KR101615741B1

KR101615741B1 - 세포접착 촉진제 및 세포의 접착을 촉진하는 방법

Info

Publication number: KR101615741B1
Application number: KR1020117001281A
Authority: KR
Inventors: 모토나리 우에스기; 사유미 야마조에
Original assignee: 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠
Priority date: 2008-06-18
Filing date: 2009-06-16
Publication date: 2016-04-26
Also published as: EP2308960B1; CN102066554B; EP2308960A4; US20110117651A1; EP2308960A1; JPWO2009154201A1; SG191662A1; US8685976B2; JP5586463B2; WO2009154201A1; KR20110025976A; CN102066554A

Abstract

공개된 것은 하기 화학식(I)로 나타낸 디스피로트리피페라진(dispirotripiperazine) 유도체 또는 그의 염을 포함하는 지지체에서의 세포접착 촉진제, 하기 화학식(I)로 나타낸 디스피로트리피페라진 유도체 또는 그의 염을 배지에 첨가 또는 지지체에 도포하는 것을 특징으로 하는 지지체에서의 세포의 접착을 촉진시키는 방법, 및 하기 화학식(I)로 나타낸 디스피로트리피페라진 유도체 또는 그의 염을 포함하는 세포접착 및/또는 세포증식을 촉진하는 헤파란 설페이트(heparan sulfate) 작용제(agonist)이다.
[화학식 1]

Description

세포접착 촉진제 및 세포의 접착을 촉진하는 방법{CELL ADHESION PROMOTING AGENT AND METHOD OF PROMOTING CELL ADHESION}

본 발명은, 디스피로트리피페라진(Dispirotripiperazine) 유도체 또는 그의 염을 포함하는 세포접착 촉진제, 그것들을 배지에 첨가 또는 지지체에 도포하는 것을 특징으로 하는 세포의 접착을 촉진시키는 방법, 및 세포접착 촉진 효과를 가지는 신규 화합물에 관한 것이다.

콜라겐 등의 천연의 세포외 매트릭스는 배양이 곤란한 세포를 배양할 때의 코팅 재료로서 이용되고, 생물 공학, 세포생물학의 기초적 연구에 크게 기여해 왔다. 그러나 이러한 천연 동물유래 소재의 결점으로는, 병 전염의 위험, 순도의 낮음, 재현성이나 안정성의 부족을 들 수 있다. 이러한 제약은 합성품에 의해 극복가능하다. 그러나 이러한 합성품은 대체로, 천연의 소재보다도 낮은 접착 효과밖에 얻을 수 없다.

또한, 몇몇 종류의 디스피로트리피페라진(Dispirotripiperazine) 유도체의 항바이러스 활성에 대해서는, 비특허문헌 1 및 2로 보고되고 있다.

Schmidtke, M., Riabova, O., Dahse, H. M., Stelzner, A., Makarov, V., Synthesis, cytotoxicity and antiviral activity of N,N’-bis-5-nitropyrimidyl derivatives of dispirotripiperazine. Antiviral Research (2002), 55(1), 117-127. Artemenko, A. G., Muratov, E. N., Kuz’min, V. E., Kovdienko, N. A., Hromov, A. I., Makarov, V. A., Riabova, O. B., Wutzler, P., Schmidtke, M. Identification of individual structural fragments of N,N’-(bis-5-nitropyrimidyl)dispirotripiperazine derivatives for cytotoxicity and antiherpetic activity allows the prediction of new highly active compounds. Journal of antimicrobial Chemotherapy (2007), 60 (1), 68-77.

본 발명은, 지지체에서의 세포의 접착을 촉진시키는, 디스피로트리피페라진(dispirotripiperazine) 유도체 또는 그의 염을 포함하는 세포접착 촉진제를 제공한다. 게다가, 본 발명은, 디스피로트리피페라진 유도체 또는 그의 염을 배지에 첨가 또는 지지체에 도포하는 것을 특징으로 하는, 지지체에 세포의 접착을 촉진시키는 방법을 제공한다. 본 발명은, 세포접착 및/또는 세포증식을 촉진하는 헤파란 설페이트(heparan sulfate)의 작용제(agonist)를 제공한다. 또한, 본 발명은, 지지체에 세포의 접착을 촉진시키는 효과를 가지는 신규 화합물을 제공한다.

본 발명자들은, 합성 화합물의 라이브러리를 스크리닝하는 과정에서, 특정한 디스피로트리피페라진(dispirotripiperazine) 유도체의 존재 하에서는 세포의 접착을 촉진한다고 하는 지식을 얻었다. 본 발명은, 이러한 지식에 기초를 두고, 더욱 검토를 거듭해서 완성된 것이며, 다음의 세포접착 촉진제, 세포의 접착을 촉진시키는 방법, 세포접착 및/또는 세포증식을 촉진하는 헤파란 설페이트(heparan sulfate) 작용제(agonist) 및 신규 화합물을 제공하는 것이다.

항 1. 하기 화학식(I)에서 나타낸 디스피로트리피페라진 유도체 또는 그의 염을 포함하는, 지지체에서의 세포접착 촉진제.

[화학식에서, R¹ 및 R²은, 같거나 다르고, 수소, 알킬기(alkyl group), 아케닐기(alkenyl group), 알키닐기(alkynyl groups), 시클로알킬기(cycloalkyl group), 시클로알킬알킬기(cycloalkylalkyl group), 아릴기(aryl group), 헤테로아릴기(heteroaryl group), 아릴 치환 알킬기, 헤테로아릴 치환 알킬기(R¹ 및 R²가 양쪽이 수소인 경우는 제외되어, R¹ 및 R²은 단실 하이드라진(dansyl hydrazine) 유도체화 또는 인테그린(integrin) 결합 활성을 가지는 물질이 결합하고 있어도 좋으며, 알킬기(alkyl group), 아케닐기(alkenyl group), 알키닐기(alkynyl groups) 및 알킬(alkyl) 부분은, 할로겐(halogen), 하이드록시(hydroxy)(상기 하이드록시(hydroxy)는 아실화(acylation), 카바메이트(carbamate)화 또는 에테르화(etherification) 되고 있어도 좋다), 시아노(cyano), 니트로(nitro), 아미노(amino), 모노(mono) 또는 다이(di) 치환 아미노(amino), 카르바모일(carbamoyl) 및 설파모일(sulfamoyl)로부터 선택되는 원자 또는 기(group)로 치환되고 있어도 좋으며, 알킬기(alkyl group), 아케닐기(alkenyl group), 알키닐기(alkynyl groups), 시클로알킬기(cycloalkyl group), 알킬(alkyl) 부분 및 시클로알킬(cycloalkyl) 부분은, -O-, -S-, -SO-, -SO2-, -OSO2-, -NH-, -CO-, -CH=CH-, -C≡C-, -CONH-, -NHCO-, -NHCOO-, -OCH2CONH- 또는 -OCH2CO-가 포함되어 있어서 되며, 아릴기(aryl group), 아릴(aryl) 부분, 헤테로아릴기(heteroaryl group), 헤테로아릴 부분, 시클로알킬기(cycloalkyl group) 및 시클로알킬 부분은, 할로겐(halogen), 하이드록시(hydroxy), 포르밀(formyl), 알킬(alkyl), 하이드록시알킬(hydroxyalkyl), 알콕시(alkoxy), 알킬티오기(alkylthio), 시아노(cyano), 니트로(nitro), 아미노(amino), 모노(mono) 또는 다이(di) 치환 아미노(amino), 카르바모일(carbamoyl), 설파모일(sulfamoyl), 알킬술포닐(alkylsulfonyl), 알킬술포닐아미노(alkylsulfonylamino), 알킬카르보닐아미노(alkylcarbonylamino), 메틸렌디옥시(methylenedioxy) 및 아릴(aryl)로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되고 있어도 좋다), 또는 하기 화학식(II)에서 나타낸 기(group)(R¹ 및 R² 모두 하기 화학식(II)에서 나타낸 기(group)의 경우를 제외한다)을 의미한다.

[화학식에서, R^1a는 알킬렌기(alkylene group), 알케닐렌기(alkenylene group), 알키닐렌기(alkynylene group), 시클로알킬렌기(cycloalkylene group), 시클로알킬알킬렌기(cycloalkylalkylene group), 아릴렌기(arylene group), 헤테로아릴렌기(hetroarylene group), 아릴(aryl) 치환 알킬렌기, 또는 헤테로아릴(heteroaryl) 치환 알킬렌기(알킬렌기, 알케닐렌기, 알키닐렌기 및 알킬렌 부분은, 할로겐(halogen), 하이드록시(hydroxy)(상기 하이드록시는 아실화(acylation), 카바메이트(carbamate)화 또는 에테르화(etherification)되어 있어도 좋다), 시아노(cyano), 니트로(nitro), 아미노(amino), 모노(mono) 또는 다이(di) 치환 아미노(amino), 카르바모일(carbamoyl) 및 설파모일(sulfamoyl)로부터 선택되는 원자 또는 기(group)로 치환되고 있어도 좋으며, 알킬렌기, 알케닐렌기, 알키닐렌기, 시클로알킬렌기, 알킬렌 부분 및 시클로알킬(cycloalkyl) 부분은, -O-, -S-, -SO-, -SO2-, -OSO2-, -NH-, -CO-, -CH=CH-, -C≡C-, -CONH-, -NHCO-, -NHCOO-, -OCH2CONH- 또는 -OCH2CO-가 포함되어 있어도 되며, 아릴렌기, 아릴 부분, 헤테로아릴렌기, 헤테로아릴 부분, 시클로알킬렌기, 및 시클로알킬 부분은, 할로겐, 하이드록시, 포르밀, 알킬, 하이드록시알킬, 알콕시, 알킬티오기, 시아노, 니트로, 아미노(amino), 모노(mono) 또는 다이(di) 치환 아미노, 카르바모일, 설파모일, 알킬술포닐, 알킬술포닐아미노, 알킬카르보닐아미노, 메틸렌디옥시 및 아릴로부터 선택되는 원자 또는 기(group)으로 치환되고 있어도 좋다)을 의미하고,

R^2a는, R¹ 및 R²의 정의와 같다. ]]

항 2. 항 1에서 디스피로트리피페라진 유도체는 다음의 군으로부터 선택되는 세포접착 촉진제.

항 3. 항 1 또는 제 항 2에 있어서, 상기 지지체는 세포배양 용기인 세포접착 촉진제.

항 4. 항 1~3의 임의의 항 1에 있어서, 상기 세포는 부유성 세포인 세포접착 촉진제.

항 5. 항 1의 디스피로트리피페라진 유도체 또는 그의 염을 배지에 첨가 또는 지지체에 도포하는 것을 특징으로 하는, 지지체에서의 세포의 접착을 촉진시키는 방법.

항 6. 항 2에 디스피로트리피페라진 유도체 또는 그의 염을 배지에 첨가 또는 지지체에 도포하는 것을 특징으로 하는, 지지체에서의 세포의 접착을 촉진시키는 방법.

항 7. 항 5 또는 항 6에 있어서, 상기 지지체가 세포배양 용기인 방법.

항 8. 항 5 ~ 7의 임의의 1항에 있어서, 상기 세포가 부유성 세포인 방법.

항 9. 항 1 또는 항 2의 디스피로트리피페라진 유도체 또는 그의 염을 포함하는, 세포접착 및/또는 세포증식을 촉진하는 헤파란 설페이트(heparan sulfate) 작용제(agonist).

항 10. 하기 화학식(Ia)에 나타낸 디스피로트리피페라진 유도체 또는 그의 염.

[화학식에서, R³ 및 R⁴는, 같거나 다르고, 단일고리의 아릴기(aryl group), 헤테로아릴기(heteroaryl group)(R³ 및 R⁴는 단실 하이드라진(dansyl hydrazine) 유도체화 또는 인테그린(integrin) 결합 활성을 가지는 물질이 결합하고 있어도 좋으며, 아릴기(aryl group) 및 헤테로아릴기(heteroaryl group)는, 할로겐(halogen), 하이드록시(hydroxy), 포르밀(formyl), 알킬(alkyl), 하이드록시알킬(hydroxyalkyl), 알콕시(alkoxy), 알킬티오기(alkylthio), 시아노(cyano), 니트로(nitro), 아미노(amino), 모노(mono) 또는 다이(di) 치환 아미노(amino), 카르바모일(carbamoyl), 설파모일(sulfamoyl), 알킬술포닐(alkylsulfonyl), 알킬술포닐아미노(alkylsulfonylamino), 알킬카르보닐아미노(alkylcarbonylamino), 메틸렌디옥시(methylenedioxy) 및 아릴(aryl)로부터 선택되는 원자 또는 기(group)로 치환되고 있어도 좋다), 또는 하기 화학식(IIa)에서 나타낸 기(group)(R³ 및 R⁴는 동일하며, 5번 위치가 니트로기, 아미노기, 포르밀기 또는 에톡시카르보닐기로 치환된 4-피리미딜기 (pyrimidly group), 3번 위치가 니트로기로 치환된 2-피리딜기(pyridyl group), 또는 2번 위치가 니트로기로 치환된 페닐기인 경우, 같은 줄의 R³ 및 R⁴가 모두 하가 화학식(IIa)에서 나타낸 기(group)의 경우를 제외한다)를 의미한다.

[화학식에서, R^3a는 단일고리의 아릴렌기 또는 헤테로아릴렌기(아릴렌기 및 헤테로아릴렌기는, 할로겐, 하이드록시, 포르밀, 알킬, 하이드록시알킬, 알콕시, 알킬티오기, 시아노, 니트로, 아미노, 모노(mono) 또는 다이(di) 치환 아미노, 카르바모일, 설파모일, 알킬술포닐, 알킬술포닐아미노, 알킬카르보닐아미노, 메틸렌디옥시 및 아릴로부터 선택되는 원자 또는 기(group)로 치환되고 있어도 좋다)를 의미하고, R^4a는, R³ 및 R⁴의 정의와 같다. ]]

항 11. 하기의 군으로부터 선택되는 디스피로트리피페라진 유도체 또는 그의 염.

항 12. 지지체에서의 세포접착을 촉진시키기 위한, 항 1 또는 2에 기재된 디스피로트리피페라진 유도체 또는 그의 염의 용도.

항 13. 항 1 또는 2의 디스피로트리피페라진 유도체 또는 그의 염을 포함하는 세포배양용 배지.

항 14. 항 1 또는 2의 디스피로트리피페라진 유도체 또는 그의 염을 도포한 세포배양 용기.

본 발명의 화학식(I)으로 나타낸 디스피로트리피페라진(dispirotripiperazine) 유도체 또는 그의 염은, 배지에 첨가하는 것만으로 세포접착을 촉진하는 것으로 처음으로 밝혀진 소분자 화합물이다.

본 발명의 화학식(I)으로 나타낸 디스피로트리피페라진 유도체 또는 그의 염의 존재 하에서는, 부유성 세포 및 부착의존성 세포(anchorage dependent cell)의 양쪽의 지지체에서의 접착을 촉진한다.

본 발명의 화학식(I)으로 나타낸 디스피로트리피페라진 유도체 또는 그의 염은 또한, 헤파란 설페이트(heparan sulfate) 작용제(agonist)로서 기능하고, 세포접착 및/또는 세포증식을 촉진한다.

또한, 화학식(Ia)로 나타낸 디스피로트리피페라진 유도체는, 세포접착을 촉진하는 효과를 가지는 신규 화합물이다.

본 발명의 세포접착 촉진 효과는 가역적이다. 주목할 만한 것은, 배지에 첨가하는 것만으로, 세포배양 접시에서의 접착은 강화하지만, 세포간의 접착은 중개하지 않는다.

