアミノ基（官能基ａ）が脱保護された状態のペプチドを得ることができる。当該ペプチドは、上述する本発明の分子プローブ前駆体に対応するものである。
脱保護は、脱保護を行う保護基の種類に応じて公知の方法に準じて行うことができる。また、当該脱保護は、ペプチドの固相担体からの切り出しとともに行い、例えば、固相担体からの切り出しを行う条件で、上記保護基の脱保護を行ってもよい。
（４）得られたペプチドを、標識化合物を用いて放射性標識する。
該ペプチドは、放射性標識する４番目のリジンの側鎖のアミノ基（官能基ａ）が脱保護され、かつ、放射性標識を行わない１９番目のリジンの側鎖のアミノ基（官能基ｂ）が保護基Ｚによって保護されおり、放射性標識後の脱保護操作を軽減する点から、官能基ｃの保護基Ｙ３及び官能基ａの保護基Ｙ１が脱保護され、かつ官能基ｂが保護基Ｚによって保護されていることが好ましい。このようなペプチドを用いることによって、目的とする部位（４番目のリジンの側鎖のアミノ基）のみを選択的に放射性標識することができる。
放射性標識は、目的とする放射性標識されたペプチドに応じて、公知の方法に準じて行うことができる。標識化合物としては特に制限されないが、例えば、上記式（I）で表される基を有する標識化合物や、金属放射性同位元素（金属核種）と結合可能なキレート化合物等が挙げられる。金属核種としては、例えば、６４Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８２Ｒｂ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１８６Ｒｅが挙げられる。キレート化合物としては、例えば、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、６−ヒドラジノピリジン−３−カルボン酸（ＨＹＮＩＣ）、テトラアザシクロドデカン四酢酸（ＤＯＴＡ）、dithisosemicarbazone（ＤＴＳ）、diaminedithiol（ＤＡＤＴ）、mercaptoacetylglycylglycylglycine（ＭＡＧ３）、monoamidemonoaminedithiol（ＭＡＭＡ）、diamidedithiol（ＤＡＤＳ）、propylene diamine dioxime（ＰｎＡＯ）等が挙げられる。本発明のイメージング用分子プローブを製造する点からは、上記式（I）で表される基を有する標識化合物が好ましく、より好ましくは上記式（III）で表されるスクシンイミジルエステル化合物であり、さらに好ましくは上記式（IV）で表されるスクシンイミジルエステル化合物である。
（５）ついで、放射性標識したペプチドの残りの保護基を脱保護する。これにより、所望の官能基ａ（４番目のリジンの側鎖のアミノ基）が放射性標識されたペプチドを製造することができる。
当該工程では、ペプチドに結合している残りの保護基、すなわち、Ｎ末端のアミノ基の保護基及び放射性標識を行わない１９番目のリジンの側鎖のアミノ基（官能基ｂ）の脱保護を行う。脱保護は、保護基の種類に応じて公知の方法に準じて行うことができる。保護基がＦｍｏｃである場合は、例えば、ピペリジン条件下とすることで脱保護することができる。これにより、本発明の分子プローブを製造することができる。
純度の高い放射性標識されたペプチドを製造する点から、さらに、精製工程等を含んでいてもよい。精製工程は、例えば、上記（３）の脱保護と上記（４）の放射性標識の間に行うことができる。
さらに、Ｎ末端のα−アミノ基を電荷を有さない修飾基によって修飾する工程や、Ｃ末端のカルボキシル基をアミド化する工程を含んでいてもよい。
以下に、実施例及び比較例を用いて本発明をさらに説明する。但し、本発明は以下の実施例に限定して解釈されない。
なお、本明細書の記載において、以下の略語を使用する。
OBu：ブチルエステル基
Boc：ブトキシカルボニル基
Trt：トリチル基
Pdf：２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル基
Mmt：４−メトキシトリチル基
Fmoc：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基
OBu：ブチルエステル基
Boc：ブトキシカルボニル基
Trt：トリチル基
Pdf：２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル基
Mmt：４−メトキシトリチル基
Fmoc：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基
［Binding Assay］
第４番目のリジン残基の側鎖のアミノ基が[127I]3-iodobenzoyl基で標識された下記式(２９)の分子プローブ（配列番号２９）、及びＮ末端のα−アミノ基が[127I]3-iodobenzoyl基で標識された下記式(３０)の分子プローブ（配列番号３０）を用いてＢｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ解析を行った。
第４番目のリジン残基の側鎖のアミノ基が[127I]3-iodobenzoyl基で標識された下記式(２９)の分子プローブ（配列番号２９）、及びＮ末端のα−アミノ基が[127I]3-iodobenzoyl基で標識された下記式(３０)の分子プローブ（配列番号３０）を用いてＢｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ解析を行った。
上記式(２９)の分子プローブ及び上記式(３０)の分子プローブは、 [125I]N-succinimidyl 3-iodobenzoateに替えて[127I]N-succinimidyl 3-iodobenzoateを使用した以外は、後述する実施例１及び２と同様の方法を用いて調製した。
マウスから単離した膵島を５０ｍｌチューブに回収し、遠心（２０００ｒｐｍ、２分）した後、冷ＰＢＳ２０ｍＬで１回洗浄した。トリプシン−ＥＤＴＡ（トリプシン−ＥＤＴＡ（０．０５％／０．５３ｍＭ）３ｍＬに、ＰＢＳを含む０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４（ＮａＯＨ））１２ｍＬを加えたもの）を１５ｍＬ加え、３７℃で振とうしながら１分間インキュベートした後、直ちに氷上に置いた。ついで、スポイト付１０ｍＬピペットで泡立てることなく勢いよく２０回ピペッティングした後、冷ＰＢＳを最終量が３０ｍＬになるように加えた。遠心（３０００ｒｐｍ、２分）した後、冷ＰＢＳ ３０ｍＬで２回洗浄した。上清を除去して膵島細胞サンプルを得た。得られた膵島細胞サンプルは−８０℃で保存した。
