JPWO2010058824A1 - 間葉系細胞の分化を調節するための薬剤及びその利用 - Google Patents

間葉系細胞の分化を調節するための薬剤及びその利用 Download PDF

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Abstract

本明細書の開示は、骨芽細胞等の分化過程に特異的に作用して分化を調節する調節剤及びその用途を提供する。本明細書の開示によれば、Ｄｌｘ５遺伝子の３’非翻訳領域に結合するｍｉＲＮＡ、その前駆体及びこれらをコードするＤＮＡ構築物並びに前記ｍｉＲＮＡの阻害剤から選択される有効成分を有する、間葉系細胞の分化調節剤が提供される。

Description

本願は、２００８年１１月１９日に出願した日本国特許出願 特願２００８−２９６１６６に基づく優先権を主張するものであって、この出願の内容全体を参照により本願明細書に引用したものとする。
本発明は、間葉系細胞の分化を調節（抑制／促進）するための薬剤及びその利用に関する。
近年、骨芽細胞の分化を調節する様々な蛋白質が同定されているが、それらは骨形成蛋白質（Bone Morphogenetic Protein, 以下ＢＭＰと略す）のごとく種々の組織に作用してしまうような特異性の極めて低い蛋白質であるか、あるいはＤＮＡに直接作用する転写制御因子である。例えばＢＭＰは、強い骨誘導作用がある一方、筋肉等の軟部組織をも骨化させてしまうことから、医薬として用いるのは難しい。また。骨芽細胞の分化を調節する転写制御因子としてはcbfa1 の他にホメオボックス遺伝子であるＭｓｘやＤｌｘが知られている。なかでも、Ｄｌｘ５は、脊椎動物の個体の発生過程において骨 組織に特異的に発現することが知られており、骨芽細胞の成熟に従ってＤｌｘ５ 遺伝子の発現レベルが増加し、Ｄｌｘ５蛋白が骨芽細胞の表現形質を遺伝子レベルで制御していることが報告されている。さらに、ＢＭＰの刺激によって骨芽細胞で特異的にＤｌｘ５ 遺伝子が誘導されること、このＤｌｘ５ を過剰発現させた骨芽細胞では分化が著しく亢進していることが報告されている。
骨芽細胞の分化には、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ）が関与する可能性も報告されている（特許文献１）。ｍｉＲＮＡは、細胞内在性の、２０〜２５塩基程度の非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、ゲノムＤＮＡ上のｍｉＲＮＡ遺伝子から、まず数百〜数千塩基程度の長さの一次転写物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）として転写され、次いで、プロセシングを受け、約６０〜７０塩基程度のヘアピン構造を有するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとなる。その後、核から細胞質内に移り、更にプロセシングを受けて、２０〜２４塩基程度の二量体（ガイド鎖とパッセンジャー鎖）の成熟ｍｉＲＮＡとなる。成熟ｍｉＲＮＡは、そのうちのガイド鎖（アンチセンス鎖）がＲＩＳＣと呼ばれるタンパク質と複合体を形成し、標的遺伝子のｍＲＮＡに作用することで、標的遺伝子の翻訳を阻害する働きをすることが知られている。
特開２００８−１８４４５０号公報
特許文献１に記載のｍｉＲＮＡは、ターゲットとなる遺伝子が不明であり、このため、ｍｉＲＮＡを導入したり、ｍｉＲＮＡの機能を阻害することの影響が不明である。骨芽細胞などの分化の調節のためには、Ｄｌｘ５遺伝子のように、骨芽細胞の分化の過程において特異的に作用する転写因子をターゲットとすることが好ましい。
そこで、本発明は、骨芽細胞等の分化過程に特異的に作用して、分化を調節する調節剤及びその用途を提供することを目的とする。
本発明者らは、ｍｉＲＮＡがＤｌｘ５遺伝子の発現を翻訳レベルで阻害しているこという知見を得て、本発明を完成した。すなわち、本明細書の開示によれば、以下の手段が提供される。
（１）Ｄｌｘ５遺伝子の３’非翻訳領域に結合するｍｉＲＮＡ、その前駆体及びこれらをコードするＤＮＡ構築物並びに前記ｍｉＲＮＡの阻害剤から選択される有効成分を有する、間葉系細胞の分化調節剤。
（２）前記ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ−１４１、ｍｉＲＮＡ−２００ａ及びｍｉＲＮＡ−２０８から選択される１種又は２種類以上である、（１）に記載の間葉系細胞の分化調節剤。
（３）前記ｍｉＲＮＡ、その前駆体及びこれらをコードするＤＮＡ構築物から選択されるいずれかを有効成分とし、間葉系細胞の分化を抑制する、（１）又は（２）に記載の間葉系細胞の分化調節剤。
（４）前記阻害剤を有効成分とし、間葉系細胞の分化を促進する、（１）に記載の間葉系細胞の分化調節剤。
（５）前記阻害剤は、前記ｍｉＲＮＡのガイド鎖の少なくとも一部に対するアンチセンス配列を含む第１のＲＮＡ鎖を有し、該第１のＲＮＡ鎖中に少なくとも一つの以下の式で表されるヌクレオシド誘導体を備える一本鎖ＲＮＡを含む、（４）に記載の間葉系細胞の分化調節剤。
[式(１)中、Ｚは、ＣＨ又はＮを表す。]
（６）前記第１のＲＮＡ鎖は、内在性の前記ｍｉＲＮＡの前記ガイド鎖に対するパッセンジャー鎖よりも前記ガイド鎖に対する相補性が高い、（５）に記載の間葉系細胞の分化調節剤。
（７）前記第１のＲＮＡ鎖は、その３'末端側に前記ヌクレオシド誘導体を備える、請求項５又は６に記載の間葉系細胞の分化調節剤。
（８）前記阻害剤は、前記第１のＲＮＡ鎖と前記マイクロＲＮＡのガイド鎖である第２のＲＮＡ鎖とを備える二重鎖ＲＮＡを含む、（５）〜（７）のいずれかに記載の間葉系細胞の分化調節剤。
（９）前記第２のＲＮＡ鎖は、その３'末端側に前記ヌクレオシド誘導体を備える、（８）に記載の間葉系細胞の分化調節剤。
（１０）前記間葉系細胞は、前骨芽細胞及び骨芽細胞の少なくともいずれかである、請求項１〜９のいずれかに記載の間葉系細胞の分化調節剤。
（１１）間葉系細胞の分化異常に起因する疾患を治療又は予防するための医薬であって、（１）〜（１０）のいずれかに記載の間葉系細胞の分化調節剤を含む、医薬。
（１２）前記疾患は、前記間葉系細胞の分化抑制又は分化不足に起因する疾患である、請求項１１に記載の医薬。
（１３）前記間葉系細胞が骨芽細胞であり、前記疾患が骨粗鬆症、骨形成不全、及び発達期における成長阻害からなる群より選択される少なくともいずれかである請求項１２に記載の医薬。
（１４）間葉系細胞の分化調節剤の評価方法であって、
Ｄｌｘ５遺伝子の３’非翻訳領域に結合するｍｉＲＮＡの作用の増大又は低下を指標とする、評価方法。
（１５）Ｄｌｘ５遺伝子を有する間葉系幹細胞若しくは前駆細胞又は非ヒト動物に対して被験化合物を供給する工程と、
前記間葉系幹細胞若しくは前駆細胞又は非ヒト動物におけるＤｌｘ５遺伝子の３’非翻訳領域に結合するｍｉＲＮＡの発現量を前記被験化合物の非供給時との対比に基づいて、前記被験化合物の骨芽細胞の分化調節作用を評価する工程と、
を備える、（１５）に記載の方法。
ｍｉＲＮＡ１４１の前駆体を示す図である。 ｍｉＲＮＡ２００ａ及び２０８の前駆体を示す図である。 ＢＭＰ−２刺激における骨芽細胞分化の状態をＡＬＰ活性と染色結果として示す図である。 ＢＭＰ−２誘導骨芽細胞分化におけるｍｉｃｒｏＲＮＡ発現の変動を示すグラフである。 人工ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１４１，−２００ａの各前駆体導入によるＢＭＰ−２誘導骨芽細胞分化への影響をＡＬＰ活性として示すグラフである。 人工ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１４１，−２００ａの各前駆体導入によるＢＭＰ−２誘導骨芽細胞分化への影響を示す図である。 人工ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１４１，−２００ａの各前駆体導入によるＢＭＰ−２誘導骨芽細胞分化への影響をＤｌｘ５タンパク質の発現量（ウエスタンブロッティング）として示す図である。 ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１４１及び−２００ａの標的遺伝子の同定結果を示す図である。 ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１４１及び−２００ａに対するアンチセンス鎖による標的遺伝子のＤｌｘ５のｍＲＮＡ発現への影響を示すグラフである。 ｍｉｃｒｏＲＮＡ−２００ａの作用を阻害する二本鎖ＲＮＡの構造を示す図である。 化学修飾ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１４１、−２００ａ及び−２０８のアンチセンス鎖及び二本鎖ＲＮＡの導入における骨芽細胞分化への影響（ＡＬＰ活性の上昇）を示す図である。 化学修飾ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１４１及び２００ａアンチセンス鎖及び二本鎖ＲＮＡの導入における骨芽細胞分化への影響（ヒドロキシアパタイト結晶の形成状態）を示す図である。