도 1은 (A, B) 1% (v/v) DMSO만(A) 또는 6μM 아데사민(adhesamine)(B) 존재하에서 배양한 HepG2 세포의 현미경 사진이다. (C, D) 0 - 60 μM의 아데사민(adhesamine)을 배지에 첨가한 HepG2세포(C)와 저켓(Jurkat) 세포(D)의 세포접착을 나타낸 그래프다.
도 2는 아데사민(adhesamine)(1)의 가역적인 활성을 나타낸 그래프이다. 접착한 세포는, 아데사민(adhesamine)(1) 제거 후 나타낸 시간으로 계산하였다. 접착율을 계산하기 위해서, 세척 전의 세포수가 100%의 값으로 하였다. 각 분석은 3회 수행하고, 평균과 표준편차가 최저 3회의 독립한 실험에서 계산되었다.
도 3은 세포증식과 세포골격 네트워크에 있어서의 아데사민(adhesamine)(1)의 효과를 나타낸 도이다. (A, B) 세포증식은, 아데사민(adhesamine)(1) (6μM)의 첨가 후, 24, 48 및 72시간에 측정되었다. 1% (v/v) DMSO의 존재 하에서의 세포증식이 100%의 값으로 하였다. 나타낸 데이터는, 최저 3회의 실험의 평균 ± SD 이다. (C∼F) 아데사민(adhesamine)(6μM)의 존재 하에서의 HepG2와 저켓(Jurkat)세포의 액틴(actin) 섬유의 재구성을 나타낸 도다. 명시야(bright field)(C, D)와 공초점(E, F) 이미지를 표시하고 있다. HepG2(C, E) 또는 저켓(Jurkat)(D, F) 세포가 각각 3 또는 5시간 뿌려져, 액틴(actin) 세포골격이 로다민(rhodamine) 표식 팔로이딘(phalloidin)으로 가시화되었다.
도 4는 아데사민(adhesamine)에 의한 접착반점의 형성을 나타낸 도이다. 트립신(trypsin) 처리된 HepG2 세포가 아데사민(adhesamine)이 첨가된 커버 유리에 3시간 뿌려져, 고정되어, 항 빈쿨린(vinculin)항체와 Alexa Fluor 488 염소 항 마우스 IgG로 염색되었다.
도 5는 아데사민(adhesamine) 유도 세포접착에 있어서 세포골격 저해제의 효과를 내보이는 그래프다. 저켓(Jurkat) 세포는 노코다졸(nocodazole)(튜불린(tubulin) 저해제)또는 사이토카라신 B(cytochalasin B)(액틴 저해제)의 존재 하에서 아데사민(adhesamine) 첨가에 의해 플라스틱판에 접착시켰다. 피브로넥틴(fibronectin)으로 코팅된 플레이트에 접착하는 세포에서 관찰된 것 같이, 노코다졸(nocodazole)과 사이토카라신(cytochalasin) 모두는 아데사민(adhesamine) 유도 세포접착을 저해했다. 폴리-L-리신(lysine)을 코팅한 플레이트에 세포접착은 사이토카라신 B(cytochalasin B) 및 노코다졸(nocodazole)에 거의 억제되지 않았다. 아데사민(adhesamine)의 농도는 6μM이었다. 피브로넥틴(fibronectin) 또는 폴리-L-리신(lysine)으로 코팅된 플레이트는, 피브로넥틴(fibronectin) 또는 폴리-L-리신(lysine)(1 ng/웰(well))로 96 웰플레이트의 웰(well)을 전처리함으로써 준비되었다.
도 6은 아데사민(adhesamine)(1)의 유도체의 화학구조식 및 세포접착을 나타낸 그래프다. 세포접착을 촉진시키는 능력은 저켓(Jurkat) 세포로 평가했다.
도 7은 명시야(A, B) 및 공초점(C, D) 이미지를 나타낸 현미경 사진이다. HepG2 세포는, 시딩(seeding) 3시간 후, 화합물 4(6 μM, A, C) 또는 화합물 5(6 μM, B, D)와 함께 배양했다.
도 8은 아데사민(adhesamine) 유도 세포접착에 있어서 RGD 펩티드(peptide)의 효과를 내보이는 도다. (A, B) 저켓(Jurkat) 세포는, 증가하는 양의 RGD 펩티드(peptide)(0-100 μg/mL)의 존재 하에서 아데사민(adhesamine) 첨가 또는 피브로넥틴(fibronectin)에서 코팅된 플라스틱판에 뿌려졌다. 아데사민(adhesamine)과 피브로넥틴(fibronectin)의 농도는 각각 6 μM과 5 μg/mL이었다. 접착한 세포는 시딩(seeding) 5시간 후에 계산되었다. 각 점은 평균 ± SD를 나타내고 있다.
도 9는 아데사민(adhesamine) 유도 세포접착에 있어서 헤파란 설페이트(heparan sulfate) 소화 효소의 효과를 내보이는 도다. (A, B) 저켓(Jurkat) 세포(A) 또는 HepG2세포(B)는 세포접착을 평가하기 전에 37 1시간, 무혈청 배지에서 헤파리나아제(heparinase), 헤파리티나아제(heparitinase) I, 및 헤파리티나아제 II의 0.02 유닛(units)/mL 또는 프로테아제(protease) 프리(free)의 콘드로이티나아제 ABC(chondroitinase ABC)의 0.1 유닛(units)/mL으로 전처리 되었다. 처리된 세포는, 아데사민(adhesamine) 첨가 또는 피브로넥틴(fibronectin)에서 코팅된 플라스틱 웰에 시딩(seeding)되었다. 접착한 세포는 시딩(seeding) 5시간 후에 계산되었다. 아데사민(adhesamine)과 피브로넥틴(fibronectin)의 농도는 각각 6 μM과 5 μg/mL이었다. 각 점은 평균 ± SD를 나타내고 있다. (C, D)헤파리나아제(heparinase)/헤파리티나아제 I(heparitinase I)/헤파리티나아제 II(heparitinase II)(C) 또는 콘드로이티나아제 ABC(chondroitinase ABC)(D)에서 처리된 HepG2에서 화합물 4의 세포하의 한정된 곳에 존재하는 것을 가리키고 있다.
도 10은 CHO-K1 및 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan) 결손 변이주에 있어서의 아데사민(adhesamine)의 효과를 내보이는 도다. (A, B) 1% (v/v) DMSO(A) 또는 6 μM 아데사민(adhesamine)(B)로 배양된 CHO-K1(야생형)세포(C, D) 1% (v/v) DMSO(A) 또는 6 μM 아데사민(adhesamine)(B)로 배양된 CHO 677(E) 6 μM의 아데사민(adhesamine)이 배양 배지에 첨가되었을 때의 CHO-K1과 변이주의 접착 세포는 아데사민(adhesamine) 첨가 또는 피브로넥틴(fibronectin)에서 코팅된 플라스틱 웰에 시딩(seeding)되었다. 아데사민(adhesamine)과 피브로넥틴(fibronectin)의 농도는 각각 6 μM과 5 μg/mL이었다. 접착 세포는 시딩(seeding) 5시간 후에 계산되었다. 각 점은, 평균 ± SD를 나타낸다.
도 11은 아데사민(adhesamine)에 의한 FAK와 ERK의 활성화를 내보이는 도다. (A)아데사민(adhesamine) 처리에 있어서의 FAK와 ERK활성화의 시간적 경과 저켓(Jurkat) 세포는 표시된 시간의 동안, 저 혈청 배지중(0.1% FBS)에서 아데사민(adhesamine)(6μM)에 의해 처리되었다. 처리된 세포의 용해물질은 FAK 포스포-티로신(phosphotyrosine)³⁹⁷(pFAK), FAK, ERK1/2포스포-트레오닌(phosphothreonine)²⁰²/티로신(tyrosine)²⁰⁴(pERK)또는 ERK에 대한 항체로 웨스턴 블롯되었다. (B)저켓(Jurkat) 세포는 다양한 농도의 아데사민(adhesamine) 또는 폴리-L-리신(lysine)과 함께 5시간 배양되었다. 세포의 용해물질은 FAK 포스포-티로신(phosphotyrosine)³⁹⁷ 또는 FAK에 대한 항체에서 웨스턴 블롯되었다. (C) 과도한 양의 헤파린 또는 RGD펩티드(peptide)(100 μg/mL)의 효과 아데사민(adhesamine)(1)의 농도는 6 μM이었다.
도 12는 화합물 1 및 코팅 재료의 세포접착 촉진 활성을 나타낸 도이다. 나타낸 데이터는, 세 차례의 실험에서의 평균 ± SD다. 웰(well)의 바닥 면적은 0.3 cm²이다.
도 13은 아데사민(adhesamine)(1)의 존재 하에서의 저켓(Jurkat) 세포에 형광색소(Alexa Fluor 594)의 마이크로 인젝션을 나타낸 그래프다. 아데사민(adhesamine)은, 타입 I 콜라겐, 폴리-L-리신(lysine) 염산염, 및 피브로넥틴(fibronectin)이상으로 마이크로 인젝션의 성공률을 올린다. 사용된 시약의 농도는 5 μg/mL이었다.

이하, 본 발명의 세포접착 촉진제, 세포의 접착을 촉진시키는 방법, 세포접착 및/또는 세포증식을 촉진하는 헤파란 설페이트(heparan sulfate) 작용제(agonist)에 대해서 상세하게 설명한다.

세포접착 촉진제

본 발명의 지지체에 세포접착 촉진제는, 하기 화학식(I)에서 나타낸 디스피로트리피페라진(dispirotripiperazine) 유도체 또는 그의 염을 포함하는 것을 특징으로 한다.

· 디스피로트리피페라진 ( dispirotripiperazine ) 유도체 및 그의 염

[화학식에서, R¹ 및 R²는, 같거나 다르고, 수소, 알킬기(alkyl group), 아케닐기(alkenyl group), 알키닐기(alkynyl groups), 시클로알킬기(cycloalkyl group), 시클로알킬알킬기(cycloalkylalkyl group), 아릴기(aryl group), 헤테로아릴기(heteroaryl group), 아릴 치환 알킬기, 헤테로아릴 치환 알킬기(R¹ 및 R²가 양쪽이 수소인 경우는 제외되어, R¹ 및 R²은 단실 하이드라진(dansyl hydrazine) 유도체화 되어 있어도 좋으며, 알킬기(alkyl group), 아케닐기(alkenyl group), 알키닐기(alkynyl groups) 및 알킬(alkyl) 부분은, 할로겐(halogen), 하이드록시(hydroxy)(상기 하이드록시(hydroxy)는 아실화(acylation), 카바메이트(carbamate)화 또는 에테르화(etherification)되고 있어도 좋다), 시아노(cyano), 니트로(nitro), 아미노(amino), 모노(mono) 또는 다이(di) 치환 아미노(amino), 카르바모일(carbamoyl) 및 설파모일(sulfamoyl)로부터 선택되는 원자 또는 기(group)로 치환되고 있어도 좋으며, 알킬기(alkyl group), 아케닐기(alkenyl group), 알키닐기(alkynyl groups), 시클로알킬기(cycloalkyl group), 알킬(alkyl) 부분 및 시클로알킬(cycloalkyl) 부분은, -O-, -S-, -SO-, -SO2-, -OSO2-, -NH-, -CO-, -CH=CH-, -C≡C-, -CONH-, -NHCO-, -NHCOO-, -OCH2CONH- 또는 -OCH2CO-가 포함되어 있어서 되며, 아릴기(aryl group), 아릴(aryl) 부분, 헤테로아릴기(heteroaryl group), 헤테로아릴(heteroaryl) 부분, 시클로알킬기(cycloalkyl group) 및 시클로알킬(cycloalkyl) 부분은, 할로겐(halogen), 하이드록시(hydroxy), 포르밀(formyl), 알킬(alkyl), 하이드록시알킬(hydroxyalkyl), 알콕시(alkoxy), 알킬티오기(alkylthio), 시아노(cyano), 니트로(nitro), 아미노(amino), 모노(mono) 또는 다이(di) 치환 아미노(amino), 카르바모일(carbamoyl), 설파모일(sulfamoyl), 알킬술포닐(alkylsulfonyl), 알킬술포닐아미노(alkylsulfonylamino), 알킬카르보닐아미노(alkylcarbonylamino), 메틸렌디옥시(methylenedioxy) 및 아릴(aryl)로부터 선택되는 원자 또는 기(group)로 치환되어 있어도 좋다), 또는 하기 화학식(II)에서 나타낸 기(group)(R¹ 및 R² 모두 하기 화학식(II)에서 나타낸 기(group)의 경우를 제외한다)을 의미한다.

[화학식에서, R^1a는 알킬렌기(alkylene group), 알케닐렌기(alkenylene group), 알키닐렌기(alkynylene group), 시클로알킬렌기(cycloalkylene group), 시클로알킬알킬렌기(cycloalkylalkylene group), 아릴렌기(arylene group), 헤테로아릴렌기(hetroarylene group), 아릴(aryl) 치환 알킬렌기(alkylene group), 또는 헤테로아릴(heteroaryl) 치환 알킬렌기(alkylene group) (알킬렌기(alkylene group), 알케닐렌기(alkenylene group), 알키닐렌기(alkynylene group) 및 알킬렌(alkylene) 부분은, 할로겐(halogen), 하이드록시(hydroxy)(상기 하이드록시(hydroxy)는 아실화(acylation), 카바메이트화(carbamate) 또는 에테르화(etherification)되고 있어도 좋다), 시아노(cyano), 니트로(nitro), 아미노(amino), 모노(mono) 또는 다이(di) 치환 아미노(amino), 카르바모일(carbamoyl) 및 설파모일(sulfamoyl)로부터 선택되는 원자 또는 기(group)로 치환되고 있어도 좋으며, 알킬렌기(alkylene group), 알케닐렌기(alkenylene group), 알키닐렌기(alkynylene group), 시클로알킬렌기(cycloalkylene group), 알킬렌(alkylene) 부분 및 시클로알킬(cycloalkyl) 부분은, -O-, -S-, -SO-, -SO2-, -OSO2-, -NH-, -CO-, -CH=CH-, -C≡C-, -CONH-, -NHCO-, -NHCOO-, -OCH2CONH- 또는 -OCH2CO-가 포함되어 있어도 되며, 아릴렌기(arylene group), 아릴(aryl) 부분, 헤테로아릴렌기(hetroarylene group), 헤테로아릴(heteroaryl) 부분, 시클로알킬렌기(cycloalkylene group), 및 시클로알킬(cycloalkyl) 부분은, 할로겐(halogen), 하이드록시(hydroxy), 포르밀(formyl), 알킬(alkyl), 하이드록시알킬(hydroxyalkyl), 알콕시(alkoxy), 알킬티오기(alkylthio), 시아노(cyano), 니트로(nitro), 아미노(amino), 모노(mono) 또는 다이(di) 치환 아미노(amino), 카르바모일(carbamoyl), 설파모일(sulfamoyl), 알킬술포닐(alkylsulfonyl), 알킬술포닐아미노(alkylsulfonylamino), 알킬카르보닐아미노(alkylcarbonylamino), 메틸렌디옥시(methylenedioxy) 및 아릴(aryl)로부터 선택되는 원자 또는 기(group)로 치환되고 있어도 좋다)을 의미하고,

R^2a는, R¹ 및 R²의 정의에서와 같다.]]

상기 디스피로트리피페라진(dispirotripiperazine) 유도체는, 새로이 RGD(Arg-Gly-Asp)배열 등의 인테그린(integrin)결합 활성을 가지는 물질을 링커(linker)를 통해 결합시킨 것 이여도 좋다.

상기 화학식(I)에서 나타낸 디스피로트리피페라진(dispirotripiperazine) 유도체의 염은, 디스피로트리피페라진(dispirotripiperazine) 유도체 1분자에 대하여, 1가 음이온(anion) 2분자 또는 2가 음이온(anion) 1분자와 염을 의미한다. 이러한 염의 구체적인 예로는, 염산염, 브롬화 수소산염, 요오드화수소산염, 황산염, 과염소산염 등의 무기산염, 수산염, 마론산염, 호박산염, 말레산염, 푸마르산염, 젖산염, 사과산염, 주석산염, 안식향산염, 트리 플루오로 아세트산염, 아세트산염, 메탄술폭산염, p-톨루엔술포닉산염, 트리플루오로메탄술폰산염등의 유기산염, 및 글루탐산(Glutamicacid)염, 아스파라긴산염 등의 산성 아미노(amino)산염을 들 수 있다.

상기 화학식(I)에 있어서 나타낸 각 기(group)는 보다 구체적으로 각각 다음과 같다.

「알킬기(alkyl group)」는, 직쇄, 측쇄 및 고리모양 이여도 좋으며, 예를 들면, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필(isopropl), n-부틸(bytyl), 이소부틸, tert-부틸(bytyl), n-펜틸(pentyl), 이소펜틸, 헥실(hexyl), 헵틸(heptyl), 옥틸(octyl), 노닐(nonyl) 및 데실(decile)을 들 수 있다. 탄소수는 바람직하게는 1∼30이며, 보다 바람직하게는 1∼20이다.

「아케닐기(alkenyl group)」는, 직쇄, 측쇄 및 고리모양이라도 좋으며, 이중 결합을 적어도 1개 가지는 것을 의미하고, 예를 들면 비닐, 알릴(allyl), 1-프로페닐(propenyl), 2-메틸-2-프로페닐(propenyl), 이소프로페닐, 1-, 2- 또는 3-부테닐(butenyl), 2-, 3- 또는 4-펜테닐(pentenyl), 2-메틸-2-부테닐(butenyl), 3-메틸-2-부테닐(butenyl), 5-헥세닐(hexenyl), 1-시클로펜테닐(cyclopentenyl), 1-시클로헥세닐, 3-메틸-3-부테닐(butenyl) 및 이들의 균등물을 들 수 있다. 탄소수는 바람직하게는 2∼30이며, 보다 바람직하게는 2∼20이다.

「알키닐기(alkynyl groups)」는, 직쇄, 측쇄 및 고리모양이라도 좋으며, 상중 결합을 적어도 1개 가지는 것을 의미하고, 예를 들면 에티닐(ethynyl), 1- 또는 2-프로피닐(propynyl), 1-, 2- 또는 3-부티닐(butynyl), 1-메틸-2-프로피닐(propynyl) 및 이들의 균등물을 들 수 있다. 탄소수는 바람직하게는 2∼30이며, 보다 바람직하게는 2∼20이다.

「시클로알킬기(cycloalkyl group)」의 구체적인 예로는, 시클로프로필(cyclopropyl) , 시클로부틸, 시클로펜틸(cyclopentyl), 시클로헥실(cyclohexyl) 및 시클로헵틸(cycloheptyl)을 들 수 있다. 탄소수는 바람직하게는 3∼8이며, 보다 바람직하게는 5 또는 6이다.

「아릴기(aryl group)」는, 5 또는 6 개의 방향족 탄화 수소 고리로 이루어지는 단일고리 또는 여러 고리의 기(group)를 의미하고, 구체적인 예로는, 페닐(phenyl), 나프틸(naphthyl) , 플루오레닐(Fluorenyl), 안트릴(anthryl), 비페닐일(biphenylyl), 테트라하이드로나프틸(tetrahydronaphthyl), 크로마닐(chromanyl), 2, 3-디하이드로(dihydro)-1, 4-디옥사나프탈레닐, 인다닐(Indanyl) 및 펜안트릴(Phenanthryl)을 들 수 있다.

「헤테로아릴기(heteroaryl group)」는, N, O 및 S로부터 선택되는 1∼3개의 헤테로(hetero) 원자를 포함하는, 5 또는 6개의 방향 고리부터 이루어지는 단일고리 또는 여러고리의 기(group)를 의미하고, 여러고리의 경우에는 적어도 1개의 고리가 방향 고리이라면 좋으며, 다른 분자에 결합하고 있는 탄소원자의 옆에 N이 존재하는 것이 바람직하다. 구체적인 예로는, 프릴, 티에닐(thienyl), 피롤릴(Pyrrolyl), 이미다졸릴(imidazolyl), 피라졸릴(pyrazolyl), 옥사졸릴(Oxazolyl), 티아졸릴(thiazolyl) , 이속사졸릴(Isoxazolyl), 이소티아졸일(Isothiazolyl) , 피리딜(pyridyl), 피라지닐(Pyrazinyl), 피리미디닐(pyrimidinyl), 피리다지닐(pyridazinyl), 인돌일(indolyl), 퀴놀릴(quinolyl), 이소퀴놀릴, 벤조(benzo) [b] 티에닐(thienyl) 및 벤즈이미다졸릴(benzimidazolyl)를 들 수 있다.

「알킬(alkyl) 부분」은, 시클로알킬알킬기(cycloalkylalkyl group), 아릴 치환 알킬기 및 헤테로아릴 치환 알킬기에 있어서의 각 알킬기(alkyl group)를 의미할 뿐만 아니라, 하이드록시알킬(hydroxyalkyl), 알킬티오기(alkylthio), 알킬술포닐(alkylsulfonyl), 알킬술포닐아미노(alkylsulfonylamino), 알킬카르보닐아미노(alkylcarbonylamino), 및 알콕시기(alkoxy group) 중의 알콕시(alkoxy)(O-알킬기(alkyl group))중의 알킬기(alkyl group), 및 모노(mono) 또는 다이(di) 치환 아미노(amino), 카르바모일(carbamoyl) 및 설파모일(sulfamoyl)의 치환 근본인 알킬기(alkyl group)를 포함한다.

「시클로알킬(cycloalkyl) 부분」은, 시클로알킬알킬기(cycloalkylalkyl group) 및 시클로알킬알킬렌기(cycloalkylalkylene group)의 시클로알킬기(cycloalkyl group)를 의미한다.

「아릴(aryl) 부분」은, 아릴 치환 알킬기 및 아릴(aryl) 치환 알킬렌기(alkylene group)의 아릴기(aryl group)를 의미한다.

「헤테로아릴(heteroaryl) 부분」은, 헤테로아릴 치환 알킬기 및 헤테로아릴(heteroaryl) 치환 알킬렌기(alkylene group)의 헤테로아릴기(heteroaryl group)를 의미한다.