１００μＬ／チューブとなるように膵島細胞サンプルをＢｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）で懸濁した。ついでＢｕｆｆｅｒ ８８０μＬ、上記式(２９)の分子プローブ又は上記式(３０)の分子プローブを含む溶液（分子プローブの終濃度：０、１×１０−６〜１×１０−１２Ｍ）１０μＬ、［125I］Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ標識Ｅｘｅｎｄｉｎ（９−３９）を含む溶液（［125I］Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ標識Ｅｘｅｎｄｉｎ（９−３９）（製品コード：ＮＥＸ３３５、1．８５ＭＢｑ／ｍＬ＝５０μＣｉ／ｍＬ，２２．７３ｐｍｏｌ／ｍＬ＝７６．５７ｎｇ／ｍＬ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）１０μＬにＢｕｆｆｅｒ９０μＬを添加したもの）１０μＬを添加し、室温で６０分インキュベーションした。なお、［125I］標識Ｂｏｌｔｏｎ−ＨｕｎｔｅｒＥｘｅｎｄｉｎ（９−３９）の終濃度は０．０５μＣｉ／チューブとした。ついで予め湿らせたガラス繊維フィルタ(Ｗｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ｃ ｆｉｌｔｅｒ)をセットした吸引装置を用い、吸引によりＢ／Ｆ分離した後、フィルタを氷冷のＰＢＳ５ｍｌで３回洗浄した。フィルタをチューブに入れ、γカウンターにより放射能の測定を行った。
第４番目のリジン残基の側鎖のアミノ基が[127I]3-iodobenzoyl基で標識された上記式(２９)の分子プローブ、及びＮ末端のα−アミノ基が[127I]3-iodobenzoyl基で標識された下記式(３０)の分子プローブはいずれも、ＧＬＰ−１受容体と[125I]Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ標識Ｅｘｅｎｄｉｎ（９−３９）との結合を濃度依存的に阻害した。上記式(２９)の分子プローブのＩＣ５０は１．６×１０−９Ｍであり、上記式(３０)の分子プローブのＩＣ５０は１．４×１０−９Ｍであった。上記式(２９)の分子プローブ及び上記式(３０)の分子プローブはいずれも膵島のＧＬＰ−１受容体に対して高い親和性を示した。また、上記式(２９)の分子プローブのＩＣ５０及び上記式(３０)の分子プローブのＩＣ５０は、いずれもＥｘｅｎｄｉｎ（９−３９）（ＩＣ５０：１．４×１０−９Ｍ）に近い値である。よって、上記式(２９)の分子プローブ及び上記式(３０)の分子プローブは、膵島のＧＬＰ−１受容体に対してＧＬＰ−１受容体拮抗薬であるＥｘｅｎｄｉｎ（９−３９）と同程度の親和性を有しているといえる。したがって、第４番目のリジン残基の側鎖のアミノ基が[127I]3-iodobenzoyl基で標識された上記式(２９)の分子プローブ、及びＮ末端のα−アミノ基が[127I]3-iodobenzoyl基で標識された下記式(３０)の分子プローブは、ＧＬＰ−１受容体、特に膵島のＧＬＰ−１受容体に対して十分な結合能を有することが確認できた。
（実施例１）
配列番号１の第４番目のリジン残基の側鎖のアミノ基が、[125I]3-iodobenzoyl基で標識され（以下、「[125I]ＩＢ標識」とも言う）、かつ、Ｃ末端のカルボキシル基がアミド化されている下記式(３１)の分子プローブ（配列番号３１）を用いてマウスの体内分布の測定を行った。まず、下記式(３１)の分子プローブは、以下のようにして調製した。
配列番号１の第４番目のリジン残基の側鎖のアミノ基が、[125I]3-iodobenzoyl基で標識され（以下、「[125I]ＩＢ標識」とも言う）、かつ、Ｃ末端のカルボキシル基がアミド化されている下記式(３１)の分子プローブ（配列番号３１）を用いてマウスの体内分布の測定を行った。まず、下記式(３１)の分子プローブは、以下のようにして調製した。
［分子プローブの調製］
ポリペプチドの合成は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ペプチド自動合成機（４３３Ａ型）を用いて添付のソフトに従って行った。側鎖に官能基のあるアミノ酸は、それぞれ、Ａｓｐ（ＯＢｕ）、Ｓｅｒ（ＯＢｕ）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｕ（ＯＢｕ）、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）を用いた。１９番目のリジンとしてはＬｙｓ（Ｍｍｔ）を使用した。Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ（０．１２５ｍｍｏｌ、０．３４ｍｍｏｌ／ｇ）を出発樹脂とし、配列に従って逐次アミノ酸を延長し、下記式(３２)の配列を有するポリペプチドを得た。なお、下記式(３２)において、Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）以外は側鎖の保護基の表記を省略した。
Fmoc-DLSKQMEEEAVRLFIEWLK(Mmt)NGGPSSGAPPPS-保護ペプチド樹脂 (32) (配列番号３２)
ポリペプチドの合成は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ペプチド自動合成機（４３３Ａ型）を用いて添付のソフトに従って行った。側鎖に官能基のあるアミノ酸は、それぞれ、Ａｓｐ（ＯＢｕ）、Ｓｅｒ（ＯＢｕ）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｕ（ＯＢｕ）、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）を用いた。１９番目のリジンとしてはＬｙｓ（Ｍｍｔ）を使用した。Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ（０．１２５ｍｍｏｌ、０．３４ｍｍｏｌ／ｇ）を出発樹脂とし、配列に従って逐次アミノ酸を延長し、下記式(３２)の配列を有するポリペプチドを得た。なお、下記式(３２)において、Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）以外は側鎖の保護基の表記を省略した。