本明細書の開示は、Ｄｌｘ５遺伝子の３’非翻訳領域に結合するｍｉＲＮＡ及びその利用に関する。本明細書の開示は、Ｄｌｘ５遺伝子の３’非翻訳領域に結合してその翻訳を抑制するｍｉＲＮＡを見出したことに基づいている。すなわち、本明細書の開示によれば、該ｍｉＲＮＡ、その前駆体及びこれらをコードするＤＮＡ構築物を間葉系細胞の分化を抑制するものとして利用できる。また、前記ｍｉＲＮＡの阻害剤を間葉系細胞の分化を促進するものとして利用できる。より具体的には、本明細書の開示によれば、さらに、ｍｉＲＮＡのパッセンジャー鎖やその誘導体に修飾を加えたＲＮＡ１本鎖と、このＲＮＡ１本鎖にさらにガイド鎖を組み合わせたｍｉＲＮＡ様二本鎖が、いずれも間葉系細胞の分化の促進剤として利用できる。さらに、さらに、本明細書の開示によれば、このような間葉系細胞の分化の調節剤を用いる医薬、間葉系細胞の分化調節剤の評価方法も提供される。以下、本明細書の開示の実施形態につき詳細に説明する。
なお、以下の説明において、ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡにおいて、最終的に標的となる遺伝子のｍＲＮＡと対合するｍＲＮＡに対するアンチセンス鎖（又は当該アンチセンスセンス鎖を含むＲＮＡ領域）をガイド鎖と表現し、前記アンチセンス鎖に対するセンス鎖（又は当該センス鎖を含むＲＮＡ領域）をパッセンジャー鎖というものとする。
（間葉系細胞の分化調節剤）
本明細書に開示の分化調節剤は、間葉系幹細胞又は前駆細胞の間葉系細胞への分化合物を調節する。したがって、分化調節剤の投与対象は、間葉系細胞への分化能を有する細胞である。間葉系細胞への分化能を有する細胞の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、間葉系幹細胞及び間葉系前駆細胞が挙げられる。間葉系幹細胞及び前駆細胞の入手方法としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、個体の骨髄等から単離することにより得ることもできるし、或いは、既にクローン化された間葉系幹細胞として各種機関から入手することもできる。このような既にクローン化された間葉系幹細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、マウスの細胞として、マウスＳＴ２細胞、マウスＮＲＧ細胞などが挙げられる（それぞれ独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター（ＢＲＣ）から入手可能である）。なお、間葉系幹細胞以外の細胞であっても、間葉系細胞への分化能を有する細胞であればよい。本明細書においては、間葉系幹細胞としては、前駆骨芽細胞が挙げられる。
また、間葉系細胞の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、骨芽細胞、脂肪細胞、筋細胞、軟骨細胞などが挙げられる。これらの中でも、特に、骨芽細胞が好ましい。
本明細書に開示の間葉系細胞の分化調節剤は、Ｄｌｘ５遺伝子の３’非翻訳領域に結合するｍｉＲＮＡ、その前駆体及びこれらをコードするＤＮＡを転写可能に保持するＤＮＡ構築物並びに前記ｍｉＲＮＡの阻害剤から選択される有効成分を有することができる。
（ｍｉＲＮＡ）
Ｄｌｘ５遺伝子の３’非翻訳領域に結合するｍｉＲＮＡとは、当該非翻訳領域に結合してＤｌｘ５遺伝子の翻訳を抑制する作用を有する１本鎖ＲＮＡ（二本鎖ｍｉＲＮＡのガイド鎖に相当する。）を意味している。かかるＲＮＡは、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−２００ａ及びｍｉＲ−２０８であり、その成熟配列はそれぞれ以下に示すとおりであり（配列番号１〜６）、マウス、ヒト等で保存されている。図１及び図２に、それぞれｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−２００ａ及びｍｉＲＮＡ−２０８の模式図を示す。
（ヒト）
miR-141: UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG（配列番号１）
miR-200a: UAACACUGUCUGGUAACGAUGU（配列番号２）
miR-208: AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU（配列番号３）
（マウス）
miR-141: UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG（配列番号４）
miR-200a: UAACACUGUCUGGUAACGAUGU（配列番号５）
miR-208: AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU（配列番号６）
こうしたｍｉＲＮＡは、その塩基配列に基づき、従来公知の手法を用いて、天然物から単離することにより、化学的に合成することにより、あるいはin vivo又はin vitroで遺伝子工学的に生産させることができる。また、こうしたｍｉＲＮＡは、内在性の成熟型ｍｉＲＮＡを模倣するように合成された類縁体であってもよい。こうした類縁体としては、例えば、Ａｍｂｉｏｎ社などから入手可能である。こうしたｍｉＲＮＡは、一本鎖であってもよいし、相補鎖を備える二本鎖であってもよい。
（ｍｉＲＮＡ前駆体）
ｍｉＲＮＡ前駆体としては、例えば、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡなどが挙げられる。その具体例としては、例えば、マウス及びヒトにつき、以下の表に示すｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ−ｍｉＲＮＡがそれぞれ挙げられる。このようなｍｉＲＮＡ前駆体も、従来公知の手法を用いて、天然物から単離することにより、化学的に合成することにより、あるいはin vivo又はin vitroで遺伝子工学的に生産させることができる。さらに、ｍｉＲＮＡ前駆体としては、内在性のｍｉＲ１２５ｂ前駆体を模倣するように合成された、ｍｉＲ１２５ｂ前駆体類縁体を同様に用いることもできる。ｍｉＲ１２５ｂ前駆体は、一本鎖であってもよいし、二本鎖であってもよい。
（ｍｉＲＮＡ等のＤＮＡ構築物）
ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ前駆体をコードするＤＮＡを転写可能に保持するＤＮＡ構築物は、in vivo又はin vitroでこうしたＲＮＡ鎖を転写可能にコードしたＤＮＡコンストラクトである。たとえば、in vitroでｍｉＲＮＡ等を転写可能なコンストラクトは、ウイルスプロモーターの制御下にｍｉＲＮＡ等をコードするＤＮＡを連結したベクターが挙げられる。また、in vivoでｍｉＲＮＡ等を転写可能なコンストラクトは、哺乳類細胞で有効なプロモーターの制御下にｍｉＲＮＡ等をコードするＤＮＡを連結したベクターが挙げられる。このようなin vivo又はin vitro転写用のベクターは商業的に入手が可能であり、そのプロトコールに従い、ｍｉＲＮＡ等の塩基配列に基づけば、容易にかかるベクターを構築できる。