알킬(alkyl), 시클로알킬(cycloalkyl), 아릴(aryl) 또는 헤테로아릴(heteroaryl) 부분을 포함하는 복합 기(group)의 구체적인 예로는, 해당 부분에서 각 기(group)에 관한 전술의 구체적인 예를 적용시킨 것을 들 수 있다.

「시클로알킬알킬기(cycloalkylalkyl group)」의 구체적인 예로는, 시클로프로필메틸(cyclopropylmethyl), 시클로부틸메틸(cyclobutylmethyl), 시클로펜틸메틸(cyclopentylmethyl), 시클로헥실메틸(Cyclohexylmethyl) 및 시클로헵틸메틸(Cycloheptylmethyl)을 들 수 있다.

「아릴 치환 알킬기」의 구체적인 예로는, 벤질(benzyl), 나프틸멜틸(Naphthylmethyl), 풀루오레일메틸(fluorenylmethyl), 안트릴메틸(Anthrylmethyl), 비페닐메틸(biphenylylmethyl), 테트라하이드로나프틸메틸(tetrahydronaphthylmethyl), 크로마닐메틸(Chromanylmethyl), 2, 3-디하이드로(dihydro)-1, 4-디옥사나프틸아조메틸(dioxanaphthylazomethyl), 인다닐메틸(indanylmethyl), 페난트릴메틸(Phenanthrylmethyl), 페네틸(phenethyl), 나프틸에틸(Naphthylethyl), 플루오레릴에틸(Fluorenylethyl), 안트릴에틸(Anthrylethyl), 비페닐일에틸(biphenylylethyl), 테트라하이드로나프틸에틸(tetrahydronaphthylethyl), 크로마닐에틸(Chromanylethyl) , 2, 3-디하이드로(dihydro)-1, 4-디옥사나프틸아조(diaxanaphthylazoethyl), 인다닐에틸(indanylethyl) 및 페난트릴에틸(Phenanthrylethyl)을 들 수 있다.

「헤테로아릴 치환 알킬기」의 구체적인 예로서는, 퓨릴메틸(furylmethyl), 티에닐메틸(thienylmethyl), 피롤리메틸(Pyrrolylmethyl), 이미다졸릴메틸(Imidazolylmethyl), 피라졸릴메틸(pyrazolylmethyl), 옥사졸일메틸(Oxazolylmethyl), 티아졸일메틸(thiazolylmethyl), 이소옥사졸일메틸(Isoxazolylmethyl), 이소티아졸일메틸(Isothiazolylmethyl), 피리딜메틸(pyridylmethyl), 피라지닐메틸(Pyrazinylmethyl), 피리미디닐메틸(Pyrimidinylmethyl), 피리다지닐메틸(pyridazinylmethyl), 인돌릴메틸(indolylmethyl), 퀴놀릴메틸(Quinolylmethyl), 이소키놀일메틸(isoquinolylmethyl), 벤조 [b] 티에닐메틸(benzo [b] thienylmethyl), 벤조이미다졸릴메틸(benzoimidazolylmethyl), 퓨릴에틸(furylethyl), 티에닐에틸, 피롤릴에틸, 이미다졸릴에틸, 피라졸릴에틸(pyrazolylethyl), 옥사졸릴에틸(Oxazolylethyl), 티아졸릴에틸(thiazolylethyl), 이소옥사졸릴에틸(Isoxazolylmethyl), 이소티아졸릴에틸(Isothiazolylethyl), 피리딜에틸(pyridylethyl), 피라지닐에틸(Pyrazinylethyl), 피리미디닐에틸(Pyrimidinylethyl), 피리다지닐에틸(pyridazinylethyl), 인돌릴에틸(indolylethyl), 퀴놀릴에틸(Quinolylethyl), 이소키놀릴에틸(isoquinolylethyl), 벤조 [b] 티에닐에틸(benzo [b] thienylethyl) 및 벤조이미다졸릴에틸(benzoimidazolylethyl)을 들 수 있다.

「하이드라진(hydrazine) 유도체화」는, 하이드라진(hydrazine)과의 반응에 의해, 하이드라진(hydrazine)과 결합하고 있는 상태를 의미하고, 구체적으로는 하기 화학식(c)에서 나타낸 화합물을 들 수 있다.

「할로겐(halogen) 원자」는, 불소, 염소, 취소 또는 옥소를 의미한다.

「아실화(acylation)된 하이드록시(hydroxy)」는, 알킬카보닐옥시(alkylcarbonyloxy), 아릴카보닐옥시(Arylcarbonyloxy) 또는 아릴(aryl) 치환 알킬카보닐옥시(alkylcarbonyloxy)를 의미한다.

「카바메이트(carbamate)화된 하이드록시(hydroxy)」는, 알킬아미노카보닐옥시(alkylaminocarbonyloxy), 아릴아미노카보닐옥시(Arylaminocarbonyloxy) 또는 아릴(aryl) 치환 알킬아미노카보닐옥시(alkylaminocarbonyloxy)를 의미한다.

「에테르화(etherification)된 하이드록시(hydroxy)」는, 알킬(alkyl) 옥시, 아릴(aryl) 옥시 또는 아릴(aryl) 치환 알킬(alkyl) 옥시를 의미한다.

알킬카보닐옥시(alkylcarbonyloxy)의 구체적인 예로서는, 메틸카보닐옥시(methylcarbonyloxy), 에틸카보닐옥시(ethylcarbonyloxy), n-프로필카보닐옥시(n-propylcarbonyloxy), 이소프로필카보닐옥시(isopropylcarbonyloxy), n-부틸카보닐옥시(n-butylcarbonyloxy), 이소부틸카보닐옥시(isobutylcarbonyloxy), tert-부틸카보닐옥시(tert-butylcarbonyloxy), n-펜틸카보닐옥시(n-pentylcarbonyloxy), 이소펜틸카르보닐옥시(isopentylcarbonyloxy) 및 헥실카르보닐옥시(hexylcarbonyloxy)를 들 수 있다.

아릴카르보닐옥시(Arylcarbonyloxy)의 구체적인 예로서는, 페닐카보닐옥시(penylcarbonyloxy), 나프틸카보닐옥시(naphthylcarbonyloxy), 플루오레닐카르복실옥시(fluorenylcarbonyloxy), 안트릴카르복실옥시(anthrylcarbonyloxy), 바이페닐카보닐옥시(biphenylcarbonyloxy), 테트라하이드로나프틸카보닐옥시(tetrahydronaphthylcarbonyloxy), 크로마닐카보닐옥시(chromanylcarbonyloxy), 2, 3-디하이드로(dihydro)-1, 4-디옥사나프탈레닐카보닐옥시(dioxanaphthalenylcarbonyloxy), 인다닐카복닐옥시(indanylcarbonyloxy) 및 페난트릴카르복실옥시(phenanthrylcarbonyloxy)를 들 수 있다.

아릴(aryl) 치환 알릴카보닐옥시(arylcarbonyloxy)의 구체적인 예로서는, 벤질카보닐옥시(benzylcarbonyloxy), 나프틸메틸카보닐옥시(naphthylmethylcarbonyloxy), 플루오레닐메틸카보닐옥시(fluorenylmethylcarbonyloxy), 안트릴메틸카보닐옥시(anthrylmethylcarbonyloxy), 바이페닐메틸카보닐옥시(biphenylmethylcarbonyloxy), 테트라하이드로나프틸메틸카보닐옥시(tetrahydronaphthylmethylcarbonyloxy), 크로마닐메틸카보닐옥시(chromanylmethylcarbonyloxy), 2, 3-디하이드로(dihydro)-1, 4-디옥사나프탈레닐메틸카보닐옥시(dioxanaphthalenylmethylcarbonyloxy), 인다닐메틸카보닐옥시(indanylmethylcarbonyloxy) 및 페난트릴메틸카보닐옥시(phenanthrylmethylcarbonyloxy), 펜에틸카보닐옥시(penethylcarbonyloxy), 나프틸에틸카보닐옥시(naphthylethylcarbonyloxy), 플루오레닐에틸카보닐옥시(fluorenylethylcarbonyloxy), 안트릴에틸카보닐옥시(anthrylethylcarbonyloxy), 바이페닐에틸카보닐옥시(biphenylethylcarbonyloxy), 테트라하이드로나프틸에틸카보닐옥시(tetrahydronaphthylethylcarbonyloxy), 크로마닐에틸카르보닐옥시(chromanylethylcarbonyloxy), 2, 3-디하이드로(dihydro)-1, 4-디옥사나프탈레닐에틸카르보닐옥시(dioxanaphthalenylethylcarbonyloxy), 인다닐에틸카르보닐옥시(indanylethylcarbonyloxy) 및 페난트릴에틸카르보닐옥시(phenanthrylethylcarbonyloxy)를 들 수 있다.

알킬아미노카르보닐옥시(alkylaminocarbonyloxy)의 구체적인 예로서는, 메틸아미노카르보닐옥시(methylaminocarbonyloxy), 에틸아미노카르보닐옥시(ethylaminocarbonyloxy), n-프로필아미노카르보닐옥시(n-propylaminocarbonyloxy), 이소프로필아미노카르보닐옥시(isopropylaminocarbonyloxy), n-부틸아미노카르보닐옥시(n-bytylaminocarbonyloxy), 이소부틸아미노카르보닐옥시(isobutylaminocarbonyloxy), 털트-부틸아미노카르보닐옥시(tert-butylaminocarbonyloxy), n-펜틸아미노카르보닐옥시(n-pentylaminocarbonyloxy),

이소펜틸아미노카르보닐옥시(isopentylaminocarbonyloxy) 및 헥실아미노카르보닐옥시(hexylaminocarbonyloxy)를 들 수 있다.

아릴아미노카르보닐옥시(arylaminocarbonyloxy)의 구체적인 예로서는, 페닐아미노카르보닐옥시(phenylaminocarbonyloxy), 나프틸아미노카르보닐옥시(naphtylaminocarbonyloxy), 플루오레닐아미노카르보닐옥시(fluorenylaminocarbonyloxyoxy), 안트릴아미노카르보닐옥시(anthrylaminocarbonyloxy), 바이페닐아미노카르보닐옥시(bi-phenylaminocarbonyloxy), 테트라하이드로나프틸아미노카르보닐옥시(tetrahydronaphtylaminocarbonyloxy), 크로마닐아미노카르보닐옥시(chromanylaminocarbonyloxy), 2, 3-디하이드로-1, 4-디옥사나프탈레닐아미노카르보닐옥시(2, 3-dihydro-1, 4- dioxanaphtalenylaminocarbonyloxy), 인다닐아미노카르보닐옥시(indanylaminocarbonyloxy) 및 페난트릴아미노카르보닐옥시(phenanthrylaminocarbonyloxy)를 들 수 있다.

아릴(aryl) 기가 치환된 알킬아미노카보닐옥시(alkylaminocarbonyloxy)의 구체적인 예로서는, 벤질카보닐옥시(benzylcarbonyloxy), 나프틸메틸아미노카보닐옥시(naphthylmethylaminocarbonyloxy), 플루오레닐메틸아미노카보닐옥시(fluorenylmethylaminocarbonyloxy), 안트릴메틸아미노카보닐옥시(anthrylmethylaminocarbonyloxy), 바이페닐메틸아미노카보닐옥시(biphenylmethylaminocarbonyloxy), 테트라하이드로나프틸메틸아미노카보닐옥시(tetrahydronaphthylmethylaminocarbonyloxy), 크로마닐메틸아미노카보닐옥시(chromanylmethylaminocarbonyloxy), 2, 3-디하이드로(dihydro)-1, 4-다이옥사나프탈레닐메틸아미노카보닐옥시(dioxanaphtalenylmethylaminocarbonyloxy), 인다닐메틸아미노카보닐옥시(indanylmethylaminocarbonyloxy) 및 페난트릴메틸아미노카보닐옥시(phenanthrylmethylaminocarbonyloxy), 페네칠아미노카보닐옥시(phenethylaminocarbonyloxy), 나프틸에틸아미노카보닐옥시(naphthylethylaminocarbonyloxy), 플루오레닐에틸아미노카보닐옥시(fluorenylethylaminocarbonyloxy), 안트릴에틸아미노카보닐옥시(anthrylethylaminocarbonyloxy), 바이페닐에틸아미노카보닐옥시(biphenylethylaminocarbonyloxy), 테트라하이드로나프틸에틸아미노카보닐옥시(tetrahydronaphthylethylaminocarbonyloxy), 크로마닐에틸아미노카보닐옥시(chromanylethylaminocarbonyloxy), 2, 3-디하이드로(dihydro)-1, 4-다이옥사나프탈레닐에틸아미노카보닐옥시(dioxanaphtalenylethylaminocarbonyloxy), 인다닐에틸아미노카보닐옥시(indanylethylaminocarbonyloxy) 및 페난트릴에틸아미노카보닐옥시(phenanthrylethylaminocarbonyloxy)를 들 수 있다.

알킬(alkyl) 옥시의 구체적인 예로는, 메틸 옥시, 에틸 옥시, n-프로필옥시(propyloxy), 이소프로필(isopropl) 옥시, n-부틸옥시(butyloxy), 이소부틸옥시(isobutyloxy), tert-부틸옥시(butyloxy), n-펜틸옥시(pentyloxy), 이소펜틸옥시(isopentyloxy) 및 헥실(hexyl) 옥시를 들 수 있다.

아릴(aryl) 옥시의 구체적인 예로는, 페닐옥시(phenyloxy), 나프틸옥시(naphtyloxy), 플루오레닐옥시(fluorenyloxy), 안트릴옥시(anthryloxy), 바이페닐옥시(biphenyloxy), 테트라하이드로나프틸옥시(tetrahydronaphthyloxy), 크로마닐옥시(chromanyloxy), 2, 3-디하이드로(dihydro)-1, 4-다이옥사나프탈레닐옥시(dioxanaphtalenyloxy), 인다닐옥시(indanyloxy) 및 페난트릴옥시(phenanthryloxy)를 들 수 있다.

아릴(aryl) 치환 알킬(alkyl) 옥시의 구체적인 예로는, 벤질옥시(benzyloxy), 나프틸메틸옥시(naphtylmethyloxy), 플루오레닐메틸옥시(fluorenylmethyloxy), 안트릴메틸옥시(anthrylmethyloxy), 바이페닐메틸옥시(biphenylmethyloxy), 테트라하이드로나프틸메틸옥시(tetrahydronaphthylmethyloxy), 크로마닐메틸옥시(chromanylmethyloxy), 2, 3-디하이드로(dihydro)-1, 4-다이옥사나프탈레닐메틸옥시(dioxanaphtalenylmethyloxy), 인다닐메틸옥시(indanylmethyloxy) 및 페난트릴메틸옥시(phenanthrylmethyloxy), 페네칠옥시(phenethyloxy), 나프틸에틸옥시(naphtylethyl옥시), 플루오레닐에틸옥시(fluorenylethyloxy), 안트릴에틸옥시(anthrylethyloxy), 바이페닐에틸옥시(biphenylethyloxy), 테트라하이드로나프틸에틸옥시(tetrahydronaphthylethyloxy), 크로마닐에틸옥시(chromanylethyloxy), 2, 3-디하이드로(dihydro)-1, 4-다이옥사나프탈레닐에틸옥시(dioxanaphtalenylethyloxy), 인다닐에틸옥시(indanylethyloxy) 및 페난트릴에틸옥시(phenanthryloxy)를 들 수 있다.

모노 또는 다이 치환 아미노(amino) 기, 모노 또는 다이 치환 카르바모일(carbamoyl) 기 또는 모노 또는 다이 치환 설파모일(sulfamoyl) 기에 있어서 「모노 치환」은, 아미노(amino) 기, 카르바모일(carbamoyl) 기 또는 설파모일(sulfamoyl) 기의 질소 원자에 결합하는 수소 원자 1개가 알킬(alkyl)로 치환되고 있는 것을 의미하고, 「다이 치환」은, 아미노(amino) 기, 카르바모일(carbamoyl)기 또는 설파모일(sulfamoyl)기의 질소원자에 결합하는 수소 원자 2개가 동일 또는 다른 알킬(alkyl)로 치환되고 있는 것을 의미한다.

알킬(alkyl)로 모노 치환된 아미노(amino) 기로는, 메틸 아미노(amino), 에틸 아미노(amino), n-프로필아미노(propylamino), 이소프로필(isopropl) 아미노(amino), n-부틸아미노(butylamino), 이소부틸아미노(isobutylamino), tert-부틸아미노(butylamino), n-펜틸아미노(pentylamino), 이소펜틸아미노(isopentylamino) 및 헥실(hexyl) 아미노(amino)를 들 수 있다.

알킬(alkyl)로 다이 치환된 아미노(amino) 기로는, 디메틸 아미노(amino), 다이에틸아미노(diethylamino), 다이 n-프로필아미노(propylamino), 다이이소프로필아미노(diisopropylamino), 다이 n-부틸아미노(butylamino), 다이이소부틸아미노(diisobutylamino), 다이tert-부틸아미노(butylamino), 다이 n-펜틸아미노(pentylamino), 다이이소펜틸아미노(diisopentylamino) 및 다이헥실아미노(dihexylamino)를 들 수 있다.

알킬(alkyl)로 모노 치환된 카르바모일(carbamoyl)기로는, 메틸카르바모일(methylcarbamoyl), 에틸카르바모일(ethylcarbamoyl), n-프로필카르바모일(propylcarbamoyl), 이소프로필카르바모일(isopropylcarbamoyl), n-부틸카르바모일(butylcarbamoyl), 이소부틸카르바모일(isobutylcarbamoyl), tert-부틸카르바모일(butylcarbamoyl), n-펜틸카르바모일(pentylcarbamoyl), 이소펜틸카르바모일(isopentylcarbamoyl) 및 헥실카르바모일(hexylcarbamoyl)을 들 수 있다.

알킬(alkyl)로 다이 치환된 카르바모일(carbamoyl)기로는, 다이메틸카르바모일(dimethylcarbamoyl), 다이에틸카르바모일(diethylcarbamoyl), 다이-n-프로필카르바모일(propylcarbamoyl), 다이이소프로필카르바모일(diisopropylcarbamoyl), 다이-n-부틸카르바모일(butylcarbamoyl), 다이이소부틸카르바모일(diisobutylcarbamoyl), 다이-tert-부틸카르바모일(butylcarbamoyl), 다이 n-펜틸카르바모일(pentylcarbamoyl), 다이이소펜틸카르바모일(diisopentylcarbamoyl) 및 다이헥실카르바모일(dihexylcarbamoyl)을 들 수 있다.

알킬(alkyl)로 모노 치환된 설파모일(sulfamoyl)기로는, 메틸설파모일(methylsulfamoyl), 에틸설파모일(ethylsulfamoyl), n-프로필설파모일(propylsulfamoyl), 이소프로필설파모일(isopropylsulfamoyl), n-부틸설파모일(butylsulfamoyl), 이소부틸설파모일(isobutylsulfamoyl), tert-부틸설파모일(butylsulfamoyl), n-펜틸설파모일(pentylsulfamoyl), 이소펜틸설파모일(isopentylsulfamoyl) 및 헥실설파모일(hexylsulfamoyl)을 들 수 있다.

