JPWO2010137489A1 - 特性の改変されたグルコースデヒドロゲナーゼ - Google Patents

Abstract

【課題】高い熱安定性と基質特異性を有するグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）であって、かつ補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を用いた場合の基質に対する親和性が高いＧＤＨを提供すること。【解決手段】高い熱安定性および厳密な基質特異性を有するＧＤＨを超好熱性始原菌サーモプロテウス・エスピー・ＧＤＨ１株より取得した。また、該ＧＤＨの特定の位置のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することによってＮＡＤを補酵素として使用した際のグルコースに対する親和性の向上した変異型ＧＤＨを得ることに成功した。【選択図】なし

Description

本発明は、グルコース濃度を測定する試薬及びグルコースセンサに利用することのできるグルコースデヒドロゲナーゼに関する。また、該酵素の製造方法、並びに該酵素を用いたグルコース定量用組成物及びグルコースセンサに関する。

ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）もしくはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を補酵素として働くＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４７、以下グルコースデヒドロゲナーゼをＧＤＨ、またＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼをＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨとも記す）は、主に血中グルコース濃度測定に用いられる酵素であり、以下の反応を触媒する。

Ｄ−グルコース ＋ ＮＡＤ（Ｐ） → Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン ＋ ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ

このような血中グルコース定量用酵素としては、他にグルコースオキシダーゼが知られているが、本酵素は分子状酸素を電子受容体としうるため、グルコース濃度を測定する際に溶存酸素濃度の影響を受けるという問題点が指摘されている。グルコースデヒドロゲナーゼは、このような溶存酸素の影響がないことから、近年のグルコースセンサ用酵素の主流となっている。ＧＤＨには、ＮＡＤ（Ｐ）依存型のほかにピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）依存型、フラビン依存型が存在する。アシネトバクター・バウマンニ由来のものに代表されるＰＱＱ依存型ＧＤＨは、マルトースに対してもグルコースと同等の反応性を有しているなど、基質特異性に問題がある。また、フラビン依存型ＧＤＨとしては例えばアスペルギルス・テレウス由来のものが知られており、ＰＱＱ依存型ＧＤＨと比して基質特異性はより厳密であるが、しかしながらキシロースに対して対グルコース比約９％の反応性を有していて、必ずしも十分な基質特異性とはいえない。また、温度安定性としても５０℃程度を限度としており、十分ではない。

公知のＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨとしては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属バクテリア由来のものが良く知られ、例えばバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）などがＧＤＨ産生菌として報告されている。これらのバクテリア由来ＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨについても、依然キシロース等に対する作用性を有する、あるいは熱安定性に乏しいといった問題を含んでいた。

特許文献１には、４種類のＢ．メガテリウム由来ＧＤＨアイソザイムの各特性が記載され、これらの１００ｍＭキシロースに対する反応性は対グルコース比（％）に換算してそれぞれＧＤＨ（Ｉ）が１２、ＧＤＨ（ＩＩ）が３．５、ＧＤＨ（ＩＩＩ）が１．８、ＧＤＨ（ＩＶ）が７．１である。最もキシロースに対する反応性の低いＧＤＨ（ＩＩＩ）については、ＮａＣｌ非存在下では４０℃２０分の加温処理で完全に活性を失い、熱安定性に乏しい。このＧＤＨ（ＩＩＩ）は２Ｍという非常に高濃度のＮａＣｌが存在するという限定的な条件においては熱安定性が向上するものの、その場合においても７０℃２０分の熱処理で完全に活性が失われるなど、必ずしも十分ではない。

安定性の問題に関しては、例えば特許文献２にはＢ．メガテリウム由来ＧＤＨの特定のアミノ酸残基を置換することにより熱安定性が向上した旨記載されるが、十分な熱安定性を発揮するには非常に高濃度の無機塩を添加する必要があり、最も高い熱安定性を示すＧＤＨにおいても塩化ナトリウム非存在下では約７５℃で２０分間の熱処理により完全に活性を失う。塩化ナトリウムやマレイン酸ナトリウム等に代表される塩の存在がＮＡＤの分解を促進することが知られていることから、ＧＤＨの安定化を図るために高濃度の塩化ナトリウムを添加することは実用上好ましくなく、塩化ナトリウム非存在下において十分な熱安定性を有するＧＤＨが有利である。

また特許文献３にはＢ．メガテリウム由来ＧＤＨを含む複数種類のＧＤＨのキメラを作製することにより塩化ナトリウム非存在下での熱安定性の向上したＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨについて記載されているものの、基質特異性の問題を解消する意図はなく、また該キメラＧＤＨは耐アルカリ性に優れる一方でｐＨ７．５を下回る中性及び酸性ｐＨ領域における安定性が十分でないという別の問題をかかえている。酸化型補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）はアルカリ性領域において極めて不安定であることが知られており、これら酸化型補酵素の安定性を担保するために通常は中性付近もしくはそれ以下のｐＨでグルコース定量用組成物を作製することを考えれば実用上極めて不利である。

１９８６年にはスルフォロバス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｒｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）由来（非特許文献１）、１９８９年にはサーモプラズマ・アシドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）由来（非特許文献２）、また１９９７年にはサーモプロテウス・テナックス（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ ｔｅｎａｘ）由来（非特許文献３）のＧＤＨがそれぞれ報告されている。

こうした超好熱菌由来ＧＤＨを利用するにあたっては、上記に例示するＧＤＨのように耐熱性を高めるべく機能改変を実施する必要がない点において有利である。しかしながら、これら酵素は熱安定性に優れている一方で、バクテリア由来のものと比して基質特異性が劣るという問題点を含んでいる。Ｓ．ソルファタリカス由来のＧＤＨについては、ＮＡＤＰを補酵素とした場合では基質特異性がブロードになり、基質濃度４０ｍｍｏｌ／Ｌにおいてグルコースよりもガラクトースやキシロースに対する活性のほうが高い。ＮＡＤを補酵素とした場合ではグルコースに対する特異性が比較的高まるものの、依然キシロースに対する活性が対グルコース比２６％程度と高い。またＴ．アシドフィラム由来ＧＤＨは、ＮＡＤＰを補酵素とした際にガラクトースに対して活性を示し、対グルコース比７０％にも及ぶ。さらにＴ．テナックス由来ＧＤＨの場合もキシロースに対して高い反応性を示す。血中グルコース濃度を測定するにあたって、使用するＧＤＨの基質特異性が低くグルコース以外の物質に反応するということはすなわち血糖値測定の正確性を損なう結果となり、極めて不都合である。

上記のように、公知のＧＤＨは、熱安定性及び／または基質特異性において問題を有しており、熱安定性と基質特異性の両特性を同時に充足しうる実用的なＧＤＨはこれまで報告例がなかった。

また、グルコースの定量に際しては、臨床検査用の液状試薬であれば３７℃、簡易型グルコースセンサであれば通常１０℃〜４０℃での測定が想定される。当然ながらグルコース定量に用いる酵素は、これら温度領域における比活性が高いほうがより好ましい。

また、ＮＡＤ（Ｐ）依存型ＧＤＨを用いたグルコースの定量を行うにあたっては、ＧＤＨを含む定量用組成物にＮＡＤもしくはＮＡＤＰを添加する必要があるが、ＮＡＤＰはＮＡＤに比して高価であるため、経済的な理由からよりＮＡＤに対して親和性の高いＧＤＨであることが望ましい。

また、グルコースセンサにおいてグルコースの定量を行うにあたっては、１０℃〜４０℃の温度範囲での使用が想定される。一般に酵素による触媒を介した化学反応は、温度の上昇に伴って反応速度も上昇し、そして一定の温度を超えた条件では酵素の失活に伴って反応速度も急激に低下するという挙動を示す。このような温度依存的な酵素活性の変動は、測定を行う際の外気温度に依存してグルコースの定量値が変動する要因となりうる。これを避けるために、例えばグルコースセンサに温度計を具備し、測定時の温度から計測値を補正する工夫がなされている。しかしながらこのような温度補正機能も、環境温度が定量値に与える影響を十分に解消しえないことが非特許文献４において指摘されている。よって環境温度がグルコースの定量値に与える影響を低減するためには、酵素自体の特性として特に１０℃〜４０℃の温度範囲において酵素活性の変動が小さいことがより望ましい。

特開平４−２５８２８９ 特許第３２２０４７１号 特開２００３−３１０２７４

Ｇｉａｒｄｉｎａ Ｐ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． Ｖｏｌ．２３９ ｐ５１７−５２２ Ｓｍｉｔｈ ＬＤ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． Ｖｏｌ．２６１ ｐ７９３−７９７ Ｓｉｅｂｅｒｓ Ｂ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ａｒｃｈ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｖｏｌ．１６８ ｐ１２０−１２７ 宇野志保ら （２００９） 医学検査 Ｖｏｌ．５８ ｐ７６−７８

野生型ＧＤＨ（配列番号２と同一のアミノ酸配列からなるＧＤＨ）およびＲ２０２Ｓ＋Ｗ３３４Ｇ、Ｄ５８Ｖ＋Ｒ２０２Ｓ＋Ｙ３２８Ｄ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｗ３３４Ｒの各変異型ＧＤＨの熱安定性を示す。縦軸は活性残存率（加温処理前のＧＤＨ活性を１００としたときの、各温度条件で３０分加温処理した後の相対活性；％）、横軸は加温処理時の温度を示す。 Ｒ２０２Ｓ＋Ｗ３３４Ｇ変異型ＧＤＨのｐＨ安定性を示す。縦軸は活性残存率（加温処理前のＧＤＨ活性を１００としたときの、各ｐＨ条件で２５℃１６時間加温した後の相対活性；％）、横軸は反応液のｐＨを示す。但しｐＨ３．６〜６．０は５０ｍＭの酢酸バッファー、ｐＨ６．１〜８．０は５０ｍＭのリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０〜８．９は５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ９．０〜１０．７は５０ｍＭのグリシン−ＮａＯＨバッファーを用いたデータである。 Ｄ５８Ｖ＋Ｒ２０２Ｓ＋Ｙ３２８Ｄ変異型ＧＤＨのｐＨ安定性を示す。縦軸は活性残存率（加温処理前のＧＤＨ活性を１００としたときの、各ｐＨ条件で２５℃１６時間加温した後の相対活性；％）、横軸は反応液のｐＨを示す。但しｐＨ３．６〜６．０は５０ｍＭの酢酸バッファー、ｐＨ６．１〜８．０は５０ｍＭのリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０〜８．９は５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ９．０〜１０．７は５０ｍＭのグリシン−ＮａＯＨバッファーを用いたデータである。 Ｒ２０２Ｓ＋Ｗ３３４Ｒ変異型ＧＤＨのｐＨ安定性を示す。縦軸は活性残存率（加温処理前のＧＤＨ活性を１００としたときの、各ｐＨ条件で２５℃１６時間加温した後の相対活性；％）、横軸は反応液のｐＨを示す。但しｐＨ３．５〜６．０は５０ｍＭの酢酸バッファー、ｐＨ６．１〜８．０は５０ｍＭのリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０〜９．０は５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ９．０〜１０．７は５０ｍＭのグリシン−ＮａＯＨバッファーを用いたデータである。 Ｒ２０２Ｓ＋Ｗ３３４Ｇ変異型ＧＤＨ活性のｐＨ依存性を示す。縦軸は相対活性（活性値最大となる条件の活性を１００とした場合の、各ｐＨ条件での相対活性）、横軸は反応ｐＨを示す。但しｐＨ３．６〜６．０は５０ｍＭの酢酸バッファー、ｐＨ５．９〜７．８は５０ｍＭのリン酸カリウムバッファー、ｐＨ８．０〜８．９は５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ８．８〜１０．４は５０ｍＭのグリシン−ＮａＯＨバッファーを用いたデータである。 Ｄ５８Ｖ＋Ｒ２０２Ｓ＋Ｙ３２８Ｄ変異型ＧＤＨ活性のｐＨ依存性を示す。縦軸は相対活性（活性値最大となる条件の活性を１００とした場合の、各ｐＨ条件での相対活性）、横軸は反応ｐＨを示す。但しｐＨ３．６〜６．１は５０ｍＭの酢酸バッファー、ｐＨ５．９〜７．８は５０ｍＭのリン酸カリウムバッファー、ｐＨ８．０〜８．９は５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ８．８〜１０．４は５０ｍＭのグリシン−ＮａＯＨバッファーを用いたデータである。 Ｒ２０２Ｓ＋Ｗ３３４Ｒ変異型ＧＤＨ活性のｐＨ依存性を示す。縦軸は相対活性（活性値最大となる条件の活性を１００とした場合の、各ｐＨ条件での相対活性）、横軸は反応ｐＨを示す。但しｐＨ３．６〜６．１は５０ｍＭの酢酸バッファー、ｐＨ５．９〜７．８は５０ｍＭのリン酸カリウムバッファー、ｐＨ８．０〜８．９は５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ８．８〜１０．４は５０ｍＭのグリシン−ＮａＯＨバッファーを用いたデータである。 野生型ＧＤＨ（配列番号２と同一のアミノ酸配列からなるＧＤＨ）およびＲ２０２Ｓ＋Ｗ３３４Ｒ変異ＧＤＨの１０℃以上３７℃以下における活性の温度依存的変動を示す。縦軸は相対活性（反応温度３７℃における活性を１００とした場合の、各温度条件での相対活性）、横軸は反応温度を示す。

本発明の目的は、熱安定性の高いＧＤＨであって、なおかつ基質であるグルコースに対する親和性の高いＧＤＨを提供することである。

また、本発明の目的は、熱安定性の高いＧＤＨであって、なおかつＮＡＤに対する親和性の高いＧＤＨを提供することである。

また、本発明の目的は、熱安定性の高いＧＤＨであって、なおかつ３７℃以下の温度領域における比活性の高いＧＤＨを提供することである。

また、本発明の目的は、熱安定性の高いＧＤＨであって、なおかつ温度依存的な活性の変動のより低減されたＧＤＨを提供することである。

また、本発明の目的は、熱安定性および基質特異性の高いＧＤＨであって、かつ３７℃以下の温度領域における比活性が高く、なおかつ補酵素としてのＮＡＤおよび基質としてのグルコースに対する親和性が高くなおかつ温度依存的な活性の変動のより低減されたＧＤＨを提供することである。

本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を行った結果、これらに代わる熱安定性が高くかつＮＡＤに対する親和性の高いＧＤＨを、超好熱性始原菌であるサーモプロテウス・エスピー・ＧＤＨ１株（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐ． ＧＤＨ１）より取得した。
本菌株より取得したＮＡＤ（Ｐ）依存型ＧＤＨは、ＮＡＤを補酵素とした場合にグルコース以外の糖類、すなわちキシロース、ガラクトース、マルトース、ラクトース、ソルビトール、スクロース、マンノースに対して実質的に活性を示さないという点で、公知の超好熱性始原菌由来酵素に比し優位であった。

（１）
ところが、該酵素は、ＮＡＤおよびＮＡＤＰどちらをも補酵素として利用可能であるが、ＮＡＤＰに対する親和性が圧倒的に高く、反応温度６０℃におけるミカエリス定数（Ｋｍ）は、ＮＡＤに対しては１０．３ｍＭである一方、ＮＡＤＰに対しては０．０７５ｍＭであり、１００倍以上の乖離がある。このことから、本酵素は代謝系においては本来ＮＡＤＰを補酵素として利用していると推測される。
しかしながら産業利用を考えた場合、ＮＡＤＰはＮＡＤよりも高価であり、ＮＡＤＰを用いることはすなわちグルコースセンサやグルコース定量用試薬製造におけるコストアップを招くこととなる。また、ＮＡＤに比しＮＡＤＰはより不安定であることからも、補酵素としてはＮＡＤを用いるのがより有利である。
該ＧＤＨはＮＡＤを補酵素とすることも可能ではあるが、ＮＡＤを補酵素とした場合の基質であるグルコースに対するミカエリス定数（Ｋｍ）は約６４ｍＭと高い。例えば血中グルコース濃度の正常値は１１０ｍｇ／ｄｌ未満、すなわちモル濃度に換算すれば約６ｍＭ未満であって、これは該ＧＤＨがＮＡＤを補酵素とした場合のグルコースに対するミカエリス定数の１／１０以下である。酵素の基質に対するミカエリス定数よりも基質濃度が低ければ低いほど酵素の活性は低くなる。これはすなわちＧＤＨを利用したグルコースセンサにおいてグルコースを定量するためのシグナル強度が十分に得られないという不都合を生じる。
またエンドポイント法によるグルコース定量を行う場合、基質に対するミカエリス定数の高い酵素では、サンプル中のグルコースを完全に酸化するのに要する時間が長くなるという欠点がある。本酵素をより実用に適したものとするためには、基質であるグルコースに対するミカエリス定数を低下させ、低濃度グルコースに対しても十分な活性を有するＧＤＨに改変する必要があった。
そこで本発明者らは、次に、サーモプロテウス・エスピー・ＧＤＨ１株より取得した該ＧＤＨタンパク質の改変を試み、該ＧＤＨタンパク質中の特定のアミノ酸残基を置換することにより、ＮＡＤを補酵素とした場合におけるグルコースに対する親和性をさらに高めることに成功し、本発明を完成するに至った。

（２）
あるいはまた、該酵素は、上述したようにＮＡＤに対する親和性が低いことから、グルコースセンサ及びグルコース定量用試薬を作製する際において大量のＮＡＤを要し、その分コストも上乗せされてしまうという問題点を含んでいた。
また、上述の非特許文献１ないし３に記載されている公知の超好熱性始原菌由来ＧＤＨも同様にＮＡＤＰに対する親和性が高いことが報告されていた。
そこで本発明者らは、次に、サーモプロテウス・エスピー・ＧＤＨ１株より取得した該ＧＤＨタンパク質の改変を試み、該ＧＤＨタンパク質中の特定のアミノ酸残基を置換することにより、ＮＡＤに対する親和性をさらに高めることに成功し、本発明を完成するに至った。

（３）
あるいはまた、本酵素は他の超好熱菌由来酵素と同様に３７℃以下の低温領域における活性が低いという問題を含んでいた。該酵素の６０℃における比活性は、ＮＡＤを補酵素とした場合にはＶｍａｘは１６７０Ｕ／ｍｇであるが、反応温度の低下に伴う比活性の低下が顕著であり、３７℃でのＶｍａｘはおよそ２９０Ｕ／ｍｇ程度、また後述する活性測定方法並びにタンパク質定量方法に従って算出した３７℃における比活性は１７２Ｕ／ｍｇである。グルコースを定量する際の温度条件としては、液状のグルコース定量試薬であれば通常３７℃であり、また比色式もしくは電気化学式の簡易型グルコースセンサであれば１０〜４０℃の範囲での使用が想定されることから、３７℃以下における活性がより高いほうが実用上有利である。
そこで本発明者らは、次に、サーモプロテウス・エスピー・ＧＤＨ１株より取得した該ＧＤＨタンパク質の改変を試み、該ＧＤＨタンパク質中の特定のアミノ酸残基を置換することにより、３７℃以下における比活性を高めることに成功し、本発明を完成するに至った。