（ｍｉＲＮＡの阻害剤）
ｍｉＲＮＡの阻害剤は、ｍｉＲＮＡの機能を低下させる化合物であれば足り特に限定されない。例えば、ｍｉＲ１４１、ｍｉＲ２００ａ、これらの前駆体のガイド鎖の少なくとも一部の相補鎖である第１のＲＮＡ鎖（いわゆるアンチセンスセンスｍｉＲＮＡ）が挙げられる。第１のＲＮＡ鎖における相補鎖としては、必ずしもｍｉＲＮＡ及びその前駆体の全体の相補鎖である必要はなく、その機能を低下させる作用を有する限りその一部の相補鎖であってもよい。また、完全な相補鎖である必要はなく、ｍｉＲＮＡ等の少なくともいずれかに対する完全な相補鎖である必要はなく、ｍｉＲＮＡ等の機能を低下させる作用を有する限り、不完全な相補鎖であってもよい。
第１のＲＮＡ鎖においては、内在性のｍｉＲＮＡ等におけるガイド鎖に対するパッセンジャー鎖と比較して相補性が高められていることが好ましい。すなわち、内在性のｍｉＲＮＡにおいて、ガイド鎖とパッセンジャー鎖との間に、ミスマッチが存在する場合、そのようなミスマッチの個数が第１のＲＮＡ鎖において低減されていることが好ましい。ミスマッチをどの程度低減すればよいかは特に限定されないが、第１のＲＮＡ鎖が阻害剤として機能する限り、すべてのミスマッチを解消する必要はなく、その一部が解消されていてもよい。阻害剤としての相補鎖において解消されるミスマッチの箇所（内在性ｍｉＲＮＡのガイド鎖における位置）は、特に限定しないが、３’末端側にあるミスマッチが解消されることにより、阻害剤として好ましい。
ｍｉＲＮＡの阻害剤は、第１のＲＮＡ鎖とｍｉＲＮＡ等のガイド鎖である第２のＲＮＡ鎖とを備えていてもよい。本明細書の開示によれば、こうした二本鎖状態であっても阻害剤として有効であることがわかっている（後述の実施例参照）。
本明細書に開示の阻害剤の少なくとも相補鎖においては、式（１）で表されるヌクレオシド誘導体を備えていることが好ましい。かかる誘導体を第１のＲＮＡ鎖に備えることで、ヌクレアーゼ耐性を向上させ、阻害剤としての機能をより高めることができる。
[式(１)中、Ｚは、ＣＨ又はＮを表す。]
本発明のオリゴオリゴヌクレオチド誘導体においては、式（１）中、Ｚは、Ｎであってもよいし、ＣＨであってもよい。式（１）における６員環は、全体として疎水性であって、親水性又は極性の置換基を有していないことが好ましい。６員環が有していてもよい置換基としては、非極性の置換基であることが好ましく、炭素数１〜４個の鎖状アルキル基を有することができる。すなわち、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基及びｔｅｒｔ−ブチル基が挙げられる。
なお、式（１）の６員環を含む構造（以下の「化３」に示す式（1)における点線枠内）に替えて、以下の環状構造体２ｂ〜２ｇを用いることもできる。これらの環においても、上記と同様の置換基を備えていてもよい。Ｚは、式（１）におけるのと同義である。化合物２ｂ〜２ｇのなかでも、単環式である２ｂを好ましく用いることができる。また、２ｄも好ましく用いることができる。
かかるヌクレオシド誘導体は、第１のＲＮＡ鎖において、１個又は２個以上備えることができる。複数のヌクレオシド誘導体は、前記Ｚにおいて同一のものを複数個備えていてもよいし、前記ＺがＮのヌクレオシド誘導体と前記ＺがＣＨであるヌクレオシド誘導体が組み合わされていてもよい。かかるヌクレオシド誘導体は、例えば、国際公開パンフレット（ＷＯ／２００７／０９４１３５）において開示されている。
また、かかるヌクレオシド誘導体は、以下のホスホアミダイド誘導体やＣＰＧ誘導体を用いることにより、一般的なＣＰＧ等を用いるオリゴヌクレオチド合成法によってオリゴヌクレオチドに導入することができる。すなわち、リン酸エステル結合を介してオリゴヌクレオチド鎖に導入される。かかるホスホアミダイド誘導体及びＣＰＧ誘導体は、当業者であれば、以下に示すスキーム１によって合成することができる。なお、以下の方法は、ピリジンカルボン酸について説明するが、ベンジル誘導体についても同様である。すなわち、フタル酸ジメチル等のベンジル誘導体あるいはピリジンジカルボン酸ジメチル等を還元し、続いてＤＭＴｒ化し、さらに、これをアミダイト試薬によりアミダイト化してアミダイト体を得る。一方、ＤＭＴｒ体をスクシニル化し、さらにＣＰＧ樹脂と結合させてＣＰＧ誘導体を得ることができる。なお、ベンジル誘導体等に対する塩基のカップリングに先だって、ベンジル誘導体等が備える水酸基に適当な保護基を付与しておき、塩基のカップリング後、ＤＭＴｒ化前の適当な段階で脱保護することが好ましい。
ヌクレオシド誘導体は、第１のＲＮＡ鎖において、第１のＲＮＡ鎖中のｍｉＲＮＡ等のガイド鎖との相補配列以外の部分に備えられていることが好ましい。第１のＲＮＡ鎖がターゲットとするｍｉＲＮＡ等のガイド鎖との相補鎖形成(すなわち、ｍｉＲＮＡとしての機能の阻害)を阻害しないためである。したがって、ヌクレオシド誘導体は、第１のＲＮＡ鎖の好ましくは３’末端側及び／又は５’末端端側に備えられる。より好ましくは、第１のＲＮＡ鎖の３’末端側に、３’末端から適数個の範囲内で追加される。ヌクレオシド誘導体の個数は、ヌクレオシド誘導体を追加しない場合よりもヌクレアーゼ耐性が向上する限りにおいて限定されないが、好ましくは、１〜４個程度である。
かかるヌクレオシド誘導体は、第２のＲＮＡ鎖に備えられていてもよい。第２のＲＮＡ鎖に備えられることにより、第１のＲＮＡ鎖の安定性も高まると考えられる。ヌクレオシド誘導体は、既に説明した第１のＲＮＡ鎖における各種態様と同様の態様で第２のＲＮＡ鎖に備えられることが好ましい。
第１のＲＮＡ鎖及び第２のＲＮＡ鎖は、化学合成又は遺伝子工学的に製造できるほか、Ａｍｂｉｏｎ社等から商業的に入手可能である。第１のＲＮＡ鎖及び第２のＲＮＡ鎖には、細胞内等における安定性を確保する観点から、その塩基、糖等において適宜修飾が施されていてもよい。例えば、よりｍｉＲＮＡ等と強固に二本鎖を形成し、より効果的にｍｉＲＮＡ等の機能を阻害する（低下させる）ことができる点で、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）やＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等の修飾を有したものであることが好ましい。前記ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等の修飾を有する相補鎖としては、例えば、ｍｉＲＣＵＲＹ Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｘｉｑｏｎ社）などを利用することができる（例えば、Ｂｉｏｍｅｄｅｃｉｎｅ ＆ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌｕｍｅ６０，Ｉｓｓｕｅ９，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００６，Ｐａｇｅｓ６３３−６３８参照）。また、相補鎖としては、細胞内で分解されることを阻止してより安定に存在することができ、例えば、２’Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ等の修飾を有したものであることも好ましい。（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．１１ ２７０５−２７１６参照）。
阻害剤としては、ｍｉＲＮＡ等に対する第１のＲＮＡ鎖、さらには第１のＲＮＡ鎖と第２のＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡを転写可能に保持するＤＮＡ構築物であってもよい。かかるＤＮＡ構築物は、in vivo又はin vitro転写用のベクターを用いることで容易に得ることができる。