알킬(alkyl)로 다이 치환된 설파모일기(sulfamoyl)로는,

디메틸설파모일(dimethylsulfamoyl), 디에틸설파모일(diethylsulfamoyl), 디 n-프로필설파모일(di-n-propylsulfamoyl), 디이소프로필설파모일(diisopropylsulfamoyl), 디 n-부틸설파모일(di-n-butylsulfamoyl), 디 n-부틸설파모일(di-n-butylsulfamoyl), 디이소부틸설파모일(diisobutylsulfamoyl), 디 털트-부틸설파모일(di-tert-butylsulfamoyl), 디 n-펜틸설파모일(di-n-pentylsulfamoyl), 디이소펜틸설파모일(diisopentylsulfamoyl) 및 디헥실설파모일(dihexylsulfamoyl)을 들 수 있다.

「-O-, -S-, -SO-, -SO₂-, -OSO₂-, -NH-, -CO-, -CH=CH-, -C≡C-, -CONH-, -NHCO-, -NHCOO-, -OCH₂CONH- 또는 -OCH₂CO-로 포함되어 있는 알킬기(alkyl group), 아케닐기(alkenyl group), 알키닐기(alkynyl groups), 시클로알킬기(cycloalkyl group), 알킬(alkyl) 부분 및 시클로알킬(cycloalkyl) 부분」과는, 알킬기(alkyl group), 아케닐기(alkenyl group), 알키닐기(alkynyl groups), 시클로알킬기(cycloalkyl group), 알킬(alkyl) 부분 및 시클로알킬(cycloalkyl) 부분 중의 탄소간의 단일결합에 있어서, -O-, -S-, -SO-, -SO₂-, -OSO₂-, -NH-, -CO-, -CH=CH-, -C≡C-, -CONH-, -NHCO-, -NHCOO-, -OCH₂CONH- 또는 -OCH₂CO-로 포함되어 있는 탄소수가 2이상의 알킬기(alkyl group), 탄소수가 3이상의 아케닐기(alkenyl group), 탄소수가 3이상의 알키닐기(alkynyl groups), 시클로알킬기(cycloalkyl group), 탄소수가 2이상의 알킬(alkyl) 부분 및 시클로알킬(cycloalkyl) 부분을 말하고, 디스파이로트리피페라진(dispirotripiperazine)의 질소원자로 2탄소이상 떨어지고 있는 탄소원자에 이것들이 결합하고 있는 것이 바람직하다.

「하이드록시알킬기(hydroxyalkyl)」의 구체적인 예로는, 하이드록시메틸(hydroxymethyl), 하이드록시에틸(hydroxyethyl), 하이드록시-n-프로필(hydroxy-n-propyl), 하이드록시이소프로필(hydroxyisopropyl), 하이드록시-n-부틸(hydroxy-n-butyl), 하이드록시이소부틸(hydroxyisobutyl), 하이드록시-털트-부틸(hydroxy-tertbutyl), 하이드록시-n-펜틸(hydroxy-n-pentyl), 하이드록시이소펜틸(hydroxyisopentyl) 및 하이드록시헥실(hydroxyhexyl)을 들 수 있다.

「알콕시(alkoxy) 기」의 구체적인 예로는, 메톡시(methoxy), 에톡시(ethoxy), 프로폭시(propoxy), 이소프로폭시(isopropxy), 부톡시(butoxy), 이소부톡시(isobutoxy), 털트-부톡시(tert-butoxy), 펜틸옥시(pentyloxy), 이소펜틸옥시(isopentyloxy) 및 헥실옥시(hexyloxy)를 들 수 있다.

「알킬티오기(alkylthio) 기」의 구체적인 예로는, 메틸티오(methylthio), 에틸티오(ehtylthio), n-프로필티오(n-propylthio), 이소프로필티오(siopropylthio), n-부틸티오(n-butylthio), 이소부틸티오(isobytylthio), 털트-부틸티오(tert-butylthio), n-펜틸티오(n-pentylthio), 이소펜틸티오(isopentylthio) 및 헥실티오(hexylthio)를 들 수 있다.

「알킬술포닐(alkylsulfonyl)기」의 구체적인 예로는, 메틸술포닐 및 에틸술포닐을 들 수 있다.

「알킬술포닐아미노(alkylsulfonylamino)기」의 구체적인 예로는, 메틸술포닐아미노 및 메틸술포닐아미노를 들 수 있다.

「알킬카르보닐아미노(alkylcarbonylamino)기」의 구체적인 예로는, 메틸카르보닐아미노 및 에틸카르보닐아미노를 들 수 있다.

「알킬렌(alkylene)기」란, 직쇄, 측쇄 및 고리모양 이여도 좋으며, 예를 들면, 메틸렌, 에틸렌, n-프로필렌, 이소프로필렌, n-부틸렌, 이소부틸렌(isobutylene), tert-부틸렌, n-펜틸렌, 이소펜틸렌, 헥실렌, 헵틸렌, 옥틸렌, 노닐렌 및 덱실렌을 들 수 있다. 탄소수는 바람직하게는 1∼30이며, 보다 바람직하게는 1∼20이다.

「알케닐렌(alkenylene)기」란, 직쇄, 측쇄 및 고리모양 이여도 좋으며, 이중 결합을 적어도 1개 소유하는 것을 의미하고, 예를 들면 비닐렌, 아릴렌(arylene), 1-프로페닐렌, 2-메틸-2-프로페닐렌, 이소프로페닐렌, 1-, 2- 또는 3-부테닐렌, 2-, 3- 또는 4-펜테닐렌, 2-메틸-2-부테닐렌, 3-메틸-2-부테닐렌, 5-헥세닐렌, 1-시클로펜테닐렌, 1-시클로헥세닐렌, 3-메틸-3-부테닐렌 및 이것들의 균등물을 들 수 있다. 탄소수는 바람직하게는 2∼30이며, 보다 바람직하게는 2∼20이다.

「알키닐렌(alkynylene)기」란, 직쇄, 측쇄 및 고리모양 이여도 좋으며, 삼중 결합을 적어도 1개 소유하는 것을 의미하고, 예를 들면 에티닐렌, 1- 또는 2-프로피닐렌, 1-, 2- 또는 3-부티닐렌, 1-메틸-2-프로피닐렌 및 이것들의 균등물을 들 수 있다. 탄소수는 바람직하게는 2∼30이며, 보다 바람직하게는 2∼20이다.

「시클로알킬렌(cycloalkylene) 기」의 구체적인 예로는, 시클로(cyclo) 프로필렌, 시클로부틸렌, 시클로펜틸렌, 시클로헥실렌 및 시클로헵틸렌을 들 수 있다. 탄소수는 바람직하게는 3∼8이며, 보다 바람직하게는 5 또는 6이다.

「아릴렌(arylene) 기」란, 5 또는 6 개의 방향족 탄화수소고리로 이루어지는 단일 또는 여러고리의 기를 의미하고, 구체적인 예로는, 페닐렌 및 나프틸렌을 들 수 있다.

「헤테로아릴렌(hetroarylene) 기」란, N, O 및 S로부터 선택되는 1∼3개의 헤테로(hetero) 원자를 포함하는, 5 또는 6 개의 방향고리로부터 이루어지는 단일고리 또는 여러고리의 기를 의미하고, 여러고리의 경우에는 적어도 1개의 고리에 방향고리라면 좋으며, 다른 분자에 결합하고 있는 탄소원자의 옆에 N이 존재하는 것이 바람직하다. 구체예로서는, 프릴렌(furylene) 및 티에닐렌(thienylene)을 들 수 있다.

「알킬렌(alkylene) 부분」이란, 시클로알킬알킬렌(cycloalkylalkylene)기, 아릴(aryl) 치환 알킬렌(alkylene)기 및 헤테로아릴(heteroaryl) 치환 알킬렌(alkylene)기에 있어서의 각 알킬렌(alkylene)기를 의미한다.

알킬렌(alkylene)을 포함하는 복합기의 구체적인 예로는, 해당 부분에 각기에 관한 전술의 구체적인 예를 적용시킨 것을 들 수 있다.

「시클로알킬알킬렌(cycloalkylalkylene)기」의 구체적인 예로는, 시클로프로필메틸렌, 시클로부틸메틸렌, 시클로펜틸메틸렌, 시클로헥실메틸렌 및 시클로헵틸메틸렌을 들 수 있다.

「아릴(aryl) 치환 알킬렌(alkylene) 기」의 구체 예로서는, 나프틸메틸렌, 플루오레닐메틸렌(fluorenylmethylen), 안트릴메틸렌(anthrylmethylene), 바이페닐메틸렌(biphenylmethylene), 테트라하이드로나프틸메틸렌(tetrahydronaphtylmethylene), 크로마닐메틸렌(chromanylmethylene), 2, 3-디하이드로(dihydro)-1, 4-디옥사나프탈레닐메틸렌(dioxanaphtalenylmethylene), 인다닐메틸렌(indanylmethylene), 페난트릴메틸렌(phenanthrylmethyl), 나프틸에틸렌(naphtylethylene), 플루오레닐에틸렌(fluorenylethylene), 안트릴에틸렌(anthrylethylene), 바이페닐에틸렌(biphenylethylene), 테트라하이드로나프틸에틸렌(tetrahydronaphtylethylene), 크로마닐에틸렌(chromanylethylene), 2, 3-디하이드로(dihydro)-1, 4-디옥사나프탈레닐에틸렌(dioxanaphtalenylethylene), 인다닐에틸렌(indanylethylene) 및 페난트릴에틸렌(phenanthrylethyl)을 들 수 있다.

「헤테로아릴(heteroaryl) 치환 알킬렌(alkylene) 기」의 구체 예로서는, 퓨릴메틸렌(furylmethylen), 티에닐메틸렌(thienylmethylene), 피로릴메틸렌(pyrrolylmethylene), 이미다졸메틸렌(imidazolmethylen), 피라조릴메틸렌(pyrazolylmethylene), 옥사조릴메틸렌(oxazolylmethylene), 디아조릴메틸렌(diazolylmethylene), 이소옥사조릴메틸렌(isooxazolylmethylene), 이소티아조릴메틸렌(isothiazolylmethylene), 피리딜메틸렌(pyridylmethylene), 피라지닐메틸렌(pyrazinylmethylene), 피리미디닐메틸렌(pyrimidynylmethylene), 피리다지닐메틸렌(pyridazinylmethylene), 인도릴메틸렌(indolylmethylene), 퀴놀릴메틸렌(quinolylmethylene), 이소퀴졸린메틸렌(isoquinolylmethylene), 벤조(benzo) [b] 티에닐메틸렌(thienylmethylene), 벤즈이미다조릴메틸렌(benzimidazolylmethylene), 퓨릴에틸렌(furylethylen), 티에닐에틸렌(thienylethylene), 피로릴에틸렌(pyrrolylethylene), 이미다졸에틸렌(imidazolethylen), 피라조릴에틸렌(pyrazolylethylene), 옥사조릴에틸렌(oxazolylethylene), 디아조릴에틸렌(diazolylethylene), 이소옥사조릴에틸렌(isooxazolylethylene), 이소티아조릴에틸렌(isothiazolylethylene), 피리딜에틸렌(pyridylethylene), 피라지닐에틸렌(pyrazinylethylene), 피리미디닐에틸렌(pyrimidynylethylene), 피리다지닐에틸렌(pyridazinylethylene), 인도릴에틸렌(indolylethylene), 퀴놀릴에틸렌(quinolylethylene), 이소퀴졸린에틸렌(isoquinolylethylene), 벤조(benzo) [b] 티에닐에틸렌(thienylethylene), 벤즈이미다조릴에틸렌(benzimidazolylethylene)을 들 수 있다.

「-O-, -S-, -SO-, -SO2-, -OSO2-, -NH-, -CO-, -CH=CH-, -C≡C-, -CONH-, -NHCO-, -NHCOO-, -OCH2CONH- 또는 -OCH2CO-를 포함하는 알킬렌기(alkylene group), 알케닐렌기(alkenylene group), 알키닐렌기(alkynylene group), 시클로알킬렌기(cycloalkylene group), 알킬렌(alkylene) 부분 및 시클로알킬(cycloalkyl) 부분」은, 알킬렌(alkylene) 근본, 알케닐렌기(alkenylene group), 알키닐렌기(alkynylene group), 시클로알킬렌기(cycloalkylene group), 알킬렌(alkylene) 부분 및 시클로알킬(cycloalkyl) 부분 중의 탄소간의 단일 결합에 있어서, -O-, -S-, -SO-, -SO2-, -OSO2-, -NH-, -CO-, -CH=CH-, -C≡C-, -CONH-, -NHCO-, -NHCOO-, -OCH2CONH- 또는 -OCH2CO-를 포함하고 있는 탄소수가 2이상의 알킬렌기(alkylene group), 탄소수가 3이상의 알케닐렌기(alkenylene group), 탄소수가 3이상의 알키닐렌기(alkynylene group), 시클로알킬렌기(cycloalkylene group), 탄소수가 2이상의 알킬렌(alkylene) 부분 및 시클로알킬(cycloalkyl) 부분을 말하고, 디스피로트리피페라진(dispirotripiperazine)의 질소원자로 2탄소이상 떨어지고 있는 탄소원자에 이들이 결합하고 있는 것이 바람직하다.

본 발명의 디스피로트리피페라진(dispirotripiperazine) 유도체 가운데에서, 특히 적합한 화합물의 구체적인 예로는 다음의 화합물 및 그의 염을 들 수 있다. 그중에서도, 화학식(a) 및 (g)에서 표시되는 화합물이 특히 바람직하다. 화학식(h)로 표시되는 화합물은, 인테그린(integrin)결합 활성을 가지는 물질이 결합한 화합물이다.

·유효농도 및 유효량

배지에 첨가하여 지지체에 세포를 접착시키기 위한 상기 디스피로트리피페라진(dispirotripiperazine) 유도체 또는 그의 염의 유효농도는, 바람직하게는 배지에 0.4∼400 μM정도, 보다 바람직하게는 배지에 0.4∼60 μM정도이다.

코팅에 의해 지지체에 세포를 접착시키기 위한 화학식(I)로 나타낸 디스피로트리피페라진(dispirotripiperazine) 유도체 또는 그의 염의 유효량으로, 바람직하게는 0.03∼36.3 pmol/cm²정도, 보다 바람직하게는 0.30∼36.3 pmol/cm²정도이다.

본 발명의 세포접착 촉진제를 이용해서 세포를 접착시키기 위한 지지체로는, 일반 플라스틱이나 유리 재료이며, 세포를 배양하기 위한 세포배양 용기 또는 체내에 넣는 의료재료라면 특히 한정되지 않는다. 그러한 세포배양 용기로서는, 예를 들면, 배양용 12웰, 24웰, 48웰 및 96웰 멀티웰플레이트, 배양용 접시(laboratory dish), 및 배양용 플라스크를 들 수 있고, 조직 배양용, 또는 부유 배양용의 어느 쪽 이여도 좋다. 체내에 넣는 의료재료는, 체내에 메워넣는 인공 장기에 사용되는 것이며, 인공 장기로서는, 예를 들면, 인공관절, 인공혈관 등을 들 수 있다.

·세포

본 발명의 세포접착 촉진제를 이용해서 접착을 촉진시키는 세포로는, 본 발명의 세포접착 촉진제를 이용하는 것에 의해 지지체에 접착이 촉진하는 세포라면 특히 한정되지 않지만, 바람직하게는 동물세포이며, 보다 바람직하게는 포유류의 동물세포다. 예를 들면, 인간, 마우스, 래트(rat) 등 유래의 세포를 들 수 있다. 또한, 세포의 종류는 세포표면에 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)이 존재하는 세포가 바람직하고, 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)으로서 헤파린, 헤파란 설페이트(heparan sulfate) 또는 케라탄 설페이트(keratan sulfate)이 존재하는 세포가 특히 바람직하다. 세포는, 부착 의존성세포 및 부유성 세포의 어느쪽 이여도 좋다. 여기에서, 부착 의존성세포는, 배양 용기에 접착하면 생존할 수 없고 증식도 할 수 없는 세포를 의미하고, 예를 들면 섬유아세포, 상피세포, 내피세포, 평활근세포, 표피세포, 줄기세포, 골아세포, 골격근세포, 배아줄기세포(ES세포), 인공 만능 줄기세포(iPS세포)등을 들 수 있다. 부유성세포는, 부유 상태에서 증식할 수 있는 세포를 의미하고, 예를 들면 골수세포, 림프계 세포, 복수 암 세포 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명에 사용되는 세포로는 초대배양 세포도 될 수 있고, 초대배양 세포는 어느 쪽의 조직에서 유래하는 것이 여도 좋다.

세포를 배양하기 위해서 사용되는 배지는, 세포의 종류에 따라 적합한 배지를 적절히 선택해서 사용하면 좋고, 예를 들면 돌베코의 변형 이글 배지, 윌리엄스 E 배지, Ham F-10배지, F-12 배지, RPMI-1640 배지, MCDB153 배지, 199배지 등의 종래의 공지의 세포배양용 기초 배지에, 필요에 따라 각 세포의 배양에 적합한 종래 공지의 성장 인자와 항산화제 등을 첨가한 것을 사용할 수 있다. 또한, 세포배양 배지는, 혈청을 첨가한 배지 또는 무혈청배지 모두 좋다.

세포의 접착을 촉진시키는 방법

본 발명의 지지체에 세포의 접착을 촉진시키는 방법은, 상기 화학식(I)에 기재된 디스피로트리피페라진(dispirotripiperazine) 유도체 또는 그의 염을 배지에 첨가 또는 지지체에 도포하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 지지체에 세포의 접착을 촉진시키는 방법의 태양은, 적합한 구체적 예로는, 상기 화학식(a)∼ (h)에 기재된 디스피로트리피페라진(dispirotripiperazine) 유도체 또는 그의 염을 배지에 첨가 또는 지지체에 도포하는 것을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 화학식(a), 및 (g)로 표시된 화합물 또는 그의 염을 배지에 첨가 또는 지지체에 도포하는 것이다.

본 발명의 지지체에 세포의 접착을 촉진시키는 방법의 지지체로는, 상기 설명한 지지체를 이용할 수 있다.

본 발명의 지지체에 세포의 접착을 촉진시키는 방법의 세포로서는, 상기 설명한 세포를 이용할 수 있다.

세포의 접착을 촉진시키기 위한 상기 디스피로트리피페라진(dispirotripiperazine) 유도체 또는 그의 염의 유효농도로는, 배양액 중에 바람직하게는 0.4∼400 μM정도, 보다 바람직하게는 0.4∼60 μM정도이며, 지지체 상에서 바람직하게는 0.03∼36.3 pmol/cm²정도, 보다 바람직하게는 0.30∼36.3 pmol/cm²정도다.