Fmoc-DLSKQMEEEAVRLFIEWLK(Mmt)NGGPSSGAPPPS-保護ペプチド樹脂 (32) (配列番号３２)
１．５％ＴＦＡ−５％ＴＩＳ−９３．５５％ＣＨ２Ｃｌ２を用いた定法処理により、上記式(３２)のポリペプチドから、まず、１９番目のリジン残基の側鎖の保護基（Ｍｍｔ基）を除去し、遊離した１９番目のリジン残基の側鎖のアミノ基をＦｍｏｃ化した。ついで、１９番目のリジン残基のＦｍｏｃ基以外の全保護基の除去と樹脂からのペプチドの切り出しとを、９２．５％ＴＦＡ−２．５％ＴＩＳ−２．５％Ｈ２Ｏ−２．５％エタンジチオールを用いた定法処理によって行った。反応終了後、ろ別により担体樹脂を取り除き、乾燥エーテルを加えて粗生成物を沈殿させ、ろ別した。得られた粗生成物は、島津製作所のＬＣ８Ａ分取装置（ＯＤＳ カラム３ｃｍｘ２５ｃｍ）を用い、０．１％ＴＦＡを含むＣＨ３ＣＮ−Ｈ２Ｏのリニアーグラジエントの系で精製し、フラクションコレクターを用いて目的の画分を集めた後、下記式(３３)の分子プローブ前駆体を凍結乾燥白色粉末として得た。
Fmoc-DLSKQMEEEAVRLFIEWLK(Fmoc)NGGPSSGAPPPS-NH2 (33) （配列番号３３）
Fmoc-DLSKQMEEEAVRLFIEWLK(Fmoc)NGGPSSGAPPPS-NH2 (33) （配列番号３３）
得られた上記式(３３)の分子プローブ前駆体（９５０μｇ）を、Ｂｏｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．８）に溶解させ、それに［125I］N-succinimidyl 3-iodobenzoate（ＳＩＢ）を加え反応溶液をｐＨ８．５〜９．０に調整し標識化を行った。その後、Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅを加えることで脱保護反応を行い、目的物である上記式(３１)の分子プローブ（配列番号１の第４番目のリジン残基が標識化された分子プローブ）を得た。なお、上記式(３１)の分子プローブにおいて、Ｎ末端のα−アミノ基は非修飾である。
［体内分布］
調製した上記式(３１)の分子プローブ（０．５７μＣｉ）を無麻酔の６週齢ｄｄＹマウス（雄性、体重３０ｇ）に静脈注射（尾静脈）により投与した。投与５分後、１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後に各臓器を摘出した（ｎ＝５）。各臓器の重量と放射能とを測定し、単位重量あたりの放射能から集積量（%dose/g）を算出した。その結果の一例を下記表１、図１Ａ及びＢに示す。図１Ａは、各臓器への分子プローブの集積の経時変化を示すグラフであり、図１Ｂは、図１Ａを拡大したグラフである。
調製した上記式(３１)の分子プローブ（０．５７μＣｉ）を無麻酔の６週齢ｄｄＹマウス（雄性、体重３０ｇ）に静脈注射（尾静脈）により投与した。投与５分後、１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後に各臓器を摘出した（ｎ＝５）。各臓器の重量と放射能とを測定し、単位重量あたりの放射能から集積量（%dose/g）を算出した。その結果の一例を下記表１、図１Ａ及びＢに示す。図１Ａは、各臓器への分子プローブの集積の経時変化を示すグラフであり、図１Ｂは、図１Ａを拡大したグラフである。
上記表１、図１Ａ及びＢに示すとおり、上記式(３１)の分子プローブの膵臓への集積は、投与後５分で１７．５%dose/g、投与後１５分で２５．４%dose/g、投与後３０分で４５．４%dose/gであった。上記式(３１)の分子プローブは、投与後１５分〜１２０分の時間帯において、肺を除けば、膵臓に最も多く集積し、膵臓への集積が２０%dose/gを超えるレベルで維持された。また、投与後１５〜６０分の時間帯では、胃への集積量に対する膵臓への集積量が４．５倍以上であり、腸への集積量に対する膵臓への集積量が９倍以上であり、肝臓への集積量は２．５倍以上であった。特に、投与後３０〜１２０分の時間帯では、肝臓への集積量に対する膵臓への集積量は６．５倍以上であった。つまり、上記式(３１)の分子プローブは、膵臓に特異的に集積したといえる。また、甲状腺への集積に大きな変化が見られないことから、生体内で上記式(３１)の分子プローブが脱ヨウ素代謝を受けていないことが示唆された。これにより、上記式(３１)の分子プローブは、膵β細胞のイメージング、とりわけ、膵β細胞の非侵襲的イメージングに適していると考えられる。
（比較例）
比較例として、配列番号１の第４番目のリジン残基の側鎖のアミノ基が、[125I]3-(3-iodo-4-hydroxyphenyl)propanoyl基で標識（以下、「[125I]ＢＨ標識」ともいう）され、かつ、Ｃ末端のカルボキシル基がアミド化されている下記式(３４)の分子プローブ（配列番号３４）を用いてマウスの体内分布の測定を行った。下記式(３４)の分子プローブの調製は、標識化をＢｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて行った以外は、実施例１と同様に行った。また、体内分布測定は、実施例１と同様に行った。その結果の一例を下記表２、図２Ａ及びＢに示す。
比較例として、配列番号１の第４番目のリジン残基の側鎖のアミノ基が、[125I]3-(3-iodo-4-hydroxyphenyl)propanoyl基で標識（以下、「[125I]ＢＨ標識」ともいう）され、かつ、Ｃ末端のカルボキシル基がアミド化されている下記式(３４)の分子プローブ（配列番号３４）を用いてマウスの体内分布の測定を行った。下記式(３４)の分子プローブの調製は、標識化をＢｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて行った以外は、実施例１と同様に行った。また、体内分布測定は、実施例１と同様に行った。その結果の一例を下記表２、図２Ａ及びＢに示す。
なお、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製の［125I］Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ標識Ｅｘｅｎｄｉｎ（９−３９）は、上記式(３４)の分子プローブと同様に、１２番目のリジン残基（配列番号１のアミノ酸配列における４番目のリジンの側鎖のアミノ基）が標識されていることが知られている（Suleiman Al-Sabah et al., The positive charge at Lys-288 of the glucagon-like peptide-1 (GLP-1) receptor is important for binding the N-terminus of peptide agonists, FEBS Letters 553 (2003) 342-346）。