本明細書に開示の分化調節剤の有効成分は、目的に応じて選択される。すなわち、分化調節剤を、間葉系細胞の分化を抑制する目的に利用する場合、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ前駆体及びｍｉＲＮＡ等の上記ＤＮＡ構築物を用いることができる。また、分化調節剤を間葉系細胞の分化を促進する目的に利用する場合、上記阻害剤を用いることができる。有効成分は、同一の目的に寄与する有効成分を１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。また、前記間葉系細胞の分化促進剤中の前記有効成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜設定することができる。
本明細書に開示の分化調節剤は、上記した有効成分のみを含有していてもよいが、必要に応じてそのほかの成分を含むことができる。その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、前記有効成分を所望の濃度に希釈等するための、水、各種緩衝液などが挙げられる。また、前記その他の成分としては、間葉系細胞への分化を抑制又は促進したい細胞（対象細胞；例えば、骨芽細胞等の間葉系幹細胞）に前記有効成分を導入するための、導入用試薬なども挙げられる。前記導入用試薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などが挙げられる。
本明細書に開示の分化調節剤は、Ｄｌｘ５遺伝子の翻訳を抑制又は促進できることがから、間葉系幹細胞又は間葉系前駆細胞等の間葉系細胞への分化を抑制又は促進することができる。したがって、間葉系細胞への分化に関連する疾患を予防又は治療するための医薬として利用できる。また、間葉系細胞への分化に関連する研究試薬や医薬の評価並びにスクリーニングにも好ましく用いることができる。
（間葉系細胞の分化異常に起因する疾患を治療又は予防するための医薬）
本明細書に開示の医薬は、間葉系細胞の分化異常に起因する疾患を治療又は予防するための医薬であって、上記した分化調節剤を有効成分として含むことができる。分化調節剤は、本明細書に既に開示した各種分化調節剤を、医薬が対象とする疾患の種類に応じて選択される。本明細書に開示の医薬が間葉系細胞の分化過剰に起因する疾患であるときには、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ前駆体、これらを転写するためのＤＮＡ構築物を有効成分とすることができる。一方、本明細書に開示の医薬が間葉系細胞の分化抑制に起因する疾患であるときには、阻害剤を有効成分とする。
本明細書に開示の医薬における分化調節剤の含有量は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、本明細書に開示の医薬は、有効成分のみからなっていてもよいが、必要に応じてそのほかの成分を含むことができる。その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。典型的には、薬学上許容され得る担体などが挙げられる。前記担体としても、特に制限はなく、例えば、前記医薬の剤型等に応じて適宜選択することができる。また、前記医薬中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
本明細書に開示の医薬は、従来公知の各種の製剤形態を採ることができる。後述するような所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤などが挙げられる。こうした各種製剤において適宜必要とされる添加剤は、当業者において周知であり、当業者であれば目的に応じて種々の製剤を製造することができる。
本明細書に開示の医薬は、好ましくは、投与対象又は投与対象から採取された細胞を含む組織に対して、細胞内への医薬のトランスフェクションに適した製剤形態を採る。たとえば、適用部位に応じた注射製剤（皮下注射、静脈注射、筋肉注射、骨髄注射、歯髄注射、腹腔内注射等）の形態をとることができる。注射剤は、例えば、有効成分のほか、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。なお、ｐＨ調節剤及び緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
本明細書に開示の医薬の投与方法は特に限定されないが、医薬の剤型に応じて適宜選択される。上記のとおり、本明細書に開示の医薬は、例えば、有効成分を、患者における細胞や組織に対してトランスフェクトすることにより投与することができる。なお、細胞や組織は、間葉系幹細胞や前駆細胞が存在する箇所であることが好ましい。例えば、骨芽細胞への分化異常に起因する疾患においては、骨芽細胞への幹細胞や前駆細胞が存在する箇所、典型的には骨髄等を投与対象とすることが好ましい。
また、患者等から採取した間葉系幹細胞や間葉系前駆細胞あるいはこれらを含む組織にトランスフェクトし、その細胞を患者に移植することにより投与することができる。トランスフェクトの方法には、特に制限はなく、例えば、従来公知のリポフェクションやエレクトロレーション等の方法を適宜選択して利用することができる。患者の生体外でトランスフェクションを行った細胞を患者に移植する方法としても、特に制限なく、例えば、従来公知の細胞移植方法を適宜利用することができる。
なお、本明細書に開示の医薬の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができる。また、その投与回数としては、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができる。さらに、その投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記間葉系細胞の分化異常（過剰や抑制）に起因する疾患に対して、予防的に投与されてもよいし、治療的に投与されてもよい。本明細書に開示の医薬の投与対象となる哺乳動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられる。
本明細書に開示の医薬が予防又は治療の対象とする疾患は、間葉系細胞の分化異常（過剰や抑制）に起因する疾患である。例えば、間葉系細胞としては、骨芽細胞であることが好ましい。本明細書に開示の分化調節剤は、骨芽細胞の分化過程で特異的に作用するＤｌｘ５遺伝子の発現に関連するからである。間葉系細胞の分化過剰に起因する疾患としては、例えば、骨芽細胞の分化過剰に起因する、骨芽細胞型骨肉種等が挙げられる。また、間葉系細胞の分化抑制（分化不足）に起因する疾患としては、骨芽細胞の分化抑制又は不足に起因する、骨粗鬆症（閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイド治療による骨粗鬆症、糖尿病性骨粗鬆症）、骨形成不全、発達期における成長阻害等が挙げられる。
（評価方法）
本明細書に開示の間葉系細胞の分化調節剤の評価方法は、Ｄｌｘ５遺伝子の３’非翻訳領域に結合するｍｉＲＮＡの作用の増大又は低下を指標とすることができる。本明細書に開示の評価方法によれば、間葉系細胞の分化を抑制又は促進できる分化調節剤を得ることができる。すなわち、本明細書に開示の評価方法は、本明細書に開示の分化調節剤及び医薬の有効成分のスクリーニング方法として利用できる。
本明細書に開示の評価方法は、典型的には、Ｄｌｘ５遺伝子を有する間葉系幹細胞若しくは前駆細胞であって当該遺伝子を標的とする内在のｍｉＲＮＡ等を有する細胞又は非ヒト動物に対して被験化合物を供給する工程と、前記間葉系幹細胞又は非ヒト動物におけるＤｌｘ５遺伝子の３’非翻訳領域に結合するｍｉＲＮＡの発現量を前記被験化合物の非供給時との対比に基づいて、前記被験化合物の間葉系幹細胞の分化調節作用を評価する工程と、を備えることができる。さらに、本明細書に開示のスクリーニング方法は、評価工程後において、間葉系幹細胞の分化を促進又は抑制する被験化合物を選択する工程を備えることができる。
上記した供給工程は、既に説明したように、本明細書に開示の分化調節剤や医薬を細胞又は患者等に投与する際に用いられる従来公知のトランスフェクトの方法を採用できる。被験化合物としては、特に限定しない。例えば、本明細書に開示の分化調節剤の候補となるｍｉＲＮＡ等やその阻害剤が挙げられる。