헤파란 설페이트(heparan sulfate)을 통한 세포접착 및 / 또는 세포증식의 작용제( agonist )

본 발명의 세포접착 및 / 또는 세포증식을 촉진하는 헤파란 설페이트(heparan sulfate) 작용제(agonist)는, 상기 화학식(I)에 기재된 디스피로트리피페라진(dispirotripiperazine) 유도체 또는 그의 염을 포함하는 것을 특징으로 한다.

헤파란 설페이트(heparan sulfate)는 단백질과 결합하여 프로테오글리칸(Proteoglycan)의 형태로 세포막의 보편적인 성분으로 널리 분포한다. 상기 디스피로트리피페라진(dispirotripiperazine) 유도체는 세포막 상의 헤파란 설페이트(heparan sulfate)에 결합하여 작용제(agonist)로서 작용하고, 세포접착 및 / 또는 세포증식을 유도할 수 있다.

본 발명의 세포접착 및 / 또는 세포증식을 촉진하는 헤파란 설페이트(heparan sulfate) 작용제(agonist)는, 바람직하게는 상기 화학식(a)∼ (h)에 기재된 디스피로트리피페라진(dispirotripiperazine) 유도체 또는 그의 염을 포함하고, 더욱 바람직하게는 화학식(a), 및 (g)로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 포함하는 것이다.

상기 작용제(agonist)를 사용하는 세포는, 세포막에 헤파란 설페이트(heparan sulfate)을 포함하는 것이라면 좋다. 세포를 배양하기 위한 지지체로서는 앞에서 언급한 지지체를 사용할 수 있다.

상기 작용제(agonist)의 세포배양용의 첨가량은, 상기 디스피로트리피페라진(dispirotripiperazine) 유도체 또는 그의 염의 유효농도로, 바람직하게는 배지에 0.4∼400 μM정도, 보다 바람직하게는 배지에 0.4∼60 μM정도다. 상기 작용제(agonist)의 세포를 배양하기 위한 지지체에의 코팅 양은, 디스피로트리피페라진(dispirotripiperazine) 유도체 또는 그의 염의 유효량으로서, 바람직하게는 0.03∼36.3 pmol/cm²정도, 보다 바람직하게는 0.30∼36.3 pmol/cm²정도다.

디스피로트리피페라진 ( dispirotripiperazine ) 유도체의 기타의 용도

상기 화학식(I)에 기재된 디스피로트리피페라진(dispirotripiperazine) 유도체 또는 그의 염은, 세포의 지지체에의 접착을 촉진시키는 활성을 가지는 것부터, 부유 성세포에 마이크로 인젝션을 할 때에 첨가하는 것으로 마이크로 인젝션의 성공률을 올릴 수 있다. 이에 의해, 부유성 세포에 유전자를 마이크로 인젝션으로 도입하는 것이 용이해진다.

디스피로트리피페라진 ( dispirotripiperazine ) 유도체 및 그의 염의 제조 방법

화학식(I)에서 나타낸 화합물 및 그의 염은, 예를 들면, 하기 화학식(III)의 화합물과 R¹-X¹ 및 R²-X²(X¹ 및 X²은 동일 또는 다른 이탈기(leaving group)이며, 예를 들면 Cl, Br등의 할로겐(halogen), p-툴루엔설포닐옥시, 메탄설포닐옥시등을 들 수 있다)와 반응시켜, 필요에 따라 생성물을 다른 화학식(I)의 화합물로 변환시켜 제조할 수 있다.

화학식(III)의 화합물과 R¹ 및 R²의 반응성 유도체와의 반응은, 용매 또는 무용매 하에서 진행된다. 사용하는 용매는, 원료 화합물의 종류 등에 따라서 선택되어야 하지만, 예를 들면 톨루엔(toluene), 테트라히드로푸란(tetrahydrofuran), 다이옥세인(Dioxane), 에틸렌글리콜디에틸에테르(Ethylene Glycol Diethyl Ether), 다이클로로메테인(dichloromethane), 클로로포름, 에틸아세테이트(ethyl acetate), 아세톤, 아세토나이트릴(acetonitrile), 디메틸포름아마이드(dimethylformamide), 1, 3- 디메틸 -2-이미다졸리디논(imidazolidinone) 및 1-메틸-2-피롤리디논(pyrrolidinone)을 들 수 있다. 이 용매는 단독으로, 또는 2종 이상 혼합해서 이용할 수 있다.

본 반응은 필요에 따라 염기 존재 하에서 행하여진다. 염기의 구체적인 예로는, 트리아틸아민(Triethylamine), 에틸디이소프로필아민(ethyldiisopropylamine), N-메틸모르폴린(methylmorpholine), 피리딘(pyridine), 4-디메틸아미노피리딘(Dimethylaminopyridine)과 같은 유기염기를 들 수 있다.

반응 온도 및 반응 시간은 이용하는 원료 화합물의 종류 등에 따라 다르지만, 일반적으로, 반응 온도는 약 0℃∼ 약 150℃이며, 반응 시간은 약 0.5시간∼ 약 72시간이다.

화학식(III)의 화합물과 R¹ 및 R²의 반응성 유도체와의 반응시 몰 비는, 원료화합물의 종류 등에 따라 다르지만, 통상, 1:1.2∼1:20, 보다 바람직하게는 1:2∼1:10이다.

화학식(e)로 나타낸 디스피로트리피페라진(dispirotripiperazine) 유도체와 같은 디스피로트리피페라진(dispirotripiperazine)이 2개 결합된 화합물을 제조하는 경우에는, 상기 화학식(III)의 화합물과 R^1a-X¹X²(X¹ 및 X²은 상기와 같은 정의다)와 반응시켜, 원하는 생성물을 다른 디스피로트리피페라진(dispirotripiperazine) 유도체가 2개 결합한 화학식(I)의 화합물로 변환시키는 것에 의해 제조할 수 있다.

이 경우 화학식(III)의 화합물과 R^1a의 반응성 유도체와의 반응시 몰 비는, 원료 화합물의 종류 등에 따라 다르지만, 일반적으로, 600:1∼2:1, 보다 바람직하게는 200:1∼2:1이다.

R¹, R² 및 R^1a의 구조에 있어서 반응에 관여하는 작용기가 존재할 경우에는, 그것들을 통상적인 방법에 따라서 보호해 두고, 반응 종료 후에 보호기를 제거시키는 것이 바람직하다.

상기 제법에 있어서의 원료화합물로 화합물(III), 및 R¹, R² 및 R^1a의 반응성 유도체는, 자체 공지의 방법으로 제조할 수 있고, 시판되고 있으므로 용이하게 입수할 수 있다.

상기 화학식(III)의 화합물과 R¹, R² 및 R^1a의 반응성 유도체를 반응시킨 후에, 단실 하이드라진(dansyl hydrazine) 유도체화 시킬 수 있다. 이 반응은, 단실 하이드라진(dansyl hydrazine) 유도체화 반응은 일반적으로 사용되는 반응 조건하에서 할 수 있다.

상기 화학식(III)의 화합물과 4, 6-디클로로(dichloro)-2- (메틸티오(methylthio)) 피리미딘(pyrimidine)-5-카르본산을 반응시킨 후에, 카르본산 부분을 활성 에스테르화하고, RGD(아르기닌(alginin)-글리신(glycine)-아스파라긴산) 펩티드(peptide) 유도체, RGD 펩티드(peptide) 모방체 등을 반응시켜, 아데사민(adhesamine)에 인테그린(integrin) 결합 활성을 갖는 물질을 결합시킬 수 있다. 이 반응은 활성 에스테르 아민의 결합 반응으로 일반적으로 사용되는 반응조건에서 할 수 있다.

상기제조 방법 혹인 이에 준하는 제조 방법으로 생성되는 화학식(I)의 화합물은, 크로마토그래피, 재결정, 재침전 등의 통상에 방법에 따라서 단리·정제할 수 있다. 통상에 방법에 따라서 다양한 산과 처리하여 염으로 이끌 수 있다. 또한, 화학식(I)의 화합물은, 반응·처리 조건 등에 따라, 염의 형태로 얻을 수 있지만, 통상에 방법에 따라서 화학식(I)의 화합물로 변환할 수 있다.

실시예

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 위하여 실시예 및 시험예를 제시한다. 그러나 본 발명은 실시예 등에 의해 한정되는 것이 아니다.

실시예 1

아데사민(adhesamine)(1) 디트리플루오로아세트산염은 250 μL의 다이옥세인(Dioxane)에 용해한 4, 6-디클로로(dichloro)-2- (메틸티오(methylthio))-5-포밀피리미딘(formylpyrimidine)(9.5 mg, 42.7 μmol)에 100μL의 3, 12-디아자(Diaza)-6, 9-디아조니아스피로(diazoniaspiro)- (5, 2, 5, 2)-헥사데칸(hexadecane) 2 브로마이드(bromide)(7.5 mg, 19.4μmol)수용액 및 6μL의 트리아틸아민(Triethylamine)을 추가하여 합성했다. 실온에서 3시간 교반 후, 500μL의 아세톤을 첨가하여, 석출한 흰색 고체를 아세톤으로 씻고, 역상 HPLC(GL science, Inertsil ODS-3, 4.6 mm × 150 mm, 유속 1.0 mL/min, 0.1% TFA MeOH/H2O, 0→100%)로 정제하고, 흰색 고체로 아데사민(adhesamine)(1) 디트리플루오로아세트산염을 얻을 수 있었다 (11.1 mg, 수율 69%). 1H NMR(300 MHz, CD3OD)δ 2.58(s, 6H), 3.82-4.12 (m, 16H), 4.24-4.31 (m, 8H), 10.3(s, 2H);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ 14.7, 37.6, 42.2, 51.8, 108.1, 161.9, 164.6, 174.2, 187.8; FABMS(NBA) [M2+] m/z = 299; HRMS (FAB) calcd. for C24H32Cl2N8O2S2 [M2+] m/z = 299.0734, found 299.0724

실시예 2

화합물(3) 디트리플루오로아세트산염은 100μL의 메탄올에서 아데사민(adhesamine)이 2 염화물(1, 5.8 mg, 8.6μmol)에 테트라하이드로보레이트 나트륨(tetrahydroborate Sodium)(0.6 mg, 16.7 μmol)을 첨가하고, 실온에서 30분 교반하여 합성했다. 반응 혼합물에, 500 μL의 아세톤을 첨가하고, 석출한 흰색 고체를 아세톤으로 씻고, 역상 HPLC(GL science, Inertsil ODS-3, 4.6 mm × 150 mm, 유속 1.0 mL/min, 0.1% TFA MeOH/H2O, 0→100%)에서 정제하고, 흰색 고체로 화합물(3) 디트리플루오로아세트산염을 얻을 수 있었다(3.8 mg, 수율 56%). 1H NMR(300 MHz, CD3OD)δ 2.57(s, 6H), 3.97 (m, 8H), 4.25 (m, 16H), 4.67(s, 4H); FABMS (NBA) [M2+] m/z = 301; HRMS (FAB) calcd. for C24H36Cl2N8O2S2 [M2+] m/z = 301.0890, found 301.0897.

실시예 3

화합물(4) 디트리플루오로아세트산염은 0.1% TFA를 포함하는 메탄올에 아데사민(adhesamine)이 2 염화물(1, 3.0 mg, 4.5 μmol)과 단실 하이드라진(dansyl hydrazine)(2.3 mg, 8.6μmol)을 혼합하고, 65도로 3시간 과열해서 합성했다. 반응 혼합물에 500 μL의 아세톤을 첨가하고, 석출한 흰색 고체를 아세톤으로 씻고, 역상 HPLC(GL science, Inertsil ODS-3, 4.6 mm × 150 mm, 유속 1.0 mL/min, 0.1% TFA MeOH/H2O, 0→100%)에서 정제하고, 흰색 고체로 화합물(4) 디트리플루오로아세트산염을 얻을 수 있었다(2.4 mg, 수율 49%). 1H NMR(300 MHz, CD3OD)δ 2.55(s, 6H), 2.91(s, 12H), 4.04-4.07 (m, 16H), 4.28-4.30 (m, 8H), 7.32(d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.61(t, J = 8.1 Hz, 2H), 7.66(t, J = 7.6 Hz, 2H), 8.27(s, 2H), 8.31(d, J = 7.6, 2H), 8.40(d, J = 7.6, 2H), 8.63(d, J = 8.1, 2H); FABMS (NBA) [M2+] m/z = 546; HRMS (FAB) calcd. for C48H58Cl2N14O4S4 [M2+] m/z = 546.1513, found 546.1523.

실시예 4

화합물(5) 디트리플루오로아세트산염은 250 μL의 다이옥세인(Dioxane)에 용해한 염화단실(dansyl)(3.6 mg, 13.5 μmol)에 100 μL의 3, 12-디아자(Diaza)-6, 9-디아조니아스피로(diazoniaspiro)- (5, 2, 5, 2)-헥사데칸(hexadecane) 2 브로마이드(bromide)(2.4 mg, 6.2μmol) 수용액 및 2.2μL의 트리아틸아민(Triethylamine)을 추가 합성했다. 실온에서 3시간 교반한 후, 500μL의 아세톤을 더해, 석출한 흰색 고체를 아세톤으로 씻고, 역상 HPLC(GL science, Inertsil ODS-3, 4.6 mm × 150 mm, 유속 1.0 mL/min, 0.1% TFA MeOH/H2O, 0→100%)에서 정제하고, 흰색 고체로서 화합물(5) 디트리플루오로아세트산염을 얻었다 (3.6 mg, 수율 82%). 1H NMR( 300 MHz, CD3OD)δ 2.93(s, 12H), 3.76-3.90 (m, 16H), 3.95-4.10 (m, 8H), 7.35(d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.58(d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.64(t, J = 7.7 Hz, 2H), 8.33(d, J = 7.7, 2H), 8.42(d, J = 7.7, 2H), 8.72(d, J = 8.0, 2H); FABMS (NBA) [M2+] m/z = 346; HRMS (FAB) calcd. for C36H48N6O4S2 [M2+] m/z = 346.1589, found 346.1592.

실시예 5

화합물(6) 디트리플루오로아세트산염은 250 μL의 다이옥세인(Dioxane)에 용해한 4, 6-디클로로(dichloro)-5-니트로피리미딘(nitropyrimidine)(5 mg, 25.7 μmol) 100μL의 3, 12-디아자(Diaza)-6, 9-디아조니아스피로(diazoniaspiro)- (5, 2, 5, 2)-헥사데칸(hexadecane) 2 브로마이드(bromide)(4.5 mg, 11.7 μmol)수용액 및 4 μL의 트리아틸아민(Triethylamine)을 추가하여 합성했다. 실온에서 3시간 교반한 후, 500μL의 아세톤을 더해, 석출한 흰색 고체를 아세톤으로 씻고, 역상 HPLC(GL science, Inertsil ODS-3, 4.6 mm × 150 mm, 유속 1.0 mL/min, 0.1% TFA MeOH/H2O, 0→100%)에서 정제하고, 백색 고체로 화합물(6) 디트리플루오로아세트산염을 얻을 수 있었다(3.2 mg, 수율 36%). 1H NMR(300 MHz, DMSO-d6) 3.92-4.00 (m, 16H), 4.10-4.21 (m, 8H), 8.64(s, 2H); FABMS (NBA) [M2+] m/z = 270.

실시예 6

화합물(7) 사염화물은 250μL의 다이옥세인(Dioxane)에 용해한 4, 6-디클로로(dichloro)-5-니트로피리미딘(nitropyrimidine) (1.2 mg, 6.2μmol) 100μL의 3, 12-디아자(Diaza)-6, 9-디아조니아스피로(diazoniaspiro)- (5, 2, 5, 2)-헥사데칸(hexadecane) 2 브로마이드(bromide)(4.8 mg, 12.3μmol)수용액 및 4 μL의 트리아틸아민(Triethylamine)을 추가하여 합성했다. 실온에서 30분 교반한 후, 95℃로 가열해서 1시간 교반하고, 500 μL의 아세톤을 첨가하고, 석출한 흰색 고체를 아세톤으로 씻고, 흰색 고체로 화합물(7) 사염화물을 얻을 수 있었다(3.8 mg, 수율 85%). 1H NMR( 300 MHz, D2O) 3.07-3.19 (m, 8H), 3.51-3.65 (m, 8H), 3.72-4.20 (m, 40H); ESIMS (pos.) [M4+] m/z = 143.

실시예 7

화합물(8) 사염화물은 125 μL의 다이옥세인(Dioxane)에 용해한 4, 6-디클로로(dichloro)-2- (메틸티오(methylthio))-5-포밀피리미딘(formylpyrimidine) (0.6 mg, 2.9μmol)에 50μL의 화합물 7 사염화물(0.9 mg, 1.3μmol)수용액 및 1μL의 트리아틸아민(Triethylamine)을 추가하여 합성했다. 실온에서 3시간 교반한 후, 500 μL의 아세톤을 첨가하고, 석출한 흰색 고체를 아세톤으로 씻고, 흰색 고체로 화합물(8) 사염화물을 얻을 수 있었다 (0.8 mg, 수율 56%). 1H NMR( 300 MHz, D2O) 2.42(s, 6H), 3.75-4.20 (m, 48H), 8.02(s, 1H), 10.00(s, 2H); ESIMS (pos.) [M4+] m/z = 236.

실시예 8

화합물(9) 디트리플루오로아세트산염은 얼음으로 빙랭시킨 500 μL의 다이옥세인(Dioxane)에 용해한 염화 사이아눌(cyanuric)(18.0 mg, 97μmol) 200μL의 3, 12-디아자(Diaza)-6, 9-디아조니아스피로(diazoniaspiro)- (5, 2, 5, 2)-헥사데칸디트리플루오로아세트산염(20 mg, 44μmol) 수용액 및 12μL의 트리아틸아민(Triethylamine)을 추가하여 합성했다. 0도에서 2시간 교반한 후, 500 μL의 아세톤을 첨가하고, 석출한 흰색 고체를 아세톤으로 씻고, 흰색 고체로 화합물(9) 디트리플루오로아세트산염을 얻을 수 있었다 (25 mg, 수율 77%). 1H NMR(300 MHz, DMSO-d6) 3.75-3.98 (m, 8H), 4.10-4.13 (m, 8H), 4.15-4.20 (m, 8H); ESIMS [M2+] m/z = 261.

실시예 9

(A) NBS, AIBN, 리플럭스(reflux); (B) DMF,실온; (C) EDC, HOBT, DMF; (D)(i) H2, Pd-C (5%, w/w), MeOH, (ii)0.01 Min DMSO, 130℃ ;(E)(i) TFA, 아니솔(anisole), CH2Cl2, (ii) iPr2NEt, DMF; (F)(i) EDC, HOBT, DMF; (G)2M NaOH, MeOH-THF (1:1); (H) Et3N, 디옥산(Dioxane)-H2O,80℃; (I) DCC, N-히드록시숙신이미드(Hydroxysuccinimide), THF ; (J)(i) TFA,아니솔(anisole), CH2Cl2, (ii) Et2N, CH3CN, 실온

１(9.85 g)와 N-브롬호박산이미드(Bromosuccinimide)(10 g), AIBN(0.41 g)를 CCl4 내에서, 24시간 리플럭스(reflux)했다. 반응 혼합물을 세라이트(celite) 여과하고, 용매를 농축 후, 조생산물(crude product) 2를 얻었다.