（４）
あるいはまた、該酵素は、３７℃における活性を１００とした場合の相対活性は、２５℃のときに３３、１０℃の時に４と温度依存的な活性の変動が大きい。
そこで本発明者らは、次に、サーモプロテウス・エスピー・ＧＤＨ１株より取得した該ＧＤＨタンパク質の改変を試み、該ＧＤＨタンパク質中の特定のアミノ酸残基を置換することにより、３７℃以下の温度領域における温度依存的な活性値の変動を低減することに成功し、本発明を完成するに至った。

（５）
また本発明者らは、サーモプロテウス・エスピー・ＧＤＨ１株より取得した該ＧＤＨタンパク質の改変を試み、該ＧＤＨタンパク質中の特定のアミノ酸残基を置換することにより、３７℃以下の温度領域における比活性、ＮＡＤおよびグルコースに対する親和性、並びに３７℃以下の温度領域における温度依存的な活性値の変動の各特性を同時に改変することに成功し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
項１−１．
配列番号２に記載されるアミノ酸配列において２０２番目アルギニンに相当するアミノ酸残基を、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、およびリジンのいずれかに置換してなる、変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
項１−２．
さらに、２０２番目アルギニン以外のアミノ酸残基の１ないし数個が欠失、置換、挿入及び／又は付加されてなる、項１−１に記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
項１−３．
配列番号２に記載されるアミノ酸配列において、５８番目アスパラギン酸、２８６番目バリン、３２８番目チロシン、３３４番目トリプトファン、３３９番目イソロイシン、３４０番目リジン、３４１番目トレオニンおよび３４５番目ロイシンからなる群より選ばれる１ないし数箇所のアミノ酸残基の他の残基への置換をさらに組み合わせてなる、項１−１に記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
項１−４．
配列番号２に記載されるアミノ酸配列において（Ｄ５８Ｖ＋Ｙ３２８Ｄ）、Ｖ２８６Ａ、Ｙ３２８Ｔ、Ｙ３２８Ｅ、Ｗ３３４Ｇ、Ｗ３３４Ｒ、Ｗ３３４Ｈ、Ｗ３３４Ａ、Ｗ３３４Ｋ、Ｉ３３９Ｐ、Ｋ３４０Ｒ、Ｔ３４１Ｒ、Ｔ３４１Ｇ、Ｔ３４１Ｐ、Ｔ３４１Ｍ、Ｔ３４１ＳおよびＬ３４５Ｑからなる群より選ばれる１ないし数種類のアミノ酸置換をさらに組み合わせてなる、項１−１に記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
項１−５．
配列番号２に記載されるアミノ酸配列において２０２番目アルギニンに相当するアミノ酸残基がセリンに置換され、かつ（Ｄ５８Ｖ＋Ｙ３２８Ｄ）、Ｖ２８６Ａ、Ｙ３２８Ｔ、Ｙ３２８Ｅ、Ｗ３３４Ｇ、Ｗ３３４Ｒ、Ｗ３３４Ｈ、Ｗ３３４Ａ、Ｗ３３４Ｋ、Ｉ３３９Ｐ、Ｋ３４０Ｒ、Ｔ３４１Ｒ、Ｔ３４１Ｇ、Ｔ３４１Ｐ、Ｔ３４１Ｍ、Ｔ３４１ＳおよびＬ３４５Ｑからなる群より選ばれる１ないし数種類のアミノ酸置換をさらに組み合わせてなる、項１−１に記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
項２−１．
配列番号２に記載されるアミノ酸配列において２０２番目アルギニンに相当するアミノ酸残基をセリンに置換してなる、グルコースに対する親和性の高い変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
項２−２．
さらに、２０２番目アルギニン以外のアミノ酸残基の１ないし数個が欠失、置換、挿入及び／又は付加されてなる、項２−１に記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
項２−３．
配列番号２に記載されるアミノ酸配列において、さらに３番目アラニン、４６番目イソロイシン、４９番目リジン、５８番目アスパラギン酸、７４番目グリシン、８０番目バリン、８５番目ロイシン、８９番目トレオニン、１２１番目アラニン、１２４番目セリン、１６８番目リジン、１７３番目アラニン、２０６番目セリン、２０８番目リジン、２９４番目ロイシン、２９８番目グルタミン酸、３０３番目ヒスチジン、３０６番目グルタミン酸、３１１番目ロイシン、３２３番目アラニン、３２８番目チロシン、３３０番目グルタミン酸、３３４番目トリプトファン、３３５番目トレオニン、３３８番目アスパラギン酸、３４１番目トレオニン、３４３番目ロイシンおよび３４５番目ロイシンからなる群より選ばれる１ないし数個のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換をさらに組み合わせてなる、項２−１に記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
項２−４．
配列番号２に記載されるアミノ酸配列においてＡ３Ｖ、Ｉ４６Ｖ、Ｋ４９Ｒ、Ｄ５８Ｖ、Ｇ７４Ｄ、Ｖ８０Ａ、Ｌ８５Ｈ、Ｔ８９Ｋ、Ａ１２１Ｔ、Ｓ１２４Ｌ、Ｓ１２４Ｐ、Ｋ１６８Ｅ、Ａ１７３Ｔ、Ｓ２０６Ｎ、Ｋ２０８Ｒ、Ｌ２９４Ｗ、Ｅ２９８Ｇ、Ｈ３０３Ｒ、Ｅ３０６Ｇ、Ｌ３１１Ｐ、Ａ３２３Ｔ、Ｙ３２８Ｄ、Ｙ３２８Ｓ、Ｙ３２８Ｔ、Ｙ３２８Ｖ、Ｙ３２８Ｇ、Ｙ３２８Ｅ、Ｙ３２８Ｌ、Ｅ３３０Ｇ、Ｗ３３４Ｇ、Ｗ３３４Ｒ、Ｗ３３４Ｈ、Ｗ３３４Ａ、Ｗ３３４Ｋ、Ｗ３３４Ｓ、Ｔ３３５Ｎ、Ｄ３３８Ｇ、Ｄ３３８Ｖ、Ｔ３４１Ｒ、Ｔ３４１Ｇ、Ｔ３４１Ｍ、Ｌ３４３Ｐ、Ｌ３４５ＱおよびＬ３４５Ｐからなる群より選ばれる１ないし数種類のアミノ酸置換をさらに組み合わせてなる、項２−１に記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
項２−５．
配列番号２に記載されるアミノ酸配列において２０２番目アルギニンに相当するアミノ酸残基がセリンに置換され、かつＡ３Ｖ、（Ｉ４６Ｖ＋Ｓ１２４Ｐ）、Ｋ４９Ｒ、（Ｄ５８Ｖ＋Ｙ３２８Ｄ）、（Ｇ７４Ｄ＋Ｅ３０６Ｇ＋Ａ３２３Ｔ）、Ｖ８０Ａ、Ｌ８５Ｈ、Ｔ８９Ｋ、Ａ１２１Ｔ、Ｓ１２４Ｌ、（Ｋ１６８Ｅ＋Ｅ３３０Ｇ）、Ａ１７３Ｔ、Ｓ２０６Ｎ、Ｋ２０８Ｒ、Ｌ２９４Ｗ、Ｅ２９８Ｇ、Ｈ３０３Ｒ、Ｌ３１１Ｐ、Ｙ３２８Ｓ、Ｙ３２８Ｔ、Ｙ３２８Ｖ、Ｙ３２８Ｇ、Ｙ３２８Ｅ、Ｙ３２８Ｌ、Ｗ３３４Ｇ、Ｗ３３４Ｒ、Ｗ３３４Ｈ、Ｗ３３４Ａ、Ｗ３３４Ｋ、（Ｗ３３４Ｓ＋Ｔ３３５Ｎ）、Ｄ３３８Ｇ、Ｄ３３８Ｖ、（Ｉ３３９Ｐ＋Ｔ３４１Ｇ）、（Ｉ３３９Ｐ＋Ｔ３４１Ｒ）、（Ｉ３３９Ｐ＋Ｔ３４１Ｌ）、（Ｉ３３９Ｐ＋Ｔ３４１Ｋ）、Ｔ３４１Ｒ、Ｔ３４１Ｇ、Ｔ３４１Ｍ、Ｌ３４３Ｐ、Ｌ３４５ＱおよびＬ３４５Ｐからなる群より選ばれる１種類のアミノ酸置換をさらに組み合わせてなる、項２−１に記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
項３−１．
配列番号２に記載されるアミノ酸配列において２０２番目アルギニンに相当するアミノ酸残基をセリンに置換してなる、３７℃以下における比活性の向上した変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
項３−２．
さらに、２０２番目アルギニン以外のアミノ酸残基の１ないし数個が欠失、置換、挿入及び／又は付加されてなる、項３−１に記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
項３−３．
配列番号２に記載されるアミノ酸配列において、さらに３番目アラニン、４６番目イソロイシン、４９番目リジン、５８番目アスパラギン酸、７４番目グリシン、８０番目バリン、８５番目ロイシン、８９番目トレオニン、１２１番目アラニン、１２４番目セリン、１６８番目リジン、１７３番目アラニン、２０６番目セリン、２０８番目リジン、２９４番目ロイシン、２９８番目グルタミン酸、３０３番目ヒスチジン、３０６番目グルタミン酸、３１１番目ロイシン、３２３番目アラニン、３２８番目チロシン、３３０番目グルタミン酸、３３４番目トリプトファン、３３５番目トレオニン、３３８番目アスパラギン酸、３４１番目トレオニン、３４３番目ロイシンおよび３４５番目ロイシンからなる群より選ばれる１ないし数個のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換をさらに組み合わせてなる、項３−１に記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
項３−４．
配列番号２に記載されるアミノ酸配列においてＡ３Ｖ、Ｉ４６Ｖ、Ｋ４９Ｒ、Ｄ５８Ｖ、Ｇ７４Ｄ、Ｖ８０Ａ、Ｌ８５Ｈ、Ｔ８９Ｋ、Ａ１２１Ｔ、Ｓ１２４Ｌ、Ｓ１２４Ｐ、Ｋ１６８Ｅ、Ａ１７３Ｔ、Ｓ２０６Ｎ、Ｋ２０８Ｒ、Ｌ２９４Ｗ、Ｅ２９８Ｇ、Ｈ３０３Ｒ、Ｅ３０６Ｇ、Ｌ３１１Ｐ、Ａ３２３Ｔ、Ｙ３２８Ｄ、Ｙ３２８Ｓ、Ｙ３２８Ｔ、Ｙ３２８Ｖ、Ｙ３２８Ｇ、Ｙ３２８Ｅ、Ｙ３２８Ｌ、Ｅ３３０Ｇ、Ｗ３３４Ｇ、Ｗ３３４Ｒ、Ｗ３３４Ｈ、Ｗ３３４Ａ、Ｗ３３４Ｋ、Ｗ３３４Ｓ、Ｔ３３５Ｎ、Ｄ３３８Ｇ、Ｄ３３８Ｖ、Ｔ３４１Ｒ、Ｔ３４１Ｇ、Ｔ３４１Ｍ、Ｌ３４３Ｐ、Ｌ３４５ＱおよびＬ３４５Ｐからなる群より選ばれる１ないし数種類のアミノ酸置換をさらに組み合わせてなる、項３−１に記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
項３−５．
配列番号２に記載されるアミノ酸配列において２０２番目アルギニンに相当するアミノ酸残基がセリンに置換され、かつＡ３Ｖ、（Ｉ４６Ｖ＋Ｓ１２４Ｐ）、Ｋ４９Ｒ、（Ｄ５８Ｖ＋Ｙ３２８Ｄ）、（Ｇ７４Ｄ＋Ｅ３０６Ｇ＋Ａ３２３Ｔ）、Ｖ８０Ａ、Ｌ８５Ｈ、Ｔ８９Ｋ、Ａ１２１Ｔ、Ｓ１２４Ｌ、（Ｋ１６８Ｅ＋Ｅ３３０Ｇ）、Ａ１７３Ｔ、Ｓ２０６Ｎ、Ｋ２０８Ｒ、Ｌ２９４Ｗ、Ｅ２９８Ｇ、Ｈ３０３Ｒ、Ｌ３１１Ｐ、Ｙ３２８Ｓ、Ｙ３２８Ｔ、Ｙ３２８Ｖ、Ｙ３２８Ｇ、Ｙ３２８Ｅ、Ｙ３２８Ｌ、Ｗ３３４Ｇ、Ｗ３３４Ｒ、Ｗ３３４Ｈ、Ｗ３３４Ａ、Ｗ３３４Ｋ、（Ｗ３３４Ｓ＋Ｔ３３５Ｎ）、Ｄ３３８Ｇ、Ｄ３３８Ｖ、（Ｉ３３９Ｐ＋Ｔ３４１Ｇ）、（Ｉ３３９Ｐ＋Ｔ３４１Ｒ）、（Ｉ３３９Ｐ＋Ｔ３４１Ｌ）、（Ｉ３３９Ｐ＋Ｔ３４１Ｋ）、Ｔ３４１Ｒ、Ｔ３４１Ｇ、Ｔ３４１Ｍ、Ｌ３４３Ｐ、Ｌ３４５ＱおよびＬ３４５Ｐからなる群より選ばれる１種類のアミノ酸置換をさらに組み合わせてなる、項３−１に記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
項４−１．
配列番号２に記載されるアミノ酸配列において２０２番目アルギニンがセリンへ置換され、かつ４６番目イソロイシン、４９番目リジン、５８番目アスパラギン酸、７４番目グリシン、８９番目トレオニン、１６８番目リジン、１２４番目セリン、２０６番目セリン、２０８番目リジン、２９４番目ロイシン、３０３番目ヒスチジン、３０６番目グルタミン酸、３１１番目ロイシン、３２３番目アラニン、３２８番目チロシン、３３０番目グルタミン酸、３３４番目トリプトファン、３３５番目トレオニン、３３８番目アスパラギン酸および３４５番目ロイシンからなる群より選ばれる１ないし数個のアミノ酸を他のアミノ酸に置換してなる変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
項４−２．
配列番号２に記載されるアミノ酸配列において２０２番目アルギニンがセリンへ置換され、かつ（Ｉ４６Ｖ＋Ｓ１２４Ｐ）、Ｋ４９Ｒ、（Ｄ５８Ｖ＋Ｙ３２８Ｄ）、（Ｇ７４Ｄ＋Ｅ３０６Ｇ＋Ａ３２３Ｔ）、Ｔ８９Ｋ、Ｓ１２４Ｌ、（Ｋ１６８Ｅ＋Ｅ３３０Ｇ）、Ｓ２０６Ｎ、Ｋ２０８Ｒ、Ｌ２９４Ｗ、Ｈ３０３Ｒ、Ｌ３１１Ｐ、Ｙ３２８Ｓ、Ｙ３２８Ｔ、Ｙ３２８Ｖ、Ｙ３２８Ｇ、Ｙ３２８Ｅ、Ｙ３２８Ｌ、Ｗ３３４Ｇ、Ｗ３３４Ｒ、Ｗ３３４Ｈ、Ｗ３３４Ａ、Ｗ３３４Ｋ、（Ｗ３３４Ｓ＋Ｔ３３５Ｎ）、Ｄ３３８Ｖ、Ｄ３３８Ｇ、Ｌ３４５ＱおよびＬ３４５Ｐからなる群より選ばれる１ないし数種類のアミノ酸置換をさらに組み合わせてなる項４−１に記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
項４−３．
配列番号２に記載されるアミノ酸配列において２０２番目アルギニンがセリンへ置換され、かつ（Ｉ４６Ｖ＋Ｓ１２４Ｐ）、Ｋ４９Ｒ、（Ｄ５８Ｖ＋Ｙ３２８Ｄ）、（Ｇ７４Ｄ＋Ｅ３０６Ｇ＋Ａ３２３Ｔ）、Ｔ８９Ｋ、Ｓ１２４Ｌ、（Ｋ１６８Ｅ＋Ｅ３３０Ｇ）、Ｓ２０６Ｎ、Ｋ２０８Ｒ、Ｌ２９４Ｗ、Ｈ３０３Ｒ、Ｌ３１１Ｐ、Ｙ３２８Ｓ、Ｙ３２８Ｔ、Ｙ３２８Ｖ、Ｙ３２８Ｇ、Ｙ３２８Ｅ、Ｙ３２８Ｌ、Ｗ３３４Ｇ、Ｗ３３４Ｒ、Ｗ３３４Ｈ、Ｗ３３４Ａ、Ｗ３３４Ｋ、（Ｗ３３４Ｓ＋Ｔ３３５Ｎ）、Ｄ３３８Ｖ、Ｄ３３８Ｇ、Ｌ３４５ＱおよびＬ３４５Ｐからなる群より選ばれる１種類のアミノ酸置換をさらに組み合わせてなる項４−１に記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
項５−１．
配列番号２に記載されるアミノ酸配列において２０２番目アルギニンがセリンへ置換され、かつ３３４番目トリプトファンがグリシンに置換されてなる変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
項５−２．
配列番号２に記載されるアミノ酸配列において２０２番目アルギニンがセリンへ置換され、かつ３３４番目トリプトファンがアルギニンに置換されてなる変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
項５−３．
配列番号２に記載されるアミノ酸配列において５８番目アスパラギン酸がバリンに置換され、かつ２０２番目アルギニンがセリンへ置換され、かつ３２８番目チロシンがアスパラギン酸に置換されてなる変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
項６．
項１−１〜５−３のいずれかに記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子。
項７．
項６に記載の遺伝子を含むベクター。
項８．
項７に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
項９．
項８に記載の形質転換体を培養することを特徴とする変異型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
項１０．
項１−１〜５−３のいずれかに記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースアッセイキット。
項１１．
項１−１〜５−３のいずれかに記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースセンサー。
項１２．
項１−１〜５−３のいずれかに記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコース測定法。

本発明により、熱安定性に優れたＧＤＨであり、かつグルコースに対する親和性の高められたＧＤＨを得ることができる。該ＧＤＨは、グルコースセンサ及びグルコース定量用試薬の原料として有用である。

本発明により、熱安定性に優れており、かつＮＡＤに対する親和性の高められたＧＤＨを得ることができる。また該ＧＤＨを用いてグルコースセンサ及びグルコース定量用試薬を作製する際にＮＡＤの使用量を低減できる。

本発明により、熱安定性に優れたＧＤＨであり、なおかつ３７℃以下における比活性の向上したＧＤＨを得ることができる。該ＧＤＨは、グルコースセンサ及びグルコース定量用試薬の原料として有用である。