上記した評価工程では、被験化合物が内在性のｍｉＲＮＡの作用を増強するか低減するかどうかを評価する。評価方法は特に特定しないで、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、被験化合物の存在下及び非存在下での内在性ｍｉＲＮＡの発現量やＤｌｘ５遺伝子の発現量（好ましくはタンパク質としての発現量）を測定することができる。また、骨芽細胞に対する間葉系幹細胞や前駆細胞を細胞として用いる場合には、アルカリフォスファターゼの活性等の各種の骨芽細胞への分化指標を用いることもできる。
評価工程では、例えば、被験化合物の非存在下（非供給時）と比べて、被験化合物の存在下（供給時）において、ｍｉＲＮＡ等の発現量等が増大するときには、被験化合物は、内在性ｍｉＲＮＡの作用を増大させると評価することができる。すなわち、被験化合物は、間葉系細胞への分化を抑制する被験化合物であると評価できる。一方、被験化合物の存在下において、ｍｉＲＮＡ等の発現量等が低下するときには、被験化合物は、内在性ｍｉＲＮＡの作用を低下させると評価することができる。すなわち、被験化合物が間葉系細胞への分化を促進すると評価できる。
なお、以上の供給工程又は評価工程のいずれかあるいはこれらの工程の間において、適宜間葉系幹細胞や前駆細胞の間葉系細胞への分化を誘導する処理を施しておいてもよい。分化誘導処理としては、例えば、骨芽細胞への誘導処理には、ＢＭＰ−２等を用いることができる。かかる分化誘導処理下において、被験化合物について評価することで、一層明確に被験化合物の分化抑制能や分化促進能を検出することができる。
また、本明細書に開示のスクリーニング方法は、上記供給工程と上記評価工程に加えて選択工程を備えることができる。選択工程は、間葉系細胞への分化を抑制又は促進すると評価できた被験化合物を間葉系細胞への分化調節剤として選択する工程である。選択された被験化合物は、本明細書に開示の分化調節剤及び医薬の有効成分あるいはその候補として有用である。
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
（実験例１）
（ＢＭＰ−２刺激における骨芽細胞分化）
マウス頭蓋骨由来前駆骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（理化学研究所より分与）を２４−ｗｅｌｌプレートに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した細胞を５００μｌ／ｗｅｌｌずつ播種し、ＭＥＭ−α（１０％ＦＢＳ，１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン含有：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で２４時間前培養した。２４時間後、ＢＭＰ−２（ＢｉｏＶｉｓｏｎ社製）を培地に終濃度が２００ｎｇ／ｍｌとなるように加え、２４〜７２時間培養した。各設定培養時間後、細胞を回収し、細胞溶解液を加え、超音波破濁（１０秒、３回）した。その後遠心分離（１４，５００ｒｐｍ、４℃、１５分）し、上清を新しい１．５ｍｌチューブに移し、酵素活性測定まで氷上で保管した。骨芽細胞分化は分化中段階で活性が上昇するアルカリフォスファターゼ（以下ＡＬＰと省略）の活性を指標に評価した。ＡＬＰの活性についてはラボアッセイ（登録商標）ＡＬＰキット（和光純薬工業株式会社製）による酵素活性及びＴＲＡＣＰ＆ＡＬＰ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔａｉｎ ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）によるＡＬＰ染色の二重評価により行った。結果を図３に示す。
図３に示すように、マウス頭蓋骨由来前駆骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞をＢＭＰ−２で分化誘導させると４８時間後より分化中段階で活性の上昇するＡＬＰの活性が有意に上昇した。このことから本細胞においてＢＭＰ−２により分化誘導されることがわかった。
（実験例２）
（ＢＭＰ−２誘導骨芽細胞分化におけるｍｉｃｒｏＲＮＡ発現の変動）
ＢＭＰ−２誘導におけるｍｉｃｒｏＲＮＡ発現の変化を確認するためにＢＭＰ−２誘導処理（終濃度：２００ｎｇ／ｍｌ）したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞と無処理の細胞から全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて抽出した。そのうち一部を三菱レイヨン株式会社製 ｍｉｃｒｏＲＮＡアレイ解析に供した。その結果、発現量が変化したｍｉｃｒｏＲＮＡ（登録商標）ｍｉＲ−）−１４１、−２００ａについてさらにＴａｑｍａｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）に供し、Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ−ＰＣＲ法により再現性を確認した。結果を図４に示す。
図４に示すように、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を、ＢＭＰ−２分化誘導処理をした細胞と無処理の細胞から抽出した全ＲＮＡを三菱レイヨン株式会社製ｍｉｃｒｏＲＮＡアレイ解析に供したところｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲ−）−１４１、−２００ａ、２０８の発現が変化した。再現性をＴａｑｍａｎ（登録商標）ｍｉｃｒｏＲＮＡ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたＲｅａｌ Ｔｉｍｅ−ＰＣＲ法により確認したところ有意に発現を低下させた。これらの結果より、ＢＭＰ−２分化誘導刺激によりこれらのｍｉＲ類の発現が低下することが確認された。
（実験例３）
（人工ｍｉＲＮＡ−１４１、−２００ａ、−２０８の各前駆体導入によるＢＭＰ−２誘導骨芽細胞分化への影響）
内在性のｍｉＲＮＡ分子を模倣するようにデザインされているＰｒｅ−ｍｉＲ（登録商標）Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ−１４１、−２００ａ、２０８（Ａｍｂｉｏｎ社製）をそれぞれＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｍｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いたリポフェクション法によりＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に終濃度が２０ｎＭおよび４０ｎＭとなるように導入した。導入したｍｉＲ類の機能を検証するために既知のｍｉＲＮＡ機能と同等と見なしうる影響を与えないＰｒｅ−ｍｉＲ（登録商標）Ｎｅｇａｔｉｖｅ ＣｏｎｔｒｏｌをＮｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌに用いた。各種導入した細胞をＯＰＴＩ−ＭＥＭ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で１８時間培養後、ＭＥＭ−α（１０％ＦＢＳ，１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン含有）に培地交換後７２時間培養した。その後、２４−ｗｅｌｌプレートに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した細胞を５００μｌ／ｗｅｌｌずつ播種し、播種３時間後にＢＭＰ−２を終濃度が２００ｎｇ／ｍｌとなるように加え分化を誘導し、７２時間培養した。分化誘導７２時間後、上記実験例１に示したＡＬＰ活性及び染色により分化能を評価した。結果を図５及び図６に示す。
