JPWO2009154201A1 - 細胞接着促進剤及び細胞の接着を促進させる方法 - Google Patents
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Abstract
Description
項1.下記式(I)で表されるジスピロトリピペラジン誘導体又はその塩を含む、支持体への細胞接着促進剤。
R2aは、R1及びR2の定義に同じである。〕〕
項2.ジスピロトリピペラジン誘導体が下記の群から選択される、項1に記載の細胞接着促進剤。
項4.前記細胞が浮遊性細胞である、項1〜3のいずれか一項に記載の細胞接着促進剤。
項5.項1に記載のジスピロトリピペラジン誘導体又はその塩を培地に添加もしくは支持体に塗布することを特徴とする、支持体へ細胞の接着を促進させる方法。
項6.項2に記載のジスピロトリピペラジン誘導体又はその塩を培地に添加もしくは支持体に塗布することを特徴とする、支持体へ細胞の接着を促進させる方法。
項7.前記支持体が細胞培養容器である、項5又は6に記載の方法。
項8.前記細胞が浮遊性細胞である、項5〜7のいずれか一項に記載の方法。
項9.項1又は2に記載のジスピロトリピペラジン誘導体又はその塩を含む、細胞接着及び/又は細胞増殖を促進するヘパラン硫酸アゴニスト。
項10.下記式(Ia)で表されるジスピロトリピペラジン誘導体又はその塩。
R4aは、R3及びR4の定義に同じである。〕〕
項11.下記の群から選択されるジスピロトリピペラジン誘導体又はその塩。
項13.項1又は2に記載のジスピロトリピペラジン誘導体又はその塩を含む細胞培養用培地。
項14.項1又は2に記載のジスピロトリピペラジン誘導体又はその塩を塗布した細胞培養容器。
本発明の支持体への細胞接着促進剤は、下記式(I)で表されるジスピロトリピペラジン誘導体又はその塩を含むことを特徴とする。
R2aは、R1及びR2の定義に同じである。〕〕
培地への添加により支持体に細胞を接着させるための上記ジスピロトリピペラジン誘導体又はその塩の有効濃度としては、好ましくは培地中で0.4〜400 μM程度、より好ましくは培地中で0.4〜60 μM程度である。
本発明の細胞接着促進剤を用いて細胞を接着させるための支持体としては、通常プラスチックやガラス材料のものであって、細胞を培養するための細胞培養容器又は体内に入れる医療材料であれば特に限定されない。そのような細胞培養容器としては、例えば、培養用12穴、24穴、48穴及び96穴マルチウェルプレート、培養用シャーレ、及び培養用フラスコが挙げられ、組織培養用、又は浮遊培養用のどちらであってもよい。体内に入れる医療材料は、体内に埋め込む人工臓器に使用されるものであり、人工臓器としては、例えば、人工関節、人工血管などが挙げられる。
本発明の細胞接着促進剤を用いて接着を促進させる細胞としては、本発明の細胞接着促進剤を用いることにより支持体への接着が促進する細胞であれば特に限定されないが、好ましくは動物細胞であり、より好ましくは哺乳類の動物細胞である。例えば、ヒト、マウス、ラット等由来の細胞が挙げられる。また、細胞の種類は細部表面にグリコサミノグリカンが存在する細胞が好ましく、グリコサミノグリカンとしてヘパリン、ヘパラン硫酸又はケラタン硫酸が存在する細胞が特に好ましい。細胞は、足場依存性細胞及び浮遊性細胞のどちらであってもよい。ここで、足場依存性細胞とは、培養容器に接着できなれば生存できず増殖もできない細胞を意味し、例えば繊維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、表皮細胞、肝細胞、骨芽細胞、骨格筋細胞、胚性幹細胞(ES細胞)、人工多能性幹細胞(iPS細胞)等が挙げられる。浮遊性細胞とは、浮遊状態でも増殖できる細胞を意味し、例えば骨髄細胞、リンパ系細胞、腹水ガン細胞等が挙げられる。また、本発明で用いられる細胞としては初代培養細胞も挙げられ、初代培養細胞はいずれの組織に由来するものであってもよい。