本発明により、熱安定性に優れており、かつ３７℃以下の温度領域における温度依存的な活性値の変動を低減したＧＤＨを得ることができる。また該ＧＤＨを用いてグルコースセンサ及びグルコース定量用試薬を作製する際にＮＡＤの使用量を低減できる。

本発明により、熱安定性および基質特異性に優れており、かつ３７℃以下の温度領域における比活性が高く、かつＮＡＤおよびグルコースに対する親和性が高く、かつ３７℃以下の温度領域における温度依存的な活性値の変動を低減したＧＤＨを得ることができる。また該ＧＤＨを用いてグルコースセンサ及びグルコース定量用試薬を作製する際にＮＡＤの使用量を低減できる。同時にグルコース定量における環境温度の定量値に与える影響を低減することができる。

［１］本発明の変異型グルコースデヒドロゲナーゼ
［１−１］
本発明の実施形態の一つは、熱安定性が高くかつグルコースに対する親和性の高い変異型グルコースデヒドロゲナーゼである。

具体的には、配列番号２に記載するアミノ酸配列における２０２番目に存在するアルギニン残基を、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、アスパラギン、およびリジンからなる群より選ばれる１つのアミノ酸残基に置換してなるグルコースデヒドロゲナーゼが例示できる。
ここで、配列番号２は、本発明者らがサーモプロテウス・エスピー・ＧＤＨ１株（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐ． ＧＤＨ１）より取得したグルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列である。その取得方法は特願２００８−６００３２に記載されているが、実施例でも後述する。

変異を導入するベースとなるＧＤＨとしては、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドからなるＧＤＨが好適な例として挙げられるが、配列番号２に示すアミノ酸配列と比して少なくとも５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、最も好ましくは８０％以上の相同性を有するＧＤＨも利用可能であると推定される。
このようなＧＤＨとしては好適には超好熱性始原菌由来のＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨが挙げられ、好ましくはサーモプロテウス属由来ＧＤＨである。
この説明は、後述の［１−２］、［１−３］および［１−４］で説明する本発明の変異型グルコースデヒドロゲナーゼについても、同様に適用される。

このようなＧＤＨを変異導入のベースとした場合、ＧＥＮＥＴＹＸなどの配列解析ソフトを用いて、配列番号２に記載するアミノ酸配列における２０２番目と同等の位置に存在すると考えられるアルギニン残基を特定することができる。これを他のアミノ酸残基に置換して得られた変異型ＧＤＨも本願発明の均等範囲に包含される。
この説明は、後述の［１−２］、［１−３］および［１−４］で説明する本発明の変異型グルコースデヒドロゲナーゼについても、同様に適用される。

さらに本発明は配列番号２における２０２番目またはそれと同等の位置に存在するアルギニン残基のセリンへの置換に加えて、５８番目アスパラギン酸、７４番目グリシン、８０番目バリン、８５番目ロイシン、８９番目トレオニン、１２１番目アラニン、１２４番目セリン、１６８番目リジン、１７３番目アラニン、２０６番目セリン、２０８番目リジン、２９４番目ロイシン、２９８番目グルタミン酸、３０３番目ヒスチジン、３０６番目グルタミン酸、３１１番目ロイシン、３２３番目アラニン、３２８番目チロシン、３３４番目トリプトファン、３３８番目アスパラギン酸、３４１番目トレオニン、３４３番目ロイシンおよび３４５番目ロイシンからなる群より選ばれる１ないし数箇所のアミノ酸残基の他の残基への置換をさらに組み合わせてなる変異型グルコースデヒドロゲナーゼである。
それぞれの部位へ導入する置換残基としては、アミノ酸置換後の効果として該グルコースデヒドロゲナーゼの３７℃における比活性を向上させるものであればよく、そのような置換残基の例としては、たとえば３番目はバリン、４６番目はバリン、４９は番目アルギニン、５８番目はバリン、７４番目はアスパラギン酸、８０番目はアラニン、８５番目はヒスチジン、８９番目はリジン、１２１番目はトレオニン、１２４番目はロイシン、１６８番目はグルタミン酸、１７３番目はトレオニン、２０６番目はアスパラギン、２０８番目はアルギニン、２９４番目はトリプトファン、２９８番目はグリシン、３０３番目はアルギニン、３０６番目はグリシン、３１１番目はプロリン、３２３番目はトレオニン、３２８番目はセリン、トレオニン、バリン、グリシン、グルタミン酸およびロイシンのいずれか、３３０番目はグリシン、３３４番目はグリシン、アルギニン、ヒスチジン、アラニン、リジンおよびセリンのいずれか、３３８番目はバリンまたはグリシン３４１番目はアルギニン、ロイシン、リジン、グリシン、メチオニンおよびプロリンのいずれか、３４３は番目プロリン、３４５番目はグルタミンまたはプロシンにそれぞれ置換するのが好ましい。
また４６番目イソロイシンと１２４番目セリンの置換、５８番目アスパラギン酸と３２８番目チロシンの置換、７４番目グリシンと３０６番目グルタミン酸と３２３番目アラニンの置換、１６８番目リジンと３３０番目グルタミン酸の置換はそれぞれセットで導入するのが好ましい。

導入するアミノ酸置換のさらに好適な例としては２０２番目アルギニンに相当するアミノ酸残基のセリンへの置換に加えて、Ａ３Ｖ、（Ｉ４６Ｖ＋Ｓ１２４Ｐ）、Ｋ４９Ｒ、（Ｄ５８Ｖ＋Ｙ３２８Ｄ）、（Ｇ７４Ｄ＋Ｅ３０６Ｇ＋Ａ３２３Ｔ）、Ｖ８０Ａ、Ｌ８５Ｈ、Ｔ８９Ｋ、Ａ１２１Ｔ、Ｓ１２４Ｌ、（Ｋ１６８Ｅ＋Ｅ３３０Ｇ）、Ａ１７３Ｔ、Ｓ２０６Ｎ、Ｋ２０８Ｒ、Ｌ２９４Ｗ、Ｅ２９８Ｇ、Ｈ３０３Ｒ、Ｌ３１１Ｐ、Ｙ３２８Ｓ、Ｙ３２８Ｔ、Ｙ３２８Ｖ、Ｙ３２８Ｇ、Ｙ３２８Ｅ、Ｙ３２８Ｌ、Ｗ３３４Ｇ、Ｗ３３４Ｒ、Ｗ３３４Ｈ、Ｗ３３４Ａ、Ｗ３３４Ｋ、（Ｗ３３４Ｓ＋Ｔ３３５Ｎ）、Ｄ３３８Ｇ、Ｄ３３８Ｖ、（Ｉ３３９Ｐ＋Ｔ３４１Ｇ）、（Ｉ３３９Ｐ＋Ｔ３４１Ｒ）、（Ｉ３３９Ｐ＋Ｔ３４１Ｌ）、（Ｉ３３９Ｐ＋Ｔ３４１Ｋ）、Ｔ３４１Ｒ、Ｔ３４１Ｇ、Ｔ３４１Ｍ、Ｌ３４３Ｐ、Ｌ３４５ＱおよびＬ３４５Ｐからなる群より選ばれた１種類のアミノ酸置換をさらに加えた二重ないし多重変異酵素が好ましい。

［１−２］
本発明の実施形態の一つは、熱安定性が高くかつＮＡＤに対する親和性の高い変異型グルコースデヒドロゲナーゼである。さらに好ましくは、該特性に加え、さらに基質特異性に優れる変異型グルコースデヒドロゲナーゼである。

具体的には、配列番号２に記載するアミノ酸配列における２０２番目に存在するアルギニン残基を、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、およびリジンからなる群より選ばれる１つのアミノ酸残基に置換してなるグルコースデヒドロゲナーゼが例示できる。

さらに本発明は配列番号２における２０２番目またはそれと同等の位置に存在するアルギニン残基の、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、およびリジンのいずれかへの置換に加えて、５８番目アスパラギン酸、２８６番目バリン、３２８番目チロシン、３３４番目トリプトファン、３３６番目ヒスチジン、３４０番目アルギニン、３４１番目トレオニンおよび３４５番目ロイシンのいずれかのアミノ酸残基の他アミノ酸残基への置換をさらに組み合わせてなる変異型グルコースデヒドロゲナーゼである。
それぞれの部位へ導入する置換残基としては、アミノ酸置換後の効果として該グルコースデヒドロゲナーゼのＮＡＤに対するミカエリス定数を低下させるものであればよく、そのような置換残基の例としては、たとえば５８番目アスパラギン酸はバリンに、２８６番目バリンはアラニンに、３２８番目チロシンはアスパラギン酸に、３３４番目トリプトファンはグリシンもしくはアルギニンに、３４０番目アルギニンはリジンに、３４１番目トレオニンはアルギニン、グリシン、プロリン、メチオニンおよびセリンのいずれかに、３４５番目ロイシンはグルタミンに、それぞれ置換するのが好ましい。
また５８番目アスパラギン酸の置換と３２８番目チロシンの置換とはセットで導入するのが好ましい。

導入するアミノ酸置換のさらに好適な例としては、Ｒ２０２Ｓの変異型ＧＤＨに、（Ｄ５８Ｖ＋Ｙ３２８Ｄ）、Ｖ２８６Ａ、Ｙ３２８Ｔ、Ｙ３２８Ｅ、Ｗ３３４Ｇ、Ｗ３３４Ｒ、Ｗ３３４Ｈ、Ｗ３３４Ａ、Ｗ３３４Ｋ、Ｉ３３９Ｐ、Ｋ３４０Ｒ、Ｔ３４１Ｒ、Ｔ３４１Ｇ、Ｔ３４１Ｐ、Ｔ３４１Ｍ、Ｔ３４１ＳおよびＬ３４５Ｑのいずれかのアミノ酸置換をさらに加えた二重もしくは三重変異酵素が好ましい。

［１−３］
本発明の実施形態の一つは、熱安定性が高くかつ３７℃以下の温度における比活性の高い変異型グルコースデヒドロゲナーゼである。また好ましくはさらに基質特異性に優れたグルコースデヒドロゲナーゼである。

具体的には、配列番号２に記載するアミノ酸配列における２０２番目に存在するアルギニン残基を、セリンに置換してなるグルコースデヒドロゲナーゼが例示できる。

さらに本発明は配列番号２における２０２番目またはそれと同等の位置に存在するアルギニン残基のセリンへの置換に加えて、３番目アラニン、４６番目イソロイシン、４９番目リジン、５８番目アスパラギン酸、７４番目グリシン、８０番目バリン、８５番目ロイシン、８９番目トレオニン、１２１番目アラニン、１２４番目セリン、１６８番目リジン、１７３番目アラニン、２０６番目セリン、２０８番目リジン、２９４番目ロイシン、２９８番目グルタミン酸、３０３番目ヒスチジン、３０６番目グルタミン酸、３１１番目ロイシン、３２３番目アラニン、３２８番目チロシン、３３４番目トリプトファン、３３８番目アスパラギン酸、３４１番目トレオニン、３４３番目ロイシンおよび３４５番目ロイシンからなる群より選ばれる１ないし数箇所のアミノ酸残基の他の残基への置換をさらに組み合わせてなる変異型グルコースデヒドロゲナーゼである。
それぞれの部位へ導入する置換残基としては、アミノ酸置換後の効果として該グルコースデヒドロゲナーゼの３７℃における比活性を向上させるものであればよく、そのような置換残基の例としては、たとえば３番目はバリン、４６番目はバリン、４９は番目アルギニン、５８番目はバリン、７４番目はアスパラギン酸、８０番目はアラニン、８５番目はヒスチジン、８９番目はリジン、１２１番目はトレオニン、１２４番目はロイシン、１６８番目はグルタミン酸、１７３番目はトレオニン、２０６番目はアスパラギン、２０８番目はアルギニン、２９４番目はトリプトファン、２９８番目はグリシン、３０３番目はアルギニン、３０６番目はグリシン、３１１番目はプロリン、３２３番目はトレオニン、３２８番目はセリン、トレオニン、バリン、グリシン、グルタミン酸およびロイシンのいずれか、３３０番目はグリシン、３３４番目はグリシン、アルギニン、ヒスチジン、アラニン、リジンおよびセリンのいずれか、３３８番目はバリンまたはグリシン３４１番目はアルギニン、ロイシン、リジン、グリシン、メチオニンおよびプロリンのいずれか、３４３は番目プロリン、３４５番目はグルタミンまたはプロシンにそれぞれ置換するのが好ましい。
また４６番目イソロイシンと１２４番目セリンの置換、５８番目アスパラギン酸と３２８番目チロシンの置換、７４番目グリシンと３０６番目グルタミン酸と３２３番目アラニンの置換、１６８番目リジンと３３０番目グルタミン酸の置換はそれぞれセットで導入するのが好ましい。

導入するアミノ酸置換のさらに好適な例としては２０２番目アルギニンに相当するアミノ酸残基のセリンへの置換に加えて、Ａ３Ｖ、（Ｉ４６Ｖ＋Ｓ１２４Ｐ）、Ｋ４９Ｒ、（Ｄ５８Ｖ＋Ｙ３２８Ｄ）、（Ｇ７４Ｄ＋Ｅ３０６Ｇ＋Ａ３２３Ｔ）、Ｖ８０Ａ、Ｌ８５Ｈ、Ｔ８９Ｋ、Ａ１２１Ｔ、Ｓ１２４Ｌ、（Ｋ１６８Ｅ＋Ｅ３３０Ｇ）、Ａ１７３Ｔ、Ｓ２０６Ｎ、Ｋ２０８Ｒ、Ｌ２９４Ｗ、Ｅ２９８Ｇ、Ｈ３０３Ｒ、Ｌ３１１Ｐ、Ｙ３２８Ｓ、Ｙ３２８Ｔ、Ｙ３２８Ｖ、Ｙ３２８Ｇ、Ｙ３２８Ｅ、Ｙ３２８Ｌ、Ｗ３３４Ｇ、Ｗ３３４Ｒ、Ｗ３３４Ｈ、Ｗ３３４Ａ、Ｗ３３４Ｋ、（Ｗ３３４Ｓ＋Ｔ３３５Ｎ）、Ｄ３３８Ｇ、Ｄ３３８Ｖ、（Ｉ３３９Ｐ＋Ｔ３４１Ｇ）、（Ｉ３３９Ｐ＋Ｔ３４１Ｒ）、（Ｉ３３９Ｐ＋Ｔ３４１Ｌ）、（Ｉ３３９Ｐ＋Ｔ３４１Ｋ）、Ｔ３４１Ｒ、Ｔ３４１Ｇ、Ｔ３４１Ｍ、Ｌ３４３Ｐ、Ｌ３４５ＱおよびＬ３４５Ｐからなる群より選ばれる１種類のアミノ酸置換をさらに加えた二重ないし多重変異酵素が好ましい。

［１−４］
本発明の実施形態の一つは、熱安定性が高くかつ３７℃以下の温度領域における温度依存的な活性値の変動を低減した変異型グルコースデヒドロゲナーゼである。さらに好ましくは、該特性に加え、さらに基質特異性に優れる変異型グルコースデヒドロゲナーゼである。よりさらに好ましくは、該特性に加え、中性付近のｐＨ領域において安定なグルコースデヒドロゲナーゼである。

具体的には、配列番号２に記載するアミノ酸配列における２０２番目に存在するアルギニン残基がセリンに置換され、かつ２０２番目セリン以外の１ないし数個のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換してなる変異型グルコースデヒドロゲナーゼである。

２０２番目アルギニンのセリンへの置換に加えてアミノ酸置換を導入する位置としては、好ましくは４６番目イソロイシン、４９番目リジン、５８番目アスパラギン酸、７４番目グリシン、８９番目トレオニン、１６８番目リジン、１２４番目セリン、２０６番目セリン、２０８番目リジン、２９４番目ロイシン、３０３番目ヒスチジン、３０６番目グルタミン酸、３１１番目ロイシン、３２３番目アラニン、３２８番目チロシン、３３０番目グルタミン酸、３３４番目トリプトファン、３３５番目トレオニン、３３８番目アスパラギン酸、３４５番目ロイシンが挙げられる。
それぞれの部位へ導入する置換残基としては、アミノ酸置換後の効果として３７℃以下の温度領域における温度依存的な活性の変動を低減させるものであればよく、そのような置換残基の例としては、たとえば４６番目イソロイシンはバリンに、４９番目リジンはアルギニンに、５８番目アスパラギン酸バリンに、７４番目グリシンアスパラギン酸に、８９番目トレオニンはリジンに、１６８番目リジングルタミン酸に、１２４番目セリンはプロリンまたはリジンに、２０６番目セリンアスパラギンに、２０８番目リジンはアルギニンに、２９４番目ロイシンはトリプトファンに、３０３番目ヒスチジンアルギニンに、３０６番目グルタミン酸グリシンに、３１１番目ロイシンプロリンに、３２３番目アラニントレオニンに、３２８番目チロシンはアスパラギン酸、セリン、トレオニン、バリン、グリシン、グルタミン酸およびロイシンのいずれかに、３３０番目グルタミン酸はグリシンに、３３４番目トリプトファンはグリシン、アルギニン、ヒスチジン、アラニン、セリンおよびリジンのいずれかに、３３５番目トレオニンはアスパラギンに、３３８番目アスパラギン酸はバリンもしくはグリシンに、３４５番目ロイシンはグルタミンもしくはプロリンに、それぞれ置換するのが好ましい。
また上記アミノ酸残基のうち２個以上の置換を組み合わせる際の好適な例としては、４６番目イソロイシンと１２４番目セリン、５８番目アスパラギン酸と３２８番目チロシン、７４番目グリシンと３０６番目グルタミン酸と３２３番目アラニン、１６８番目リジンと３３０番目グルタミン酸、３３４番目トリプトファンと３３５番目トレオニンの各残基のアミノ酸置換の組み合わせが例示されるがこれらに限定されない。

導入するアミノ酸置換のさらに好適な例としては、Ｒ２０２Ｓの変異型ＧＤＨに、（Ｉ４６Ｖ＋Ｓ１２４Ｐ）、Ｋ４９Ｒ、（Ｄ５８Ｖ＋Ｙ３２８Ｄ）、（Ｇ７４Ｄ＋Ｅ３０６Ｇ＋Ａ３２３Ｔ）、Ｔ８９Ｋ、Ｓ１２４Ｌ、（Ｋ１６８Ｅ＋Ｅ３３０Ｇ）、Ｓ２０６Ｎ、Ｋ２０８Ｒ、Ｌ２９４Ｗ、Ｈ３０３Ｒ、Ｌ３１１Ｐ、Ｙ３２８Ｓ、Ｙ３２８Ｔ、Ｙ３２８Ｖ、Ｙ３２８Ｇ、Ｙ３２８Ｅ、Ｙ３２８Ｌ、Ｗ３３４Ｇ、Ｗ３３４Ｒ、Ｗ３３４Ｈ、Ｗ３３４Ａ、Ｗ３３４Ｋ、（Ｗ３３４Ｓ＋Ｔ３３５Ｎ）、Ｄ３３８Ｖ、Ｄ３３８Ｇ、Ｌ３４５Ｑお
よびＬ３４５Ｐからなる群より選ばれるいずれか１種類のアミノ酸置換をさらに加えた二重ないし四重変異酵素が好ましい。