DMF에 용해한 2(5 g)에 3(3 g)을 떨어뜨려 추가하였다. 실온에서 3시간 교반한 후, 용매를 농축하고, 물과 에틸아세테이트에서 액체 분배 후 유기층을 농축하였다. 얻어진 잔사를 실리카겔컬럼크로마토그래피에서 정제하고, 4(304 mg)를 얻었다. MS(ESI) 369(M+)

EDC (194 mg), HOBT(145 mg)을 4(304 mg) 및 5(264 mg)의 DMF용액과 함께, 24시간 실온에서 교반한 후, 물과 에틸아세테이트에서 액체 분배 후 유기층을 농축하였다. 얻어진 잔사를 실리카겔컬럼크로마토그래피에서 정제하고, 6(327 mg)을 얻었다. MS (ESI) 654(MNa+)

Pd-C(5% w/w, 130 mg)를 6(327 mg)의 MeOH용액에 첨가하고, 수소치환을 하고, 24시간 교반 하였다. 반응 혼합물을 여과 후, 용매를 농축하고, 잔기를 실리카겔컬럼크로마토그래피에서 정제하고, 탈 칼보벤질옥시기(carbobenzyloxy)형태(200 mg)를 얻었다. 이것을 무수 DMSO에 용해하고, 130도까지 가열하고, 16시간 교반한 후, 물과 에테르로 액체 분배 후 유기층을 농축하였다. 얻어진 잔사를 실리카겔컬럼크로마토그래피에서 정제하고, 7(60 mg)을 얻었다. MS (ESI) 500(MNa+)

TFA 7(60 mg)의 CH2Cl2 용액에 첨가하여, 실온하에서 7시간 교반한 후, 용매를 농축하고, 조생성물을 DMF에 용해했다. 이에 8(60 mg) 및 iPr2Net(0.2 mL)을 첨가하고, 실온하에서 4시간 교반하였다. 반응 혼합물을 물과 에틸아세테이트에서 액체 분배 후 유기층을 농축한 후, 실리카겔컬럼크로마토그래피에서 정제하고, 9(52 mg)를 얻었다.

EDC(84 mg), HOBT(59 mg) 및 NMM(0.19 mL)을 10(155 mg) 및 9(50 mg)의 DMF용액에 첨가하고, 3시간 교반한 후, 물과 에틸아세테이트에서 액체 분배 후 유기 층을 농축하였다. 그 후, 잔사를 실리카겔컬럼크로마토그래피에서 정제하고, 11(104 mg)을 얻었다.

NaOH(18 mg)을 용해한 물(0.5 mL)을 THF-MeOH(1:1, 2 mL)에 용해한 11(50 mg)을 추가하고, 16시간 교반한 후, 아세트산 0.2 mL을 첨가했다. 용매를 농축 제거 후, 실리카겔컬럼크로마토그래피에서 정제하고, 12(32 mg)를 얻었다. MS (ESI) 687(MNa+)

14(6.8 mg)의 다이옥세인(Dioxane) 용액에 13의 브로마이드 염(5 mg)의 수용액을 첨가하고, 15분 교반한 후, 5 μL의 트리아틸아민(Triethylamine)을 첨가하고, 한번 더 5시간 80도로 교반하였다. 반응 혼합물을 아세톤으로 씻고, 역상 HPLC로 정제하고, 15(4 mg)를 얻었다. MS (ESI) 315(M2+)

15(2 mg) 및 N-히드록시숙신이미드(1.2 mg), DCC(2.3 mg)의 THF용액을 실온하에서 3시간 교반하고, 용매를 농축 제거했다.

12(10 mg)를 CH2Cl2에 용해하고, TFA를 첨가하여, Boc기를 제거했다. 용매를 농축하고, 그대로 다음 반응에 이용했다. 수득한 조생성물 16(1.2 mg)의 아세토나이트릴(acetonitrile)용액에 12의 탈Boc형태(1.6 mg) 및 트리아틸아민(Triethylamine) 10 μL을 첨가하고, 0도로 4시간 교반한 뒤, 용매를 농축 제거했다. 이것을 역상 HPLC로 정제하고, 화합물(10)(2.4 mg)을 얻었다. MS (ESI) 788(M2+)

재료

3, 12-디아자(Diaza)-6, 9-디아조니아스피로(diazoniaspiro)- (5, 2, 5, 2)-헥사데칸(hexadecane) 2 브로마이드(bromide)(화합물 3)는 Sigma-Aldrich사에서 구입했다. 4, 6-디클로로(dichloro)-5-니트로피리미딘(nitropyrimidine), 염화단실(dansyl), 염화 사이아눌(cyanuric), 테트라하이드로보레이트 나트륨은 와코쥰야쿠공업(和光純藥工業) 주식회사에서 구입했다. 4, 6-디클로로(dichloro)-2- (메틸티오(methylthio))-5-포밀피리미딘(formylpyrimidine)은 Toronto Research Chemicals로부터 구입했다. 단실 하이드라진(dansyl hydrazine)은 도쿄(東京) 화성공업 주식회사에서 구입했다. 화합물 1, 3, 4 및 5는, 앞에서 설명한 방법으로 제작했다. 아데사민(adhesamine) 및 그 유도체(2-5)는 DMSO에 희석하고, 농도조정을 하고, 세포접착분석 및 ITC 측정에 제공했다. 연어 가죽 유래 타입 I 콜라겐 및 소 혈장 유래 피부로넥틴(fibronectin)(와코쥰야쿠공업(和光純藥工業) 주식회사), 폴리-L-리신(lysine) 염산염(주식회사 펩티드(peptide) 연구소), 폴리-L-오르니틴(ornithine) 브롬수소산염(MP Biomedicals, Inc.)은 Milli-Q물에 용해하고, 사용하기 전까지 -20℃로 저장했다. 헤파린(평균 분자량(Mw), 18.0 kDa) 및 헤파란 설페이트(heparan sulfate)(Mw, 13.6 kDa)은 나트륨 염을 각각, MP Biomedicals Inc. 및 Celsus사에서 구입했다. 콘드로이틴(chondroitin) 설페이트 A(Mw, 37.5 kDa), 케라탄 설페이트(keratan sulfate)

(Mw, 30.0 kDa) 및 히알루론산(hyaluronic acid)(Mw, 125.0 kDa)은 생화학공업(生化學工業) 주식 회사에서 구입했다. 토끼항FAK(C-20)항체 및 토끼항 ERK(C-16)항체는 Santa Cruz Biotechnology로부터 구입했다. 마우스항FAK(포스포-티로신(phosphotyrosine)397)항체는 BD Biosciences Pharmingen으로부터 수득하였다. 토끼항 ERK1/2포스포-트레오닌(phosphothreonine)²⁰²/티로신(tyrosine)²⁰⁴(pERK)항체는 Cell Signaling Technology로부터 구입했다. 항토끼 및 항마우스 면역 글로불린G(IgG)(서양 고추냉이 페록시다제(peroxidase) 결합 완전항체)와 ECL Plus Western blotting detection reagents는 GE Healthcare로부터 구입했다. 합성 RGD특이적 펩티드(peptide)(GRGDTP)은 시그마사에서 구입했다.

세포배양 및 저 분자 화합물 스크리닝

HepG2 세포는 10% 소 태아혈청(FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(streptomycin)을 첨가한 MEM을 배지로 해서 37℃, 5% CO2 존재하에서 배양했다. 저켓(Jurkat) 세포는 10% 소 태아혈청(FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(streptomycin)을 첨가한 RPMI-1640을 배지로 해서 37℃, 5% CO2존재하에서 배양했다. 저분자 화합물의 스크리닝은 20μg/mL의 농도로 각 화합물을 첨가한 96웰 플레이트에, HepG2현탁액(2×105 세포(cells)/mL) 100 μL을 시당(seeding)하고, 3, 16, 24 시간 후 현미경하에서 표현계 변화를 관찰했다. CHO K1세포와 CHO 결손 변이주는 7.5% 소 태아혈청을 추가한 Ham's F-12 배지에서 유지되었다.

세포접착분석

첨가에 의한 분석-50, 500 및 5000μg/mL의 농도로 아데사민(adhesamine)(1), 타입 I 콜라겐, 폴리-L-리신(lysine) 염산염, 폴리-L-오르니틴(ornithine) 브롬수소산염 및 피부로넥틴(fibronectin) 수용액 1μL 을 96웰 플레이트에 첨가하고, 여기에 HepG2 현탁액(4×105cells/mL) 100 μL을 추가하였다. 3시간 37℃로 배양한 후, 접착하지 않고 있는 세포를 3회 PBS로 웰(well)을 세척하여 제거하고, 접착한 세포수를 Neubauer counting chamber(Digital Bio)에서 카운트했다. 저켓(Jurkat) 세포에 대해서는 100μL의 세포현탁액을 각각의 웰(well)에 1×106 세포(cells)/mL의 농도로 시딩(seeding)하고, 5시간 37℃로 배양한 뒤, PBS에서 2회 웰(well)를 세척하고 접착하지 않은 세포를 제거하고, 접착한 세포수를 Neubauer counting chamber(Digital Bio)에서 카운트했다. 접착율을 산출하기 위해서, 최초에 시당(seeding)한 세포수를 100%로 했다. 대조 실험은 1μL의 DMSO만을 첨가한 웰(well)에서 진행되었다. 각각의 분석을 3회 하고, 평균치 및 표준편차를 산출했다.

CHO 야생형 및 결손 변이주에 대해서는, 배양 배지에서 트립신(trypsin) 처리된 100μL의 세포 현탁액을 각각의 웰(well)에 2 × 105 세포(cells)/mL의 농도로 시딩(seeding)하고, 5시간 37℃로 배양한 뒤, PBS에서 2회 웰(well)를 세척하고 접착하지 않는 세포를 제거하고, 접착한 세포수를 Neubauer counting chamber(Digital Bio)에서 카운트했다. 접착율을 산출하기 위해서, 세척전의 세포수를 100%로 했다. 각 분석을 3회 하고, 최저 3회의 독립한 실험에 의해 평균치 및 표준편차를 산출했다.

코팅에 의한 분석-각 실험자료(아데사민(adhesamine)(1), 타입 I 콜라겐, 폴리-L-리신(lysine) 염산염, 폴리-L-오르니틴(ornithine)브롬수소산염 및 피부로넥틴(fibronectin))의 농도조제는 1%의 DMSO를 포함하는 10 mM PBS 에 의해 희석하였다. 100μL의 각각의 용액(1, 10, 및 100 μg/mL)을 96 웰(well)에 첨가하고, 밤새 4℃로 배양한 후, 웰(well)를 Milli-Q 물에서 2회 세척하였다. 100 μL의 저켓(Jurkat) 세포 현탁액(1×106 세포(cells)/mL)을 코팅을 한 웰(well)에 시딩(seeding)하고, 5시간 37℃로 배양한 후, PBS에서 2회 웰(well)을 세척하고 접착하지 않는 세포를 제거하고, 접착한 세포수를 Neubauer counting chamber(Digital Bio)에서 카운트했다.

아데사민(adhesamine)과 그 유도체와의 세포접착 촉진 활성의 비교는 시약첨가에 의한 분석에서 Jurkat세포를 이용하였다. 60 μM, 600 μM, 6000 μM의 농도로 조제한 화합물의 DMSO용액 1 μL을 96 웰플레이트에 첨가하고, 여기에 저켓(Jurkat) 현탁액(1×106 세포(cells)/mL) 100 μL을 더했다. 5시간 37℃로 배양한 뒤, PBS에서 2회 웰(well)을 세척하고 접착하지 않는 세포를 제거하고, 접착한 세포수를 Neubauer counting chamber(Digital Bio)에서 카운트했다. 접착율을 산출하기 위해서, 최초에 시딩(seeding)한 세포수를 100%로 했다. 대조 실험은 1 μL의 DMSO만을 첨가한 웰(well)에서 진행되었다. 각각의 분석을 3회 하고, 평균치 및 표준편차를 산출했다.

경합 저해 시험

아데사민(adhesamine) (1, 0.6 nmol)와 0.006으로부터 12 nmol까지 농도를 내린 각종 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)(GAG) (헤파린, 헤파란 설페이트(heparan sulfate), 콘드로이틴(chondroitin) 설페이트, 케라탄 설페이트(keratan sulfate), 히알루론산(hyaluronic acid) 및 헤파린 올리고 당)을 10 μL의 100 mM NaCl과 1% DMSO를 포함하는 50 mM 인산 버퍼(pH 6.0)에서 보텍스(vortex) 믹서로 실온에서 30분 교반한 후, 각각의 혼합물을 96 웰플레이트에 옮기고, 90 μL의 저켓(Jurkat) 세포현탁액(1×105 cells/mL)을 추가하였다. 5시간 37℃로 배양한 후, PBS에서 2회 웰(well)을 세척하고 접착하지 않는 세포를 제거하고, 접착한 세포수를 Neubauer counting chamber(Digital Bio)에서 카운트했다. 저해율을 산출하기 위해서, 각 시료를 첨가하여 접착이 인정되는 세포수에서, 1%의 DMSO만 또는 1%의 DMSO와 각 농도의 GAG만을 추가한 웰(well)에 있어서의 접착 세포수를 뺐다. 저해율은 다음 식으로 나타내진다.

여기서, AC+ (-)GAGs, + (-)아데사민(adhesamine)은 GAGs 및 아데사민(adhesamine)의 존재화(비존재화)에서의 접착 세포수를 나타낸다. IC 50 값은 6 μM의 아데사민(adhesamine)이 유도하는 접착 활성을 50% 저해하는 각 GAG의 농도로 한다. 결과를 GAG의 농도의 로그에 대하여, 저해율을 플롯하고, 복수의 독립한 실험에 바탕으로, 얻어진 곡선에서 IC 50을 찾았다.

ITC 측정은 25℃로 MicoCal VP-ITC 마이크로 칼로리미터(calorie meter)를 사용하였다. 아데사민(adhesamine)(15μM) 10 μL을 25회, GAG(2.7 mM의 헤파란 설페이트(heparan sulfate), 헤파린, 콘드로이틴(chondroitin) 설페이트, 히알루론산(hyaluronic acid)산 및 헤파린 올리고당)에 주입하여, 적정을 실시하였다. 적정은 100 mM NaCl 및 1% DMSO를 포함하는 50 mM 인산 버퍼(pH 6.0)에서 실시했다. GAGs는 중합도에 따라 분자량에 편차가 있기 때문에, 이를 보정한 다음, ITC에 있어서의 열 흐름을 비교할 필요가 있다. 따라서 GAGs의 경우의 몰 농도는, 2당 단위의 농도를 나타내고 있다.

세포박리 분석

아데사민(1) DMSO용액 1 μL(6 mM)가 96 웰플레이트의 각 웰(well)에 공급되었다. 저켓(Jurkat) 세포가 증식 배지에 현탁되고, 세포현탁액의 100 μL을 각 웰(well)에 1×106 세포(cells)/mL의 농도로 첨가되었다. 37℃로 5시간 인큐베이션(incubation)한 후, 배지가 흡인되고, 플레이트를 PBS로 2회 세척하였다. 새로운 배지 100 μL를 각 웰(well)에 첨가하였다. 한번 더 37℃로 4, 8, 14 및 24시간 인큐베이션(incubation)한 후, 비접착 세포가 2회 PBS로 세척하여 제거되어, 접착 세포가 Neubauer counting chamber에서 카운트되었다. 접착율을 계산하기 위해서, 세척전의 세포수가 100%의 값으로 하였다. 각 분석은 3회 행하였고, 평균과 표준편차가 최저 3회의 독립한 실험으로 계산되었다.

공초점현미경

HepG2세포 현탁액(100μL)을 96 웰플레이트(Greiner bio-one)에 2×105 세포(cells)/mL의 세포밀도로 시딩(seeding)하고, 화합물 4 및 5(6μM)과 함께 3시간 37℃로 배양했다. 인큐베이션(incubation)한 후, 배지 교환을 한 후, 형광현미경관찰에 올려놓았다. 현미경 상은 Yokogawa 사의 USC 22 공초점형광현미경으로 여기 파장 405 nm으로 행하였다.

세포의 효소처리

저켓(Jurkat) 세포(5×104)는 RPMI의 100 μL에서 배양되었고, 실온에서 30분간, 헤파리나아제(heparinase), 헤파리티나아제 I(heparitinase I) 및 헤파리티나아제 II의 병용(0.02 units/mL) 또는 콘드로이티나아제 ABC(chondroitinase ABC)(0.1 units/mL)로 처리되었다. 처리된 세포의 아데사민(adhesamine)에 반응하는 능력은 아데사민(adhesamine)의 존재하(6μM)에 96 웰플레이트의 플라스틱 웰에 접착한 세포를 카운트하는 것에 의해 평가되었다.

세포증식 분석

아데사민(adhesamine)(1)의 DMSO용액 1μL가 600μM의 농도로 96 웰플레이트에 첨가되었다. HepG2세포와 저켓(Jurkat) 세포는 증식 배지에 현탁되고, 100 μL의 세포 현탁액이 각각 2×105 세포(cells)/mL 및 4×105 세포(cells)/mL의 농도로 각 웰(well)에 첨가되었다. 표시된 시간을 인큐베이션(incubation)한 후, 세포생존도는 살아있는 세포 중에 NADH 데히드로게나제(Dehydrogenase)에 의해 수용성포르마잔(formazan) 색소를 생성하는 테트라졸리움(Tetrazolium)염(WST-8)을 포함하는 Cell Counting Kit-8(Dojindo Molecular Technologies, Inc. , Gaithersburg, MD)을 사용해서 측정되었다. 5 μl의 WST-8분석용액이 각 웰(well)당 100 μl의 증식 배지에 첨가되고, 4시간 배양되었다. 용액의 광학 밀도(OD)는, 450 nm의 측정 파장과 650 nm의 참조 파장을 사용해서 마이크로플레이트 리더(Microplate Reader)에서 읽혀졌다. 1% (v/v)의 DMSO를 포함하여 증식 배지에서 배양되는 세포생존도가 100%의 값으로 하였다. 각 분석은 3회 수행하였고, 평균과 표준편차가 최저 3회의 독립한 실험에서 계산되었다.

로다민 ( rhodamine ) 표지 팔로이딘(phalloidin)에 의한 액틴 ( actin ) 골격의 가시화

저켓(Jurkat) 또는 HepG2세포가 아데사민(adhesamine)(6 μM)의 존재 하에서 커버 유리에 뿌려졌다. 각각 3 또는 5시간 후에 20분간 4% 파라포말더하이드(paraformaldehyde)를 사용해서 고정되었다. 세포막은 (PBS중의) 0.1% triton X-100에서 5분간의 처리에 의해 투과화되었다. 샘플은 PBS로 2회 세척되고, 제조회사의 사용 설명서(Invitrogen)에 따라 액틴(actin) 세포골격이 로다민(rhodamine)표지 팔로이딘(phalloidin)으로 가시화되었다. 세포사진은 588 nm 레이저 여기를 이용한 Yokogawa CSU22 공초점형광현미경으로 확인하였다.