本発明の支持体へ細胞の接着を促進させる方法は、上記式(I)に記載のジスピロトリピペラジン誘導体又はその塩を培地に添加もしくは支持体に塗布することを特徴とする。
本発明の細胞接着及び/又は細胞増殖を促進するヘパラン硫酸のアゴニストは、上記式(I)に記載のジスピロトリピペラジン誘導体又はその塩を含むことを特徴とする。
上記式(I)に記載のジスピロトリピペラジン誘導体又はその塩は、細胞の支持体への接着を促進させる活性を有することから、浮遊性細胞にマイクロインジェクションを行う際に添加することでマイクロインジェクションの成功率を上げることができる。これにより、浮遊性細胞に遺伝子をマイクロインジェクションで導入することが容易になる。
式(I)で表される化合物及びその塩は、例えば、下記式(III)の化合物とR1-X1及びR2-X2(X1及びX2は同一又は異なる脱離基であり、例えばCl, Br等のハロゲン、p-トルエンスルホニルオキシ、メタンスルホニルオキシ等が挙げられる)とを反応させ、必要に応じて生成物を他の式(I)の化合物に変換させることにより製造することができる。
実施例2
実施例3
実施例4
実施例5
実施例6
実施例7
実施例8
実施例9
3,12−ジアザ−6,9−ジアゾニアジスピロ−(5,2,5,2)−ヘキサデカン二臭化物(化合物3)はSigma-Aldrich社から購入した。4,6−ジクロロ−5−ニトロピリミジン、塩化ダンシル、塩化シアヌール、テトラヒドロホウ素ナトリウムは和光純薬工業株式会社から購入した。4,6−ジクロロ−2−(メチルチオ)−5−ホルミルピリミジンはToronto Research Chemicalsから購入した。ダンシルヒドラジンは東京化成工業株式会社から購入した。化合物1, 3, 4及び5は、前述した方法で作製した。アドヘサミン及びその誘導体 (2-5) はDMSOに希釈し、濃度調整を行い、細胞接着アッセイ及びITC測定に供した。サケ皮由来タイプIコラーゲン及びウシ血漿由来フィブロネクチン(和光純薬工業株式会社)、ポリ−L−リジン塩酸塩(株式会社ペプチド研究所)、ポリ−L−オルニチン臭素水素酸塩(MP Biomedicals, Inc.) はMilli-Q水に溶解し、使用するまで-20℃で保存した。ヘパリン (平均分子量 (Mw), 18.0 kDa)及びヘパラン硫酸(Mw, 13.6 kDa) はナトリウム塩をそれぞれ、MP Biomedicals Inc. およびCelsus社から購入した。コンドロイチン硫酸 A(Mw, 37.5 kDa)、ケラタン硫酸(Mw, 30.0 kDa)及びヒアルロン酸(Mw, 125.0 kDa)は生化学工業株式会社から購入した。ウサギ抗FAK(C-20)抗体及びウサギ抗ERK(C-16)抗体はSanta Cruz Biotechnologyから購入した。マウス抗FAK(ホスホ-チロシン397)抗体はBD Biosciences Pharmingenから得た。ウサギ抗ERK1/2ホスホ-スレオニン202/チロシン204(pERK)抗体はCell Signaling Technologyから購入した。抗ウサギ及び抗マウス免疫グロブリンG(IgG)(西洋ワサビペルオキシダーゼ結合完全抗体)とECL Plus Western blotting detection reagentsはGE Healthcareから購入した。合成RGD特異的ペプチド(GRGDTP)はシグマ社から購入した。
HepG2細胞は10%ウシ胎児血清(FBS) と1% ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したMEM を培地とし、37℃、5% CO2存在下にて培養した。Jurkat細胞は10%ウシ胎児血清(FBS)と1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したRPMI-1640 を培地とし、37℃、5% CO2存在下にて培養した。小分子化合物のスクリーニングは20 μg/mL の濃度で各化合物を添加した96穴プレートに、HepG2懸濁液(2 × 105 cells/mL)100μLを播種し、3, 16, 24時間後に顕微鏡下にて表現系変化を観察した。CHO K1細胞とCHO欠損変異株は7.5%ウシ胎児血清を追加されたHam’s F-12培地中で維持された。