［１−５］
本発明の実施形態の一つは、熱安定性が高くかつ３７℃以下の温度領域における比活性の高められた変異型グルコースデヒドロゲナーゼである。さらに、補酵素としてのＮＡＤに対する親和性が高められ、同時にＮＡＤを補酵素とした場合に基質であるグルコースに対して親和性が高められた変異型グルコースデヒドロゲナーゼである。さらに、上記特性に加え３７℃以下の温度領域における温度依存的な活性値の変動を低減した変異型グルコースデヒドロゲナーゼである。そして上記特性に加え、さらに基質特異性に優れる変異型グルコースデヒドロゲナーゼである。そしてさらに上記特性に加え、中性付近のｐＨ領域において安定なグルコースデヒドロゲナーゼである。

具体的には、配列番号２に記載するアミノ酸配列における２０２番目に存在するアルギニン残基がセリンに置換され、かつ３３４番目に存在するトリプトファン残基がグリシンに置換されてなる変異型グルコースデヒドロゲナーゼである。
または、配列番号２に記載するアミノ酸配列における２０２番目に存在するアルギニン残基がセリンに置換され、かつ３３４番目に存在するトリプトファン残基がアルギニンに置換されてなる変異型グルコースデヒドロゲナーゼである。
または、配列番号２に記載するアミノ酸配列における５８番目に存在するアスパラギン酸残基がバリンに置換され、かつ２０２番目アルギニン残基がセリンに置換され、かつ３２８番目チロシン残基がアスパラギン酸残基に置換されてなる変異型グルコースデヒドロゲナーゼである。

変異を導入するベースとなるＧＤＨとしては、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドからなるＧＤＨが好適な例として挙げられるが、配列番号２に示すアミノ酸配列と比して少なくとも５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、最も好ましくは８０％以上の相同性を有するＧＤＨも利用可能であると推定される。
このようなＧＤＨとしては好適には超好熱性始原菌由来のＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨが挙げられ、好ましくはサーモプロテウス属由来ＧＤＨである。

このようなＧＤＨを変異導入のベースとした場合、ＧＥＮＥＴＹＸなどの配列解析ソフトを用いて、配列番号２に記載するアミノ酸配列における５８番目と同等の位置に存在すると考えられるアスパラギン酸残基、２０２番目と同等の位置に存在すると考えられるアルギニン残基、３２８番目と同等の位置に存在すると考えられるチロシン残基、並びに３３４番目と同等の位置に存在するトリプトファン残基を特定することができる。これらを他のアミノ酸残基に置換して得られた変異型ＧＤＨも本願発明の均等範囲に包含される。

［２］本明細書における用語の定義など
［２−１］アミノ酸置換の表記
本明細書において、アミノ酸置換の表記は、元のアミノ酸残基・Ｎ末端からの位置・置換後のアミノ酸残基の順に記しており、例えばＶ２８６Ａとは配列番号２において２８６番目バリンをアラニンに置換するという意味である。アルファベット表記は、Ｒはアルギニン、Ｓはセリン、Ｖはバリン、Ａはアラニン、Ｗはトリプトファン、Ｇはグリシン、Ｐはプロリン、Ｔはトレオニン、Ｍはメチオニン、Ｑはグルタミン、Ｋはリジン、Ｄはアスパラギン酸、Ｌはロイシン、Ｉはイソロイシン、Ｙはチロシンをそれぞれ指す。
ここで（Ｄ５８Ｖ＋Ｙ３２８Ｄ）とは、Ｄ５８ＶおよびＹ３２８Ｄで表されるアミノ酸置換を同時に有することを意味し、Ｒ２０２Ｓの変異型ＧＤＨにさらに（Ｄ５８Ｖ＋Ｙ３２８Ｄ）のアミノ酸置換を加えた酵素とはすなわちＤ５８Ｖ＋Ｒ２０２Ｓ＋Ｙ３２８Ｄで表される３重変異型ＧＤＨということができる。

［２−２］基質に対する親和性
本発明において、基質に対する親和性は、グルコースに対するミカエリス定数（Ｋｍ）によって評価する。
本発明に述べるグルコースに対するミカエリス定数（Ｋｍ）は、後述の測定例に従って測定・算出することによって得られる値である。
本発明の変異型ＧＤＨにおけるグルコースに対するミカエリス定数としては、好ましくは５０ｍＭ以下であり、より好ましくは３５ｍＭ以下であり、さらに好ましくは２０ｍＭ以下であり、よりさらに好ましくは１０ｍＭ以下であり、最も好ましくは５ｍＭ以下である。
また別の観点からは、変異の導入後におけるグルコースに対するミカエリス定数（Ｋｍ）は、好ましくは野生型比７８％以下、より好ましくは５５％以下、さらに好ましくは３０％以下、よりさらに好ましくは１６％以下、最も好ましくは８％以下である。

本発明において、ＮＡＤに対する親和性は、ＮＡＤに対するミカエリス定数（Ｋｍ）によって評価する。
本発明に述べるＮＡＤに対するミカエリス定数（Ｋｍ）は、後述の「ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）に対するミカエリス定数（Ｋｍ）の算出例」に記載の方法に従って測定・算出することによって得られる値である。
本発明の変異型ＧＤＨにおけるＮＡＤに対するミカエリス定数としては、好ましくは５ｍＭ以下であり、より好ましくは２ｍＭ以下であり、さらに好ましくは１．２５ｍＭ以下であり、よりさらに好ましくは１ｍＭ以下であり、最も好ましくは０．５ｍＭ以下である。
また別の観点からは、変異の導入によるＮＡＤに対するミカエリス定数（Ｋｍ）の低減度は、好ましくは野生型比６０％以下、より好ましくは２５％以下、さらに好ましくは１５％以下、よりさらに好ましくは１２％以下、最も好ましくは６％以下である。

［２−３］熱安定性
本発明のＧＤＨは、上記特性に加えて、必要な熱安定性を有していることが好ましい。熱安定性は、塩化ナトリウムを含まない０．１Ｍのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）に５Ｕ／ｍｌのＧＤＨが含まれる状態で３０分間の加温処理をした後も維持される活性で評価される。
必要な熱安定性とは、８０℃で加温した際の活性残存率が好ましくは加温処理前比５０％以上であり、より好ましくは８０％以上であり、最も好ましくは９０％以上である。
また、別の観点からは３０分の加温処理後の活性残存率が９０％以上となる温度条件の最大限界値が好ましくは７０℃以上９０℃以下であり、より好ましくは７５℃以上８５℃以下であるグルコースデヒドロゲナーゼである。

［２−４］基質特異性
本発明のＧＤＨは、上記特性に加えて、必要な基質特異性を有していることが好ましい。
基質特異性は、後述の「基質特異性の算出例」に従って評価される。本発明に述べるグルコースデヒドロゲナーゼの基質特異性としては、対グルコース比としてマルトース・ガラクトース・キシロースに対する作用性が好ましくは５％以下であり、より好ましくは３％以下であり、よりさらに好ましくは２％以下であり、最も好ましくは１％未満である。

［２−５］比活性
本発明に述べる比活性は、後述の「タンパク質の定量および比活性の算出例」に記載の方法により測定・算出されるものである。
本発明の変異型ＧＤＨの比活性としては、好ましくは２２０Ｕ／ｍｇ以上であり、より好ましくは４００Ｕ／ｍｇ以上であり、さらに好ましくは５００Ｕ／ｍｇ以上であり、最も好ましくは６００Ｕ／ｍｇ以上である。
別の観点からは、本発明による変異型ＧＤＨの比活性の向上度は、野生型比として好ましくは１．３倍以上、より好ましくは２．３倍以上、さらに好ましくは２．９倍以上、最も好ましくは３．５倍以上である。

［２−６］温度依存的な活性の変動
本発明において、温度依存的な活性の変動は２５℃／３７℃活性温度比として評価され、その算出方法は、後述する「２５℃／３７℃活性温度比の算出例」に記す方法である。
この値が上昇しているということはすなわち２５℃−３７℃間の活性の温度依存的変動が低減していることを意味する。
また生化学的知見に照らせば、２５℃における酵素活性が周囲の温度領域に比して突出して高いまたは低いということはありえず、２５℃における相対活性（３７℃における活性を１００とする）が高いことはすなわち、３７℃未満の広範な温度領域、少なくとも１０℃以上３７℃未満の温度範囲における相対活性が高いことを示唆し、よって少なくとも１０℃以上３７℃以下の温度領域における活性の温度依存的な変動が低減していることを示唆するものと考えられる。
本発明の変異型ＧＤＨにおける２５℃／３７℃活性温度比は、好ましくは０．４０以上であり、より好ましくは０．４５以上であり、最も好ましくは０．５以上である。
また別の観点からは、変異の導入による２５℃／３７℃活性温度比の上昇度は、好ましくは野生型比１．２倍以上、より好ましくは１．４倍以上、最も好ましくは１．５倍以上である。

［２−７］ｐＨ安定性
本発明のＧＤＨは、上記特性に加えて、中性領域を中心とする広範なｐＨ領域において安定であることが好ましい。
本発明に述べるｐＨ安定性は、５０ｍＭの各バッファー溶液にＧＤＨ濃度が１０Ｕ／ｍｌとなるよう含まれた状態で２５℃で１６時間インキュベートを行い、インキュベート前のＧＤＨ活性に対するインキュベート後の活性残存率として評価する。
この条件において、８０％以上の活性残存率を示すｐＨ領域として少なくとも５．５〜９．５であり、さらに好ましくは５．０〜９．９であり、よりさらに好ましくは５．０〜１０．７である。

［３］本発明の変異型グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体、および、該形質転換体を培養することを特徴とする変異型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法
［３−１］
本発明の実施形態の一つは、熱安定性が高くかつＮＡＤに対する親和性の高い変異型グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子である。
また、本発明の実施形態の一つは、熱安定性が高く３７℃以下の温度における比活性の高い変異型グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子である。
［３−２］
また、該遺伝子を含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体、該形質転換体を培養することを特徴とする変異型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法も本発明の実施形態として挙げられる。
本発明のＧＤＨを生産する方法としては、該ＧＤＨのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを作製し、これを宿主細胞に形質転換して培養することにより発現させる方法が好適である。

本発明のＧＤＨをコードするポリヌクレオチド、および該ポリヌクレオチドをからなる遺伝子を発現可能なプラスミドの作製方法としては、例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡもしくは該ＤＮＡを含んでなるプラスミドを取得し、これに所望の変異を導入する方法、並びに本発明のＧＤＨをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド全長を人工的に化学合成し、制限酵素処理、ライゲーションによりプラスミドに挿入する方法が挙げられるが、これらに限定されない。
ここで、配列番号１は、本発明者らがサーモプロテウス・エスピー・ＧＤＨ１株（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐ． ＧＤＨ１）より取得したグルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子である。配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（配列番号１）および該ＤＮＡを挿入したプラスミドの取得方法は特願２００８−６００３２に記載されているが、実施例でも後述する。

そして、本発明のＧＤＨを産生させるためのＤＮＡへの変異導入方法としては、例えば置換しようとするアミノ酸残基をコードするコドンに相当する部分を、置換後のアミノ酸をコードするコドンに換えた配列を有するミスマッチプライマーを作製し、このプライマーとＤＮＡポリメラーゼを用いて配列番号２をコードするＤＮＡ（配列番号１に代表される）を鋳型に変異が導入された配列を有するＤＮＡを伸長作製する方法が利用される。このような遺伝子の部位特異的改変を行うに際しては、市販の各種サイトダイレクト変異導入キットを使用することも可能であり、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ社製ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ、 あるいはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社製ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔなどが適用可能であるが、これらに限定されない。

また、本発明のＧＤＨ生産に用いるＤＮＡの入手方法としては、化学的にＤＮＡ鎖を合成するか、もしくは合成した一部オーバーラップするオリゴＤＮＡ短鎖を、ＰＣＲ法を利用して接続することにより、本発明のＧＤＨの全長をコードするＤＮＡを構築することも可能である。
化学合成もしくはＰＣＲ法との組み合わせで全長ＤＮＡを構築することの利点は、該遺伝子を導入する宿主に合わせて使用コドンを遺伝子全長にわたり設計できる点にある。同一のアミノ酸をコードする複数のコドンは均一に使用されるわけではなく、生物種によってその使用頻度が異なる。一般にある生物種において高発現する遺伝子に含まれるコドンは、その生物種において使用頻度の高いコドンを多く含んでおり、逆に発現量の低い遺伝子は使用頻度の低いコドンの存在がボトルネックとなって高発現を妨げている例が少なくない。異種遺伝子の発現に際し、その遺伝子配列を宿主生物において使用頻度の高いコドンに置換することで該異種タンパク質発現量が増大した例はこれまでに多数報告されており、このような使用コドンの改変は異種遺伝子発現量の増大に効果があると期待される。

上記の理由から、本発明のＧＤＨをコードするＤＮＡは、それが導入される宿主細胞により適したコドン（即ち、該宿主において使用頻度の高いコドン）に改変することが望ましい。各宿主のコドン使用頻度は、該宿主生物のゲノム配列上に存在する全遺伝子における各コドンの使用される割合で定義され、たとえば１０００コドンあたりの使用回数で表される。またコドン使用頻度は、その全ゲノム配列の解明されていない生物にあっては代表的な複数遺伝子の配列から近似的に算出することも可能である。
組換えようとする宿主生物におけるコドン使用頻度のデータは、例えば（財）かずさＤＮＡ研究所のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ）に公開されている遺伝暗号使用頻度データベースを用いることができ、または各生物におけるコドン使用頻度を記した文献を参照してもよく、あるいは使用する宿主生物のコドン使用頻度データを自ら決定してもよい。入手したデータと導入しようとする遺伝子配列を参照し、遺伝子配列に用いられているコドンの中で宿主生物において使用頻度の低いものを、同一のアミノ酸をコードし使用頻度の高いコドンに置換すればよい。
このような使用頻度の高いコドンとしては、例えば宿主が大腸菌Ｋ１２株である場合にあっては、ＧｌｙにはＧＧＴまたはＧＧＣ、ＧｌｕにはＧＡＡ、ＡｓｐにはＧＡＴ、ＶａｌにはＧＴＧ、ＡｌａにはＧＣＧ、ＡｒｇにはＣＧＴまたはＣＧＣ、ＳｅｒにはＡＧＣ、ＬｙｓにはＡＡＡ、ＩｌｅにはＡＴＴまたはＡＴＣ、ＴｈｒにはＡＣＣ、ＬｅｕにはＣＴＧ、ＧｌｎにはＣＡＧ、ＰｒｏにはＣＣＧなどが挙げられる。

本発明のＧＤＨをコードするＤＮＡは、組換えベクターに接続した状態で形質転換される。本発明の組換えベクターは原核および／または真核細胞の各種宿主細胞内で複製保持または自律増殖できるものであれば特に限定されず、プラスミドベクターやウイルスベクター等が包含される。
当該組換えベクターは、簡便には当該技術分野において入手可能な公知のクローニングベクターまたは発現ベクターに、上記のＧＤＨをコードするＤＮＡを適当な制限酵素およびリガーゼ、あるいは必要に応じてさらにリンカーもしくはアダプターＤＮＡを用いて連結することにより調製することができる。
また、Ｔａｑポリメラーゼのように増幅末端に一塩基を付加するようなＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅作製した遺伝子断片であれば、ＴＡクローニングによるベクターへの接続も可能である。

ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミドとして、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９など、酵母由来プラスミドとして、例えばｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５など、枯草菌由来プラスミドとして、例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４などが挙げられる。また、ウイルスとして、λファージなどのバクテリオファージや、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）等のパポバウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）等のレトロウイルス、アデノウイルス（ＡｄＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニヤウイルス、バキュロウイルスなどの動物および昆虫のウイルスが例示される。

特に、本発明は、目的の宿主細胞内で機能的なプロモーターの制御下にＧＤＨをコードするＤＮＡが配置されたＧＤＨ発現ベクターを提供する。
使用されるベクターとしては、原核および／または真核細胞の各種宿主細胞内で機能して、その下流に配置された遺伝子の転写を制御し得るプロモーター領域（例えば宿主が大腸菌の場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌｅｃＡプロモーター等、宿主が枯草菌の場合、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等、宿主が酵母の場合、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等、宿主が哺乳動物細胞の場合、ＳＶ４０由来初期プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ由来ロングターミナルリピート、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター）と、該遺伝子の転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有し、該プロモーター領域と該ターミネーター領域とが、少なくとも１つの制限酵素認識部位、好ましくは該ベクターをその箇所のみで切断するユニークな制限部位を含む配列を介して連結されたものであれば特に制限はないが、形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有していることが好ましい。さらに、挿入されるＧＤＨをコードするＤＮＡが開始コドンおよび終止コドンを含まない場合には、開始コドン（ＡＴＧまたはＧＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡ）を、それぞれプロモーター領域の下流およびターミネーター領域の上流に含むベクターが好ましく使用される。
宿主細胞として細菌を用いる場合、一般に発現ベクターは上記のプロモーター領域およびターミネーター領域に加えて、宿主細胞内で自律複製し得る複製可能単位を含む必要がある。また、プロモーター領域は、プロモーターの近傍にオペレーターおよびＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列を包含する。
宿主として酵母，動物細胞または昆虫細胞を用いる場合、発現ベクターは、エンハンサー配列、ＧＤＨ ｍＲＮＡの５’側および３’側の非翻訳領域、ポリアデニレーション部位等をさらに含むことが好ましい。

本発明のＧＤＨは、上記のようにして調製されるＧＤＨ発現ベクターを含む形質転換体を培地中で培養し、得られる培養物からＧＤＨを回収することによって製造することができる。

使用される培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源，無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース，デキストラン，可溶性デンプン，ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類，硝酸塩類，アミノ酸，コーンスチープ・リカー，ペプトン，カゼイン，肉エキス，大豆粕，バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素〔例えば、無機塩（例えば塩化カルシウム，リン酸二水素ナトリウム，塩化マグネシウム），ビタミン類，抗生物質（例えばテトラサイクリン，ネオマイシン，アンピシリン，カナマイシン等）など〕を含んでいてもよい。