上記表２、図１Ａ及びＢ、並びに、図２Ａ及びＢに示すとおり、[125I]3-iodobenzoyl基で標識した実施例１の上記式(３１)の分子プローブは、[125I]3-(3-iodo-4-hydroxyphenyl)propanoyl基で標識した比較例の上記式(３４)の分子プローブと比べて、全ての時間帯において、膵臓への集積が多かった。特に、投与後３０分における上記式(３１)の分子プローブの膵臓への集積量は、比較例の上記式(３４)の分子プローブの膵臓への集積量の略２倍であった。
また、上記表２、図２Ａ及びＢに示すように、比較例の上記式(３４)の分子プローブは、時間が経過とともに甲状腺への集積が増加し、生体内での脱ヨウ素代謝がみられるのに対し、上記式(３１)の分子プローブでは、上記表１、図１Ａ及びＢに示すように、甲状腺への集積の増加、つまり、生体内での脱ヨウ素代謝がみられなかった。以上のことから、[125I]3-iodobenzoyl基で標識した上記式(３１)の分子プローブは、[125I]3-(3-iodo-4-hydroxyphenyl)propanoyl基で標識した比較例の上記式(３４)の分子プローブと比べて、膵β細胞のイメージング、とりわけ、膵β細胞の非侵襲的イメージングにより適しているといえる。
実施例１の分子プローブ、及び比較例の分子プローブの体内分布実験により得られた集積量に基づき、各プローブについての膵臓／肝臓比（膵臓の集積量／肝臓の集積量）を下記表３に、膵臓／腎臓比（膵臓の集積量／腎臓の集積量）を下記表４に示す。
上記表３及び４に示すように、実施例１の分子プローブ（上記式(３１)の分子プローブ）は、比較例の分子プローブと比較して顕著に膵臓／肝臓比及び膵臓／腎臓比が経時的に高くなった。特に、投与後３０分〜６０分の時間帯では、実施例１の分子プローブ（上記式(３１)の分子プローブ）は比較例の分子プローブに対して６倍を超える膵臓／肝臓比を示した。このように膵臓の周辺臓器に対する膵臓への集積量の比率が高く、また膵臓の周辺臓器への集積が少ない本実施例１の分子プローブによれば、イメージングした際に、明瞭な膵臓の画像が得られることが示唆された。
［blocking実験］
実施例１で調製した分子プローブ（上記式(３１)の分子プローブ）を用い、blocking実験を行った。マウスは、６週齢ｄｄＹマウス（雄性、体重約３０ｇ）を使用した。
実施例１で調製した分子プローブ（上記式(３１)の分子プローブ）を用い、blocking実験を行った。マウスは、６週齢ｄｄＹマウス（雄性、体重約３０ｇ）を使用した。
まず、無麻酔下のマウスに、標識していないＥｘｅｎｄｉｎ（９−３９）（コールドプローブ、配列番号３７）を静脈注射により前投与した（０．５ｍｇ／ｍＬを０．１ｍＬ）。前投与から３０分後に、調製した上記式(３１)の分子プローブ（５μＣｉ）を静脈注射により投与した。分子プローブの投与から３０分後に各臓器を摘出した（ｎ＝５）。各臓器の重量と放射能とを測定し、単位重量あたりの放射能から集積量（%dose/g）を算出した。その結果の一例を図３に示す。
H2N-DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (37) （配列番号３７）
H2N-DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (37) （配列番号３７）
コントロールとして、コールドプローブを前投与することなく、調製した上記式(３１)の分子プローブ（５μＣｉ）を無麻酔下のマウスに静脈注射により投与した。投与から３０分後に各臓器を摘出した（ｎ＝５）。各臓器の重量と放射能とを測定し、単位重量あたりの放射能から集積量（%dose/g）を算出した。その結果の一例を前投与した結果とあわせて図３に示す。
図３は、前投与ありの集積量（%dose/g）及びコントロール（前投与なし）の集積量（%dose/g）を示すグラフである。図３に示すように、コールドプローブを前投与してＧＬＰ−１受容体への結合を阻害することにより、上記式(３１)の分子プローブの膵臓への取り込みが約９２．２％阻害されたことが観察された。したがって、上記式(３１)の分子プローブは、ＧＬＰ−１受容体、特に膵島のＧＬＰ−１受容体に特異的に結合しているといえる。
［２次元イメージング解析］
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの遺伝的バックグラウンドを有し、かつ、ＭＩＰ（mouse insulin I gene promoter）の制御下でＧＦＰ（green fluorescent protein）を発現するトランスジェニックマウス（以下、「ＭＩＰ−ＧＦＰマウス」という）を使用し、２次元イメージング解析を行った。まず、調製した上記式(３１)の分子プローブ（１μＣｉ）を無麻酔のＭＩＰ−ＧＦＰマウス（雄性、体重２０ｇ）に静脈注射により投与し、投与３０分後及び６０分後に膵臓を摘出した（ｎ＝２）。摘出した膵臓から切片を切り出し、切片をスライドガラス上に置き、その上にカバーガラスを載せた。切片の蛍光及び放射能（オートラジオグラフィー）は、画像解析装置（商品名：Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４１０、ＧＥヘルスケア社製）を用いて測定した（露光時間：１４時間）。その結果の一例を図４に示す。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの遺伝的バックグラウンドを有し、かつ、ＭＩＰ（mouse insulin I gene promoter）の制御下でＧＦＰ（green fluorescent protein）を発現するトランスジェニックマウス（以下、「ＭＩＰ−ＧＦＰマウス」という）を使用し、２次元イメージング解析を行った。まず、調製した上記式(３１)の分子プローブ（１μＣｉ）を無麻酔のＭＩＰ−ＧＦＰマウス（雄性、体重２０ｇ）に静脈注射により投与し、投与３０分後及び６０分後に膵臓を摘出した（ｎ＝２）。摘出した膵臓から切片を切り出し、切片をスライドガラス上に置き、その上にカバーガラスを載せた。切片の蛍光及び放射能（オートラジオグラフィー）は、画像解析装置（商品名：Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４１０、ＧＥヘルスケア社製）を用いて測定した（露光時間：１４時間）。その結果の一例を図４に示す。