添加によるアッセイ−50、500及び5000 μg/mLの濃度でアドヘサミン(1)、タイプIコラーゲン、ポリ−L−リジン塩酸塩、ポリ−L−オルニチン臭素水素酸塩及びフィブロネクチンの水溶液1μL を96穴プレートに添加し、ここにHepG2懸濁液(4 × 105cells/mL)100 μLを加えた。3時間37℃でインキュベートした後、接着していない細胞を3回PBSでウェルを洗うことで除去し、接着した細胞数をNeubauer counting chamber (Digital Bio)にてカウントした。Jurkat 細胞については 100 μL の細胞懸濁液をそれぞれのウェルに1 × 106 cells/mLの濃度で播種し、5時間37℃でインキュベートしたのち、PBSで2回ウェルを洗うことで接着していない細胞を除去し、接着した細胞数をNeubauer counting chamber (Digital Bio)にてカウントした。接着率を算出するため、最初に播種した細胞数を100%とした。対照実験は1μLのDMSOのみを添加したウェルにて行った。それぞれのアッセイを3回行い、平均値および標準偏差を算出した。
アドヘサミン(1, 0.6 nmol) と0.006 から12 nmolまで濃度をふった各種グリコサミノグリカン(GAG)(ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸及びヘパリンオリゴ糖)を10μLの100 mM NaCl と1% DMSOを含む50 mMリン酸バッファー(pH 6.0)中にてボルテックスミキサーで室温にて30分攪拌後、それぞれの混合物を96ウェルプレートに移し、90μL のJurkat細胞懸濁液(1 × 105 cells/mL)を加えた。5時間37℃でインキュベートした後、PBSで2回ウェルを洗うことで接着していない細胞を除去し、接着した細胞数をNeubauer counting chamber (Digital Bio)にてカウントした。阻害率を算出するため、各試料を加えて接着が認められた細胞数から、1%のDMSOのみ又は1%のDMSOと各濃度のGAGのみを加えたウェルにおける接着細胞数を差し引いた。阻害率は次の式で表される。
ITC 測定は25℃でMicoCal VP-ITCマイクロカロリメーターを用いて行った。アドヘサミン(15 μM) 10 μLを25 回、GAG(2.7 mM のヘパラン硫酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸及びヘパリンオリゴ糖)に注入し、滴定を行った。滴定は100 mM NaCl および 1%DMSOを含む50 mMリン酸バッファー(pH 6.0) 中で行った。GAGsは重合度により分子量にばらつきがあるため、これを補正したうえで、ITCにおける熱流量を比較する必要がある。このためGAGsの場合のモル濃度は、二糖単位の濃度を示している。
アドヘサミン(1)のDMSO溶液1μL(6mM)が96ウェルプレートの各ウェルに供給された。Jurkat細胞が増殖培地に懸濁され、細胞懸濁液の100μLが各ウェルに1×106cells/mLの濃度で添加された。37℃で5時間インキュベーション後、培地が吸引され、プレートがPBSで2回洗われた。新しい培地100μLが各ウェルに添加された。更に37℃で4、8、14及び24時間インキュベーション後、非接着細胞が2回PBSで洗浄することで除去され、接着細胞がNeubauer counting chamberでカウントされた。接着率を計算するため、洗浄前の細胞数が100%の値とされた。各アッセイは3回行われ、平均と標準偏差が最低3回の独立した実験から計算された。