培養は当分野において知られている方法により行われる。下記に宿主細胞に応じて用いられる具体的な培地および培養条件を例示するが、本発明における培養条件はこれらに何ら限定されるものではない。
宿主が細菌，放線菌，酵母，糸状菌等である場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５〜９である培地である。宿主が大腸菌の場合、好ましい培地としてＬＢ培地，Ｍ９培地［Ｍｉｌｌｅｒ． Ｊ．， Ｅｘｐ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ， ｐ．４３１， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９７２）］等が例示される。培養は、必要により通気・攪拌をしながら、通常１４〜４３℃で約３〜７２時間行うことができる。宿主が枯草菌の場合、必要により通気・攪拌をしながら、通常３０〜４０℃で約１６〜９６時間行うことができる。宿主が酵母の場合、培地として、例えばＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最少培地 ［Ｂｏｓｔｉａｎ． Ｋ．Ｌ． ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７， ４５０５ （１９８０）］が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
宿主が動物細胞の場合、培地として、例えば約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）［Ｓｃｉｅｎｃｅ， １２２， ５０１ （１９５２）］、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ８， ３９６ （１９５９）］、ＲＰＭＩ１６４０培地［Ｊ． Ａｍ． Ｍｅｄ． Ａｓｓｏｃ．， １９９， ５１９ （１９６７）］、１９９培地［Ｐｒｏｃ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ．， ７３， １ （１９５０）］ 等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
宿主が昆虫細胞の場合、培地として、例えばウシ胎仔血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２， ８４０４ （１９８５）］等が挙げられ、そのｐＨは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約２０〜４０℃で１５〜１００時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。

ＧＤＨの精製は、ＧＤＨ活性の存在する画分に応じて、通常使用される種々の分離技術を適宜組み合わせることにより行うことができる。
培養物の培地中に存在するＧＤＨは、培養物を遠心または濾過して培養上清（濾液）を得、該培養上清から、例えば、塩析、溶媒沈澱、透析、限外濾過、ゲル濾過、非変性ＰＡＧＥ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動などの公知の分離方法を適当に選択して行うことにより得ることができる。

一方、細胞質に存在するＧＤＨは、培養物を遠心または濾過して細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、例えば超音波処理、リゾチーム処理、凍結融解、浸透圧ショック、および／またはトライトン−Ｘ１００等の界面活性剤処理などにより、細胞およびオルガネラ膜を破砕（溶解）した後、遠心分離や濾過などによりデブリスを除去して可溶性画分を得、該可溶性画分を、上記と同様の方法で処理することにより単離精製することができる。

組換えＧＤＨを迅速且つ簡便に取得する手段として、ＧＤＨのコード配列のある部分（好ましくはＮまたはＣ末端）に、金属イオンキレートに吸着し得るアミノ酸配列（例えば、ヒスチジン、アルギニン、リシン等の塩基性アミノ酸からなる配列、好ましくはヒスチジンからなる配列）（いわゆる「タグ」）をコードするＤＮＡ配列を、遺伝子操作により付加して宿主細胞で発現させ、該細胞の培養物のＧＤＨ活性画分から、該金属イオンキレートを固定化した担体とのアフィニティーによりＧＤＨを分離回収する方法が好ましく例示される。
金属イオンキレートに吸着し得るアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は、例えば、ＧＤＨをコードするＤＮＡをクローニングする過程で、ＧＤＨのＣ末端アミノ酸配列をコードする塩基配列に該ＤＮＡ配列を連結したハイブリッドプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行ったり、あるいは該ＤＮＡ配列を終止コドンの前に含む発現ベクターにＧＤＨをコードするＤＮＡをインフレームで挿入することにより、ＧＤＨコード配列に導入することができる。また、精製に使用される金属イオンキレート吸着体は、遷移金属、例えばコバルト、銅、ニッケル、鉄の二価イオン、あるいは鉄、アルミニウムの三価イオン等、好ましくはコバルトまたはニッケルの二価イオン含有溶液を、リガンド、例えばイミノジ酢酸（ＩＤＡ）基、ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）基、トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン（ＴＥＤ）基等を付着したマトリックスと接触させて該リガンドに結合させることにより調製される。キレート吸着体のマトリックス部は通常の不溶性担体であれば特に限定されない。
あるいは、タグとしてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース
結合タンパク質（ＭＢＰ）、ＨＡ、ＦＬＡＧペプチドなどを用いてアフィニティー精製することもできる。

上記精製工程において、必要に応じて膜濃縮、減圧濃縮、活性化剤および安定化剤添加等の処理を行うこともできる。特に本ＧＤＨは耐熱性に優れているため、他の宿主細胞由来夾雑タンパク質を熱変性せしめ、かつＧＤＨ活性を保持しうる範囲での加温処理が、大幅なＧＤＨ純度向上に有効である。これら工程に用いる溶媒としては特に限定されないが、ｐＨ６〜９程度の範囲において緩衝能を有するＫ−リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、ＧＯＯＤの緩衝液等に代表される各種緩衝液が好ましい。

かくして得られるＧＤＨが遊離体である場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって該遊離体を塩に変換することができ、該タンパク質が塩として得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により該塩を遊離体または他の塩に変換することができる。
また、該ＧＤＨを含む溶液または組成物に対して安定化剤及び／又は活性化剤としてウシ血清アルブミン、セリシン等のタンパク質、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、コール酸塩、デオキシコール酸塩などの界面活性剤、グリシン、セリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシルグリシン等のアミノ酸、トレハロース、イノシトール、ソルビトール、キシリトール、グリセロール、スクロース等の糖及び／又は糖アルコール類、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類を適宜添加してもよい。

精製酵素は液状で産業利用に供することも可能であるが、粉末化し、あるいはさらに造粒することもできる。液状酵素の粉末化は定法により凍結乾燥することでなされる。

さらに、本発明のＧＤＨは、それをコードするＤＮＡに対応するＲＮＡを鋳型として、ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセートなどからなる無細胞タンパク質翻訳系を用いてインビトロ翻訳することによっても合成することができる。
本発明のＧＤＨをコードするＲＮＡは、本発明のＧＤＨをコードするｃＤＮＡの取得方法において上記した、本発明のＧＤＨをコードするｍＲＮＡを常法を用いて該ＲＮＡを発現する宿主細胞から精製するか、あるいは、ＧＤＨをコードするＤＮＡを鋳型とし、ＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞転写系を用いてｃＲＮＡを調製することによって取得することができる。無細胞タンパク質転写／翻訳系は市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には、大腸菌抽出液はＰｒａｔｔ Ｊ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， "Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ"， Ｈａｍｅｓ Ｂ．Ｄ． ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ． ｅｄｓ．， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ １７９−２０９ （１９８４） に記載の方法等に準じて調製することもできる。
市販の細胞ライセートとしては、大腸菌由来のものはＥ．ｃｏｌｉ Ｓ３０ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ社製） やＲＴＳ ５００ Ｒａｐｉｄ Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｒｏｃｈｅ社製） 等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはＲａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ社製） 等、さらにコムギ胚芽由来のものはＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（ＴＯＹＯＢＯ社製） 等が挙げられる。このうちコムギ胚芽ライセートを用いたものが好適である。コムギ胚芽ライセートの作製法としては、例えばＪｏｈｎｓｔｏｎ Ｆ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １７９： １６０−１６１ （１９５７） あるいはＥｒｉｃｋｓｏｎ Ａ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ９６： ３８−５０ （１９９６） 等に記載の方法を用いることができる。

化学合成によるＧＤＨの製造は、例えば、配列番号１に所望の変異を導入したアミノ酸配列、すなわち本発明のGDHのアミノ酸配列を基にして、配列の全部または一部をペプチ
ド合成機を用いて合成することにより行うことができる。
ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。本発明のＧＤＨを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を含む場合は保護基を脱離することにより、目的とするタンパク質を製造することができる。ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の（１）および（２）に記載された方法に従って行われる。
（１） Ｍ． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙａｎｄ Ｍ．Ａ． Ｏｎｄｅｔｔｉ， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９６６）
（２） Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ａｎｄ Ｌｕｅｂｋｅ， Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ＮｅｗＹｏｒｋ（１９６５）

このようにして得られた本発明のＧＤＨは、公知の精製法により精製単離することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。
上記方法で得られるＧＤＨが遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆にタンパク質が塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。

［４］グルコース測定用試薬
本発明のグルコース測定用試薬は、典型的には、本発明のＧＤＨ、補酵素、緩衝液、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。また好ましくはメディエーターなど測定に必要な試薬を含む。また、ＧＤＨを含む試薬中には、安定化剤及び／又は活性化剤としてウシ血清アルブミン、セリシン等のタンパク質、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、コール酸塩、デオキシコール酸塩などの界面活性剤、グリシン、セリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシルグリシン等のアミノ酸、トレハロース、イノシトール、ソルビトール、キシリトール、グリセロール、スクロース等の糖及び／又は糖アルコール類、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類を適宜添加してもよい。

［５］グルコースアッセイキット
本発明のグルコースアッセイキットは、典型的には、本発明のＧＤＨ、補酵素、緩衝液、メディエーターなど測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。
本発明のキットは、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。また、ＧＤＨを含む試薬中には、安定化剤及び／又は活性化剤としてウシ血清アルブミン、セリシン等のタンパク質、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、コール酸塩、デオキシコール酸塩などの界面活性剤、グリシン、セリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシルグリシン等のアミノ酸、トレハロース、イノシトール、ソルビトール、キシリトール、グリセロール、スクロース等の糖及び／又は糖アルコール類、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類を適宜添加してもよい。

［６］グルコースセンサ
本発明のグルコースセンサは、電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上にＧＤＨを固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどを用いる方法があり、ＮＡＤもしくはＮＡＤＰといった補酵素、あるいは電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。
本発明のＧＤＨは補酵素であるＮＡＤもしくはＮＡＤＰと共存させた形態で電極上に固定化するが、補酵素不在の形態で固定化し、補酵素を別の層としてまたは溶液中で供給することも可能である。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
使用する電子メディエーターとしては、ＧＤＨの補酵素であるＮＡＤもしくはＮＡＤＰから電子を受け取り、発色物質や電極に電子を供与しうるものが挙げられ、たとえばフェリシアン化物塩、フェナジンエトサルフェート、フェナジンメトサルフェート、フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルフェニレンジアミン、１−メトキシ−フェナジンメトサルフェート、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、２，５−ジメチル−１，４−ベンゾキノン、２，６−ジメチル−１，４−ベンゾキノン、２，５−ジクロロ−１，４−ベンゾキノン、ニトロソアニリン、フェロセン誘導体、オスミウム錯体、ルテニウム錯体等が例示されるが、これらに限定されない。
また、電極上のＧＤＨ組成物中には、安定化剤及び／又は活性化剤としてウシ血清アルブミン、セリシン等のタンパク質、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、コール酸塩、デオキシコール酸塩などの界面活性剤、グリシン、セリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシルグリシン等のアミノ酸、トレハロース、イノシトール、ソルビトール、キシリトール、グリセロール、スクロース等の糖及び／又は糖アルコール類、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類を適宜添加してもよく、またあるいはプルラン、デキストラン、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースなどに代表される親水性ポリマーを賦形剤として含んでもよい。

グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液、ＧＤＨ、補酵素としてＮＡＤもしくはＮＡＤＰを含む反応液を入れ、一定温度に維持する。そこにグルコースを含む試料を加え、一定温度で一定時間反応させる。この間、３４０ｎｍの吸光度をモニタリングする。レート法であれば吸光度の時間あたりの上昇率から、エンドポイント法であれば試料中のグルコースがすべて酸化された時点までの吸光度上昇度より、あらかじめ標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブを元に試料中のグルコース濃度を算出することができる。また、可視光領域での比色による定量を行う場合においては、さらに適当なメディエーター及び発色試薬を添加すればよい。
このような例としては、たとえば２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）を添加し、６００ｎｍにおける吸光度の減少をモニタリングすることでグルコースの定量が可能である。また、メディエーターとしてｐｈｅｎａｚｉｎｅ ｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ （ＰＭＳ）を、さらに発色試薬としてｎｉｔｒｏｔｅｔｒａｚｏｒｉｕｍ ｂｌｕｅ （ＮＴＢ）を加え、５７０ｎｍ吸光度を測定することにより生成するジホルマザンの量を決定し、グルコース濃度を算出することが可能である。いうまでもなく使用するメディエーターおよび発色試薬はこれらに限定されない。

またグルコース濃度の測定は、以下のようにしても行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、補酵素、および必要に応じてメディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明のＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。

活性測定例
本発明においては、ＧＤＨ活性は特に断りのない限り、以下の方法に従って行われる。
反応液（０．１ｍｏｌ／Ｌ トリス、１０ｍｍｏｌ／Ｌ β−ＮＡＤ^＋、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｄ−グルコース、 ｐＨ８．０）２．９ｍＬを石英セルにいれ、３７℃で５分間予備加温する。そしてＧＤＨ溶液０．１ｍＬを加えて混和し、３７℃で５分反応させ、この間３４０ｎｍ吸光度を測定する。吸光度変化の直線部分から１分間あたりの吸光度の上昇度（ΔＯＤ_ＴＥＳＴ）を算出する。盲検は、ＧＤＨ溶液の代わりに緩衝液を加えて混和し、同様に３７℃５分インキュベートして３４０ｎｍ吸光度を記録し、１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ_{ＢＬＡＮＫ}）を算出する。これらの値を以下の式に当てはめて活性値（Ｕ／ｍＬ）を算出する。なおここでは、基質存在下で１分間に１マイクロモルの補酵素を還元する酵素量を１Ｕと定義する。

ＧＤＨ活性（Ｕ／ｍＬ）＝［（ΔＯＤ_ＴＥＳＴ−ΔＯＤ_{ＢＬＡＮＫ}）×３．０×希釈倍率］／（６．２２×１．０×０．１）

なお、ここで
３．０ ：ＧＤＨ溶液混和後の容量（ｍＬ）
６．２２ ：ＮＡＤＨのミリモル分子吸光係数（ｃｍ^２／マイクロモル）
１．０ ：光路長（ｃｍ）
０．１ ：添加するＧＤＨ溶液の液量（ｍＬ）
である。

タンパク質の定量および比活性の算出例
本発明に述べるタンパク質量は２８０ｎｍの吸光度を測定することにより測定したものである。
すなわち、２８０ｎｍにおける吸光度が０．１〜１．０の範囲となるように酵素溶液を蒸留水で希釈し、蒸留水を用いてゼロ点補正を行った吸光度計を用いて２８０ｎｍの吸光度（Ａｂｓ）を測定する。本発明に述べるタンパク質濃度は、１Ａｂｓ≒１ｍｇ／ｍｌと近似し、吸光度の測定と測定した溶液の希釈倍率とを乗じた値で示したものである。
また、本発明に述べる比活性とは、本測定方法によるタンパク質量として１ｍｇあたりのＧＤＨの活性（Ｕ／ｍｇ）であり、この際のＧＤＨ活性は、上記活性測定例に従って測定することにより得られる値である。

ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）に対するミカエリス定数（Ｋｍ）の算出例
本発明に述べるＮＡＤに対するミカエリス定数（Ｋｍ）の算出方法は、以下の測定方法により行う。
すなわち、測定溶液として上述の活性測定例に記載の反応液組成におけるβ―ＮＡＤ＋の濃度を２０ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ、０．５ｍｍｏｌ／Ｌとした６種類の反応液を作製し、それぞれの測定溶液を用いて上述の活性測定例の方法に従いＧＤＨ溶液（上述の活性測定例における活性値が０．８Ｕ／ｍｌとなるよう調整した溶液）のΔＯＤ（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。それら測定値をもとにＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロット法（両逆数プロット法）に従ってミカエリス定数（Ｋｍ）を算出する。

グルコースに対するミカエリス定数（Ｋｍ）の算出例
本発明に述べる基質に対するミカエリス定数（Ｋｍ）の算出方法は、以下の測定方法により行う。
すなわち、測定溶液として上述の活性測定例に記載の反応液組成におけるＤ−グルコースの濃度を１０００ｍｍｏｌ／Ｌ、 ２００ｍｍｏｌ／Ｌ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌとした６種類の反応液を作製し、それぞれの測定溶液を用いて上述の活性測定例の方法に従いＧＤＨ溶液（上述の活性測定例における活性値が０．８Ｕ／ｍｌとなるよう調整した溶液）のΔＯＤ（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。それら測定値をもとにＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロット法（両逆数プロット法）に従ってミカエリス定数（Ｋｍ）を算出する

基質特異性の算出例
本発明に述べる基質特異性の評価方法は、以下の測定方法により行う。すなわち、測定溶液として上述の活性測定例に記載の反応液組成におけるＤ−グルコースに換えて、マルトース、ガラクトース、キシロースを１５０ｍｍｏｌ／Ｌ含む反応液をそれぞれ作製し、これらを用いて活性測定例に従って活性値を測定する。これら反応液を用いた活性値を、グルコースを基質とした場合の活性値で割った値を、各基質に対する反応性（対グルコース％）として算出する。

２５℃／３７℃活性温度比の算出例
本発明に述べる２５℃／３７℃活性温度比の算出方法は、以下のとおり行う。
すなわち、上述の活性測定例による活性の測定を、反応温度２５℃において実施することで得られる活性値を、３７℃において測定した活性値で割ることにより２５℃／３７℃活性温度比を算出する。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

まず、本発明者らがサーモプロテウス・エスピー・ＧＤＨ１株（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐ． ＧＤＨ１）より取得したグルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列（配列番号２に記載のアミノ酸配列）をコードする遺伝子（配列番号１）および該遺伝子を挿入したプラスミドの取得方法を、以下の試験例１〜４に示す。（この方法は特願２００８−６００３２にも記載されている。）