コントロール１−１として、標識化していないｅｘｅｎｄｉｎ（９−３９）（コールドプローブ）を無麻酔のＭＩＰ−ＧＦＰマウス（雄性、体重２０ｇ）に静脈注射により前投与した（０．５ｍｇ／ｍＬを０．１ｍＬ）。前投与から３０分後に上記式(３１)の分子プローブ（１μＣｉ）を静脈注射により投与し、上記式(３１)の分子プローブの投与から３０分後に膵臓を摘出した（ｎ＝２）。摘出した膵臓から切片を切り出し、得られた切片について、上記と同様にして蛍光及び放射能の測定を行った。
また、コントロール１−２として、ＤＰＰ（ジペプチジルペプチダーゼ）ＩＶ阻害薬を無麻酔のＭＩＰ−ＧＦＰマウス（雄性、体重２０ｇ）に静脈注射により投与した（６ｍｇ／ｍＬを０．１ｍＬ）。ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の投与から３０分後にＧＬＰ−１を投与し（０．５ｍｇ／ｍＬを０．１ｍＬ）、その直後に上記式(３１)の分子プローブ（１μＣｉ）を静脈注射により投与した。上記式(３１)の分子プローブの投与から３０分後に膵臓を摘出した（ｎ＝２）。摘出した膵臓から切片を切り出し、得られた切片について、上記と同様にして蛍光及び放射能の測定を行った。コントロール１−１及び１−２の結果の一例を、上記実施例１の結果とあわせて図４に示す。
図４は、上記式(３１)の分子プローブを投与したＭＩＰ−ＧＦＰマウスの膵島切片のイメージ解析の結果の一例を示し、上記式(３１)の分子プローブ投与後３０分の切片、上記式(３１)の分子プローブ投与後６０分の切片、コントロール１−１の切片及びコントロール１−２の切片についての蛍光シグナル（ａ）及び放射性シグナル（ｂ）を示す画像である。
図４（ａ）に示すように、いずれのＭＩＰ−ＧＦＰマウスの膵臓切片においても、画像解析装置によって蛍光ＧＦＰシグナルが観察された。図４（ｂ）に示すように、上記式(３１)の分子プローブを投与する前にコールドプローブを投与したコントロール１−１の切片及びＧＬＰ−１を投与したコントロール１−２の切片からは放射性シグナルはほとんど検出されなかった。このことから、コールドプローブ又はＧＬＰ−１を投与して受容体への結合を阻害することにより、上記式(３１)の分子プローブの取り込みが阻害されたことが観察できた。また、図４（ａ）及び（ｂ）に示すように、標識化された上記式(３１)の分子プローブから検出された放射性シグナルの局在性は、ＧＦＰシグナルと一致していた。このことから、上記式(３１)の分子プローブが、膵β細胞に特異的に集積することが確認できた。
ここで、１２５Ｉ、１２３Ｉ及び１３１Ｉはいずれもγ線放出核種である。さらに、１２５Ｉ及び１２３Ｉは核スピン数も同一である。これらのことから、上記式(３１)の分子プローブの標識化に使用する放射性ヨウ素原子（１２５Ｉ）を、１２３Ｉ又は１３１Ｉとした場合であっても、上記式(３１)の分子プローブとほぼ同様の挙動を示すことが推測される。また、１２４Ｉとした場合であっても、上記式(３１)の分子プローブとほぼ同様の挙動を示すと推測される。したがって、上記式(３１)の分子プローブの１２５Ｉを、１２３Ｉ、１２４Ｉ又は１３１Ｉとした分子プローブを使用することにより、例えば、ＳＰＥＣＴやＰＥＴ等での膵β細胞の非侵襲の三次元イメージング、好ましくは膵β細胞の定量が可能なことが示唆された。
（実施例２）
配列番号５のＮ末端のα−アミノ基が、[125I]3-iodobenzoyl基で標識され、かつ、Ｃ末端のカルボキシル基がアミド化されている下記式(３５)の分子プローブ（配列番号３５）を用いてマウスの体内分布の測定を行った。下記式(３５)の分子プローブは、標識化するアミノ基をＮ末端のα−アミノ基とした以外は、実施例１と同様に調製した。
配列番号５のＮ末端のα−アミノ基が、[125I]3-iodobenzoyl基で標識され、かつ、Ｃ末端のカルボキシル基がアミド化されている下記式(３５)の分子プローブ（配列番号３５）を用いてマウスの体内分布の測定を行った。下記式(３５)の分子プローブは、標識化するアミノ基をＮ末端のα−アミノ基とした以外は、実施例１と同様に調製した。
［体内分布］
調製した上記式(３５)の分子プローブ（０．５８μＣｉ）を無麻酔の６週齢ｄｄＹマウス（雄性、体重３０ｇ）に静脈注射（尾静脈）により投与した。投与５分後、１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後に各臓器を摘出した（ｎ＝５）。各臓器の重量と放射能とを測定し、単位重量あたりの放射能から集積量（%dose/g）を算出した。その結果の一例を下記表５、図５Ａ及びＢに示す。図５Ａは、各臓器への分子プローブの集積の経時変化を示すグラフであり、図５Ｂは、図５Ａを拡大したグラフである。
調製した上記式(３５)の分子プローブ（０．５８μＣｉ）を無麻酔の６週齢ｄｄＹマウス（雄性、体重３０ｇ）に静脈注射（尾静脈）により投与した。投与５分後、１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後に各臓器を摘出した（ｎ＝５）。各臓器の重量と放射能とを測定し、単位重量あたりの放射能から集積量（%dose/g）を算出した。その結果の一例を下記表５、図５Ａ及びＢに示す。図５Ａは、各臓器への分子プローブの集積の経時変化を示すグラフであり、図５Ｂは、図５Ａを拡大したグラフである。
上記表５、図５Ａ及びＢに示すとおり、上記式(３５)の分子プローブの膵臓への集積は、投与後５分で１４．３%dose/g、投与後１５分で２２．０%dose/g、投与後３０分で２７．９%dose/g、投与後６０分で２７．５%dose/g、投与後１２０分で２９%dose/gであった。上記式(３５)の分子プローブは、投与後１５分〜１２０分の時間帯において、肺を除けば、膵臓に最も多く集積し、膵臓への集積が２０%dose/gを超えるレベルで維持された。また、いずれの時間帯においても、胃への集積量に対する膵臓への集積量が３倍以上であり、腸への集積量に対する膵臓への集積量が１１倍以上であった。また、投与後６０〜１２０分の時間帯では、肝臓への集積量に対する膵臓への集積量は２倍以上であった。つまり、上記式(３５)の分子プローブは、膵臓に特異的に集積したといえる。また、甲状腺への集積に大きな変化が見られないことから、生体内で上記式(３５)の分子プローブが脱ヨウ素代謝を受けていないことが示唆された。これにより、上記式(３５)の分子プローブは、膵β細胞のイメージング、とりわけ、膵β細胞の非侵襲的イメージングに適していると考えられる。