図５に示すように、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に内在性のｍｉＲＮＡ分子を模倣するようにデザインされているＰｒｅ−ｍｉＲ（登録商標）Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ−１４１、−２００ａ、−２０８（Ａｍｂｉｏｎ社製）を導入し、ＢＭＰ−２にて分化誘導させたところ、これらｍｉＲ類を導入した細胞では骨芽細胞の分化指標であるＡＬＰ活性がＢＭＰ−２処理、Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して有意に低下することが確認された。また、図６に示すように、ＡＬＰ染色結果も同様にｍｉＲ導入により染色が淡色化していることが確認された。これら結果から、これらｍｉＲ類の発現低下は骨芽細胞の分化に関与していることが確認された。
（実験例４）
（ｍｉＲＮＡ−１４１及び−２００ａの標的遺伝子の同定）
ｍｉＲ−１４１、−２００ａの標的遺伝子をサンガー研究所のデータベースｍｉＲＢａｓｅ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ５（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｔａｒｇｅｔｓ／ｖ５／）およびＴａｒｇｅｔＳｃａｎ４．２ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ／）により検索したところ、これまでに骨芽細胞分化を制御すると報告されている（文献１−５）転写因子の一つであるｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ５（Ｄｌｘ５）を共通に標的としていることが推測された。そこで推測された標的遺伝子であるＤｌｘのタンパク発現をウエスタンブロッティング法により検討した。
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に上記実験３と同様に、Ｐｒｅ−ｍｉＲ（登録商標）Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ−１４１、−２００ａを導入し（終濃度：４０ｎＭ）、６−ｗｅｌｌプレートに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した細胞を１ｍｌ／ｗｅｌｌずつ播種し、播種３時間後にＢＭＰ−２（終濃度：２００ｎｇ／ｍｌ）加え、７２時間培養した。分化誘導７２時間後、細胞溶解液（ＲＩＰＡ緩衝液）を加え、細胞溶解液を調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ウエスタンブロッティングに供した。検出には化学発光を利用したＥＣＬ−Ｐｌｕｓ（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いた。結果を、図７に示す。
図７に示すように、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞にＰｒｅ−ｍｉＲ（登録商標）Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ−１４１、−２００ａ（Ａｍｂｉｏｎ社製）を導入し、ＢＭＰ−２にて分化誘導させた細胞から細胞溶解液を調製し、ウエスタンブロッティングンに供したところ、これらｍｉＲ類を導入した細胞群ではＢＭＰ−２処理、Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べ顕著に骨芽細胞分化に関わる転写因子であるＤｌｘ５のタンパク発現を抑制した。この抑制はＢＭＰ−２無処理のレベルに匹敵していた。この結果からｍｉｃｒｏＲＮＡ−１４１および−２００ａがＤｌｘ５を標的遺伝子としていることが確認された。
（実験例５）
（ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１４１及び−２００ａによる標的遺伝子のＤｌｘ５のｍＲＮＡ発現への影響）
上記実験例４よりｍｉＲ−１４１及び−２００ａが骨芽細胞分化に関わるＤｌｘ５のタンパク発現を有意に抑制したことからこれらｍｉＲ類のタンパク発現抑制メカニズムについてＲｅａｌ Ｔｉｍｅ−ＰＣＲ法にて検討した。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に上記実験例３と同様にＰｒｅ−ｍｉＲ（登録商標）Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ−１４１、−２００ａを導入し、６−ｗｅｌｌプレートに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した細胞を１ｍｌ／ｗｅｌｌずつ播種し、播種３時間後にＢＭＰ−２（終濃度：２００ｎｇ／ｍｌ）加え、７２時間培養した。その後各細胞から全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて抽出し，ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社社製）によりｃＤＮＡを調製後、ＳＹＢＥＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標）ＩＩ（タカラバイオ株式会社社製）によりｍＲＮＡの発現量を測定した。内部標準にはＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を用いた。Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ−ＰＣＲに用いたプライマー対はＧＡＰＤＨについてはｍｏｕｓｅ ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ Ｇｅｎｅ ｐｒｉｍｅｒ（ｍｏｕｓｅ Ｇａｐｄｈ ｐｒｉｍｅｒ）（タカラバイオ株式会社社製）を用い、Ｄｌｘ５については以下に示す。結果を図８に示す。
Ｄｌｘ５−ｓｅｎｓｅ；５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＴＧＧＧＣＴＡＣＴＴＴＣＴＣＴＴ−３’
Ｄｌｘ５−ａｎｔｉｓｅｎｓｅ；５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＧＴＴＣＡＡＡＣＡＴＣＣＣＣＧＴＡＴＧＡ−３’
図８に示すように、Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ−ＰＣＲ法でＤｌｘ５のｍＲＮＡレベルを確認したところｍｉＲを導入した細胞においてもＤｌｘ５のｍＲＮＡ発現はＢＭＰ−２処理、Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ群と変わらなかった。この結果から、これらｍｉＲ類はＤｌｘ５のｍＲＮＡを分解するのではなくｍＲＮＡからの翻訳を制御することによりＤｌｘ５のタンパク発現を抑制していることが確認された。
（実験例６）
（ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１４１および−２００ａアンチセンス鎖導入における骨芽細胞分化への影響）
内在性のｍｉｃｒｏＲＮＡに特異的に結合し、阻害するようにデザインされているＡｎｔｉ−ｍｉＲ（登録商標）Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１４１、−２００ａ（Ａｍｂｉｏｎ社製）を上記実験例３と同様の方法により細胞に導入した（終濃度：２０ｎＭ，４０ｎＭ，８０ｎＭ）。ＢＭＰによる分化誘導２４、４８、７２時間後、上記実験例１に示したＡＬＰ活性により分化能を評価した。結果を図９に示す。