＜試験例１＞
超好熱性始原菌の培養とＧＤＨの精製
発明者らは、鹿児島県小宝島の温泉水より超好熱性始原菌を分離した。本菌株は、１６ＳｒＲＮＡの塩基配列より、サーモプロテウス属に分類される菌であると推定され、さらに以下の（Ａ）〜（Ｇ）に示す特性を有していた。（Ａ）１６ＳｒＲＮＡをコードするゲノムＤＮＡ上の塩基配列として、配列番号３に示す塩基配列を含む。（Ｂ）８０℃以上の温度で生育可能であり、至適生育温度は約９０℃である。（Ｃ）ゲノムＤＮＡのＧＣ含量が５８〜６２モル％である。（Ｄ）絶対嫌気性菌である。（Ｅ）電子受容体としてチオ硫酸塩を加えた場合に良好な増殖を示す。（Ｆ）ＮａＣｌ濃度１％以下で生育可能である。（Ｇ）形状は長さ１０〜３０μｍ、幅約５μｍの長桿菌である。以上の特徴を有する本菌株を、サーモプロテウス・エスピー・ＧＤＨ１株（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐ． ＧＤＨ１）と名づけた。
ＧＤＨ１株を培養するにあたって、０．５％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％チオ硫酸ナトリウム、０．５％塩化ナトリウム、０．００５％硫化ナトリウム、さらに溶存酸素の指示薬として５ｍｇ／Ｌのレサズリンを成分として含む培地を嫌気性グローブボックスに入れ、窒素置換を繰り返すことで培地中の酸素を除いた。ここに、上記の分離菌株を植え、８５℃で３日間静置培養した。さらに、上記培地組成に終濃度０．５％のグルコースを追加した培地に増殖菌体を植え継ぎ、８５℃で３日間嫌気培養を行った。培養液７Ｌを、高速冷却遠心装置を用いて遠心し、上清を除くことで菌体を回収した。この菌体を２０ｍＬの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁して氷上に置き、超音波破砕機（トミー精工社製、ＵＤ−２０１）を用いて出力３、駆動率４０％で１０分処理し、菌体を破砕した。破砕液をさらに遠心分離することで固形残渣を取り除き、ＧＤＨ粗抽出液を得た。この粗抽出液に、硫酸アンモニウムを終濃度３０％となるよう溶解して室温で２０分攪拌することで夾雑タンパク質を沈殿させた。遠心分離にて沈殿を取り除き、さらに終濃度４８％となるよう硫酸アンモニウムを加えて溶解し、室温で２０分攪拌することでＧＤＨを含む画分を沈殿させた。遠心分離にて上清を取り除き、得られたＧＤＨ画分を２０ｍＬの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解した。この液をカラム容量６ｍＬのＲｅｓｏｕｒｃｅＱ（ＧＥヘルスケア社製）にアプライして夾
雑タンパク質をカラムに吸着させ、ＧＤＨを透過させた。この透過液に終濃度２２．８％となるよう硫酸アンモニウムを溶解し、疎水性カラムであるｒｅｓｏｕｒｃｅＩＳＯカラム（ＧＥヘルスケア社製、容量６ｍＬ）にアプライし吸着させた。硫酸アンモニウム濃度２２．８％〜０％のグラジエントをかけて吸着タンパク質を溶出してＧＤＨ活性を有するフラクションを集めた。さらに分離カラムとしてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００、溶出バッファーとして５０ｍＭトリス、０．１５ｍＭ塩化ナトリウムを含むｐＨ７．０の緩衝液を用いてゲルろ過を行った。得られたＧＤＨ画分を精製溶液とした。

＜試験例２＞
ＧＤＨ遺伝子のクローニング
実施例１で得られたＧＤＨ溶液１０μＬに等量の２×ＳＤＳサンプルバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、０．１％ブロモフェノールブルー、２％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、ｐＨ６．８）を加えて１００℃で１０分煮沸した。これを１２．５％アクリルアミドゲルにアプライし、４０ｍＡで電気泳動の後、ＣＢＢ Ｓｔａｉｎ Ｏｎｅ（ナカライテスク社製）を用いてゲルのＣＢＢ染色を行った。染色後のゲルから、サンプルのメインバンドを切り出し、質量分析装置によるペプチドシーケンスの解析を行った。得られた推定アミノ酸配列を元に、ミックス塩基を含むディジェネレートＰＣＲプライマーを作製し、ゲノムＤＮＡをテンプレートにＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ反応液を１％アガロースゲルにアプライして電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色したのち、ＵＶ照射下で増幅したＧＤＨ遺伝子の内部部分断片のバンドを切り出した。そして切り出したゲル片からＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いてＤＮＡを抽出・精製した。得られたＤＮＡ断片を東洋紡製ＴＡｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ Ｐｌｕｓを用い、ＴＡクローニングの要領で本キットに付属のクローニングベクターｐＴＡ２にライゲーションした。ライゲーション産物を大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡製コンピテントハイＪＭ１０９）に添加してヒートショックによる形質転換を行い、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢアガロースプレート上に塗布、３７℃一晩培養して形質転換体コロニーを形成させた。複数のコロニーをそれぞれ５ｍＬのＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）に植菌して一晩培養し、培養液からＱｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐ ミニプレップキット（バイオラッド社製）を用いて、本キットのマニュアルに従いプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドのインサートの塩基配列を解析することで、目的のＧＤＨ遺伝子の部分塩基配列を決定した。さらに決定した配列を元に、内部部分配列の外側に向けたプライマーを作製し、このプライマーとＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ製）を用いてＧＤＨ遺伝子の５’側および３’側末端領域の増幅および塩基配列決定を行うことで、遺伝子の全塩基配列を決定した。決定した塩基配列を配列番号１に、推定されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。

＜試験例３＞
ＧＤＨ発現ベクターの構築
超好熱菌ゲノムＤＮＡをテンプレートに、ＧＤＨ遺伝子の開始コドンにＮｄｅＩ、終止コドン直後にＢａｍＨＩサイトを付加させた配列を有するよう設計したプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。反応液を１％アガロースゲルにアプライして電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色したのち、ＵＶ照射下で増幅したＧＤＨ遺伝子のバンドを切り出した。そして切り出したゲル片からＤＮＡを抽出・精製し、得られたＤＮＡ断片をＴＡｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ Ｐｌｕｓを用い、本キットに付属のクローニングベクターｐＴＡ２に挿入した（ｐＴＡ２ＴＧＤＨ１）。挿入したＧＤＨ遺伝子内部に存在するＮｄｅＩサイト（ＣＡＴＡＴＧ）を、コードするアミノ酸は変えずに別の塩基配列に置換するために以下の操作を行った。５’−ＡＧＣＡＣＧＧＣＡＴＴＴＧＧＧＧＧＣＴＣＣ−３’（配列番号４）および５’−ＧＧＡＧＣＣＣＣＣＡＡＡＴＧＣＣＧＴＧＣＴ−３’（配列番号５）からなる塩基配列を有するオリゴＤＮＡをプライマーとし、上記で得られたｐＴＡ２ＴＧＤ
Ｈ１をテンプレートとしてＰＣＲと同様の反応をサーマルサイクラーを用いて行った。つづいて反応液に対液２％のＤｐｎＩを添加し、３７℃１時間処理することでテンプレート（ｐＴＡ２ＴＧＤＨ１）を消化した。このＤｐｎＩ処理液を大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡製コンピテントハイＪＭ１０９）に添加してヒートショックによる形質転換を行い、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢアガロースプレート上に塗布、３７℃一晩培養して形質転換体コロニーを形成させた。複数のコロニーをそれぞれ５ｍＬのＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）に植菌して一晩培養し、培養液からＱｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐ プラスミドミニプレップキットを用いてプラスミドを抽出した。得られたプラスミドの塩基配列を解析し、ＧＤＨアミノ酸配列のうち１１３番目のイソロイシンをコードするコドンがＡＴＡからＡＴＴに変換された、すなわちＧＤＨ遺伝子塩基配列のうち３３９番目のＡがＴに置換されたことを確認して配列修正済みプラスミドｐＴＡ２ＴＧＤＨ２とした。このｐＴＡ２ＴＧＤＨ２についてＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩによる制限酵素処理を行い、１％アガロースゲルで電気泳動を行ってＧＤＨ遺伝子（ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ切断末端を５’、３’末端にそれぞれ有する）を含むゲル片を切り出し、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍを用いてＤＮＡを抽出・精製した。これを同じ制限酵素で処理した発現ベクターｐＥＴ２１ａと混合し、この混合液と等量のライゲーションハイ（東洋紡製）を混和して１６℃３０分インキュベートすることによりライゲーションを行った。このライゲーション液を大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセルに添加してヒートショックによる形質転換を行い、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢアガロースプレート上に塗布、３７℃一晩培養して形質転換体コロニーを形成させた。形質転換体コロニーのうち、コロニーダイレクトＰＣＲでインサートの挿入が確認されたものを５ｍＬのＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）に植菌して一晩培養した。培養液を遠心分離して得られた菌体から、プラスミド抽出キットを用いてプラスミドを回収した。このプラスミドのインサートのシーケンス解析により、正しい遺伝子配列を有していることを確認して発現ベクター（ｐＥＴ２１ａＴＧＤＨ２）とした。

＜試験例４＞
ＧＤＨ遺伝子の発現と精製
実施例３で得たｐＥＴ２１ａＴＧＤＨ２を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（ストラタジーン社製）に添付のマニュアルに従ってヒートショック導入し、形質転換株を得た。形質転換コロニーを試験管中のＬＢ培地５ｍＬ（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）８本に懸濁し、３７℃で１晩振とう培養した。得られた培養液を、２Ｌ容坂口フラスコ中のＬＢ培地８００ｍＬ（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）４本にそれぞれ８ｍＬずつ植菌した。フラスコは３７℃１２０ｒｐｍで３時間振とうし、６６０ｎｍにおける菌体濁度が約０．６になった時点で終濃度０．１ｍＭとなるようＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃１２０ｒｐｍで４時間振とう培養を継続した。培養液を高速冷却遠心分離機で遠心分離して上清をデカントにより除き、得られた菌体を７０ｍＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液＋０．１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁した。この懸濁液に、超音波破砕機（トミー精工社製、ＵＤ−２０１）を用いて出力４、駆動率４０％で２０分処理することで菌体を破砕した。破砕液を遠心分離して残渣を取り除き、ＧＤＨ粗抽出液とした。この粗抽出液を８５℃で３０分処理して夾雑タンパク質を変性させ、変性タンパク質を遠心分離によって除いた。上清画分は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ・０．１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）で緩衝化したｒｅｓｏｕｒｃｅＱカラムを透過させた後、透過液に対液２１．３％の硫酸アンモニウムを溶解させた。この液を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ・２２．８％硫酸アンモニウム（ｐＨ８．０）で緩衝化したｒｅｓｏｕｒｃｅＩＳＯカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム濃度０％までのグラジエント溶出を行い、ＧＤＨ画分を集めた。この画分をさらにｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを用いてゲルろ過し、得られたＧＤＨ画分を精製リコンビナントＧＤＨ溶液とした。この精製溶液は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにてＣＢＢ染色で単一バンドを示す純品であることを確認した。

＜実施例１＞
２０２番目アルギニンに相当する残基の部位特異的変異導入
試験例３の要領で得たｐＥＴ２１ａＴＧＤＨ２を制限酵素ＮｄｅＩ・ＢａｍＨＩで消化し、１％アガロースを含むゲルにアプライして電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色ののち紫外線照射下で約１ｋｂのバンドを切り出し、切り出したゲルを東洋紡製の核酸精製キット（ＭａｇＥｘｔｒａｎｔｏｒ −Ｇｅｌ＆ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ Ｕｐ−）を用いて精製・抽出することで野生型ＧＤＨをコードするＤＮＡ断片を得た。
この精製ＤＮＡをＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩによる制限酵素処理を行った発現ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳＮ＋（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋のβガラクトシダーゼ遺伝子翻訳開始コドン位置に塩基置換によりＮｄｅＩサイトを導入したもの）溶液と混合してライゲーションを行うことで発現プラスミドｐＢＳＴＧＤＨ２を作製した。
２０２番目アルギニンを別の任意のアミノ酸残基に置換するにあたって、ミスマッチプライマーの設計を行った。プライマーの配列は、Ｒ２０２Ｘ−Ｆ：５’−ＣＧＴＧＧＣＣＡＣＧＮＮＳＣＣＧＣＣＧＧＡＴ−３’（配列番号６）、Ｒ２０２Ｘ−Ｒ：５’−ＡＴＣＣＧＧＣＧＧＳＮＮＣＧＴＧＧＣＣＡＣＧ−３’（配列番号７）である。但し、配列中のＮはＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃを含むミックス塩基、ＳはＧ、Ｃを含むミックス塩基を示す。
このミスマッチプライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応並びに制限酵素ＤｐｎＩ処理によるテンプレートＤＮＡの消化を経て、２０２番目Ａｒｇに任意の変異が導入されたＧＤＨの発現プラスミドライブラリーを作製した。このライブラリー溶液を大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡製コンピテント・ハイＪＭ１０９）に添加し、本製品に添付のマニュアルに従ってヒートショックにより形質転換を行った。
得られた形質転換コロニーから５０個を爪楊枝でピックアップし、それぞれ試験管中の５ｍｌのＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む）に植菌し、３７℃で２４時間振とう培養を行った。培養液１ｍｌを１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブに移し、１２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除いて菌体を得た。この菌体を２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）１ｍｌに懸濁し、超音波処理により菌体を破砕した。
この破砕液についてまずは活性測定例に記載のとおり活性を測り、活性の認められた液について培養液からミニプレップによりプラスミドを抽出・精製し、シーケンスを解析することで２０２番目アルギニンに相当する部位に導入されたアミノ酸置換を調べた。
またこれら変異型ＧＤＨについては、発現プラスミドを形質転換した大腸菌ＪＭ１０９株を５００ｍｌ容坂口フラスコに入った５０ｍｌＧＤＨ生産培地（２．４％酵母エキス、２．４％ペプトン、１．２５％リン酸１水素２カリウム、０．２３％リン酸２水素１カリウム、０．４％グリセロール、ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃１８０ｒｐｍで２４時間振とう培養して発現させた。
得られた培養液を遠心後上清を捨てて菌体を得、これを１０ｍｌの２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により破砕した。さらにこの破砕液に１．５２ｇの硫酸アンモニウムを加えて溶解し、６０℃１時間の加温を行い、さらに遠心分離によって沈殿を除いた。この溶液を、１５．２％硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）で緩衝化させたＯｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）にアプライしてＧＤＨを樹脂に吸着させた。そして硫酸アンモニウム濃度を１５．２％から０％へ、同時にエチレングリコール濃度を０％から０．１％へ、それぞれグラジエントをかけながらバッファーを通液することでＧＤＨを溶出させた。最後に、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）により緩衝化したＧ−２５
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂を用いて脱塩を行い、精製ＧＤＨとした。

このようにして得た精製ＧＤＨについて、ＮＡＤに対するミカエリス定数の算出・グルコースに対するミカエリス定数の算出を上述の算出例に従ってそれぞれ測定・算出した。
また、ｐＢＳＴＧＤＨ２を発現ベクターとして使用し、同様に発現および精製を行った野生型ＧＤＨについても同様にＮＡＤに対するミカエリス定数の算出・グルコースに対す
るミカエリス定数の算出を行った。
結果を表１に示す。この結果から、２０２番目アルギニンに相当するアミノ酸残基を、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、およびリジンのいずれかに置換した変異酵素では、野生型に比べてＮＡＤに対するミカエリス定数が低下していることが見出された。また、２０２番目アルギニンに相当するアミノ酸残基を、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、およびアスパラギンのいずれかに置換した変異酵素では、野生型に比べて基質（グルコース）に対するミカエリス定数が低下していることが見出された。

さらに、試験例４で得た野生型ＧＤＨとＲ２０２Ｓ変異酵素の３７℃における比活性をそれぞれ上述の方法に従って算出した。その結果、野生型ＧＤＨが１７２Ｕ／ｍｇであったのに対しＲ２０２Ｓは２２９Ｕ／ｍｇであった。上述の精製方法に従って精製したＲ２０２Ｓ変異型ＧＤＨの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば全タンパク質の約８５〜９０％であり、すなわちＲ２０２Ｓ変異型ＧＤＨ自体の比活性は少なくとも２２９Ｕ／ｍｇを超える比活性を有しているということができる。以上から、Ｒ２０２Ｓ変異型ＧＤＨは野生型ＧＤＨに比して比活性が上昇していることが確認された。

＜実施例２＞
３４０番目リジンおよびその近傍への部位特異的変異導入
実施例１で得られた、２０２番目アルギニンをセリンに置換した変異酵素（Ｒ２０２Ｓ）の発現プラスミドをテンプレートとして用い、実施例１の要領でさらに３３９番目〜３４１番目へのアミノ酸置換導入の検討を行い、特製が改変したと推定される変異酵素の選抜、並びに導入されたアミノ酸置換の確認を行った。またそれぞれについて実施例１のとおり作製した精製酵素について、比活性、ＮＡＤに対するミカエリス定数、およびグルコースに対するミカエリス定数の算出を上述の方法に従って行った。
導入されたアミノ酸置換と、それぞれの変異酵素の特性を表２に示す。Ｒ２０２Ｓに加えて、Ｔ３４１Ｒ、Ｔ３４１Ｇ、Ｔ３４１Ｍのいずれかの変異がさらに導入された変異ＧＤＨにおいて、３７℃における比活性のさらなる向上が見出された。また、Ｒ２０２Ｓに加えて、Ｉ３３９Ｐ、Ｋ３４０Ｒ、Ｔ３４１Ｒ、Ｔ３４１Ｐ、Ｔ３４１Ｍ、Ｔ３４１ＳおよびＴ３４１Ｇのいずれかの変異がさらに導入された変異ＧＤＨにおいて、ＮＡＤに対するミカエリス定数のさらなる低下が見出された。同時に、Ｒ２０２ＫおよびＲ２０２ＮについてもＫ３４０Ｒとの組合せを検討したところ、これらもＲ２０２Ｓとの組みあわせ同
様にＮＡＤに対するミカエリス定数の顕著な低下がみられた。さらに、Ｒ２０２Ｓに加えて、Ｔ３４１Ｒ、Ｔ３４１Ｍ、Ｔ３４１Ｇのいずれかの変異がさらに導入された変異ＧＤＨにおいて、グルコースに対するミカエリス定数の顕著な低下が見出された。

引き続き、Ｒ２０２Ｓ＋Ｉ３３９Ｐをベースに３４１番目トレオニンへの変異導入の検討を行った。このＲ２０２Ｓ＋Ｉ３３９Ｐは補酵素ＮＡＤに対するミカエリス定数の低下した変異酵素として取得されたものであって、３７℃における比活性は１３２Ｕ／ｍｇとむしろ野生型よりも低い。しかし、この変異酵素に３４１番目のアミノ酸置換を組み合わせることで意外にも飛躍的な３７℃における比活性の向上が認められた。
効果のあった組合せとしては、表２に示すＲ２０２Ｓ＋Ｉ３３９Ｐ＋Ｔ３４１Ｇ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｉ３３９Ｐ＋Ｔ３４１Ｒ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｉ３３９Ｐ＋Ｔ３４１ＬおよびＲ２０２Ｓ＋Ｉ３３９Ｐ＋Ｔ３４１Ｋであった。また、Ｒ２０２Ｓ＋Ｉ３３９Ｐは、グルコースに対するミカエリス定数としては野生型よりも低減されているものの、Ｒ２０２Ｓ単独変異よりは高まっている。
しかし、このＲ２０２Ｓ＋Ｉ３３９Ｐに加えて、Ｔ３４１Ｇ、Ｔ３４１Ｒ、Ｔ３４１ＬおよびＴ３４１Ｋのいずれかの変異をさらに加えることにより、グルコースに対するミカエリス定数の顕著な低減が認められた。