HepG2 細胞の懸濁液 (100 μL) を96穴プレート(Greiner bio-one)に2 × 105 cells/mLの細胞密度で播種し、化合物4 および 5(6 μM) と共に3時間37℃でインキュベートした。インキュベーション後、培地交換を行った後、蛍光顕微鏡観察に供した。顕微鏡像はYokogawa 社製USC 22共焦点蛍光顕微鏡にて励起波長 405 nmで行った。
Jurkat細胞(5×104)はRPMIの100μL中で培養され、室温で30分間、ヘパリナーゼ、へパリチナーゼI及びヘパリチナーゼIIの併用(0.02 units/mL)又はコンドロイチナーゼABC(0.1 units/mL)で処理された。処理された細胞のアドヘサミンに反応する能力はアドヘサミンの存在下(6μM)で96ウェルプレートのプラスチックウェルに接着した細胞をカウントすることにより評価された。
アドヘサミン(1)のDMSO溶液1μLが600μMの濃度で96ウェルプレートに添加された。HepG2細胞とJurkat細胞は増殖培地に懸濁され、100μLの細胞懸濁液がそれぞれ2×105 cells/mL及び4×105cells/mLの濃度で各ウェルに添加された。示された時間のインキュベーション後、細胞生存度が生細胞中のNADHデヒドロゲナーゼによって水溶性ホルマザン色素を生成するテトラゾリウム塩(WST-8)を含むCell Counting Kit-8(Dojindo Molecular Technologies, Inc., Gaithersburg, MD)を使用して測定された。5μlのWST-8アッセイ溶液が各ウェル当たり100μlの増殖培地に加えられ、4時間インキュベートされた。溶液の光学密度(OD)が、450 nmの測定波長と650 nmの参照波長を使用してマイクロプレートリーダーで読まれた。1%(v/v)のDMSOを含む増殖培地でインキュベートされた細胞生存度が100%の値とされた。各アッセイは3回行われ、平均と標準偏差が最低3回の独立した実験から計算された。
Jurkat又はHepG2細胞がアドヘサミン(6μM)の存在下でカバーガラスに蒔かれた。それぞれ5又は3時間後に20分間4%パラホルムアルデヒドを使用して固定された。細胞膜は(PBS中の)0.1% triton X-100での5分間の処理により透過化された。サンプルはPBSで2回洗浄され、製造会社の使用説明書(Invitrogen)に従ってアクチン細胞骨格がローダミン標識ファロイジンで可視化された。細胞画像は588 nmレーザー励起を用いたYokogawa CSU22共焦点蛍光顕微鏡で取り込まれた。
Jurkat細胞(5×104)は100μLのRPMI中で培養され、37℃でサイトカラシンB(0-100μM)又はノコダゾール(0-0.5μM)と共にインキュベートされた。処理された細胞は、アドヘサミン(6μM)への反応がアッセイされた。フィブロネクチン又はポリ-L-リジンでコートされたプレートへの反応も評価された。コートされたプレートはフィブロネクチン又はポリ-L-リジン(1 ng/ウェル)で96ウェルプレートのウェルを前処理することにより調製された。
Jurkat細胞は10%FBSを含むRPMI培地で維持された。5-6百万のJurkat細胞が最終容量2 mLで6ウェルプレートのウェルに供給され、アドヘサミン又はポリ-L-リジンの存在下で0-5時間37℃でインキュベートされた。非接着細胞は除去され、ペレット化された。残りの接着細胞は4%SDS、10%グリセロール、0.006%ブロモフェノールブルー及び1.8%β-メルカプトエタノールを含む125 mMのTris-HClバッファー(pH 6.8)で溶解された。接着細胞のホモジネートは同じウェルからのペレット化された非接着細胞と混合され、混合されたサンプルは5分間煮沸された。サンプルはSDS-PAGEによって分離され、ニトロセルロース膜にエレクトロブロットされた。膜は1%BSAでブロックされ、一次抗体と共にインキュベートされ、それから西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体と共にインキュベートされた。ブロットは増強した化学発光技術を使用して現像された。