図９に示すように、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に内在性のｍｉｃｒｏＲＮＡに特異的に結合し、阻害するようにデザインされているＡｎｔｉ−ｍｉＲ（登録商標）Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１４１、−２００ａ（ｍｉＲ阻害剤）を導入し、ＢＭＰ−２にて分化誘導させたところ、これらｍｉＲ阻害剤を導入した細胞では骨芽細胞の分化指標であるＡＬＰ活性がＢＭＰ−２処理、Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して有意に上昇することが確認された。また、このＡＬＰ活性は培養時間及び添加濃度依存性があることも確認された。これら結果から、これらｍｉＲ阻害剤のアンチセンス鎖の導入は骨芽細胞の分化促進剤として有効であることが確認された。
（実験例７）
（化学修飾ｍｉｃｒｏＲＮＡ２００ａアンチセンス鎖導入における骨芽細胞分化への影響）
図１０に示すように、２本鎖におけるミスマッチが５箇所存在するｍｉＲＮＡ−２００ａのｐａｓｓｅｎｇｅｒ鎖の塩基配列を２箇所または３箇所マッチングさせた修飾ｍｉＲＮＡ（阻害剤）を準備した。なお、この修飾ｍｉＲＮＡの３末端には、式（１）においてＺがＣＨであるヌクレオシド誘導体（図１０においては「Ｂ」で示す。）及び同式（１）においてＺがＮであるヌクレオシド誘導体（図１０においては「Ｐ」で示す。）を各ＲＮＡ鎖の３’末端に導入した。なお、用いたホスホアミダイド及びＣＰＧへの固定は以下のスキーム１、２に示すとおりであり、各スキーム中のそれぞれの化合物の合成方法を以下に示す。なお、これらのホスホアミダイド体は、他のヌクレオチド誘導体のホスホアミド体と同様に扱って修飾ＲＮＡを合成した。３’末端ダングリングエンドを有するRNAオリゴヌクレオチドを固相ホスホロアミダイト法に従って核酸自動合成機によって合成した。すなわち、RNAの固相合成に関してはCPG樹脂に結合したオリゴヌクレオチドをEtOH:NH3=3:1水溶液2mLを加えて室温で12時間振とうして樹脂からの切り出し及び脱保護を行った。また、縮合時間は15分とした。反応後のろ液をエッペンドルフチューブに移し、減圧下で乾固した。残渣に1M TBAF in THF 溶液1mLを加え、12時間振とうした。この反応液を0.1M TEAA bufferで希釈して30mLとした。この反応液を平衡化したC-18カラム(Sep-Pak)に通し、カラムに吸着させた。ここでカラムを滅菌水で洗浄して塩を取り除き50% CH3CN in H2O 3mLで溶出し、減圧下で乾固した。残渣にloading solution (1×TBE in 90% formamide )100 μLを加え20% PAGEにより(600V,20mA)目的のオリゴヌクレオチドを単離した。目的のオリゴヌクレオチドを切り出し0.1M TEAA buffer 1mM EDTA水溶液20mLを加え、12時間振とうした。このろ液を平衡化したC-18逆相かラム(Sep-Pak)に通し、カラムに吸着させた。ここでカラムを滅菌水で洗浄して塩を取り除き50% CH3CN in H2O 3mLで溶出し、減圧下乾固した。
（ベンゼンユニットの合成）
上記スキームＩに示す化合物２〜化合物５を合成した。すなわち、イソフタル酸ジメチルを還元し化合物２を収率７５％で得て、続いてDMTr化を行い化合物３を収率５４％で得た。DTMr体３をアミダイド化して化合物４を８８％の収率で得た。また、DMTr体３をスクシニル化し、CPG樹脂と結合させ、化合物５を１０６μmol/gの活性で得た。化合物２〜５の製造例を以下に示す。
イソフタル酸ジメチル（化合物1）を出発原料とし、LiBH4にて還元反応を行い、化合物2を得た。さらに一方の水酸基をDMTr保護し化合物3であるトリチル体を得た後、これを亜リン酸化することで化合物4であるアミダイトユニットを得た。また化合物3からスクシニル化を経てＣＰＧ担体である化合物5を得た。
（化合物２：1,3-bis-hydroxymethylbenzeneの製造例）
イソフタル酸ジメチル（2.00g,10.30mmol）にAr雰囲気下、dry THF(51.5ml,0.2M solution)を加え、水素化ホウ素リチウム（1.12g,51.1mmol,5eq）を加えた。２３時間攪拌した後、氷浴で酢酸を数滴加えて反応液を中性にし、反応を停止した。しばらく攪拌した後、析出した結晶をMeOHで溶解した。反応中のTLC(Hex:EtOAc=1:1)では生成物は１スポットであったが、反応を停止すると２スポットに分かれた。溶媒を減圧留去後、シリカゲルクロマトグラフィー（EtOAc only）で単離し、化合物２（75%）を得た。
（化合物３：1-(4,4’-dimethoxytrityloxy)methyl-3-hydroxymethylbenzeneの製造例）
予め真空乾燥させておいた化合物２（0.5g,3.62mmol）をpyridine(18mL)に溶解し、DMAP(22.1mg,0.18mmol,0.05eq)と4,4’-Dimethoxytrityl chloride(1.23g,3.62mmol,1eq)を加え、Ar雰囲気下で17時間攪拌した。TLC(Hex:EtOAc=3:1)により原料の消失を確認した。EtOAcとsatNaHCO3 aqで抽出し、有機層をsat NaCl aqで洗浄、無水Na2SO4を加え乾燥させた。溶媒を減圧留去後、シリカゲルクロマトグラフィー(Hex:EtOAc=4:1)で単離し、化合物３(54%)を得た。
（化合物４：1-(4,4’-dimethoxytrityloxy)methyl-3-0-[(2-cyanoethyl) -(N,N-diisopropyl)]-
phosphoamidiomethyl-hydroxymethylbenzeneの製造例）
予め真空乾燥させておいた化合物３（0.35g,0.80mmol）をdry THF(8mL)に溶解し、DIPEA(0.4mL,4.00mmol,5eq)と亜リン酸化試薬（0.29mL,1.60mmol,2eq）をｐ加え、Ar雰囲気下で1.5時間攪拌した。TLC(EtOAc only)により原料の消失を確認した。EtOAcとsatNaHCO3 aqで抽出し、有機層をsat NaCl aqで洗浄、無水Na2SO4を加え乾燥させた。溶媒を減圧留去後、シリカゲルクロマトグラフィー(Hex:EtOAc=1:1)で単離し、化合物４(88%)を得た。
（化合物５（イソフタル酸誘導体のCPG樹脂）の製造例）
化合物３(0.30g,0.68mmol)をpyridine(6.8mL)に溶解し、そこにDMAP(3.7mg,0.03mmol,0.02eq)と無水コハク酸(204mg,2.04mmol,3eq)を加えAr雰囲気下で攪拌した。24時間攪拌した後、TLC(Hex:EtOAc=3:1)により反応の進行を確認し、EtOAcとsatNaHCO3 aqで抽出し、有機層をsat NaCl aqで洗浄、無水Na2SO4を加え乾燥させた。溶媒を減圧留去後、真空乾燥させた。この濃縮物(5)(0.04g,0.74mmol,109%)にdry DMF(10mL)を加え溶解させ、CPG(500mg,0.11mmol)を加え30分間靜置して反応液となじませた。その後、WSC(110mg,0.57mmol,4.9eq)を加え室温で一日振とうさせた。後処理として、pyridineで洗浄した後に0.1M DMAP in pyridine:無水酢酸（9:1）溶液(6mL)を加え、16時間振とうさせた。このものをMeOH、acetoneで洗浄し乾燥させ活性を測定した。化合物５の活性は108.6μmol/gであった。なお、活性は、乾燥したCPG樹脂6mgをガラスフィルターにのせ、HClO4:EtOH=3:2の溶液を流し込み、そのろ液のUV 498 nmの波長(DMTr基の波長)の吸光度を求め、以下の式に代入することにより算出した。
活性（μmol/g）=Abs,(498 nm)×Vol.(solution)(mL)×14.3/Weight(support)(mg)
（３’末端ダウングリングエンドの合成のためのピリジンカルボン酸ジメチル誘導体の合成）
2,6-ピリジンカルボン酸ジメチル（化合物6）を出発原料とし、LiBH4にて還元反応を行うことで、化合物7を得た。さらに一方の水酸基をDMTr保護し化合物１０であるトリチル体を得た後、この化合物からスクシニル化を経てＣＰＧ担体である化合物１０を得た。なお、参考までにアミダイト体９の合成例も示す。
（化合物７：2,6-bis-hydroxymethylpyridineの製造例）