上記表３及び４に示すように、実施例２の分子プローブ（上記式(３５)の分子プローブ）は、比較例の分子プローブと比較して顕著に膵臓／肝臓比及び膵臓／腎臓比が経時的に高くなった。このように膵臓の周辺臓器に対する膵臓への集積量の比率が高く、また膵臓の周辺臓器への集積が少ない本実施例２の分子プローブによれば、イメージングした際に、明瞭な膵臓の画像が得られることが示唆された。
［２次元イメージング解析］
調製した上記式(３５)の分子プローブ（０．８μＣｉ）を無麻酔のＭＩＰ−ＧＦＰマウス（雄性、体重２０ｇ）に静脈注射により投与し、投与３０分後及び６０分後に膵臓を摘出した（ｎ＝２）。摘出した膵臓から切片を切り出し、切片をスライドガラス上に置き、その上にカバーガラスを載せた。切片の蛍光及び放射能（オートラジオグラフィー）は、画像解析装置（商品名：Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４１０、ＧＥヘルスケア社製）を用いて測定した（露光時間：１８時間）。その結果の一例を図６に示す。
調製した上記式(３５)の分子プローブ（０．８μＣｉ）を無麻酔のＭＩＰ−ＧＦＰマウス（雄性、体重２０ｇ）に静脈注射により投与し、投与３０分後及び６０分後に膵臓を摘出した（ｎ＝２）。摘出した膵臓から切片を切り出し、切片をスライドガラス上に置き、その上にカバーガラスを載せた。切片の蛍光及び放射能（オートラジオグラフィー）は、画像解析装置（商品名：Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４１０、ＧＥヘルスケア社製）を用いて測定した（露光時間：１８時間）。その結果の一例を図６に示す。
コントロール２として、標識化していないｅｘｅｎｄｉｎ（９−３９）（コールドプローブ）を無麻酔のＭＩＰ−ＧＦＰマウス（雄性、体重２０ｇ）に静脈注射により前投与した（０．５ｍｇ／ｍＬを０．１ｍＬ）。前投与から３０分後に上記式(３５)の分子プローブ（０．８μＣｉ）を静脈注射により投与し、上記式(３５)の分子プローブの投与から３０分後に膵臓を摘出した（ｎ＝２）。摘出した膵臓から切片を切り出し、得られた切片について、上記と同様にして蛍光及び放射能の測定を行った。その結果の一例を、上記実施例２の結果とあわせて図６に示す。
図６は、上記式(３５)の分子プローブを投与したＭＩＰ−ＧＦＰマウスの膵島切片のイメージ解析の結果の一例を示し、上記式(３５)の分子プローブ投与後３０分の切片、上記式(３５)の分子プローブ投与後６０分の切片、コントロール２の切片についての蛍光シグナル（ａ）及び放射性シグナル（ｂ）を示す画像である。
図６（ａ）に示すように、いずれのＭＩＰ−ＧＦＰマウスの膵臓切片においても、画像解析装置によって蛍光ＧＦＰシグナルが観察された。図６（ｂ）に示すように、上記式(３５)の分子プローブを投与する前にコールドプローブを投与したコントロール２の切片からは放射性シグナルはほとんど検出されなかった。このことから、コールドプローブを前投与してＧＬＰ−１受容体への結合を阻害することにより、上記式(３５)の分子プローブの取り込みが阻害されたことが観察できた。また、図６（ａ）及び（ｂ）に示すように、標識化された上記式(３５)の分子プローブから検出された放射性シグナルの局在性は、ＧＦＰシグナルと一致していた。このことから、上記式(３５)の分子プローブが、膵β細胞に特異的に集積することが確認できた。
ここで、１２５Ｉ、１２３Ｉ及び１３１Ｉはいずれもγ線放出核種である。さらに、１２５Ｉ及び１２３Ｉは核スピン数も同一である。これらのことから、上記式(３５)の分子プローブの標識化に使用する放射性ヨウ素原子（１２５Ｉ）を、１２３Ｉ又は１３１Ｉとした場合であっても、上記式(３５)の分子プローブとほぼ同様の挙動を示すことが推測される。また、１２４Ｉとした場合であっても、上記式(３５)の分子プローブとほぼ同様の挙動を示すと推測される。したがって、上記式(３５)の分子プローブの１２５Ｉを、１２３Ｉ、１２４Ｉ又は１３１Ｉとした分子プローブを使用することにより、例えば、ＳＰＥＣＴやＰＥＴ等での膵β細胞の非侵襲の三次元イメージング、好ましくは膵β細胞の定量が可能なことが示唆された。
これらの結果より、本発明のイメージング用分子プローブであれば、ヒトにおいて非侵襲的膵臓の三次元イメージング、とりわけ非侵襲的膵β細胞の三次元イメージングが可能なことが示唆された。
（実施例３）
配列番号１の第４番目のリジン残基の側鎖のアミノ基が、[123I]3-iodobenzoyl基で標識され（以下、「[123I]ＩＢ標識」とも言う）、かつ、Ｃ末端のカルボキシル基がアミド化されている下記式(３６)の分子プローブ（配列番号３６）を用いてマウスの体内分布の測定を行った。まず、下記式(３６)の分子プローブは、［125I］ＳＩＢに替えて［123I］ＳＩＢを使用した以外は上記式(３３)の分子プローブ前駆体を用いて上記式(３１)の分子プローブと同様の方法で調製した。
配列番号１の第４番目のリジン残基の側鎖のアミノ基が、[123I]3-iodobenzoyl基で標識され（以下、「[123I]ＩＢ標識」とも言う）、かつ、Ｃ末端のカルボキシル基がアミド化されている下記式(３６)の分子プローブ（配列番号３６）を用いてマウスの体内分布の測定を行った。まず、下記式(３６)の分子プローブは、［125I］ＳＩＢに替えて［123I］ＳＩＢを使用した以外は上記式(３３)の分子プローブ前駆体を用いて上記式(３１)の分子プローブと同様の方法で調製した。
［三次元イメージング］
調製した上記式(３６)の分子プローブを用いてマウスのＳＰＥＣＴ撮像を行った。調製した上記式(３６)の分子プローブ（４９８μＣｉ）を麻酔した５週齢ｄｄｙマウス（雄性、体重２５ｇ）に静脈注射により投与した。ＳＰＥＣＴ撮像を行った。ＳＰＥＣＴ撮像は、ガンマカメラ（製品名：ＳＰＥＣＴ２０００Ｈ−４０、日立メディコ製）を用いて、下記の撮像条件で投与後３０分から２１分間撮像を行った。得られた画像を、下記の再構成条件で再構成処理を行った。
撮像条件
コリメータ ：ＬＥＰＨ ｐｉｎｈｏｌｅコリメータ
検出器の収集角度：１１．２５°／４０秒で３６０°
収集時間 ：４０秒×３２フレーム、２１分間
再構成条件
前処理フィルタ：Butterworthフィルタ（order：１０、cutoff周波数：０．１２）
調製した上記式(３６)の分子プローブを用いてマウスのＳＰＥＣＴ撮像を行った。調製した上記式(３６)の分子プローブ（４９８μＣｉ）を麻酔した５週齢ｄｄｙマウス（雄性、体重２５ｇ）に静脈注射により投与した。ＳＰＥＣＴ撮像を行った。ＳＰＥＣＴ撮像は、ガンマカメラ（製品名：ＳＰＥＣＴ２０００Ｈ−４０、日立メディコ製）を用いて、下記の撮像条件で投与後３０分から２１分間撮像を行った。得られた画像を、下記の再構成条件で再構成処理を行った。