세포골격저해

저켓(Jurkat) 세포(5×104)는 100 μL의 RPMI에서 배양되어, 37도에서 사이토카라신B(cytochalasinB)B(0-100μM) 또는 노코다졸(nocodazole)(0-0.5μM)과 함께 배양되었다. 처리된 세포는, 아데사민(adhesamine)(6μM)에 대한 반응이 분석되었다. 피부로넥틴(fibronectin)또는 폴리-L-리신(lysine)으로 코팅된 플레이트에서 반응도가 평가되었다. 코팅된 플레이트는 피부로넥틴(fibronectin) 또는 폴리-L-리산(lysine)(1 ng/웰(well))로 96 웰플레이트의 웰(well)에 전처리하여 준비되었다.

웨스턴 블롯팅 ( Western blotting )

저켓(Jurkat) 세포는 10% FBS가 포함된 RPMI 배지에서 유지되었다. 5-600만의 저켓(Jurkat) 세포가 최종용량 2 mL에서 6 웰플레이트의 웰(well)에 공급되어, 아데사민(adhesamine) 또는 폴리-L-리신(lysine)의 존재하에서 0-5시간 37도로 배양되었다. 비접착 세포는 제거되고, 펠렛(pellet)화되었다. 나머지의 접착 세포는 4% SDS, 10% 글리세롤, 0.006% 브로모페놀블루(Bromophenol blue) 및 1.8% β-메르캅토에탄올(mercaptoethanol)를 포함하는 125 mM의 Tris-HCl 버퍼(pH 6.8)로 용해되었다. 접착 세포의 호모제네이트(homogenate) 같은 웰(well)로부터의 펠렛(pellet)화된 비접착 세포와 혼합되어, 혼합된 샘플은 5분간 끓여졌다. 샘플은 SDS-PAGE에 의해 분리되어, 니트로(nitro)셀룰로오스(nitrocellulose) 막에 일렉트로블롯되었다. 막은 1% BSA에 의해 차단되고, 일차항체와 함께 배양되고, 그 후로 부터 서양 고추냉이 페록시다제(peroxidase) 결합 ２차항체와 함께 배양되었다. 블롯은 증강한 화학발광 기술을 사용해서 현상되었다.

마이크로인젝션( microinjection )

아데사민(adhesamine)(1), 타입 I 콜라겐, 폴리-L-리신(lysine) 염산염, 및 피부로넥틴(fibronectin)의 용액이, 1% (v/v) DMSO를 포함하는 PBS에서 희석됨으로써 조제되었다. 각 용액은 10 μL(1 mg/mL) 유리 바닥 배양 접시(dish)(35 mm미 코팅 접시(dish))에 첨가되었다. 배양 배지 중의 세포현탁액 2 mL, 2×105 세포(cells)/mL의 농도로 각 웰(well)에 첨가되었다. 37도로 14시간 인큐베이션(incubation)한 후, 5 mg/mL의 농도로 Alexa Fluor 594(Molecular Probes, USA), CI-2000 자동화세포 인젝션 시스템(후지쯔)을 사용하여 저켓(Jurkat) 세포에 주입되었다. 마이크로 인젝션의 성공률은, 인젝션 시스템의 형광현미경의 표시를 통해서 형광세포의 직접적인 관찰에 의해 평가되었다. 표시된 데이터는, 최저 3회의 실험의 평균 ± SD다. 20의 세포가 각 실험으로 주입되었다.

시험예 1

아데사민(adhesamine)의 존재하에서, HepG2 세포가 배양 플레이트 상에서 접착이 강해지는 것이 관찰되었다 (도 1A, B). 세포접착을 촉진하는 것을 확인하기 위해서, 트립신(trypsin)을 처리하여 플레이트로부터 탈착한 HepG2 세포를 0.6-60μM의 아데사민(adhesamine)의 존재하에서 배양하고, 재접착의 정도를 평가했다. HepG2 세포가 배양 플레이트 상에 접착하기 시작하는 시간을 고려하여, 배양시간을 3시간으로 하였다. 3시간 후, 플레이트를 인산완충액으로 세척하고, 접착하지 않은 세포를 제거한 후, 플레이트 위에 남은 접착 세포의 수를 측정하였다.¹ 그 결과, 아데사민(adhesamine)은 HepG2 세포의 접착을 최대 2배까지 높이고, 그 작용은 농도의존적임을 확인하였다 (도 1C).

그러나 HepG2는 플라스틱제의 조직 배양용 플레이트에 접착하는 성질이 있으므로, 부유 세포인 인간 T 림프구계의 암 세포, Jurkat 세포의 경우에도 동일한 효과가 나타날 것인지 여부를 확인하였다. 그 결과, 놀랍게도 6, 60μM의 아데사민(adhesamine)에 의해, 각각 30, 60%의 Jurkat 세포가 접착됨을 확인하였다 (도 1D). 플레이트를 PBS로 2회 세척하여 아데사민(adhesamine)을 제거하고 세포를 이탈시켰다. 세정 후 24시간 만에 93%의 Jurkat 세포가 배양 플레이트의 표면에서 탈착되었다 (도 2). 이것은 아데사민(adhesamine)의 작용이 가역적인 것을 의미한다. 특히 주목해야 할 점은, 아데사민(adhesamine)이 세포끼리의 접착은 촉진하지 않지만, 세포와 기질간의 접착을 높인다는 것이다. 아데사민(adhesamine)의 첨가에 의하여 배양 플레이트 상에서 Jurkat 세포의 접착은 강화되지만, 세포끼리의 접착은 중개되지 않는다.

시험예 2

아데사민(adhesamine)은, 시험한 세포형에서는 명확한 세포독성을 나타내지 않았다. 세포증식은 실제로는, 강화할 수 있었다 (도 3AB). 세포의 형태도 유지된 HepG2 세포나 Jurkat 세포와 같이 일반적이었다 (도 1). 로다민(rhodamine)으로 표식된 팔로이딘(phalloidin)으로 액틴(actin) 세포골격을 가시화함으로써, 접착된 세포에서의 F 액틴 네트워크를 밝혔다. HepG2 세포에서는 액틴 네트워크의 다발이 세포축 방향으로 평행하거나 또는 세포돌기를 관통하여 달려있었다. Jurkat 세포에서 형성된 피질의 액틴(actin) 구조는 잘 조직화되어, 생존하고 있음을 암시하였다. 비특이적인 코팅제인 폴리-L-리신(lysine)으로 코팅된 플레이트에 접착한 세포에서는 상기와 같이 잘 조직화된 액틴(actin) 구조가 검출되지 않았다.

또한, 접착반의 마커인 빈쿨린(vinculin)에 대한 항체로 세포를 염색하였다. 비처리된 HepG2 세포는 컨택트(contact)를 형성하지 않았지만, 아데사민(adhesamine) 처리 세포에서는 씨딩(seeding, 파종(播種)) 후 곧바로 빈쿨린(vinculin) 함유 접착반이 관찰되었다 (도 4). 상기와 같은 관찰들은, 플레이트에 대한 세포의 아데사민(adhesamine) 유도 접촉이 일반적으로 예정된 세포 접착의 시작을 나타낸다. ^{2, 3}

세포골격 저해제의 효과를 평가함으로써, 아데사민(adhesamine) 매개 접착을 시험하였다. 각각 액틴 네트워크와 미세소관의 형성을 저해하는 물질인 사이토카라신(cytochalasin) B 또는 노코다졸(nocodazole)을 처리한 후, 접착 어세이(assay)를 수행하였다.^4,5 피브로넥틴(fibronectin) 매개 세포접착을 저하시키는 것처럼, 사이토카라신(cytochalasin) B 또는 노코다졸(nocodazole)는 양-의존적(dose-dependent)으로 아데사민(adhesamine) 매개 세포접착을 저해했다. 반대로, 폴리-L-리신(lysine)에 의한 세포접착 유도에 있어서는, 상기 두 종류의 물질이 검출가능한 효과를 나타내지 않았다 (도 5AB). 상기와 같은 결과들은, 전체적으로 아데사민(adhesamine)에 의해 유도되는 세포 접착이 생체 유래 세포외기질(extracellular matrix, ECM)에 의해 유도되는 세포 접착과 매우 유사함을 시사한다.

시험예 3

세포접착 작용의 구조를 밝히기 위해, 먼저 두 종류의 아데사민(adhesamine) 유도체의 활성을 평가하였다. 그 결과, 말단의 피리미딘 고리를 제거하면 활성이 완전히 상실되지만 (도 6, 화합물 2), 피리미딘 고리 상의 알데히드기를 수산기로 환원하여도 활성은 유지되는 것이 밝혀졌다 (화합물 3). 거기에서, 피리미딘 고리 상의 알데히드 부분에 형광기를 부착하여 분자의 움직임을 조사하였다. 상기 형광기로서는 단실(dansyl)기를 이용하였다. 제작된 단실(dansyl) 결합형 아데사민(adhesamine)(화합물 4)은 세포접착 촉진 활성을 보유하고 있었다.

형광현미경을 통하여 화합물 4를 관찰한 결과, 상기 형광 프로브체(화합물 4)는 세포표면에 국소적으로 존재하고 있는 것으로 밝혀졌다 (도 7A, C). 대조적으로, 활성이 없는 단실(dansyl) 결합형 디스피로트리피페라진(dispirotripiperazine) (5)은 어디에도 존재하지 않았다 (도 7B, D).

세포표면의 표적의 후보는, 피부로넥틴(fibronectin)과 같은 세포외 매트릭스의 주지의 세포표면수용체인 인테그린(integrin)이었다. 이 가능성을 조사하기 위해서, 인테그린(integrin)의 피부로넥틴(fibronectin)상호작용 도메인에 결합해 마스크하는 Arg-Gly-Asp(RGD)펩티드(peptide)를 배지에 첨가하고, 아데사민(adhesamine)의 활성을 경합 저해하는 능력을 시험봤다. RGD펩티드(peptide)는 피부로넥틴(fibronectin)에서 코팅된 플레이트상에서 저켓(Jurkat) 세포의 접착을 감소시켰다. 그러나 고농도(100μg/mL)로마저 Jurkat세포의 아데사민(adhesamine) 유도 접착의 저해에 실패했다 (도 8A, B). 아데사민(adhesamine)은 인테그린(integrin)의 피부로넥틴(fibronectin)인식 도메인과의 상호작용을 통해서 활성을 발휘하고 있지 않은 것 같았다.

아데사민(adhesamine)의 다른 잠재적인 표적은 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)(GAG)이며⁶, 이것은 인테그린(integrin)과 함께 세포접착에 주요한 역할을 다한다고 보고된, 음전하를 띤 세포표면의 당쇄이다.^7-11 GAG는 헤파린, 헤파란 설페이트(heparan sulfate), 콘드로이친 설페이트(chondroitin sulfate), 케라탄 설페이트(keratan sulfate), 및 히알루론산(hyaluronic acid)의 5 종류로 분류된다. 이 GAG들을 아데사민(adhesamine)과 함께 투여한 후, 아데사민(adhesamine)의 활성이 경쟁적으로 저해되는지 여부를 확인하였다 (표1). 그 결과, 헤파린, 헤파란 설페이트(heparan sulfate), 케라탄 설페이트(keratan sulfate)에 의해 아데사민(adhesamine)의 활성은 저해되었고, 그 IC₅₀(6μM의 아데사민(adhesamine)에 의해 유도되는 접착 활성이 50% 저해되는 농도로 정의한다)는 각각, 0.27, 0.79, 1.03μM이었다. 콘드로이친 설페이트(chondroitin sulfate) 및 히알루론산(hyaluronic acid)에 의해서는 경쟁적 저해가 일어나지 않았다. 아데사민(adhesamine)과 상기 분자들 간의 상호작용을 확인하기 위해, ITC를 이용하여 아데사민(adhesamine)과 각종 GAG와의 결합에 의해 발생하는 열량차이를 측정했다.¹² 헤파린, 헤파란 설페이트(heparan sulfate), 케라탄 설페이트(keratan sulfate)에 의한 적정에서는 명확한 흡열반응이 발생하였고, 산출된 K_d값은 각각, 0.39, 4.67, 5.85μM이었다. 한편, 콘드로이친 설페이트(chondroitin sulfate) 및 히알루론산(hyaluronic acid)에 의한 적정에는 열량차이를 측정할 수 없었고, K_d값은 산출할 수 없었다. 상기와 같은 결과로부터, 아데사민(adhesamine)이 세포표면의 헤파린, 헤파란 설페이트(heparan sulfate), 케라탄 설페이트(keratan sulfate)에 선택적으로 결합할 수 있는 가능성이 시사된다.

GAGs^a를 이용한 ITC 측정 및 경쟁적 저해 시험의 결과

GAGs	K _d (μM)	n( GAGs 당 아데사민 의 수)	IC ₅₀ ^b (μM)
헤파린	0.39±0.09	20.34±2.53	0.27±0.05
헤파란 설페이트 (heparan sulfate)	4.67±0.49	6.38±0.49	0.79±0.19
케라탄 설페이트 (keratan sulfate)	5.85±4.75	33.28±3.2	1.03±0.11
콘드로이친 설페이트 (chondroitin sulfate)	n.d.^c	-	>120
히알루론산 (hyaluronic acid)	n.d.^c	-	>120

^a 모든 데이터는 25℃의, 100 mM NaCl과 1% DMSO를 포함하는 50 mM 인산 완충액(pH 6.0) 내에서 수집되었다.

^b IC₅₀ 값은 아데사민(6μM) 유도 세포접착의 50% 저해에 필요한 GAGs의 농도로 정의한다.

^c 불충분한 열방출로 인해 산출 불가능

상호작용을 상세하게 조사하기 위해서, K_d값이 가장 우수한 헤파린에 초점을 맞추어 실험을 진행하였다. 헤파린은 직쇄상의 다당으로서, 주로, 설페이트화된 우론산(uronic acid)과 D-글루코사민(glucosamine)의 2개의 당이 반복되어 구성된다.¹³ 결합하는 최소의 길이를 밝히기 위해, ITC를 이용한 경쟁적 저해 실험으로, 여러 길이의 헤파린(2, 4, 6, 8, 10당)과 아데사민(adhesamine)의 상호작용을 평가하였다. 상기 두 실험에서, 6당이 가장 높은 아데사민(adhesamine) 친화성을 나타냈다 (표2). ITC의 결과에 의하여, 6당 1분자에 대하여 아데사민(adhesamine) 2분자가 결합하는 것이 시사되었고, 그 K_d값은 0.12μM이었다.

헤파린올리고당^a을 사용한 ITC 측정 및 경쟁적 저해 시험

헤파린 올리고당	K _d (μM)	n(올리고당 당 아데사민 의 수)	IC ₅₀ ^b (μM)
2당	n.d.^c	-	>120
4당	n.d.^c	-	>120
6당	0.12±0.03	2.16±0.43	2.09±0.13
8당	0.45±0.14	2.29±0.17	2.18±0.29
10당	2.09±0.14	3.42±0.72	2.3±0.26
다당(54mer)	0.39±0.09	20.34±2.53	0.27±0.05

^a 모든 데이터는 25℃의, 100mM NaCl과 1% (v/v) DMSO를 포함하는 50mM 인산 완충액(pH 6.0) 내에서 수집되었다.

^b IC₅₀ 값은 아데사민(6μM) 유도 세포접착의 50% 저해에 필요한 올리고당의 농도로 정의한다.

^c 불충분한 열방출로 인해 산출 불가능

시험예 4

기타의 아데사민(adhesamine) 유도체의 세포접착 촉진 활성을 평가하였고, 그 결과를 표3에 나타내었다.

화합물 번호	아데사민 6μM의 Jurkat 세포 접착률
6	22±3.2
7	21±1.3
8	28±4.1
9	35±5.2

시험예 5

아데사민(adhesamine)과의 세포접착이 세포표면 헤파란 설페이트(heparan sulfate)에 의해 매개되고 있는 것 확인하기 위하여, Jurkat 세포에 GAG소화효소를 처리하였다. 헤파리나아제(heparinase), 헤파리티나아제 I(heparitinase I) 및 헤파리티나아제 II(heparitinase II)(0.02 units/mL)에 의한 세포표면 헤파란 설페이트(heparan sulfate) 사슬의 소화는, 아데사민(adhesamine) 유도 세포접착을 감소시켰다. 반대로, 5배 높은 농도(0.1 units/mL)의 콘드로이티나아제(chondroitinase) ABC는, 아데사민(adhesamine) 유도 세포접착에 대하여 검출가능한 효과를 나타내지 않았다 (도 9A). 아데사민(adhesamine)으로 처리된 세포보다는 영향이 적었지만, 헤파란 설페이트(heparan sulfate)가 소화됨으로써 피브로넥틴(fibronectin)으로 코팅된 플레이트로의 세포접착에 영향을 주었다 (도 9A). 상기의 결과는 피브로넥틴(fibronectin)이 세포접착을 매개하는 인테그린(integrin)과 헤파란 설페이트(heparan sulfate) 양쪽에 결합한다는 기존의 발견에 일치한다.

미처리된 또는 아데사민(adhesamine)에 의해 접착이 강화된 HepG2 세포에서, GAG소화효소의 효과를 실험하였다. GAG소화효소의 처리에 의하여, 미처리된 HepG2 세포의 접착은 조금 저하되었다. 헤파리나아제(heparinase)/헤파리티나아제(heparitinase)I/헤파리티나아제(heparitinase)II(0.02 units/mL) 또는 콘드로이티나아제(chondroitinase) ABC(0.1 units/mL)로 처리된 세포의 경우, 13%과 7%의 저해가 관찰되었다 (도9B). Jurkat 세포에서 관찰된 것 같이, 아데사민(adhesamine) 유도 세포접착은, 헤파란 설페이트(heparan sulfate) 소화효소에 의해서는 취소되었지만, 콘드로이티나아제(chondroitinase) ABC에 의해서는 취소되지 않았다 (도 9B).

형광 프로브인 화합물(4)의 국소화 여부를 통하여, GAG소화효소의 효과를 조사하였다. 세포를 헤파란 설페이트(heparan sulfate) 소화효소로 처리된 경우 화합물 4는 세포표면으로부터 확산되었지만, 콘드로이티나아제(chondroitinase)의 처리는 화합물 4가 세포 표면으로 국소화되는데 아무런 영향이 없었다 (도 9CD). 상기 결과는, 아데사민(adhesamine)이 세포표면의 헤파란 설페이트(heparan sulfate)와 상호작용함으로써, 세포접착을 유도한다는 것을 의미한다.