アドヘサミン(1)、タイプIコラーゲン、ポリ-L-リジン塩酸塩、及びフィブロネクチンの溶液が、1%(v/v)DMSOを含むPBSで希釈することによって調製された。各溶液の10μL(1 mg/mL)がガラス底培養ディッシュ(35 mm未コートディッシュ)に添加された。培養培地中の細胞懸濁液2 mLが、2×105 cells/mLの濃度で各ウェルに添加された。37℃で14時間インキュベーション後、5 mg/mLの濃度でAlexa Fluor 594(Molecular Probes, USA)が、CI-2000自動化細胞インジェクションシステム(富士通製)を使用することによりJurkat細胞に注入された。マイクロインジェクションの成功率は、インジェクションシステムの蛍光顕微鏡の表示を通じての蛍光細胞の直接的な観察によって評価された。示されたデータは、最低3回の実験の平均±SDである。20の細胞が各実験で注入された。
アドヘサミンの存在下では、HepG2細胞は培養プレート上への接着が強まることが観察された(図1A, B)。細胞接着を促進していることを確かめるために、トリプシン処理にてプレートから脱着したHepG2細胞をアドヘサミン0.6-60 μM存在下で培養し、再接着の度合いを評価した。培養時間は3時間としたが、これはHepG2細胞が3時間のうちに培養プレート上へ接着し始めるからである。3時間後、プレートをリン酸バッファーで洗い、接着していない細胞を除去したのち、プレート上に残った接着細胞の数をカウントした。1その結果、アドヘサミンは最大でHepG2の接着を2倍まで高め、その作用は濃度依存的であることが分かった(図1C)。
アドヘサミンは試験した細胞型では明確な細胞毒性を有していない。細胞増殖は実際には、強められた(図3AB)。細胞の形態も維持されたHepG2細胞やJurkat細胞のように通常であった(図1)。ローダミン標識ファロイジンでのアクチン細胞骨格の可視化は、接着細胞でのFアクチンネットワークを明らかにした。アクチンフィラメントの束がHepG2細胞において細胞軸に平行に又は細胞突起を突き通して走っていた。生存していることを暗示させるよく組織化した皮質のアクチン構造はJurkat細胞で形成していた(図3EF)。そのように組織化されたアクチン構造は非特異的なコーティング剤であるポリ-L-リジンでコートされたプレートに接着した細胞では検出されなかった。
細胞接着作用の仕組みを探るため、まずアドヘサミン誘導体2種の活性を評価した。その結果、末端のピリミジン環を除去すると活性は完全に失われるが(図6、化合物2)、ピリミジン環上のアルデヒド基を水酸基に還元しても活性は保たれることが明らかになった(化合物3)。そこで、ピリミジン環上のアルデヒド部分に蛍光基を施して分子の挙動を探ることにした。蛍光基としてはダンシル基を用いた。作製したダンシル結合型アドヘサミン(化合物4)は細胞接着促進活性を保持していた。
その他のアドヘサミン誘導体の細胞接着促進活性を評価した。結果を表3に示す。
アドヘサミンとの細胞接着が細胞表面ヘパラン硫酸によって媒介されていること確かめるために、Jurkat細胞はGAG消化酵素で処理された。ヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼI及びへパリチナーゼII(0.02 units/mL)での細胞表面ヘパラン硫酸鎖の消化は、アドヘサミン誘導細胞接着を減少させた。反対に、5倍高い濃度(0.1 units/mL)のコンドロイチナーゼABCは、アドヘサミン誘導細胞接着の検出可能な効果はなかった(図9A)。影響はアドヘサミンで処理された細胞より小さかったが、ヘパラン硫酸での消化はフィブロネクチンでコートされたプレートへの細胞の接着に影響を与えた(図9A)。これはフィブロネクチンが細胞接着を媒介するインテグリンとヘパラン硫酸の両方に結合するという以前の発見に一致する。