＜実施例３＞
ランダム変異導入による改変
実施例１で得られた、２０２番目アルギニンをセリンに置換した変異酵素（Ｒ２０２Ｓ）の発現プラスミドをテンプレートとして、エラープローンＰＣＲを実施することにより、ＧＤＨ遺伝子全長およびその上流・下流部分を含む領域を増幅させた。
エラープローンＰＣＲは、クロンテック社製ＤｉｖｅｒｓｉｆｙＴＭ ＰＣＲ Ｒａｍｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、本キットに添付のマニュアルに従って
行い、ＧＤＨ遺伝子中にランダムに変異を導入させた。
増幅されたＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで処理し、同じ制限酵素処理を行った発現ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳＮ＋溶液と混合してライゲーションを行うことでランダム変異ＧＤＨ発現プラスミドライブラリーを作製した。
このライブラリ溶液を大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセルに形質転換し、得られた形質転換コロニーを９６ウエルマイクロプレート中のＬＢ培地４００μＬに植菌し、マイクロプレートシェーカーを用いて３７℃で２４時間振とう培養した。
得られた培養液は液体窒素による凍結と６０℃ヒートバス湯浴による融解を繰り返すことで菌体を破砕し、１０μＬの破砕液を２００μＬのアッセイ溶液（５０ｍＭ Ｄ−グルコース、２ｍＭ β―ＮＡＤ^＋、０．２ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）に懸濁、室温に静置してＤＣＰＩＰの青色の退色を目視することにより活性の有無を判断した。
活性の認められた液について上述の活性測定例に従って活性を測定した。また、ＮＡＤに対するミカエリス定数の低下を評価するために、活性測定例に記載の反応液組成のうち、ＮＡＤ濃度を０．２ｍＭ、５ｍＭとした２種類の反応液を作製して活性を測定し、０．２ｍＭのＮＡＤを使用して測定した活性値を５ｍＭのＮＡＤを使用して測定した活性値で割ることにより、０．２ｍＭ／５ｍＭ比を算出した。
また、グルコースに対するミカエリス定数の低下を評価するために、活性測定例に記載の反応液組成のうち、グルコース濃度を１５ｍＭ、１５０ｍＭとした２種類の反応液を作製して活性を測定し、１５ｍＭグルコースを使用して測定した活性値を１５０ｍＭのグルコースを使用して測定した活性値で割ることにより、１５ｍＭ／１５０ｍＭ比を算出した。
これらの値が同様に培養・破砕を行って生産したＲ２０２Ｓ変異酵素と比して上昇しているものを選抜した。約１０，０００コロニーについてアッセイし、２５株を選抜してそれぞれについて導入された変異をプラスミドのシーケンス解析により特定すると共に、それぞれの変異酵素について実施例１の要領に従って培養発現・精製し、各種酵素特性を調べた。さらに、上記の「２５℃／３７℃活性温度比の算出例」に記載の方法に従い、各変異酵素について温度依存性の評価も実施した。

導入された変異と各変異酵素の特性とを表３に示す。比活性向上という観点から改変効果のみられた変異としては、Ａ３Ｖ＋Ｒ２０２Ｓ、Ｉ４６Ｖ＋Ｓ１２４Ｐ＋Ｒ２０２Ｓ、Ｋ４９Ｒ＋Ｒ２０２Ｓ、Ｄ５８Ｖ＋Ｒ２０２Ｓ＋Ｙ３２８Ｄ、Ｇ７４Ｄ＋Ｒ２０２Ｓ＋Ｅ３０６Ｇ＋Ａ３２３Ｔ、Ｖ８０Ａ＋Ｒ２０２Ｓ、Ｌ８５Ｈ＋Ｒ２０２Ｓ、Ｔ８９Ｋ＋Ｒ２０２Ｓ、Ａ１２１Ｔ＋Ｒ２０２Ｓ、Ｓ１２４Ｌ＋Ｒ２０２Ｓ、Ｋ１６８Ｅ＋Ｒ２０２Ｓ＋Ｅ３３０Ｇ、Ａ１７３Ｔ＋Ｒ２０２Ｓ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｓ２０６Ｎ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｋ２０８Ｒ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｌ２９４Ｗ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｅ２９８Ｇ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｈ３０３Ｒ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｌ３１１Ｐ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｙ３２８Ｓ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｗ３３４Ｇ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｄ３３８Ｖ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｄ３３８Ｇ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｌ３４３Ｐ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｌ３４５Ｑ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｌ３４５Ｐが挙げられる。

また、ＮＡＤに対するミカエリス定数の低減という観点から改変効果のみられた変異としては、Ｄ５８Ｖ＋Ｒ２０２Ｓ＋Ｙ３２８Ｄ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｖ２８６Ａ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｗ３３４Ｇ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｈ３３６Ｐ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｌ３４５Ｑが挙げられる。

また、基質であるグルコースに対するミカエリス定数の低減という観点から改変効果のみられた変異としては、Ｉ４６Ｖ＋Ｓ１２４Ｐ＋Ｒ２０２Ｓ、Ｄ５８Ｖ＋Ｒ２０２Ｓ＋Ｙ
３２８Ｄ、Ｇ７４Ｄ＋Ｒ２０２Ｓ＋Ｅ３０６Ｇ＋Ａ３２３Ｔ、Ｔ８９Ｋ＋Ｒ２０２Ｓ、Ａ１２１Ｔ＋Ｒ２０２Ｓ、Ｓ１２４Ｌ＋Ｒ２０２Ｓ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｖ２８６Ａ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｌ２９４Ｗ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｗ３３４Ｇ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｄ３３８Ｖ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｌ３４５Ｑ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｌ３４５Ｐが挙げられる。

さらに、温度依存的活性値変動幅の低減、すなわち２５℃／３７℃活性温度比の上昇という観点から改変効果のみられた変異としては、Ｉ４６Ｖ＋Ｓ１２４Ｐ＋Ｒ２０２Ｓ、Ｋ４９Ｒ＋Ｒ２０２Ｓ、Ｄ５８Ｖ＋Ｒ２０２Ｓ＋Ｙ３２８Ｄ、Ｇ７４Ｄ＋Ｒ２０２Ｓ＋Ｅ３０６Ｇ＋Ａ３２３Ｔ、Ｔ８９Ｋ＋Ｒ２０２Ｓ、Ｓ１２４Ｌ＋Ｒ２０２Ｓ、Ｋ１６８Ｅ＋Ｒ２０２Ｓ＋Ｅ３３０Ｇ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｓ２０６Ｎ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｋ２０８Ｒ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｌ２９４Ｗ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｅ２９８Ｇ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｈ３０３Ｒ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｌ３１１Ｐ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｙ３２８Ｓ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｗ３３４Ｇ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｄ３３８Ｖ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｄ３３８Ｇ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｌ３４５Ｑ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｌ３４５Ｐが挙げられる。

特に、これらすべての観点において改変効果がみられ、かつ基質特異性としても、マルトース・ガラクトース・キシロースに対して実用上問題とならない低い反応性を維持している変異ＧＤＨとしてはＤ５８Ｖ＋Ｒ２０２Ｓ＋Ｙ３２８ＤとＲ２０２Ｓ＋Ｗ３３４Ｇの２種類が挙げられる。

＜実施例４＞
アミノ酸置換による改変効果の高い部位における導入残基の検討
実施例３の結果から改変効果の高い部位と推定される３２８番目チロシン並びに３３４番目トリプトファンについて、置換されるアミノ酸の違いによる改変効果を詳細に検討した。
実施例１に記載する方法に従ってそれぞれの部位をコードするコドン部位に任意のアミノ酸残基が導入されるようにミックス塩基を導入した配列のミスマッチプライマーを作製し、それぞれＲ２０２Ｓ変異ＧＤＨ発現プラスミドを鋳型に部位特異的変異導入を行った。
それぞれの部位に任意のコドン置換を導入した変異ＧＤＨ発現ライブラリーについて、実施例３と同様のスクリーニングを実施し、得られた改変ＧＤＨについて実施例１の要領に従って培養発現・精製し、実施例３と同じ要領で各酵素特性を調べた。また、それぞれについて培養液よりプラスミドを抽出・精製し、シーケンスを解析することで、導入されたアミノ酸残基を特定した。

結果を表４に示す。３２８番目チロシンについては、Ｙ３２８Ｔ、Ｙ３２８Ｖ、Ｙ３２８Ｇ、Ｙ３２８Ｅ、Ｙ３２８Ｌが、また３３４番目トリプトファンについてはＷ３３４Ｒ、Ｗ３３４Ｈ、Ｗ３３４Ａ、Ｗ３３４Ｋが、それぞれＲ２０２Ｓとの組合せでさらなる比活性の向上に寄与することが確認された。また、３３４番目への変異導入操作にも関わらずＲ２０２Ｓ＋Ｗ３３４Ｓ＋Ｔ３３５Ｎという３３５番目にもアミノ酸置換の導入された変異酵素も得られたが、これも同様にＲ２０２Ｓ単独変異に比し高い比活性を示した。

また、ＮＡＤに対するミカエリス定数（Ｋｍ）の低減に寄与する変異としては、３２８番目チロシンについては、Ｙ３２８Ｔ、Ｙ３２８Ｅ、Ｙ３２８Ｒが、また３３４番目トリプトファンについてはＷ３３４Ｒ、Ｗ３３４Ｈ、Ｗ３３４Ａ、Ｗ３３４Ｋが、それぞれＲ２０２Ｓとの組合せで効果があることが確認された。

また、Ｙ３２８Ｔ、Ｙ３２８Ｖ、Ｙ３２８Ｇ、Ｙ３２８Ｅ、Ｙ３２８Ｌ、Ｗ３３４Ｒ、Ｗ３３４Ｈ、Ｗ３３４Ａ、Ｗ３３４Ｋ、Ｗ３３４Ｓ＋Ｔ３３５Ｎの各変異のいずれかとＲ２０２Ｓとの組合せにより、Ｒ２０２Ｓ単独での変異と比してグルコースに対するミカエリス定数がより低減されていることが確認された。

さらに、温度依存的活性値変動幅の低減、すなわち２５℃／３７℃活性温度比の上昇という観点からも、Ｙ３２８Ｔ、Ｙ３２８Ｖ、Ｙ３２８Ｇ、Ｙ３２８Ｅ、Ｙ３２８Ｌ、Ｗ３３４Ｒ、Ｗ３３４Ｈ、Ｗ３３４Ａ、Ｗ３３４Ｋ、Ｗ３３４Ｓ＋Ｔ３３５Ｎの各変異のいずれかとＲ２０２Ｓとの組合せが有効であることが確認された。

＜実施例５＞
変異型ＧＤＨのスケールアップ製造
実施例３で得られたＤ５８Ｖ＋Ｒ２０２Ｓ＋Ｙ３２８Ｄ変異ＧＤＨ発現プラスミド、Ｒ２０２Ｓ＋Ｗ３３４Ｇ変異ＧＤＨ発現プラスミド、並びに実施例４で得られたＲ２０２Ｓ＋Ｗ３３４Ｒ発現プラスミドについて、それぞれコンピテント・ハイＪＭ１０９に形質転換し、組換え大腸菌を得た。それぞれの組換え大腸菌を、５００ｍｌ容坂口フラスコに入った２００ｍｌ前培養培地（０．５％酵母エキス、０．２５％ペプトン、０．５％塩化ナトリウム、０．５％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリンナトリウム、ｐＨ７．４）に植菌し、３０℃１８０ｒｐｍで１６時間振とう培養した。得られた前培養液を、１０Ｌ容ジャーファーメンター中の６ＬのＧＤＨ生産培地（２．４％コウボエキス、２．４％ペプトン、１．２５％リン酸１水素２カリウム、０．２３％リン酸２水素１カリウム、０．４％グリセロール、０．１％消泡剤、１００μｇ／ｍｌアンピシリンナトリウム、ｐＨ７．０）に全量投入し、通気量２Ｌ／分、攪拌速度３１０ｒｐｍ、槽内圧０．０２ＭＰａ、温度３７℃で２４時間通気攪拌培養を行った。得られた培養液を遠心分離することにより
菌体を得、これを１Ｌの２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）に懸濁してフレンチプレス菌体破砕装置を用いて平均圧力８０ＭＰａで菌体を破砕した。さらにこの破砕液に１Ｌあたり１５２ｇの硫酸アンモニウムを加えて溶解し、６０℃１時間の加温を行い、さらに遠心分離によって沈殿を除いた。この溶液を、１５．２％硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）で緩衝化させたＯｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）にアプライしてＧＤＨを樹脂に吸着させ、さらに７．６％硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）で樹脂を洗浄した。そして硫酸アンモニウム濃度を７．６％から０％へ、同時にエチレングリコール濃度を０％から０．２％へ、それぞれグラジエントをかけながらバッファーを通液することでＧＤＨを溶出させた。次に、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）により緩衝化したＧ−２５
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂を用いて脱塩・バッファー置換を行った。最後に、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）で緩衝化したＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅにＧＤＨ溶液を通液することで夾雑タンパク質を樹脂に吸着させ、透過液を精製ＧＤＨとした。
このように得られた各変異ＧＤＨは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、ＣＢＢ染色で単一のバンドとなる高い純度であることが確認され、この状態における各ＧＤＨの比活性は、Ｒ２０２Ｓ＋Ｗ３３４Ｇが８５７Ｕ／ｍｇ、Ｄ５８Ｖ＋Ｒ２０２Ｓ＋Ｙ３２８Ｄが８８９Ｕ／ｍｇ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｗ３３４Ｒが９２３Ｕ／ｍｇであった。

＜実施例６＞
変異型ＧＤＨの熱安定性
実施例５で得られた各ＧＤＨおよび試験例４で得られた野生型ＧＤＨについて、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）を用いてＧＤＨ濃度５Ｕ／ｍｌとなるよう希釈し、それぞれの溶液について５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃の各温度で３０分加温処理を行い、加温後におけるＧＤＨ活性の加温前のＧＤＨ活性に対する比率（活性残存率）を調べた。結果を図１に示す。７０℃３０分処理では野生型・３種の変異型ＧＤＨはいずれも活性の低下がみられなかった。８０℃３０分処理後の活性残存率は、Ｒ２０２Ｓ＋Ｗ３３４Ｒ、Ｄ５８Ｖ＋Ｒ２０２Ｓ＋Ｙ３２８ＤおよびＲ２０２Ｓ＋Ｗ３３４Ｇはいずれも約９０％であり、野生型は９９％であった。また、９０℃３０分処理後の活性残存率は、Ｒ２０２Ｓ＋Ｗ３３４Ｇが７５％、Ｄ５８Ｖ＋Ｒ２０２Ｓ＋Ｙ３２８Ｄが３４％、Ｒ２０２Ｓ＋Ｗ３３４Ｒが７６％であり、野生型は９１％であった。いずれの変異型ＧＤＨも、８０℃３０分処理で少なくとも８５％、９０℃３０分処理で少なくとも３０％以上の活性を維持しており、変異導入後も熱安定性が高いレベルで維持されていることが確認された。
本発明におけるその他の変異型ＧＤＨも同様の安定性を有していると推察され、各変異型ＧＤＨを３０分間加温処理した後に９０％以上の活性が残存する温度条件の最大限界点は、７０℃以上９０℃以下の範囲に存在すると考えられる。

＜実施例７＞
変異型ＧＤＨのｐＨ安定性
実施例５で得られた各ＧＤＨについて、次のようにＧＤＨの安定ｐＨ領域を調べた。まず、ｐＨ３．５〜１１．０の範囲でバッファーを作製した。使用したバッファー種は、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５〜６．０）、リン酸カリウム（ｐＨ６．０〜８．０）、トリス塩酸（ｐＨ７．０〜９．０）、グリシンＮａＯＨ（ｐＨ９．０〜１１．０）であり、バッファー濃度はすべて５０ｍＭである。それぞれのバッファーを用いてＧＤＨ濃度が１０Ｕ／ｍｌとなるよう希釈し、希釈後の各溶液のｐＨを測定するとともに、それぞれの溶液を２５℃で１６時間インキュベートした。インキュベート後におけるＧＤＨ活性のインキュベート前のＧＤＨ活性に対する比率（活性残存率）を調べた。Ｒ２０２Ｓ＋Ｗ３３４Ｇ、Ｄ５８Ｖ＋Ｒ２０２Ｓ＋Ｙ３２８Ｄ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｗ３３４Ｒの各変異型ＧＤＨ活性のｐＨ安定性をそれぞれ図２、図３、図４に示す。活性残存率が８０％以上となるｐＨ領域は、Ｒ２０２Ｓ＋Ｗ３３４Ｒが５．０〜１０．７、Ｄ５８Ｖ＋Ｒ２０２Ｓ＋Ｙ３２８Ｄが５．０〜９．９、Ｒ２０２Ｓ＋Ｗ３３４Ｇが、５．０〜１０．７であり、いずれも広いｐＨ領域で安定であることが確認された。
またその他の変異型ＧＤＨについても同様のｐＨ安定性を有していると推定され、少なくともｐＨ６．０〜９．０の範囲において２５℃１６時間のインキュベート後も８０％以上の活性残存率が示すものと考えられる。

＜実施例８＞
変異型ＧＤＨ活性値のｐＨ依存性
実施例５で得られた各ＧＤＨについて、次のようにＧＤＨ活性値のｐＨ依存性を調べた。活性測定例に示す組成のうち、０．１ｍｏｌ／Ｌのトリスに代えて各種バッファーを使用し、ｐＨ３．５〜１１．０の範囲でさまざまなｐＨの測定液を作製した。使用したバッファー種は、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５〜６．０）、リン酸カリウム（ｐＨ６．０〜８．０）、トリス塩酸（ｐＨ８．０〜９．０）、グリシンＮａＯＨ（ｐＨ９．０〜１１．０）であり、測定液中におけるバッファー濃度はすべて５０ｍＭである。それぞれの測定液を用い、上述の活性測定例の手順に従って各ｐＨにおけるＧＤＨ活性を測定した。最も高い活性を示した条件における活性値を１００として、各ｐＨにおける相対活性値を算出した。Ｒ２０２Ｓ＋Ｗ３３４Ｇ、Ｄ５８Ｖ＋Ｒ２０２Ｓ＋Ｙ３２８Ｄ、Ｒ２０２Ｓ＋Ｗ３３４Ｒの各変異型ＧＤＨ活性のｐＨ依存性をそれぞれ図５、図６、図７に示す。至適反応ｐＨは、いずれもおおよそ９．０であったが、ｐＨ７．０における相対活性はＲ２０２Ｓ＋Ｗ３３４Ｒが８７、Ｄ５８Ｖ＋Ｒ２０２Ｓ＋Ｙ３２８Ｄが６６、Ｒ２０２Ｓ＋Ｗ３３４Ｇが７４あり、いずれも中性領域において十分な活性を示すことが確認された。