헤파란 설페이트(heparan sulfate)와 아데사민(adhesamine)의 상호작용을 더욱 검증하기 위하여, 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)의 합성이 결손된 CHO-K1 세포의 변이주(CHO 745, CHO 677, CHO 606 및 CHO F17 등을 포함하는 세포주)를 사용하였다. CHO 745세포는 헤파란 설페이트(heparan sulfate)와 콘드로이친 설페이트(chondroitin sulfate)을 합성할 수 없고, CHO 677세포에서는 헤파란 설페이트(heparan sulfate)의 발현이 감소되나 콘드로이친 설페이트(chondroitin sulfate)의 발현은 증가된다.^{14, 15} 상기 두 세포 계통 모두, 모체인 CHO-K1 세포보다 아데사민(adhesamine)에 대한 반응성이 낮았다 (도 10E). 상기 데이터들은, 아데사민(adhesamine) 유도 세포접착이 헤파란 설페이트(heparan sulfate) 프로테오글리칸(protelglycans)에 의존적인 과정이라는 점과 헤파란 설페이트(heparan sulfate)의 결손이 콘드로이친 설페이트(chondroitin sulfate)의 발현 수준 증가에 의해 보충될 수는 없다는 점을 의미한다.

GlcNAc N-디아세틸라제(deacetylase)/N-설포트랜스퍼라제-1(sulfotransferase-1)의 활성이 결여된 CHO 606세포 역시 아데사민(adhesamine)에 대해 낮은 반응성을 보였다 (도 10E).¹⁶ 반대로, 2-O-설포트랜스퍼라제(2-O-sulfotransferase) 결손 CHO F17 세포는 아데사민(adhesamine)에 반응성을 보였다 (도 10E).¹⁷ 상기 결과들은, 헤파란 설페이트(heparan sulfate)의 N-설페이트(N-sulfate)기가 아데사민(adhesamine)과의 상호작용에 있어서 중요한 요소이나, 우론산(uronic acid) 잔기의 C-2의 설페이트 에스테르(ester sulfate)는 결합에 그다지 중요하지 않다는 것을 의미한다.

시험예 6

인테그린(integrin)과 세포표면 헤파란 설페이트(heparan sulfate) 프로테오글리칸(protelglycans)에 의해 매개되는 세포접착은, 많은 비수용체 키나제(kinase)를 자극하는 세포간 시그널을 발생시킨다. 세포외기질(extracellular matrix, ECM)로의 세포접착에 의해 활성화되는 가장 중요한 키나제(kinase)인 포컬어드히션키나아제(Focal Adhesion kinase, FAK)의 인산화가, 아데사민(adhesamine)의 존재에 의해 모니터링되었다. 아데사민(adhesamine)에 의한 자극 5시간 후 시점에서의 FAK 인산화는 Jurkat 세포에서 FAK 활성화의 시계열분석을 통하여 증명되었다 (도 11A). 활성화는 양의존적(dose-dependent)이어서, 5μg/mL의 아데사민(adhesamine)은 FAK를 인산화하는데 충분했지만, 같은 양으로 폴리-L-리신(lysine)을 활성화하는데는 실패했다 (도 11B). 세포가 경쟁적인 농도의 헤파린과 함께 배양된 경우, FAK의 아데사민(adhesamine) 유도 인산화는 감소했다 (도 11C). 반대로, RGD 펩티드(peptide)의 첨가에 의해서는 검출가능한 효과가 나타나지 않았다 (도 11C). 함께 행하여진 웨스턴 블롯은 세포용해액에서의 총 FAK 수준에 유의한 변화를 나타내지 않았다.¹⁸

FAK에 의해 활성화되는 하류의 키나제(kinase)인 세포외 시그널 조절 키나제(Extracellular signal-regulated kinases, ERK)에서도 동일한 결과를 얻을 수 있었다. ERK는 아데사민(adhesamine)과의 인큐베이션(incubation) 5시간 후 시점에 인산화되어, 그 활성화는 과량의 헤파린을 첨가함으로써 차단되었다 (도 11). FAK와 ERK의 활성화는, 세포운동성, 세포증식, 세포골격조직화, 및 접착의존성 세포생존에 있어서 중요한 역할을 담당한다.^{19, 20} 아데사민(adhesamine)의 세포골격조직화 및 증식촉진 활성은 상기 2 종류 키나제(kinase)의 인산화에 의해 설명된다.

시험예 7

아데사민(adhesamine)의 접착촉진작용을 4개의 기존 플레티트코팅제와 비교하였다. 비교한 코팅제는 타입I콜라겐, 피부로넥틴(fibronectin), 폴리-L-리신(lysine) 및 폴리-L-오르니틴이다. 아데사민(adhesamine)을 첨가한 경우, 다른 코팅제보다도 훨씬 효율적으로 접착이 높아진다는 것을 확인하였다 (도 12). 동일한 효과는 아데사민(adhesamine) 및 코팅제를 함께 도포한 경우에도 확인되었고, 이 경우, 50μg/well 농도의 아데사민(adhesamine)은 피부로넥틴(fibronectin), 폴리-L-리신(lysine), 폴리-L-오르니틴보다도 뛰어난 효과를 나타내었다.

시험예 8

플레이트로의 강고한 접착은 일반적으로 마이크로인젝션(microinjection)의 성공을 위해서 필요하므로, 아데사민(adhesamine)은 마이크로인젝션(microinjection)을 촉진하기 위한 시약으로서 응용될 수 있는 가능성이 있다. 상기와 같은 응용 가능성을 시험하기 위하여, 림프구의 부유성으로 인하여 기술적으로 용이하지 않은 것으로 인식되는 실험인 Jurkat 세포의 마이크로인젝션(microinjection)이 아데사민(adhesamine)으로 인하여 가능할지 여부를 확인하였다. 실제로, 세포에의 형광색소 Alexa Fluor 594의 마이크로인젝션(microinjection)은, 아데사민(adhesamine)이 없을 경우, 완전히 성공적이지 않았다. 배지에 타입I콜라겐 또는 폴리-L-리신(lysine)을 첨가한 경우에도 대부분 효과가 없었고, 피브로넥틴(fibronectin)을 첨가한 경우 성공률이 ∼30%까지 향상되었다 (도 13). 그렇지만, 같은 양의 아데사민(adhesamine)은 그 성공률을 ∼80% 정도까지 향상시켰다 (도 13). 아데사민(adhesamine)은, 인젝션(injection)하는 것이 어려운 세포에 마이크로 인젝션을 가능하게 하거나 또는 보조하는 합성 시약으로써 이용될 수 있을 것이다.

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아데사민(adhesamine)은 배양플레이트에 대한 세포의 접착을 강화시키는 활성을 가지는 바, 세포생물학에 있어서 세포접착제, 플레이트코팅제로 응용될 수 있다.

Claims

하기 화학식(I)에서 나타낸 디스피로트리피페라진(dispirotripiperazine) 유도체 또는 그의 염을 포함하는, 지지체에서의 세포접착 촉진제:
[화학식 1]

[상기 화학식(I)에서, R¹ 및 R²는, 같거나 다르고, 수소, 알킬기(alkyl group), 알케닐기(alkenyl group), 알키닐기(alkynyl groups), 시클로알킬기(cycloalkyl group), 시클로알킬알킬기(cycloalkylalkyl group), 아릴기(aryl group), 헤테로아릴기(heteroaryl group), 아릴 치환 알킬기, 헤테로아릴 치환 알킬기(R¹및 R²가 양쪽이 수소인 경우는 제외하고, R¹ 및 R²는 하이드라진(hydrazine) 유도체화된 것일 수도 있고, 아르기닌(arginine)-글라이신(glycine)-아스파르트산(aspartic acid)을 포함하는 펩티드가 결합된 것일 수도 있으며, 알킬기(alkyl group), 알케닐기(alkenyl group), 알키닐기(alkynyl groups) 및 알킬(alkyl) 부분은, 할로겐(halogen), 하이드록시(hydroxy)(상기 하이드록시는 아실화(acylation), 카바메이트화(carbamate) 또는 에테르화(etherification)되어 있어도 좋다), 시아노(cyano), 니트로(nitro), 아미노(amino), 모노(mono) 또는 다이(di) 치환 아미노(amino), 카르바모일(carbamoyl) 및 설파모일(sulfamoyl)로부터 선택되는 원자 또는 기(group)로 치환되고 있어도 좋으며, 알킬기(alkyl group), 알케닐기(alkenyl group), 알키닐기(alkynyl groups), 시클로알킬기(cycloalkyl group), 알킬(alkyl) 부분 및 시클로알킬(cycloalkyl) 부분은, -O-, -S-, -SO-, -SO2-, -OSO2-, -NH-, -CO-, -CH=CH-, -C≡C-, -CONH-, -NHCO-, -NHCOO-, -OCH2CONH- 또는 -OCH2CO-가 포함되어 있어도 되며, 아릴기(aryl group), 아릴 부분, 헤테로아릴기(heteroaryl group), 헤테로아릴 부분, 시클로알킬기(cycloalkyl group) 및 시클로알킬 부분은, 할로겐(halogen), 하이드록시(hydroxy), 포르밀(formyl), 알킬(alkyl), 하이드록시알킬(hydroxyalkyl), 알콕시(alkoxy), 알킬티오기(alkylthio), 시아노(cyano), 니트로(nitro), 아미노(amino), 모노(mono) 또는 다이(di) 치환 아미노, 카르바모일(carbamoyl), 설파모일(sulfamoyl), 알킬술포닐(alkylsulfonyl), 알킬술포닐아미노(alkylsulfonylamino), 알킬카르보닐아미노(alkylcarbonylamino), 메틸렌디옥시(methylenedioxy) 및 아릴(aryl)로부터 선택되는 원자 또는 기(group)로 치환되어 있어도 좋다), 또는 하기 화학식(II)에서 나타낸 기(group)(R¹ 및 R² 모두 하기 화학식(II)에서 나타낸 기(group)의 경우를 제외한다)을 의미하며,
상기 알킬(alkyl) 부분은, 시클로알킬알킬기(cycloalkylalkyl group), 아릴 치환 알킬기 및 헤테로아릴 치환 알킬기에 있어서의 각 알킬기(alkyl group)를 의미할 뿐만 아니라, 하이드록시알킬(hydroxyalkyl), 알킬티오기(alkylthio), 알킬술포닐(alkylsulfonyl), 알킬술포닐아미노(alkylsulfonylamino), 알킬카르보닐아미노(alkylcarbonylamino), 및 알콕시기(alkoxy group) 중의 알콕시(alkoxy)(O-알킬기(alkyl group))중의 알킬기(alkyl group), 및 모노(mono) 또는 다이(di) 치환 아미노(amino), 카르바모일(carbamoyl) 및 설파모일(sulfamoyl)의 치환 근본인 알킬기(alkyl group)를 포함하고,
상기 시클로알킬(cycloalkyl) 부분은, 시클로알킬알킬기(cycloalkylalkyl group) 및 시클로알킬알킬렌기(cycloalkylalkylene group)의 시클로알킬기(cycloalkyl group)를 의미하며,
상기 아릴(aryl) 부분은, 아릴 치환 알킬기 및 아릴(aryl) 치환 알킬렌기(alkylene group)의 아릴기(aryl group)를 의미하고,
상기 헤테로아릴(heteroaryl) 부분은, 헤테로아릴 치환 알킬기 및 헤테로아릴(heteroaryl) 치환 알킬렌기(alkylene group)의 헤테로아릴기(heteroaryl group)를 의미한다.

[화학식 2]

[상기 화학식(II)에서, R^1a는 알킬렌기(alkylene group), 알케닐렌기(alkenylene group), 알키닐렌기(alkynylene group), 시클로알킬렌기(cycloalkylene group), 시클로알킬알킬렌기(cycloalkylalkylene group), 아릴렌기(arylene group), 헤테로아릴렌기(hetroarylene group), 아릴(aryl) 치환 알킬렌기, 또는 헤테로아릴(heteroaryl) 치환 알킬렌기(알킬렌기, 알케닐렌기, 알키닐렌기 및 알킬렌 부분은, 할로겐(halogen), 하이드록시(hydroxy)(상기 하이드록시는 아실화(acylation), 카바메이트(carbamate)화 또는 에테르화(etherification)되고 있어도 좋다), 시아노(cyano), 니트로(nitro), 아미노(amino), 모노(mono) 또는 다이(di) 치환 아미노(amino), 카르바모일(carbamoyl) 및 설파모일(sulfamoyl)로부터 선택되는 원자 또는 기(group)로 치환되고 있어도 좋으며, 알킬렌기, 알케닐렌기, 알키닐렌기, 시클로알킬렌기, 알킬렌 부분 및 시클로알킬(cycloalkyl) 부분은, -O-, -S-, -SO-, -SO2-, -OSO2-, -NH-, -CO-, -CH=CH-, -C≡C-, -CONH-, -NHCO-, -NHCOO-, -OCH2CONH- 또는 -OCH2CO-가 포함되어 있어도 되며, 아릴렌기, 아릴 부분, 헤테로아릴렌기, 헤테로아릴 부분, 시클로알킬렌기, 및 시클로알킬 부분은, 할로겐, 하이드록시, 포르밀, 알킬, 하이드록시알킬, 알콕시, 알킬티오기, 시아노, 니트로, 아미노, 모노(mono) 또는 다이 치환 아미노, 카르바모일, 설파모일, 알킬술포닐, 알킬술포닐아미노, 알킬카르보닐아미노, 메틸렌디옥시 및 아릴로부터 선택되는 원자 또는 기(group)로 치환되고 있어도 좋다)을 의미하고,
R^2a는, R¹ 및 R²의 정의와 같으며,
상기 알킬렌 부분이란, 시클로알킬알킬렌(cycloalkylalkylene)기, 아릴(aryl) 치환 알킬렌(alkylene)기 및 헤테로아릴(heteroaryl) 치환 알킬렌(alkylene)기에 있어서의 각 알킬렌(alkylene)기를 의미하고,
상기 시클로알킬(cycloalkyl) 부분, 아릴 부분, 헤테로아릴 부분은 각각 상기 [화학식 1]에서 정의한 바와 같다.]] .
하기의 군으로부터 선택되는 디스피로트리피페라진(dispirotripiperazine) 유도체 또는 그의 염을 포함하는, 지지체에서의 세포접착 촉진제 :
[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

및

[화학식 10]

.
제 1항에 있어서, 상기 지지체는 세포배양 용기인 것을 특징으로 하는 세포접착 촉진제.
제 1항에 있어서, 상기 세포는 부유성 세포인 것을 특징으로 하는 세포접착 촉진제.
제 1항의 디스피로트리피페라진 유도체 또는 그의 염을 배지에 첨가 또는 지지체에 도포하는 것을 특징으로 하는, 지지체에서의 세포 접착을 촉진시키는 방법.
제 2항의 디스피로트리피페라진 유도체 또는 그의 염을 배지에 첨가 또는 지지체에 도포하는 것을 특징으로 하는, 지지체에서의 세포 접착을 촉진시키는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 지지체는 세포배양 용기인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 세포는 부유성 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항의 디스피로트리피페라진 유도체 또는 그의 염을 포함하는, 세포접착 또는 세포증식을 촉진하는 헤파란 설페이트(heparan sulfate) 작용제(agonist).
하기 화학식(Ia)에 나타낸 디스피로트리피페라진 유도체 또는 그의 염:
[화학식 11]

[상기 화학식(Ia)에서, R³는 단일고리의 아릴기 또는 헤테로아릴기(heteroaryl group)(R³는 하이드라진 유도체화된 것일 수도 있고, 아르기닌(arginine)-글라이신(glycine)-아스파르트산(aspartic acid)을 포함하는 펩티드가 결합된 것일 수도 있으며, 아릴기 및 헤테로아릴기는, 할로겐, 하이드록시, 포르밀, 알킬, 하이드록시알킬, 알콕시, 알킬티오기, 시아노, 니트로, 아미노, 모노(mono) 또는 다이(di) 치환 아미노, 카르바모일, 설파모일, 알킬술포닐, 알킬술포닐아미노, 알킬카르보닐아미노, 메틸렌디옥시 및 아릴로부터 선택되는 원자 또는 기(group)로 치환되고 있어도 좋다)를 의미하고, R⁴는 하기 화학식(IIa)에서 나타낸 기(group)를 의미한다.
[화학식 12]

[상기 화학식(IIa)에서, R^3a는 단일고리의 아릴렌기 또는 헤테로아릴렌기(아릴렌기 및 헤테로아릴렌기는, 할로겐, 하이드록시, 포르밀, 알킬, 하이드록시알킬, 알콕시, 알킬티오기, 시아노, 니트로, 아미노, 모노(mono) 또는 다이(di) 치환 아미노, 카르바모일, 설파모일, 알킬술포닐, 알킬술포닐아미노, 알킬카르보닐아미노, 메틸렌디옥시 및 아릴로부터 선택되는 원자 또는 기(group)로 치환되고 있어도 좋다)를 의미하고,
R^4a는, R³의 정의와 같다.]] .
하기의 군으로부터 선택되는 디스피로트리피페라진 유도체 또는 그의 염 :
[화학식 13]

[화학식 14]

[화학식 15]

[화학식 16]

및

[화학식 17]

.
하기 화학식(Ⅰb)에 나타낸 디스피로트리피페라진 유도체 또는 그의 염:
[화학식 18-1]

(Ⅰb)
[상기 화학식(Ib)에서, R⁵및R⁶는 동일하거나 다른 단일고리의 아릴기, 헤테로아릴기(heteroaryl group)(R⁵및R⁶ 중 하나 이상은 아르기닌(arginine)-글라이신(glycine)-아스파르트산(aspartic acid)을 포함하는 펩티드가 결합된 것일 수 있으며, 아릴기 및 헤테로아릴기는, 할로겐, 하이드록시, 포르밀, 알킬, 하이드록시알킬, 알콕시, 알킬티오기, 시아노, 니트로, 아미노, 모노(mono) 또는 다이(di) 치환 아미노, 카르바모일, 설파모일, 알킬술포닐, 알킬술포닐아미노, 알킬카르보닐아미노, 메틸렌디옥시 및 아릴로부터 선택되는 원자 또는 기(group)로 치환되어 있어도 좋다), 또는 하기 화학식(IIb)로 나타낸 기(group)를 의미하되, R⁵및R⁶둘다 하기 화학식(IIb)로 나타낸 기(group)인 경우는 제외한다.
[화학식 19-1]

(Ⅱb)
[상기 화학식(IIb)에서, R^5a는 단일고리의 아릴렌기 또는 헤테로아릴렌기(아릴렌기 및 헤테로아릴렌기는, 할로겐, 하이드록시, 포르밀, 알킬, 하이드록시알킬, 알콕시, 알킬티오기, 시아노, 니트로, 아미노, 모노(mono) 또는 다이(di) 치환 아미노, 카르바모일, 설파모일, 알킬술포닐, 알킬술포닐아미노, 알킬카르보닐아미노, 메틸렌디옥시 및 아릴로부터 선택되는 원자 또는 기(group)로 치환되고 있어도 좋다)를 의미하고,
R^6a는, R⁵및 R⁶의 정의와 같다.]] .