2.6ピリジンカルボン酸ジメチル（2.00g,10.25mmol）にAr雰囲気下、無水THF(51.3mL,0.2M solution)を加え、水素化ホウ素リチウム(1.16g, 51.3mmol,
5eq)を加えた。16時間攪拌した後、氷浴で酢酸を数滴加えて反応液を中性にし、反応を停止した。しばらく攪拌した後、析出した結晶をメタノールで溶解した。反応中のTLC（クロロホルム：メタノール＝3:1）では生成物は１スポットであったが、反応を停止すると２スポットに分かれた。溶媒を減圧流去後、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール=10:1~3:1）で単離し、化合物７（９１％）を得た。
（化合物８：2-(4,4’-dimethoxytrityloxy)methyl-6-hydroxymethylpyridineの製造例）
予め真空乾燥させておいた化合物７（0.5g,3.62mmol）をpyridine(18mL)に溶解し、DMAP(22.1mg,0.18mmol,0.05eq)と4,4’-Dimethoxytrityl chloride
・ 22g,3.60mmol,1eq)を加え、Ar雰囲気下で16時間攪拌した。
(TLC(Hex:EtOAc=1:1)により原料の消失を確認した。EtOAcとsatNaHCO3
aqで抽出し、有機層をsat NaCl aqで洗浄、無水Na2SO4を加え乾燥させた。溶媒を減圧留去後、シリカゲルクロマトグラフィー(Hex:EtOAc=4:1~3:1)で単離し、化合物８(44%)を得た。
（化合物９：2-(4,4’-dimethoxytrityloxy)methyl-6-0-[(2-cyanoethyl) -(N,N-diisopropyl)]-phosphoamidiomethyl-hydroxymethylbenzeneの製造例）
予め真空乾燥させておいた化合物８（0.20g,0.45mmol）を無水THF(4.5mL)に溶解し、DIPEA(0.23mL,2.25mmol,5eq)と亜リン酸化試薬（0.16mL,0.90mmol,2eq）を加え、Ar雰囲気下で15時間攪拌した。TLC(EtOAc only)により原料の消失を確認した。EtOAcとsatNaHCO3 aqで抽出し、有機層をsat NaCl aqで洗浄、無水Na2SO4を加え乾燥させた。溶媒を減圧留去後、シリカゲルクロマトグラフィー(EtOAc only)で単離し、化合物９を得た。
（化合物１０：ピリジルカルボン酸ジメチル誘導体のCPG樹脂の製造例）
化合物８(0.20g,0.45mmol)をpyridine(4.5mL)に溶解し、そこにDMAP(1.1mg,0.009mmol,0.02eq)と無水コハク酸(136mg,1.36mmol,3eq)を加えAr雰囲気下で攪拌した。17時間攪拌した後、TLC(Hex:EtOAc=1:1)により反応の進行を確認し、EtOAcとsatNaHCO3 aqで抽出し、有機層をsat NaCl aqで洗浄、無水Na2SO4を加え乾燥させた。溶媒を減圧留去後、真空乾燥させた。この濃縮物(0.16g,0.30mmol,66%)にdry DMF(7.5mL)を加え溶解させ、CPG(338mg,0.075mmol)を加え30分間靜置して反応液となじませた。その後、WSC(71mg,0.37mmol,4.9eq)を加え室温で一日振とうさせた。後処理として、pyridineで洗浄した後に0.1M DMAP in pyridine:無水酢酸（9:1）溶液(6mL)を加え、16時間振とうさせた。このものをMeOH、acetoneで洗浄し乾燥させ活性を測定した。化合物１０の活性は31.4μmol/gであった。
各修飾ｍｉＲＮＡ（阻害剤）及び実験例６で用いたＡｎｔｉ−ｍｉＲ（登録商標）Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１４１、−２００ａのほか−２０８（Ａｍｂｉｏｎ社製）を、上記実験例３と同様な方法により細胞に導入した（終濃度：２０ｎＭ，４０ｎＭ、８０ｎＭ）。ＢＭＰによる分化誘導２４、４８、７２時間後、上記実験例１に示したＡＬＰ活性及び染色により分化能を評価した。また、ハイドロキシアパタイト結晶を形成させた。これらの結果を図１１及び図１２に示す。
図１１及び図１２に示すように、これらｍｉＲＮＡ（阻害剤）を導入した細胞では骨芽細胞の分化指標であるＡＬＰ活性、ハイドロキシアパタイト結晶の形成がＢＭＰ−２処理群及びＮｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して有意に上昇することが確認された。また、このＡＬＰ活性は培養時間及び添加濃度依存性があることも確認された。これら結果から、これらｐａｓｓｅｎｇｅｒ鎖の塩基配列を２箇所または３箇所マッチングさせ、式（１）で表されるヌクレオシド誘導体を導入した修飾ｍｉＲＮＡ−２００ａの導入は骨芽細胞の分化促進剤として有効であることが確認された。

Claims (15)

  1. Ｄｌｘ５遺伝子の３’非翻訳領域に結合するｍｉＲＮＡ、その前駆体及びこれらをコードするＤＮＡ構築物並びに前記ｍｉＲＮＡの阻害剤から選択される有効成分を有する、間葉系細胞の分化調節剤。
  2. 前記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ−１４１、ｍｉＲＮＡ−２００ａ及びｍｉＲＮＡ−２０８から選択される１種又は２種類以上である、請求項２に記載の間葉系細胞の分化調節剤。
  3. 前記ｍｉＲＮＡ、その前駆体及びこれらをコードするＤＮＡ構築物から選択されるいずれかを有効成分とし、間葉系細胞への分化を抑制する、請求項１又は２に記載の間葉系細胞の分化調節剤。
  4. 前記阻害剤を有効成分とし、間葉系細胞への分化を促進する、請求項１に記載の間葉系細胞の分化調節剤。
  5. 前記阻害剤は、前記ｍｉＲＮＡのガイド鎖の少なくとも一部に対するアンチセンス配列を含む第１のＲＮＡ鎖を有し、該第１のＲＮＡ鎖中に少なくとも一つの以下の式で表されるヌクレオシド誘導体を備える一本鎖ＲＮＡを含む、請求項４に記載の間葉系細胞の分化調節剤。
    [式(１)中、Ｚは、ＣＨ又はＮを表す。]
  6. 前記第１のＲＮＡ鎖は、内在性の前記ｍｉＲＮＡの前記ガイド鎖に対するパッセンジャー鎖よりも前記ガイド鎖に対する相補性が高い、請求項５に記載の間葉系細胞の分化調節剤。
  7. 前記第１のＲＮＡ鎖は、その３'末端側に前記ヌクレオシド誘導体を備える、請求項５又は６に記載の間葉系細胞の分化調節剤。
  8. 前記阻害剤は、前記第１のＲＮＡ鎖と前記マイクロＲＮＡのガイド鎖である第２のＲＮＡ鎖とを備える二重鎖ＲＮＡを含む、請求項５〜７のいずれかに記載の間葉系細胞の分化調節剤。
  9. 前記第２のＲＮＡ鎖は、その３'末端側に前記ヌクレオシド誘導体を備える、請求項８に記載の間葉系細胞の分化調節剤。
  10. 前記間葉系細胞は骨芽細胞である、請求項１〜９のいずれかに記載の間葉系細胞の分化調節剤。
  11. 間葉系細胞の分化異常に起因する疾患を治療又は予防するための医薬であって、請求項１〜１０のいずれかに記載の間葉系細胞の分化調節剤を含む、医薬。
  12. 前記疾患は、前記間葉系細胞の分化抑制又は不足に起因する疾患である、請求項１１に記載の医薬。
  13. 前記間葉系細胞が骨芽細胞であり、前記疾患が骨粗鬆症、骨形成不全、及び発達期における成長阻害からなる群より選択される少なくともいずれかである請求項１２に記載の医薬。
  14. 前記間葉系細胞の分化調節剤の評価方法であって、
    Ｄｌｘ５遺伝子の３’非翻訳領域に結合するｍｉＲＮＡの作用の増大又は低下を指標とする、評価方法。
  15. Ｄｌｘ５遺伝子を有する間葉系幹細胞若しくは前駆細胞又は非ヒト動物に対して被験化合物を供給する工程と、
    前記間葉系幹細胞若しくは前駆細胞又は非ヒト動物におけるＤｌｘ５遺伝子の３’非翻訳領域に結合するｍｉＲＮＡの発現量を前記被験化合物の非供給時との対比に基づいて、前記被験化合物の骨芽細胞の分化調節作用を評価する工程と、
    を備える、請求項１４に記載の方法。
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