インテグリンと細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカンによって媒介される細胞接着は、多くの非受容体キナーゼを刺激する細胞間シグナルを発生する。細胞外マトリックスへの細胞接着によって活性化される最も重要なキナーゼであるフォーカルアドヒージョンキナーゼ(FAK)のリン酸化が、アドヘサミンの存在でモニターされた。Jurkat細胞でのFAK活性化の時系列分析は、アドヘサミン刺激後5時間でのFAKリン酸化を証明した(図11A)。活性化は量依存的であり、アドヘサミンの5 μg/mLがFAKをリン酸化するのに十分であったが、ポリ-L-リジンは同じ量での活性化に失敗した(図11B)。細胞が拮抗的な濃度のヘパリンとインキュベートされたときには、FAKのアドヘサミン誘導リン酸化は減少した(図11C)。反対にRGDペプチドの添加では検出可能な効果は無かった(図11C)。並行で行われたウェスタンブロットは細胞溶解液での総FAKレベルに有意な変化を示さなかった。18
アドヘサミンの接着促進作用を4つの既存のプレートコーティング剤と比較した。比較したコーティング剤はタイプIコラーゲン、フィブロネクチン、ポリ−L−リジン及びポリ−L−オルニチンである。アドヘサミンを添加した場合、ほかのコーティング剤よりもずっと効率的に接着を高めることが分かった(図12)。同様の効果はアドヘサミンおよびコーティング剤の塗布によっても得られ、この場合、アドヘサミンは50 μg/wellの濃度ではフィブロネクチン、ポリ−L-リジン、ポリ−L-オルニチンよりも優れた効果を示した。
プレートへの強固な接着は一般的にマイクロインジェクションの成功のために必要であるので、アドヘサミンの可能性のある一つの応用はマイクロインジェクションを促進するための試薬としての使用である。この可能性をテストするために、アドヘサミンによって、リンパ球の浮遊性のために技術的に難しいと考えられている実験であるJurkat細胞へのマイクロインジェクションが可能になるかを試験した。実際に、細胞への蛍光色素Alexa Fluor 594のマイクロインジェクションは、アドヘサミンが無い場合、完全に成功しなかった。培地へのタイプIコラーゲン又はポリ-L-リジンの添加はほとんど効果がなく、フィブロネクチンの添加は成功率を〜30%まで向上させた(図13)。しかしながら、同じ量のアドヘサミンは成功率を〜80%位まで高めた(図13)。アドヘサミンは、インジェクトすることが難しい細胞にマイクロインジェクションを可能又は補助する合成試薬として役立つかもしれない。
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Claims (11)
- 下記式(I)で表されるジスピロトリピペラジン誘導体又はその塩を含む、支持体への細胞接着促進剤。
R2aは、R1及びR2の定義に同じである。〕〕 - 前記支持体が細胞培養容器である、請求項1に記載の細胞接着促進剤。
- 前記細胞が浮遊性細胞である、請求項1に記載の細胞接着促進剤。
- 請求項1に記載のジスピロトリピペラジン誘導体又はその塩を培地に添加もしくは支持体に塗布することを特徴とする、支持体へ細胞の接着を促進させる方法。
- 請求項2に記載のジスピロトリピペラジン誘導体又はその塩を培地に添加もしくは支持体に塗布することを特徴とする、支持体へ細胞の接着を促進させる方法。
- 前記支持体が細胞培養容器である、請求項5に記載の方法。
- 前記細胞が浮遊性細胞である、請求項5に記載の方法。
- 請求項1に記載のジスピロトリピペラジン誘導体又はその塩を含む、細胞接着及び/又は細胞増殖を促進するヘパラン硫酸のアゴニスト。
- 下記式(Ia)で表されるジスピロトリピペラジン誘導体又はその塩。
R4aは、R3及びR4の定義に同じである。〕〕
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