撮像条件
コリメータ ：ＬＥＰＨ ｐｉｎｈｏｌｅコリメータ
検出器の収集角度：１１．２５°／４０秒で３６０°
収集時間 ：４０秒×３２フレーム、２１分間
再構成条件
前処理フィルタ：Butterworthフィルタ（order：１０、cutoff周波数：０．１２）
その結果の一例を図７に示す。画像は分子プローブ投与３０分後のものである（積算時間：２０分）。図７Ａは横断像（transverse view）であり、図７Ｂは冠状断像（coronal view）であり、図７Ｃはの矢状断像（sagittal view）である。図７Ａ〜Ｃにおいて膵臓の位置は矢印で示される。なお、図７Ａ〜Ｃのコントラストは同一である。
図７に示すとおり、上記式(３６)の分子プローブを用いることによって、マウスにおいて非侵襲的に膵臓の位置を確認することができた。つまり、本発明の分子プローブによって非侵襲的な膵島の三次元イメージングが可能であることが確認できた。
このように、ヒトよりも膵臓のサイズが小さく、かつ、臓器が密集しているマウスにおいて非侵襲的に膵臓の位置を確認できたことから、マウスよりも膵臓のサイズが大きく、かつ、臓器が密集していないヒトであれば、例えば、膵島の位置、膵臓のサイズをより明確に判別でき、さらには、膵臓におけるプローブの発現量を測定できることが示唆された。したがって、本発明のイメージング用分子プローブであれば、ヒトにおいて非侵襲的膵臓の三次元イメージング、とりわけ非侵襲的膵β細胞の三次元イメージングが可能なことが示唆された。
以上説明したとおり、本発明は、例えば、医療分野、分子イメージングの分野、糖尿病に関する分野などで有用である。
配列番号１〜１２：本発明のイメージング用分子プローブのアミノ酸配列
配列番号１３〜２４：本発明のイメージング用分子プローブ前駆体のアミノ酸配列
配列番号２５〜２８：本発明の標識方法に使用するペプチドのアミノ酸配列
配列番号２９〜３０：Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｓｓａｙに使用した分子プローブのアミノ酸配列
配列番号３１：実施例１のイメージング用分子プローブのアミノ酸配列
配列番号３２：実施例１のイメージング用分子プローブの製造に用いるポリペプチドのアミノ酸配列
配列番号３３：実施例１のイメージング用分子プローブの製造に用いる分子プローブ前駆体のアミノ酸配列
配列番号３４：比較例の分子プローブのアミノ酸配列
配列番号３５：実施例２のイメージング用分子プローブのアミノ酸配列
配列番号３６：実施例３のイメージング用分子プローブのアミノ酸配列
配列番号３７：Ｅｘｅｎｄｉｎ−（９−３９）のアミノ酸配列
配列番号１３〜２４：本発明のイメージング用分子プローブ前駆体のアミノ酸配列
配列番号２５〜２８：本発明の標識方法に使用するペプチドのアミノ酸配列
配列番号２９〜３０：Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｓｓａｙに使用した分子プローブのアミノ酸配列
配列番号３１：実施例１のイメージング用分子プローブのアミノ酸配列
配列番号３２：実施例１のイメージング用分子プローブの製造に用いるポリペプチドのアミノ酸配列
配列番号３３：実施例１のイメージング用分子プローブの製造に用いる分子プローブ前駆体のアミノ酸配列
配列番号３４：比較例の分子プローブのアミノ酸配列
配列番号３５：実施例２のイメージング用分子プローブのアミノ酸配列
配列番号３６：実施例３のイメージング用分子プローブのアミノ酸配列
配列番号３７：Ｅｘｅｎｄｉｎ−（９−３９）のアミノ酸配列
Claims (13)
- 膵島のイメージングに用いられる分子プローブであって、
下記式(１)〜(１２)のいずれかで表されるポリペプチド、
下記式(１)〜(１２)のポリペプチドから１〜数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換したポリペプチドであって、膵島に結合可能なポリペプチド、又は、
下記式(１)〜(１２)のポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するポリペプチドであって、膵島に結合可能なポリペプチドを含む、膵島イメージング用分子プローブ。
Z-DLSXQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (1) （配列番号１）
Z-LSXQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (2) （配列番号２）
Z-SXQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (3) （配列番号３）
Z-XQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (4) （配列番号４）
Z-DLSKQMEEEAVRLFIEWLXNGGPSSGAPPPS-NH2 (5) （配列番号５）
Z-LSKQMEEEAVRLFIEWLXNGGPSSGAPPPS-NH2 (6) （配列番号６）
Z-SKQMEEEAVRLFIEWLXNGGPSSGAPPPS-NH2 (7) （配列番号７）
Z-KQMEEEAVRLFIEWLXNGGPSSGAPPPS-NH2 (8) （配列番号８）
B-DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (9) （配列番号９）
B-LSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (10) （配列番号１０）
B-SKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (11) （配列番号１１）
B-KQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (12) （配列番号１２）
［上記式(１)〜(８)において、「Z-」は、Ｎ末端のα−アミノ基が、非修飾であるか、又は、電荷を有さない修飾基により修飾されていることを示し、「X」は、側鎖のアミノ基が、下記式（I）で表される芳香環を含む基によって標識されたリジン残基を示し、
上記式(９)〜(１２)において、「B-」は、Ｎ末端のα−アミノ基が、下記式（I）で表される芳香環を含む基によって標識されていることを示し、