＜実施例９＞
変異型ＧＤＨの詳細な基質特異性
実施例５で得られた各ＧＤＨについて、さらに詳細に基質特異性を調べた。方法は上述の基質特異性の評価例に従うが、使用する基質としてマルトース、ガラクトース、キシロースに加えて、さらに２−デオキシグルコース、ソルボース、マンノース、フルクトース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、サッカロース、イノシトール、マルチトール、ラクチトールについても同様に反応性（対グルコース％）を測定した。結果を表５に示す。各ＧＤＨは、良好な基質特異性を維持していることが確認された。

＜実施例１０＞
変異型ＧＤＨの温度依存的活性変動
試験例４で得られた野生型ＧＤＨおよび実施例５で得られたＲ２０２Ｓ＋Ｗ３３４Ｒ変異型ＧＤＨについて、反応温度１０℃、２０℃、２５℃、３０℃、３７℃における活性を測定し、３７℃における活性を１００とした場合の各温度における相対活性を算出した。測定方法は上記の活性測定例に準じ、予備加温および反応中の温度を各温度条件の温度に設定して活性を測定した。結果を図８に示す。該変異型ＧＤＨは、少なくとも１０℃以上３７℃以下の温度範囲において温度依存的な活性変動が少ないことが示された。同様に、２５℃／３７℃活性温度比が野生型に比して高い変異型ＧＤＨは、少なくとも１０℃以上３７℃以下の温度範囲において野生型よりも温度依存的な活性変動が少ないものと推察される。

本発明により製造したグルコースデヒドロゲナーゼは、血糖値測定用試薬、血糖センサー並びにグルコース定量キットの原料としての供給が可能である。

Claims (28)

1. 配列番号２に記載されるアミノ酸配列において２０２番目アルギニンに相当するアミノ酸残基を、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、およびリジンのいずれかに置換してなる、変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
2. さらに、２０２番目アルギニン以外のアミノ酸残基の１ないし数個が欠失、置換、挿入及び／又は付加されてなる、請求項１に記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
3. 配列番号２に記載されるアミノ酸配列において、５８番目アスパラギン酸、２８６番目バリン、３２８番目チロシン、３３４番目トリプトファン、３３９番目イソロイシン、３４０番目リジン、３４１番目トレオニンおよび３４５番目ロイシンからなる群より選ばれる１ないし数箇所のアミノ酸残基の他の残基への置換をさらに組み合わせてなる、請求項１に記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
4. 配列番号２に記載されるアミノ酸配列において（Ｄ５８Ｖ＋Ｙ３２８Ｄ）、Ｖ２８６Ａ、Ｙ３２８Ｔ、Ｙ３２８Ｅ、Ｗ３３４Ｇ、Ｗ３３４Ｒ、Ｗ３３４Ｈ、Ｗ３３４Ａ、Ｗ３３４Ｋ、Ｉ３３９Ｐ、Ｋ３４０Ｒ、Ｔ３４１Ｒ、Ｔ３４１Ｇ、Ｔ３４１Ｐ、Ｔ３４１Ｍ、Ｔ３４１ＳおよびＬ３４５Ｑからなる群より選ばれる１ないし数種類のアミノ酸置換をさらに組み合わせてなる、請求項１に記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
5. 配列番号２に記載されるアミノ酸配列において２０２番目アルギニンに相当するアミノ酸残基がセリンに置換され、かつ（Ｄ５８Ｖ＋Ｙ３２８Ｄ）、Ｖ２８６Ａ、Ｙ３２８Ｔ、Ｙ３２８Ｅ、Ｗ３３４Ｇ、Ｗ３３４Ｒ、Ｗ３３４Ｈ、Ｗ３３４Ａ、Ｗ３３４Ｋ、Ｉ３３９Ｐ、Ｋ３４０Ｒ、Ｔ３４１Ｒ、Ｔ３４１Ｇ、Ｔ３４１Ｐ、Ｔ３４１Ｍ、Ｔ３４１ＳおよびＬ３４５Ｑからなる群より選ばれる１ないし数種類のアミノ酸置換をさらに組み合わせてなる、請求項１に記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
6. 配列番号２に記載されるアミノ酸配列において２０２番目アルギニンに相当するアミノ酸残基をセリンに置換してなる、グルコースに対する親和性の高い変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
7. さらに、２０２番目アルギニン以外のアミノ酸残基の１ないし数個が欠失、置換、挿入及び／又は付加されてなる、請求項６に記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
8. 配列番号２に記載されるアミノ酸配列において、さらに３番目アラニン、４６番目イソロイシン、４９番目リジン、５８番目アスパラギン酸、７４番目グリシン、８０番目バリン、８５番目ロイシン、８９番目トレオニン、１２１番目アラニン、１２４番目セリン、１６８番目リジン、１７３番目アラニン、２０６番目セリン、２０８番目リジン、２９４番目ロイシン、２９８番目グルタミン酸、３０３番目ヒスチジン、３０６番目グルタミン酸、３１１番目ロイシン、３２３番目アラニン、３２８番目チロシン、３３０番目グルタミン酸、３３４番目トリプトファン、３３５番目トレオニン、３３８番目アスパラギン酸、３４１番目トレオニン、３４３番目ロイシンおよび３４５番目ロイシンからなる群より選ばれる１ないし数個のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換をさらに組み合わせてなる、請求項６に記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
9. 配列番号２に記載されるアミノ酸配列においてＡ３Ｖ、Ｉ４６Ｖ、Ｋ４９Ｒ、Ｄ５８Ｖ、Ｇ７４Ｄ、Ｖ８０Ａ、Ｌ８５Ｈ、Ｔ８９Ｋ、Ａ１２１Ｔ、Ｓ１２４Ｌ、Ｓ１２４Ｐ、Ｋ１６８Ｅ、Ａ１７３Ｔ、Ｓ２０６Ｎ、Ｋ２０８Ｒ、Ｌ２９４Ｗ、Ｅ２９８Ｇ、Ｈ３０３Ｒ、Ｅ３０６Ｇ、Ｌ３１１Ｐ、Ａ３２３Ｔ、Ｙ３２８Ｄ、Ｙ３２８Ｓ、Ｙ３２８Ｔ、Ｙ３２８Ｖ、Ｙ３２８Ｇ、Ｙ３２８Ｅ、Ｙ３２８Ｌ、Ｅ３３０Ｇ、Ｗ３３４Ｇ、Ｗ３３４Ｒ、Ｗ３３４Ｈ、Ｗ３３４Ａ、Ｗ３３４Ｋ、Ｗ３３４Ｓ、Ｔ３３５Ｎ、Ｄ３３８Ｇ、Ｄ３３８Ｖ、Ｔ３４１Ｒ、Ｔ３４１Ｇ、Ｔ３４１Ｍ、Ｌ３４３Ｐ、Ｌ３４５ＱおよびＬ３４５Ｐからなる群より選ばれる１ないし数種類のアミノ酸置換をさらに組み合わせてなる、請求項６に記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
10. 配列番号２に記載されるアミノ酸配列において２０２番目アルギニンに相当するアミノ酸残基がセリンに置換され、かつＡ３Ｖ、（Ｉ４６Ｖ＋Ｓ１２４Ｐ）、Ｋ４９Ｒ、（Ｄ５８Ｖ＋Ｙ３２８Ｄ）、（Ｇ７４Ｄ＋Ｅ３０６Ｇ＋Ａ３２３Ｔ）、Ｖ８０Ａ、Ｌ８５Ｈ、Ｔ８９Ｋ、Ａ１２１Ｔ、Ｓ１２４Ｌ、（Ｋ１６８Ｅ＋Ｅ３３０Ｇ）、Ａ１７３Ｔ、Ｓ２０６Ｎ、Ｋ２０８Ｒ、Ｌ２９４Ｗ、Ｅ２９８Ｇ、Ｈ３０３Ｒ、Ｌ３１１Ｐ、Ｙ３２８Ｓ、Ｙ３２８Ｔ、Ｙ３２８Ｖ、Ｙ３２８Ｇ、Ｙ３２８Ｅ、Ｙ３２８Ｌ、Ｗ３３４Ｇ、Ｗ３３４Ｒ、Ｗ３３４Ｈ、Ｗ３３４Ａ、Ｗ３３４Ｋ、（Ｗ３３４Ｓ＋Ｔ３３５Ｎ）、Ｄ３３８Ｇ、Ｄ３３８Ｖ、（Ｉ３３９Ｐ＋Ｔ３４１Ｇ）、（Ｉ３３９Ｐ＋Ｔ３４１Ｒ）、（Ｉ３３９Ｐ＋Ｔ３４１Ｌ）、（Ｉ３３９Ｐ＋Ｔ３４１Ｋ）、Ｔ３４１Ｒ、Ｔ３４１Ｇ、Ｔ３４１Ｍ、Ｌ３４３Ｐ、Ｌ３４５ＱおよびＬ３４５Ｐからなる群より選ばれる１種類のアミノ酸置換をさらに組み合わせてなる、請求項６に記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
11. 配列番号２に記載されるアミノ酸配列において２０２番目アルギニンに相当するアミノ酸残基をセリンに置換してなる、３７℃以下における比活性の向上した変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
12. さらに、２０２番目アルギニン以外のアミノ酸残基の１ないし数個が欠失、置換、挿入及び／又は付加されてなる、請求項１１に記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
13. 配列番号２に記載されるアミノ酸配列において、さらに３番目アラニン、４６番目イソロイシン、４９番目リジン、５８番目アスパラギン酸、７４番目グリシン、８０番目バリン、８５番目ロイシン、８９番目トレオニン、１２１番目アラニン、１２４番目セリン、１６８番目リジン、１７３番目アラニン、２０６番目セリン、２０８番目リジン、２９４番目ロイシン、２９８番目グルタミン酸、３０３番目ヒスチジン、３０６番目グルタミン酸、３１１番目ロイシン、３２３番目アラニン、３２８番目チロシン、３３０番目グルタミン酸、３３４番目トリプトファン、３３５番目トレオニン、３３８番目アスパラギン酸、３４１番目トレオニン、３４３番目ロイシンおよび３４５番目ロイシンからなる群より選ばれる１ないし数個のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換をさらに組み合わせてなる、請求項１１に記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
14. 配列番号２に記載されるアミノ酸配列においてＡ３Ｖ、Ｉ４６Ｖ、Ｋ４９Ｒ、Ｄ５８Ｖ、Ｇ７４Ｄ、Ｖ８０Ａ、Ｌ８５Ｈ、Ｔ８９Ｋ、Ａ１２１Ｔ、Ｓ１２４Ｌ、Ｓ１２４Ｐ、Ｋ１６８Ｅ、Ａ１７３Ｔ、Ｓ２０６Ｎ、Ｋ２０８Ｒ、Ｌ２９４Ｗ、Ｅ２９８Ｇ、Ｈ３０３Ｒ、Ｅ３０６Ｇ、Ｌ３１１Ｐ、Ａ３２３Ｔ、Ｙ３２８Ｄ、Ｙ３２８Ｓ、Ｙ３２８Ｔ、Ｙ３２８Ｖ、Ｙ３２８Ｇ、Ｙ３２８Ｅ、Ｙ３２８Ｌ、Ｅ３３０Ｇ、Ｗ３３４Ｇ、Ｗ３３４Ｒ、Ｗ３３４Ｈ、Ｗ３３４Ａ、Ｗ３３４Ｋ、Ｗ３３４Ｓ、Ｔ３３５Ｎ、Ｄ３３８Ｇ、Ｄ３３８Ｖ、Ｔ３４１Ｒ、Ｔ３４１Ｇ、Ｔ３４１Ｍ、Ｌ３４３Ｐ、Ｌ３４５ＱおよびＬ３４５Ｐからなる群より選ばれる１ないし数種類のアミノ酸置換をさらに組み合わせてなる、請求項１１に記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
15. 配列番号２に記載されるアミノ酸配列において２０２番目アルギニンに相当するアミノ酸残基がセリンに置換され、かつＡ３Ｖ、（Ｉ４６Ｖ＋Ｓ１２４Ｐ）、Ｋ４９Ｒ、（Ｄ５８Ｖ＋Ｙ３２８Ｄ）、（Ｇ７４Ｄ＋Ｅ３０６Ｇ＋Ａ３２３Ｔ）、Ｖ８０Ａ、Ｌ８５Ｈ、Ｔ８９Ｋ、Ａ１２１Ｔ、Ｓ１２４Ｌ、（Ｋ１６８Ｅ＋Ｅ３３０Ｇ）、Ａ１７３Ｔ、Ｓ２０６Ｎ、Ｋ２０８Ｒ、Ｌ２９４Ｗ、Ｅ２９８Ｇ、Ｈ３０３Ｒ、Ｌ３１１Ｐ、Ｙ３２８Ｓ、Ｙ３２８Ｔ、Ｙ３２８Ｖ、Ｙ３２８Ｇ、Ｙ３２８Ｅ、Ｙ３２８Ｌ、Ｗ３３４Ｇ、Ｗ３３４Ｒ、Ｗ３３４Ｈ、Ｗ３３４Ａ、Ｗ３３４Ｋ、（Ｗ３３４Ｓ＋Ｔ３３５Ｎ）、Ｄ３３８Ｇ、Ｄ３３８Ｖ、（Ｉ３３９Ｐ＋Ｔ３４１Ｇ）、（Ｉ３３９Ｐ＋Ｔ３４１Ｒ）、（Ｉ３３９Ｐ＋Ｔ３４１Ｌ）、（Ｉ３３９Ｐ＋Ｔ３４１Ｋ）、Ｔ３４１Ｒ、Ｔ３４１Ｇ、Ｔ３４１Ｍ、Ｌ３４３Ｐ、Ｌ３４５ＱおよびＬ３４５Ｐからなる群より選ばれる１種類のアミノ酸置換をさらに組み合わせてなる、請求項１１に記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
16. 配列番号２に記載されるアミノ酸配列において２０２番目アルギニンがセリンへ置換され、かつ４６番目イソロイシン、４９番目リジン、５８番目アスパラギン酸、７４番目グリシン、８９番目トレオニン、１６８番目リジン、１２４番目セリン、２０６番目セリン、２０８番目リジン、２９４番目ロイシン、３０３番目ヒスチジン、３０６番目グルタミン酸、３１１番目ロイシン、３２３番目アラニン、３２８番目チロシン、３３０番目グルタミン酸、３３４番目トリプトファン、３３５番目トレオニン、３３８番目アスパラギン酸および３４５番目ロイシンからなる群より選ばれる１ないし数個のアミノ酸を他のアミノ酸に置換してなる変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
17. 配列番号２に記載されるアミノ酸配列において２０２番目アルギニンがセリンへ置換され、かつ（Ｉ４６Ｖ＋Ｓ１２４Ｐ）、Ｋ４９Ｒ、（Ｄ５８Ｖ＋Ｙ３２８Ｄ）、（Ｇ７４Ｄ＋Ｅ３０６Ｇ＋Ａ３２３Ｔ）、Ｔ８９Ｋ、Ｓ１２４Ｌ、（Ｋ１６８Ｅ＋Ｅ３３０Ｇ）、Ｓ２０６Ｎ、Ｋ２０８Ｒ、Ｌ２９４Ｗ、Ｈ３０３Ｒ、Ｌ３１１Ｐ、Ｙ３２８Ｓ、Ｙ３２８Ｔ、Ｙ３２８Ｖ、Ｙ３２８Ｇ、Ｙ３２８Ｅ、Ｙ３２８Ｌ、Ｗ３３４Ｇ、Ｗ３３４Ｒ、Ｗ３３４Ｈ、Ｗ３３４Ａ、Ｗ３３４Ｋ、（Ｗ３３４Ｓ＋Ｔ３３５Ｎ）、Ｄ３３８Ｖ、Ｄ３３８Ｇ、Ｌ３４５ＱおよびＬ３４５Ｐからなる群より選ばれる１ないし数種類のアミノ酸置換をさらに組み合わせてなる請求項１６に記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
18. 配列番号２に記載されるアミノ酸配列において２０２番目アルギニンがセリンへ置換され、かつ（Ｉ４６Ｖ＋Ｓ１２４Ｐ）、Ｋ４９Ｒ、（Ｄ５８Ｖ＋Ｙ３２８Ｄ）、（Ｇ７４Ｄ＋Ｅ３０６Ｇ＋Ａ３２３Ｔ）、Ｔ８９Ｋ、Ｓ１２４Ｌ、（Ｋ１６８Ｅ＋Ｅ３３０Ｇ）、Ｓ２０６Ｎ、Ｋ２０８Ｒ、Ｌ２９４Ｗ、Ｈ３０３Ｒ、Ｌ３１１Ｐ、Ｙ３２８Ｓ、Ｙ３２８Ｔ、Ｙ３２８Ｖ、Ｙ３２８Ｇ、Ｙ３２８Ｅ、Ｙ３２８Ｌ、Ｗ３３４Ｇ、Ｗ３３４Ｒ、Ｗ３３４Ｈ、Ｗ３３４Ａ、Ｗ３３４Ｋ、（Ｗ３３４Ｓ＋Ｔ３３５Ｎ）、Ｄ３３８Ｖ、Ｄ３３８Ｇ、Ｌ３４５ＱおよびＬ３４５Ｐからなる群より選ばれる１種類のアミノ酸置換をさらに組み合わせてなる請求項１６に記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
19. 配列番号２に記載されるアミノ酸配列において２０２番目アルギニンがセリンへ置換され、かつ３３４番目トリプトファンがグリシンに置換されてなる変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
20. 配列番号２に記載されるアミノ酸配列において２０２番目アルギニンがセリンへ置換され、かつ３３４番目トリプトファンがアルギニンに置換されてなる変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
21. 配列番号２に記載されるアミノ酸配列において５８番目アスパラギン酸がバリンに置換され、かつ２０２番目アルギニンがセリンへ置換され、かつ３２８番目チロシンがアスパラギン酸に置換されてなる変異型グルコースデヒドロゲナーゼ。
22. 請求項１〜２１のいずれかに記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子。
23. 請求項２２に記載の遺伝子を含むベクター。
24. 請求項２３に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
25. 請求項２４に記載の形質転換体を培養することを特徴とする変異型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
26. 請求項１〜２１のいずれかに記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースアッセイキット。
27. 請求項１〜２１のいずれかに記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースセンサー。
28. 請求項１〜２１のいずれかに記載の変異型グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコース測定法。
    

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