上記式(１)〜(１２)において、「-NH2」は、Ｃ末端のカルボキシル基が、アミド化されていることを示す。］
- 前記芳香環を含む基は、下記式（II）で表される基である、請求項１記載の膵島イメージング用プローブ。
- 膵島のイメージングを行うためのキットであって、
請求項１又は２に記載の膵島イメージング用分子プローブを含む、キット。 - 前記膵島イメージング用分子プローブを注射液の形態で含有する、請求項３記載のキット。
- 膵島のイメージングを行うための試薬であって、
請求項１又は２に記載の膵島イメージング用分子プローブを含む、膵島イメージング用試薬。 - 膵島のイメージング方法であって、
請求項１又は２に記載の膵島イメージング用分子プローブを投与された被検体から前記膵島イメージング用分子プローブのシグナルを検出することを含む、膵島のイメージング方法。 - さらに、前記膵島イメージング用分子プローブを用いた膵島イメージングの結果から膵島の状態を判定することを含む、請求項６記載の膵島のイメージング方法。
- 請求項１又は２に記載の膵島イメージング用分子プローブを投与された被検体から前記膵島イメージング用分子プローブのシグナルを検出すること、及び、
検出した膵島イメージング用分子プローブのシグナルから膵島量を算出することを含む、膵島量の測定方法。 - さらに、算出した膵島量を提示することを含む、請求項８記載の膵島量の測定方法。
- 請求項１又は２に記載の膵島イメージング用分子プローブの製造方法であって、
膵島イメージング用分子プローブ前駆体を標識化及び脱保護することを含み、
前記膵島イメージング用分子プローブ前駆体が、
下記式(１３)〜(２４)のいずれかで表されるポリペプチド、
下記式(１３)〜(２４)のポリペプチドから１〜数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換したポリペプチドであって、標識化及び脱保護後に膵島に結合可能なポリペプチド、又は、
下記式(１３)〜(２４)のポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するポリペプチドであって、標識化及び脱保護後に膵島に結合可能なポリペプチドを含む、膵島イメージング用分子プローブ前駆体である、膵島イメージング用分子プローブの製造方法。
*-DLSKQMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (13) （配列番号１３）
*-LSKQMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (14) （配列番号１４）
*-SKQMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (15) （配列番号１５）
*-KQMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (16) （配列番号１６）
*-DLSK* QMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (17) （配列番号１７）
*-LSK* QMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (18) （配列番号１８）
*-SK* QMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (19) （配列番号１９）
*-K* QMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (20) （配列番号２０）
DLSK* QMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (21) （配列番号２１）
LSK* QMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (22) （配列番号２２）
SK* QMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (23) （配列番号２３）
K* QMEEEAVRLFIEWLK* NGGPSSGAPPPS-NH2 (24) （配列番号２４）
［上記式(１３)〜(２０)において、「*-」は、Ｎ末端のα−アミノ基が保護基により保護されているか又は電荷を有さない修飾基により修飾されていることを示し、
上記式(１３)〜(２４)において、「K*」は、リジンの側鎖のアミノ基が保護基により保護されていることを示し、「-NH2」は、Ｃ末端のカルボキシル基がアミド化されていることを示す。］ - 前記膵島イメージング用分子プローブ前駆体の標識化が、下記式（I）で表される芳香環を含む基を有する標識化合物により標識化することを含む、請求項１０記載の膵島イメージング用分子プローブの製造方法。
- 放射性標識可能な官能基を側鎖に有するアミノ酸を複数個有するペプチドを放射性標識する方法であって、
Ｎ末端のα−アミノ基及び側鎖の官能基が保護基によって保護された保護アミノ酸を用いてペプチドの合成を行うこと、
合成したペプチドの放射性標識可能なアミノ酸の側鎖の官能基のうち放射性標識を行わない官能基の保護基を脱保護すること、
脱保護したアミノ酸の側鎖の官能基を、脱保護前の保護基とは異なる保護基によって再度の保護を行うこと、
前記再度の保護を行ったアミノ酸の側鎖の官能基以外の官能基の保護基を脱保護して放射性標識を行うペプチドを得ること、
得られたペプチドを標識化合物を用いて放射性標識すること、及び、
放射性標識したペプチドの保護基を脱保護することを含む、標識方法。 - 放射性標識されたペプチドを製造する方法であって、
前記ペプチドは、放射性標識可能な官能基を側鎖に有するアミノ酸を複数個有し、
前記方法は、
Ｎ末端のα−アミノ基及び側鎖の官能基が保護基によって保護された保護アミノ酸を用いて放射性標識するペプチドを合成すること、
合成したペプチドの放射性標識可能なアミノ酸の側鎖の官能基のうち放射性標識を行わない官能基の保護基を脱保護すること、
脱保護したアミノ酸の側鎖の官能基を、脱保護前の保護基とは異なる保護基によって再度の保護を行うこと、
前記再度の保護を行ったアミノ酸の側鎖の官能基以外の官能基の保護基を脱保護して放射性標識を行うペプチドを得ること、
得られたペプチドを標識化合物を用いて放射性標識すること、及び、
放射性標識したペプチドの保護基を脱保護することを含む、製造方法。
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